DD210303A5

DD210303A5 - Verfahren zur herstellung von humangewebe-plasminogen-aktivator

Info

Publication number: DD210303A5
Application number: DD83250611A
Authority: DD
Inventors: David V Goeddel; William J Kohr; Diane Pennica; Gordon A Vehar
Original assignee: Genentech Inc
Priority date: 1982-05-05
Filing date: 1983-05-04
Publication date: 1984-06-06
Also published as: JP2564444B2; JPH0448440B2; JPH0216981A; JPH05137583A; DK198883A; PL152438B1; BG60253B1; FR2526443B1; GB2119804B; PT76636B; GB8312221D0; CY1341A; IL68561A; ES522085A0; IE54975B1; BR8302318A; NO831575L; EP0093619B2; HK88586A; BG60253B2

Abstract

Humangewebe-Plasminogen-Aktivator (t-PA) wird in brauchbaren Mengen unter Verwendung von Rekombinationstechniken gebildet. Erfindungsgemaess ist die Bildung von t-PA moeglich, der frei von Verunreinigungen ist, mit denen er in seiner nativen zellulaeren Umgebung assoziiert ist. Ferner werden Verfahren, Expressionsvehikel und verschiedene Wirtszellen,die sich zur Herstellung von t-PA eignen, beschrieben.

Description

_//_ Berlin, den 14.11.1983 AP G 12 N/250 611/4 62 422/12

Verfahren zur Herstellung-von Humangewebe-Plasminogen-Aktivator . .

Anwendungsgebiet der Erfindung

O . -

Die Erfindung betrifft.die Herstellung von Human-Plasminogen-Aktivator, der dem in Humanserum und/oder -geveben gefunde-nen».Alstivato,t!,/ entspriciit-j sowie· neu©' SOrmen-.und,- ZusaÄme-n·-''"- - .setzunge:%4avj3iH. ,Insbesondere, betrifft- die- Erfindung-^Mittel und Verfahren, mit dem dieser Aktivator in homogenervj'orm in therapeutisch erheblichen Mengen hergestellt weiden."kann«-.-

Die Erfindung beruht zum Teil auf der Ermittlung Sequenz und abgeleite^en^^ffiinosäLUiese-quenz.i von gen-Aktivator. Diese Ermittlung ermöglichte die Bildung von Human-Plasminogen-Aktivator unter Anwendung der rekombinanten -DNA-Technik,, die wiederum die Bildung von Material in ausreichender Qualität und Menge möglich machte, um Tierversuche und klinische Untersuchungen als Voraussetzung für eine Markteinführung durchzuführen, wobei keine Beschränkungen vorlagen, mit denen bisherige Isolationsverfahren unter Produktion und Extraktion vorhandener Zellkulturen notwendigerweise behaftet sindo Gegenstand d.er Erfindung sind sämtliche vorstehend angedeuteten Ausführungsformen,

Bekannte technische Losungen

Druckschriftliche Veröffentlichungen und andere Materialien, die den technischen¹Hintergrund'der Erfindung' erläutern und in speziellen Fällen auch zusätzliche Einzelheiten bezüglich

o KinuiQQWt λ 0 47 Ü

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der praktischen Durchführung der Erfindung liefern, sind in der nachstehenden Beschreibung mit Hummern gekennzeichnet· Diese Hummern beziehen sich auf die Bibliographie am Schluß der Beschreibung«

A. Humangewebe-Plasminogen-Aktivator Das"fibrinolytisGhe System befindet sich in einem dynami-sehen Gleichgewicht mit dem Koagulationssystem, wodurch ein intaktes, offenes Gefässbett aufrechterhalten wird. Das Ko-5agulationssystem lagert Fibrin als eine Matrix ab,, die zur Wiederherstellung eines hämostatischen Zustands dient. Das fibrinolytische System entfernt das Fibrinnetzwerk, nachdem der hämostatische Zustand erreicht ist. Der fibrinolytische Prozess wird durch das proteolytische Enzym Plasmin, das aus dem Plasmaprotein-Vorläuferprodukt. Plasminogen' gebildet wird,hervorgerufen. Plasminogen wird durch Aktivierung mittels eines Aktivators in Plasmin umgewandelt.

Gegenwärtig sind im Handel zwei Aktivatoren erhältlich, näm-15vlich-Streptokinase und Urokinase'. Beide'-sind ,zur; Behandlung-- von akuten Gefässerkrankungen, wie- Myokardinfarkt, Schlaganfall., Lungenembolie, tiefe Venehthrombose, peripherer Arte- - rienverschluss und andere venöse Thrombosen, indiziert. Insgesamt stellen diese Krankheiten schwerwiegende Gesundheitsrislken dar.

Die diesen Krankheiten zugrunde liegende ätiologische Basis besteht in einem partiellen oder - in schweren Fällen - totalen Verschluss -eines Blutgefässes durch ein. Gerinnsel, d.h.

Thrombus oder Thromboembolus.Bei der herkömmlichen Antiköagulationstherapie', zum Beispiel' mit Heparin und Cumarin, wird nichts getan, um die Auflösung von Thrombi oder Thromboemboli. direkt zu fördern. Die vorstehend erwähnten thrombolytischen Mittel.Streptokinase und Urokinase werden in der Praxis eingesetzt, unterliegen aber beide starken Beschrän- kungen. Keines der beiden Mittel besitzt eine hohe Affinität für Fibrin, so dass sie zirkulierendes und fibringebundenes Plasminogen relativ wahllos aktivieren. Das- im zirkulierenden Blut gebildete Plasmin wird relativ rasch neutralisiert und ist für die Throrabolyse verloren. Restliches Plasmin baut verschiedene Gerinnungsf äkt or proteine ab', zum' Beispiel Fibrinogen, Faktor V und Faktor VIII,"was ein hämorrhagisches Potential verursacht. Ferner ist Streptokinase

stark antigen, und Patienten mit' hohen Antikörpertitern reagieren ungenügend auf die Behandlung und können nicht unter Dauerbehandlung bleiben. Die Urokinasetherapie ist teuer, was auf" die Isolierung aus menschlichem Urin oder Gewebekul-

Sturen zurückzuführen ist, so dass sie sich in der klinischen Praxis nicht allgemein durchgesetzt hat. Urokinase ist Gegenstand zahlreicher Untersuchungen gewesen; vgl. zum Beispiel Literaturstellen 1-6.

Sogenannte Plasminogen-Aktivatoren wurden aus verschiedenen Humangeweben, zum Beispiel Uterusgewebe, Blut, Serum (vgl. allgemein Literaturstellen 7-11) und Zellkulturen isoliert (94). Zusammensetzungen davon wurden ebenfalls beschrieben (vgl. Literaturstellen 12,¹ 13 und 14-18). Die aus'

15diesen Quellen abgeleiteten Plasminogen-Aktivatoren wurden in zwei Hauptgruppen eingeteilt: Plasminogen-Aktivatoren vom Urokinasetyp (u-PA) und Plasminogen-Aktivatoren vom Gewebetyp (t-PA)., basierend .auf Unterschieden in den immunologischen Eigenschaften. (Die Abkürzungen t-PA und u-PA- wurden beim XXVIII Meeting of. the International Committee/ on Thrombosis and Hemostasis., ' Bergamo, Italien, 27.JuIi 1982, vorgeschlagen.)

Kürzlich wurde.eine Humanmelanomlinie identifiziert, die 25t--.PA sekretiert. Die Charakterisierung dieses Melanom-Plasminogen-Aktivators ergab, dass er sich sowohl immunologisch : als auch im Hinblick -auf die.Aminosäurezusammensetzung von aus' normalem Humangewebe isoliertem Plasminogen-Aktivator nicht unterscheiden lässt (Literaturstellen 19, 88). ' '.. .. '

Das Produkt: wurde in relativ reiner Form isoliert und cha-, rakterisiert. Es wurde festgestellt, dass es sich um ein hochaktives, fibrinolytisches" Mittel handelt (20).

Einige Untersuchungen (vgl. zum Beispiel Literaturstellen 95-98), die aus Melanomzellinien gereinigte t-PA verwendeten, ergaben für dieses Produkt im Vergleich zu Plasminogen-Aktivatoren vom Urokinasetyp' eine höhere Affinität für Fibrin.

Eingehendere Untersuchungen von human-t-PÄ als potentielles, thrombol.ytisches Mittel wurden jedoch durch dessen äusserst niedrige Konzentration in Blut, Gewebeextrakten, Gefässperfusionsprodukten und Zellkulturen behindert. '5

Man nahm an, dass die Anwendung der rekombinanten DNA-Technik einen sehr, wirksamen Weg zur Bereitstellung der erforderlichen, grossen Mengen an qualitativ hochwertigem Plasminogen-Aktivator vom Humangewebetyp (vorher als-Human-Plasminogen-Aktivator bezeichnet), der im wesentlichen frei von anderem:Humanprotein ist, darstellt. Diese Materialien sollten vermutlich biologisch aktiv sein, was ihre klinische Verwendung bei der Behandlung verschiedener kardiovaskulärer Zustände oder Krankheiten ermöglichen würde.

Zufriedenstellende⁵· Mengen an Humän-t-PA' werden von Zellkulturen gebildet, wobei jedoch weitere Verfeinerungen unter Anwendung einer' sekundären, kodierenden Sequenz dazu dienen, die Produktionsmengen noch weiter zu erhöhen. Die sekundäre, kodierende Sequenz umfass.t Dihydrofolat-reduktase (DHFR)-, die durch einen extern-gesteuerten Parameter, wie Methotrexat, beeinflusst' wird', wodurch die Steuerung der Expression durch Steuerung der Methotrexat (MTX)-Konzentration ermöglicht wird.

B. Rekombinante DNA-Technik *

Die rekombinante ,DNA-Technik hat in Letzter Zeit eine erhebliche Verfeinerung erfahren. Die Molekularbiologen sind in der Lage, verschiedene DNA-Sequenzen relativ- leicht zu rekombinieren und neue DNA-Einheiten zu schaffen, die zur . Bildung von'erheblichen Mengen an exogenen Proteinprodukten in transformierten Mikroben und -Zellkultüren fähig sind. Es stehen allgemeine Mittel.und Verfahren zur in vitro-Ligation von verschiedenen DNA-Fragmenten mit stumpfen oder kohäsiven Enden zur Verfügung, die zur Bildung von' leistungsfähigen Expressionsvehikeln führen, mit denen spezielle Organismen transformiert werden können, so dass deren Syn--

1theseleistung auf das gewünschte, exogene Produkt gerichtet wird. Bei einzelnen Produkten ist dieses Verfahren jedoch recht umständlich. Die Kenntnisse sind noch nicht so weit fortgeschritten, dass regelmässige Vorhersagen über die Er-

5folgsaussichten gemacht werden können. Versucht man Erfolge ohne entsprechende, experimentelle Basis vorherzusagen, so läuft man Gefahr zu scheitern.

Die DNA-Rekombination der wesentlichen Elemente, d.h. ein Startpunkt der Replikation,.eine oder mehrere- phänotypische Selektionschäräkteristlkea, ein Expressionspromotor, heterologes Geninsert und restlicher Vektor, findet im allgemeinen ausserhalb der Wirtszelle statt. Das erhaltene, rekombinante, replizierbare Expressionsvehikel oder Plasmid werden· in die Zellen durch Transformation eingeführt und grosse Mengen:des' rekombinanten· Vehikels durch Wachstum des Transformanten erhalten. Wird das Gen in Bezug auf die Teile, die die Transkription und Translation der einkodierten DNA-Botschaftsteuern, in geeigneter Weise mit Inserts versehen, s-.o eignet: sich das" erhaltene Expressionsvehikel zur ' tatsäch-· liehen Bildung der Pol-ypeptidsequenz, für die das-eingesetzte Gen kodiert'; ein Vorgang: der als Expression- bezeichnet¹ wird. Da-s gebildete Produkt kann gegebenenfalls durch Lysis der Wirtszelle in mikrobiellen Systemen und Gewinnung des Produkts

25durch entsprechende .Reinigung von anderen Proteinen erhalten werden. ·

In der Praxis kann die Verwendung der rekombinanten DNA-Technik zur Expression von vollkommen-heterologen Polypep-

30tiden - sogenannte direkte Expression - oder zur Expressioneines heterologen Polypeptids führen, das mit einem Teil der Aminosäuresequenz' eines homologen Polypeptids verschmolzen ist. In den letztgenannten Fällen wird ' das gewünschte,bioaktive Produkt gelegentlich innerhalb des verschmolzenen,

35homolog/heterologen Polypeptids biologisch inaktiv, bis es in einer extrazellulären Umgebung gespalten wird; vgl. (21) und (22).- ^: 7 " ' -

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In ähnlicher Weise ist die Technik von Zeil- qder Gewebekulturen für genetische und zellphysiologische Untersuchungen gut eingeführt. Mittel und Methoden zur Erhaltung von' permanenten Zellinien, die durch sukzessive Serienübertragungen von isolierten, normalen Zellen hergestellt werden, stehen zur Verfügung. Pur Forschungszwecke werden derartige Zellinien auf einem "festen Träger in einem flüssigen Medium gehalten oder in Suspension mit einem Gehalt an erhaltenden Mährstoffen gezüchtet. Sine Vergrößerung des' Herstellungamaßstabs zur Herstellung von großen Präparatemengen scheint nur eine Frage der . me chani 3 ehe η Liögl i chic eitan' ζ u sein . Z ur ' Ve r t i ef üng ' wird:- in diesem Zusammenhang^:auf die Literaturstelleh (2J) und (24) verwiesen·

Ebenso stellt die Proteinbiochemie ein wertvolles, ja notweniges Hilfsmittel in der Biotechnologie dar« Zellen, die das** gewüns^;chts*i?röti5ih^; bilden-, bilden' 'darüber- hinaus -noch Hunderte von anderen Proteinen, endogenen Produkten des Zellstoffwechsela. Diese verunreinigenden Proteine sowie andere Verbindungen"können, wenn sie nicht vom gewünschten Protein abgetrennt werden, bei Verabreichung an Tiere oder Menschen im Verlauf einer therapeutischen Bell and lung mit dem gewünschten Protein toxisch wirken» Hiar-Hier kommen die Methoden der Proteinbiochemie zum Tragen, die die Bereitstellung von Trennungsverfahren ermöglichen, die für das^spezielle, in Betracht.kommende System geeignet sind Und zur Bildung eines' für den beabsichtigten ^erwendungazweck sicheren, homogenen Produkts führen. Die Proteinbiochemie ermöglicht auch eine Identifizierung und Charakterisierung' dieses Produkts und stellt sicher, daß die gebildeten Zellen das- Produkt ohne., Veränderungen oder'

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Mutationen gebildet haben» Dieser Zweig der Wissenschaft befaßt sich auch mit der Ausarbeitung von Bio.assays, Stabilitätsuntersuchungen und anderen -Verfahren, die durchgeführt-werden müssen, bevor erfolgreiche, klinische Untersuchungen oder eine Markteinführung möglich sind.

Ziel, der: Erfindung;

Bs ist Ziel der Erfindung, die rekombinante DMA-Technik zur Herstellung von Humangeweb.e-PXasminogen-Aktivator (T-PA) miteinzubeziehen, vorzugsweise in direkter Porm und in Mengen, die ausreichen,, Tierversuche und klinische Untersuchungen, die eine Voraussetzung für eine -Markt— Zulassung sind, zu initiieren und durchzufuhren,. Das gebildete human t-PA eignet sich für allePormen der prophylaktischen, oder therapeutischen Behandlung des Menschen bei verschiedenen kardiovaskulären Zuständen oder Kraakheiten*. Die Verwendung-von t-PA und-von geeigneten pharmazeutischen Zusammensetzungen davon stellen bei der Behandlung vaskulärer Störungen beim Menschen einen wichtigen Gesichtspunkt dar.

Wesen der Erfindung..

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Herstellung von Humangewebe-Plasminogen-Aktivator bereitzustellen» Der: durch genetische Manipulation vcn Mikroorganismen oder Zellkulturen gebildete Human-Plasminogen-Aktivator eröffnet die Möglichkeit, Humangewebe-Plasminogen-Aktivator.effizienter als bisher herzustellen, wodurch die bisher schwer durchführbare, wirtschaftliche Verwertung ermöglicht wird, ferner kann der erfindungs- gemäß hergestellte Humahgewebe-Plasminogen-Aktivator je

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nach. Art der Wirtazelle im Vergleich zu nativem Material in größerem oder geringerein Umfangassozierte Glycoaylierung enthalten·, ^af. jeden Fall ist das t-PA frei von Verunreinigungen, von denen es normalerweise in nichtrekombinanter, zellulärer Umgebung begleitet ist.

Für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens sind ferner replizierbare DHA-Sxpressionsvehikel erforderlich, die Gensequenzen beherbergen, welche Humangewebe-Plasminogen-Aktivator in expressionsfähiger J?orm kadjaen sowie Mikroorgahisinenstäinine^ oder; Zellkulturen, die mit den vorstehenden SxpresaionsvehikeIn transformiert, sind, sowie .Mikroben- oder Zellkulturen von derart transformierten Stämmen oder Kulturen, die zur Bildung von Humangewebe-Plasminogen-Aktivator in der.Lage sind.

Die Ausdrücke "Humangewebe-Plasminogen-Aktivator" oder "human t-?A" oder "t-PA" betreffen den durch Mikroorganismenöder Zellkultursysteme gebildeten, exogenen (Gewebetyp) Plasminogen-Aktivätor in bioaktiven Formen, der einen Proteaseteil umfaßt und den für Humangewebe nativen Gewebe-Plasminogen-Aktivatoren entspricht. Das erfindungsgemäß gebildete Humangewebe-Plassiinogen-Aktivatorprotein wurde mittels eines bestimmten DHA-Gens und der abgeleiteten .Aminosäuresequenz definiert. Ss ist klar, daß natürliche allele Variationen vorkommen und von Individuum zu Individuum auftreten, Diese Variationen können sich durch eine oder mehrere unterschiedliche -aminosäuren in der Gesamtsequenz oder durch DeIetionen, Substitutionen, Insertionen, Inversionen oder Additionen von einer odermehreren .Aminosäuren dieser Sequenz

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bemerkbar machen· ferner hängt die Stellung and das Ausmaß der Glycösylierung von der Hatur der Wirtszellenumgebung, ab·

Bei der Anwendung rekombinanter DNA-Technik besteht die Möglichkeit zur Herstellung verschiedener Humangewebe-Plasminogen-Aktivatorderivate, die in verschiedener V/eise durch einfache oder mehrfache Substitution, Deletion, . Addition oder Ersatz von Aminosäuren modifiziert sind, beispielsweise durch gezielte Mutagenese der zugrunde liegenden DHA...Umfaßt wird auch die Herstellung von Derivaten, bei denen der wesentli-

ehe "kringle"-Bereich und der Serinprotease-Bereich, die Im₇ allgemeinen für den hier speziell beschriebenen Humangewebe-Plasiöinpgen-Aktivator charakteristisch sind, erhalten sind, die aber ansonsten auf die vorstehend beschriebene Weise 5. modifiziert sind. Sämtliche derartigen allelen Variationen und Modifikationen, die zu Derivaten von Humangewebe.-Plas- minogen-Aktivator führen, fallen unter den Gegenstand der Erfindung, desgleichen auch andere verwandte, exogene (Gewebetyp) Human-Plasminogen-Aktivatoren, die physikalisch und chemisch ähnlich sind, sofern die wesentliche charakteristische Aktivität von Humangewebe-Plasminogen-AktivatOr in ihrer Art unbeeinträchtigt bleibt.

Es wird' Humangewebe-Plasminogen-Aktivator hergestellt, 1) der Methicillin als erste Aminosäure (vorhanden auf Grund der AIG-.Startslgirälcotiöninsert io,n zu Beginn- des Strukturgens) oder

2) der, w'e'hri" das'¹ Methionin- intra- oder extracellular gespalten ist, seine normalerweise erste Aminosäure aufweist oder

3) der zusammen entweder mit seinem Signälpolypeptid oder

einem sich vom'herkömmlichen Signälpolypeptid unterscheidenden, konjugierten Protein vorliegt, wobei das Signälpolypeptid oder" das Kon'jugät spezifisch in einer intra-oder' extra- zellulären Umgebung abspaltbar sind (vgl. Literaturstelle 21), oder 4) der durch direkte Expression in reifer Form erhältlich ist, ohne dass die Notwendigkeit zur Abspaltung eines nicht dazugehörigen, überflüssigen Polypeptids besteht. Das letztgenannte Produkt ist besonders wichtig, wenn ein bestimmter Wirt nicht oder nicht in ausreichendem Umfang zur Entfernung-eines Signalpeptids in der Lage ist, sofern das Expressionsvehikel so aufgebaut.ist, dass es den Gewebe-Plasmiriogen-Aktivatör zusammen mit.dessen Signalpeptid exprimiert. Auf jeden Fallwird der auf diese Weise gebildete human t-PA in seinen verschiedenen Formen gewonnen und soweit gereinigt, dass er sich zur Behandlung verschiedener vas'kulärer Zustände oder Krankheiten eignet.

Ferner besitzt t-PA Formen,die sowohl das Einzelketten- : (1-Kette)-Protein als auch das 2-Ketten-Protein umfassen. Das letzt genannte Produkt leitet sich proteolytisch von der 1-Ketten-Verbindung ab. Es wird angenommen, dass das 2-Ketten-Protein mit dem gebildeten Fibrin assoziiert ist und dass die proteolytische Umwandlung vom 1- in das 2-Ketten-Material am Ort der Umwandlung vom Plasminogen zu Plasmin erfolgt. Erfindungsgemäss kommt die Verabreichung des 1-Ketten-Proteins zur vorstehend beschriebenen in vivo-Umwandlung oder die Verabreichung des 2-Ketten-Proteins, das sich ebenfalls als aktiv erwiesen hat, in Frage. Das 2-Ketten-Protein kann durch in vitro-proteolytische Umwandlung hergestellt werden, nachdem das 1-Ketten-Material gebildet ist. Ein sogenannter "kringle"-Bereich findet sich oberhalb des Serinproteasebereichs. Es wird angenommen, dass dieser eine wichtige Funktion bei der Bindung des Gewebe-Plasminogen-A'ktivators an eine Fibrinmatrix spielt. Darauf beruht die beobachtete, spezifische Aktivität des erfindungsgemässen Gewebe-Plasminogen-Aktivators gegen fühlbare: vorhandene Thromben. Der erfindungsgemässe Gewebe-Plasminogen-Aktivator wird mit einem Gehalt an dem enzymatisch aktiven Bereich gebildet, der dem nativen Material entspricht. Der Ausdruck Humangewebe-Plasminogen-Aktivator definiert Produkte, die diesen Bereich allein oder zusammen mit zusätzlichen Aminosäure-Sequenzen bis zur vollen Länge des Moleküls umfassen.

Zusammenfassend lässt sich für die vorliegende Erfindung human t-PA' folgendermassen funktionell definieren: Es ist in der Lage, die 'Umwandlung von Plasminogen^:zu Plasmin zu katalysieren, geht eine Bindung mit Fibrin ein und wird auf Grund der vorstehend dargelegten immunologischen' Eigenschaften als t-PA klassifiziert.

Der Ausdruck "in. im.wesentlichen reiner Form" beschreibt den Zustand von .erfindungsgemäss gebildetem human t-PA, das frei von Protein oder anderen normalerweise mit human t-PA assoziierten Materialien ist, die bei Bildung- durch nichtrekombinante Zellen, d.h. in der "nativen" Umgebung, ent-

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stehen.

Der Ausdruck "DHFR-Protein" bezieht sich auf ein Protein, das die mit Dihydrofolat-reductase (DHFR) assoziierte Akti-5vität entfaltet und· das daher von Zellen gebildet werden muss, die in einem Medium mit einem Mangel an Hypoxanthin, Glycin' und Thymidin (-HGT-Medium) nicht lebensfähig sind. Im allgemeinen können Zellen mit einem Mangel an. DHFR-Protein auf diesem Medium nicht wachsen, während Zeilen mit ei-IQ nem Gehalt an DHFR-Protein dazu in der Lage sind.

Der Ausdruck "gegenüber MTX empfindliche Zellen" betrifft Zellen, die nicht in der Lage sind ,auf Medien, die den DHFR-Inhibitor Methotrexat (MTX) enthalten, zu wachsen. Bei diesen "gegenüber MTX empfindlichen Zellen" handelt es sich um solche"Zellen, die ohne eine genetische:: Veränderung oder" eine" anderweitige"Ergänzung' nicht in der Lage sind-, unter Bedingungen, die für den Zeil typ: in Bezug- auf Umgebung und Medium an sich geeignet sind, zu wachsen, wenn die MTX-^Konzentration^; 0,2 ug/ml/oder mehr beträgt. Einige Zellen,zum Beispiel Bakterien,' besitzen keine MTX-Empfindlichkeit, was darauf zurückzuführen' ist-, dass" sie" MTX nicht' in ihre¹¹ Zell'begren- zügen gelängen lassen, selbst wenn sie DHFR enthalten, das ansonsten gegenüber diesem Arzneistoff empfindlich wäre. Im allgemeinen sind Zellen, die als DHFR-Protein Wildtyp-DHFR enthalten, gegenüber Methotrexat -empfindlich, wenn sie in Bezug auf MTX^:durchlässig oder zu dessen= Aufnahme in der Lage sind.

Der Ausdruck' "Wildtyp-DHFR" bezieht sich auf Dihydrofolatreductase, wie sie üblicherweise in dem speziellen in Fra-< ge kommenden Organismus gefunden wird. Wildtyp-DHFR ist im allgemeinen in vitro empfindlich gegenüber niedrigen- Konzentrationen an Methotrexat. ^:

Der Ausdruck "DHFR-Protein mit geringer Bindungsaffinität für MTX" ist funktionell definiert-. Es handelt sich um ein DHFR-Protein, das bei Bildung innerhalb von Zellen das Wachs-

turn von MTX-empfindlichen Zellen in einem Medium mit einem Gehalt an 0,2 yg/ml oder mehr MTX ermöglicht. Es ist ersichtlich, dass eine derartige funktionelle Definition von der Leichtigkeit,mit der der Organismus das "DHFR-Protein mit niedriger Bindungsaktivität für MTX" bildet sowie vom Protein selbst abhängt. Jedoch sollte im Rahmen der vorliegenden Erfindung ein derartiger Ausgleich zwischen diesen beiden Mechanismen keine Schwierigkeiten bereiten. Erfindungsgemäss wird eine Überlebensfähigkeit bei diesen MTX-Konzentrationen gewährleistet. Es ist belanglos, ob die Fähigkeit hierzu zusätzlich zur vorhandenen.Natur des gebildeten DHFR durch erhöhte Expression beeinflusst wird. Ein geeignetes DHFR-Protein, das dieser-Definition entspricht, ist in der US-Anmeldung '459 151 vom 19- Januar 1983 beschrieben.

.

Der Ausdruck "Expressionsvektor" umfasst Vektoren, die zur Expression von hier in Betracht kommenden DNA-Sequenzen in der Lage sind, wobei diese Sequenzen funktionell mit anderen Sequenzen verknüpft sind, die.zur Durchführung von deren Expression in.-der Lage sind. ~Es wird stillschweigend angenommen, wenn auch nicht immer ausdrücklich-erwähnt, dass diese Expressionsvektoren in den Wirtsorganismen entweder als Episomen oder als integrierender Bestandteil der chromosomalen' DNA replizierbar sein müssen. Ein Mangel an ' Replikationsfä-

25higkeit würde sie ganz eindeutig unbrauchbar machen..Zusammengefasst ist der Ausdruck "Expressionsvektor" funktionell, definiert. Jede DNA-Sequenz, : die zur Expression eines- bestimmten, hier in Frage kommenden DNA-Codes in der Lage ist, fällt unter diesen Ausdruck, sofern er .auf die bestimmte Sequenz angewandt wird. Im allgemeinen liegen für rekombinante DNA-Techniken geeignete Expressionsvektoren häufig in Form von "Plasmiden" vor, wobei dieser Ausdruck sich auf kreisförmige, doppelsträngige DNA-Schleifen'- bezieht, die in ihrer Vektorform nicht an das Chromosom gebunden sind. In' der vorliegenden Beschreibung werden die Ausdrücke "Plasmid" und "Vektor" wechselweise verwendet, da das Plasmid. die am häufigsten verwendete Vektorform ist. Jedoch umfasst die Erfindung auch solche andere Formen von Expressionsvektoren,

die¹¹ äquivalente Funktionen erfüllen und ^:die noch aufgefunden werden. '

Der Ausdruck "rekombinante Wirtszellen" betrifft Zellen,die 5mit Vektoren, die durch rekombinante DNA-Techniken aufgebaut sind, transformiert sind. Entsprechend der hier gegebenen Definition wird t-PA in den auf Grund dieser Transformation erreichten Mengen gebildet und nicht in den geringen Mengen, di'e' Öur'c'h ^:-deri ünt'ranöförmierten Wirt-entstehen, die häufig unter der Nachweisgrenze liegen. Durch derartige Zellen gebildeter^jVt-'P'Ä'^; kann'-auch als -"rekombinahter t-PA". bezeichnet werden·;'"'·'-"' . ^: ' · .: ' ^: "·.' ."'"."^:"'·^ν:-':'.:''· ^;.' '. ;

B. Wirtszellkulturen und Vektoren' '" ^; . 15

Die hier beschrieb.en'en- Vektoren;und-- Metho^:deln eigenen ^: sich·- ' zur Anwendung in Wirtszellen innerhalb eines- breite'n Bereichs von prokaryontischen und eukaryontischen Organismen.

Selbstverständlich werden im allgemeinen Prokarypnten zum/ 'Klonen· von DNA-Sequenzen beim Aufbau der erfindungsgemäss geeigneten Vektoren bevorzugt-. Beispielswe'lse/ist Ξ. coli K12 Stamm 29^ (ATCC 31 4 4 6 ) besonders--geelgnet. Es können · auch andere Mikroorganismenstämme verwendet werden, darun-

25ter die E. coli-Stämme E. coll B und.E. coli. X.177.6 (ATCC

31537). Diese Beispiele dienen jedoch nur zur Erläuterung und stellen keine- Beschränkung dar.. "

*" ' Prokaryonten können¹ ebenfalls zur Expression verwendet werden. Die vorerwähnten Stämme sowie E. coli W3110 (¹F", A~, - ""prototroph, ATCC 27325 ), 'Bazillen,' wie Bacillus' subtilis und andere Enterobacteriaceae,' wie' Salmonella- typhimurium oder · Serratia·' marcescens¹ und verschiedene Pseudomonas-Spezi'es können verwendet werden

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I Ό

Im allgemeinen werden Replikon und Kontrollsequenzen enthaltende Plasmidvektoren, die von mit der Wirtszelle verträglichen Spezies abgeleitet sind, in Verbindung mit diesen Wirten verwendet. Der Vektor trägt üblicherweise eine Repli-5kationsstelle sowie markierende Sequenzen, die in der Lage sind ,eine phänotypische Selektion in transformierten Zellen zu gewährleisten. Beispielsweise wird E. coli typischerweise unter Verwendung von pBR 322, einem von einer E. coli-Spezies abgeleiteten Plasmid (Bolivar et al., Gene 2, (1977), Seite

95)' · : , transformiert. pBR 322 enthält

Gene für Ampicillin- und Tetracyclinresistenz und erlaubt somit eine leichte Identifizierung von transformierten Zellen. Das pBR .322-Plasmid oder andere mikrobielle Plasmid muss- auch Promotoren enthalten, die vom mikrobiellen Orga- .

nismus zur Expression seiner eigenen . Proteine verwendet werden können, oder es muss- so modifiziert sein, dass es diese Promotoren enthält. Diese Promotoren, die sehr häufig beim rekombinanten DNA-Aufbau verwendet werden, umfassen /j-Lactamase ( Penicilline se.) und Lactose-Promo tor systeme (Chang _:et. al., Nature, Bd. 275 (1978) , S. 615; Itakura et al., Science, Bd. 1.98- (1977 ) , . S. 1 056 ; Goeddel et al.,' Nature-, Bd.. 281 (19-79), S. 5^4) sowie- ein- Tryptophan (trp) Promotorsystem (Goeddel et al., Nucleic Acids Res., Bd. 8 (1980), S. 4057; EP-Veröffentlichungsnummer 0 036 776).

Neben diesen besonders gebräuchlichen Promotoren wurden auch andere mikrobielle Promotoren aufgefunden und eingesetzt .. Einzelheiten bezüglich der Nukleotidsequenzen dieser Promotoren wurden veröffentlicht ,was es dem Fachmann erlaubt, sie funktionell mit Plasmidvektoren zu verknüpfen.(Siebenlist et al., Cell, Bd. 20 (,198O)₁-S. 269).

Neben Prokaryonten können auch eukaryontische Mikroben, wie Hefekulturen, verwendet werden. Unter den eukaryontiscben- .Mikroorganismen wird am häufigsten Saccharomyces cerevisiae oder übliche Bäckerhefe verwendet, wenngleich auch zahlreiche andere Stämme verfügbar sind. Für die Expression in Saccharomyces wird im allgemeinen das Plasmid YRp7 (Stinchcomb et al., Nature, Bd. 282 ( 1979) , S-. . 39 ; 'Kingsman et al.,

lGene, Bd. 7(1979), S. 14 1 ; Tschember et al., Gene, Bd. 10 (198O), S. 157) verwendet. Dieses Plasmid enthält bereits · das trp1-Gen, das einen Selektionsmarker für einen Mutantenstamm von Hefe, dem die Fähigkeit zum Wachstum in Tryptophan fehlt, zum Beispiel ATCC 44076 oder PEP4-1 (Jones, Genetics, Bd. 85 (1977), S. 12), bereitstellt. Die Anwesenheit der trp1-Läsion als Oharakteristikum für das Hefewirtszellengenom stellt dann eine wirksame Umgebung zum Nachweis der Transformation durch Wachstum in Abwesenheit von Tryptophan ΊΟ dar.

Beispiele für geeignete Promotorsequenzen in Hefevektoren sind die Promotoren für 3-Phosphoglycerat-kinase (Hitzeman et al., J. Biol. Chem,, Bd. 255 (198Ο), S. 2073) oder andere. gly colytische Enzyme (Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg., Bd. 7 (1968), S. 149; Holland.: et-al _{f r} Biochemistry, Bd. 17 (1978), S. 49OO), wie Enolase, GlycerinaTdehyd-3-phosphatdehydrogenase, Hexokinase, Pyruvat-decarboxylase, Phosphofruc tokinase, 'Glukose-6-phosphat-isomerase, 3-Phösphogly-

20cerat-mutase, Pyruvat-kinase, Triosephosphat-isomerase,

^: Phosphoglucose-isomerase und Glucokinase. Beim Aufbau von geeigneten- Ex.p-r.es.si-onsp'lasml.dedi werden - die·'mit ^; diesen -Genen assoziierte Terminationssequenzen ebenso in den Expressionsvektor 3' der gewünschten, zu exprimierenden Sequenz ligiert, um für die Polyadenylierung von mRNA und Termination zu sorgen. Weitere promotoren, die den zusätzlichen Vorteil der ,durch die Wachsturnsbedingungen kontrollierten Transkription aufweisen_v sind die Promotorbereiche für Alkohol-dehydrogenase 2, Isocytochrom C, saure Phosphates«, mit dem StickstoffStoffwechsel assoziierte, abbauende Enzyme und die vorer- ^: wähnten Glycerinaldehyd-S-phosphat-dehydrogenase sowie Enzyme, die. für die Verwertung von Maltose und Lactose verantwortlich sind (Holland a.a.O.). Beliebige Plasmidvektoren mit einem Gehalt an hefeverträglichen Promotor-Replikationsstartstellen- und Terminationssequenzen sind geeignet.

Neben Mikroorganismen können auch Kulturen von Zellen, die sich von mehrzelligen Organismen ableiten, als Wirte ver-

wendet werden. Im Prinzip sind beliebige, derartige Zellkulturen geeignet, unabhängig davon, ob sie von Wirbeltieren oder wirbellosen Tieren stammen. Das grösste Interesse besteht jedoch für Wirbeltierzellen. Die Vermehrung von Wirbeltierzellen in Kulturen (Gewebekulturen) ist in den letzten Jahren zu einem routinemässigen Verfahren geworden (Tissue Culture, Academic Press-, Herausgeber Kruse und Patterson, 1973)· Beispiele für derartige, geeignete Wirtszelllinien sind VERO- und HeLa-Zellen, Zellinien aus den Ovarien des Chinesischen Hamsters (CHO) und W138-, BHK-, COS-7- und MDCK-Zellinien. Expressiqnsvektoren für derartige Zellen umfassen im allgemeinen (soweit erforderlich) eine Replikationsstartstelle, einen vor dem zu exprimierenden Gen befindlichen Promotor zusammen mit eventuell erforderlichen Ribosomenbindungsstellen, RNA-Spleissstellen, eine Polyadenylierungsstelle und transkriptionale- Terminatorsequenzen.

Bei Säugetierzellen werden die Kontrollfunktionen an den Expressiönsvektoren häufig durch virales Material bereitgestellt. Beispielsweise leiten sich üblicherweise Promotoren; von Polyoma, Adenovirus 2 und sehr häufig von Simian Virus 40 (SV 40) ab. Die frühen und späten Promotoren · ·. des SV' 40-Virus sind besonders geeignet, da sie beide leicht aus dem Virus als. ein Fragment erhalten werden, das auch die SV 40-virale Replikationsstartstelle enthält (Fiers et al,, Nature, Bd. 273 (T 9 7 S) _T S. 113). Kleinere oder grössere SV 40-Fragmente können ebenfalls' verwendet werden, vorausgesetzt es ist die etwa 250 bp umfassende Sequenz von der Hind III-Stelle bis zur BgI !-Stelle y die sich in der viralen. Replikationsstartstelle befindet, vorhanden. Ferner ist es auch möglich und häuf ig erwünscht, Promotor- oder Kontrollsequenzen zu-'verwenden, die normalerweise mit der erwünschten Gen-. sequenz assoziiert sind , -vorausgesetzt diese Kontrollsequen- zen sind mit den Wirtszellsystemen verträglich.

' . ' '. ' ' '

Eine Replikationsstartstelle kann entweder durch Aufbau des .-Vektors einer exogenen Startstelle, abgeleitet beispielsweise von SV 40 oder einer anderen viralen Quelle (zum Bei-

spiel Polyoma, Adeno, VSV, BPV und dergleichen), oder durch den chromosomalen Replikationsmechanismus der Wirtszelle bereitgestellt werden. Ist der Vektor in das Wirtszellenchromosom integriert, ist dieses Chromosom häufig ausreichend.

Bei der Auswahl einer bevorzugten ;Wirtszelle für die Transfektion durch die erfindungsgemässen Vektoren, die sowohl t-PA als auch DHFR-Protein kodierende DNA- Sequenzen umfas-' sen, ist es angebracht, den Wirt entsprechend dem Typ des verwendeten DHFR-Proteins auszuwählen. Wird Wildtyp-DHFR-Protein.verwendet, wählt man vorzugsweise eine Wirtszelle mit einem Mangel an DHFR, was die Verwendung der DHFR kodierenden Sequenz als Marker für die erfolgreiche Transfektion im selektiven Medium mit Mangel an Hypoxanthin, Glycin und Thymidin ermöglicht. Eine geeignete.Wirtszelle in diesem* Fall ist die Zellinie aus den Övarien des Chinesischen¹ Hamsters (CHO) mit einem Mangel an DHFR-Aktivität. Diese Zelllinie lässt sich gemäss Urlaub und Chasin, Proc. Natl. Acad.

Sei.· (USA)., Bd. .77 (1980), S. 4216) herstellen und vermeh-. ren. . ·

Wird andererseits DHFR-Protein mit niedriger Bindungsaffinität für MTX als Kontrollsequenz verwendet, ist es nicht erforderlich, DHFR-resistente Zellen zu verwenden. Da die mutante DHFR gegen Methotrexat resistent ist,- können Medien mit einem Gehalt an MTX als Selektionsmittel verwendet werden, vorausgesetzt- die Wirtszellen sind selbst gegen Methotrexin^;empfindlich. Die meisten eukaryontischen Zellen, die zur Absorption von MTX fähig sind, scheinen- gegenüber Methotrexa.t empfindlich zu sein. Eine geeignete derartige Zelllinie ist eine CHO-Linie, CHO-K1 ATCC CCL. 61..

Die nachstehenden Beispiele beschreiben die Verwendung von E. coli mit dem trp-Promotorsystem und CHO-Zellen als -Wirtszeilen und von ExpressiOnsvektoren, die die SV'40-Replikationsstartstelle als Promotor enthalten. Der Fachmann kann jedoch auf Grund seines Fachwissens;analoge Techniken anwen-

. 19 ·

lden, um Expressionsvektoren zur Expression der gewünschten Proteinsequenzen in anderen prokaryontischen oder eukaryontischen Wirtszellkulturen aufzubauen.

C. Angewandte Verfahren -

Werden Zellen ohne erhebliche Zellwandbarrieren als Wirts·- zellen verwendet, wird die Transfektion gemäss dem Calciumphosphat-Fällungsverfahren nach Graham und Van der Eb, VilOrology, Bd. 52 (1978), S. 546 durchgeführt. Doch können auch andere Verfahren zur Einführung von DNA in Zellen zum Beispiel durch nukleare Injektion oder durch Protoplastenfusion angewandt werden.

Werden prokaryontische Zellen oder Zellen, die wesentliche Zellwandkonstruktionen enthalten, verwendet, so besteht die bevorzugte Transfektionsmethode in der Cal.ciumbehandlung unter Verwendung^: von Calciumchlorid..- gemäss; F. N. Cohen et al., PrOC. Natl. Acad. Sei. (USA), Bd. 69 (1972), S. 21Ί0.

Beim Aufbau-von geeigneten Vektoren- mit einem Gehalt an diesenKodl-erungs- und*, Kontrollsequenzen:- we-rden'';,übliche^vLigati--onstechniken angewandt. Isolierte Plasnri.de 'oder DNA-Fragmente werden zur Bildung der gewünschten Form der erforder-

25'llchen Plasmide gespalten, geschnitten und religiert.

Die Spaltung wird durch Behandlung mit Restriktionsenzym (oder Enzymen) in einem geeigneten Puffer durchgeführt. Im allgemeinen werden etwa T ug Plasmid oder- DNA-Fragmente mit

30etwa 1 unit Enzym in etwa 20 μΐ Pufferlösung verwendet. (Entsprechende Puff er. und Substratmeng.en. für. bestimmte Restriktionsenzyme werden vom:-Hersteller angegeben.) Inkubationszeiten von etwa 1 Stunde bei 37⁰C sind geeignet. Nach der Inkubation wird- das Protein durch Extraktion mit Phenol und Chloroform entfernt..Die Nucleinsäure wird aus der wässrigen Fraktion durch Fällung mit Äthanol gewonnen.

Sind stumpfe Enden erforderlich, wird; das Präparat -15 Minu-

ten bei 15⁰C mit 1Ö units Polymerase I (Klenow) behandelt, Phenol/Choroform extrahiert und mit Äthanol gefällt.

Die Auftrennung der gespaltenen Fragmente nach der Grosse wird unter Verwendung von 6 prozentigem Polyacrylamidgel gemäss D. Goeddel et al., Nucleic Acids Res., Bd. 8.(1980), S. 4057 durchgeführt.·

Zur Ligation werden etwa 'äquimolare Mengen der gewünschten Komponenten, die am Ende in geeigneter Weise geschnitten sind,' um eine korrekte Übereinstimmung - zu gewährleisten, mit etwa 10 units T4 DNA-Ligase pro 0,5 Ug DNA behandelt. (Wenn gespaltene Vektoren als Bestandteile verwendet werden, kann zur Verhinderung der Religation des gespaltenen Vektors eine Vorbehandlung mit bakterieller, alkalischer Phosphatase- durchgeführt·¹ werden. )

Für eine Analyse zur Bestätigung der korrekten Sequenzen in den aufgebauten Plasmiden werden die Ligationsgemische zur Transformation von E: coli K12-Stamm 294 (ATCC 31446) verwendet. Erfolgreiche Transformanten werden gegebenenfalls auf Grund von Ampicillinresistenz ausgewählt. Von· den''Trans· formanten werden Plasmide hergestellt, durch Restriktion analysiert und /oder nach dem Verfahren von Messing et al., Nucleic Acids Res., Bd. 9 (1981), S. 309 oder" nach dem Verfahren von Maxam et al., Methods in Enzymology, Bd. 65 (1980), S." 499 sequenziert. ' '

Die Amplifikation von DHFR-Protein kodierenden.Sequenzen wird durchgeführt, .indem man Wirtszellkulturen in Gegen- wart von Methotrexat, einem kompetitiven Inhibitor der DHFR-Ativität in Konzentrationen von etwa 20-500 ,000 nanomolar züchtet. Der wirksame Konzentrationsbereich hängt natürlich stark von der Art des DHFR-Gens, dem Protein und den Eigenschaften des Wirts ab. Im allgemeinen lassen sich klar definierte obere und untere Grenzen nicht feststellen,. Es können auch geeignete Konzentrationen von anderen Folsäureanalogen oder anderen Verbindungen, die DHFR hemmen,' ver-

wendet werden. MTX selbst ist jedoch besonders zweckmässig, leicht zugänglich und wirksam.

D. Allgemeine Beschreibung von bevorzugten Ausführungsformen . ' .

Humangewebe-Plasminogen-Aktivator wurde a"uf folgende Weise erhalten:

1. Humanmelanomzellen, die aktiv Gewebe-Plasminogen-Aktivator bildeten, wurden bis zur Konfluenz gezüchtet.

.. ' ·

2. Zellpellets^: aus diesea Zellkulturen wurden in Gegenwart von Ribonuclease-Inhibitoren gezüchtet, um die gesamte, zytoplasmatische RNA zu isolieren.'.

3· Eine oligo-dT-Säule. isolierte die gesamte messenger-RNA (mRN¹A) in polyadenylierter Form¹. Diese¹ mRNA wurde d.er Grössenf r aktionierung- unter Anwendung: der Säure—Harnstoff-Agarosegel-Elektrophorese unterzogen.

4.. Die GeIf raktion· mit eiaem- Gehalt an¹ GeWebe^-Plasminogen-Aktivator-spezifischer RNA wurde auf folgende Weise identifiziert: Die" RNA'der einzelnen Gelfräktionen wurde¹ in einem Kaninchen-Reticulocytenlysat- in vitro- System, ergänzt mit Hundepankreas-Mikrisomen, translatiert. Die erhaltenen Translationsprodukte wurden dann mit Humange-webe-Plasminogen-Aktivator-spezifischem IgG-Antikörper immunopräzipitiert.

5. Die geeignete RNA (21 bis 24S) wurde in die entsprechende einzelsträngige, komplementäre DNA (cDNA) übergeführt, aus der doppelsträngige cDNÄ gebildet;wurde. Nach¹ polydC-Schwänzen wurde es in einen Vektor eingesetzt, beispielsweise in ein Plasmid, das einen oder mehrere phänotypische Marker trug. . .. . ' ' , ·

6. Die auf diese Weise hergestellten Vektoren wurden zur Transformation von Bakterienzellen unter Bildung einer geklonten cDNA-Bibliothek verwendet. Ein Pool von radio-

aktiv markierten, synthetischen Desoxyoligonucleotiden, die komplementär zu den Kodons für bekannte Aminosäuresequenzen in t-PA waren, zum Beispiel der Pool von 8 14-meren

5'-dtC(Q)CA(g)TA(^)TCCCA-3' (komplementär zu den Sequenzen, die für die bekannte (vgl. unten) Aminosäuresequenz Tryptophan-Glutaminsäure-Tyrosin-Cystein-Asparaginsäure (W-E-Y-C-D) kodieren) wurde hergestellt und zur Markierung der Koloniebibliothek verwendet.

7- Aus den positiven cDNA-Klonen wurde Plasmid-DNA isoliert und sequenziert.

8. Die sequenzierte DNA wurde dann in vitro zur Insertion Io

in ein geeignetes Expressionsvehikel,, das zur Transformation einer geeigneten Wirtszelle verwendet wurde/ geschnitten. Die Wirtszelle wurde in einer Kultur gezüchtet, wodurch der gewünschte Humangewebe-Plasminogen-Aktivator gebildet wurde. . · .

9'. Der- auf^: diese Weise gebildete Humangewebe-Plasmiho'geri-Aktivator weist in seinem enzymatischen Serinproteaseteil etwa 251 Aminosäuren auf. Ferner besitzt er oberhalb davon eine einen "kringle" enthaltende Sequenz-, von ' .

der zur Zeit angenommen wird, dass sie für die Fibrin- ; bindung verantwortlich ist. Das reife Protein zuzüglich dessen Signalpräsequenz weist insgesamt 562 Aminosäuren auf. . . ..-.' .

Das vorstehende Verfahren selbst gewährleistet die erfolgreiche Bildung von reinem t-PA. Erfindungsgemässe Verfahren unter Anwendung ein,er zusätzlichen kodierenden, gegenüber Methotrexat empfindlichen Sequenz erlauben die Bildung von antigenaktivem t-PA-Protein in Wirtszellkulturen in Mengen

: ' . .

von mehr als 0,1 pg pro Zelle pro.Tag. Bei entsprechender Anwendung von ampiifizierenden Bedingungen können Mengen von mehr als 20 pg erhalten werden. Mit anderen Worten, es.

lassen sich Genexpressionsgrade erreichen, die zur Bildung von mehr/als. .9 χ 10" Plough-Einheiten oder bei entsprechen-

' -4

der Amplifikation von mehr als 18 χ 10 Plough-Einheiten an

t-PA-Aktivität führen. 5

Gemäss dieser Ausführungsform der Erfindung bedient man sich des Arzneistoffs Methotrexat, der.zwar normalerweise, für zur Aufnahme dieses Wirkstoffs fähige Zellen tödlich ist, der in. Gegenwart von kontrollierten Konzentrationen an MTX durch Amplifikation des Gens, das für die DHFR-kodierende Sequenz kodiert, Zellwachstum ermöglicht (R;^T. Schimke et al., Science, Bd.202 (1978), S. 1051; J. L. Biedler et al., Cancer Res., Bd. 32 (1972), S. 153; S. E. Chang et al., Cell, Bd. 7 (1976), S. 391).

Diesbezüglich ist der, Befund von Bedeutung, dass die AmpIifikation des Gens für DHFR .die Amplifikation von assoziierten Sequenzen, die für andere Proteine kodieren, verursach err kann. Dies erscheint der Fall zu sein, wenn es sich beim assoziierten Protein um Hepatitis B-Oberflächenantigen (HBsAg). (J. ' Chris tman et-al., Proc. Natl. Acad .. Sei . , _: 3d . (1982.) , S-. 1815) ,'E.. coli-Protein- XGPRT (G. Ringold et. al. , J. Molec. and Appl. Gen., Bd. 1 (198,1), S. 165) und eine endogene Sequenz aus einer DHFR/SV 40-Plasmidkombination

25-.(Ri F. Kaufman et al., J. Molec. Biol., Bd'. 159 (1982), S. 601 ) handelt.

Andere Mechanismen, durch die eine Methotrexat-Resistenz verliehen werden kann, 'umfassen die"Verminderung der Bin-dungsaffinität für das DHFR-Protein , so dass es gegenüber Methotrexat weniger empfindlich wird (W. F.'Flintoff et-al., Somat. Cell Genet. , Bd. 2 (1976), S'. 245), aber in· diesem Fall Amplifikation ebenfalls stattfindet.

Es scheint, dass die Gene für Wildtyp-DHFR und für DHFR, die gegenüber MTX resistant ist. auf Grund ihrer eigenen verminderten Bindungskapazität durch die Gegenwart von MTX amplifiziert werden. Somit wird gemäss dieser Ausführungs-

• -24- 14.11.1983·

AP G 12 K/250 611/4 62 422/12

form der Erfindung die Einwirkung der DHSR-Sequenzamplifikation.: auf; assoziierte^ proteinkodierende Sequenzen angewendet, um einen'Kontrollmechanismus bereitzustellen, der verstärkte Expressionsgrade von t-PA-Sequenzen in Gegenwart von MTX.oder aufgrund einer vorherigen Behandlung von transformierte_;n-Zlelle.ai:niit_iMTS ,erlaubt,.,

Die Erfindung soll nachstehend durch Beispiele näher erläutert werden. In der dazugehörigen Zeichnung bedeuten:

J¹Ig, 1: zeigt 10 ^SDSPAGS von mit anti t-PA IgG fällbaren

35 ' ' .. '

- -^S-markierten Proteinen, extrahiert aus Mslanomzellen mit und ohne Proteaseinhibitor;

Pig. 2: zeigt die Elektrophorese der jjknunopräzlpitierten 'Trähsia%i'Q&ä'pr^

leiteten mRHA-Praktionen^ '

Pig. 3i zeigt das Hybridisierungsmuster von 96 .mit cDHA transformierten Kolonien unter Verwendung des Pools von j P-niärkiertem 14-mer als Tracer, hergestellt auf der -^asis einer 5-Aminosäuresequenz von human t-ΡΔ; :' " . '. :

Pig. 4; zeigt eine Restriktionsendonucleasekarte ^; von human'"'· t-PA οΏΈλ in voller Länge; '

Fig.. 5a, 5b und 5c zeigen die lucleotidsequenz und abgeleitete Aminosäuresequenz von human t-PA cDHA in voller Länge;

-24a- 14.11.1.983

AP G 12 1/250 611/4 62 422/12

Pig. 6: -zeigt ein Schema des Auf baas des Expressionsplasmids ρΛΕΙΡΑ⁰;

Pig, 7: zeigt die Ergebnisse eines Fibrin-Plattentests zur Bestimmung der fibrinolytischen Aktivität der mit p^uRIPA⁰ transformierten Zellen;

Pig. 8: ist ein HPLC-Diagramm von Peptiden eines Irypsinverdauungsprodukta von human t-PA;

Pig. 9: zeigt den Aufbau eines für die direkte Expression von reif ein human, t-PA-in E. coil kodierenden Plasiaids ;

Pig. 1Oi sdigt dieErgebnisse eines Fibrin-Plattentests

zur 3estimmiin-g-. der. fibrinolytischen Aktivität von h.uiaan t-PA, das durch mit ρt-PAtrp 12 transfor-S... call- gebildet: ist^:-«j;.

Pig. 11: zeigt den Aufbau von DHPR (Mutante oder Wildtyp)/ t-PA, das zur Transformation in Säugetiergewebekulturzellen geeignete Plasmide kodiert4

Pig, 12; ist .ein schematisches Diagramm des Humangewebe-Pläsminogen-Aktivators, der .gemäß der hier in 3.1 erläuterten Methode hergestellt worden ist.

Aus führ ung sbe!spiel

In den Beispielen Wurden eine S. coli-Wirtskultur und eine GHO-Zellinie, die sich für den Typ der einzuführenden DHPR-proteinkodierenden Sequenz eignet als -V/irtszellkultur verwendet. Jedoch eignen sich auch andere eukaryontische und prokaryontische Zellen für das erfindungsgemäße Verfahren.

-24b- 14.11.1333

AP G 12 H/250 611/4 62 422/12

E«1 Expression von human t-PA-Gen j_n 5, coli IS« 1 .A -Beschreibung der Figuren

Fig. 1 ist ein Autoradiogramm eines lOprozentigen SDS-Äcrylamidgels, das das, oder die iimnunopräzipitierte(n) /~ 'S^J-Methionin-markierteCn) Protein(e), darstellt, die aas Humanmelanomz eilen in vivo während 3 Stunden sekretiert wurden, und zwar in Gegenwart (Heine b) oder Abwesenheit (Reihe a) des Proteaseinhibitors AprOtinin_o-;Hach der Iinmunopräsipitation mit Gewebe*--" Plasminogen-Aktivator-spezifischem IgG wurden drei Banden beobachtet (Reihe a), die Molekulargewichte' von-.. etwa 65.000, 63 000 bzw, 35 000 aufwiesen« In Gegenwart des Proteaseinhibitors wurde jedoch die Spesies mit einein Molekulargewicht von 35 000 nicht festgestellt. Durch die.Immunopräzipitation wurden keine* Produkte~ ausgefällt, wenn Präimmunserum verwendet' wurde (Eeihe c). Die «'änderungen und die Molekulargewichte von ^C-markierten Proteinstandards sind Ijka von Reihe a wiedergegeben.

Fig. 2 zeigt die Elektrophorese der immunopräzipitierten Translationsprodukte von aus einem Säure-Harnstoff-Agarose-

Igel isolierten RNA-Fraktionen. Eine Hauptbande wurde in den Fraktionen 7 un-d 8 nach Translation in Gegenwart von Hundepankreas-Mikrosomen unter anschliessender Immunopräzipitation mit Gewebe-Plasminogen-Aktivator- spezifischem IgG beo-

5bachtet. Diese Bande weist ein Molekulargewicht von etwa 63 000 Dalton auf. Die Grosse der in den Fraktionen 7 und

' wandernden mRNA beträgt etwa 21· bis 24 S. Die Positionen der ribosomalen RNA-Marker, die nach Elektrophorese am RNA-Harnstoff-Gel bestimmt und durch Färben mit Ethidiumbromid sichtbar gemacht wurden, sind über den entsprechenden Gelreihen angegeben.

Fig. 3 zeigt das Hybridisierungsmuster von 96 Kolonien mit

dem ³²P-dTC(i)CA(p)TA(i)TCCCA (W-E-Y-C-D)-Marker. 96indi- ^{G G T} vldüelle Transformanten wurden auf einer Mikrotiterplatte

gezüchtet, replikaplattiert und auf einer. Nitrocellulosemembran gezüchtet. Die' Kolonien, wurden sodann lysiert., die

20 bakterielle DNA fixiert und die Filter mit P-14-mer. (W-E-Y-C-D)-Markern hybridisiert. Die Filter wurden zur Entfernungvon nicht-hybridisiertem Marker gewaschen und auf Röntgenfilm., auf gelegt. Das Autoradiogramm stellt die Muster von 48 einzelnen Filtern (4600' unabhängige Kolonien) dar. Ein · Beispiel für einen positiven Gewebe-Plasminogen-Aktiyator-

cDNA-Klon. auf Filter Nummer 25 ist.als E.10 (Pfeil) gekennzeichnet.

Fig. 4 ist eine Restriktionsendonuclease-Karte der vollen Länge¹ von Humangewebe-Plasminogen-Aktivator-cDNA. Die An-„_Ω zahl und die Grosse der durch die Spaltung mit Restriktionsendonuclease gebildeten Fragmente wurde durch Elektrophorese an 6 prozentigen Acrylamidgelen bestimmt. Die Positionen der Stellen wurden durch Nucleinsäuresequenz (in Fig. 5. wiedergegeben) bestätigt. Der kodierende Bereich des gröss_o 'ten offenen Leserasters ist durch' ein Kästchen gekennzeich-

net. Der schraffierte Bereich stellt die mutmassliche Signälpeptidsequenz dar, während . der punktierte Bereich die mutmassliche Sequenz von reifem Gewebe-Plasminogen-Aktivator

(527 Aminosäuren) wiedergibt. Das 5'-Ende von mRNA befindet sich auf der linken Seite und das 3'-Ende auf der rechten Seite.- 7

Die Figuren 5A,5B und 5C erläutern die Nucleotidsequenz und die abgeleitete Aminosäuresequenz von Humangewebe-Plasminogen-Aktivator-cDNA in voller Länge. Die der reifen Sequenz vorhergehenden 35 Aminosäuren (-35 bis -1)sind als ununterbrochene Sequenz dargestellt. Es wird angenommen, dass diese Sequenz mit 35 Aminosäuren aus einer hydrophilen "pro"-Sequenz mit etwa 12 bis 15 Aminosäuren, die dem Serin (+1) des reifen Proteins vorausgeht, und einem dieser "pro"-Sequenz vorausgehenden "herkömmlichen" hydrophoben Signal . (sich erstreckend von 5' bis -35) besteht. Dieser Typ von prä-pro.-Struktur an sekretierten Proteinen wurde, bereits früher beschrieben, zum Beispiel für Präproalbuminv G-emässdieser Theorie beginnen sämtliche .sekretierten Gewebe-Plasminogen-Aktivator-Moleküle mit dem Serin (+1) als Aminoende. Eine zweite Theorie besteht darin, dass die hydrophile Sequenz an: der Funktion von Gewebe-Plasminogen-Aktivatör auf analoge .-Weise, beteiligt sein kann, wie sie ein bei Plasminogen, bei dem ein Peptid mit 10 000 Dalton vom'· aminoterminalen Bereich des nativen- Plasminogen (. GIu-Plasminogen, be-; . nannt nach dem äminoterminalen Ende) gespalten werden kann, beobachtet wurde, wodurch ein kleineres Molekül mit einem neuen Aminoende, bezeichnet als Lys-Plasminogen, erhalten wird. Lys-Plasminogen wird leichter zu Plasmin aktiviert und hat auch eine grössere Affinität für Fibrin als GIu-Plasminogen. Es wurde gezeigt, dass Plasmin die Umwandlung von GIu- in Lys-Plasminogen katalysiert. Diese Art von Kontrollmechanismuns bewirkt einen "positiven:feedback"-Mechanismus. Die ersten Mengen an gebildetem Plasmin bewir-ken neben dem Abbau von Fibrin auch eine Bildung von Plasminogenmolekülen, die leichter aktiviert werden,und gehen auch eine festere Bindung mit ihrem Substrat als natives Plasminogen ein. Es ergibt sich ein rascherer Abbau von Fibrin. Das hydrophile Peptid des Gewebeplasminogen-Ak.tivators könnte an einem ähnlichen Mechanismus beteiligt sein, so.

dass dessen Spaltung eine modifizierte Bindung des Enzyms an Fibrin ergibt. In jedem Fall wird die 35-Äminosäuresequenz als Präsequenz für das reife Protein angesehen.

Fig. 6 ist ein schematisches Diagramm des Aufbaus eines Gewebeplasminogen-Aktivators-Expressionsplasmids pARIPA°. Das Ausgangsplasmid pP.A25El 0 wurde zunächst mit Pstl verdaut, um ein 376 bp-Fragment zu isolieren, das sodann gemäss den Angaben dieser Figur verdaut wurde.

Fig. 7 zeigt das Ergebnis eines Fibrinplattentests zur Bestimmung der fibrinolytischen Aktivität des über pÄRIPA⁰ in transformierten Zellen erhaltenen Expressionsprodukts.

Fig. 8 ist ein HPLC-Diagramm .-.von Peptiden aus einem Trypsin-Verdauungsprodukt von Gewebe-Plasminogen-Aktivator (Absorption bei 210 nm). Der Pfeil identifiziert den Peak, der dem Peptid entspricht, das zur Bezeichnung des' bei der Koloniebibliothek: verwendeten Nucleotid-Markers verwendet wurde Dasdiesem Peak entsprechende^Peptid wies folgende voll-, . ständige Sequenz auf: L-T-W-E-Y-C-D-V-P-S-C-S-T-C-G-L. Die anderen Hauptpeaks wurden, in ähnlicher Weise^: sequenziert · und führten zu einer Bestätigung der korrekten Aminosäuresequenz von Humangewebe-Plasminogen-Aktivator . Zur-Bezeich-

25nung der Aminosäuren in den Peptiden wurden folgende, einbuchstabige Symbole verwendet:

Asp	D	Asparaginsäure	lie	I	Isoleucin
Thr	T,	Threonin	.Leu	. ]_,--.	Leucin
30 Ser	S-	Serin	Tyr '	Y	Tyrosin
GIu	' E	Glutaminsäure	Phe	^: F	Phenylalanin
Pro	P	Prolin	His	H	Histidin
GIy	G	Glycin	Lys	K	Lysin
AIa	A	/Alanin	Arg	R	Arginin
35 Cy s	C-	Cystein- .	Trp -;	W	Tryptophan
VaI	\V	Valin	GIn-	Q	Glutamin
Met .	M	Methionin	As η	N '	Asparagin

Fig. 9 zeigt den Aufbau eines für die direkte Expression von reifem Humangewebe-Plasminogen-Aktivator in E. coli kodierenden Plasmids. 50 μg Plasmid pPA17 wurden mit Sau3AI, HincII und Hhal verdaut und der Elektrophorese an 6 prozentigern Polyacrylamidel unterworfen. Etwa 0,5 Ug des 55 bp Sau3AI-HhaI-Fragments wurden gewonnen. In ähnlicher Weise wurden etwa 3 Ug des 263 bp Hhal-Narl-Fragments aus 80 ug des Ions pPA25E10 gereinigt, indem zunächst ein 300 bp PstI-Narl-Fragment Isoliert und' dieses Fragment mit·Hhal .

verdaut wurde. Sämtliche Verdauungsvorgänge wurden 1 Stunde bei 37⁰C durchgeführt. Die Reaktionsprokukte wurden aufge-. trennt und der Elektroelution an 6 prozentigem Polyacrylamidgel unterworfen. Die beiden angegebenen Desoxyoligonucleotide 5' dAATTCATGTCTTATCAAGT (I) und 5' GATCACTTGATAAGACATG

15(11) wurden nach der, Festphasen-phosphotriester-Methode (51) synthetisiert. 100 pMol des Oligoriucleot'ids II wurden^::in' einem 30 μΐ fassenden Reaktionsgemisch mit- einem Gehalt an 60 millimolar Tris (ph-Wert 8), 10 millimolar MgCl₀,. -T5 millimolar ^-Mercaptoäthanol und 50-uCi / P7ATP (Amersham

205000 Ci mMol ) phosphoryliert. 12 units T4-Polynucleotidkinase wurden zugesetzt. Die Umsetzung wurde 15 Minuten bei 37'⁰C durchgeführt. 1 μ± 10- millimolar ATP 'und ^:' 12 units-T4-' Kinase wurden sodann zugesetzt und die Umsetztüng. wurde weitere 3G Minuten fortgesetzt. Nach Phenol/CHCl^-Extraktion wurden das phosphorylierte Oligomer II und das 5'-Hydroxyloligomer I mit o,5 Ug.des eluierten 55 bp Sau3AI-HhaI-Fragments und 2 μg des 2.63 bp. Hhal-Narl-Fragments vereinigt und- mit Äthanol gefällt. Diese'Fragmente wurden 4 Stunden bei Raumtemperatur in 60 μΐ 20 millimolar Tris-HCl-(ph-Wert 7,5), 10 millimolar MgCl₂', 10 millimolar Dithiothreit, 0,5 millimolar ATP und 1000 units T4-DNA-Ligase verknüpft. Das Gemisch wurde 1 Stunde mit 48 units Narl, 20 units EcoRI und 40 units BgIII (zur Beseitigung der Polymerisation durch Ligation von kohäsiven Sau3AI-Enden). verdaut und der Elektrophorese an 6 prozentigem Gel unterworfen. Das 338 bp-Produkt (etwa 0,1 μ-g) wurde 'durch- Elektroelution gewonnen. Der Rest der t-PA-kodierenden Sequenzen (Aminosäuren'111 bis 528) wurden an einem 1645 b.p-Fragment durch Verdauen des

Plasmids pPA25E10 mit Narl und BgIII isoliert. Das Plasmid pLeIFAtrp103 ist ein Derivat des Plasmids pleIFA25 (52), bei dem die EcoRI-Stelle distal zum LeIF Α-Gen entfernt worden ist (53)- .3 -Ug pLeIFAtrp103 wurden mit 20 units EcoRI und 20 units BgIII 90 Minuten bei 37⁰C verdaut, der Elektrophorese an 6 prozentigem Polyacrylam.idgel unterworfen. Das grosse Vektorfrägment ( 4200 bp) wurde durch Elektroelution gewonnen. Für den endgültigen Aufbau wurden 80 ng EcoRI-BgIII pLeIFAtrp103 mit 100 ng des 1645 bp-Narl-Bglll-Fragments und 20 ng des 338 bp-EcoRI-Narl-Fragments 10 Stunden bei Raumtemperatur verknüpft. Dieses Verknüpfungsgeraisch wurde zur Transformation von E. coli K-12 Stamm 294 verwen^ det. Plasmid-DNA wurde aus 38 dieser Transformanten hergestellt mit EcoRI verdaut. 10 dieser Plasmide enthielten die gewünschten 600 bp- und 472 bp-EcoRI-Fragmente. Die DNA-Sequenzanalyse bestätigte, dass eines dieser Plasmide (pt-PAtrp12) die gewünschte Nucl.eotidsequenz an den Verbindungen zwischen trp-Promotor, synthetischer DNA und cDNA aufwies. '

'.' . '..

Fig. 10 zeigt das Ergebnis eines Fibrinplattentests zur Bestimmung der f ibrinolytischen- Aktivität- des erfindungsgemä^· ssen Gewebe-Plasminogen-Aktivator-Expressionsprodukts. Eine über Nacht.gezüchtete Kultur von E. coli W31 TO/pt-PAtrp12 in Luria-Brühe mit einem Gehalt an 5 ug ml~ Tetracyclin wurde 1:100 in M9-Medium mit einem Gehalt an 0,2 Prozent

Glucose., 0,5 Prozent Casaminsäuren und 0,5 ug' nil Tetra-r

cyclin verdünnt. Die Zellen wurden-bei 37⁰C bis zu- einem A₁-J-Q -Wert von 0,2 gezüchtet . Ind'olacrylsäure wurde in einer

Endkonzentration von 20-Ug/ml zugesetzt. Die Proben wurden

R 1

bei einem l_[-_t-₀-Wert^: von 0,5 bis 0,6 K χ 10 Zellen ml" )

durch Zentrifugation gewonnen und sofort eingefroren. Die Zellpellets wurden- in 6m Guanidin-hydrochlorid in einer Konzentration von 5 χ 10 Zellen /ml suspendiert, 10 Sekunden mit Ultraschall behandelt, 30 Minuten bei 24⁰C inkubiert und sodann 4 Stunden gegen-25 millimolar' Tris-HCl vom pH-Wert 8,0' mit einem Gehalt an 250 millimolar NaCl, 0,25 millimolar EDTA und 0,01 Prozent Tween 80 dialysiert. Nach der

1 Dialyse wurden die Proben 2 Minuten bei 13 000 g zentrifugiert und 10 μΐ der Überstände wurden jeweils auf ihre Aktivität an Gewebe-Plasminogen-Aktivator analysiert. Gemäss dem Verfahren von Granelli-Piperno und Reich (87) wurde die Platte 3,5 Stunden-.bei 37⁰C inkubiert, und die Lysiszonen wurden gemessen. Ein quantitativer Befund wurde durch Vergleich mit Verdünnungen einer Lösung von gereinigtem MeIanomgewebe-Plasminogen-Aktivator erhalten.

1OE.1.B'Quelle ,für'Gewebe-Plasminogen-Aktivator-mRNA

Es wurden Humanmelanomzellen (Bowes) verwendet. Die Melanomzellen wurden bis zur Bildung von konfluenten Monolayers in 100 ml. Earles-Minimal-Essentiell-Medien , die mit Natriumhydrogencarbonat (0,12 Prozent Endkonzentration), 2 millimolar Glutamin und 10 Prozent wärmeinaktiviertes,: fötales Kälberserüm ergänzt, waren, gezüchtet. Zur- Bestätigung,- dass die Melanomzellen in Bezug auf die Bildung von Humangewebe- Blasminogen-Aktivator aktiv waren, wurden die Humanmelanom^ zellen bis zur' Konfluenz in- einer '24 Vertiefungen aufweisenden Mikrotiterplatte entweder in Gegenwart oder Abwesenheit von 0, 33 mikromol.ar Protea.se-Inhibitor Aprotinin-/gezüchtet-. Die Zellen wurden einmal mit gepufferter'Kochsalzlösung gewaschen, und mit 0,3 ml s.erumfreiem, methioninfreiem Medium

-35 - '

versetzt, 75 μθΐ / S/-Methionin wurden zugesetzt. Die Zellen wurden 3 Stunden bei 37⁰C markiert. Nach der dreistündigen Markierungsdauer wurden die Medien von den Zellen abgetrennt und zur Immunopräzipitation entweder mit Gewebe-Plasminogen-Aktiv.ator-spezifischem IgG oder Präimmunserum behandelt <54). Die immunopräzipitierten Prudukte wurden der Elektrophorese an einem 10 prozentigen SDS-Acrylamidgel unterworfen. Das Scheibeng~el wurde fixiert, getrocknet undder Fluorigraphie unterworfen. ..'

3.5 E. 1 . C. Isolierung und Grössenfraktionierung von MessengermRNA.· '

Die gesamte RNA aus Melanomzellkulturen wurde im wesentli^--

chen nach dem Verfahren von Ward et al. (55) extrahiert. Die Zellen wurden durch Zentrifugation pelletisiert und sodann in 10 millimolär NaCl, 10 millimolär Tris-HCl vom pH-Wert 7,5, 1,5 millimolär MgCIp resuspenäiert. Die Zellen wurden durch Zugabe von NP-40 (Endkonzentration 1 Prozent) lysiert.. Die Kerne wurden durch Zentrifugation pelletisiert. Der die gesamte RNA enthaltende Überstand wurde durch mehrfache Phenol- und Chloroform-Extraktionen weiter gereinigt.Die wässrige Phase wurde auf eine .NaCl-Konzentration von 0,2 m gebracht. Anschliessena wurde die gesamte RNA durch Zugabe von 2 .Volumina Äthanol ausgefällt. Zur Reinigung, von mRNA aus den Gesamt-RNA-Präparaten wurde die oligo-dT-Cellulosechromatographie angewandt (51). Typische Ausbeuten aus TO g gezüchteten Melanomzellen betrugen 5 bis 10 mg Gesamt-RNA und. 50' bis 200 \ig Poly(A) ⁺-mRNA.

Die Fraktionierung von PolyA⁺-mRNA (200 ]ig) (56) wurde durch Elektrophorese an Harnstoff-Agarosegelen durchgeführt. Das Scheibenagarosegel .(57, 58) bestand aus 1,75 Prozent Agarose, 0,025 m' Nä-triumcitrat, pH-Wert 3,8 und 6 m Harnstoff. Die Elektrophorese wurde 7 Stunden bei 25 mA und 4⁰C durchgeführt. Das Gel wurde' sodann mit einer Rasierklinge fraktioniert. Die einzelnen Scheiben wurden bei 7O⁰C geschmolzen und zweimal mit Phenol und einmal mit Chloroform extra-

25hiert. Die Fraktionen wurden sodann mit Äthanol gefällt und anschliessend durch in vitro-Translation in einem Kaninchen-Reticulocytenlysat-System, Bethesda .Research Lab. (59, 60), ergänzt mit Hundepankreas-Mikrosomen folgendermassen getestet: Translationen wurden unter Verwendung von 25 uCi an /~ S7-Methionin und 500'ng der einzelen Gelscheiben-RNA in einem Endvolumen von 30 μΐ mit einem Gehalt an 25 millimolär HEPES, 48, 3 millimolär KCi, 10 millimolär-Kr-eatinphosphat, Aminosäuren jeweils 50 millimolär, 1,1.millimoiar Magnesiumchlorid, 16,.6 millimolär EDTA, 0,16 millimolär Dithiothreit, 8,3 millimolar Hämin, 16, 6 μg/ml Kreafin-kinase,. 0,33 millimoiar Calciumchlorid, 0,66 millimoiar EGTA, 23,3 millimoiar Natriumchlorid durchgeführt.

Die Inkubationen wurden 90 Minuten' bei 3O⁰C durchgeführt. Hundepankreas-Mikrosomenmembranen, die aus rohen Mikrosomen unter Verwendung von EDTA zur Entfernung der Ribosomen hergestellt waren (61), wurden gemäss (62) mit Nuclease behandelt. Sie lagen im Translationsgemisch in einer Endkonzentration von 7Apg₀ units/ml vor. Die Translationsprodukte oder immunopräzipitierten Translationsprodukte wurden durch Elektrophorese an 10 prozentigen Polacrylamidgelen gemäss den nachstehenden Angaben inNatriumdodecylsulfat analysiert (63). Die ungefärbten Plattengele wurden fixiert, getrocknet und der Fluorigraphie unterworfen (64).

Die erhaltenen Translationsprodukte aus den einzelnen GeI-fraktionen wurden mit Kaninchen-anti-Humangewebe-Plasminogen-Aktivator-spezif ischetn IgG immunopräzipitiert. Eine immunopräzipitierte/ Polypep.tidhauptbande wurde bei der Translation der RNA-Fraktionsnummern- 7 und 8 (Wanderung von 21 bis 24 S) mit einem Molekulargewicht von etwa 63 000 DaI-ton beobachtet. Diese Bande wurde nicht beobachtet, wenn Präimmun-IgG zur Immunopräzipitation verwendet wurde, was darauf schliessen Hess, dass diese Polypeptide für Gewebe-Plasminogen-Äktivatör spezifisch waren.

E.1.D Hersteilung einer Koloniebibliothek mit einem Gehalt an Gewebe-Plasminogen-Ak t.i vat or-Sequenzen.

5 yg gelfraktionierte mRNA (Gelscheibe 7 mRNA) wurden zur Herstellung von. doppelsträngiger cDNA nach üblichen Verfahren (52,65,66) verwendet. Die cDNA wurde an .6 prozentigem Polyacrylamidgel der Grössenfraktionierung unterworfen.cDNA mit mehr als 350 bp Länge (125 ng) wurde der Elektroelution unterzogen. 30 ng cDMA wurden mit desoxy(C)-Resten unter Verwendung von terminaler Desoxynucleotidyl-transferase (67) erweitert und mit 300 ng Plasmid-pBR'322' (68) , das in ähnlicher Weise mit desoxy (G)-Resten an der Pst- !-Stelle-geschnitten war (67 ) , verschweigst. Das verschweisste. Gemischwurde sodann, in E. coli K12 Stamm 294 (ATCC 31446) transformiert. Es wurden etwa 4600 Transformanten erhalten.

DD

E.1.E Herstellung eines DMA-Markers

Gereinigter Humangewebe-Plasminogen-Aktivator wurde gemäss dem Verfahren der Literaturstellen 19 und 20 erhalten. 5

Das Molekül wurde zur Feststellung der Bereiche, die sich am besten zur Herstellung von synthetischen Markern eigneten, auf folgende Weise zerlegt:

Um die Proteine gegenüber einer Verdauung durch Trypsin empfindlich zu machen., wurden sie reduziert und carboxymethyliert. Eine 2 ug-Probe an Gewebe-Plasminogen-Aktivator wurde zunächst über Nacht bei Raumtemperatur gegen 0,01 Prozent Tween 80 dialysiert. Das lyophilisierte Protein wurde sodann.in 12 ml 0,56 m Tris-HCl-Puffer (pH-Wert 8,6) mit einem Gehalt an -8 m. Harnstoff und 5 millimolar EDTA gelöst. Die Disulfidbindungen wurden durch Zugabe von .0,1 ml /j-Mercaptoäthanol reduziert. Diese Reaktion wurde 2 Stunden bei 45⁰C unter Stickstoff durchgeführt. Die reduzierten Disulfide wurden sodann durch Zugabe von 1,0 ml ' 1,4 m Jodessigsäure in Tm NaOH zum Carboxymethylderivat alkyliert·. Nach 20 Minuten- bei ^: Raumtemperatur wurde die Umsetzung durch .18-.stündige Dialyse bei Raumtemperatur gegen 0,01 Prozent Tween 80 gestoppt.. Sodann dann wurde' lyophilisiert.

. . ;

Das erhaltene, lyophilisierte, carboxymethylierte Protein wurde in 3 ml.0,1 m Natriumphosphatpuffer (pH-Wert 7,5) gelöst. Trypsin (TPGK) wurde in einem Verhältnis von 1:50 zugesetzt. Die Verdauung wurde bei 37⁰C durchgeführt. Nach 3 , 6 bzw. 12 Stunden wurden jeweils Aliquotanteile (0,1.ml) entnommen. Eine zweite: Trypsinzugabe; erfolgte nach 12 Stunden. Nach 24 Stunden wurde die Umsetzung durch Einfrieren gestoppt. Sie wurde bis zur Injektion in die HPLC-Vorrichtung in gefrorenem Zustand gehalten. Der Verdauungsblauf wurde durch SDS-GeIe der Aliquotanteile ermittelt. Sämtliche Gele waren leer mit Ausnahme einer schwachen Bande am 3-Stunden-Aliquotanteil. Dies zeigt, dass das 24 Stunden-Verdaüungs- produkt vollständig war und keine grosser, Peptide enthielt.

34 ^:

Eine Probe (etwa 0,5 ml) wurde in eine hochauflösende Altex C-8-Ultrasphere 5 μ-Säule mit zwei Durchläufen injiziert. Ein Acetonitrilgradient (T bis 5 Prozent in 5 Minuten, 5 bis 35 Prozent in 100 Minuten, 35 bis 50 Prozent in 30 Minuten). wurde angewandt. In einer der beiden präparativen Durchläufe wurde das eluier.te Produkt bei zwei Wellenlängen .( 210 und 280 nm) überprüft. Das Verhältnis der Absorptionen bei den beiden Wellenlängen wurde als Mass für den Tryptophangehalt der Peptide herangezogen.

'

Die Peptidpeaks, bei denen- ein Tryptophangehalt am-wahrscheinlichsten war, oder solche Peaks, die aus.anderen Gründen als geeignet erschienen wurden,zuerst sequenziert. Dies ermöglichte die Bestimmung der Sequenz um die meisten der Tryptophan.reste. Nach Sequenzieren von etwa 25 der bestgeeigneten Peptidpeaks wurden sämtliche zusammenpassenden¹ Sequenzdaten zu einem- vorlaufigen Modell der Primärstrüktur von Gewebe-Plasminogen-Aktivator vereinigt. Aus diesen Daten und dem. Modell konnten mehrere mögliche Tracer festgestellt

werden. ·

E."1 .F Identifikation- von.- Bakterienklonen mit einem Gehalt an Gewebe-Plasminogen-Aktivator-cDNA-Sequenzen

Die Kolonien wurden einzeln in Vertiefungen von Mikrotiterplatten mit einem Gehalt, an LB (93) + 5 μ-g/ml Tetracyclin gebracht und-nach Zugabe von DMSO auf eine Konzentration von 7 Prozent bei -2O⁰C gelagert. Zwei Kopien der Koloniebibliothek wurden auf Nitrocellulosefiltern gezüchtet. Die DNA einer jeden Kolonie wurde gemäss dem Grunstein-Hogness-Verfahren (69) am Filter fixiert.

Der ³²P-markierte TC(^)CA(i)TA(£)TCCCA- Tracer wurde gemäss

den vorstehenden Ausführungen aus dem synthetischen Oligo-³⁵meren (W-E-Y-C-D) 14-mer-Pool hergestellt. Filter mit einem Gehalt an 4600 Transformanten wurden 2 Stunden bei Raumtemperatur in 50 millimolar Natriumphosphat vom pH-Wert' 6,8· 5χ SSC (80), 150 ug/ml mit Ultraschall behandeltes Lachs-

sperma-DNA, 5x Denhardt-Lösung (85), 10 Prozent Formamid prähybridisiert und anschliessend mit 50x 10 cpm des markierten Tracers in der gleichen Lösung hybridisiert. Nach Inkubation über Nacht bei Raumtemperatur 30 Minuten in 6x

5SSC, 0,1 Prozent SDS, einmal in 2x SSC gewaschen und sodann 16 Stunden auf Kodak XR-5-Röntgenfilm unter Verwendung von Dupont Lightning Plus-Verstärkungsfiltern gelegt.

Plasmid-DNA wurde aus sämtlichen Kolonien nach einem Schnellverfahren (71) isoliert, wobei sich eine positive Hybridisierungsreaktion ergab. Die cDNA-In.serts aus diesen Klonen wurden sodann nach Subklonierung von Fragmenten in den M13-Vektor mp 7 (73) und nach dem chemischen Verfahren gemäss Maxam Gilbert (74) sequenziert. Fig. 3 zeigt, dass Filter 'Nummer. 25 das Hybridisierungsmuster eines positiven Gewebe-Plasminogen-Aktivator-Klons aufweist. Das. cDNA-Insert im Klon 25E10 erwies sich als DNA-kodierend für Gewebe-Plasminogen-Aktivator, was durch einen Vergleich von dessen Aminosäuresequenzen der Peptidsequenz · (vgl. oben) von gereinigtem Gewebe-Plasminogen-Aktivator und durch dessen in E. coil gemäss den vorstehenden, näheren Angaben gebildeten Expressionsprodukt-gezeigt^! wurde-. Der Klon- 25E10 war 2304 Basenpaare lang, wobei der längste, offene Ableseraster ein Protein von 508 Aminosäuren (Molekulargewicht 56 756) kodier-

25te und einen 772 bp-3'-nicht-translatierten Bereich enthielt. Diesem cDNA-Klon fehlten die N-terminalen, kodierenden Sequenzen .

E.1.G Direkte Expression von Humangewebe-Plasminogen- Aktivator-Klonin E. coli

Bezugnehmend auf Fig.. 6 wurden 50 Ug pPA25S10 (vgl. oben) mit Pstl verdaut: Das 376 bp-Fragment wurde durch Elektro-• phorese, an 6 prozentigem Polyacrylamidgel isoliert. Etwa 3 ug dieses Fragments wurden durch Elektroelution'aus dem Gel isoliert,-mit 30 units Dde I 1. Stunde bei 37⁰C verdaut, mit Phenol und Chloroform, extrahiert und mit Äthanol ge-' fällt. Die erhaltenen Dde I-kohäsiven Enden wurden durch

Zusatz von 5 units DNA-Polymerase I (Klenow-Fragment) und jeweils 0,1 millimolar dATP, dCTP, dGTP, dTTP zum Reaktionsgemisch und 8-stündige "Inkubation bei 4⁰C zu stumpfen Enden erweitert.Nach Extraktion mit Phenol und Chloroform wurde die DNA 2 Stunden mit 15 units Nar I verdaut. Das Reaktionsgemisch wurde der Elektrophorese an 6 prozentigem Polyacrylamidgel unterworfen. Etwa 0,5 yg des gewünschten 125 bpstumpfendigen Nar I-Fragments wurden gewonnen. Dieses Fragment kodiert für die Aminosäuren Nummer 69 bis 110 von reifern Gewebe-Plasminogen-Aktivator-Protein voller Länge.

Zur Isolation des 1645 bp-Nar I - BgI II-Fragments wurden 30 \ig pPa25EiO mit 30 units Nar I und 35- units BgI II 2. Stunden bei 37⁰C verdaut. Das Reaktionsgemisch wurde der Elektrophorese an 6 prozentigem Polyacrylamidgel unterworfen-. EtVa- 6 ugi des - gewünschten 1645" bp-Nar I- BgI II-Frag- ' •ments wurden gewonnen.

Das Plasmid ρ ARlSRC ist ein Derivat des Plasmids

2OpSRCexi6 (79), bei dem die Eco Rl-Stellen proximal zum trp- Promotor und distal zum SRC-Gen durch Reparatur mit DNA-

Pblym.6ra.se , I (28 )^; entfernt waren: Das selbst-kömplementäre· Oligodesoxynucleotid AATTATGAATTCAT (hergestellt nach dem Phosphortriester-Verfahren (75)) wurde in die verbleibende Eco RI-Stelle unmittelbar neben der Xba I-Stelle einge- \ setzt. 20 ug.' pARISRC wurden vollständig mit Eco RI verdaut, mit Phenol und Chloroform extrahiert und mit Äthanol gefällt. Das Plasmid wurde·sodann mit 100 units Nuclease SI 30 Minuten bei 16°C in 25 millimolar Natriumacetat (pK-Wert 4,6) mit einem Gehalt an 1 millimolar ZnCIp und 0,3 m NaCl verdaut, um ein stumpfes Ende mit der Sequenz ATG zu schaffen- Nach Extraktion mit Phenol und Chloroform und nach Äthanolfällung wurde die DNA mit Bam- HI verdaut, der Elektrophorese aη. 6 prozentigem Polyacrylamidgel unterworfen ₍ und: das grosse Vektorfragment (4300 bp) wurde durch Elektroelution gewonnen. .

; .. ' 37

Das Expressionsplasmid wurde durch 7-stündige Ligation bei Raumtemperatur von 0,2 yg Vektor, 0,06 yg des 125 bp-stumpfendigen Nar I-Fragments und 0,6 ug des 1645 bp-Nar I BgI II-Fragments mit 10 units T^-DNA-Ligase aufgebaut. Die-5ses wurde zur Transformation von E. coli Stamm 294 (ATCC 31446) zur Verleihung von Ampicillinresistenz verwendet. Plasmid-DNA wurde aus 26 der Kolonien hergestellt und mit Xba I und Eco RI verdaut. 12 dieser Plasmide enthielten die gewünschten .415 bp Xba I-Eco RI- und 472 bp-Eco RI-Fragmente. Die Analyse der DNA-Sequenz ergab, dass einige dieser Plasmide ein ATG-Initiationscodon aufwiesen, das korrekt am Start der Aminosäure Nummer 69 (Serin) plaziert war. Eines dieser Plasmide, p-RIPA⁰, wurde untersucht. Es ergab den gewünschten Gewebe-Pläsminogen-Aktivator (Fig. 7).

. ,

E. 1 ..H Gewebe-Plasminogen-Aktivator-cDNA von voller Länge-

a·. ) Herstellung einer Koloniebibliothek mit einem Gehalt an ' N-terminalen Gewebe-Plasminogen-Akt.iva.t or-Sequenzen·

0,4 ug des synthetischen Oligonucleotids 5 ^T -TTCTGAGCACAGGGG.G-3 ' wurden zum "Primen"· von 7,5 Ug Gelfraktion'Nummer 8 mRNA (vgl. oben) verwendet, um nach üblichen Verfahren (65, 66) doppelsträngige cDNA.

herzustellen. Die cDNA wurde der Grössenfraktiön'ierung an 6 prozentigem Polyacrylamidgel unterworfen. Eine Fraktion von mehr als 300 bp (36 ng) wurde der Elektroelution unterworfen. 5 ng cDNA.wurden mit desoxy (C)-Resten unter Verwendung von terminaler' Desoxycytidyl-

30, transferase (67) erweitert und mit 50 ng des Plasmids . pBR322 (68), das in ähnlicher Weise mit desoxy (G)-Resten an der Pst I-Stelle geschnitten war (67), verschweisst. Das verschweisste Gemisch wurde sodann in E. coli K12 ^: Stamm 294 transformiert. Es wurden etwa 1500 Transfor- manten erhalten.

38 Ib.) Southern-Hybrisierung von Humangenom-DNA

Da die cDNA-Primer-Reaktion unter Verwendung eines synthetischen Fragments, das 13 bp vom N-Ende des Klons pPA25E10 hybridisierte, durchgeführt worden war, stand in diesem 29 bp-Bereich (der die 16-mer Sequenz umfasst) kein geeignetes Restriktionsfragment zum Screening der cDNA-Klone zur Verfügung. Daher war es erforderlich,ein Humangewebe-Plasminogen-Aktivator-Genom-Klon zu isolie- ren, um alle Primer-erweiterten cDNA-Klone'mit einem Gehalt an N-terminalen Gewebe-Plasminogen-Aktivat'orkodierenden Sequenzen zu identifizieren.

Bei der ersten Stufe dieses Verfahrens wurde festgestellt, dass in Humangenom-DNA nur ein einziges, homologes Gewebe-Plasminogen-Aktivator-Gen vorhanden; ist. Um dies festzustellen-, wurde eine Southern-Hybridisierurig durchgeführt. Bei diesem Verfahren (77) wurden 5 Ug.hochmolekulare Humanlymphocyten-DNA (hergestellt gemäss 80) vollständig mit verschiedenen Restriktionsendonucleasen verdaut, der Elektrophorese 'an 1,0 prozentigeh Ägarosegelen unterworfen (81)' und- auf ein Nitro.cellulosefilter geblottet (77). Ein P-markierter DMA-Tracer wurde aus dem 5'-Ende des cDNA-Iserts des cDNA-Klons pPA25E10 ( ein 230 bp-Hpa. II -RSA I-Fragment) hergestellt (76) und mit dem Nitrocellulosefilter hybridisiert (82). 35.x 10 cpm des Tracers-wurden 40 Stunden hybridisiert und sodann gemäss (82) gewaschen. Zwei Endonuclease-Verdauungsmuster zeigen nur,ein einziges, hybridisierendes DNA-Fragment: BgI II (5,7 Kbp) und Pvu II (4,2 kbp) Zwei hybridisierende DNA-Fragmente.wurden mit Hinc II (5,1 Kbp und 4/3 Kbp) beobachtet. Zusammen lassen diese Daten den Schluss zu, dass im Humangenom nur ein einziges Gewebe-Plasminogen-Aktivator-Gen vorhanden ist und dass ^;dieses Gen mindestens eine Zwischensequenz (intervening sequence) enthält.

.39

lc.) Screening der Human- A -Phagenbibliothek auf Plasminogen-Aktivator-Gene

Die zur Identifizierung der ^-Phagenrekombinanten,die die Gewebe-Plasminögen-Aktivator-Gene tragen, angewandte Strategie bestand

. im Nachweis der Nucleotidhomologie mit einem aus dem Gewebe-Plasminogen-Aktivator-Klon pPA25E10 hergestellten, radioaktiven Tracers,! Million rekombinante ,i-Phagen wurden in einer Dichte von 10 OOO.'.pfu/1-5 .cm Platte auf DP 50 Sup F ausgestrichen. Nitrocellulosefilter-Replikaplattierungen wurden von jeder Platte gemäss dem Verfa'nren von Benton und..Davis (78) hergestellt. Eine 32

P-markierte DNA-Probe wurde nach üblichen Verfahren

(83) aus einem 230 bp-Hpa II - Rsa I-Fragment, das sich in einer Entfernung von 3^ bp vom 5'-Ende des Klons p25E10 befand., hergestellt. Jeder Nitrocellulosef ilter wurde bei 42⁰C zwei Stunden in 50 millimolar Natriumphosphat (pH-Wert 6 , 5) , 5x SSC ( 77) , 0·, 05 mg /ml mit Ultraschall behandelter Lachssperma-DNA, 5x: Denhardt-Lösung (84), 50 Prozent Formamid prähybridisiert und sodann mit.50 χ 10 cpm der markierten Probe in der gleiche:n Lö.s-ungi mit einem-Gehalt.. an- 10 -Prozent- Na^;triumdextransulfat hybridisiert (85). Nach Inkubation über Nacht bei 42⁰C wurden die Filter viermal bei 50⁰C 30 Minuten in 0,2x SSC, 0,1 Prozent SDS, einmal bei Raumtemperatur in 2χ SSC gewaschen und .sodann über Nacht auf Kodak XR-5-Röntgenfilme- unter Verwendung,von Dupont-Cronex-Verstärkungsfiltern aufgelegt. Insgesamt wurden 19 mit dem ' Tracer hybridisierte Klöne erhalten . Phagen-DNA wurde gemäss den vorstehenden Angabe-n (86) aus 6 Rekombinanten hergestellt. Der ; yl-Klon C wurde zur Herstellung eines Pvu II-Fragments zum Kolonlenscreening verwendet. 30 ug DNA wurden 1 Stunde bei 37°C mit Pvu II verdaut- und.der Elektrophorese an 1,0 prozentigem Agarosegel unterworfen. Ein 4,2 Kbp.--Fragme.nt, in dem vorher der Gehalt an Gewebe-Plasminogen-Aktivator-Sequenzeri nachgewiesen worden war, würde der Elektroelution

32

unterworfen und gereinigt. Ein P-raarkrerter Tracer

40 ,

wurde nach üblichen Verfahren (83) für Kolönienhybridisierungen geraäss den vorstehenden Angaben hergestellt.

d.) Screening der Kcloniebibliothek für 5'-Gewebe-Plasminogen-Aktivator-Sequenzen

Die Kolonien wurden von Platten übertragen und auf-. Nitrocelluiosefiltern gezüchtet. Die DNA der einzelnen Kolonien wurden am Filter geraäss" dem Verfahren von Grunstein-' Hogness (69) fixiert. Ein F-markierter Tracer wurde .· durch Kalbsthymüs-Primen (83.) eines 4 , 2 : kbp-Pvu II-Fragments aus einem isolierten Gewebe-Plasminogen-Aktivator-Λ-Genomklon hergestellt. Filter mit einem Gehalt an 1500 Tränsformanten wurden mit 112 χ 10 . cpm des- P-Genom-Pvu II-Fragments hybridisiert.

Die Hybridisierung'wurde 16 Stunden unter den Bedingungen gemäss Fritsch et al. (82) durchgeführt. Die Filter wurden gründlich gewaschen und sodann 16 bis 48 Stunden auf: Kodak XR-5-Röntgenfilme. unter Verwendung, von Dupont-Lightning-Plus-Verstärkungsfiltern .aufgelegt. 1.8 Κοί,οηί-e.tt.' hybridlsa'erteft-kl.ar' mi t . der G'.e-n'b'm'^:prOb'e-.-f.. Plasnild-DMÄ· wurde aus jeder dieser Kolonien isoliert, an Nitrocellulosefilter gebunden' und mit den .für die ursprüngliche

op ..-',-

Primer-Reaktion verwendeten P-markierten, synthetischen Oligonucleotid · (1 6-mer ) hybridisiert. Von den; 1 8^; Klonen hybridisierten 7 mit dem der Kinasebehandlung .unterworfenen 16-mer. Bei der Sequenzanalyse- nach Subkionierung der Fragmente in den ra13-Vektor rnp (73) ergab sich für -.

einen Klon (pPA17), dass er den korrekten 5 '-N-terminalen Bereich von Gewebe-Pla.sminogen-Aktivator , eine- Signalleitsequenz (signal leader sequence) und einen 84 bp-5'-nicht-translatierten Bereich enthielt. Aus den beiden Klonen "pPA25E10 und pPA17 wurde die vollständige Nucleotidsequenz gemäss Fig. 5 und das, Restriktionsmu-. ster (Fig. 4) von Gewebe-Plasniinogen-Aktlvator-Klon von voller Länge bestimmt.

Beim nativen Gewebe-Plasminogen-Aktivator-Molekül be- steht die Möglichkeit zur Stabilisierung durch 17 Disulfidbrücken, basierend auf der Homologie mit anderen Serinproteasen. Es gibt vier potentielle N-Glykosylierungsstellen', drei in den "kringle"-Bereichen bei asn₁₁₇, asn.nji, asn_?1o und eine potentielle Stelle im gleichen Kettenbereich bei asn^n. Variationen in der Struktur der Oligosaccharid-Liganden können für die unterschiedlichen molekularen Formen (mit Molgewichten von 65.000 bzw. 63 000) verantwortlich sein.

- E.1.1 Direkte Expression von Gewebe-Plasminogen-AktivatorcDNA-Klon voller Länge in E. coli

Eine Rekonstruktion der gesamten kodierenden Sequenz war unter Verwendung: der gemeinsamen Hha I-Restriktionsendonucleäse-Stelle, die beide partiellen Klone pPA17 und pPA25E10 gemeinsam besitzten, möglich. Ein 55 bp-Sau3AI-

Hhal-Restrikti.onsfragment, das den Aminosäuren . 5-23 entsprach, wurde aus dem Plasmid. ρ P A-17- isoliert. Die- Sau3AI-Restriktionsstelle befand- sich am Kodon 4 der angenommenen reifen, kodierenden Sequenz und wurde-zur Entfernung-· des das. Signalpeptid kodierenden Bereichs verwendet. Ein 263 bp-Hhal - NarI-Fragment (kodierend für die Aminosäuren 24-110)

25wurde ebenfalls aus dem Plasmid pPA25E10 isoliert. Zwei synthetische'.DesoxyoligonuGleotide wurden hergestellt, die dieKodons für die Aminosäuren 1-4 wiederherstellen, ein ATG-translationales Initiationskodon einverleiben und ein. Sco Rl-kohäsives Ende schaffen. Diese drei Fragmente wurden so-

3Qdann unter Bildung eines für die Aminosäuren 1-110 kodierenden 338 bp-Fragments miteinander-verknüpft. Dieses Fragment und ein 1645 bp-Narl - BgI II-Fragment aus pPA25E10 wurden sodann zwischen .den Eco RI- und BgI Il-Stellen des Plasmids pLelFAtrp 103 (53) unter Bildung des Expressionsplasmids pt-PAtrp.12 verknüpft. Das geklonte t-PA-Gen wurde unter der Kontrolle eines 300 bp-Fragments von E. coli-trp-Operon, das den trp-Promoto.r, Operator und die Shine-Dalgarno-Sequenz des trp-Leitpeptids enthält, aber das Leitpeptid

ATG-Initiationskodon nicht enthält, transkribiert (52).

E. coli K12 Stamm W3110 (ATCC 27325) mit einem.Gehalt am Plasmid pt-PAtrp12 wurde gezüchtet. Extrakte wurden zur Be-Stimmung der fibrinolytischen Aktivität hergestellt. Eine Methode zur Messung der Gewebe-Plasminogen-Aktivator-Aktivität war der Fibrinplattentest (87). Dabei wird die Menge an gebildetem Plasmin gemessen, indem man das Au.smass der Piasminverdauung von Fibrin in einer Agaroseplatte mit einem Gehalt an Plasminogen und Fibrin bestimmt. Plasmin ruft eine klare Lysiszone· in der Fibrinplatte hervor.- Aus der Fläche dieser Zone kann die Menge an in der Probe vorhandenem Gewebe-PLasminogen-Aktivator ermittelt werden. Werden Extrakte von pt-PAtrp12.-Klonen auf die Gewebe-Plasm.inogen-Aktivator-Aktivität unter Anwendung des Fibrinplattentests getestet, so ergibt sich eine klare Lysiszone.. Diese fibrinolytische Aktivität wird durch anti t-PA- IgG₍ aber' nicht durch Präimmun-IgG· oder anti- Urokinase-IgG gehemmt. Keine Aktivität ergibt sich bei einem Extrakt, der aus Zellen hergestellt ist., die zur Kontrolle das Leukocyteninterferonpla'smid pLelFAtrp 103 enthalten. Unter'Anwendung einer Eichkurve" von gereinigtem 't-PA lässt sich berechnen, dass"etwa

-Q

20 units an extrahierter Aktivität pro VO Zellen erhalten wurden (für gereinigtes t-PA: 90 000 Plough-units = 1 mg) (Fig. 10).

E.1.J Sequenzanalyse

Die Sequenzanalyse beruhte auf dem Edman-Abbau (83Ό)'. Die Probe wurde in das Probengefäss des Beckman 8903 oder 89OC-Sequenziergerät mit drehendem Probengefäss gegeben'. Poly-

R 1 1

brene (PoIy-N,N,M ,N -tetramethyl-N-trimethylenhexamethylen-

diammonium-diacetat) wurde als Träger im Gefass verwendet. (63c). Das Sequenziergerät war mit einer Kühlfalle und mit einigen Programmveränderungen zur Verringerung von Hintergrun.dpeaks modifiziert. Als Reagentien wurden die Beckman-Reagentien für Sequenzierzwecke 0,1 m Quadrol-Puffer, Phenyiisothiocyanat und Heptafluorbuttersäure verwendet.

Die gesammelten Edman-Zyklen wurden manuell zu 2-Anilino-5-thiazolinonderivaten umgesetzt. Das 1 Chlorbutan wurde unter Stickstoff getrocknet. Sodann wurde. 1,0 η HCl in Wasser zum 2-Anilino-5-thiazolinou gegeben und 10 Minuten auf

57O⁰C erwärmt, um eine Umwandlung in das 3-Phenyl-2-thiohydantoin (PTH-Derivat) durchzuführen. Der PTH-Aminosäurep.est wurde sodann in 50 prozentigem Acetonitril in Wasser gelöst und in eine Hochdruck-Flüssigchromatographievorrichtung mit Phasenumkehr -injiziert. Die einzelnen PTH-Amino- YQ säuren wurden durch Vergleich der Retentionszeiten eines Standardgemisches von PTH-Aminosäuren, die in die Konversionsflasche eingeführt und wie ein Zyklus des Sequenziergeräts behandelt wurden, identifiziert.

E.-1..K Tests zum Nachweis, der Expression von Gewebe-Plasminogsn-Aktivator

1 . Direkter Test- der Plasminbildung . '. '

a. Theorie

2® Ein empfindlicher Test für Gewebe-Plasminogen-Aktivator lässt sich durchführen,indem¹ man die durch den Gewebe-Plasminogen-Aktivator katalysierte Umwandlung von Plasminogen zu Plasmin ermittelt. Plasmin ist ein Enzym, für das chromogene Substratests zur Verfügung stehen. Diese.Tests be- ^ ruhen auf der proteolytischen Spaltung eines Tripeptids von ^; einer chromophoren Gruppe. Die Spaltungsgeschwindigkeit ist direkt proportional zur Spezifität und zur Konzentration der zu untersuchenden Protease. Die Grundlage für diesen Test ist die'Bestimmung der Menge an Plasmin, die nach Inkubation der den Gewebe-Plasminogen-Aktivator enthaltenden Lösung mit einer Plasminogenlösung entsteht. Je grosser die Aktivatormenge ist, desto grosser ist die Menge an gebildetem Plasmin. Plasmin wird auf Grund der Spaltung des chromogenen Substrats S2251 (Kabi Group, Inc., Greenwich, CT) gemessen.

b. Verfahren Ein Aliquotanteil der Probe wird mit O₁10 ml 0,7 mg/ml Plasminogen (in 0,05 m TrIs-HCl, pH-Wert 7,4" mit einem Gehalt

lan 0,012 m NaCl) vermischt. Das Volumen wird auf 0,15 ml eingestellt. Das Gemisch wird 10 Minuten bei 37⁰C inkubiert und mit 0,35 ml S2251 (1,0 millimolare Lösung im vorgenannten Puffer) versetzt. Die Umsetzung wird 30 Minuten bei 37⁰C fortgesetzt. Zur Beendigung der Reaktion werden 25-μΐ Eisessig zugesetzt. Die Proben werden zentrifugiert. Die Absorbtion bei 405 nm wird gemessen. Die quantitative Bestimmung der Aktivität erfolgt mittels eines Vergleichs mit einer Urokinase-Eichlösung. Die . Testbedingurtgen zum Nachwels des Gewebe-Plasminoge.n-Aktivators der vollen Länge werden durch Zugabe von 0,2 mg Fibrinogen zur Lösung modifiziert. Fibrinogen bewirkt eine Stimulierung der Aktivität des Gewebe-Plasminogen-Aktivators, wodurch sich eine etwas erhöhte Aktivität ergibt. Die Aktivität wird in Plough-units festgehalten, wobei 90 000 Plough-units der Aktivität von V" rag gereinigtem' Gewebe-Plasminogen-Aktivator- entsprechen'.

2. Indirekter Test der Plasminbildung '

a. Theorie

_^ Es wurde ein empfindlicher Test auf die Aktivität an Gewebe-Plasmihogen-Aktivator-entwickelt (87). Der Test beruht auf der" Bestimmung der Plasminbildung durch Messung: des' Grads- der Verdauung von Fibrin durch Plasmin in einer Agarplatte mit einem Gehalt an Fibrin und Plasminogen. Plasmin bildet eine klare ^° Lysiszone in der Fibrinplatte. Die Fläche dieser' Ly.siszone korreliert mit der Menge an Gewebe-Plasminogen-Aktivator in der Probe.

b.Verfahren

Gemäss dem Verfahren von Granelli-Piperno und-Reich (87) werden die Platten 3,5 Stunden bei 37°C inkubiert . Die Lysiszonen werden gemessen. Eine quantitative Bestimmung ergibt sich durch Vergleich mit einer Urokinase-Eichlösung.

^ Ξ. 1 .'L Nachweis der Gewebe-Plasminogan-Akt.ivator-Aktivität

1 . Bakterielles Wachstum und Probenvorbereitung· Eine Kolonie von E. coli mit. einem, Gehalt an dem Plasmid-

) wurde in ein Teströhrchen mit einem Gehalt an 5 ml LB-Wachstumsmedium mit einem Gehalt an 20 μg/ml Ampicillin überimpft. Die Zellen wurden über Nacht bei 37⁰C gezüchtet. Eine Äliquotmenge ..dieser Kultur wurde 1:100 in 300 ml M-9-Medium mit einem Gehalt an 20 ug/ml Ampicillin verdünnt. Die Zellen wurden 4 Stunden bei 37⁰C in einem Schüttelkolben gezüchtet, wobei sich eine Absorbtion bei 550 niD von 0,419 ergab. Die tryptophananaloge Indoläcrylsäure wurde in einer Konzentration von 30 ug/ml zugesetzt.

Die Zellen wurden 90 Minuten inkubiert, wobei sich eine Absorption bei 550 nmv von 0.., 6.28 ergab. Die Zellen wurden durch Zentrifugation geerntet und in 0,8-ml 0,01 m TrIs vom pH-Wert 8,0 mit einem Gehalt an 0,01 m EDTA resuspendiert. Die erhaltene Suspension wurde 18 Stunden bei Raumtemperatur rasch gerührt. Die Probe wurde zentrifugiert. Der Überstand wurde auf- die" Aktivität an- Gewebe-Plasminogen-Aktivator getestet. . .

Bezüglich der Expression von pt-PAtrp 12 wird auf die. aus- ^:. führliche Erläuterung zu Fig.. 10 verwieser;.

2 . Ak ti ν 1 tat sna c hwe i s-

Die Tabellen I und II zeigen die Ergebnisse der Aktivierung von Plasminogen durch entsprechende E. coli-Extrakte. Es bildet sich eine Aktivität, die von der Anwesenheit von Plasminogen abhängig ist (Tabelle I). Diese Aktivität wird nicht durch Präimmunserum von Kaninchen "beeinflusst, wird aber durch Antiserum, das gegen aus gereinigten Melanomzellen abgeleiteten Gewebe-Plasminogen-Aktivator hergestellt wurde

(88) ,deutlich gehemmt (Tabellen I und II). Dies zeigt, dass E. coli-Extrakte eine Plasminogen aktivierende Aktivität erzeugen, die durch Antikörper gegen den Gewebe-Plasminogen--Aktivator gehemmt wird.'- *

Fig. 7 zeigt das Ergebnis eines Fibrinplattentests auf fibriholytische Aktivität. Eine- Standardmenge an" Urokinase wurde in die Mittelreihe in Konzentrationen ' (von links nach rechts) von/ 0,24, 0,1.4, 0,10, 0,05 und 0,02 Plough-units ge-

geben. Die untere Reihe enthält Proben von natürlichem Gewebe-Plasminogen-Aktivator mit der gleichen Enzymmenge in jeder Vertiefung. Die Vertiefungen enthalten (von links nach rechts) Gewebe-Plasminogen-Aktivator, anti-Plasminogen-Akt-5vator plus Präimmunserum und Gewebe-Plasminogen-Aktivator plus Gewebe-Plasminogen-Aktivator-Antikörper. Die Vertiefungen in der oberen Reihe enthalten jeweils 8 μΐ der rekombinanten Gewebe-Plasminogen-Aktivator-E. coli-Extrakte. Die erste Vertiefung enthält das Extrakt allein, in der zweiten Vertiefung ist Präimmunserum zugesetzt und in der dritten Vertiefung -sind Gewebe-Plasminogen-Aktivator-Antikörper zugesetzt. Es ist offensichtlich, dass das Präimmunserum natürlichen oder rekombinanten Gewebe-Plasminogen-Aktivator nicht beeinflusst und dass Gewebe-Plasminogen-Aktivator-Antikörper die Aktivität von natürlichen und. von E. co-Ii-Extrakten hemmen.. Bezogen auf die Urokinas-e-Standärds enthalten die Extrakte geringfügig weniger als 2,5 Ploughunits pro ml. Dies braucht den Vergleich mit dem in Tabelle I erhaltenen Wert von 1,3 Plough-units pro ml nicht' scheuen.

; ^:

In den Tabellen I und II sind die Ergebnisse der in Ξ-.1.Κ. 1 .b. durchgeführten- Tests zusammengestellt.

	Plasminogenaktivierung	(ohne	plus Prä-	plus anti	mit	Tabelle I	prozentuale berechnete Aktivität Plough-Units/ml
25		Plasminogen)	immunserum	;ikörper	Il	durch E. coli-Extrakte von Kulturen	' (0)
		Extrakt	Extrakt		einem Gehalt an p^RlPA
	Probe	Extrakt	t-PA-Ant	ο,	nc	(100) , 1,3
	Extrakt			Ud	106..
30		ο,	043
		0,		9 . ^; . —
			451
	ο,	4?7

35	079

¹ Prozentuale Aktivität,' berechnet durch Subtraktion des Leerwerts

(0,043) von den erhaltenen Werten und Division durch den vom Extrakt erhaltenen Wert.

	Plasminogenaktivierung	Tabelle-II	-Ext	rakte.von Kulturen
5		durch E. eoli	12
	Probe	von pt-PAtrp		prozentuale Aktivität
	Extrakt Extrakt plus Präimmun- serum	Λ —ÜDR		(100) ' 101
10	0,657 0,665 -

Extrakt plus anti . 0,059

t-PA-Antikörper

Fig. 10 gibt die Ergebnisse eines Fibrinplättentests wieder, der mit Extrakten'aus'10 Liter' FermentatiOnskulturen von E'. coli mit einem Gehalt' an Gewebe-Plasminogen-Aktivator exprimierendem Plasmid durchgeführt wurde. Die f.ibrinolytische-Aktivität des Gewebe-PlasminOgen-Aktivators. mit einem

20^Gs^alt an dem Extrakt¹ ist in Fig. 10 durch die: Vertiefung- A wiedergegeben. Diese fibrinOlytische Aktivität wird durch anti-t-PÄ-IgG (Vertiefung C), aber nicht durch- Präimmun-IgG (Vertiefung B) oder durch ant'I-Urokinase-IgG ' (Vertiefung 'D)' geiiemmt. Keine Aktivität ergibt sich bei einem Extrakt, der aus Zellen hergestellt ist, die als Kontrolle das Leukocyteninterferonplasmid pLeIFAtrp103 enthalten (Vertiefung H).

E.2 Herstellung von t-PA unter Verwendung von DHFR-Protein mit geringer BindungsaffinitätV- für -MTX

. ' ; - . ' ' ';

E.2.A Vektoraufbau

Die Humangewebe-Plasminogen-Aktivator (t-PA) kodierende.Se- ' quenz wird in ein Expressionsplasmid mit einem Gehalt an mutänter DHFRmit geringer Bindungsaktivität für MTX (beschrieben in der US-Anmeldung 459.151 vom 19. Januar 1983) gemäss folgendem Verfahren (vgl·. Fig. 11) eingesetzt:

, 48

Drei Fragmente von überlappenden t-PA-Plasmiden, nämlich pPA25E10, pPA17 und pARIPA⁰ (vgl. oben) wurden folgendermassen hergestellt: Plasmid pPA17 wurde mit Dde I verdaut , unter Verwendung von Klenow DNA-Polymerase I gefüllt und mit PstI geschnitten. Das. auf diese Weise gebildete Fragment mit etwa 200 bp mit einem Gehalt an der 5' -terminalen t-PA-Sequenz wurde isoliert.Das zweite t-PA-Fragment wurde durch Verdauen von p^RIPA⁰ mit Pstl und Narl und Isolieren desFragments mit etwa 310 bp erhalten . Das dritte t-PA-Fraoment wurde 1.0 durch'Verdauen-von pPA25E10 mit Narl und BgIII und Isolieren des-etwa 1 645 '·' bp- auf weisenden-¹ Fragments , das zusätzlich zueinem Grossteil des t-PA-kodierenden Bereichs einige '3 '-nicht-translatierte Sequenzen enthält, erhalten.

Das Plasmid pE342, das HBV-Oberflächenantigen exprimiert (auch bezeichnet' als pHBs348-E) ) ist In'der-US-Patentanmeldung'' 326 980 vom 03. Dezember 1981 beschrieben. Kurz zusammengefasst, wurde die Startstelle des Simian-Virus SV 40 durch Verdauen .von ^:'SV 40-DNA mit Hindlll und Umwandeln' der Hindlll-Enden. zu E'co RI-Enden durch Zugabe eines Konverters

'"" (AGCTGAATTC) isoliert. Diese DNA wurde' mit PvüII geschnitten und mit'RI-Linkern versetzt/ Durch anschliessende/Verdauung mit Eco RI wurde das 348 bp-Fragment, ·.' das die Startstelle umspannt, durch Elektrophorese..an. Polyacrylamidgel und Elektroelution isoliert und in pBR322 geklont. Das Expressions-¹ plasmid. pHBs34-8-E wurde durch Klonen des 1986 bp-Fragments, das durch Eco RI-und Bglll-Verdauung von HBV (Animal Virus Genetics ,'(Ch.5) Acad. Press, N.Y.,' 198Ο) (das das HBsAg kodierende Gen umspannt) erhalten worden ist, in das Plasmid piML (Lusky et al., Nature, Bd.' 293 (1981), S. 79) an den Eco RI- und BamHI-Stellen aufgebaut. (pML ist ein Derivat von pBR322, das eine Deletion unter Weglassen von Sequenzen ,' die eine Hemmung der Plasmidreplikation in Affenzellen ' bewirken', aufweist). Das erhaltene Plasmid (pRI-Bgl)

'35 wurde dann mit Eco RI linearisiert, und das 348 bp-Fragment, : das den SV 40-Startbereich repräsentiert,, wurde in die Eco Rl-Stelle von pRI-Bgl. eingeführt. Das Startstellenfragment kann in beliebiger Orientierung eingesetzt werden. Da dieses

Fragment sowohl die frühen als auch die späten SV 40-Promotoren zusätzlich zur Replikationsstartstelle kodiert, konnten HBV-Gene unter der Kontrolle beider Promotoren je nach dieser Orientierung (pHBS348-E repräsentiert HBs, das unter der Kontrolle des frühen Promotors exprimiert ist) exprimiert werden. pE342 ist durch teilweise Verdauung mit Eco RI, Füllen der Spaltungsstelle unter Verwedung von Klenow-DNA-Polymerase I und Rückligation des Plasmids modifiziert, wordurch die Eco Rl-Stelle, die der SV 40-Ursprungsstelle in pE342' vorausgeht,entfernt wird. Das erhaltene Plasmid, al,s- pE342^RI bezeichnet,, wird mit Eco RI verdaut-, unter Verwendung von Klenow-DNA-Polymerase I gefüllt und mit Bam HI-geschnitten. Nach Elektrophorese an Acrylamidgel wird das Fragment mit etwa 3500 bp auf die vorstehend erläuterte Weilöse der. Elektroelution unterworfen, mit Phenol/Chloroform extrahiert' und mit Äthanol, gefällt. . . -

Der auf diese Weise hergestellte p342E-3500 bp-Vektor und die vorstehend beschriebenen M?Ä-Fragmente mit, etwa 2160 bp werden unter Anwendung von .üblichen Techniken miteinander ligiert.; Ein Plasmid mit einem Gehalt an den drei' t-PA kodierenden Fragmenten-, in' richtiger Orientierung, .wurde isoliert, charakterisiert und als pE342-t-PA bezeichnet. Dieses Plasmid wurde mit Sac II verdaut und mit bakterieller alkalischer Phosphatase (BRL) behandelt. Zur Erzeugung der DHFR-Sequenz (zusammen mit Kontrollsequenzen für dessen Expression) wurde; ein Fragment' mit etwa 1700 bp durch- SacII-Verdauung von pEHER erzeugt. (pEHER ist ein Plasmid, das mutän-te DHFR exprimiert ; vgl. US-Patentanmeldung 459 151 a.a.O. ). Dieses Fragment wurde- in das pE342-t-PA-Plasmid' unter" Bildung von pEdPAER400, einem Plasmid, das analog zu pEHER ist, mit der Ausnahme, dass der HBsAg kodierende Bereich durch' die cDNA-Sequenzen aus t-PA ersetzt ist, ligiert.

E.2.B Expression und Amplification der t-PA-Sequenz :

pETPAER400 (pETPER) wurde gemäss dem Verfahren von Graham und Van der Eb (vgl. oben) sowohl in dhfr" CHO-DUX. B-1 1 -ZeI-

50 '

Ilen als auch in DHFR⁺ CH0-K1 (ATCC CCL61) transfiziert. Transformierte dhfr~-Zellen wurden durch Züchtung irr einem Medium mit einem Mangel an Glycin, Hypoxanthin und Thymidin ausgewählt. Transformierte DHFR⁺-Zellen wurden durch Züchtung in —100 nanomolar MTX ausgewählt. Kolonien, die im entsprechenden Selektionmedium entstanden, wurden unter Verwendung von Klonierungsringen isoliert und im gleichen Medium auf mehrere Generationen vermehrt.

Zur Amplifikation wurden die Zellen aus den Kolonien in Medien mit einem Gehalt an 5 χ 10 , 10⁵, 2,5 χ TO⁵, 5 χ 10⁵

• und 10 nanomolar MTX aufgeteilt und mehrmals passagiert.

2 3 Die Zellen wurden in sehr niedrigen Zelldichten (10 -10

Zellen/Platte) in 10 cm-Schalen ausgestrichen. Die'erhalte-15nen Kolonien wurden isoliert.

Ev'2: C Testmethoden ·

Die.Expression von t-PA in den transfizierten, amplifizierten Kolonien kann zweckmässigerweise- nach ähnlichen Verfahren bestimmt werden, wie sie vorstehend unter. B. 1 .Ll ..b .angegetre-ii? sind,:

Die Koamplifikation von DHFR- und t-PA-Sequenzen wird durch Isolierung von DNA aus konfluenten Monolayers von amplifizierten Kolonien folgendermassen bestimmt: Konfluente Monolayers in 150 mm' Platten werden mit 50 ml steriler PBS gewaschen und durch Zugabe von 5 ml 0,1 Prozent SDS, 0,4m CaCl₂, 0,1'm EDTA, pH-Wert. 8 lysiert. Nach 5 bis 10 Minuten wird das Gemisch entfernt, mit Phenol und. Chloroform extra-, hiert und mit Äthanol gefällt. Die DNA wird in 1 ml (pro 150 mm-Platte) 10 millimolar Tris-HCl, pH-Wert 8,1 millimolar EDTA (TE) resuspendiert. 0,1 mg/ml 'RNase'· werden zugesetzt und die Lösung wird 30 Minuten bei 37⁰C inkubiert. Sodann wird 0,1 Prozent SDS- und 0,5 mg/ml Pronase (Sigma) zugegeben. Nach 3- bis 16-stündiger. Inkubation bei 37⁰C wird die Lösung wieder mit Phenol und Chloroform extrahiert und mit Äthanol gefällt. Das DNA-Pellet wird in 0,5 ml Wasser

1. resuspendiert und mit Restriktionsenzymen verdaut. Etwa 5 bis 10 \ig der verdauten DNA werden der Elektrophorese in einem Agarosegel (1 Prozent Agarose in Tris-Äcetat-Puffer (40 millimolar Trrs, 1 millimolar EDTA, mit Essigsäure auf den pH-Wert 8,2 eingestellt)) unterworfen; vgl. Crouse et al., J. Biol. Chem., Bd. 257 (1982), S. 7887. Nachdem Bromphenolblau-Farbstoff im Gel 2/3 der Strecke nach unten gewandert ist, wird das Gel entfernt und mit Ethidiumbromid gefärbt. Nach Sichtbarmachen der DNA mit UV-Licht wird die •10 DNA gemäss dem Verfahren von Southern, J. Mol. Biol., Bd. (1975), S. 503, auf Nitrocellulosefilter übertragen. Die Filter werden sodann mit einem der Nick-Translation unterworfenen Tracer,' der aus dem 1700 bp-SacII-Fragment von pEHER (hergestellt und hybridisiert auf die vorstehend be-15schriebene Weise) oder aus.dem etwa 1970 bp umfassenden Bglll-Fragment von p.ETPER hergestellt worden ist, unterzogen.

E.3 Herstellung von. t-PA in Konjunktion:mit_Wildtyp-DHFR- Protein

E\,3 · A-- Vektoraufbau

Auf analoge. Weise wie beim Aufbau von pETPER wird ein Plas mid mit einem Gehalt an der DNA-Sequenz, die Wildtyp-DHFR ·. kodiert, nämlich pETPFR,- aufgebaut. Der Auf bau erfolgt gemäss. Beispiel C.1.A mit der Ausnahme, dass an, Stelle des Plas'mids pEHER als Quelle für die DHFR-Pro tein-Gensequenz das -Pläsmid pE342 . HBV ; E400 . D22'(vgl.,Genentech-Anmeldung mit dem internen Aktenzeichen 100/92) verwendet wurde. Das. Plasmid -pE342.-HBV.E400.D22 ist das gleiche- wie pEHER, mit Ausnahme eines Unterschieds bezüglich eines einzigen Basenpaars zwischen Wildtyp- und Mutanten-DHFR. Somit ist das erhaltene Plasmid pETPFR in jeder Weise zu pETPER analog, mit der Ausnahme, dass die für Wildtyp-DHFR kodierende DNA-Sequenz durch die Sequenz der Mutante ersetzt ist.

E.3.B Expression der t-PA-Sequenz

pETPFR wurde zur Transfektion von CHO-Zellen mit DHFR-Mangel (Urlaub und Chasin, a.a.0.) unter Verwendung des Calcium-5.phosphat-Fällungsverfahrens gemäss Graham und Van der Eb verwendet. 21 Kolonien, die auf dem selektiven Medium (-HGT) entstanden, wurden durch Nachweis der Plasminbildung bestimmt. Dieser Machweis erfolgte auf Grund der Verdauung von Fibrin in einer Agarpiatte mit einem Gehalt an Fibrin und Plasminogen gemäss Granelli-Pipernö et al. , J. Exp. Me'd . , Bd.. 148 (1978).,· S. 223-

Vier der besten positiven Klone wurden dann quantitativ auf Plasminbildung pro Zelle gemäss dem in D.2.C erläuterten Verfahren getestet.

Auf Grund' d re's er ν quantitativ en Bestimmung, wurde festgestellt, :dass die vier untersuchten Klone bei der Bestimmung von' units/Zelle/Tag die gleiche oder eine · vergleichbare Sekretion von t-PA in das Medium aufwiesen. Subklone wurden hergestellt, indem Inocula aus zwei der Klone in getrennte . Platten mit:, einem-- GehaJ.t,.ah -KGT-MeULjJm' übe^:r.:trag-s^;EU wu'rden\, Zwei der erhaltenen Subklone, 18B und 1, wurden für die weitere Analyse herangezogen.

E.3.C Am-plifikatio.n und Grad der t-PA-Bildung

Die vorerwähnten Subklone wurden in einer Menge von 2 χ 10 Zellen pro 100 mm-Platten in 50 nanomolar MTX ausgestrichen, um die Amplifikation zu fördern. Die überlebenden Zellen ergaben—bei der vorstehend beschriebenen Bestimmung in sämtlichen Fällen im Vergleich zur unverstärkten Menge an Gewebe-Plasminogen-Aktivator-Aktivität die 10-fache Aktivität. Zwei dieser Klone wurden für die weitere Untersuchung ausgewählt und als 1-15 und 188-9 bezeichnet.

Der Subklon 1-15 wurde weiter durch überimpfen von' 2 χ\\Q° . Zellen in 100 mm-Platten mit einem Gehalt an 500 nanomolar

53 -

MTX verstärkt. Die Bestimmung der auf diese Weise amplifizierten Zellen ergab einen weiteren Anstieg (etwa um das 3-fache) in Bezug auf die t-PA-Bildung. Bei quantitativer Bestimmung gemäss dem Verfahren von C.1.C ergaben sich Mengen im Bereich von 7 χ 10" units/Zelle/Tag. Ein Teil dieser amplifizierten Zellen wurde sodann übertragen und in Gegen-, wart von 10 000 nanomolar MTX erhalten. Subklone von 1-15 undi8B-9 wurden, nachdem sie etwa 1 bis 2 Monate unter den in. Tabelle I¹ angegebenen Bedingungen gehalten worden waren, weiter getestet.

Tabelle 1 '

Zellinie	Wachstumsbedingungen	MTX	. ng	t-PA/Zelle/Tag*
^l5>¹⁵500 -'	500 nanomolar	MTX	28	,5 χ 10~³
-¹⁵SO₀:	500 nanomolar	kein MTX)	26	,Ox 10"°
¹-¹⁵5OO	(-HGT-Medium,	kein MTX)	8	,3 x 10"³
	'(-HGT-Medium,	MTX ;	18	,0, χ 10"³
20 1-15_{10 000}	10 mikromolar	MTX	29	,3 χ 10"³
.¹~¹⁵10 000	10 mikromolar	MTX'	49	,0 χ 10"³
.18B-9	50 nanomolar	MTX	14	,3 χ 10"³
18B-9	50 nanomolar	kein MTX)	14	,4 χ 10"³
25 ^18B"⁹	(-HGT-Medium,	kein MTX) -	14	,3 χ 10"³
18B-9	(-HGT-Medium,	kein:· MTX)	14	,4 χ 10"³
1	{-HGT-Medium^	kein MTX)	1	,0 χ 10~³
1	(-HGT-Medium,	0	,7^;x 10"³

* ' '

t-PA im Kulturmedium wurde quantitativ durch einen Radio-

immunoassay folgendermässen·. bestimmt: Gereinigter t-PA und gereinigter, jodierter Tracer-t-PA, die aus Melanomzellen abgeleitet waren, wurden Serienverdünnungen.auf Konzentrationen von 12,5 bis- 400 ng/ml in einem Puffer mit einem Gehalt an phosphatgepufferter Kochsalzlösung ,. pH-Wert 7 , 3 , 0,5 Prozent Rinderserumalbumin, 0,01 Prozent Tween 80 und 0.,02 Prozent MaN3 unterzogen. Entsprechende Verdünnungen der zu untersuchenden- Mediumproben wurden zu radioaktiv markierten Tracerproteinen gegeben. Man liess die Antigeneüber Nacht bei Raumtemperatur in Gegenwart einer 1:10 000-Verdünnung der IgG-Fraktion von Kaninchen-anti-t-PA-Anti-

serum inkubieren. Der Antikörper-Antigen-Komplex wurde durch zweistündige Absorption bei Raumtemperatur an Ziegen-antiKaninchen- IgG-Immunokügelchen (Immunobeads,BiοRad) präzipitiert. Die Kügelchen wurden durch Zugabe von Kochsalzlösung-Verdünnungsmittel geklärt und sodann 10 Minuten bei 2000 g bei 4⁰C zentrifugiert. Die Überstände wurden verworfen. Die Radioaktivität der Niederschläge wurde ermittelt. Die Konzentrationen wurden durch Vergleich mit Eichstandards festgelegt.

Es handelte sich um folgende Zellinien: Zellinie "1" ist ein nicht-amplifizierter' Klon aus dem ursprünglichen Satz voYr' vier"'Klönen . "'i - T5,-_oo" 'isf'ein ampli fixierter Sub kl on der Zellinie "1", die zunächst in 50 nanomolar MTX unter Bildung von 1-15 amplifiziert und sodann zur weiteren- Amplif'ikation in 500 nanomolar MTX übertragen worden ist.-1-15_1Q. Q₀Q ist. ein Subklon von 1-15^₀₀,der weiter in Gegenwart von .10 000 nanomölar 'MTX' amplifiziert' worden ist. Die/ Zellinie 18B-9 ist ein Subklon von einem der ursprünglichen vier nachgewiesenen Klone, der mit 50 nanomolar MTX •amplifiziert worden ist. · 20

Sämtliche amplif izierten Zellen; zeigen eine erhöhte "t-P'Ä-^:- Bildung im. Vergleich zur:, nicht-ampüf izierten * Zellkurt'ür'. Auch die nicht-amplif izierte Kultur bildet t'-PA-Hengen von mehr als 0,5 pg/Zelle/Tag. Durch Amplifikation nähert man sich der Menge- von 50 pg/Zelle/Tag.

F. Arzneimittel-

Die Verbindungen der Erfindung können nach an sich bekannten

Verfahren zu Arzneimitteln formuliert werden,- wobei das erfindungsgemässe Humangewebe-Plasminogen-Aktivator-Produkt mit einem pharmakologisch verträglichen Träger vermischt wird. Entsprechende Träger und deren Herstellung, unter' Einschluss von anderen Humanproteinen, wie Humanserumalbumin,

sind zum Beispiel in' Remington's Pharmaceutical Sciences, E. W. Martin-, erläutert.. Diese Arzneimittel enthalten eine wirksame: Menge des erfindungsgemässen Proteins zusammen mit einer entsprechenden Trägerstoff menge,. so dass p.harmakolo-

DD

gisch verträgliche Arzneimittel, die sich zur wirksamen Verabreichung an einen Wirt eignen, gebildet werden.

Beispielsweise kann der erfindungsgemässe Humangewebe-Plas-

5minogen-Aktivator parenteral an Patienten, die an kardiovaskulären Krankheiten oder Zuständen leiden, verabreicht werden. Die, Dosierung bei Patienten mit Pulmoharembolie kann entsprechend der gegenwärtigen Praxis bei .klinischen Untersuchungen von anderen kardiovaskulären-, thrombolytischen Mitteln erfolgen, zum Beispiel durch eine intravenöse Anfangsdosis von etwa 440 IU/kg Körpergewicht, gefolgt von einer 12-stündigen, kontinuierlichen, intravenösen Infusion von etwa 440 IU/kg/Stunde.

Ein Beispiel für eine entsprechende Dosierungsform für im

wesentlichen- homogenen Humangewebe-Plasminogen-Aktivator zur parenteralen Verabreichung sind Fläschchen mit einem Gehalt an 25 0Ό0 IU Gewebe-Plasminogen-Aktivator-Aktivität, 25 mg Mannit und 45 mg; NaCl., die für die intravenöse Verabreichung mit 5 ml sterilem Wasser-für' Injektionszwecke rekonstituiertund mit einem entsprechendem Volumen an 0,9 prozentiger-. Natriu-mc-hlorldlösung- oder 5 prozentiger Dextroselösung für Injektionszwecke vermischt werden können.

G. Ausführliche Beschreibung von rekombinanter human t-PA

Die Struktur des gemäs.s den Beispielen hergestellten human t-PA wurde näher untersucht, und zwar sowohl durch Aufklärung der Genkodierungssequenz und durch biochemische Proteinuntersuchungstechniken.Gegenwärtig nimmt man die in /ig·- 12. dargestellte Proteinstruktur an.

Durch Collen et al. (88) wurde- auch nachgewiesen, dass zweikettiger .human t-PA durch proteolytische Spaltung des- einkettigen Moleküls in zwei durch Disulfidbindung verbundene Polypeptide erfolgt. Die gegenwärtigen Befunde erlauben den Schluss, dass die schwere Kette (Molekulargewicht 30 882) sich vom NH_?-terminalen Teil ableitet und die leichte Kette

(Molekulargewicht 28 126) den COOH-terminalen Bereich umfasst. Die N-terminale Sequenzierung des zweikettigen Moleküls legt den Schluss nahe,, dass die zweikettige Form durch

t

Spaltung einer' einzigen Arginyl-Isoleucin-Bindung entsteht (Fig..12, Pfeil). '

Die.primäre Struktur eines "Teils des Bereichs der schweren Kette von human t-PA (Fig. 12) zeigt ein hohes Ausmass an Sequenzhomologie mit den "kringle"-Bereichenvon Plasminogen (89) und- Prothrombin (40, 41). Der "kringle"-Bereich bezieht sich auf eine,charakteristische, dreifache Disulfidstruktur im "pro"-Fragment von Prothrombin, was zunächst von Magnusson et al. (91, 92) näher beschrieben wurde. In der Primärsequenz von t-PA sind zwei sogenannte "kringle"-Bereiehe von jeweils 82 Aminosäuren erkennbar, die ein hohes Ausmass an Homologie mit den 5- "kringle^-Bereichen' von Plasmi-. nogen zeigen. Die restlichen N-terminalen 91'Aminosäuren zeigen wenig Homologie mit dem üblichen "kringle"-Bereich. Es lässt sich jedoch vermuten, dass dieser Bereich ebenfalls eine Struktur mit einem Gehalt an mehrfachen Disulfidbindungen annehmen kann, da dort 11 weitere'Cysteinreste' vor- ha^l;nden- sind.^: '.

Das katalytische. Zentrum der; leichten Kette von human t-PA, der sogenannte Serinproteasebereich ist wie bei anderen Serinenzymen vermutlich aus den Resten Histidin,₂₂, Asparaginsäure.,,-,... und Serin_ü7g gebildet. Ferner zeigen die diese Reste umgebenden Aminosäuresequenzen eine strake Homologie zu entsprechenden Teilen anderer Serinproteasen, wie Trypsin, Prothrombin und Plasminogen. :

Claims

ü_f υ id β / άο υ οίί/4 -57- 62 422 12

rf irtdung sanspruch

1. Verfahren zur Herstellung von Humangewebe-Plasminogen-Aktivator (HPA,.gekennzeichnet dadurch, daß eine. Expression von DNA, die HPA kodiert, in einer rekombinanten Wirtszelle durchgeführt wird.

2, Verfahren nach"Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß man aX_einen .replizierbaren Expressionsvektor herstellt, der zur Expression der HPA kodierender. DNA-Sequenz in einer geeigneten Wirtszelle in der Lage ist, "b) eine Wirtszellenkultur zur Bildung einer rekombinanten Wirtszelle transformiert,

c) die rekombinanten Wirtszellen unter Bedingungen züchtet, die eine Expression der HPA kodierenden DiIA-S equenz zur Bildung von HPA erlauben, und
ά) 'HPA-gewinnt»

3« Verfahren nach Punkt 2, gekennzeichnet dadurch, daß man die Wirtszellenkultur mit dem Plasraid oder p.t-PAtrp 12 transformiert.
4. Verfahren nach Punkt 2 oder 3, gekennzeichnet dadurch, daß man eine Mikroorganismenkultur oder Zellkultur verwendet.
5. Verfahren nach Punkt 4₅ gekennzeichnet dadurch, daß man einen 3, coil—Stamm:verwendet, ' · .

6. Verfahren/nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß ein HPA hergestellt wird, der nicht von assoziierter nativer Gl 3; c ο syl ie rung begleitet ist.
7. Verfahren nach Punlct 1, gekennzeichnet dadurch, daß ein

HPA hergestellt wird, der eine Polypeptidsequenz enthält, die sich vom N—Ende der üblicherweise- ersten Aminosäure des HPA erstreckt-.

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