DE3854537T2

DE3854537T2 - Dekonvolution von chromatographischen Peaks.

Info

Publication number: DE3854537T2
Application number: DE3854537T
Authority: DE
Inventors: Richard F Lacey
Original assignee: Hewlett Packard Co
Current assignee: HP Inc
Priority date: 1987-05-29
Filing date: 1988-05-27
Publication date: 1996-03-21
Anticipated expiration: 2008-05-28
Also published as: EP0294121A2; JP3045729B2; JPS63308560A; US4807148A; EP0294121A3; EP0294121B1; DE3854537D1

Description

Hintergrund der Erfindung

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Chromatographie und insbesondere auf ein System, ein Programm und ein Verfahren zum Bestimmen von Komponentenspektren eines Chromatogramms mit überlappenden Komponentenspitzen.
Die analytische Chemie verschaffte den Wissenschaftern die Fähigkeit, chemische Systeme in ihre Bestandteile zu zerlegen, wobei deren Eigenschaften dann einzeln untersucht werden können. Die Chromatographie trägt zu dieser Fähigkeit bei, indem sie es Wissenschaftlern ermöglicht, die Identität und die relativen Konzentrationen von Verbindungen in einem Gemisch zu bestimmen. Das Gemisch selbst kann das Ergebnis der Zerlegung einer hochkomplexen molekularen Struktur sein, wie z.B. eines Proteins, so daß die Chromatographie als ein Teilverfahren bei der Untersuchung komplexer Moleküle verwendet werden kann.
Die Chromatographie schließt den Fluß einer mobilen Phase über eine stationäre Phase ein. Jede Komponente eines Gemischs wird zwischen diesen zwei Phasen entsprechend einem charakteristischen Verhältnis geteilt. Wenn sich die mobile Phase an der stationären Phase vorbeibewegt, tritt eine wiederholte Absorption und Desorption einer Komponente mit einer Geschwindigkeit auf, die hauptsächlich durch das Verteilungsverhältnis derselben zwischen den zwei Phasen bestimmt ist. In dem Maß, in dem sich die Verteilungsverhältnisse derselben unterscheiden, bewegen sich die Komponenten des Gemischs mit verschiedenen Geschwindigkeiten.
Wenn die Verteilungsverhältnisse ausreichend verschieden sind, können die Komponenten des Gemischs in eine Reihe von Bändern aufgelöst werden. Für die einzelnen Bänder können dann spektrale Verteilungen bestimmt werden. Eine spektrale Verteilung kann eine von mehreren Typen sein, die allgemein der spezifischen chromatographischen Technik entsprechen, die angewendet wird. Z.B. kann bei einem Flüssigkeits-Chromatographiesystem, bei dem eine mobile flüssige Phase durch eine stationäre feste oder flüssige Phase geleitet wird, ein Diodenarraydetektor verwendet werden, um das sichtbare Licht oder die ultravioletten Spektren der eluierenden Komponenten zu bestimmen. Alternativ können Gas-Chromatographiesysteme, bei denen eine mobile Gasphase durch eine stationäre feste oder flüssige Phase geleitet wird, eine Fouriertransformations-Infrarot-Spektroskopie oder eine -Massenspektroskopie verwenden, um Chroinatogramme zu erhalten.
Wenn die Komponenten des Gemischs ausreichend aufgelöst sind, sind die Spektren, die gemessen werden, wenn eine chromatographische Spitze eluiert, diejenigen, die für eine einzelne Komponente charakteristisch sind. Jedoch tritt bei komplexen Gemischen ein bestimmtes Überlappen der reinen Komponentenspektren auf.
Die Spektren, die eine Überlappung bilden, können manchmal entfaltet werden, d.h. mathematisch bestimmt werden. Wenn eine Entfaltung möglich ist, ist dieselbe häufig effektiver und effizienter als aufeinanderfolgende chromatographische Läufe, die eigentlich verwendet werden könnten, um überlappende Spitzen aufzulösen.
Eine Entfaltung kann unter jeder der folgenden Bedingungen unkompliziert angewendet werden: 1) die spektralen Verteilungen der Komponenten sind bekannt, z.B. wenn nur die relativen Konzentrationen der Komponenten unbekannt sind; und 2) maximal zwei Spitzen überlappen. Komplexere Überlappungen können auf eine relativ unkomplizierte Art gehandhabt werden, indem komplexeren spektralen Verteilungen bestimmte Annahmen auferlegt werden. Man kann z.B. annehmen, daß die unbekannten spektralen Verteilungen eine bestimmte Form aufweisen. Eine derartige Annahme kann die Komponentenbestimmung erleichtern, wenn sie korrekt ist. Andererseits kann die Aufbürdung strenger Annahmen die Wahrscheinlichkeit erniedrigen, daß die erhaltenen Bestimmungen gültig sind, wodurch das Vertrauen in die Ergebnisse derartiger Verfahren begrenzt ist.
Verfahren, die ausreichend leistungsfähig sind, um bis zu drei überlappende Komponentenspitzen zu entfalten, obwohl höchstens eine schwache Annahme bezüglich der Spitzenform auferlegt wird, können entsprechend dem Typ der verwendeten Normierung grob kategorisiert werden, d.h. es existieren Flächennormierungsverfahren und euklidische Normierungsverfahren.
Flächennormierungsverfahren, wie z.B. das, das von R. F. Lacey in dem Artikel "Deconvolving of Overlapping Chromatographic Peaks", Analytical chemistry, Bd. 53, Nr. 7, Juni 1986, S. 1404-1410, Washington, US, beschrieben wird, ermöglichen eine Darstellung der chromatographischen Daten in einer Ebene, in der binäre Gemische sich ändernder, relativer Konzentrationen entlang eines Liniensegments liegen, das durch Endpunkte definiert ist, welche die reinen Komponentenspektren der reinen Verbindungen in dem Gemisch darstellen. Nach der Intervallauswahl wird eine Faktoranalyse durch das Begrenzen der Faktoren auf die drei grundsätzlichen Faktoren durchgeführt. Dies ermöglicht eine unkomplizierte, lineare Extrapolation der reinen Komponentenspektren wie folgt. Bei einer gegebenen chromatographischen Eluierungsseguenz einer Verbindung A allein, von A gemischt mit einer Verbindung B, von B gemischt mit A und einer Verbindung C, von B gemischt mit C und c allein, entspricht das reine Komponentenspektrum für B dem Schnitt der geraden Liniensegmente, die während der binären Gemischeluierungen A mit B und B mit C definiert werden. Dieses zuverlässige Verfahren zum Extrapclieren reiner Komponentenspektren kann als eine Basis zur Bestimmung der Konzentrationsprofile für jede eluierende Verbindung, die in einem Chromatogramm dargestellt ist, dienen.
Bei der Flächennormierung existieren zwei elementare Nachteile. Der erste besteht darin, daß dieselbe Kleinsignalregionen relativ zu Großsignalregionen verstärkt, wodurch ein Rauschen relativ zu dem Signal verstärkt wird. Der zweite besteht darin, daß die Flächennormierung eine Division durch Null und Beträge, die beinahe Null sind, ermöglicht, wenn sowohl positive als auch negative spektrale Komponenten eingeschlossen sind, wodurch eine beliebige, mögliche Interpretation der Ergebnisse mit großen Werten geringer Gültigkeit verfälscht wird.
Obwohl es nicht wahrscheinlich ist, daß das zweite Problem unter Verwendung roher chromatographischer Daten, wobei in diesem Fall alle Spektraldaten als bestimmt angenommen werden können, signifikant ist, gibt es viele Situationen, in denen erwartet wird, daß negative Werte auftreten können. Es ist häufig vorteilhaft, die Spektren derart zu modifizieren, daß die Summe der Elemente Null oder sehr gering ist. Z.B. könnte man einen konstanten Versatz einer unbekannten Amplitude jedes Elements eines Spektrums korrigieren, indem gefordert wird, daß der Durchschnitt der Elemente Null ist. Weitere, üblicherweise verwendete Modifikationen der Spektren schließen die Verwendung der ersten oder höherer Ableitungen der Spektren anstelle der Spektren selbst ein. Da die Summe der Elemente dieser modifizierten Spektren sehr klein sein kann, sind diese Modifikationen mit der Flächennormierung inkonsistent, welche dazu führt, daß die Summe Eins ist.
Bei euklidischen Verfahren wird die Summe der Quadrate der Elemente jedes Spektrums auf Eins eingestellt und nicht die Summe der Elemente. Im Vergleich zu der Flächennormierung werden Starksignalbereiche über die relativ verrauschten Schwachsignalbereiche hervorgehoben. Die Terme einer Summe von Quadraten gleichen einander nicht aus, so daß beim Behandeln von Daten, die sowohl positive als auch negative Werte annehmen, keine besondere Schwierigkeit auftritt. Daher ist die euklidische Normierung mit Verfahren kompatibel, die eine Basislinien-Korrektur verwenden oder Ableitungen der Spektren benutzen.
Jedoch erlaubt der Polarkoordinaten-Bezugsrahmen, der unter Verwendung der euklidischen Normierung erzeugt wird, keine lineare Extrapolation der reinen Komponentenspektren. Folglich besaßen die vorher genannten Verfahren der euklidischen Art einen oder mehrere der folgenden Nachteile: 1) einen Bedarf nach Annahmen bezüglich der Spitzenform; 2) eine Schwierigkeit beim Bestimmen eines Vertrauenspegels oder einer Fehlergrenze für das erhaltene Ergebnis; 3) eine Ungenauigkeit der Ergebnisse; und 4) große Berechnungsanforderungen.
Außerdem bürden einige euklidische Lösungsansätze den chromatographischen Spektren Annahmen der Nicht-Negativität auf. Derartige Lösungsansätze sind mit bestimmten Basislinien- Korrekturtechniken nicht kompatibel, die vor der Analyse auf das Chromatogramm angewendet werden können, wie z.B. diejenigen, die negative Absorptionsspitzen ergeben.
Wie angezeigt wurde, sind verfügbare Verfahren zum Entfalten von Chromatogrammen, in denen bis zu drei unbekannte spektrale Komponenten überlappen, auf verschiedene Arten begrenzt, welche die Genauigkeit und den Berechnungswirkungsgrad einschließen. Ferner ist in den meisten Fällen kein Maß für die Fehler in den erhaltenen Abschätzungen vorgesehen.
Demgemäß ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein verbessertes System, ein Programm und ein Verfahren zum Entfalten von Chromatogrammen mit bis zu drei unbekannten, sich überlappenden, spektralen Komponenten zu schaffen. Die Verbesserung besteht teilweise aus einer verbesserten Kombination des Berechnungs-Wirkungsgrads und der -Genauigkeit. Zusätzlich ist eine Fehlergrenze für die Abschätzungen vorgesehen.

Zusammenfassung der Erfindung

Gemäß der vorliegenden Erfindung gemäß Anspruch 1 (Verfahren) und Anspruch 9 (Vorrichtung), ermöglicht es die Verwendung einer geeigneten Koordinatentransformation, daß eine lineare Extrapolation mit einer euklidischen Normierung verwendet wird. Das neuartige euklidische Extrapolationsverfahren kombiniert die Vorteile der bekannten euklidischen und der Flächennormierungs-Verfahren. Spektren, die als euklidische, normierte, lineare Kombinationen von Hauptfaktoren ausgedrückt sind, werden auf eine Ebene abgebildet, so daß Gemische von zwei spektralen Komponenten auf geraden Linien liegen, wobei die Endpunkte derselben die Spektren der einzelnen Komponenten darstellen. Anfängliche Abschätzungen der Komponentenspektren können dann durch Extrapolation erhalten werden. Danach kann eine Fehleranalyse angewendet werden, um für die Abschätzung eine Fehlergrenze zu schaffen und verbesserte Abschätzungen zu liefern.
Anfänglich wird aus einem Chromatogramm ein interessierendes Intervall ausgewählt. Vorzugsweise wird das Intervall derart gewählt, daß die Enden des Intervalls von jeweiligen, einzelnen Komponentenspektren dominiert werden. Z.B. könnte ein Intervall eine Spitze und relative Minima auf jeder Seite der Spitze einschließen. Die Daten in dem Intervall werden dann in euklidische, normierte, lineare Kombinationen dreier Hauptfaktoren umgewandelt, die durch eine Faktoranalyse der Daten erhalten werden.
Geometrisch sind die umgewandelten Daten auf die Oberfläche einer Einheitskugel begrenzt. Folglich können die umgewandelten Daten in Kugelkoordinaten e, einem Polarwinkel, und , einen Azimutalwinkel uin einen Äguator, neu ausgedrückt werden. Diese sphärische Darstellung der Daten kann mittels der Transformation X = tanΘ cos , Y = tanΘ sin auf eine Ebene abgebildet werden. Dies bildet eine typische Reihe von spektralen Daten auf eine Kurve ab, die alternierend geradlinige Segmente und mehr oder weniger abgerundete Scheitelpunkte aufweist, wobei die Kurve in einer "Hauptfaktor"-Ebene liegt.
In dieser Hauptfaktorebene liegen Mischungen von zwei Komponentenspektren auf einem geradlinigen Segment, das durch die Punkte, die die einzelnen spektralen Komponenten darstellen, definiert ist. Folglich kann die Extrapolation der geradlinigen Segmente, die zwei binäre Mischungen mit einer gemeinsamen Komponente darstellen, einen Schnitt ergeben, der das Spektrum dieser gemeinsamen Komponente darstellt. Folglich kann die Extrapolation verwendet werden, um die Spektralverteilung aller Komponenten zwischen der ersten und der letzten in dem Intervall zu bestimmen.
Wenn mehr als drei Komponenten auftreten, können genauere Abschätzungen erhalten werden, indem jeder abgerundete Scheitelpunkt in der Ebene der Hauptfaktoren im Zusammenhang mit einem Spektralkurvensegment, das nur drei Scheitelpunkte einschließt, den ausgewählten Scheitelpunkt und diejenigen, die demselben unmittelbar vorhergehen und nachfolgen, analysiert wird. Für jedes Kurvensegment wird das entsprechende Teilintervall faktormäßig analysiert und in ebene Koordinaten umgewandelt, wie oben beschrieben wurde, derart, daß der ausgewählte Scheitelpunkt extrapoliert werden kann, um eine Abschätzung für die entsprechende Komponente zu ergeben.
Die Endkomponenten jedes spektralen Kurvensegments werden durch das Auswählen eines besten Punkts in dem ursprünglichen planaren Ausdruck bestimmt. Das obige Verfahren wird für jeden Zwischenscheitelpunkt wiederholt, um Abschätzungen für alle Komponenten des interessierenden Intervalls zu erhalten. Die Abschätzungen können verwendet werden, um die zugehörigen Verbindungen zu identifizieren. Die Verteilung jedes Komponentenspektrums kann über das Intervall integriert werden, um die relativen Konzentrationen jeder Verbindung in dem ursprünglichen Gemisch zu bestimmen.
Fehler in den abgeschätzten Komponentenspektren können durch Auswerten der Konzentrationsmatrix C abgeschätzt werden, deren Zeilen die berechneten Eluierungsprofile für die Komponenten sind, und deren Spalten die berechneten Konzentrationen, die aus jedem experimentellen Spektrum herausgefunden werden, sind. Alle negativen Werte und alle Werte jenseits einer vorbestimmten Anzahl von Standardabweichungen von der entsprechenden Spitze werden auf Null gesetzt, während die verbleibenden Werte skaliert werden, derart, daß die Summe der Elemente in jeder Spalte zurückbehalten wird. Der Unterschied zwischen der ursprünglichen Matrix und dieser überarbeiteten Matrix ist eine abgeschätzte Fehlermatrix, die verwendet werden kann, um den Fehler in den abgeschätzten Komponentenspektren zu bestimmen.
Dieser Fehler in den abgeschätzten Komponentenspektren kann verwendet werden, um überarbeitete, abgeschätzte Komponentenspektren herzuleiten, wobei die Fehlerabschätzung wiederholt werden kann, bis eine zufriedenstellende Konvergenz erreicht ist. Der verbleibende Fehler ist eine Komponente in dem Gesamtfehler. Diese kann mit dem abgeschätzten Rauschen und der Norm der Unterschieds zwischen dem gesamten Signalchromatogramm und dem neu aufgebauten, gesamten Signalchromatogramm kombiniert werden, derart, daß eine Gesamtfehlergrenze unter Verwendung bekannter Techniken gebildet werden kann.
Die Erfindung kombiniert die Verwendung der euklidischen Normierung der Gemischspektren mit der Darstellung dieser Spektren als Punkte auf einer Ebene, wobei die Punkte, die Gemische zweier Verbindungen darstellen, auf einer geraden Linie liegen. Eine gerade Linie ermöglicht eine lineare Extrapolation, die zum Herstellen von Abschätzungen der Spektren reiner Verbindungen nützlich ist.
Die euklidische Normierung ist gegenüber einer Normierung, bei der die Summe der Elemente in einem Spektrum Eins sein muß, bevorzugt, da es häufig vorteilhaft ist, die Spektren derart zu modifizieren, daß die Summe der Elemente Null oder sehr gering ist. Z.B. könnte man einen konstanten Versatz einer unbekannten Amplitude jedes Elements eines Spektrums korrigieren, indem gefordert wird, daß der Durchschnitt der Elemente Null ist. Weitere, üblicherweise verwendete Modifikationen der Spektren schließen die Verwendung der ersten oder höherer Ableitungen der Spektren anstelle der Spektren selbst ein. Da die Summe der Elemente dieser modifizierten Spektren sehr klein sein kann, sind diese Modifikationen mit einer Normierung inkonsistent, bei der die Summe Eins ist.
Ferner ermöglicht es die vorliegende Erfindung, daß die Ergebnisse relativ schnell erhalten werden, obwohl die gesamten verfügbaren Daten verwendet werden. Bei dem iterativen Zielübertragungs-Faktoranalyse-Verfahren, das oben in dem Hintergrundabschnitt erörtert wurde, muß man die Hauptfaktoren viel größerer Datenarrays herausfinden als es bei der vorliegenden Erfindung erforderlich ist. Die Zeit, die erforderlich ist, um die Hauptfaktoren zu berechnen, erhöht sich mit der Größe des Arrays schnell.
Außerdem werden keine starken Annahmen über die Spitzenformen getroffen. Daher können aus den Spitzenformen, die herausgefunden werden, Informationen erhalten werden. Weitere Merkmale und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden aus der nachfolgenden Beschreibung bezugnehmend auf die folgenden Zeichnungen offensichtlich.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 ist eine graphische Darstellung von chromatographischen Daten aus ultraviolettem und sichtbarem Licht, die das Absorptionsvermögen als eine Funktion der Wellenlänge und der Zeit zeigt.
Fig. 2 ist eine schematische Darstellung eines Systems zum Erhalten und Analysieren chromatographischer Daten gemäß der vorliegenden Erfindung.
Fig. 3 ist ein Flußdiagramm eines Verfahrens des Analysierens chromatographischer Daten gemäß der vorliegenden Erfindung.
Fig. 4 ist eine graphische Darstellung der Spektren des ultravioletten und des sichtbaren Lichts der Flüssigkeitschromatographiedaten, die in einer Ebene von drei Hauptfaktoren ausgedrückt sind.
Fig. 5 ist eine Umgestaltung eines Chromatogramms für ultraviolettes und sichtbares Licht, welches mit Komponentenverteilungen gezeigt ist, die unter Verwendung des chromatographischen Ausdrucks von Fig. 4 bestimmt sind.
Fig. 6A ist eine graphische Darstellung des Spektrums der zweiten Komponente von Fig. 5, wie sie gemäß der vorliegenden Erfindung bestimmt wurde.
Fig. 6B ist eine graphische Darstellung des Spektrums der zweiten Komponente von Fig. 5, die chromatographisch gut isoliert ist.
Fig. 7 ist eine graphische Darstellung von chromatographischen Daten einer Gaschromatographie und einer Massenspektroskopie, die in einer Ebene der drei Hauptfaktoren ausgedrückt sind.
Fig. 8 ist eine Umgestaltung des Chromatogramms einer Gaschromatographie und einer Massenspektroskopie, das mit Komponentenverteilungen, die unter Verwendung des chromatographischen Ausdrucks von Fig. 7 bestimmt sind, gezeigt ist.
Fig. 9 ist eine verbesserte Umgestaltung des Chromatogramms von Fig. 8, die gemäß der vorliegenden Erfindung erhalten wird.
Fig. 10 ist eine Tabelle, die Änderungen der Spitzenflächen und der Fehlergrenze bei einer Wiederholung einer Routine, um die spektralen Abschätzungen gemäß der vorliegenden Erfindung zu verbessern, zeigt.

Beschreibung der bevorzugten Ausführungsbeispiele

Gemäß der vorliegenden Erfindung schließt ein verbessertes System, ein Programm und ein Verfahren zum Abschätzen der spektralen und relativen Konzentrationen von Komponenten eines Gemisches das Erhalten eines Chromatogramms 100, das in Fig. 1 gezeigt ist, und das Verarbeiten der Daten mittels eines Systems 200 von Fig. 2 gemäß einem Programm und einem Verfahren, wie es in dem Flußdiagramm von Fig. 3 dargestellt ist, ein. Das Programm ist entworfen, um chromatographische Spitzen mit bis zu drei überlappenden Spektralkomponenten zu entfalten, vorausgesetzt, jeder Region der dreifachen Überlappung, die entfaltet werden soll, geht eine Region voraus oder folgt derselben, in der sich zwei Spektralkomponenten überlappen. Um Abschätzungen der überlappenden Spektralkomponenten und ihrer dazugehörigen relativen Konzentrationen in dem ursprünglichen Gemisch zu ermöglichen, liefert das Programm außerdem iterative Verbesserungen bei den Abschätzungen und eine abgeschätzte Fehlergrenze für die Abschätzungen.
Das Chromatogramm von Fig. 1 weist eine Reihe von Spektren 101, 102, usw. auf. Jedes Spektrum weist eine Reihe von Intensitäten, die über verschiedene Frequenzen, f&sub1;, f&sub2;, .... fn aufgenommen sind, auf. In anderen Worten heißt das, daß jedes Spektrum einen Punkt in einem Freguenzraum mit den Koordinaten (f1, f2, .... fn) darstellt. Das i-te Spektrum kann folglich als ein Vektor S(i) mit den vorhergehenden Koordinaten als seinen Elementen charakterisiert werden. Entsprechend kann ein Chromatogramm, und ein beliebiges Intervall eines Chromatogramms, als eine Matrix S mit einer Reihe von Vektoren S(i) als ihren Spalten ausgedrückt werden.
Das dargestellte Chromatogramm 100 ist nur ein kleiner Abschnitt eines Chromatogramms mit bis zu 100 oder mehr Spitzen, und mit 10 bis 30 Spektren pro Spitze. Die Spektren stellen Absorptionsspektren ultravioletten und sichtbaren Lichts dar, die während der Eluierung eines chromatographischen Probengemisches aus einer chromatographischen Säule 202 von Fig. 2 aufgenommen werden. Die Spektren werden mittels des Spektrumanalysators 204 für ultraviolettes und sichtbares Licht erhalten. Die Spektren werden mittels eines Computers 206 analysiert, wobei eine Anzeige/Ausdruck-Vorrichtung eine Anzeige der Ergebnisse liefert, wie in den nachfolgenden Figuren dargestellt ist.
Die chromatographischen Daten weisen die Form einer Absorption über der Frequenz über der Zeit auf. Bei einer nachfolgend beschriebenen Anwendung der Erfindung werden die Ergebnisse des Programms auf die Daten, die durch eine Massenspektroskopie der Verbindungen, die durch eine Gaschromatographie erhalten werden, erhalten werden, angewendet, derart, daß die Daten in der Form einer Menge über der Masse über der Zeit vorliegen. Selbstverständlich ist das Computerprogramm nicht von den physikalischen Größen der Daten, die dasselbe verarbeitet, betroffen. Daher kann die vorliegende Erfindung verwendet werden, um andere Datentypen zu entfalten, vorausgesetzt, die zugrundeliegenden Annahmen, die nachfolgend erörtert werden, sind im wesentlichen erfüllt.
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung erfordert die Auswahl eines geeigneten Kandidaten für eine Entfaltung, wie bei 301 in Fig. 3 angezeigt ist. Im allgemeinen wird das Programm auf ein Zeitintervall eines Chromatogramms angewendet. Eine Entfaltung ist kein Ersatz für eine gute Chromatographie. Ein typisches Chromatogramm für ein komplexes Gemisch kann 20 bis 100 Spitzen aufweisen. Die meisten dieser Spitzen sollten einzelne Komponenten darstellen. Jedoch kann eine visuelle Untersuchung oder ein relativ effizientes, mathematisches Verfahren, wie z.B. ein Spitzenreinheitstest, verwendet werden, um gefaltete Spitzen zu identifizieren. Außerdem können speziell interessierende Spitzen in einem Gemisch durch eine Entfaltung getestet werden, um zu bestimmen, ob mehrere Komponenten dargestellt sind oder nicht.
Das vorliegende Verfahren schließt eine Extrapolation der Komponentenspektren aus Daten, die vorhergehende und nachfolgende Komponentenspektren darstellen, ein. Obwohl die Extrapolation ohne weiteres auf Zwischenkomponenten angewendet werden kann, ist es schwierig, Spektralkomponenten der ersten und der letzten Komponenten, die in einem Intervall dargestellt sind, zu extrapolieren. Deshalb ist das Intervall vorzugsweise derart ausgewählt, daß die ersten und die letzten Komponenten genau durch nicht-extrapolierte Daten dargestellt werden. Dies wird am besten sichergestellt, indem ein Intervall ausgewählt wird, das Amplituden mit relativ niedrigen Pegeln, z.B. Hintergrundpegeln, auf jeder Seite der Spitze aufweist.
Das Ziel des vorliegenden Verfahrens ist es, die "reinen" Spektren P(k) und die Eluierungsprofile C(i) der Verbindungen, die während des Intervalls eluieren, zu bestimmen. Die reinen Spektralvektoren P(k) definieren die Spalten einer Spektralmatrix P reiner Komponenten, während die Eluierungsprofil-Vektoren C(i) die Zeilen einer Konzentrationsmatrix definieren. Die Spektraldaten, die reinen Spektren und die Konzentrationsmatritzen stehen durch die Gleichung S = PC in Beziehung.
Die Vektoren S(i) werden Faktor-analysiert, um drei Hauptfaktoren zu bestimmen, wie bei 302 angezeigt ist. Die Faktoranalyse kann vereinfacht werden, indem die Daten gruppiert werden. Die Unterteilung in Gruppen wird auf eine solche Weise durchgeführt, daß die Anzahl der Gruppen maximiert ist, bis zu zwölf, in Übereinstimmung mit dem Minimieren der Anzahl der Spektren, die am Anfang und am Ende der Reihen übrig bleiben. Die Vektoren in jeder Gruppe werden addiert, um zehn bis zwölf Vektoren Sr(j) zu definieren, die Spalten einer "reduzierten" Datenmatrix Sr, die Faktor-analysiert werden soll.
In einem Intervall mit 38 Spektren werden z.B. die Vektoren S(2), S(3) und S(4) addiert, um einen einzelnen Vektor Sr(1) zu definieren. In gleicher Weise werden nacheinander Kombinationsvektoren Sr(2) bis Sr(12) für nachfolgende Gruppen von drei Vektoren S(i) definiert. Die Vektoren Sr(1) bis Sr(12) sind die Spalten der Matrix Sr, die Faktor-analysiert werden soll. S(1) und S(38) werden beim Bestimmen der Hauptfaktoren nicht verwendet.
Die Kombinationen der Vektoren S(i) beim Definieren der Matrix Sr reduzieren das Rauschen und die Berechnungszeit, während im wesentlichen die gesamten Daten verwendet werden. Diese Behandlung beeinflußt das Herausfinden der Hauptkomponenten nicht schwerwiegend, solange die Spanne jeder Gruppe von Spektren nicht größer als die Breite einer chromatographischen spitze ist. Die experimentellen Spektren können einer Fensterbehandlung unterzogen oder gewichtet werden, werden jedoch nicht normiert.
Eine quadratische Kovarianzmatrix Z wird gebildet, indem Sr mit seiner transponierten Sr' multipliziert wird, d.h. Z = Sr'Sr. Die Eigenvektoren und Eigenwerte von Z werden durch das Auflösen der Gleichung ZQ = QR gefunden, wobei Q eine quadratische Matrix ist, deren Spalten die Eigenvektoren von Z sind, und R eine diagonale Matrix ist, deren Elemente die Eigenwerte sind. Sowohl Z als auch R sind in der Reihenfolge der Größe der Eigenwerte angeordnet.
Eine Matrix von Faktoren Fr wird aus folgender Beziehung berechnet:
Fr = DQR&supmin;½
Die Hauptfaktoren oder Hauptkomponenten sind die Spalten von Fr, die den größeren Eigenwerten entsprechen. Es ist einfach, zu zeigen, daß die Spalten von Fr orthogonal zueinander sind, und daß dieselben folglich eine orthogonale Basis bilden, die den gleichen Raum überspannt, wie die Spalten von Sr und die experimentellen Spektren S(i).
Jedes Spektrum S(i) wird dann durch seine Erweiterung Sf(i) in den Raum der ersten drei Hauptfaktoren fx, fy und fz approximiert, und die resultierenden Vektoren werden euklidisch normiert, wie bei 303 angezeigt ist, d.h.
über alle i in dem ausgewählten Intervall. In anderen Worten heißt das, daß alle ursprünglichen Daten in dem Intervall einzeln erweitert werden. Die Gruppen Sr(i) werden nach der Faktoranalyse nicht berücksichtigt. In dem obigen Beispiel ist i 1 bis 38. Die Erweiterung kann in Form der Koeffizienten der Erweiterung neu ausgedrückt werden:
Sf(i) = Sx(i)fx + Sy(i)fy + Sz(i)fz
Aufgrund der euklidischen Normierung ist die Summe der Quadrate der Koeffizienten jedes Spektrums in dem Raum der drei Hauptfaktoren Eins. Geometrisch bedeutet dies, daß alle Spektren in dem Intervall als Punkte auf einer Einheitskugel dargestellt werden. Außerdem liegen lineare Kombinationen zweier Spektren auf einem Bogen eines Großkreises der Einheitskugel. Folglich liegen alle möglichen binären Gemische auf einem Großbogen, der die Spektren der einzelnen Komponenten an seinen Endpunkten aufweist.
Da alle Spektraldaten auf der Einheitskugel liegen, können dieselben in Polarkoordinaten Θ und ausgedrückt werden, wobei Θ der Polarwinkel und der Azimutalwinkel ist.
Dieser sphärische Oberflächenraum kann, wie bei 304 angezeigt ist, mittels folgender Transformation in eine X,Y-Ebene W abgebildet werden:
Wx = tan(Θ) cos ( )
Wy = tan(Θ) sin ( )
Die ursprünglichen Spektraldaten S sind nun als Punkte auf der Ebene W ausgedrückt, d.h. Sw = Sx Wx + Sy Wy.
Diese Transformation bildet nicht nur die Oberfläche der Einheitskugel in die Ebene W ab, sondern bildet ferner Großkreise in gerade Linien und Großbögen in gerade Liniensegmente ab. Folglich liegen in der Ebene W binäre Gemische zweier Verbindungen auf einem geraden Liniensegment, wobei die Spektren der zwei Verbindungen die Endpunkte des Segments definieren. Theoretisch würde ein chromatographisches Intervall, das durch alternierende unitäre und binäre Teilintervalle charakterisiert ist, durch eine Reihe von geraden Liniensegmenten, die von Scheitelpunkten V(k), die die Spektren der reinen Verbindungen darstellen, verbunden sind, dargestellt werden.
Wenn das chromatographische Intervall mindestens ein Teilintervall mit Gemischen dreier Komponenten einschließt, welches durch Teilintervalle mit binären Gemischen begrenzt ist, ist ein gerundeter, und nicht scharf definierter, Scheitelpunkt U(k) in der Spektralkurve gebildet, wofür die abgerundeten Scheitelpunkte U&sub1;, U&sub2;, U&sub3; und U&sub4; in Fig. 4 ein typisches Beispiel sind. Ein abgerundeter Scheitelpunkt U(k) kann verwendet werden, um die Region des virtuellen Scheitelpunkts V(k), der dem Spektrum einer einzelnen Verbindung entspricht, anzuzeigen; der genaue Standort des Scheitelpunkts V(k), der die reinen Komponentenspektren P(k) in der Ebene W darstellt, wird durch eine Extrapolation, wie bei 305 in Fig. 3 angezeigt ist, identifiziert.
Bevor der bevorzugte Lösungsansatz für die Extrapolation detailliert erläutert wird, ist es aufschlußreich, die Analogie zwischen der vorliegenden Darstellung der Spektraldaten und der, die unter Verwendung des Extrapolations-Lösungsansatzes, der anstelle der euklidischen Normierung auf einer Flächennormierung basiert, geboten wird, anzumerken. Die geometrische Übereinstimmung zwischen den Kurven, die von den zwei Entfaltungs-Lösungsansätzen erzeugt werden, impliziert, daß die gleichen Verfahren einer linearen Extrapolation angewendet werden können, um spektrale Verteilungen und relative Konzentrationen zu erhalten. Jedoch entsprechen sich die Spektraldaten, wie sie in den jeweiligen Ebenen dargestellt sind, aufgrund der unterschiedlichen Normierungen, die angewendet werden, nicht.
Wie oben in dem Hintergrundabschnitt angezeigt wurde, besteht ein Hauptvorteil der euklidischen Normierungsverfahren gegenüber Verfahren, die eine Flächennormierung verwenden, darin, daß das erstgenannte weniger empfindlich auf Rauschen und mit verschiedenen Basislinien-Korrekturtechniken und verschiedenen Lösungsansätzen zur Datenmodif ikation, die negative Spektralwerte einschließen können, besser kompatibel ist. Folglich liefert die vorliegende Erfindung die Vorteile einer linearen Extrapolation, die von bekannten Flächennormierungsverfahren erhalten werden, ohne die Nachteile, die einer Flächennormierung inhärent sind.
Wieder bezugnehmend auf das Verfahren der vorliegenden Erfindung liegt die Sequenz der Punkte, die dem Chromatogramm entsprechen, entlang einer Kurve U in der konstruierten X, Y-Ebene W. Idealerweise würde zumindest diese Kurve U aus geraden Liniensegmenten mit mehr oder weniger scharf gekrümmten Segmenten, die dieselben verbinden, bestehen.
Die Kurve U wird zur weiteren Analyse unterteilt, wobei die Scheitelpunkte U(k) als Referenzpunkte verwendet werden. In der Grenze eines geringen Rauschens ist die Anzahl der scheitelpunkte U(k) in der chromatogrammkurve in der Ebene W gleich der Anzahl der Komponenten, die in der Reihe von Spektren S(i) dargestellt sind. Rauschen verschiebt die Spektralpunkte aus dem Ort, den dieselben andernfalls aufweisen würden, und kann, wie erwartet werden könnte, die Bestimmung der Anzahl und der Position der Scheitelpunkte U(k) schwierig machen.
Der bevorzugte Algorithmus zum Lokalisieren von Scheitelpunkten besteht darin, die Maxima in der Korrelation zwischen jedem Spektrum Sw(i) und dem nächsten Spektrum Sw(i+1) herauszufinden. Wenn die Maxima zu nahe beieinander liegen, wird angenommen, daß dieselben einen einzigen, abgerundeten Scheitelpunkt darstellen, der verwendet wird, als wäre er der Punkt in der Mitte zwischen denselben.
Wenn mehr als drei Scheitelpunkte existieren, können bessere spektrale Abschätzungen erhalten werden, indem jede Extrapolation in dem Raum durchgeführt wird, der für den Scheitelpunkt, der bestimmt werden soll, am besten geeignet ist. Wenn mehr als drei Scheitelpunkte existieren, sind folglich überlappende Reihen von Daten durch Punkte mitten zwischen Scheitelpunkten definiert, auf eine solche Art und Weise, daß in jeder Gruppe drei Komponenten enthalten sind. Jede Gruppe wird dann weiter analysiert, um mittels einer Extrapolation die Spektralkomponente zu bestimmen, die dem Zwischenscheitelpunkt entspricht. Die Anzahl der Gruppen ist folglich gleich der Anzahl der Scheitelpunkte minus zwei, konkret dem ersten und dem letzten Scheitelpunkt.
Bei einer gegebenen Kurve U mit vier Scheitelpunkten U&sub1;, U&sub2;, U&sub3; und U&sub4; wirkt ein Punkt in der Mitte zwischen U&sub3; und U&sub4; mit dem ersten Spektrum 5(1) des Intervalls zusammen, um eine erste Gruppe zu definieren, die U&sub1;, U&sub2; und U&sub3; einschließt, jedoch U&sub4; ausschließt. Diese erste Gruppe wird zur Extrapolation der spektralen Komponente verwendet, die am engsten zu dem Scheitelpunkt U&sub2; gehört. In gleicher Weise wirkt ein Punkt in der Mitte zwischen U&sub1; und U&sub2; mit dem letzten Spektrum des Intervalls zusammen, um eine zweite Gruppe zu definieren, die U&sub2;, U&sub3; und U&sub4; einschließt, jedoch U&sub1; ausschließt. Diese zweite Gruppe wird für die Extrapolation der spektralen Komponente verwendet, die am engsten zu dem Scheitelpunkt U&sub3; gehört.
Die Extrapolationstechnik ist auf den ersten und den letzten Scheitelpunkt der Chromatogrammkurve nicht anwendbar. Folglich sind der erste und der letzte Scheitelpunkt, die mittels des Herausfindens der Korrelationsmaxima lokalisiert werden, die anfänglichen Abschätzungen für das erste und das letzte Komponentenspektrum, die in dem Intervall dargestellt sind. Diese Abschätzungen sollten in dem Maß gültig sein, daß der erste und der letzte Scheitelpunkt einzelne Komponenten darstellen, und keine Gemische. Diese Bedingung ist im allgemeinen erfüllt, indem die Enden des interessierenden Intervalls von der Spitze entfernt definiert werden. Bei dem Beispiel sind die Spektren, die U&sub1; und U&sub4; entsprechen, verwendet, um die Spektren der ersten und vierten Verbindungen darzustellen, die während des ausgewählten Intervalls eluiert werden sollen.
Die Vektoren S(i), die jede Gruppe darstellen, werden unter Verwendung des Algorithmusses, der ursprünglich auf das gesamte Intervall angewendet wird, Faktor-analysiert. Folglich gehört zu der i-ten Gruppe eine Matrix Fi dreier Hauptfaktoren Fix, Fiy und Fiz. Für jede Gruppe werden die Vektoren S(i) in den Raum erweitert, der durch diese Faktoren definiert ist, und die Erweiterung wird euklidisch normiert. Folglich gehört zu jedem Abschnitt der Kurve ein Raum dreier Hauptfaktoren, der durch eine Matrix Fi definiert ist. Die Daten in jedem Abschnitt der Kurve werden dann erweitert und in dem Raum der entsprechenden Hauptfaktoren euklidisch normiert. Die Transformation in Polar- und dann in ebene Koordinaten, wird, wie oben gezeigt ist, bezüglich des gesamten Intervalls durchgeführt.
Da sich die Matritzen Fi im allgemeinen unterscheiden, werden die Gruppen von Daten in verschiedene Ebenen Wi abgebildet. Tatsächlich wählt das vorliegende Verfahren die optimale Ebene Wi zum Extrapolieren jedes Scheitelpunkts V(k), wenn mehr als drei Verbindungen eingeschlossen sind. An diesem Punkt ist der Fall von mehr als drei Scheitelpunkten U(k) auf getrennt behandelbare Fälle von Kurven mit drei Scheitelpunkten reduziert.
Wie oben angezeigt wurde, werden die Erweiterungen der Spektren an dem ersten und dem letzten Scheitelpunkt auf der Ebene W für das vollständige Intervall für die Abschätzungen der Spektren der ersten und der letzten Komponente, die in dem Intervall, das analysiert wird, eluieren, verwendet. Bei dem obigen Beispiel sind dies die erste und die vierte Spektralkomponente für das Intervall, so daß V(1) = U(1) und V(4) = U(4).
Abschätzungen für die Zwischenkomponenten werden unter Verwendung des entsprechenden Faktorraums durch Extrapolieren gerader Liniensegmente auf jeder Seite des jeweiligen Scheitelpunkts gefunden, wie von O.S. Borgen und B.R. Kowalski (siehe oben) beschrieben ist. Die Koordinaten des Schnittpunkts sind die Koeffizienten der linearen Erweiterung des abgeschätzten Spektrums in der Form des jeweiligen Satzes der Hauptkomponenten.
Bei dem Beispiel ist der Scheitelpunkt V(2), der durch den Schnittpunkt der geraden Liniensegmente in der Ebene W&sub1; der drei Hauptfaktoren für die erste Gruppe definiert ist, verwendet, um die zweite Spektralkomponente, die dem Kurvenscheitelpunkt U(2) entspricht, abzuschätzen. In gleicher Weise werden gerade Liniensegmente in der Ebene W&sub2; der drei Hauptfaktoren für die zweite Gruppe verwendet, um V(3), die Abschätzung der dritten Spektralkomponente, die dem Scheitelpunkt U(3) entspricht, zu extrapolieren.
Die reinen Komponentenspektren P(k) sind durch die Beziehung P(k) = FkV(k) gegeben, wobei P(k) das abgeschätzte Spektrum für die k-te Verbindung, die während des Intervalls eluiert, ist, Fk die entsprechende Matrix von Faktoren ist, und V(k) der Vektor ist, der die Koordinaten des k-ten extrapolierten Scheitelpunktes aufweist. Bei dem Beispiel ist das Spektrum P(2) der zweiten Komponente, die während des Intervalls eluiert, gleich dem Produkt der entsprechenden Faktormatrix F&sub2; und der Koordinaten des extrapolierten Schnittpunkts V(2) mit dem Kurvenscheitelpunkt U(2). Die Abschätzungen der Spektren der Komponentenverbindungen, die wie oben beschrieben durchgeführt wurden, weisen eine Matrix P auf, deren Spalten die reinen Komponentenspektren P(k) sind, wodurch der Verfahrensschritt, der bei 306 in Fig. 3 angezeigt ist, vollendet wird.
Die Konzentrationen relativ zu den Konzentrationen jeder Verbindung, für die die Summe der Quadrate der spektralen Elemente einheitlich Eins ist, werden herausgefunden, wie bei 307 in Fig. 3 angezeigt ist, indem die abgeschätzten Spektren P(k) der Komponentenverbindungen an jedes experimentelle Spektrum entsprechend dem Verfahren der kleinsten Quadrate angepaßt werden und dann über das Integral integriert wird, z.B. unter Verwendung der Trapezregel, um ihre Gesamtf läche herauszufinden.
Die Lösung gemäß dem Verfahren der kleinsten Quadrate der Gleichung
S(i) = PC(i) ist die, die die euklidische Norm S(i)-PC(i) minimiert, wobei S(i) das experimentelle Spektrum ist, das durch die Spektren, die die Spalten der Matrix P sind, angepaßt werden soll, und C(i) der entsprechende Vektor der relativen Konzentrationen ist. Die Anzahl der Elemente in dem Vektor C(i) ist gleich der Anzahl der Komponenten, wobei jedes Element der relativen Konzentration der jeweiligen Komponente entspricht, die eluiert, während P bestimmt wird.
Es gibt eine Vielzahl von Techniken, um eine solche euklidische Norm zu minimieren. Ein Orthogonalisierungsverfahren, bei dem Householder-Transformationen S in eine obere Dreieckmatrix ändern, ist bevorzugt, da dasselbe effizient ist und eine sehr gute numerische Stabilität besitzt. Bei der anfänglichen Lösung wird die Reihe von experimentellen Spektren S(i) in überlappende Gruppen mit jeweils drei Komponentenspitzen segmentiert, auf eine Art und Weise, die ähnlich der ist, die zur Faktor-Analyse in Verbindung mit der Abschätzung der Spektren verwendet ist. Die Matrix P der reinen Komponentenspektren wird dann auf drei Spalten begrenzt, die die abgeschätzten Spektren der Verbindungen enthalten, die in dem Intervall vorliegen. Dieses Verfahren verbessert die Gesamtanpassung.
Die Konzentrationsvektoren C(i) können verwendet werden, um eine Darstellung der Konzentration über der Zeit für jede der vier Hauptkomponenten P(k) zu erhalten, wie in Fig. 5 dargestellt ist. Eine Kurve P, die die Summe der vier Komponenten P(k) darstellt, dient als eine Umgestaltung der ursprünglichen Datenmatrix S. Die Wirksamkeit des vorliegenden Verfahrens wird durch einen Vergleich des abgeschätzten Spektrums für die zweite Verbindung, die P(2) entspricht, wie in Fig. 6A dargestellt ist, mit dem experimentellen Spektrum in Fig. 6B der gleichen Verbindung, die chromatographisch gut getrennt ist, gezeigt.
Das Programm liefert eine Verbesserung der ursprünglichen Abschätzungen, wie in der zweiten Spalte von Fig. 3 gezeigt ist, indem die berechneten Konzentrationen mit einem Standard verglichen werden. Beim Verbessern der ursprünglichen Abschätzungen ist es geeignet, die ursprünglichen Spektren in einem Raum auszudrücken, der von einer Hauptfaktormatrix G definiert ist, wobei die Anzahl der Hauptfaktoren gleich der Anzahl der vorliegenden Verbindungen gesetzt ist.
Die Faktormatrix G wird durch das Faktor-Analysieren aller experimenteller Spektren S(j) zwischen dem ersten und dem letzten Scheitelpunkt bestimmt, z.B. in dem Beispiel zwischen U(1) und U(4). Im allgemeinen ist der Bereich von j bezüglich des Bereichs des Indexes i für das gesamte experimentelle Intervall abgekürzt. In dem Beispiel, j = 3, 4, ... 33. Sobald G erhalten ist, wird der gesamte Satz von spektralen Daten S bei der Analyse verwendet. Die Erweiterung der gekürzten Daten in dem Raum der Matrix G wird als Sg bezeichnet; genauso wird die Erweiterung von S(i) in dem Raum G als Sg(i) bezeichnet.
Dann
Sg = G'S = G'PC1 = A1C1
Sg(i) = G'S(i) = G'PC1(i) = A1C1(i)
wobei Sg(i) die Erweiterung des i-ten Spektrums in dem Raum der Faktoren, der von der Matrix G definiert ist, ist, G' die Transponierte von G ist, und A&sub1; eine Komponentenfaktormatrix ist, die durch A&sub1; = G'P definiert ist. Die Komponentenfaktormatrix A&sub1; ist eine quadratische Matrix (k x k, z.B. 4 x 4 in dem Beispiel), deren Spalten Vektoren sind, die die gleiche Anzahl aufweisen, wie Komponenten vorliegen. C&sub1;(i) ist der Konzentrationsvektor für S(i) mit den relativen Konzentrationen der Verbindungen als seinen Elementen. Der Index "1" zeigt an, daß A&sub1; und C&sub1;(i) die ersten Abschätzungen sind, die bei einem iterativen Verfahren zum Bestimmen aufeinanderfolgend verbesserter Abschätzungen verwendet sind. Die Elemente von C&sub1;(i) können durch Lösen der Gleichung Sg(i) = A1C1(i) unter Verwendung des gleichen Algorithmusses, der oben verwendet ist, um die kleinsten Quadrate zu lösen, gefunden werden.
Die Zeilen der Matrix C&sub1; sind die berechneten Eluierungsprofile für die Komponenten; die Spalten von C&sub1; sind die berechneten Konzentrationen, die aus jedem experimentellen Spektrum gefunden werden. Eine Fehlermatrix E wird wie folgt aus C&sub1; erhalten. Alle negativen Werte der Konzentrationen werden auf Null gesetzt. Die Standardabweichungen der Konzentrationsprofile werden berechnet. Außerdem sind alle Werte eine gegebene Anzahl von Standardabweichungen, z.B. Drei, von den Mittelwerten der Konzentrationsprofile entfernt auf Null eingestellt. Die verbleibenden Konzentrationen werden neu normiert, um die ursprüngliche Summe der Elemente für jede Spalte zu speichern, was entsprechend Schritt 308 in Fig. 3 eine eingestellte Konzentrationsmatrix D ergibt, d.h. Σk C1(i, k) = Σk D(i, k). Es sei bemerkt, daß iterative Indizes in der hergeleiteten Konzentrationsmatrix und den nachfolgenden Fehlermatritzen impliziert sind.
Eine Matrixsubtraktion ergibt eine Konzentrationsfehlermatrix E = C&sub1; - D, wie bei 309 angezeigt ist. Eine entsprechende Spektralkomponenten-Fehlermatrix B, wie bei 310 gefordert wird, kann aus der Beziehung Sg = A1C berechnet werden, indem explizit Fehlerterme in den folgenden Ausdruck eingeschlossen werden:
Sg = (A1 + B) (C&sub1; + E) = (A&sub1; + B) E + A&sub1;C&sub1; + BC&sub1;
Unter Verwendung der Approximation Sg = A1C1 reduziert sich dieselbe auf
O = (A&sub1; + B) E + BC&sub1;
was für eine Abschätzung von B gelöst werden kann.
Die Abschätzung von B kann verwendet werden, um eine verbesserte Abschätzung für die Matrix der reinen Komponentenspektren zu erhalten:
A&sub2; = A&sub1; - B
eine verbesserte Konzentrationsmatrix kann durch Lösen folgender Gleichung erhalten werden:
Sg = A2C2
Durch Inkrementieren der Indizes und Wiederholen der obigen Verfahren können neue Werte von E und B berechnet werden, die zu im allgemeinen besseren Werten für A und C führen. Die verbesserten Werte der Komponentenspektren können explizit durch die Beziehung A = GP hergestellt werden.
Im allgemeinen wird bei der Iteration der Wert von B kleiner. Er wird nicht notwendigerweiser Null, da es sein kann, daß die interessierende Referenz mit einer begrenzten Anzahl von Faktoren nicht erreicht wird. Wenn es scheint, daß der Iterationsprozeß gut arbeitet, wird die Änderung der spektralen Abschätzungen relativ gering. In jeder Stufe des Iterationsverfahrens liefert B eine Abschätzung des Fehlers in den Komponentenspektren.
Der Fehler in den abgeschätzten Komponentenspektren ist eine von zwei Fehlerquellen bei der Berechnung der Konzentration. Die andere Fehlerquelle ist ein Rauschen in den experimentellen Spektren. Unter der Annahme, daß das Rauschen orthogonal zu den Hauptfaktoren ist, ist die Amplitude seines quadratischen Mittels durch die euklidische Norm S(i) - GG'S(i) gegeben. Aufgrund der Faktorerweiterung, die wir verwenden, ist diese ebenfalls gleich der Norm der restlichen Fehlanpassung zwischen dem experimentellen Spektrum und der Linearkombination nach dem Verfahren der kleinsten Quadrate des abgeschätzten Komponentenspektrums.
Eine Gesamtfehlergrenze kann unter Verwendung der Abschätzungen für die zwei Fehlertypen bei der Berechnung der Konzentration berechnet werden, wie bei 311 angezeigt ist. Da A eine quadratische Matrix ist, ist die wichtige Größe beim Abschätzen der Fehlergrenze die niedrigste obere Grenze ihrer inversen, lub(A&supmin;¹) = λn&supmin;½, wobei λn der kleinste charakteristische Wert von A'A ist. Die Norm für das Gesamtrauschen kann abgeschätzt werden durch
ΔY = Σ(S(i) - GG'S(i)
Die Norm für die Gesamtkonzentrationsvektoren kann abgeschätzt werden durch
X = ΣD(i)
Die Fehlergrenze, ΔX , wird unter Verwendung eines Verfahrens, das von J. Stoer und R. Bulirsch, Introduction to Numerical Analysis Springer Verlag, New York, 1980, angepaßt wurde, abgeschätzt.
ΔX = lub(A&supmin;¹) lub (B) X
+ (lub(A&supmin;¹))² lub(B) ΔY
+ lub(A&supmin;¹) ΔY
Es sollte hervorgehoben werden, daß die Fehlergrenze nur eine Abschätzung ist, primär, da wir B nur abschätzen können, und lub(B) nicht exakt das gleiche ist wie die kleinste obere Grenze der Fehler in der Matrix der Komponentenspektren.
Ferner wird eine zusätzliche Größe ausgewertet: die Norm des Unterschieds zwischen dem Gesamtsignalchromatogramm und dem umgestalteten Gesamtsignalchromatogramm:
(Σ(ΣSij - ΣPikCkj))2)½
Da die Spektren aus Linearkombinationen der Hauptfaktoren gebildet werden, sollte die Summe der relativen Konzentrationen sehr gut mit den relativen Gesamtkonzentrationen übereinstimmen. Daher ist dieser Unterschied im allgemeinen eine relativ geringe Zahl, die nur unwesentlich zu einer abgeschätzten Gesamtfehlergrenze beiträgt.
Obwohl die Form der Spitzen ein wichtiges Diagnosewerkzeug zum Entscheiden, ob die Antworten, die erzeugt werden, glaubhaft sind, ist, können die Spitzen alle richtig aussehen, während dennoch ein beträchtlicher Fehler vorliegt. Ein großer Wert für lub(A&supmin;¹) zeigt an, daß dies der Fall sein kann.
Wenn lub(A&supmin;¹) groß ist, was der Fall sein wird, wenn die Komponentenspektren stark korreliert sind, kann die Fehlergrenze leicht größer als die integrierte Fläche einer Komponentenspitze sein, speziell wenn die Spitze klein ist. Der Fehler in jeder Komponentenspitze muß geringer als die Fehlergrenze sein, wobei man allerdings nicht wirklich sagen kann, welcher Teil des Gesamtfehlers jeder Spitze zugeschrieben werden sollte.
Die Fehlergrenze kann kein hinreichendes Maß eines Fehlers sein, wenn beim Bestimmen der Anzahl von vorliegenden Verbindungen ein Fehler gemacht wird, oder wenn eine Annahme, wie z.B. die Linearität, nicht gilt. Zusätzlich zu der Fehlergrenze ist es wichtig, die entfalteten chromatographischen Spitzen zu untersuchen. Wenn die Form der Spitzen nicht plausibel ist, sollte das Ergebnis mit extremer, wenn auch unquantifizierbarer, Vorsicht behandelt werden.
Die vollständigen Spektren der Komponenten werden aus den gleichen Spektren rekonstruiert, die verwendet sind, um die Datenmatrix zu bilden, ohne irgendeine Gewichtung oder Fensterbehandlung, unter der Annahme, daß dieselben die gleiche lineare Kombination der ursprünglichen Daten sind, daß die gewichteten Komponentenspektren, die zur Entfaltung verwendet werden, aus den gewichteten Spektren sind, die die Datenmatrix aufweisen. Wenn die Abschätzungen der gewichteten Komponentenspektren "verbessert" sind, werden die vollständigen Spektren ebenfalls aktualisiert und gespeichert.
In dem Fall der Probe der Fig. 4 und 5 ist das Rauschen gering und die Spektralabschätzungen sind gut, wie durch den Vergleich der berechneten und der experimentellen Spektren in den Fig. 6A und 6B für die zweite und die letzte aufgelöste Komponente gezeigt ist. Folglich hat das Verfahren zur Verbesserung der Abschätzungen kaum merkbare Änderungen zur Folge.
Die Wirkung des Verbesserungsverfahrens zeigt sich stärker bei der Entfaltung eines Abschnitts eines Chromatogramms, das unter Verwendung der Gaschromatographie mit Massenspektroskopie-Techniken (GC/MS) erhalten wird. Die Projektionen der Massenspektren in dem Raum der ersten drei Hauptkomponenten sind in Fig. 7 gezeigt, in der zu sehen ist, daß Anfangs- und End-Bündel von Punkten und zwei Richtungsänderungen des Orts der Punkte dazwischen existieren. Dies bildet vier Scheitelpunkte, weshalb angenommen wird, daß vier Komponenten vorliegen.
In diesem Fall findet der Scheitelpunkt-Aufnahmealgorithmus aufgrund des Rauschens in den Daten zu viele Scheitelpunkte, es sei denn, es gibt irgendeine vorbereitete Glättung der Daten. Scheitelpunkte sollten sich in Regionen befinden, in denen die Dichte der Datenpunkte in ihrer Ortsebene maximal ist, entsprechend dem Maximum der relativen Konzentrationen der eluierenden Verbindungen. Es ist daher einfach, die Zusätzlichen zurückzuweisen, die dort erscheinen, wo die Punktdichte gering ist. Nach dem Zurückweisen der Maxima mit geringer Dichte sind vier abgerundete Scheitelpunkte 701, 702, 703 und 704 identifiziert, die vier Hauptkomponenten anzeigen.
Das Verfahren gemäß den Schritten 301 bis 307 in der ersten Spalte von Fig. 3 führt zu den entfalteten Spitzen, die in Fig. 8 gezeigt sind. Die negative Amplitude der zweiten Komponente zeigt, daß die Abschätzungen für die Spektren verbessert werden könnten. Die Ergebnisse nach fünf Iterationen des Verbesserungsverfahrens, der Schritte 308 bis 311 in der zweiten Spalte von Fig. 3, sind in Fig. 9 gezeigt.
Das iterative Verbesserungsverfahren ändert die spektralen Abschätzungen nicht sehr stark. Wie angenommen werden könnte, müssen die Abschätzungen an erster Stelle vernünftig genau sein, wenn es nur schwache Anforderungen für die Eluierungsprofile gibt, wenn das Verfahren zu besseren Ergebnissen konvergieren soll. Die Tabelle in Fig. 10 zeigt, wie die Abschätzungen der Spitzenflächen und der Fehlergrenze sich mit jeder Iteration ändern. Mit Ausnahme der Zunahme der zweiten Spitzenfläche, wenn der negative Teil verschwindet, betragen die Änderungen der Spitzenfläche nach der ersten Iteration weniger als 3 Prozent.
Gemäß dem vorher Gesagten ist ein System, ein Programm und ein Verfahren zum Entfalten chromatographischer Spitzen mit den folgenden Charakteristika geschaffen. 1) Die Entfaltung kann in einer vernünftigen Zeit durchgeführt werden. 2) Die chromatographischen Überlappungen können ziemlich kompliziert sein; d.h. bis zu drei Komponenten können gleichzeitig eluieren und Ketten von mindestens 6 Verbindungen werden ohne weiteres aufgenommen. 3) Das Verfahren ist auf jede Art von chromatographischen Detektoren anwendbar, die Spektren erzeugt, deren Amplituden linear zur Konzentration sind. 4) Bezüglich der Form der Eluierungsspitzen werden keine Annahmen getroffen, ausgenommen einer Nicht-Negativität und vernachlässigbarer Amplituden entfernt vom Mittelwert bei der Verbesserungsroutine. 5) Keinerlei Annahmen sind bezüglich der Struktur der Spektren der die Bestandteile bildenden Verbindungen getroffen. 6) Eine Fehlergrenze wird für die berechneten Konzentrationen erhalten. 7) Keine vorherige Kenntnis der Spektren der eluierenden Verbindungen ist erforderlich. 8) Abschätzungen der vollständigen Spektren der eluierenden Verbindungen werden erzeugt, die verwendet werden können, um dieselbe zu identifizieren.
Diese Merkmale werden erhalten, wenn die vorliegende Erfindung auf chromatographische oder analoge Daten angewendet wird. Die Daten müssen nicht in der Form unbearbeiteter Spektren vorliegen: die vorliegende Erfindung kann auf Daten angewendet werden, nachdem eine Basislinien-Korrektur bewirkt wurde, und die vorliegende Erfindung kann auf modifizierte Datenarrays angewendet werden, die z.B. die Folge sind, wenn die erste Ableitung oder Ableitungen höherer Ordnung der spektralen Daten erhalten werden. Da es unzählige äquivalente Verfahren zum Implementieren jedes Schritts der Erfindung gibt, ist der Bereich derselben nur durch die folgenden Ansprüche begrenzt.

Claims

1. Ein Verfahren zum Entfalten von Spektren aus einem Chromatogramm eines Viel-Komponenten-Gemischs, wobei das Chromatogramm die Änderung der Ausgabe einer oder mehrerer Komponenten bezüglich einer unabhängigen Variable darstellt, das folgende Schritte aufweist: chromatographisches Verarbeiten des Gemischs, um eine Reihe von Spektren zu erhalten, von denen jedes das Gemisch zu einer jeweiligen Erfassungszeit in einem vorbestimmten interessierenden Zeitintervall bezüglich einer vorbestimmten physikalischen Eigenschaft des Gemischs, wie z.B. der Lichtabsorption oder der Masse, charakterisiert; Aufbauen eines Chromatogra'nins aus der Reihe von Spektren in der Form einer Reihe von Spektraldatenvektoren (S(i)), wobei jeder Spektraldatenvektor einem Amplitudenprofil der vorbestimmten physikalischen Eigenschaft entspricht; Gruppieren der Reihe von Spektraldaten, wobei die Vektoren in jeder Gruppe addiert werden, um die Spalten einer quadratischen, reduzierten, Spektraldatenmatrix (Sr) zu bilden; Bilden einer Spektralkovarianzmatrix (Z) aus der Spektraldatenmatrix (Sr); Zerlegen der Spektralkovarianzmatrix in Spektralkovarianz-Eigenwerte (R) und entsprechende Spektralkovarianz-Eigenvektoren (Q); Bestimmen dreier orthogonaler Hauptfaktoren (fx, fy, fz) des Chromatogramms als eine vorbestimmte Funktion einer linearen Kombination der größten drei Spektralkovarianz-Eigenwerte und der entsprechenden Eigenvektoren; Ausdrücken jedes Spektraldatenvektors als eine lineare Summe der drei orthogonalen Faktoren, um einen entsprechenden dreidimensionalen (Sx, Sy, Sz)' Faktor-analysierten Spektralvektor (Sf) zu bilden; Normieren jedes Faktor-analysierten Spektralvektors, derart, daß die Summe der Quadrate seiner drei Elemente (Sx, Sy, Sz) Eins ist, wodurch jeder Spektralvektor, der somit normiert ist, als ein Punkt auf der Oberfläche einer Kugel mit einem Radius von Eins dargestellt werden kann; Projizieren jedes normierten, Faktor-analysierten Spektralvektors auf einen zweidimensionalen Raum (Wx, Wy) unter Verwendung einer vorbestimmten Koordinatentransformation, die Bögen von Großkreisen der Kugel auf Liniensegmente in dem zweidimensionalen Raum abbildet, wodurch die Endpunkte jedes Liniensegments reinen Komponentenspektren entsprechen, und die übrigen Punkte jedes Liniensegments binären Kombinationen der reinen Komponentenspektren entsprechen; und Herleiten von Abschätzungen der Komponentenspektren als eine Funktion ihrer Positionen entlang der Liniensegmente.

2. Das Verfahren gemäß Anspruch 1, das ferner den Schritt des Zusammenstellens der Koeffizienten einer Anpassung gemäß dem Verfahren der kleinsten Quadrate der abgeschätzten Komponentenspektren an die zweidimensionalen, projizierten, Faktor-analysierten Spektralvektoren in einer Konzentrationsmatrix einschließt.

3. Das Verfahren gemäß Anspruch 2, das ferner einen Schritt des Bestimmens einer Konzentrations-Fehlermatrix als den Unterschied zwischen der Konzentrationsmatrix, die durch das Nullsetzen aller Werte, die negative Konzentrationen darstellen, und aller Werte, die Konzentrationen einer vorbestimmten Anzahl von Standardabweichungen von der Spitze der jeweiligen Komponente entfernt darstellen, modifiziert ist, und der Konzentrationsmatrix selbst aufweist.

4. Verfahren gemäß Anspruch 3, das ferner den Schritt des Bestimmens einer Komponentenfehlermatrix B aus der Gleichung (A+B)E = -BC aufweist, wobei A die Konzentrationsmatrix ist, E die Konzentrationsfehlermatrix ist, und C die Konzentrationsmatrix ist.

5. Das Verfahren gemäß Anspruch 4, das ferner den Schritt des Erhaltens einer verbesserten Komponentenmatrix A&sub2; aus der Gleichung A&sub2; = A&sub1; - B aufweist.

6. Das Verfahren gemäß Anspruch 5, das ferner den Schritt des Erhaltens einer verbesserten Konzentrationsmatrix durch das Bestimmen der Konzentrationsmatrix aufweist, welche am besten die ursprüngliche gegebene Chromatogramm-Komponentenmatrix A&sub2; rekonstruiert.

7. Ein Verfahren gemäß einem beliebigen vorhergehenden Anspruch, bei dem die Koordinatentransformation das Bestimmen einer Reihe von Scheitelpunkten mittels einer linearen Extrapolation oder aus einer wesentlichen Koinzidenz der Punkte benachbarter Spektren in der zweidimensionalen Darstellung der normierten Spektralvektoren einschließt, von denen jeder im wesentlichen einem Schnittpunkt zweier unterschiedlicher Liniensegmente entspricht, die wiederum jeweilige binäre Kombinationen dreier Komponenten des Gemischs darstellen.

8. Das Verfahren gemäß einem beliebigen vorhergehenden Anspruch, das ferner den Schritt des Bestimmens einer Konzentrationsmatrix einschließt, die am besten das ursprüngliche Chromatogramm in dem interessierenden Intervall bei gegebenen abgeschätzten Komponentenspektren rekonstruiert.

9. Chromatographie-Vorrichtung, die ein Chromatogramm erzeugt, das die Änderung der Ausgabe einer oder mehrerer Komponenten bezüglich einer unabhängigen Variable darstellt, mit folgenden Merkmalen: einer Einrichtung zum chromatographischen Verarbeiten des Gemisches, um eine Reihe von Spektren zu erhalten, von denen jedes das Gemisch zu einer jeweiligen Erfassungszeit in einem vorbestimmten interessierenden Zeitintervall bezüglich einer vorbestimmten physikalischen Eigenschaft des Gemisches, wie z.B. der Lichtabsorption oder der Masse, charakterisiert; einer Einrichtung zum Aufbauen eines Chromatogramms aus der Reihe von Spektren in der Form einer Reihe von Spektraldatenvektoren (S(i)), wobei jeder Spektraldatenvektor einem Amplitudenprofil einer vorbestimmten physikalischen Eigenschaft entspricht; einer Einrichtung zum Gruppieren der Reihe von Spektraldaten, wobei die Vektoren in jeder Gruppe addiert werden, um die Spalten einer quadratischen reduzierten Spektraldatenmatrix (Sr) zu bilden; einer Einrichtung zum Bilden einer Spektralkovarianzmatrix (Z) aus der Spektraldatenmatrix (Sr); einer Einrichtung zum Zerlegen der Spektralkovarianzmatrix in Spektralkovarianz-Eigenwerte (R) und entsprechende Spektralkovarianz-Eigenvektoren (Q); einer Einrichtung zum Bestimmen dreier orthogonaler Hauptfaktoren (fx, fy, fz) des Chromatogramms als ein vorbestimmte Funktion einer linearen Kombination der größten drei Spektralkovarianz- Eigenwerte und der entsprechenden Eigenvektoren; einer Einrichtung zum Ausdrücken jedes Spektraldatenvektors als eine lineare Summe der drei orthogonalen Faktoren, um einen entsprechenden dreidimensionalen (Sx, Sy, Sz), Faktor-analysierten Spektralvektor (Sf) zu bilden; einer Einrichtung zum Normieren jedes Faktor-analysierten Spektralvektors, derart, daß die Summe der Quadrate seiner drei Elemente (Sx, Sy, Sz) Eins ist, wodurch jeder Spektralvektor, der somit normiert ist, als ein Punkt auf der Oberfläche einer Kugel mit einem Radius von Eins dargestellt werden kann; einer Einrichtung zum Projizieren jedes normierten, Faktor-analysierten Spektralvektors auf einen zweidimensionalen Raum (Wx, Wy) unter Verwendung einer vorbestimmten Koordinatentransformation, die Bögen von Großkreisen der Kugel auf Liniensegmente in dem zweidimensionalen Raum abbildet, wodurch die Endpunkte jedes Liniensegments reinen Komponentenspektren entsprechen und die übrigen Punkte jedes Liniensegments binären Kombinationen der reinen Komponentenspektren entsprechen; und einer Einrichtung zum Herleiten von Abschätzungen der Komponentenspektren als eine Funktion ihrer Positionen entlang der Liniensegmente.