DE3851226T2

DE3851226T2 - Wachstumsfaktor-rezeptor.

Info

Publication number: DE3851226T2
Application number: DE3851226T
Authority: DE
Inventors: Enrique Rosengurt; Penella Woll; Ian Zachary
Original assignee: Imperial Cancer Research Technology Ltd
Current assignee: Cancer Research Horizons Ltd
Priority date: 1987-03-31
Filing date: 1988-03-31
Publication date: 1994-12-08
Anticipated expiration: 2008-04-01
Also published as: DE3851226D1; JP2728476B2; EP0359745A1; ATE110390T1; WO1988007551A2; EP0359745B1; WO1988007551A3; JPH02503195A

Description

Die Erfindung betrifft Verwendungen von Antagonisten und neue Antagonisten für die Bombesinrezeptoren.
Das Tetradecapeptid Bombesin der Amphibien (6) und die Säugetier-Peptide, die strukturell mit Bombesin verwandt sind, die das Gastrin-Releasing-Peptid (GRP) und die Neuromedine (7 bis 12) umfassen, sind Wachstumsfaktoren, die vermutlich an der Kontrolle der Zellproliferation beteiligt sind. Bombesinartige Peptide sind in hohen Konzentrationen im kleinzelligen Lungenkarzinom (18 bis 21) vorhanden, wo sie als autocrine Wachstumsfaktoren (22) wirken könnten. Die Bombesingruppe der Peptide zeigt in der Zelle mit Rezeptoren Wechselwirkung, aber während ein gewisses Wissen über die Chemie der Bombesingruppe der Peptide bekannt ist, ist sehr wenig über die Chemie der Rezeptoren der bombesinartigen Peptide bekannt. Angesichts der Entwicklung der bombensinartigen Peptide im Zellwachstum und der Einflüsse des Vorhandenseins oder Fehlens von Bombesin/Rezeptor-Wechselwirkungen am Zellwachstum ist eine ausführliche Untersuchung der Rezeptoren deutlich von Bedeutung.
Es wurden nun Verfahren entwickelt, die die Identifizierung bestimmter Rezeptoren für bestimmte Peptide der Bombesinfamilie erlaubten, die ihre Charakterisierung als neue Verbindungen erlaubte, und die vorliegende Erfindung betrifft solche Rezeptoren und zusätzlich Antagonisten und Antikörper für solche Rezeptoren. Die Bombesinfamilie der Peptide unterscheidet sich strukturell voneinander, aber besitzt auch eine gemeinsame 7-Aminosäuresequenz und es wurde angenommen, daß der Rezeptor, den die Erfinder identifiziert haben, als Rezeptor für verschiedene Mitglieder der Bombesinfamilie unabhängig von der Ausgangsart des bombesinartigen Peptids wirken kann.
Die sogenannte Substanz P ist ein 11-meres Neuropeptid von Interesse bei Untersuchungen der Schmerzweiterleitung und besitzt die Formel:
Arg-Pro-Lys-Pro-Gln-Gln-Phe-Phe-Gly-Leu-Met-NH&sub2;
Es gibt eine im Handel erhältliche strukturelle Variante der Substanz P, welche als [D-Arg¹, D-Pro², D-Trp7,9, Leu¹¹]-Substanz P bekannt ist und daher die Formel
D-Arg-D-Pro-Lys-Pro-Gln-Gln-D-Trp-Phe-D-Trp-Leu-Leu-NH&sub2;
besitzt, die als Antagonist A bezeichnet wurde und die auch als [D-Pro²]-Spantid bekannt ist. Sie wirkt als Bombesinantagonist. Es wurde gefunden, daß eine weitere im Handel erhältliche strukturelle Variante von Substanz P, die Antagonist D genannt wird, die auch als [D-Phe&sup5;]-Spantid bekannt ist und die Formel
D-Arg-Pro-Lys-Pro-D-Phe-Gln-D-Trp-Phe-D-Trp-Leu-Leu-NH&sub2;
besitzt, noch stärker als Bombesinantagonist wirksam ist als Antagonist A und daher auch von großem Interesse für die Modifikation des Zellwachstums, das durch das Vorhandensein von bombesinartigen Peptiden beeinflußt wird, ist.
Die Untersuchungen der Erfinder bezüglich Antagonist D zeigen die Wichtigkeit der strukturellen Variation an den Aminosäurepositionen 2 und 5 in Verbindungen dieses Typs an, wodurch verbesserte Bombesinantagonisten erzeugt werden können, und die Erfindung umfaßt neue Verbindungen der Formel (I)
D-Arg-X-Lys-Pro-Y-Gln-D-Trp-Phe-D-Trp-Leu-Leu-NH&sub2; (I)
worin X D-Pro oder Pro bedeutet und Y D-Trp bedeutet, und sie betrifft auch ihre Verwendung in einem Verfahren zur Behandlung des menschlichen oder tierischen Körpers durch Therapie oder in einem Diagnoseverfahren, das am menschlichen oder tierischen Körper durchgeführt wird.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen der Formel I können mit pharmazeutisch verträglichen Trägern oder Verdünnungsmitteln, z. B. herkömmlichen parenteralen Trägern, formuliert werden, so daß die Verbindungen I parenteral verabreicht werden können, wenn sie von Interesse zur Verwendung bei einem Verfahren zur Behandlung des menschlichen oder tierischen Körpers zur Diagnose oder Therapie sind, und genauer bei der Diagnose oder Therapie von Krebsformen, bei denen unkontrolliertes Zellwachstum in Zusammenhang mit Störungen der Proteine der Bombesinfamilie steht. Die Verbindungen I sind auch zur Verwendung zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung unkontrollierter Zellproliferation von Interesse.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen I und Antagonist D sind ebenfalls zur Verwendung bei der in vitro Diagnose der unkontrollierten Zellproliferation durch ein Verfahren, bei dem man den Antagonisten oder den Antikörper in Kontakt mit einer Körperprobe von einem Wirt, der vermutlich an unkontrollierter Zellproliferation leidet, bringt, von Interesse. Das Verfahren ist besonders nützlich zur Diagnose von Krebszuständen durch Histologie oder einem Serumassay.
Die Isolierung und molekulare Charakterisierung der Rezeptoren benötigt ein Verfahren zu ihrer Identifizierung, und die Erfinder haben ein System entwickelt, bei dem bestimmte bifunktionelle Vernetzungsreagentien, die bereits zur Identifizierung von Membranrezeptoren in anderen Systemen (23 bis 28) verwendet wurden, verwendet werden. Sie verwendeten das Vernetzungsmittel Ethylenglykol-bis(succinimidylsuccinat), um kovalent ¹²&sup5;I-markiertes Gastrin-Releasing-Peptid (¹²&sup5;I-GRP) an ein Oberflächenprotein in Swiss-3T3-Zellen zu knüpfen. Dieses Oberflächenprotein zeigt bei Isolierung aus den Swiss-3T3-Zellen die Eigenschaften eines spezifischen Rezeptors für die Peptide der Bombesinfamilie. Dieses Protein war in anderen Zellinien nicht vorhanden, die keine Rezeptoreigenschaften für die bombesinartigen Peptide zeigen.
Genauer, der Polypeptidrezeptor kann nach einem Verfahren isoliert werden, bei dem man eine Kultur von Swiss-3T3-Zellen in einem Kulturmedium einschließlich ¹²&sup5;I-markiertes Gastrin-Releasing-Peptid (¹²&sup5;I-GRP) inkubiert, die ¹²&sup5;I-GRP behandelten Swiss-3T3-Zellen in Gegenwart eines bifunktionellen Vernetzungsmittels weiter inkubiert und das so erhaltene ¹²&sup5;I-GRP/Vernetzungsreagens/Polypeptidkonjugat solubilisiert, um das Peptid aus der Zelloberfläche freizusetzen.
Swiss-3T3-Zellen sind weithin für experimentelle Zwecke verfügbar und sind von der American Type Culture Collection in Rockville, Maryland, USA unter der Hinterlegungs-Nr. ATCC-CCL92 erhältlich.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1

Materialien und Methoden

Materialien

Bombesin und Litorin wurden von Sigma bezogen. GRP, das 14-27 Aminosäurefragment von GRP und [D-Arg¹, D-Pro², D-Trp7,9, Leu¹¹]-Substanz P wurden von Bachem Fine Chemicals (Saffrom Walden, UK) bezogen, und das 1-16 Fragment von GRP und Neuromedin B wurden von Peninsula Laboratories (San Carlos, CA) bezogen. Hochgereinigter Plättchenwachstumsfaktor (PDGF) wurde von Bioprocessing bezogen. Ethylenglykol-bis(succinimidylsuccinat) (EGS), Disuccinimidylsuberat (DSS), Dithiobis(succinimidylpropionat) (DSP) und Bis[2-(succinimidooxycarbonyloxy)ethyl]sulfon (BSCOES) wurden von Pierce Chemical Co. bezogen. ¹²&sup5;I-GRP (2000 Ci/mmol; 1 Ci = 37 GBq) wurde von dem Radiochemical Centre (Amersham, UK) bezogen oder wurde durch radioaktive Markierung von GRP mit ¹²&sup5;I unter Verwendung des lösliche Lactoperoxidase-Verfahrens (29, 30) hergestellt. Das markierte Peptid wurde von nicht-umgesetztem Na ¹²&sup5;I, wie beschrieben (8), abgetrennt. ¹²&sup5;I-GRP zeigte eine mitogene Aktivität innerhalb eines ähnlichen Konzentrationsbereiches, wie er mit dem nicht-markierten Peptid beobachtet wurde. Alle anderen verwendeten Reagentien hatten den höchstmöglich verfügbaren Reinheitsgrad.

Chemische Vernetzung von ¹²&sup5;I-GRP an die Rezeptoren

Konfluente und ruhende Kulturen von Swiss-3T3-Zellen wurden bei 15ºC in 1 ml eines Mediums aus 0,14 M NaCl, 5 mM KCl, 0,01 M Na&sub2;HPO&sub4;, 1,8 mM KH&sub2;PO&sub4;, 1,8 mM CaCl&sub2;, 1 mM MgCl&sub2;, 25 mM 4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinethansulfonsäure (Bindungsmedium), pH 7,0, supplementiert mit 0,1% BSA und der geeigneten Konzentration an ¹²&sup5;I-GRP in Gegenwart oder Abwesenheit eines 500fachen Überschusses an nicht-markiertem GRP inkubiert. Nach 2,5 Stunden wurden die Zellen dreimal bei 15ºC mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen und dann 15 Minuten bei 15ºC in 1 ml Bindungsmedium, pH 7,4, in Gegenwart des geeigneten Vernetzungsmittels bei der angegebenen Konzentration inkubiert. Die Vernetzungsmittel (EGS, DSS, DSP und BSCOES) wurden in Dimethylsulfoxid unmittelbar vor Gebrauch aufgelöst und wurden dem Medium zugesetzt, wodurch eine Endkonzentration an Dimethylsulfoxid von 1-2% erhalten wurde. Die Kulturen wurden rasch 2· mit PBS bei 4ºC gespült und in 0,1 ml von zweimal Probenpuffer 0,2 M Tris-HCl, pH 6,8, 10% (Gew./Vol.) Glycerin, 6% Natriumdodecylsulfat (SDS) (Gew./Vol.), 4% β-Mercaptoethanol (Vol./Vol.) und 2 mM Ethylendiaminotetraessigsäure solubilisiert. Die Proben wurden sofort 3 bis 5 Minuten lang auf 100ºC erhitzt und mit entweder ein- oder zweidimensionaler Gelelektrophorese analysiert.

SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese

Die Stabgelelektrophorese wurde unter Verwendung von 7,5% Acrylamid im Trenngel und 5% im Sammelgel und 0,1% SDS (31) durchgeführt. Nach der Elektrophorese wurden die Gele gefärbt, entfärbt und auf Papier für die Autoradiographie mit einem Fuji Röntgenfilm (Fuji Photo Film Co., Ltd., Japan) getrocknet. Die getrockneten Gele wurden dem Film 4 bis 8 Tage lang exponiert. Die zweidimensionale Gelelektrophorese wurde, wie von O'Farrell (32) beschrieben, unter Verwendung der isoelektrischen Fokussierung in der ersten Dimension und der SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) (8% Polyacrylamid) in der zweiten Dimension durchgeführt. Die für die isoelektrische Fokussierung hergestellten Proben enthielten 1,4% LKB-Ampholyte, pH 5-7, plus 0,6% LKD-Ampholyte, pH 3,5-10, 6 M Harnstoff und 2% Nonidet P-40. Die Banden mit einem Molekulargewicht von 75.000-85.000 aus den Autoradiogrammen wurden unter Verwendung eines Joyce-Loebl-Doppelstrahldensitometers gescannt und die Flächen unter den spezifischen Peaks wurden mit einem Hewlett-Packard-Digitalisiergerät gemessen.
Das Zellkulturverfahren (33), die Assays auf die DNA-Synthese durch ³H-Thymidin-Inkorporation (34) und auf die ¹²&sup5;I-GRP Bindung an intakte Zellen (13) wurden wie früher beschrieben durchgeführt.

Ergebnisse und Diskussion

Wenn die Kulturen aus konfluenten und ruhenden Swiss-3T3- Zellen bei 15ºC mit ¹²&sup5;I-GRP inkubiert wurden, erreichte die zellassoziierte Radioaktivität ein Maximum nach 2,5 Stunden (Fig. 1A) und war beträchtlich erhöht, verglichen mit der Oberflächenbindung bei entweder 37ºC oder 4ºC (unveröffentlichte Beobachtung). Die Analyse der Zellen, die mit 5 nM ¹²&sup5;I-GRP bei 15ºC 2,5 Stunden lang inkubiert worden waren und mit den homobifunktionellen Vernetzungsmitteln EGS, DSS, DSP oder BSCOES behandelt worden waren, durch SDS-PAGE zeigte das Vorhandensein einer einzelnen Hauptbande mit einem Molekulargewicht von 75.000-85.000 (Fig. 1B). Identische Ergebnisse wurden unter Verwendung von entweder im Handel erhältlichem ¹²&sup5;I-GRP oder mit ¹²&sup5;I im Labor der Erfinder markiertem GRP erhalten. In Gegenwart eines 500fachen Überschusses an unmarkierten GRP(+) war diese Bande vollständig verschwunden. EGS zeigt die größte Effizienz der Vernetzung und dieses Mittel wurde daher bei den anschließenden Versuchen verwendet. Der Effekt von EGS auf den Gehalt des Proteins mit einem Molekulargewicht von 75.000-85.000 war konzentrationsabhängig. Die halbmaximale Wirkung von EGS wurde bei einer Konzentration von 2 mM (Fig. 1C) erreicht. Die Rangordnung der Vernetzungseffizienz (EGS > DSS > DSP > BSCOES) kann auf die Kettenlänge der Arme dieser bifunktionellen Moleküle zurückzuführen sein. So war BSCOES, das die kürzeste Kettenlänge hat, praktisch ineffektiv (Fig. 1B). Das Protein mit einem Molekulargewicht von 75.000-85.000 erschien als ein aus mehreren Komponenten zusammengesetzter Fleck, der mit einem isoelektrischen Punkt von 6,4 bis 6,9 wanderte, wenn vernetzte Kulturen von Swiss-3T3-Zellen durch die zweidimensionale Gelelektrophorese unter Verwendung der isoelektrischen Fokussierung in der ersten Dimension und der SDS-PAGE in der zweiten Dimension analysiert wurden (Ergebnisse nicht gezeigt)
Die Bande mit einem Molekulargewicht von 75.000-85.000 wurde nicht erhalten, wenn die Vernetzungsreaktion entweder in Abwesenheit des Vernetzungsmittels, in Plastikschalen ohne Zellen oder unter Verwendung anderer Zellinien, einschließlich Rat-1, ganzen Mausembryonen-Fibroblasten und Balbc/3T3, die weder eine signifikante spezifische ¹²&sup5;I-GRP-Bindung zeigen noch mitogen auf Bombesin verwandte Peptide (13) ansprechen, verwendet wurden. Die Möglichkeit, daß die affinitätsmarkierte Bande ein Abbauprodukt eines Proteins mit einem höheren Molekulargewicht ist, wurde durch Extrahieren von Kulturen nach der Vernetzungsreaktion in Gegenwart der Protease-Inhibitoren Aprotinin (100 ug/ml), Pepstatin (4 ug/ml), Phenylmethylsulfonylfluorid (2 mM) und Ethylenglykol-bis-(β-aminoethylether)-N,N'-tetraessigsäure (4 mM) durchgeführt wurde. Diese Behandlungen zeigten keine signifikante Wirkung auf den Gehalt des Proteins mit einem Molekulargewicht von 75.000-85.000 und führten nicht zum Auftreten irgendwelcher Proteine mit höherem Molekulargewicht. In einem anderen Versuch, der bei 4ºC durchgeführt wurde, um den Einbau und Abbau des Liganden zu verhindern, wurden identische Ergebnisse zu denen, die in Fig. 1 gezeigt sind, erhalten (Ergebnisse nicht gezeigt). So war das Protein mit einem Molekulargewicht von 75.000-85.000 weder eine intrazelluläre Komponente, die mit eingebautem ¹²&sup5;I-GRP assoziiert ist, noch ein Produkt eines Abbaupeptids, noch ein Fragment, das aus der Proteolyse eines größeren Moleküls entstand. Zusätzlich führte die Behandlung mit 0,6 M 2-Mercaptoethanol nicht zum Auftreten zusätzlicher Banden mit niedrigerem Molekulargewicht, was nahelegt, daß das Protein mit einem Molekulargewicht von 75.000-85.000 aus einer einzelnen Polypeptidkette besteht. Diese wichtigen Kontrollen legen stark nahe, daß die Bande mit dem Molekulargewicht von 75.000-85.000 eine Oberflächenkomponente der Swiss-3T3-Zellen war, die in enger Beziehung zu dem Rezeptor für Peptide der Bombesinfamilie steht.
Die vorstehende Schlußfolgerung wurde weiter durch Vernetzen von ¹²&sup5;I-GRP mit Kulturen, die in Gegenwart von verschiedenen Konzentrationen an nicht-markiertem Peptid inkubiert wurden, unterstützt. Die Abnahme des Gehalts der Bande mit einem Molekulargewicht von 75.000-85.000 mit ansteigenden Konzentrationen an unmarkiertem GRP (Fig. 2A, offene Symbole) hat eine enge Parallele mit der Fähigkeit von GRP, die Bindung einer identischen Konzentration an ¹²&sup5;I-GRP in einem parallelen Kulturansatz zu hemmen (Fig. 2A, geschlossene Symbole). Die Vernetzung von ¹²&sup5;I-GRP an Swiss-3T3-Zellen wurde auch deutlich durch andere Peptide, die strukturell mit GRP verwandt sind, einschließlich Bombesin, Neuromedin B, Litorin und des Bombesinantagonisten [D-Arg¹, D-Pro², D-Trp7,9, Leu¹¹]-Substanz P (13, 17, 35, 36) gehemmt. Das aminoterminale GRP-Fragment (GRP (1-16)), das weder die ¹²&sup5;I-GRP-Bindung hemmt, noch die DNA-Synthese stimuliert (13), verursachte keine Verringerung des Gehalts an dem Protein mit einem Molekulargewicht von 75.000-85.000 (Tabelle 1). Um die Spezifität, mit der ¹²&sup5;I-GRP das Protein mit einem Molekulargewicht von 75.000-85.000 erkennt, festzustellen, wurden Swiss-3T3-Zellen mit ¹²&sup5;I-GRP in Gegenwart einer Vielzahl von anderen Mitogenen für diese Zellen inkubiert. Wie in Tabelle 1 gezeigt, wurde der Gehalt des Proteins, das durch Behandlung mit EGS erhalten wurde, nicht wesentlich durch Sättigungskonzentrationen von PDGF, Epidermiswachstumsfaktor (EGF), Vasopressin, Insulin und Phorbol 12,13-Dibutyrat beeinträchtigt (1, 37, 38). Zusätzlich hatten die Neuropeptide Substanz P, Substanz K und Somatostatin auch keine Wirkung auf die Affinitätsmarkierung der Bande mit einem Molekulargewicht von 75.000-85.000 (Tabelle 1). Dieses Ergebnis entspricht der Erkenntnis, daß die Bindung von ¹²&sup5;I-GRP an intakte 3T3-Zellen durch diese Mitogene ebenfalls nicht gehemmt wird (13)
Die Schlußfolgerung, daß das Protein mit einem Molekulargewicht von 75.000-85.000 eine Hauptkomponente des Rezeptors für die Peptide der Bombesinfamilie in Swiss-3T3-Zellen ist, wurde weiter durch Messen des Gehalts an diesem Protein als Funktion des mit radioaktivem Iod markierten Liganden erhärtet. Die Fig. 2B zeigt, daß die Vernetzung von ¹²&sup5;I-GRP an die Bande mit einem Molekulargewicht von 75.000-85.000 in sättigbarer Weise mit zunehmender Konzentration des markierten Peptids zunahm. Eine doppelt reziproke Auftragung dieser Daten (nicht gezeigt) ergibt eine gerade Linie und ergab einen Wert für Kd von 1 nM, der sich sehr gut mit dem Kd (0,5 · 10&supmin;&sup9; M), erhalten aus einer Scatchard-Analyse der Bindungskurven (13), vergleichen ließ. Ferner steht die Abhängigkeit der Affinitätsmarkierung des Proteins mit einem Molekulargewicht von 75.000-85.000 von der ¹²&sup5;I-GRP Konzentration in enger Parallele mit der Fähigkeit des Peptids, eine Vielzahl von frühen biologischen Antworten (16, 17) und DNA-Synthese (13) in ruhenden Swiss-3T3-Zellen zu stimulieren. Bei höheren Konzentrationen von ¹²&sup5;I-GRP wurde eine Bande mit einem höheren Molekulargewicht von etwa 160.000 beobachtet (Fig. 2B). Diese Bande stellte 4% des gesamten vernetzten Materials dar und war entweder bei niedrigen Gehalten an ¹²&sup5;I-GRP oder bei 4ºC fast nicht nachweisbar.
Fußnote¹: Die verwendeten Abkürzungen sind: GRP, Gastrin Releasing Peptid; BSA, Rinderserumalbumin; PBS, phosphatgepufferte Kochsalzlösung; EGF, Epidermiswachstumsfaktor; PDGF, Plättchenwachstumsfaktor, EGS, Ethylenglykol-bis- (succinimidylsuccinat) DSS, Disuccinimidylsuberat; DSP, Dithio-bis(succinimidylpropionat) BSCOES, Bis[2-(succinimidooxycarbonyloxy)ethyl]sulfon; SDS-PAGE, Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese.

Beispiel 2

[DPhe-&sup5;-Spantid ist ein starker Inhibitor der GRP-vermittelten Mitogenese

Die Substanz P besitzt eine geringe Homologie bezüglich der Aminosäuresequenz mit Bombesin (Tabelle 2) und hemmt weder die Bindung von GRP an Swiss-3T3-Zellen, noch stimuliert sie die DNA-Synthese. Jedoch wurde gefunden, daß [DPro²]-Spantid (Antagonist A, Tabelle 2), das als Substanz P Antagonist synthetisiert wurde, ein Bombesinantagonist in den Pankreasacinuszellen A war und die wachstumsfördernden Wirkungen von Bombesin in Swiss-3T3-Zellen blockierte. Um einen stärkeren Antagonisten der bombesinartigen Peptide zu identifizieren, wurden 10 Substanz P Antagonisten in einer Konzentration von 50 uM (Tabelle 2) auf ihre Fähigkeit, die durch GRP-stimulierte Mitogenese zu hemmen (Säuger homolog von Bombesin in Swiss-3T3-Zellen), getestet. [DPhe&sup5;]-Spantid (Antagonist D) war deutlich der stärkste GRP-Antagonist. Im Gegensatz dazu waren die Peptide B, C, E, F, G, H, J und K weniger stark als entweder A oder D. Spantid (B) besaß keine antagonistische Aktivität, selbst in einer Konzentration von 100 uM. Keines der Peptide stimulierte die DNA-Synthese bei Test in einer Konzentration von 20 uM mit Insulin in einer Konzentration von 1 ug/ml, d. h. keines zeigte irgendeine agonistische Aktivität.
Nach der Identifizierung von [DPhe&sup5;]-Spantid als den aussichtsreichsten GRP-Antagonisten wurde die Wirksamkeit von [DPhe&sup5;]-Spantid mit derjenigen von [DPro²]-Spantid verglichen. Die Fig. 3 zeigt, daß [DPhe&sup5;]-Spantid in einer Konzentration von 20 uM deutlich die Konzentration an GRP erhöhte, die benötigt wurde, um eine halbmaximale Stimulierung der DNA-Synthese zu erreichen, wohingegen die Zugabe von [DPro²]-Spantid auch in einer Konzentration von 20 uM nur eine geringe Wirkung besaß. Die Hemmung der DNA-Synthese durch [DPhe&sup5;]-Spantid wurde durch hohe Konzentrationen an GRP vollständig umgekehrt, was zeigt, daß dessen Hemmwirkung kompetitiv und reversibel war. Die Dosisantwortkurven für die zwei Antagonisten in Gegenwart von 3,6 nM GRP sind in Fig. 3 (rechts) gezeigt. Die halbmaximale Hemmung der DNA- Synthese wurde mit 22 uM [DPhe&sup5;]-Spantid und 118 uM [DPro²]-Spantid erzielt. So ist [DPhe&sup5;]-Spantid 4,5fach stärker als [DPro²]-Spantid bezüglich der Hemmung der GRP-induzierten DNA-Synthese.
Die folgenden Beispiele zeigen, daß Antagonist D alle Ereignisse, die durch Bombesin/GRP initiiert wurden, auf spezifische Weise hemmt.

Beispiel 3

[DPhe-&sup5;]-Spantid bindet kompetitiv an den GRP-Rezeptor

Die vorstehenden Ergebnisse zeigen, daß [DPhe&sup5;]-Spantid ein starker Inhibitor der GRP-induzierten DNA-Synthese ist, der Spezifität gegenüber anderen Mitogenen zeigt. Um diesen Wirkmechanismus zu erhellen, untersuchten die Erfinder die Wirkung von [DPhe&sup5;]-Spantid auf die spezifische Bindung von ¹²&sup5;I-GRP an Swiss-3T3-Zellen. Fig. 4 (links) zeigt, daß sowohl [DPro²]-Spantid als auch [DPhe&sup5;]-Spantid eine konzentrationsabhängige Hemmung der spezifischen Bindung von ¹²&sup5;I-GRP (1 nM) verursachte. Die halbmaximale Hemmung der Bindung wurde mit 2,3 uM [DPhe&sup5;]-Spantid und 14 uM [DPro²]-Spantid erzielt, das bedeutet einen 6,1fachen Unterschied in der Wirksamkeit. Dies stimmt mit den relativen Wirkungen der zwei Antagonisten bezüglich der Hemmung der durch GRP induzierten DNA-Synthese überein.
Die Bindung verschiedener Konzentrationen an ¹²&sup5;I-GRP wurde in Abwesenheit und Anwesenheit von 10 uM [DPhe&sup5;]-Spantid gemessen. Eine doppelt reziproke Auftragung dieser Daten (Fig. 4, Mitte) zeigt, daß [DPhe&sup5;]-Spantid deutlich die Affinität der Rezeptoren von ¹²&sup5;I-GRP verringert, obwohl die Anzahl der Bindungsstellen unverändert ist. Dies stimmt mit zuvor mit [DPro²]-Spantid erhaltenen Ergebnissen überein und legt stark nahe, daß diese Peptide kompetitiv an den GRP-Rezeptor binden.
Um diese Entdeckungen weiter zu substantiieren, wurden die Wirkungen von zwei Antagonisten auf die Affinitätsmarkierung des jüngst beschriebenen Proteins mit einem Molekulargewicht von 75.000-85.000, das ein vermutlicher Bombesinrezeptor ist, untersucht (Fig. 4, rechts). Sie konnten beide differentiell das Protein mit einem Molekulargewicht von 75.000-85.000, erhalten durch Vernetzung von ¹²&sup5;I-GRP an Swiss-3T3-Zellen mit EGS, hemmen. Die halbmaximale Hemmung (erhalten durch Scanning-Densitometrie der Autoradiogramme) wurde mit [DPhe&sup5;]-Spantid bei einer Konzentration von 5,5 uM und [DPro²]-Spantid bei einer Konzentration von 20 uM erhalten, was erneut die Überlegenheit des [DPhe&sup5;]-Spantids zeigt.

Beispiel 4

[DPhe-&sup5;]-Spantid hemmt die frühen Ereignisse, die durch GRP hervorgerufen werden

Eines der frühesten Ereignisse, das durch die Wirkung von Bombesin oder GRP auf ruhende Swiss-3T3-Zellen stimuliert wird, ist eine Erhöhung der cytosolischen Ca²&spplus;-Konzentration ([Ca²&spplus;]i). Fig. 5 (links) zeigt, daß die Erhöhung an [Ca²&spplus;]i, die durch Zugabe von GRP (1 nM) zu ruhenden Swiss- 3T3-Zellen hervorgerufen wird, durch Zugabe von [DPro²]-Spantid in einer Konzentration von 20 uM, aber nicht in einer Konzentration von 5 uM, verhindert wurde. Im Gegensatz dazu war [DPhe&sup5;]-Spantid in einer Konzentration von 5 uM wirksam, was zeigt, daß [DPhe&sup5;]-Spantid mindestens vierfach stärker ist als [DPro²]-Spantid in diesem Assay. Diese Effekte waren spezifisch und reversibel, da [DPhe&sup5;]-Spantid in einer Konzentration von 5 uM eine Antwort auf PDGF nicht verhinderte und weil die Wirkungen des Antagonisten bezüglich der Hemmung der Ca²&spplus;-Mobilisation als Antwort auf 5 nM GRP durch Zugabe von GRP in einer Konzentration von 50 nM umgekehrt wurde.
Die Hemmung der Bindung von ¹²&sup5;I-EGF durch GRP, die durch den Proteinkinase-C-Stoffwechselweg vermittelt wird, wurde konzentrationsabhängig durch [DPro²]-Spantid und [DPhe&sup5;]-Spantid umgekehrt (Fig. 5, rechts). Die halbmaximale Umkehrung der Hemmung wurde mit [DPhe&sup5;]-Spantid in einer Konzentration von 8,7 uM und [DPro²]-Spantid in einer Konzentration von 30 uM erhalten. Diese Feststellungen untermauern die Schlußfolgerung, daß [DPhe&sup5;]-Spantid ein starker GRP-Antagonist ist, weiter.

Beispiel 5

Zusätzlich zum Nachweis der Hemmung der zellulären Wirkungen von Bombesin/GRP an Maus 3T3-Zellen wurde nun gezeigt, daß die Antagonisten A und D das Wachstum von SCLC-Zellen spezifisch und reversibel hemmen können.
Es ist bekannt, daß SCLC bombesinartige Peptide sezerniert, von denen vorgeschlagen wurde, daß sie als autokrine Wachstumsfaktoren wirken. Somit ist es plausibel, aber bis jetzt noch unbewiesen, daß ein Antagonist gegen Bombesin/GRP das SCLC-Wachstum hemmt, und so haben die Erfinder nun die Wirkungen von [DPro²]-Spantid und [DPhe&sup5;]-Spantid auf SCLC in vitro getestet.
Die Fig. 6 zeigt, daß die Wachstumsgeschwindigkeit der SCLC-Linien H69, H128 und H417 in serumfreiem Medium durch Zugabe von [DPro²]-Spantid in einer Konzentration von 150 uM, einer Konzentration, die reversibel die GRP induzierte Mitogenese in Swiss-3T3-Zellen hemmt, gestoppt wurde. Die Wachstumshemmung durch den Antagonisten in den SCLC-Zellinien wurde durch Waschen der Zellen und ihrer Resuspension in einem serumfreien Medium umgekehrt.
Die Wirkungen von [DPro²]-Spantid und [DPhe&sup5;]-Spantid auf H69-Zellen sind in Fig. 7 verglichen. Die Zellen erreichten eine 10fache Erhöhung ihrer Anzahl in etwa 12 Tagen in einem serumfreien Medium (kleines Bild). Beide Antagonisten hemmten das Wachstum dosisabhängig. Die halbmaximale Wirkung wurde bei einer Konzentration von 24 uM und [DPhe&sup5;]-Spantid und bei 82 uM mit [DPro²]-Spantid beobachtet. Der Wirksamkeitsunterschied liegt in der gleichen Größenordnung, wie an Swiss-3T3-Zellen gezeigt und stützt die Behauptung, daß bombesinartige Peptide (oder Vasopressin) wichtige Wachstumfaktoren für SCLC sein können.
Diese Ergebnisse zeigen die mehr als 5fache Wirksamkeit von Antagonist D gegenüber Antagonist A.

Legenden zu den Figuren

Fig. 1: A. Zeitabhängigkeit der Bindung von ¹²&sup5;I-GRP an Swiss-3T3-Zellen bei 15ºC. Die Kulturen wurden gewaschen und dann bei 15ºC in 1 ml Bindungsmedium, welches ¹²&sup5;I-GRP (2 nM) enthielt, inkubiert. Nach verschiedenen Zeiten wurden die Zellen rasch viermal mit kalter (4ºC) PBS, supplementiert mit 1 mg/ml Rinderserumalbumin (BSA), gewaschen und dann 6 Minuten lang mit 1 ml 0,2 M Essigsäure, 0,5 M NaCl bei 4ºC inkubiert, um den mit der Zelloberfläche assoziierten Liganden zu entfernen. Dieses Medium wurde dann zur Bestimmung der Radioaktivität entfernt, und dann wurde die verbleibende intrazelluläre, mit der Zelle assoziierte Radioaktivität mit 1 ml 0,1 M NaOH, enthaltend 2% Na&sub2;CO&sub3; und 1% SDS, extrahiert. Leere Quadrate bezeichnen den oberflächengebundenen Liganden und ausgefüllte Quadrate die intrazelluläre Radioaktivität.
B. ¹²&sup5;I-GRP-Affinitätsmarkierung eines zellulären Proteins mit einem Molekulargewicht von 75.000-85.000 unter Verwendung von Disuccinimidyl-Vernetzungsmitteln. Konfluente Kulturen von Swiss-3T3-Zellen wurden gewaschen und dann mit ¹²&sup5;I-GRP (5 nM) in Gegenwart (+) oder in Abwesenheit (-) von 0,9 uM unmarkiertem GRP 2,5 Stunden bei 15ºC inkubiert. Die Zellen wurden dann gespült, um den freien Liganden zu entfernen, und dann mit entweder EGS, DSS, DSP oder BSCOES in Konzentrationen von 6 mM, 2 mM, 2 mM beziehungsweise 4 mM behandelt. Die Zellen wurden in SDS Probenpuffer solubilisiert und dann einer 7,5% Polyacrylamid-Gelelektrophorese unterworfen. Der Pfeil zeigt die Position des Proteins mit einem Molekulargewicht von 75.000-85.000. Alle anderen experimentellen Verfahren, die bei diesem und ähnlichen Versuchen verwendet wurden, waren wie unter Materialien und Methoden beschrieben. Eine breite und intensiv radioaktive Bande, die bei einem niedrigen Molekulargewicht wanderte, wurde in allen Gelen der Erfinder beobachtet. Dieses Material wurde in Gegenwart eines Überschusses an unmarkiertem GRP nicht erhalten und stellt daher höchstwahrscheinlich das nicht-umgesetzte Peptid dar.
C. Konzentrationsabhängigkeit der Wirkung von EGS auf die Affinitätsmarkierung des Proteins mit einem Molekulargewicht von 75.000-85.000. Konfluente Kulturen von Swiss-3T3-Zellen wurden mit 1 nM ¹²&sup5;I-GRP bei 15ºC inkubiert und dann mit verschiedenen Konzentration an EGS wie angegeben behandelt. Die Proben wurden für die SDS-PAGE, wie unter Materialien und Methoden beschrieben, hergestellt. Der Pfeil zeigt die Position des Proteins mit einem Molekulargewicht von 75.000-85.000. Bei diesem und bei den anderen Versuchen lag die Wirksamkeit der Vernetzung unter Verwendung von EGS im Bereich von 5 bis 10% der mit der Zelloberfläche assoziierten Radioaktivität.
Fig. 2: A. Wirkung der Variation der Konzentrationen von nicht-markiertem GRP auf die Bindung von ¹²&sup5;I-GRP an intakte Swiss-3T3-Zellen ( ) und die Affinitätsmarkierung des Proteins mit einem Molekulargewicht von 75.000-85.000 (o). Konfluente Kulturen von 3T3-Zellen wurden mit 5 nM ¹²&sup5;I-GRP in Gegenwart von variierenden Konzentrationen des nicht-radioaktiven Liganden bei 15ºC 2,5 Stunden lang inkubiert. Nach dieser Zeit wurden einige Zellen viermal mit kalter (4ºC) PBS, supplementiert mit 1 mg/ml BSA, gewaschen solubilisiert, und die gesamte zellassoziierte Radioaktivität wurde dann in einem Gammacounter bestimmt. Parallelkulturen wurden mit PBS bei 15ºC gespült und dann mit EGS (6 mM) behandelt, um gebundenes ¹²&sup5;I-GRP zu vernetzen. Die Zellen wurden dann solubilisiert, und die Proben wurden durch SDS-PAGE analysiert. Nach der Elektrophorese wurden die Gele getrocknet, einem Film exponiert und, wie unter Materialien und Methoden beschrieben, gescannt. Die Flächen unter den einzelnen Peaks für das Protein mit einem Molekulargewicht von 75.000-85.000 sind als Funktion der Konzentration des nicht-markierten Peptids gezeigt und als Prozentsatz der Kontrolle ausgedrückt. Das Innenbild zeigt die Region des Autoradiogramms, die für das Scanning verwendet wurde.
B. Konzentrationsabhängigkeit der ¹²&sup5;I-GRP Affinitätsmarkierung des Proteins mit einem Molekulargewicht von 75.000-85.000. Konfluente Kulturen von Swiss-3T3-Zellen wurden mit verschiedenen Konzentrationen an ¹²&sup5;I-GRP bei 15ºC 2,5 Stunden lang inkubiert und dann mit EGS (6 mM) behandelt. Der Gehalt des Proteins mit dem Molekulargewicht von 75.000-85.000, der in willkürlichen Einheiten ausgedrückt ist, ist als Funktion der Konzentration des markierten Liganden ausgedrückt. Innenbild: Autoradiogramm des Gels, das zum Scannen verwendet wurde. Die Banden mit einem Molekulargewicht von 75.000-85.000 und 160.000 sind durch Pfeile gekennzeichnet. Alle anderen Einzelheiten des Versuchs waren wie unter Materialien und Methoden beschrieben.
Fig. 3: Hemmung der GRP induzierten DNA-Synthese durch [DPro²]-Spantid (A) und [DPhe&sup5;]-Spantid (D). Links: Konfluente und ruhende Kulturen von Swiss-3T3-Zellen in 35 mm Plastikschalen wurden zweimal mit DMEM gewaschen und dann bei 37ºC in 2 ml eines 1 : 1 Gemisches eines DMEM/Waymouth-Mediums, enthaltend [³H]-Thymidin in einer Konzentration von 1 uCi/ml (1 uM), Insulin in einer Konzentration von 1 ug/ml und zunehmenden Konzentrationen von GRP in Abwesenheit ( ) oder Anwesenheit von Antagonist A in einer Konzentration von 20 uM (o) oder Antagonist D in einer Konzentration von 20 uM ( ) inkubiert. Nach 40 Stunden wurde die DNA-Synthese durch den [³H]-Thymidineinbau in das säurepräzipitierbare Material abgeschätzt. Die Werte sind als Prozentsatz des [³H]-Thymidineinbaus, erhalten mit sättigenden Spiegeln an GRP (36 nM) in Abwesenheit des Antagonisten (100% = 8,4 · 10&sup5; cpm pro Schale), ausgedrückt. Jeder Punkt stellt den Mittelwert doppelter Bestimmungen dar. Rechts: Kulturen von Swiss-3T3-Zellen wurden gewaschen und wie vorstehend inkubiert, ausgenommen, daß die Konzentration an GRP auf 3,6 nM fixiert wurde, wobei die Konzentrationen der Antagonisten A (o) und D ( ) variierten. Die Werte sind als Prozentsatz des [³H]-Thymidineinbaus, erhalten in Abwesenheit von Antagonisten (100% = 8,6 · 10&sup5; cpm pro Schale), ausgedrückt. Jeder Punkt stellt den Mittelwert von vier Bestimmungen dar.
Fig. 4: Wirkungen von [DPro²]-Spantid (A) und [DPhe&sup5;]-Spantid (D) auf die Bindung von ¹²&sup5;I-markiertem GRP (¹²&sup5;I-GRP) an Swiss-3T3-Zellen. Links: Hemmung der spezifischen ¹²&sup5;I-GRP Bindung durch Antagonisten A und D. Konfluente und ruhende Zellen wurden zweimal mit DMEM gewaschen und dann bei 37ºC in 1 ml Bindungsmedium (3), enthaltend ¹²&sup5;I-GRP in einer Konzentration von 1 nM und verschiedene Konzentrationen von Antagonist A (o) und D ( ), inkubiert. Die zellassoziierte ¹²&sup5;I-GRP-Bindung wurde nach 30 Minuten gemessen. Die Werte sind als Prozentsatz der spezifischen Bindung, erhalten in Abwesenheit von Antagonisten, ausgedrückt. Unspezifische Bindung wurde durch die Zugabe eines 300fachen Überschusses an nicht-markiertem GRP bestimmt. Jeder Punkt stellt den Mittelwert von drei Bestimmungen dar. Mitte: Wirkung von Antagonist D auf die Affinität der Bindungsstellen in Swiss-3T3-Zellen für ¹²&sup5;I-GRP. Konfluente und ruhende Zellen wurden zweimal mit DMEM gewaschen, dann 30 Minuten lang bei 37ºC in 1 ml Bindungsmedium, enthaltend verschiedene Konzentrationen an ¹²&sup5;I-GRP in Abwesenheit ( ) oder Anwesenheit ( ) von D in einer Konzentration von 10 uM, inkubiert. Die spezifische Bindung (B) ist in pmol/10&sup6; Zellen ausgedrückt und ist in einer doppelt reziproken Auftragung gezeigt. Jeder Punkt stellt den Mittelwert von Doppelbestimmungen dar. Rechts: Wirkungen der Antagonisten A und D auf die Affinitätsmarkierung des mit dem Bombesinrezeptor assoziierten Proteins mit einem Molekulargewicht von 75.000-85.000. Konfluente Kulturen von Swiss-3T3-Zellen wurden zweimal mit DMEM gewaschen und bei 15ºC in 1 ml Bindungsmedium, pH 7,0 (15), enthaltend 0,5 nM ¹²&sup5;I-GRP und verschiedene Konzentrationen der Antagonisten, inkubiert. Nach 2 Stunden wurden die Kulturen zweimal mit Bindungsmedium gewaschen und dann in 1 ml, enthaltend 6 mM Ethylenglykolbis(succinimidylsuccinat) (EGS)&sub1; bei pH 7,4 15 Minuten lang bei 15ºC inkubiert. Die Kulturen wurden dann zweimal mit kalter phosphatgepufferter Kochsalzlösung gewaschen und in 0,1 ml 2· Probenpuffer solubilisiert und dann sofort 5 Minuten lang auf 100ºC erhitzt und auf einem 10%igen Poylacrylamidgel elektrophoretisch untersucht.
Fig. 5: Wirkungen von [DPro²]-Spantid (A) und [DPhe&sup5;]-Spantid (D) auf die frühen zellulären GRP-stimulierten Antworten. Links: Wirkungen der Antagonisten auf [Ca²&spplus;]i. Ruhende Swiss-3T3-Zellen, die auf Cytodex-2-Kugeln gezüchtet wurden, wurden zweimal mit DMEM gewaschen und 10 Minuten lang mit 2- Fura-tetraacetoxymethylester in einer Konzentration von 1 uM inkubiert und dann dreimal gewaschen und in 2 ml Elektrolytlösung (6) in dem Fluorimeter bei 37ºC suspendiert und gerührt. Die Fluoreszenz wurde kontinuierlich in einem Perkins-Elmer LS5 Lumineszenz-Spektrometer mit einer Anregungswellenlänge von 335 nm und einer Emissionswellenlänge von 510 nm aufgezeichnet. Nach einer Zeitspanne der Equilibrierung wurden die folgenden Zugaben gemacht: Lösungsmittel, S; Antagonist A, 5 uM, A, 5 und 20 uM, A, 20; Antagonist D, 5 uM, D, 5. Nach drei Minuten wurden in jedem Fall GRP in einer Konzentration von 1 nM, G oder in einer Konzentration von 50 nM, G, 50; PDGF in einer Konzentration von 1 nM, P zugesetzt. Rechts: Die Antagonisten A und D kehren die Hemmung der ¹²&sup5;I-EGF-Bindung, die durch GRP induziert wurde, um. Konfluente und ruhende Kulturen von Swiss-3T3-Zellen wurden zweimal mit DMEM gewaschen und dann 1 Stunde lang bei 37ºC in 1 ml Bindungsmedium (9), enthaltend ¹²&sup5;I-EGF in einer Konzentration von 0,2 nM und GRP in einer Konzentration von 3,6 nM, allein ( ) oder in Gegenwart von verschiedenen Konzentrationen von A (o) oder D ( ) inkubiert. Die Werte sind als Prozentsätze der spezifischen Bindung, erhalten mit ¹²&sup5;I-EGF allein in einer Konzentration von 0,2 nM, ausgedrückt. Die nicht-spezifische Bindung wurde durch Zugabe eines 500fachen Überschusses an nicht-markiertem EGF erhalten. Jeder Punkt stellt den Mittelwert von sechs Bestimmungen dar.
Fig. 6: [DPro²]-Spantid hemmt reversibel das Wachstum von SCLC-Zellinien. Stammkulturen der Zellinien H69, H128 und H417 wurden in RPMI 1640 Medium mit 10% fetalem Rinderserum (hitzeinaktiviert) in einer Feuchtatmosphäre von 10% CO&sub2;:90% Luft bei 37ºC gehalten. Sie wurden alle 7 Tage durchgeleitet. Identisches Wachstum wurde in dem serumfreien RPMI 1640 Medium, das mit HITES (29) (Hydrocortison, 10 nM; Insulin, 5 ug/ml; Transferrin, 100 ug/ml; 17β-Östradiol, 10 nM; Natriumselenit, 30 nM) und 0,25% Rinderserumalbumin supplementiert war, erhalten. Die Zellen wurden zweimal mit RPMI 1640 Medium gewaschen und dann in dem serumfreien Medium in Abwesenheit ( ) oder Anwesenheit ( , ) von [DPro²]-Spantid in einer Konzentration von 150 uM inkubiert. Nach 4 Tagen wurden sie erneut zweimal mit RPMI 1640 Medium gewaschen und dann in einer Dichte von 5 · 10&sup4; Zellen pro ml in Abwesenheit ( , ) oder Anwesenheit ( ) von [DPro²]-Spantid in einer Konzentration von 150 uM resuspendiert (Tag 0). Die Zellzahl wurde in Intervallen über 14 Tage in einem Coulter-Counter nach Trennen der Zellklumpen durch Spritzen durch 19G- und 21G-Nadeln bestimmt. Jeder Punkt stellt den Mittelwert von drei Bestimmungen dar.
Fig. 7: Die Hemmung des SCLC Wachstums in vitro durch [DPro²]-Spantid und [DPhe&sup5;]-Spantid ist konzentrationsabhängig. Kulturen von H69-Zellen wurden zweimal mit RPMI 1640 Medium gewaschen und dann in einem serumfreien Medium (wie in Fig. 6) in Abwesenheit ( ) oder Anwesenheit verschiedener Konzentrationen an [DPro²]-Spantid (o, A) und [DPhe&sup5;]-Spantid ( , D) inkubiert. Die Zellzahl wurde in einem Coulter-Counter nach Trennen der Zellklumpen durch Spritzen durch 19G- und 21G-Nadeln bestimmt. Die Proben wurden 13 Tage lang inkubiert, wenn die Kontrollen (Einsatzbild) eine zehnfache Erhöhung bezüglich der Zahl erreicht hatten, gekennzeichnet durch einen Pfeil. Jeder Punkt stellt den Mittelwert (± Standardabweichung) von fünf Bestimmungen dar.

Tabelle 1

Spezifität der ¹²&sup5;I-GRP Affinitätsmarkierung des Proteins mit einem Molekulargewicht von 75.000-85.000

Zugabe Protein mit einem Molekulargewicht von 75000-85000 % der Kontrolle
- 100
GRP 0,8
GRP (14-27) 0,4
Bombesin 0,5
Litorin 2
Neuromedin B 10
[D-Arg¹, D-Pro², D-Trp7,9, Leu¹¹] Substanz P 9,7
GRP (1-16) 93
PDGF 99
EGF 94
Vasopressin 94
Insulin 90
Phorbol-12,13-dibutyrat 99
Substanz P 91
Substanz K 94
Somatostatin 97
Neurotensin 93
Konfluente Kulturen von Swiss-3T3-Zellen wurden mit ¹²&sup5;I-GRP (0,5 nM) bei 15ºC 2,5 Stunden lang entweder in Abwesenheit (-) oder Anwesenheit der folgenden GRP verwandten Peptide bei den angegebenen Konzentrationen inkubiert: GRP (360 nM), das 14-27 Aminosäurefragment von GRP (GRP (14-27)) (30 nM), Bombesin (30 nM), Litorin (92 nM), Neuromedin B (220 nM), der Bombesinantagonist [D-Arg¹, D-Pro², D-Trp7,9, Leu¹¹]-Substanz P (100 uM) und das 1-16 Aminosäurefragment von GRP (GRP (1-16)) (3230 nM). Parallele Kulturen wurden mit der gleichen Konzentration an ¹²&sup5;I-GRP in Anwesenheit der folgenden nichtverwandten Faktoren inkubiert: PDGF (5 nM), EGF (83 nM), Vasopressin (1000 nM), Insulin (1 ug/ml), Phorbol- 12,13-dibutyrat (2000 nM), Substanz P (740 nM), Substanz K (880 nM), Somatostatin (610 nM) und Neurotensin (600 nM) Nach der Inkubationsperiode wurden die Kulturen mit 6 mM EGS, wie unter Materialien und Methoden beschrieben, inkubiert. Jeder Wert wird als Prozentsatz des Gehalts des Proteins mit einem Molekulargewicht von 75.000-85.000, erhalten ohne Zugaben (-), ausgedrückt. Andere experimentelle Einzelheiten sind wie unter Materialien und Methoden beschrieben. Bombesin Substanz P Antagonist

Literaturstellen

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Claims

1. Verwendung von [D-Arg¹, D-Phe&sup5;, D-Trp7,9, Leu¹¹]-Substanz P (Antagonist D) zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung unkontrollierter Zellproliferation.

2. Verwendung einer Verbindung der Formel (I)

D-Arg-X-Lys-Pro-Y-Gln-D-Trp-Phe-D-Trp-Leu-Leu-NH&sub2; (I)

worin X für D-Pro oder Pro steht und Y für D-Trp steht, zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von unkontrollierter Zellproliferation.

3. Verbindung der allgemeinen Formel (I)

D-Arg-X-Lys-Pro-Y-Gln-D-Trp-Phe-D-Trp-Leu-Leu-NH&sub2; (I)

worin X für D-Pro oder Pro steht und Y für D-Trp steht.

4. Pharmazeutisches Präparat, umfassend eine Verbindung nach Anspruch 3 zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger oder Verdünnungsmittel.

5. Verbindung nach Anspruch 3 zur Verwendung bei einem Verfahren zur Behandlung des menschlichen oder tierischen Körpers durch Therapie oder bei einem Diagnoseverfahren.

6. Verfahren zur in vitro Diagnose unkontrollierter Zellproliferation, umfassend die Stufe des gegenseitigen Inkontaktbringens einer Körperprobe von einem Wirt, der vermutlich an unkontrollierter Zellproliferation leidet, und Antagonist D nach Anspruch 1 oder einer Verbindung nach Anspruch 3.