DE3688549T2

DE3688549T2 - Verfahren zur expression von genen in hefe, dns-fragmente und plasmide die letztere fragmente enthalten und zur durchfuehrung des verfahrens verwendet werden.

Info

Publication number: DE3688549T2
Application number: DE8686114704T
Authority: DE
Inventors: Erik Ostergard Jensen; Kjeld Adrian Marcker
Original assignee: Danisco AS
Current assignee: International N and H Denmark ApS
Priority date: 1985-10-24
Filing date: 1986-10-23
Publication date: 1993-09-23
Anticipated expiration: 2006-10-24
Also published as: SE8604517L; AU6433886A; NO175103C; FR2598432A1; NL8602657A; CA1333162C; AU593296B2; DE3688549D1; EP0220679A2; DK162900C; ES2054608T3; US4849348A; NZ217948A; FR2598432B1; EP0220679B1; ATA282386A; BR8605221A; GB2183656A; NO175103B; FI864301A7

Description

Die Erfindung betrifft ein neues Verfahren zur Expression von Genen in Hefe, DNA-Fragmente und Plasmide, die letztere DNA-Fragmente enthalten und zur Durchführung des Verfahrens verwendet werden.
In der vorliegenden Beschreibung werden u. a. die nachstehenden Begriffe verwendet:
Promotorbereich: DNA-Fragment, enthaltend einen Promotor und Zielsequenzen für RNA-Polymerase und außerdem mögliche Aktivierungsbereiche, die Zielsequenzen für transkriptionale Effektorsubstanzen umfassen.
Effektorsubstanz: Substanzen, die eine regulatorische Funktion bewirken oder vermitteln. Die Effektorsubstanzen umfassen somit auch Substanzen, welche die Konzentration von solchen Substanzen beeinflussen, die eine regulatorische Funktion bewirken oder vermitteln.
Leader-Sequenz: Im allgemeinen ist damit eine DNA-Sequenz gemeint, die in eine mRNA transkribiert wird, die jedoch nicht weiter in Protein translatiert wird. Die Leader- Sequenz umfaßt somit das DNA-Fragment vom Transkriptions- Start zum ATG-Translations-Startcondon.
In bezug auf die vorliegende Erfindung ist ein kurzes DNA-Fragment gemeint, das typischerweise 40 bis 70 Bp aufweist und Zielsequenzen für eine durch intrazelluäres Häm bewirkt oder vermittelte posttranskriptionale Regulation umfaßt.
Ferner werden die nachstehenden Begriffe verwendet, die einem Fachmann der Molekularbiologie im allgemeinen geläufig sind.
Cap-Additionsstelle: Die Stelle, an der 7-Methyl-GTP an die entsprechende mRNA angefügt wird.
DNA-Sequenz, DNA-Segment oder DNA-Molekül: Lineare Anordnung von Nucleotiden, die über Phosphodiesterbindungen zwischen den 3'- und den 5'-Kohlenstoffatomen von benachbarten Pentosen miteinander verknüpft sind.
Expression: Prozeß, den ein Strukturgen durchläuft, um ein Polypeptid zu erzeugen. Hierbei handelt es sich um eine Kombination aus Transkription und Translation und außerdem möglichen posttranslationalen Modifikationen.
Benachbarte Bereiche: DNA-Sequenzen, welche die codierenden Bereiche umgeben. 5'-benachbarte Bereiche enthalten einen Promotor. 3'-benachbarte Bereiche können transkriptionale Terminatorsignale usw. enthalten.
Gen: DNA-Sequenz, die aus drei oder vier Teilen zusammengesetzt ist, (1) der das Genprodukt codierenden Sequenz, (2) den Sequenzen im Promotorbereich, die kontrollieren, ob das Gen exprimiert wird oder nicht, (3) denjenigen Sequenzen im 3'-Ende, welche die transkriptionale Termination und mögliche Polyadenylierung bestimmen, und außerdem (4) intervenierenden Sequenzen, sofern vorhanden.
Intervenierende Sequenzen: DNA-Sequenzen innerhalb eines Gens, die nicht für ein Peptidfragment codieren. Die intervenierenden Sequenzen werden in Prä-mRNA transkribiert und dann durch die Modifizierung von Vorläufer-RNA in mRNA eliminiert.
Clonierung: Verfahren zum Erhalt einer Population von Organismen oder DNA-Sequenzen, die von einem solchen Organismus oder einer solchen Sequenz durch asexuelle Reproduktion abgeleitet werden, oder insbesondere:
Verfahren zur Isolierung eines bestimmten Organismus oder Teils davon und Vermehrung dieser Subfraktion als homogene Population.
Codierende Sequenz: DNA-Sequenz, welche die Aminosäuresequenz eines Polypeptids bestimmt.
Messenger-RNA (mRNA): RNA-Molekül, das durch Transkription eines Gens und mögliche Modifizierung von Vorläufer-RNA gebildet wird. Das mRNA-Molekül vermittelt die genetische Information, welche die Aminosäuresequenz eines Polypeptids bestimmt, indem ein Teil des mRNA-Moleküls in das Peptid translatiert wird.
Nucleotid: Monomere Einheit von DNA oder RNA, die aus einem Zuckerrest (Pentose), einem Phosphatrest und einer stickstoffhaltigen heterocyclischen Base besteht. Die Base ist über eine glycosidische Bindung (1'-Kohlenstoff der Pentose) an den Zuckerrest gebunden, diese Kombination von Base und Zucker ist ein Nucleosid. Die Base kennzeichnet das Nucleotid. Die vier DNA-Basen sind Adenin (A), Guanin (G), Cytosin (C) und Thymin (T). Die vier RNA-Basen sind A, G, C und Uracil (U).
Plasmid: Nichtchromosomale doppelsträngige DNA-Sequenz, die ein intaktes Replikon umfaßt, so daß das Plasmid in einer Wirtszelle repliziert wird. Wenn das Plasmid in einen einzelligen Organismus eingebracht wird, werden die Eigenschaften dieses Organismus durch die Plasmid-DNA verändert oder transformiert. Beispielsweise transformiert ein Plasmid, das das Gen für Tetracyclin-Resistenz (TcR) trägt, eine Zelle, die vorher gegen Tetracyclin empfindlich war, zu einer Zelle, die dagegen resistent ist. Eine durch ein Plasmid transformierte Zelle wird eine Transformante genannt.
Polypeptid: Lineare Anordnung von Aminosäuren, die durch Peptidbindungen zwischen den α-Amino- und Carboxy- Gruppen von benachbarten Aminosäuren miteinander verknüpft sind.
Rekombination: Erzeugung eines neuen DNA-Moleküls durch Kombination von DNA-Fragmenten unterschiedlichen Ursprungs.
Replikation: Prozeß zur Reproduktion von DNA-Molekülen.
Replikon: Selbst-replizierendes genetisches Element, das einen Ursprung zur Initiation der DNA-Replikation und Gene besitzt, welche die zur Kontrolle der Replikation notwendigen Funktionen spezifizieren.
Restriktionsfragment: DNA-Fragment, das bei Spaltung des Doppelstranges durch ein solches Enzym entsteht, das eine spezifische Ziel-DNA-Sequenz erkennt.
RNA-Polymerase: Enzym, das die Transkription von DNA in RNA bewirkt.
Transformation: Prozeß, durch den ein Plasmid in eine Zelle eingeführt wird.
Translation: Prozeß, durch den ein Polypeptid aus mRNA erzeugt wird oder:
Prozeß, wobei die in einem mRNA-Molekül vorliegende genetische Information während der Synthese eines Polypetids die Reihenfolge von spezifischen Aminosäuren bestimmt.
Transkription: Verfahren zur Synthese einer komplementären RNA-Sequenz aus einer DNA-Sequenz.
Vektor: Plasmid, Phagen-DNA oder andere DNA-Sequenzen, die zur Replikation in einer Wirtszelle befähigt sind und eine oder eine kleine Zahl von Endonuclease-Erkennungsstellen aufweisen, an denen DNA-Sequenzen in bestimmbarer Art und Weise gespalten werden können, ohne daß dabei eine wesentliche biologische Funktion der DNA verlorengeht, z. B. Replikation, Produktion von Hüllproteinen oder Verlust von Promotor oder Bindungsstellen, und die einen Marker enthalten, der zur Verwendung bei der Identifizierung von transformierten Zellen geeignet ist, z. B. in Form von Tetracyclin-Resistenz oder Ampicillin-Resistenz. Ein Vektor wird häufig Clonierungsvehikel genannt.
Die Produktion eines biologisch aktiven Produktes mittels DNA-Rekombinations-Technik stellt einen komplexen Vorgang dar, der viele Prozeßschritte von der Initiation der Transkription bis schließlich zum Erhalt des biologisch aktiven Moleküls umfaßt.
Viele dieser Prozeßschritte kommen in prokaryotischen Organismen nicht vor, aus diesem Grund müssen für die Produktion in vielen Fällen eukaryotische Organismen verwendet werden.
Die Hefe ist ein eukaryotischer Organismus, dessen Syntheseapparat viele der Prozesse und Regulationsmechanismen umfaßt, die für höhere Organismen charakteristisch sind. Ferner haben Hefezellen eine kurze Generationszeit, und außerdem kann man bei Verwendung von Hefe als gezüchteter Organismus auf eine tausendjährige Erfahrungsgrundlage zurückgreifen.
Ganz entscheidende Faktoren für die biologische Synthese eines gewünschten Genproduktes sind die Möglichkeit und Verbesserung sowohl von transkriptionaler Initiation als auch von transkriptionaler und posttranskriptionaler Regulation der Genexpression.
Diese Funktionen werden hauptsächlich durch 5'-benachbarte Bereiche ausgeführt. Viele verschiedene 5'-benachbarte Bereiche von prokaryotischen und eukaryotischen Genen sind sequenziert worden, hieraus wurde u. a. ein verständliches Wissen über die Regulation von Genexpression und über die Subregionen und Sequenzen erhalten, die für die Regulation der Genexpression von Wichtigkeit sind. Die Regulationsmechanismen von prokaryotischen und eukaryotischen Organismen weisen große Unterschiede auf, es gibt jedoch innerhalb dieser zwei Gruppen auch viele gemeinsame Merkmale.
Die Regulation der Genexpression kann auf transkriptionaler Ebene stattfinden, sie wird dann vorzugsweise durch Regulation der Initiationsfrequenz der Transkription bewirkt. Die letztere ist wohlbekannt und wird u. a. von Benjamin Lewin, Gene Expression, John Wiley & Sons, Bd. I, 1974, Bd. II, Zweite Auflage, 1980, Bd. III, 1977, beschrieben. Andererseits kann die Regulation auch auf Posttranskriptionaler Ebene erfolgen, z. B. Regulation der Frequenz der Translationsinitiation bei der Translationsrate und der Translationstermination.
Leghämoglobine sind monomere Hämoproteine, die ausschließlich in den Wurzelknöllchen synthetisiert werden, die sich bei symbiotischer Verbindung von Rhizobia und Leguminosenpflanzen entwickeln. Ein Kandidat für eine die Leghämoglobingene aktivierende Effektorsubstanz ist Häm, das in Rhizobia produziert wird und die prosthetische Gruppe der Leghämoglobingene darstellt. Außerdem wird die Synthese von verschiedenen Hämoproteinen in der Hefe Saccharomyces cerevisiae durch den intrazellulären Hämspiegel reguliert, wobei Häm auch bei diesen Proteinen die prosthetische Gruppe bildet. Demgemäß ist die Transkription des Isocytochrom c- Gens Häm-abhängig, während im Falle von Katalase T&sub1; die Häm- Kontrolle sowohl auf transkriptionaler als auch auf posttranskriptionaler Ebene bewirkt wird. Die Nucleotidsequenzen von zwei Leghämoglobingenen aus Sojabohnen mit drei intervenierenden Sequenzen in identischen Positionen und konservierten Sequenzen in den 5'- und 3'-benachbarten Bereichen werden von Hyldig-Nielsen et al., Nucl. Acids Res. 10 (1982), 689-701, und Wiborg et al., Nucl. Acids. Res. 11 (1982), 3487-3494, beschrieben.
Erfindungsgemäß wird die Sequenz der 5'-benachbarten Bereiche der vier Sojabohnen-Leghämoglobingene Lba, Lbc1, Lbc2 und Lbc3 dargestellt. Die Sequenzen werden in der eingeschlossenen Fig. 1 dargestellt, in der sie so nebeneinandergestellt sind, daß die Homologie deutlich wird.
Wie aus dem Sequenzschema ersichtlich ist, liegt ein eindeutiger Homologiegrad zwischen den vier 5'-benachbarten Bereichen vor, in der Position 23 bis 24 Bp stromaufwärts der Cap-Additionsstelle enthalten sie alle eine TATATAAA-Sequenz, die der "TATA"-Box entspricht, welche in eukaryotischen Zellen üblicherweise eine entsprechende Anzahl von Bp stromaufwärts der Cap-Additionsstelle vorkommt. Außerdem liegt eine CCAAG-Sequenz 64 bis 72 Bp stromaufwärts der Cap- Additionsstelle vor, wobei diese Sequenz der "CCAAT"-Box entspricht, die üblicherweise 70 bis 90 Bp stromaufwärts der Cap-Additionsstelle vorkommt. Zwischen der Cap-Additionsstelle und dem Translations-Startcodon ATG liegen Leader-Sequenzen mit 52 bis 59 Bp vor, die einen deutlichen Homologiegrad von etwa 75 bis 80% aufweisen.
Erfindungsgemäß ist außerdem am Beispiel von Lbc3 gezeigt worden, daß die 5'-benachbarten Bereiche der Sojabohnen-Leghämoglobingene in Hefe funktionell aktiv sind. Das Letztere ist bewiesen worden, indem das Chloramphenicol-Acetyltransferase(CAT)-Gen von E. coli mit den 5'- und 3'-benachbarten Bereichen des Sojabohnen-Lbc3-Gens in solcher Art und Weise fusioniert wurde, daß die Expression des CAT-Gens durch den Lb-Promotor kontrolliert wird. Das Fusionierungsfragment wurde in den Hefeplasmidvektor YEP 24 eingefügt, welcher das Hefe-URA-3-Gen als selektierbaren Marker umfaßte. Der Hefestamm S. cerevisiae TM1, der URA-3&supmin; ist und aufgrund einer Mutation im δ-Aminolävulinsäure(6-ALA)-Synthetase-Gen unfähig ist, Häm zu synthetisieren, wurde anschließend mit der resultierenden Konstruktion transformiert. Die transformierten Hefezellen zeigten bei allen getesteten Wachstumsbedingungen eine CAT-Aktivität. Folglich kann hieraus geschlossen werden, daß die 5'-benachbarten Bereiche von Sojabohnen-Hämoglobingenen in Hefe funktionell sind.
Erfindungsgemäß ist außerdem gezeigt worden, daß die 5'-benachbarten Bereiche als Ziel für eine durch intrazelluläres Häm bewirkte oder vermittelte Regulation fungieren. Daher ist die CAT-Aktivität in der Hefe Saccharomyces cerevisiae TMI, die in Gegenwart von &-ALA gewachsen ist, 20- bis 40fach höher als die CAT-Aktivität in Hefe, die ohne diesen Häm-Vorläufer im Nährmedium gewachsen ist. Ähnlich hohe CAT-Aktivitäten lagen in den Hefen S. cerevisiae TMI vor, die in Gegenwart von Häm, Protoporphyrin IX oder dem Häm-Analog Deuteroporphyrin IX gewachsen waren. Die Wirkung von Häm auf die CAT-Aktivität ist spezifisch, da die Menge des URA-3-Genproduktes unter allen getesteten Bedingungen konstant bleibt. Außerdem ändert sich die transkriptionale Ebene aufgrund der Gegenwart von Häm offenbar nicht, da der CAT-mRNA-Spiegel unabhängig von Änderungen in der intrazellulären Häm-Konzentration konstant bleibt. Somit kann gefolgert werden, daß der durch Häm bewirkte oder vermittelte Regulationsmechanismus auf posttranskriptionaler Ebene stattfindet.
Der beobachtete Anstieg der CAT-Aktivität ist von der Proteinsynthese abhängig. Die Halbwertszeit des CAT-Enzyms ist ferner von der Gegenwart von Häm unabhängig, und die in vitro-CAT-Aktivität wird nicht durch Häm stimuliert. Folglich reguliert Häm die Genexpression höchstwahrscheinlich auf translationaler Ebene. Der codierende Bereich des Neomycin-Phosphotransferase(Neo)-Gens wird nach Fusion mit dem 5'-benachbarten Bereich von Lbc3 in vollkommen gleicher Art und Weise durch Häm kontrolliert wie das mit einem 5'-benachbarten Bereich des Lbc3-Gens fusionierte CAT-Gen. Die Wirkung von Häm wird folglich nicht dadurch vermittelt, daß Häm mit der codierenden Sequenz in Wechselwirkung tritt, sondern eher dadurch, daß Häm mit den in der CAT-mRNA vorliegenden 5'- oder 3'-benachbarten Lbc3-Bereichen in Wechselwirkung tritt. Die Expression eines Gens, das lediglich den 5'-benachbarten Lbc3-Bereich und das Neo-Gen enthält, wird in gleicher Art und Weise durch Häm kontrolliert. Die Wirkung von intrazellulärem Häm auf die Genexpression kann somit durch eine Wechselwirkung mit der Leader-Sequenz vermittelt werden.
Die kurzen Leader-Sequenzen enthalten keine Translations-Startcodons. Der durch intrazelluläres Häm bewirkte oder vermittelte Regulationsmechanismus ist somit nicht mit Regulationsmechanismen verwandt, an denen falsche Startcodons beteiligt sind, vgl. die Beschriebung von Hunt, T., Nature 316 (1985), 580-581. Der in Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung beschriebene Regulationsmechanismus wird durch das mit einer Leader-Sequenz in Wechselwirkung tretende Häm bewirkt oder vermittelt, somit handelt es sich hier um einen neuen Regulationsmechanismus.
Die Gegenwart von Plasmiden in einer in natürlicher Umgebung vorliegenden Zelle stattet die Zelle mit einer Eigenschaft aus, die für die Zelle nur unter bestimmten Umständen von Vorteil ist. Eine auf einem Plamid codierte Eigenschaft kann beispielweise die Resistenz gegen ein Antibiotikum sein, das in der Umgebung vorliegt. Das Vorliegen eines Plasmides und die Synthese der durch das Plasmid codierten Genprodukte belasten jedoch den Energiestoffwechsel der Zelle und den Proteinsyntheseapparat, aus diesem Grunde wird eine Zelle, die ein Plasmid enthält, in einer solchen Umgebung verdrängt, in der die durch das Plasmid codierten Eigenschaften nicht gebraucht werden, und sie geht verloren.
Die vorstehend erwähnte Instabilität wird außerdem noch dadurch erhöht, daß Plasmide als Vektoren für die Synthese eines gewünschten Genproduktes verwendet werden, das durch die betreffende Zelle üblicherweise nicht erzeugt wird. Das Letztere bedeutet, daß Zellen, die solche Produkte synthetisieren, einem Selektionsdruck ausgesetzt werden müssen, um sicherzustellen, daß das gewünschte Genprodukt noch synthetisiert werden kann. Das bisherige Verfahren zum Erhalt einer hohen Expression eines bestimmten Genproduktes besteht darin, daß die Expression durch einen starken Promotor kontrolliert wird, wodurch eine hohe Konzentration der mRNA bewirkt wird, die in das betreffende Genprodukt translatiert wird.
Eine hohe Konzentration des Genproduktes kann jedoch auch durch eine effizientere Translation der betreffenden mRNA erhalten werden. Das Letztere bedeutet, daß die Synthese des Genproduktes sowohl auf transkriptionaler als auch auf translationaler Ebene kontrolliert wird, das heißt, daß die genetische Belastung einer Zelle, die ein bestimmtes Genprodukt synthetisiert, auf zwei Aktivitäten verteilt werden kann, anstatt wie üblich auf einer zu beruhen.
Die zwei Aktivitäten können somit in einer solchen Art und Weise manipuliert werden, daß bezüglich Konzentration des Genproduktes das gleiche Ergebnis erhalten werden kann, obwohl der Promotor nicht so stark ist wie die üblicherweise verwendeten Promotoren. Eine solche Verteilung auf zwei Aktivitäten bedeutet, daß die Zelle nicht so stark genetisch belastet wird, wie wenn die Synthese des Genproduktes lediglich durch einen starken Promotor kontrolliert wird. Ein Ergebnis davon ist, daß der Selektionsdruck auf die betreffende Zelle vermindert werden kann.
Außerdem ist es wichtig, die Ausnützung des Energiestoffwechsels und des Proteinsyntheseapparates in der Phase, in der die Synthese des gewünschten Genproduktes stattfindet, für die Zelle so zweckmäßig wie möglich zu gestalten.
Eine solche zweckmäßige Ausnützung des Energiestoffwechsels und des Proteinsyntheseapparates läßt sich vorzugsweise verbessern, indem man die späten Schritte der Synthese eines Genproduktes optimiert, anstatt die frühen Schritte zu optimieren.
Ein wichtiges Merkmal eines Genexpressionssystems besteht somit darin, daß die Expression des gewünschten Produktes durch eine Manipulation der äußeren Umgebung der Zelle von einer anfangs geringen Expression zu einer Überproduktion erhöht werden kann, wie die vorliegende Erfindung offenbart. Überdies ist eine induzierbare Optimierung der posttranskriptionalen Syntheseschritte - die in der vorliegenden Erfindung offenbart wurde - vorteilhafter als eine induzierte Optimierung der Transkription.
Frühere Verfahren zur Expression von Genen in Hefe setzen verschiedene Promotoren und Expressionsvektoren ein, vgl. z. B. EP 120 551 A2, worin die Verwendung von GAPDH- oder PyK-Hefe-Promotoren und außerdem von diese Promotoren umfassenden Expressionsvektoren beschrieben wird.
GB 2 137 208 A beschreibt außerdem die Verwendung des Promotors GAL1 in mehreren Expressionsvektoren.
Bei Verwendung dieser bereits bekannten Promotoren kann die Expression nur durch Erhöhung der Transkriptionsinitiationsfrequenz gesteigert werden. Die Verwendung dieser Promotoren beinhaltet folglich eine hohe genetische Belastung für die Zelle, eine unzweckmäßige Ausnützung des Energiestoffwechsels und des Syntheseapparates sowie eine daraus resultierende Instabilität, die bei Verwendung dieser Promotoren einen hohen Selektionsdruck auf den Wirtsorganismus erforderlich macht.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist somit die Offenbarung eines Verfahrens zur Verwendung von in Hefe aktiven Promotoren sowie Leader-Sequenzen, wodurch die Expression des nachfolgenden Gens unter eine neuartige Regulation auf posttranskriptionaler Ebene gestellt wird. Weitere Aufgaben der Erfindung sind die Bereitstellung von Kombinationen des Promotors und der Leader-Sequenz, wobei diese Kombinationen aus den 5'-benachbarten Bereichen von Pflanzen- Leghämoglobingenen erhalten worden sind und nachgewiesen wurde, daß sie in Hefe funktionell sind, außerdem ist eine Aufgabe der Erfindung die Bereitstellung von Plasmiden, welche die vorstehende Kombination von Promotor und Leader-Sequenzen umfassen.
Im erfindungsgemäßen Verfahren wird die Expression von Genen in Hefe beschrieben, wobei ein rekombinantes DNA-Molekül in eine Hefezelle eingeführt wird und die transformierten Hefezellen in einem Nährmedium gezüchtet werden, wobei das rekombinante DNA-Molekül die nachstehenden DNA-Fragmente enthält:
(a) ein zu exprimierendes Gen und funktionell damit verbunden
(b) einen 5'-benachbarten Bereich, enthaltend
(ba) einen Promotor und
(bb) eine Leader-Sequenz eines Pflanzen-Leghämoglobingens, eines Hefegens oder eines anderen Gens, wobei diese Gene auf posttranskriptionaler Ebene durch Häm, Häm-Analoga oder Häm-Vorläufer reguliert werden, oder eine aus der Leader-Sequenz abgeleitete Sequenz, die auf posttranskriptionaler Ebene durch Häm, Häm-Analoga oder Häm-Vorläufer regulierbar ist.
Auf diese Weise ist es möglich, durch Einführung eines Gens stromabwärts der Kombination und in einen geeigneten Vektor, der zur Replikation in Hefe befähigt ist, eine Synthese eines biologisch aktiven Produktes zu erhalten. Dieses Verfahren erlaubt eine Steigerung der Expression eines gewünschten Gens durch einen neuen Regulationsmechanismus, der auf posttransskriptionaler Ebene wirkt. Als besonderes Ergebnis wird eine verminderte genetische Belastung der Wirtszelle und eine optimale Ausnützung des Proteinsyntheseapparates und des Energiestoffwechsels der Wirtszelle und folglich eine gesteigerte Stabilität des Expressionsvektors in der Wirtszelle erhalten.
Eine besondere Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens verwendet als DNA-Fragment (ba) eine isolierte oder synthetisierte Promotor-Sequenz, die mit einem zweiten DNA-Fragment (bb) kombiniert wird, das eine isolierte oder synthetisierte Leader-Sequenz darstellt. Auf diese Weise ist es möglich, eine beliebige Leader-Sequenz aus Hefe, Pflanzen oder Tieren, die unter natürlichen Bedingungen unter einer posttranskriptionalen Regulation gemäß Anspruch 1 steht, mit einem beliebigen geeigneten Hefepromotor, Pflanzenpromotor oder einem anderen in Hefe funktionellen Promotor zu kombinieren.
Gemäß einer besonderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die intrazelluläre Häm-Konzentration durch Zusatz von solchen Kohlenstoffquellen, insbesondere nicht-fermentierbaren Kohlenstoffquellen, zum Nährmedium erhöht, die eine erhöhte intrazelluläre Häm-Konzentration bewirken. Auf diese Weise wird eine Induktion der Expression des gewünschten Gens erhalten, indem eine Kohlenstoffquelle zum Nährmedium zugegeben wird. Beispiele solcher Kohlenstoffquellen sind Glycerin und Succinat, die besonders bevorzugt sind, da sie billige und leicht verfügbare Kohlenstoffquellen darstellen. Außerdem kann Ethanol verwendet werden. Unter bestimmten Bedingungen kann die Hefe selbst dieses Ethanol produzieren, während sie wächst. Nach Beendigung des Wachstums wird das Ethanol verwertet, wodurch die Translation gesteigert wird.
Gemäß einer speziellen Ausführungsform kann der gleiche Effekt dadurch erhalten werden, daß die intrazelluläre Häm- Konzentration erhöht wird, indem eine oder mehrere Substanzen zum Nährmedium zugegeben werden, die aus der Gruppe bestehend aus Häm, Häm-Analoga und Häm-Vorläufern ausgewählt sind. Ein Beispiel eines Häm-Analogs ist Deuteroporphyrin IX, ein Beispiel eines Häm-Vorläufers ist 6-Aminolävulinsäure.
In einer speziellen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens stehen die in (bb) erwähnten Gene unter natürlichen Bedingungen unter einer durch intrazelluläres Häm bewirkten oder vermittelten Expressionsregulation. Somit wird auf einfache Weise eine Kombination aus Leader-Sequenz und Promotor-Sequenz erhalten, wobei erfindungsgemäß nachgewiesen wird, daß die Kombination in Hefe funktionell ist. Beispiele solcher Gene sind die Sojabohnen-Leghämoglobin gene, die Gene mit den nachstehenden 5'-benachbarten Bereichen, nämlich Lba mit der Sequenz:
Lbc1 mit der Sequenz:
Lbc2 mit der Sequenz:
und Lbc3 mit der Sequenz:
Eine weitere Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens verwendet ein DNA-Fragment, das identisch ist mit den 5'-benachbarten Bereichen des YEP Lb CAT-Gens mit der Sequenz:
davon abgeleitet ist oder diese umfaßt.
Eine weitere Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens beschreibt ein Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids durch Einführung eines rekombinanten Plasmides in eine Hefezelle, dadurch gekennzeichnet, daß als rekombinantes Plasmid ein Plasmid verwendet wird, das eine Promotor- Sequenz und eine Leader-Sequenz in einem DNA-Fragment mit einem 5'-benachbarten Bereich eines Pflanzen-Leghämoglobingens enthält.
Eine weitere Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens beschreibt das Verfahren zur Verwendung als rekombinantes Plasmid ein Plasmid, das zusätzlich einen 3'-benachbarten Bereich eines Pflanzen-Leghämoglobingens enthält.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner eine DNA-Sequenz, die eine Leader-Sequenz eines Pflanzen-Leghämoglobingens, eines Hefegens oder eines anderen Gens codiert, zur Verwendung als ein zweites DNA-Fragment bei Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens, wobei die Sequenz dadurch gekennzeichnet ist, daß sie eine kurze DNA-Sequenz darstellt, die in einen messenger-RNA-Strang transkribiert wird, der ein Ziel für eine durch intrazelluläres Häm bewirkte oder vermittelte Regulation ist. Beispiele solcher DNA-Sequenzen sind DNA-Sequenzen, die identisch sind mit einer Leader-Sequenz aus Pflanzen-Leghämoglobingenen, Hefegenen oder anderen Genen, davon abgeleitet sind oder diese umfassen, in denen diese Leader-Sequenz unter natürlichen Umständen ein Ziel für eine durch intrazelluläres Häm bewirkte oder vermittelte Regulation ist. Beispiele davon sind erfindungsgemäß DNA-Sequenzen, die identisch sind mit einer Leader-Sequenz aus den Sojabohnen-Leghämoglobingenen, nämlich
Lba mit der Sequenz:
AACTTGCATC GAACAATTAA TAGAAATAAC AGAAAATTAA AAAAGAAATA TG,
Lb1l mit der Sequenz: AACTTGCATT GAACAATAGA AAATAACAAA AAAAAGTAAA AAAGTGAAA
Lbc2 mit der Sequenz:
AACTTGCATT GAACAATAGA AATAACAACA AAGAAAATAA GTGAAAAAAG AAATATG,
und Lbc3 mit der Sequenz:
AACTTGCATT GAACAATTAA TAGAAATAAC AGAAAAGTAG AAAAGAAATA TG.
davon abgeleitet sind oder diese umfassen.
Ein weiteres Beispiel eines solchen DNA-Fragmentes ist ein Fragment, das identisch ist mit einer Leader-Sequenz aus dem YEP Lb CAT-Gen mit der Sequenz:
AACTTGCATT GAACAATTAA TAGAAATAAC AGAAAAGTAG AATTCTAAAA TG
davon abgeleitet ist oder diese umfaßt.
Außerdem betrifft die Erfindung ein beliebiges Plasmid, das bei Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens verwendet wird und dadurch gekennzeichnet ist, daß es ein erstes DNA-Fragment wie vorstehend definiert oder eine Kombination aus einem ersten DNA-Fragment und einem zweiten DNA- Fragment, auch wie vorstehend definiert, umfaßt. Geeignete erfindungsgemäße Plasmide sind YEP Lb CAT und YEP 5 Lb Km. Die erfindungsgemäßen Plasmide ergeben eine hohe Expression eines gewünschten Genproduktes, indem man die für diese Genprodukte codierenden Sequenzen insertiert.
Die Figuren zeigen
Fig. 1 DNA-Sequenzen der vier Sojabohnen-Leghämoglobingene Lba, Lbc1, Lbc2 und Lbc3. Die Sequenzen sind so nebeneinandergestellt, daß die Homologien deutlich werden. Im Sequenzschema bedeutet "-", daß in der betreffenden Position keine Base vorliegt. Die Namen der Gene und die stromaufwärts vom ATG-Startcodon gezählte Basenposition sind am rechten Rand des Sequenzschemas angegeben. Außerdem sind die wichtigen Sequenzen unterstrichen worden.
Fig. 2 Restriktionskarte des 12 kB EcoRI-Restriktionsfragmentes, welches das Lbc3-Gen enthält, und schematische Darstellung der Konstruktion der Plasmide pLpHH und pLpHX.
Fig. 3 Schematische Darstellung der Konstruktion von Plasmid p213-5'-Lb.
Fig. 4 Schematische Darstellung der Konstruktion von Plasmid pEJLb5'-3'-1.
Fig. 5 Schematische Darstellung der Konstruktion von Plasmid pEJLb5'-3'-CAT15.
Fig. 6 Restriktionskarte von Plasmid REP Lb CAT.
Fig. 7 Schematische Darstellung der Konstruktion von Plasmid pEJLb5'-3'-Km1.
Fig. 8 Restriktionskarte von Plasmid YEP 5Lb Km.
Fig. 9 Sequenzvergleich von Subregionen der Plasmide pEJLb5'-3'-CAT15 und pEJLb5'-3'-CAT101.
Fig. 10 Sequenzvergleich von Subregionen der Plasmide PEJ CAT-KN und PEJ CAT-BD.
Die Beispiele dienen zur Erläuterung der Erfindung.
Es soll so verstanden werden, daß der geübte Praktiker, dem die in den nachstehend beschriebenen Beispielen verwendeten Verfahren geläufig sind, andere Mikroorganismen und Plasmide kennt, die zum Zweck der vorliegenden Erfindung genauso verwendet werden können.

BEISPIEL 1

Sequenzbestimmung von 5'-benachbarten Bereichen von Sojabohnen-Leghämoglobingenen

Die vier Sojabohnen-Leghämoglobingene Lba, Lbc1, Lbc2 und Lbc3 werden aus einer Sojabohnen-Genbank bereitgestellt, wie von Jensen, E. ø., et al., Nature 291, Nr. 3817 (1981), 677-679 beschrieben. Die genetisch stabile, invariabele Inzucht-Sojabohnenart "Glycine max. var. Evans" wurde als Ausgangsmaterial zur Isolierung der für die Konstruktion der Genbank eingesetzte DNA verwendet. Die 5'-benachbarten Bereiche der vier Sojabohnen-Leghämoglobingene werden isoliert, wie von Jensen, E. ø., Ph. D. Thesis, Institut for Molekylaer Biologi, Århus Universitet (1985), beschrieben, und die Sequenzen der vier 5'-benachbarten Bereiche unter Anwendung des Didesoxy-Ketten-Terminations-Verfahrens bestimmt, wie von Sanger, F., J. Mol. Bio. 143 (1980), 161, beschrieben, und in Fig. 1 angegeben.

BEISPIEL 2

Konstruktion von YEP Lb CAT

Die Konstruktion ist in einer Folge von Verfahrensabschnitten wie nachstehend beschrieben durchgeführt worden.

Subclonierung des Lbc3-Gens

Das Lbc3-Gen wurde auf einem 12 kB-EcoRI-Restriktionsfragment aus der vorstehend erwähnten Sojabohnen-DNA-Genbank isoliert, wie von Wiborg et al., in Nucl. Acids Res. 10 (1982), 3487, beschrieben. Ein Teil des Fragmentes wird oben in Fig. 2 gezeigt. Dieses Fragment wurde durch die angegebenen Enzyme gespalten, so daß es anschließend an pBR322 ligiert werden konnte, wie in Fig. 2 dargestellt. Die resultierenden Plasmide Lbc3HH und Lbc3HX wurden sodann durch
PvuII gespalten und religiert, wodurch zwei Plasmide, genannt pLpHH und pLpHX, erhalten wurden.

Subclonierung von 5'-benachbarten Sequenzen aus dem Lbc3-Gen

Hierfür wurde pLpHH verwendet, wie in Fig. 3 dargestellt. Dieses Plasmid wurde mittels PvuII geöffnet und mit Exonuclease Ba131 behandelt. Diese Umsetzung wurde zu verschiedenen Zeiten gestoppt und die gekürzten Plasmide in Fragmente von pBR322 ligiert. Diese Fragmente waren vorher, wie in Fig. 3 dargestellt, in solcher Art und Weise behandelt worden,
daß sie an einem Ende eine DNA-Sequenz TTC---/AAG aufwiesen.
Nach der Ligierung fand eine Spaltung mit EcoRI statt, sodann wurden die Fragmente, die 5'-benachbarte Sequenzen enthielten, in mit EcoRI gespaltenes pBR322 ligiert. Diese Plasmide wurden in E. coli K803 transformiert und die Plasmide in den Transformanten mittels Sequenzanalyse getestet. Ein aus einer der Transformanten isoliertes Plasmid, p213 5'Lb, enthielt eine 5'-benachbarte Sequenz, die 7 Bp vor dem Lbc3-ATG-Startcodon endete, so daß die Sequenz folgendermaßen aussieht:
2kB
-5' benachbarte --- AAAGTAGAATTCTAAAATG
Lbc3-Sequenz.

Subclonierung des 3'-benachbarten Bereiches des Lbc3-Gens

Hierfür wurde pLpHX verwendet, das durch XhoII gespalten wurde. Die Enden wurden teilweise aufgefüllt und überschüssige DNA entfernt, wie in Fig. 4 dargestellt. Das dargestellte Fragment wurde in pBR322 ligiert, das wie in Fig. 4 dargestellt vorbehandelt worden war. Die Konstruktion wurde in E. coli K803 transformiert. Eine der Transformanten enthielt ein Plasmid, genannt Xho2a-3'Lb. Da die XhoII-Erkennungsstelle unmittelbar hinter dem Lb-Stoppcodon liegt (vgl. Fig. 2), enthielt das Plasmid etwa 900 Bp des 3'-benachbarten Bereichs, außerdem fing die Sequenz mit GAATTCTACAA--- an.

Konstruktion der Lb-Promotor-Kassette

Ein EcoRI/SphI-Fragment aus Xho2a-3'Lb wurde mit einem BamHI/EcoRI-Fragment aus p213-5'Lb gemischt. Diese zwei Fragmente wurden über die BamHI/SphI-Spaltungspunkte in ein pBR322-Derivat ligiert, bei dem die EcoRI-Erkennungssequenz entfernt worden war (vgl. Fig. 4). Die ligierten Plasmide wurden in E. coli K803 transformiert. Ein Plasmid in einer der Transformanten enthielt ein korrektes Fragment und wurde pEJLb5'-3'-1 genannt.

Konstruktion des chimären Lb/CAT-Gens

Das CAT-Gen von pBR322 wurde auf mehreren kleineren Restriktionsfragmenten isoliert, wie in Fig. 5 dargestellt. Der 5'-codierende Bereich wurde auf einem AluI-Fragment isoliert, das anschließend in pBR322 ligiert und behandelt wurde, wie in Fig. 5 dargestellt. Dieses wurde in E. coli K803 transformiert, eine selektierte Transformante enthielt ein Plasmid, genannt Alu11. Der 3'-codierende Bereich wurde auf einem Taql-Fragment isoliert. Dieses Fragment wurde mit Exonuclease Ba131 behandelt, worauf EcoRI-Linker zugefügt wurden. Darauffolgte eine Spaltung mit EcoRI und eine Ligierung in mit EcoRI gespaltenes pBR322. Das Letztere wurde in E. coli K803 transformiert und die Transformanten analysiert. Ein Plasmid, Taq 12, enthielt den 3'-codierenden Bereich des CAT-Gens plus 23 Bp 3'-benachbarte Sequenzen, so daß es mit der nachstehenden Sequenz terminiert wurde CCCCGAATTC. Anschließend wurden die folgenden Fragmente zusammen in mit EcoRI gespaltenes pEJLb5'-3'-1 ligiert: EcoRI/PvuII-Fragment aus AluII, PvuII/DdeI-Fragment aus pBR322 und DdeI/EcoRI-Fragment aus Taq 12. Das Letztere wurde in E. coli K803 transformiert. Eine selektierte Transformante enthielt ein korrektes Plasmid, das pEJLb5'-3' CAT15 genannt wurde.

Clonierung des chimären Lb/CAT-Gens in Hefeplasmid

Dieses chimäre Gen wurde auf einem BamHI/SphI-Fragment von pEJLb5'-3' CAT15 isoliert und in das mit den gleichen Enzymen gespaltene Hefeplasmid YEP24 ligiert. Nach der Transformation in E. coli K803 wurde eine selektierte Transformante untersucht. Sie enthielt das in Fig. 6 dargestellte Plasmid YEP Lb CAT. Dieses Plasmid wurde weiter in die Hefestämme Saccharomyces cerevisiae DBY747 und TM1 transformiert.

BEISPIEL 3

Konstruktion von YEP 5Lb Km

Das Neomycin-Phosphotransferase (NPTII)-Gen wurde aus pKM2 isoliert (Beck et al., Gene 19 (1982), 327). Der 5'-codierende Bereich aus diesem Gen wurde auf einem Sau3A-Fragment isoliert, wie in Fig. 7 dargestellt, und anschließend in pBR322 ligiert, wodurch ein Sau 13 genanntes Plasmid erhalten wurde. Der 3'-codierende und -benachbarte Bereich aus dem NPTII-Gen wurde auf einem PvuII-Fragment isoliert. Das Letztere wurde zusammen mit einem EcoRI/PvuII-Fragment aus Sau 13 in das mit EcoRI/PvuII gespaltene pEJLb5'-3'-1 ligiert. Nach Transformation in E. coli K803 wurde eine Transformante mit dem korrekten Plasmid pEJLb 5' Km 1 selektiert. Dieses Plasmid wurde später mittels BamHI und teilweise mittels PvuII auf eine solche Art und Weise gespalten, daß die gesamte 5'-benachbarte Lb-Sequenz + die NPTII-codierende Sequenz auf einem BamHI/PvuII-Fragment vorlagen. Dieses Fragment wurde in das mit BamHI/PvuII gespaltene YEP24 ligiert, wodurch das in Fig. 8 dargestellte Plasmid YEP 5Lb Km erhalten wurde. Dieses Plasmid wurde in den Hefestamm Saccharomyces cerevisiae TM1 transformiert.

BEISPIEL 4

Wirkung der Kohlenstoffquelle auf die Expression von CAT Saccharomvces cerevisiae DBY747, die das Plasmid YEP Lb CAT enthält, wird in Minimalmedium plus 2% einer Kohlenstoffquelle gezüchtet. Die Zellen werden bei einer Zelldichte von 5·106 Zellen pro ml geerntet. Die CAT-Aktivität wird gemessen, wie von Walker, Edlund, Boulet und Rutter, Nature 306 (1983), 557, beschrieben.
In Tabelle 1 wurde die CAT-Aktivität als Funktion der Kohlenstoffquelle dargestellt. Die höchste Aktivität, die durch Wachstum auf Succinat und Glycerin erhalten wurde, wurde willkürlich auf 100% gesetzt.

Tabelle 1

Kohlenstoffquelle Aktivität
Succinat 100
Glycerin 100
Glucose 28
Saccharose 18

BEISPIEL 5

Wirkung von Häm-Vorläufern und Häm-Analoga auf die Induktion von Genexpression

Saccharomvces cerevisiae TM1, der das Plasmid YEP Lb CAT enthielt, wird in Minimalmedium plus 2% Glucose plus 0,1% Tween® plus 20 ug/ml Ergosterol plus 50 ug/ml Methionin und außerdem einem der nachstehenden Häm-Analoga oder Häm- Vorläufer gezüchtet. Deuteroporphyrin IX (dp) bzw. Protoporphyrin (pp) wird zum Erhalt einer Endkonzentration von 5 ug/ml zugegeben. Hämin wird zum Erhalt einer Endkonzentration von 5 ug/ml zugegeben. δ-Aminolävulinsäure, δ-ALA, wird zum Erhalt einer Endkonzentration von 50 ug/ml zugegeben.
In Tabelle 2 wurde die CAT-Aktivität als Aktivität von Häm-Vorläufer bzw. Häm-Analog dargestellt. Die höchste Aktivität, die durch Zusatz von &-ALA oder dp erhalten wurde, wurde willkürlich auf 100% gesetzt.

Tabelle 2

Induktor CAT-Aktivität
Glucose + δ-ALA 100
Glucose + dp 100
Glucose + pp 50
Glucose + Hämin 25
Glucose 5

BEISPIEL 6

Insertion von Linkern in die Leader-Sequenz

Zwei synthetische DNA-Linker wurden eingefügt: einer unmittelbar über dem Startcodon, der die Erkennungssequenz des Enzyms BglII enthielt, und einer stromaufwärts der Cap- Additionsstelle, der die Erkennungsstelle für KpnI enthielt (vgl. Fig. 9). Die neue Konstruktion pEJ5'-3'-CAT101 wird in Fig. 9 mit der ursprünglichen Konstruktion verglichen.
Ein Vergleich der Expression aus den zwei Konstruktionen zeigt (Test wie in Beispiel 5):
Glucose Glucose + Häm Induktion
CAT15 0,11 6,01 55x
CAT101 0,22 1,72 8x
Die Zahlen geben nMol umgesetztes Chloramphenicol/mg Protein/ min an.
Dies macht deutlich, daß zwei spezifische Änderungen im 5'-Bereich zu einem Abfall der Häm-Induktion von 55x auf 8x führen.

BEISPIEL 7

Ersetzen des Lbc3-5'-Bereiches durch einen entsprechenden Bereich aus dem ILVI-Gen von S. cerevisiae

Der gesamte Lbc3-5'-Bereich wird aus CAT101 entfernt, indem es mit BamHI und BglII gespalten wird. Stattdessen wird ein DNA-Fragment mit 765 Bp aus dem ILV1-Gen eingefügt, das Promotor- und Leader-Sequenz enthält. Diese Konstruktion wird PEJ CAT-BD genannt.
In einer anderen Konstruktion wird der Lbc3-Promotor entfernt, wobei die Leader-Sequenz verbleibt. Dies wird durchgeführt, indem CAT101 mit BamHI und KpnI gespalten wird. Dieses Fragment wird durch ein Fragment mit 670 Bp aus ILV1 ersetzt, hierbei handelt es sich um den Promotor ohne die Leader-Sequenz. Dieses Plasmid wird PEJ CAT-KN genannt.
Die Konstruktionen werden schematisch erläutert: -Promotor Leader-Sequenz codierende Sequenz
Der Vergleich der Sequenzen wird in Fig. 10 erläutert. Test der Expression
Glucose Glucose + Häm Induktion
CAT-BD 1089 1162 keine
CAT-KN 789 1580 2 x
Die gleichen Einheiten wie in vorstehenden Tests.
Die zwei Konstruktionen unterscheiden sich nur in der Herkunft der Leader-Sequenz. Das Ergebnis zeigt, daß die Lbc3-Leader-Sequenz für die Induktion nötig ist. Der Induktionslevel liegt jedoch nicht so hoch wie bei CAT101, welches das Ausgangsmaterial darstellt; das ist möglicherweise auf die Tatsache zurückzuführen, daß die Konstruktion 13 Nucleotide näher am ATG startet und daher die mRNA 13 Nucleotide kürzer ist, die möglicherweise für die Induktion wichtig sind.
Alle diese Tests zeigen deutlich, daß die Häm-Induktion mit der Lbc3-Leader-Sequenz in Zusammenhang steht.
Es liegt auf der Hand, daß der Patentschutz der vorliegenden Erfindung nicht auf die hier angegebenen Beispiele beschränkt ist.
Die Erfindung setzt also nicht ausschließlich 5'-benachbarte Bereiche von Sojabohnen-Leghämoglobingenen ein. Es ist wohlbekannt, daß die Leghämoglobingene aller Leguminosenpflanzen die gleiche Aktivität besitzen, vgl. Appleby (1974) in "The Biology of Nitrogen Fixation", Quispel, A., Hrsg., North-Holland Publishing Company, Amsterdam Oxford, S. 499-554, außerdem wurde für das Feuerbohne-PvLb1-Gen gezeigt, daß mit den Sequenzen von Sojabohne-Lbc3 ein bestimmter Homologiegrad vorliegt. Daher umfaßt die Erfindung die Verwendung von 5'-benachbarten Bereichen von Leghämoglobingenen aus allen Pflanzen.
Erfindungsgemäß ist es auch möglich, solche Fragmente aus Pflanzen, Tieren oder Hefe-zu verwenden, die unter natürlichen Bedingungen die erfindungsgemäß beschriebene neue Regulationsaktivität bewirken oder vermitteln. Das Letztere betrifft insbesondere solche Fragmente, die aus DNA-Fragmenten aus Genbanken durch Hybridisierung mit markierten Sequenzen aus 5'-benachbarten Bereichen von Sojabohnen-Leghämoglobingen isoliert werden können.
Bekanntermaßen ist es möglich, Nucleotidsequenzen in nicht-essentiellen Subregionen von 5'-benachbarten Bereichen zu verändern, ohne daß dadurch eine veränderte Promotor-Aktivität und -Regulierbarkeit verursacht wird. Außerdem ist es bekanntermaßen möglich, durch Änderung der Sequenzen von wichtigen Subregionen von 5'-benachbarten Bereichen Bindungsaffinitäten zwischen Nucleotidsequenzen und denjenigen Faktoren oder Effektorsubstanzen zu verändern, die für die transkriptionale Initiation und die Translationsinitiation nötig sind, folglich ist es möglich, die Promotor-Aktivität und/oder -Regulierbarkeit zu verbessern. Die vorliegende Erfindung deckt selbstverständlich auch die Verwendung solcher veränderter Sequenzen von 5'-benachbarten Bereichen ab. Insbesondere kann die Verwendung von Leader-Sequenzen erwähnt werden, die über die natürliche Länge erweitert wurden, wobei die Expression eines gewünschten Genproduktes durch Verwendung eines solchen Fragmentes unter die neuartige erfindungsgemäße Regulation gestellt wird.

Claims

1. Verfahren zur Expression von Genen in Hefe, wobei ein rekombinantes DNA-Molekül in eine Hefezelle eingeführt wird und die transformierten Hefezellen in einem Nährmedium gezüchtet werden, wobei das rekombinante DNA-Molekül die nachstehenden DNA-Fragmente enthält:

(a) ein zu exprimierendes Gen und funktionell damit verbunden

(b) ein 5'-benachbarter Bereich enthaltend (ba) einen Promotor, und

(bb) eine Leader-Sequenz eines Pflanzen- Leghämoglobingens, eines Hefegens oder eines anderen Gens, wobei diese Gene auf posttranskriptionaler Ebene durch Häm, Häm- Ahaloga oder Häm-Vorläufer reguliert werden, oder eine aus der Leader-Sequenz abgeleitete Sequenz, die auf posttranskriptionaler Ebene durch Häm, Häm-Analoga oder Häm-Vorläufer regulierbar ist.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als DNA-Fragment (ba) eine isolierte oder synthetisierte Promotorsequenz verwendet wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als DNA-Fragment (bb) eine isolierte oder synthetisierte Leader-Sequenz verwendet wird.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die intrazelluläre Häm-Konzentration durch Zugabe von solchen Kohlenstoffquellen zum Nährmedium erhöht wird, die eine erhöhte intrazelluläre Häm-Konzentration bewirken.

E. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Kohlenstoffquelle Glycerin, Succinat oder Ethanol ist.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die intrazelluläre Häm-Konzentration dadurch erhöht wird, daß zu dem Nährmedium eine oder mehrere Stoffe zugegeben werden, die aus der Gruppe bestehend aus Häm, Häm-Analoga und Häm-Vorläufern ausgewählt sind.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß als Häm-Analog Deuteroporphyrin IX und/oder als Häm- Vorläufer Ö-Aminolävulinsäure verwendet wird.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die in (bb) genannten Gene unter natürlichen Bedingungen unter einer durch intrazelluläres Häm bewirkten oder vermittelten Expressionsregulation stehen.

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß das Pflanzen-Leghämoglobingen ein Sojabohnen- Leghämoglobingen ist.

10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß der 5'- benachbarte Bereich identisch ist mit 5'- benachbarten Bereichen des Lba-Gens mit der Sequenz:

davon abgeleitet ist oder diese umfaßt.

11. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß der 5'- benachbarte Bereich identisch ist mit 5'- benachbarten Bereichen des Lbc1-gens mit der Sequenz:

davon abgeleitet ist oder diese umfaßt.

12. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß der 5'-benachbarte Bereich identisch ist mit 5'- benachbarten Bereichen des Lbc2-Gens mit der Sequenz:

davon abgeleitet ist oder diese umfaßt.

13. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß der 5'- benachbarte Bereich identisch ist mit 5' benachbarten Bereichen des Lbc3-Gens mit der Sequenz:

davon abgeleitet ist oder diese umfaßt.

14. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß der 5'- benachbarte Bereich identisch ist mit 5'- benachbarten Bereichen des YEP Lb CAT-Gens mit der Sequenz:

davon abgeleitet ist oder diese umfaßt.

15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, wobei die Leader-Sequenz des Pflanzen-Leghämoglobingens den 49 bis 56 Nucleotiden entspricht, die dem ATG-Translationsinitiationscodon vorangehen.

16. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß das rekombinante Plasmid außerdem einen 3'-benachbarten Bereich eines Pflanzen- Leghämoglobingens enthält.

17. DNA-Sequenz, die eine Leader-Sequenz eines Pflanzen- Leghämoglobingens, eines Hefegens oder eines anderen Gens codiert, wobei diese Gene auf posttranskriptionaler Ebene durch Häm, Häm-Analoga oder Häm-Vorläufer reguliert werden, oder eine von dieser Leader-Sequenz abgeleitete Sequenz, die auf posttranskriptionaler Ebene durch Häm, Häm-Analoga oder Häm-Vorläufer regulierbar ist.

18. DNA-Sequenz nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß diese ein Ziel für eine durch intrazelluläres Häm bewirkte oder vermittelte Regulation ist.

19. DNA-Sequenz nach Anspruch 17 oder 18, wobei die Leader-Sequenz des Pflanzen-Leghämoglobingens den 49 bis 56 Nucleotiden entspricht, die dem ATG-Translationsinitiationscodon des Gens vorangehen.

20. DNA-Sequenz nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß diese identisch ist mit einer Leader-Sequenz aus Sojabohnen-Leghämoglobingenen, davon abgeleitet ist oder diese umfaßt.

21. DNA-Sequenz nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß diese identisch ist mit der Leader-Sequenz aus dem Lba-Gen mit der Sequenz:

AACTTGCATC GAACAATTAA TAGAAATAAC AGAAAATTAA AAAAGAAATA TG,

davon abgeleitet ist oder diese umfaßt.

22. DNA-Sequenz nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß diese identisch ist mit der Leader-Sequenz aus dem Lbc1-Gen mit der Sequenz:

AACTTGCATT GAACAATAGA AAATAACAAA AAAAAGTAAA AAAGTAGAAA AGAAATATG,

davon abgeleitet ist oder diese umfaßt.

23. DNA-Sequenz nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß diese identisch ist mit der Leader-Sequenz aus dem Lbc2-Gen mit der Sequenz:

AACTTGCATT GAACAATAGA AATAACAACA AAGAAAATAA GTGAAAAAAG AAATATG,

davon abgeleitet ist oder diese umfaßt.

24. DNA-Sequenz nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß diese identisch ist mit der Leader-Sequenz des Lbc3-Gens mit der Sequenz:

AACTTGATT GAACAATTAA TAGAAATAAC AGAAAAGTAG AAAAGAAATA TG,

davon abgeleitet ist oder diese umfaßt.

25. DNA-Sequenz nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß diese identisch ist mit der Leader -Sequenz des YEP Lb CAT-Gens mit der Sequenz:

AACTTGCATT GAACAATTAA TAGAAATAAC AGAAAAGTAG AATTCTAAAAA TG,

davon abgeleitet ist oder diese umfaßt.

26. Rekombinantes Plasmid, das eine DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 17 bis 25 enthält.

27. Plasmid nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, daß es das Plasmid YEP Lb CAT mit der in Fig. 6 gezeigten Restriktionskarte ist.

28. Plasmid nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, daß es das Plasmid YEP 5 Lb Km mit der in Fig. 8 gezeigten Restriktionskarte ist.