DE3855890T2

DE3855890T2 - Verfahren zur herstellung von imunodiagnose-mitteln

Info

Publication number: DE3855890T2
Application number: DE3855890T
Authority: DE
Inventors: Lawrence Kauvar
Original assignee: Terrapin Technologies Inc
Current assignee: Terrapin Technologies Inc
Priority date: 1987-10-13
Filing date: 1988-10-12
Publication date: 1998-02-12
Anticipated expiration: 2008-10-13
Also published as: JP2674948B2; JPH03504638A; HUT55143A; EP0387276B1; AU2790989A; NZ226552A; AU635492B2; EP0387276A1; CA1340459C; KR890701761A; JPH0772151A; EP0387276A4; ATE152244T1; JPH07111427B2; WO1989003430A1; IE81146B1; DE3855890D1; HU886713D0; IE883094L

Description

Fachbereich

Die Erfindung betrifft die Verwendung von Immunoassay- Verfahren im allgemeinen, und im speziellen die Verwendung solcher Verfahren zum Nachweisen und quantitativen Bestimmen von Zielstoffen, die normalerweise keinen Immunoassays unterzogen werden. So lassen sich beispielsweise Spurenkontaminaten in Wasser, Erde und Luft, die normalerweise durch Hochdruck-Flüssigchromatographie detektiert werden, mittels der Stoffe, die beim Verfahren der Erfindung hergestellt werden, bequemer nachweisen. Die charakteristischen Profile der Stoffe, die in der hierin beschriebenen Weise erhalten wurden, ermöglichen die Auswahl von Stoffen, die mit dem Ziel reaktionsfähig sind.

Hintergrund

Die Verwendung des Immunoassays zum Nachweisen eines breiten Bereichs biologischer Verbindungen im human- oder veterinärmedizinischen Zusammenhang ist recht verbreitet, und Verfahren und Variationen zur Durchfuhrung der Assays sind wohlbekannt. Tatsächlich haben sich in letzter Zeit viele Bemühungen auf eine bessere Eignung der Assays durch Neuauslegung des Formats gerichtet. Siehe hierzu zum Beispiel US-Patentschrift 4.427.781, worin ein Partikelagglutinations-Verfahren beschrieben wird, welches von der Fähigkeit von Antikörpern bis zu erwunschten niedermolekularen Haptenen abhängt, Partikel zu agglutinieren, an denen die Haptene haften. Eine andere Abwandlung ist in US-Patentschrift 4.447.526 offenbart, worin ein Assay beschrieben wird, bei dem Eigenschafts- Veränderungen bei einer Markierung ausgenutzt werden, wenn eine spezifische Bindung an das Reagenz durch das zu analysierende Hapten eintritt. Diese Offenbarungen sind lediglich zwei von Hunderten, die spezifische analytische Methoden zur Steigerung von Handhabbarkeit oder Empfindlichkeit der Assays beschreiben, die auf den spezifischen Wechselwirkungen zwischen Antikörper-Molekülen (oder Fragmenten von Antikörpern) und nachzuweisenden Analyten beruhen.
Aufgrund der Abhängigkeit von dieser spezifischen Wechselwirkung hängt die Anwendbarkeit eines Immunoassays für jedes spezielle Analyt davon ab, ob geeignete Antikörper für die erforderliche spezifische Wechselwirkung erhalten werden können. Zwei Aspekte sind dabei festzuhalten: Erstens muß der Antikörper oder dessen Fragment zur Unterscheidung zwischen dem Analyt und anderen Stoffen, bei denen es sich um Kontaminanten in der zu analysierenden Probe handeln kann, in ausreichendem Umfang befähigt sein, d.h. die Spezifität muß hoch sein. Zweitens ist auch wichtig, daß der Antikörper oder das Fragment fest an das Analyt bindungsfähig ist, d.h. die Empfindlichkeit eines Assays wird durch die Affinität bestimmt. In US-Patentschrift 4,376.110 an David zum Beispiel ist die Verwendung monoklonaler Antikörper zur Verbesserung der Affinitäts-Eigenschaften der erwünschten Wechselwirkung offenbart.
Es gibt eine Vielzahl von Analyten als Kandidaten für den Nachweis, für die spezifisch und stark an sie bindende Antikörper mittels standardmäßiger in vivo-Methoden schwer züchtbar sind. Wie wohlbekannt ist, bestehen die üblichen Verfahrensweisen zum Erhalt von Antikörpern für eine bestimmte Substanz darin, diese Substanz einem geeigneten Versuchstier, zum Beispiel einer Ratte oder Maus, zu verabreichen und darauf zu zählen, daß das Immunsystem des Versuchstiers B-Zellen erzeugt, die zur Sekretion des geeigneten Antikörpers in der Lage sind. Entweder werden polyklonale Antiseren zur direkten Verwendung bei den Assays erhalten, wenn die Titer ausreichend hoch und die Ergebnisse zufriedenstellend genug sind, oder es wird eine Quelle für B-Zellen, zum Beispiel die Milz, zur Bereitstellung von Fusionspartnern verwendet, durch die sich Hybridome erhalten lassen, die zum Ausscheiden der gewünschten Antikörper in der Lage sind. Diese Hybridome können zum Erhalt der spezifischen Antikörper für das gesuchte Analyt einem Screening unterzogen werden. Diese Methoden sind gut durchführbar, wenn das Material groß genug ist, um immunogen zu sein, ungiftig genug ist, damit das Tier nicht vor Züchtung der Antikörper stirbt, und preiswert genug ist, um ausreichende Mengen zur Durchführung dieses Verfahrens zu erhalten. Dies ist nicht immer der Fall.
Das Problem der unzureichenden Größe kann oftmals durch Konjugation des Analyts oder einer modifizierten Form davon an einen Carrier gelöst werden, was die erforderliche Größe schafft, um dem, was ansonsten vom Immunsystem als zu klein ignoriert werden würde, Immunogenität zu verleihen. Es hat sich als möglich erwiesen, Antikörper zu bestimmten spezifischen Molekülen in dieser Kategorie durch Anwendung dieser inzwischen recht herkömmlichen Methode zu züchten. So ist beispielsweise in US-Patentschrift 4.456.691 ein Verfahren zur Herstellung von Antikörpern beschrieben, die mit polychloriertem Biphenyl (PCB) durch chemisches Modifizieren des PCBs und dessen Konjugation an einen Carrier reaktionsfähig sind. Ein ähnliches Verfahren ist in US-Patentschrift 4.530.786 für das Herbizid Antrazin beschrieben. Solch ein Ansatz ist jedoch unhandlich, muß für jedes einzelne Analyt neu ausgelegt werden und ist nicht erfolgsgesichtert, da die durch das Konjugat erhaltenen Antikörper sich in der Tat nicht auf das Analyt, sondern auf die Verbindungsregionen zwischen dem Analyt und dem Carrier richten können. Es ist merklich schwieriger, "neutralisierende" Antikörper - d.h. solche, die mit dem Analyt selbst reaktionsfähig sind - mittels dieses Verfahrens zu erhalten.
Ob das Problem der Toxizität ernst genug ist, um das Gesamtsystem zunichte zu machen, ist natürlich auch Frage des Zufalls. Was die erforderlichen Mengen an Antigen anbelangt, so hängt es natürlich vom jeweiligen Antigen ab, ob dieser Parameter minimiert werden muß.
Ein analoges Problem entsteht in einem therapeutischen Zusammenhang. Obwohl noch im Entwicklungsstadium, hat das therapeutische Verfahren der Verabreichung monoklonaler, für Versuchsobjekt-eigene Tumoren immunspezifischer Antikörper mit oder ohne Konjugation einer Markierung oder eines Toxins für die Therapie und/oder Diagnose einige positive Ergebnisse erzielt. Ein Methode zum Erhalt der in diesem Zusammenhang nützlichen monoklonalen Antikörper besteht in der Isolierung des Tumorgewebes und Verwendung des Gewebes als ein Immunogen, gefolgt von der Aufbereitung und Sortierung der abgeleiteten monoklonalen Antikörper unter Verwendung des Verfahrens von Kohler und Milstein und eines geeigneten Screenings. Dies ist eindeutig ein unpraktische Methode, da mehrere Monate erforderlich sind, um eine ausreichende Immunisierung zu bewirken und dadurch die Herstellung eines monoklonalen Antikörper-Panels zu ermöglichen Bis zu diesem Zeitpunkt kann sich der Zustand des Objekts hoffnungslos verschlechtert oder das antigene Profil des Tumors wesentlich verändert haben. Könnte ein geeigneter Antikörper aus einem großen, bereits vorhandenen Panel gewählt werden, so könnten diese Schwierigkeiten überwunden werden. Ein anwendbares Panel zur Behandlung von Tumoren existiert bereits (Oldham, R.K., J Biol Resp Mod (1987) 6:227-234). Außerdem können weitere große Panele unter Anwendung der Gentechnik hergestellt werden. Methoden zum Screening dieses Panels auf ein geeignetes Gegenstück hin wären zur Auswahl des zur Behandlung korrekten Antikörpers nützlich.
Diese letztere Anwendung ist bezeichnend für die Tatsache, daß im Fachbereich kein allgemeines Verfahren zum Erhalt eines Antikörpers der erwünschten Affinität und Spezifität bezüglich jeglichen Antigens unter Verwendung eines generischen Verfahrens angeboten wird, das für alle möglichen Antigene durchführbar und wiederholbar ist.
Dem umgekehrten Problem, d.h. dem Auffinden eines Mimotops für einen gegebenen Antikörper, hat sich jedoch Geysen, H.M., PCT-Anmeldung W086/00991, veröffentlicht am 13. Februar 1986, zugewandt. Das Wort "Mimotop", wie im folgenden verwendet, entspricht sehr grob der Verwendung dieses Begriffs in der Anmeldung von Geysen.

Beschreibung der Erfindung

Die Erfindung bietet Verfahren zur Herstellung immunologischer Reagenzien für jedes erwünschte Analyt, einschließlich bisher für den Immunoassay unzugänglicher Analyte, um einen geeigneten Antikörper aus einem bestehenden Set für die Reaktion mit einem erwünschten Ziel auszuwählen. Die verschiedenen Ausführungsformen der Verfahren der Erfindung können alle im Prinzip in vitro durchgeführt werden, doch kann in einigen Fällen die Anwendung des somatischen Immunglobulin- Diversifikations-Systems in vivo geeigneter sein.
Die Erfindung bietet auch ein Verfahren zur Erstellung eines Profils eines bestimmten Analyts durch Ausnutzung seines spezifischen Musters der Reaktivität gegenüber einem Panel von Antikörpern variierender Spezifität Die Erfindung stellt außerdem neuartige Verfahren zur Aufstellung solcher Profile mittels eines kompetitiven Bindungsassays unter Ausnutzung der Konkurrenz zwischen einem diversifizierten Set von Mimotopen und dem Analyt bereit. Die Erfindung stellt dabei ein neuartiges Verfahren zum Erhalt von Mimotopen für ein erwünschtes Analyt vor. Diese Mimotope sind zur Erzielung einer erhöhten Spezifität und Affinität bei Antikörpern, die mit dem Analyt immunreaktiv sind, und darüber hinaus als Reagenzien für kompetitive Assays nützlich. Die Erfindung stellt außerdem ein Verfahren zur Auswahl eines Antikörpers einer hohen spezifischen Reaktivität für ein erwünschtes Ziel durch Screening des Ziels gegen ein monoklonales Reversmotiv- (Umkehrbild)-Antikörper-Panel zur Verfügung.
Daher betrifft eine Ausführungsform der Erfindung ein Verfahren zum Erhalt von Antikörpern, die mit einem erwünschten Analyt reaktionsfähig sind, welches Verfahren das Umsetzen eines Panels willkührlich erzeugter, immortalisierter, Antikörper-produzierender Zellen mit einem Gemisch repräsentativer Mimotope in Konkurrenz mit dem Analyt und dann das Ernten der Zellen umfaßt, die jene Antikörper produzieren, um die das Analyt erfolgreich konkurriert. Das Mimotop-Panel kann von willkührlich bis maximal verschieden variieren; maximal verschiedene Panele von Mimotopen erfordern eine geringere Anzahl von Elementen und sind daher von Vorteil. Es wird sofort ersichtlich werden, daß nicht nur ein geeigneter Antikörper oder Set von Antikörpern identifiziert worden ist, sondern auch eine kontinuierliche Quelle dieses Antikörpers bereitgestellt wird. Der derart erhaltene Antikörper kann zu diesem Zeitpunkt ausreichend spezifisch und stark bindend sein, um das angestrebte Reagenz darzustellen. Dies trifft besonders auf die Situationen zu, bei denen die routinemäßige Überwachung einer bekannten Komponente in hoher Konzentration die angestrebte Anwendungsform ist. Sollte dies jedoch nicht der Fall sein, so werden durch die Erfindung weitere Verfahren zur Optimierung dieser Eigenschaften bereitgestellt.
Bei einer zweiten Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren zum Erhalt eines Mimotops für ein erwünschtes Analyt bereit, welches die Durchführung des oben genannten Verfahrens und dann das Screening eines Panels der Mimotope (im allgemeinen jener, die im Ausgangsgemisch enthalten waren) auf die Reaktivität mit dem Antikörper, der durch die ausgewählten Zellen ausgeschieden wurde, umfaßt. Diese Mimotope, die mit dem ausgewählten Antikörper reagieren, ahmen daher das Analyt hinsichtlich der Bindung an bestimmte Immunglobuline nach, wennauch nicht unbedingt hinsichtlich der Toxizität oder T-Zell-Erkennung als solcher. Polyklonale, mit dem Analyt reaktive Antiseren können dann durch Verabreichung der Mimotope als Ersatz-Immunogene erhalten werden.
Diese Möglichkeit führt zu einer dritten Ausführungsform der Erfindung, d.h. einem Verfahren zur Verbesserung der Affinität und Spezifität der ursprünglich erhaltenen Antikörper. Da das Mimotop ein Ersatz-Immunogen für das Analyt darstellt, kann es zur Immunisierung eines Tieres, zum Beispiel Ratte, Maus oder Schaf, und, mittels herkömmlicher Immortalisierungs- und Screening-Methoden, zum Erhalt von Antikörpern der erwünschten Spezifität verwendet werden. Dieses letztgenannte in vivo- Verfahren, bezüglich der Immortalisierungs- und Screening- Methoden des resultierenden B-Zell-Repertoires zwar ein herkömmliches, ist jedoch in seiner Verwendung von Mimotopen einzigartig, deren Fähigkeit, Analyte zu ersetzen, eher durch funktionelle Tests der Homologie als der chemischen Struktur definiert ist. Diese Mimotope werden zur Immunisierung des Versuchstiers und zum Screening des resultierenden Panels verwendet. Das Analyt selbst braucht bei keinem dieser Verfahren eingesetzt zu werden.
Die Erfindung betrifft auch Analysesätze, die für die Durchführung der vorangegangenen Verfahren nützlich sind.
Der Einfachheit halber wurden die verschiedenen Verfahren, die Teil der Erfindung bilden, bezüglich der Verwendung eines einzelnen Mimotops oder einzelnen Antikörpers in den Screening-Verfahren beschrieben. Ein weiterer Bestandteil der Erfindung und eine Verbesserung der Methode, bei der ein Antikörper oder ein Mimotop verwendet wird, ist jedoch die Verwendung von Subsets der Panele, die eine Vielzahl erfolgreicher Kandidaten darstellen. Bei dieser Abwandlung wird, anstelle der Wahl eines einzelnen Antikörper-Produzenten aus einer Ausgangsgruppe immortalisierter, Antikörperproduzierender Zellen, ein Subset von z.B. etwa zehn bis fünfzehn solcher Zellen verwendet. Die von diesem Set produzierten Antikörper werden dann als Gemisch zum Screening des Mimotop-Panels verwendet, und auch hierbei wird, anstelle der Wahl eines einzelnen, nämlich des reaktivsten Mimotops, ein Subset von z.B. zehn oder fünfzehn gewählt. Dieses Gemisch wird dann beim Immunisierungsverfahren verwendet, wodurch der immunisierte Organismus differenziell B-Zellen sich vermehren läßt, die auf die gemeinsamen Merkmale der favorisierten Gruppe von Mimotopen ansprechen Das monoklonale Panel, das durch Immortalisierung der Antikörper-ausscheidenden B-Zellen des immunisierten Tieres erhalten wurde, kann dann nochmals mittels Konkurrenz zwischen dem Subset-Pool der Mimotope und dem Antigen gescreent und das erfolgreichste ausgewählt werden.
Über die derartige Bereitstellung eines einzelnen, hochspezifischen, stark bindenden Antikörpers für das Analyt hinaus, stellt das Screening ein weiteres Subset zur Verfügung, dessen Muster der Reaktivität bezüglich des Analyts erhalten bleiben und zur Kennzeichnung des Vorhandenseins des jeweiligen Analyts von Interesse, im Unterschied zu unvollständig kreuzreagierenden Stammverwandten, verwendet werden kann.
Bei einer Anwendung dieses Konzepts kann ein handliches Panel von beispielsweise 25-75 Antikörpern verwendet werden. Das Profil eines solchen Panels kann mittels herkömmlicher Immunoassay-Techniken oder, vorteilhafterweise, in kompetitiven Assays zwischen dem unmarkierten, unmodifizierten Analyt und markierten Mimotopgemischen erhalten werden. Das Panel kann zur Identifikation des Analyts oder zur wiederholten Überwachung der Größe des durch die Reaktivität erzeugten Musters mit einem bestimmten Analyt als einer Funktion der Analytkonzentration verwendet werden.
Daher betrifft eine weitere Ausführungsform der Erfindung die Nutzung des Musters der Reaktivität eines spezifischen Analyts bezüglich eines begrenzten Antikörper-Panels, das aus einem oder mehreren der willkührlichen Panele gewählt ist. Bei dieser Ausführungsform richtet sich die Erfindung auf ein Panel von Antikörpern mit variierender Reaktivität gegenüber einem angezielten Analyt, und, wahlweise, auf ein kompetitives Gemisch markierter Mimotope, das zur Ermittlung variierender Reaktivitätsgrade zwischen dem Analyt und jedem Antikörper im Panel in Konkurrenz mit dem Mimotopgemisch nützlich ist. Um die Erzeugung der erwünschten Profile zu erleichtern, ist ein neuartiges Verfahren zur Bereitstellung des Panels auf einem festen Träger ebenfalls Teil der Erfindung.
Bei wiederum einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird ein maximal verschiedenes Mimotop-Set zur Erzeugung eines komplementären Sets monoklonaler Antikörper verwendet, welches ein Inversmotiv der Mimotope darstellt. Die strikte Komplementarität zwischen diesen beiden Referenz-Sets, dem einen der Mimotope und dem anderen der Antikörper, zeigt zusätzlichen Nutzen bei der Bereitstellung eines Registriersystems, das den indirekten Test kleiner Analytmengen gegen eine große Sammlung potentiell kreuzreaktiver Antikörper und die Auswahl von mit dem Analyt reaktionsfähigen Stoffen ermöglicht. Die geringen Kosten und die Schnelligkeit solch eines Vorauswahlverfahrens sind oftmals von Wert, zum Beispiel bei der Suche nach Antikörpern gegen Patient-spezifische Tumorantigene. Die Erfindung betrifft auch Verfahren zur Definierung maximal verschiedener Sets von Mimotopen und das derart definierte Set.

Kurzbeschreibung der Zeichnungen

In Abbildung 1 ist ein Panel von Antikörpern gezeigt, das an einen festen Träger gemäß des Verfahrens der Erfindung gebunden ist.
In Abbildung 2 ist das Muster der Bindungskoeffizienten für ein Basal-Antikörper-Panel mit 335 Elementen bezüglich dreier verschiedener Antigene gezeigt.
In Abbildung 3 ist eine Liste verschiedener Mimotope gezeigt, die auf variablen hydrophoben Index (hi) und hydrophobes Moment (hm) hin ausgelegt sind.
In Abbildung 4 ist der Bereich von hi und hm für die Peptide aus Abbildung 3 gezeigt.
In Abbildung 5 ist die Entwicklung eines Analytprofils gezeigt.
In Abbildung 6 sind die Aminosäure-Sequenzen eines Sets von 24 verschiedenen Nonapeptidamiden gezeigt.
In Abbildung 7 sind die Ergebnisse eines Assays gezeigt, bei dem die Bindung von 16 Elementen des Sets aus Abbildung 6 an einen beliebigen Antikörper getestet wurde.

Durchführungsformen der Erfindung

A. Definitionen

Nie hierin verwendet, bezieht sich "Mimotop" auf den Abschnitt eines Moleküls, der Komplementarität zur Antigen-Bindungsregion eines Antikörpers aufweist, der immunspezifisch an ein gesuchtes Antigen oder Analyt bindet - d.h. im allgemeinen der Region, die dem Epitop auf dem Analyt entspricht. Das Mimotop weist im allgemeinen nicht exakt dieselben Raum- und Ladungs- Konturen wie das Epitop auf, doch ist die Definition erfüllt, wenn das Molekül, in dem es vorliegt, auch durch das Mimotop zum spezifischen Binden an den gewünschten Antigen-bindenden Antikörper veranlaßt wird. Bei Mimotopen handelt es sich geeigneterweise um kurze Peptid-Sequenzen, da Peptide leicht in großer Vielfalt synthetisierbar sind, doch ist dies nicht aus theoretischen Gründen erforderlich. So könnten sich beispielsweise auch Kohlehydrate oder Detergenzien so verhalten, daß diese Definition zutrifft; der Grund ist einfach der, daß weder für ein willkührliches noch ein diversifiziertes Panel solcher Mimotope die Herstellmethoden durch die derzeit verfügbaren Synthesemethoden bezüglich dieser Moleküle eingegrenzt sind. Einzelne Mimotope dieser chemischen Typen könnten natürlich aufgebaut werden.
Gewöhnlich liegt das Epitop, das mit einem Antikörper reaktionsfähig ist, dessen Ersatz das Mimotop darstellt, im Gefüge eines größeren Moleküls vor, bei dem es sich, zum Beispiel im Falle von Peptiden, um eine verlängerte Peptidkette handeln kann, oder, entsprechend, um ein an irgendeinen anderen Stoff konjugiertes Peptid. In manchen Fällen dienen die zusätzlichen Teile des Moleküls bestimmten Funktionen. Soll das Mimotop als ein Immunogen verwendet werden, so ist zusätzliche Größe erforderlich, da die meisten Mimotop-Regionen durch relativ kurze Aminosäuresequenz- Regionen von 3-6 Aminosäuren dargestellt sind. Andererseits kann das Mimotop an einen Stoff konjugiert werden, der eine Markierung ermöglicht. Die Markierung kann eine direkte sein, wie im Falle einer Konjugation eines Fluorophors oder der Maskierung eines radiomarkierten Stoffes, oder es kann eine anschließende Anlagerung eines markierten Stoffs durch spezifische Bindung möglich sein, wie beispielsweise in dem Fall der Konjugation an Biotin bei der Biotin/Avidin-Bindung, bei der dann das Avidin die Markierung trägt. In jedem Fall ist das Mimotop selbst oftmals im Gefüge einer vergrößerten Molekularstruktur vorzufinden, und obschon der Begriff Mimotop als die Region betreffend definiert ist, die für die Antikörperbindung verantwortlich ist, so wird der Begriff doch oft austauschbar mit der Bedeutung von Konjugat verwendet. Ausdem Zusammenhang wird zu erkennen sein, ob im jeweiligen Fall das gesamte Konjugat oder die Bindungs-spezifische Region gemeint ist.
"Antikörperfragmente" bezieht sich auf Fragmente von Antikörpern, die die spezifischen Bindungseigenschaften des gesamten Antikörpers beibehalten. Bestimmte Fragmente sind im Fachbereich wohlbekannt, zum Beispiel F(ab')&sub2;, Fab und Fab', die durch Verdauung mit verschiedenen Proteasen erhalten werden. Wenn rekombinant hergestellt, können natürlich auch beliebige Fragmente so erhalten werden, daß sie die Antigenerkennenden Eigenschaften beibehalten. Diese Fragmente sind oftmals in vivo nützlich, da sie weniger immunogen als der Gesamtantikörper sind; es scheinen sich gewisse Vorteile zu ergeben, wenn auch bei in vitro-Assays Fragmente anstelle von Antikörpern für die spezifische Bindung verwendet werden. Wenn nicht anderweitig spezifisch angemerkt, sollte klar sein, daß dort, wo auf Antikörper im Zusammenhang mit einem in vivo oder in vitro-Assay Bezug genommen wird, auch immunspezifische Fragmente verwendet werden könnten.
""Willkührlich stimulierte Antikörper-produzierende Zellen" bezieht sich auf immortalisierte Antikörper-ausscheidende Zellen, die in nicht-spezifischer Weise stimuliert wurden, zum Beispiel durch Zugabe bakteriellen Lipopolysaccharids (LPS) zur Kultur. Es ist bekannt, daß eine derart erhaltene Probe der allgemeinen B-Zell-Population eines einzelnen Säugetiers Antikörper-produzierende Zellen enthält, die spezifisch mit jedem möglichen Antigen reaktionsfähig sind, obschon bei mäßiger Affinität.
"Mimotope willkührlicher Konturen" bezieht sich auf Mimotope, die Oberflächenbereiche eine Vielfalt von Raum- und Ladungsstrukturen aufweisen. Wie unten beschrieben, kann ein solches willkührliches Gemisch durch Erzeugung von Peptiden aus Aminosäure-Sequenzen erzielt werden, wobei die Aminosäure in jeder einzelnen Position aus einer beträchtlichen Anzahl von Kandidaten willkührlich gewählt wird. Allerdings ist jegliches Gemisch von Molekülen, die eine breite Vielfalt von Oberflächenregionen entsprechend potentieller Epitope aufweisen, miteinbezogen.
"Mimotope maximal verschiedener Eigenschaften" bezieht sich auf ein Set von Mimotopen, bei dem verschiedene Eigenschaften bewußt manipuliert wurden, um ein Panel mit maximal verschiedenen, repräsentativen Eigenschaften zu generieren. Zu geeigneten, für die Herstellung dieser diversifizierten Panele zu berücksichtigenden Eigenschaften zählen, ohne darauf beschränkt zu sein: Isoelektrischer Punkt (pI), hydrophober Index (hi), hydrophobes Moment (hm), Dipolmoment (dm) und "Glätte". Durch Diversifizieren dieser Eigenschaften unter den Elementen eines Mimotop-Panels kann die Anzahl der Mimotope im Panel enorm gesenkt werden im Vergleich zu Panelen, bei denen eine vergleichbare Verschiedenheit durch willkührliche Wahl der Peptide erhalten wird.
"Maximal verschiedene" Gemische von Peptiden bezüglich eines gegebenen Sets von Parametern bezieht sich auf Gemische, bei denen die Elemente den gesamten Bereich jedes Parameter umspannen, und die Elemente des Gemischs innerhalb des Bereichs gleich beabstandet sind. Eine geeignete Normalisierung der Skalen für die verschiedenen Parameter erleichtert den Diversifikationsprozeß. So weist beispielsweise ein Gemisch von Peptiden, bei dem die Elemente maximal verschieden bezüglich des hydrophoben Index sind, auf ein Gemisch hin, in dem Stellvertreter des gesamten Bereichs der hydrophoben Indizes zu finden sind und in dem nicht zwei Elemente des Gemischs im hydrophoben Indexwert zueinander wesentlich näher liegen als jedes beliebig gewählte andere Paar. Es ist klar, daß eine perfekte maximale Verschiedenheit schwer erreichbar ist, weshalb sich der Begriff auf Gemische bezieht, bei denen die größtmögliche Verschiedenheit für den spezifizierten Parameter erzielbar ist. So variieren in einem Gemisch, das maximal verschieden bezüglich des hydrophoben Index (hi) und bezüglich des pI ist, alle Peptide mit ähnlichem pI bezüglich des hydrophoben Index und alle Peptide mit ähnlichem hi bezüglich des pI.
"Invers- oder Reversmotiv-Panele oder -Gemische" bezieht sich auf die Komplementarität der Ladungs/Raum-Konturen der Epitop/Paratop-Wechselwirkung von Antigen/Antikörper- Interaktionen. Daher stellt ein Panel monoklonaler Antikörper, bei dem jedes Element eine hohe Spezifität für ein einzelnes Element eines Mimotop-Panels im Vergleich zu den anderen Elementen des Mimotop-Panels aufweist, ein Panel mit einem Invers- oder Reversmotiv des entsprechenden Mimotop-Panels dar. Die Inversmotiv-Anwendung setzt voraus, daß für jedes Mimotop in einem Panel mit beispielsweise 50 Elementen ein Antikörper gefunden werden kann, der eine hohe Affinität für das spezifizierte Mimotop aufweist und nahezu keine Bindung an eines der anderen 49 zeigt. Solche Panele werden am geeignetsten gegen ein Set maximal verschiedener Mimotope hergestellt.
Wie im vorangegangenen ausgeführt, können Inversmotiv-Panele zum Beispiel in kompetitiven Assays zur Beschreibung entweder des Analyts oder der Antikörper verwendet werden. Vorzugsweise sind die Elementzahlen der Inversmotiv-Panele klein genug, um ein praktisches Set zu ergeben, doch groß genug, um ein aussagefähiges Muster zu erhalten. Diese Panele sollten daher gewöhnlich 10-100 Elemente, bevorzugt etwa 40-50 Elemente, umfassen. Die Reaktivität eines Analyts mit dem monoklonalen Antikörper-Inversmotiv-Panel oder eines Antikörpers mit dem Mimotop-Panel kann mittels einer Vielzahl von Methoden ausgewertet werden, wie nachfolgend beschrieben.

B. Allgemeine Beschreibung

Die Erfindung betrifft Verfahren zum Erhalt angezielter analytischer Stoffe zur Verwendung bei Immunoassays und der daraus abgeleiteten Stoffe. Einige Ausführungsformen der Verfahren umfassen die Verwendung großer Anzahlen willkührlich erzeugter Antikörper-produzierender Zellen und großer Anzahlen potentieller Mimotope.
Im Laufe der Durchführung des Verfahrens der Erfindung nimmt die Anzahl der Antikörper und Mimotope in einem bestimmten Panel oder Subset beträchtlich ab, weshalb die resultierenden Stoffe zur Verwendung in der Analyse hochgradig spezifische und stark bindende Mimotope und Antikörper umfassen können, oder außerdem Panele dieser Stoffe sein können, die charakteristische Reaktionsmuster bezüglich des Analyts zeigen. Die Panele der erhaltenen Antikörper werden immer charakteristischer und spezifischer für die Analyseverfahren, für die sie vorgesehen sind.
Im kurzen Überblick dargestellt, beginnt dieser Prozeß mit der Generierung eines Panels immortalisierter, monoklonaler, Antikörper-produzierender Zellen, die als Ausgangspunkt für die Herstellung von Stoffen bezüglich jedem speziell gewählten Analyt dienen werden. Für wiederholtes Screening wird die Zahl dieses Panels vorzugsweise auf eine handliche beschränkt, zum Beispiel etwa 10.000; da die Zahl der potentiellen Analyte in die Millionen geht, wird das Ausgangs-Panel nur dann einen entsprechenden Umfang aufweisen, wenn die Spezifität geopfert wird. Empirisch gesehen wird selbst bei zahlenmäßig wesentlich kleineren Panelen, zum Beispiel 300-500, nicht allzuviel der Spezifität für ein Ausgangsprofil geopfert. Eine breite Spezifität ist eine den willkührlich stimulierten B-Zellen zueigene Eigenschaft. Diese Klone erzeugen zumeist IgM-Immunglobuline. Auch ein rekombinant hergestelltes Set von Immunglobulinen kann verwendet werden.
Wäre es praktisch, die Millionen um Millionen möglicher Paratope herzustellen und zu screenen, die zur präzisen Anpassung an das Repertoire der gewählten Analyte erforderlich sind, so könnte dies direkt vorgenommen werden. Da dies jedoch nicht praktisch ist, stellt das System der Erfindung daher einen Weg zur Konzentrierung des Sceeningverfahrens auf einen praktischen Bereich der Möglichkeiten bereit.
Wird die Erfindung in ihrer einfachsten Form ausgeführt, so wird das Basal-Panel der Antikörper, das der erforderlichen Spezifität am nächsten kommt, zur Auswahl eines Mimotops aus einem willkührlich erzeugten Set verwendet, welches, da es eine sinnvolle Anzahl von Elementen enthalten muß, auch hier nicht jeder der Millionen von vorhandenen Analytkonturen mit absoluter Genauigkeit entsprechen kann. Daher wird ein Panel von Kandidat-Mimotopen einer großen Spannweite verwendet und die beste Option gewählt. Ist dieser "Ureingabe"-Schritt vollzogen, so erfordert das Verfahren der Erfindung die systematische Optimierung zuerst des einen, dann des anderen Partners der Antikörper/Mimotop-Bindungsreaktion. Das Kriterium für die Optimierung ist funktionell definiert durch die Fähigkeit zur Detektion des Analyts.
Ist das Ausgangsmimotop ausgewählt, so kann es das Analyt bei der Stimulierung des somatischen Diversifikationsprozeß' des Immunsystems eines Tiers ersetzen, der gewöhnlich als Antwort auf ein Antigen aktiviert wird. Das Panel monoklonaler Antikörper, das als Antwort auf diese Immunisierung erzeugt wird, kann dann unter Verwendung des Analyts in Konkurrenz mit dem Mimotop oder mit dem Gemisch der Mimotope oder unter direkter Verwendung des Analyts zur Auswahl des besten Kandidaten gescreent werden. Die Antikörper, die meist in IGG-Form vorliegen, sind als unterschiedlicher bekannt als ihre Basal-Repertoire-Vorläufer. In wohluntersuchten Fällen zeigten manche eine höhere, andere eine geringere Affinität für das Immunogen. In dem Maße, in welchem das Mimotop ein wirksames Ersatz-Antigen ist, enthalten die diversifizierten Klone auch Elemente mit einer höheren Affinität für das Analyt selbst. Alternativ dazu können die Antikörperklone in vitro mittels positionsgerichteter Mutagenese der Immunglobulincodierenden DNA randomisiert werden.
Ist diese Verbesserung unzureichend, so könnte der verbesserte Antikörper zum Screening eines Mimotop-Panels verwendet werden, was möglicherweise zur Wahl eines anderen Mimotops als dem zuvor verwendeten führen würde, nämlich einem, das besser zum Analyt paßt. Dieses zweitgewählte Mimotop kann für eine zweite Immunisierung zum Erhalt eines zweiten Panels in vivo- erzeugter B-Zellen, die die monoklonalen Antikörper zum Screening ausscheiden, verwendet werden. Auch dieses Verfahren kann wiederholt werden.
Bei einer eleganteren und effizienteren Form dieses Vorgangs wird das einzeln gewählte Mimotop oder Antikörper in jedem Schritt durch ein Subset mit gemeinsamen Eigenschaften einer funktionellen Homologie zum Analyt ersetzt. Dies ist vorzuziehen, da das spezielle Analyt eine Reihe von überlappenden Epitopen aufweisen kann, um seine Gesamt- Oberflächenkonturen zu regenerieren, weshalb eine Ansammlung davon die Gesamtoberfläche in nützlicherer Weise nachahmen kann als ein einzelner Anteil davon. Umgekehrt kann ein Mimotop eine erweiterte Oberfläche aufweisen, von der nur ein Teil dem Analyt hornolog ist. Durch Verwendung multipler Mimotope und/oder Antikörper werden die gemeinsamen Merkmale betont. Da Antikörper-Subsets außerdem charakteristische und reproduzierbare Interaktionsmuster mit einem einzelnen Analyt bereitstellen, die von denen verschieden sind, die mit verwandten Analyten erhalten wurden, kann Spezifität durch das Muster selbst verliehen werden und nicht durch die Reaktivität eines einzelnen Antikörpers als solchem.
So wird bei diesem abgewandelten Verfahren eine kleine Zahl, etwa 10 oder 15, des ursprünglichen Antikärper-Panels zum Screening des Mimotop-Panels verwendet. Diese Ergebnisse aus dem Mimotop-Panel ergeben noch ein weiteres Subset von etwa 10 oder 15 Mimotopen, die zur Immunisierung verwendet werden können. Das Immunsystem des immunisierten Tieres ist daher den gemeinsamen Merkmalen überaus stark ausgesetzt, weshalb das vom immunisierten Tier erhaltene Panel der monoklonalen Antikörper dann durchaus in Richtung dieser gemeinsamen Merkmale verschoben werden kann. (Chua, M.M., J Immunol (1987) 138:1281-1288.) Außerdem bietet das aus dem immunisierten Tier erhaltene Panel, entweder in diesem Fall oder dann, wenn nur ein einzelnes Mimotop verwendet wird, Subset-Panele, die durch ihre Bindungsanordnung in der Erkennung bestimmter Analyte kraft des Musters der Bindungsspezifitäten quer durch das Panel nützlich sind.
Im folgenden wird jeder der Schritte des Verfahrens der Erfindung ausführlicher beschrieben.

C. Herstellung der Ausgangsstoffe

Das Ausgangs-Antikörper-Panel

Das willkührliche Panel Antikörper-produzierender Zellen kann auf mehrere Weisen erzeugt werden. Seit nahezu zehn Jahren ist bekannt, daß Mitogen-aktivierte B-Zellen ein willkührliches Set von Antikörpern produzieren, die potentiell zum Binden mit jedmöglichem Antigen fähig sind. Die meisten der durch diese stimulierten Zellen ausgeschiedenen Immunglobuline sind jedoch Igms und von relativ geringer Affinität und Spezifität Das handliche Repertoire scheint ausreichend zu sein, um jedes der vielen Millionen Antigene, gegen die eine Abwehr erforderlich sein könnte, in gewissem Grade zu binden; daher ist eine Kreuzreaktivität erforderlich.
Die Immortalisierung einer großen Anzahl von B-Zellen, die zuvor unter Verwendung von Mitogenen, zum Beispiel Lipopolysaccharid (LPS), mittels Zellfusion oder viraler Infektion stimuliert wurden, ergibt eine im allgemeinen permanente Quelle einer großen Anzahl breitgefächerter Antikörper. Die LPS-Stimulierung führt zu einer teilweisen Differenzierung der B-Zellen, was sie zu guten Fusionspartnern macht. Verfahren zur Stirnulierung der Produktion von Antikörpern und zur Durchführung solcher Fusionen wurden zum Beispiel beschrieben von Andersson, J., et al, Current Topics on Microbiol and Immunol (1978) 81:130-138; Andersson, J., et al, Proc Natl Acad Sci USA (1981) 78:2497-2501; Goldsby, R.A., et al, Current Microbiol (1979) 2:157162. Andere Verfahren zur Konservierung der Lymphozyten als durch Fusion wurden berichtet von Howard, M., et al, Proc Natl Acad Sci USA (1981) 78:5788-5792, und die Sortierung dieser Hybridome nach Antigenspezifität wurde berichtet von Parks, D.R., et al, Proc Natl Acad Sci USA (1979) 1962-1966. Auch die Erzeugung von Hybridomen, die Antigen-spezifische Immunglobuline ausscheiden und als Immunogene in vitro verwendet werden, wurden ebenfalls beschrieben (Luben, R.A., et al, Molecular Immunol (1980) 17:635-639).
Um die Panelgröße handlicher zu machen, umfaßt eine Abwandlung der allgemeinen Verwendung eines großen willkührlichen Panels eine Vorsortierung, um dadurch das Panel auf die besten Kandidaten einzuengen. So beschreibt zum Beispiel Casali, P., et al, Science (1986) 234:476-479 die Verwendung eines fluoreszenzaktivierten Zellsorters zur Abtrennung humaner Lymphozyten, die zur Bindung an ein markiertes Antigen fähig sind. Die einzelnen Zellen könnten dann rückgewonnen und mit in Mikrokultur gezüchtetern Epstein-Barr-Virus transformiert werden. Eine solche Vorauswahl ist innerhalb des Rahmens der vorliegenden Erfindung möglich, wenn das gesuchte Analyt wirksam markiert werden kann. Kann solch eine Markierung vorgenommen werden, zum Beipsiel durch direkte Konjugation des Analyts an Fluoreszein oder durch Konjugation an eine Linkerkomponente, zum Beispiel Avidin, zur Assoziation mit Fluoreszenz-markiertem Biotin, so kann das von Casali beschriebene Verfahren (hierin durch Verweis miteinbezogen) zum Erhalt eines begrenzten Panels monoklonaler Antikörper von zum Beispiel 10-50 Elementen für ein anschließendes Screening des Mimotop-Panels verwendet werden. Die Immortalisierung der gewählten Zellen braucht nicht notwenigerweise mittels eines Epstein-Barr-Virus zu erfolgen, sondern kann auch durch standardmäßige Fusionsmethoden oder durch die heutzutage verfügbaren effizienten Elektrofusionsmethoden erfolgen, wie zum Beispiel von Biotechnologies and Experimental Research Incorporated (San Diego, CA) im Handel beziehbar.
In jüngerer Zeit ist es möglich geworden, Immunglobuline unter Verwendung rekombinanter Techniken zu erzeugen. Daher umfaßt ein alternatives Verfahren zum Erhalt eines willkührlichen Panele Antikörper-produzierender Zellen das willkührliche Mutagenisieren Immunglobulin-codierender DNA und Transfizieren des mutierten Gemischs in Zellen, die zur Expression der codierten, mutierten Immunglobuline fähig sind. Immunglobulin- Proteine wurden erfolgreich in E. Coli und in Hefe exprimiert, wobei Hefe die erzeugten Proteine zu immunologisch aktiven Formen verarbeitet. So wurde beispielsweise die Synthese von Immunglobulinen und deren in vivo Ansammlung in Hefe berichtet von Wood, C.R., et al, Nature (1980) 314:446-448. Die Synthese in E. Coli sowohl "nativer" als auch "dimerer" Antikörperfragmente, die zur Bindung von Antigen fähig sind, wurde ebenfalls berichtet (Skerra, A. Science (1988) 240:1038-1041; Butler, M., et al, ibid:1041-1043).
Ein Panel entweder immortalisierter B-Zellen oder rekombinanter Wirtszellen, die Expressionssysteme für Immunglobuline enthalten, kann mit jedem der vorangegangenen Verfahren erhalten werden. Wird ein völlig Willkührliches Panel verwendet, so kann ein Panel von etwa 10.000 Elementen erforderlich sein. Ein Panel von mindestens 50.000 Elementen verschafft einen besseren Querschnitt. Eine empirische Arbeit der letzten Zeit weist jedoch darauf hin, daß kleinere Zahlen für einige Zwecke zufriedenstellend sein können.
Die Ergebnisse dieser Arbeit sind in Abbildung 2 gezeigt. Abbildung 2A zeigt die Bindungskonstanten für 335 monoklonale Antikörper, die wie hierin in Beispiel 1 beschrieben erzeugt und quantitativ gegen das kurze Peptid Kassinin zur Bestimmung des "Bindungskoeffizients", d.h. der beobachteten Bindung, korrigiert für Hintergrund, gescreent wurden. (Das Screening wurde mittels einer Variante des handelsüblichen Dot-Blot- Verfahrens von Bio-Rad vorgenommen.) Wie in Abbildung 2A gezeigt, weist nur einer der 335 MAks einen Bindungskoeffizient von 3.500-4.000 auf; zwei weitere MAks weisen Bindungskoeffizienten von etwa 1.500 auf und einige wenige Antikörper zeigen Bindungskoeffizienten von etwa 1.000, doch bindet der Großteil nur sehr geringfügig an dieses sehr einfache Antigen.
Abbildung 2B zeigt dieselben Ergebnisse, die bei einem Test gegen ein komplexeres Antigen, den einfachen filamentösen Phagen F1, erhalten wurden. In diesem Fall, bei dem sich wenige Epitope willkührlich vielmals wiederholten, weist nahezu das gesamte Panel eine beträchtliche Bindung mit dem Antigen auf, wobei die Bindung vermutlich durch die multivalente Natur des IgM erhöht ist.
In Abbildung 2C sind die Ergebnisse gezeigt, wenn ähnliche Assays gegen ein hochkomplexes Antigen, Weinbergschnecken- Hämocyanin (KLH), durchgeführt wurden. In diesem Fall sind mehr Epitope und folglich größere Anzahlen von Antikörpern mit einer beträchtlichen Affinität für das Antigen vorhanden.
Die in Abbildungen 2A, 2B und 2C gezeigten Ergebnisse sind in Abbildung 2D zusammengefaßt, worin die Verteilung der Bindungskoeffizienten im murinen Basal-Repertoire für diese drei Stoffe aufgetragen ist. Wie in der Abbildung gezeigt, ist der Prozentsatz an monoklonalen Antikörpern mit hoher Bindung für Kassinin recht niedrig; nichtsdestotrotz sind innerhalb des Panels von lediglich 335 MAks zumindest einige wenige Antikörper mit beträchtlicher Affinität zu finden.
Diese Ergebnisse führen zu mehreren wichtigen Konsequenzen. Zunächst einmal muß das Basal-Panel nicht übermäßig groß sein, wenn das Antigen von korrekter Komplexität ist, um eine Trennung bei einer geringen Zahl vorhandener Antikörper im Panel sicherzustellen, wie dies in Abbildung 2A der Fall ist. Zweitens kann das Subset-Panel hochbindender MAks selbst ein nützliches analytisches Instrument sein. Der "Fingerabdruck" von Kassinin gegenüber diesem Panel, wie aus dem in Abbildung 2A gezeigten Muster abgeleitet, kann zur Überwachung des Kassiningehalts in Testproben wirksam eingesetzt werden. Erhöhte oder verminderte Kassiningehalte können durch in sich folgerichtige Bestimmungen der Bindung an zwei oder drei hochbindende Antikörper nachgewiesen werden.
Wie auch immer das monoklonale Basal-Antikörper-Panel hergestellt wird, können diese Kulturen in Mikrotiterplatten oder auf anderen geeigneten Substraten gezüchtet werden, die eine leichte Analyse der Oberstände hinsichtlich der Bindefähigkeit für das Analyt oder die Mimotope gestatten. Eine Ausführungsform der Erfindung betrifft einen Analysesatz, welcher Analysesatz dieses oder ein später hergestelltes Panel von Antikörper-produzierenden Zellen umfaßt, das auf ein geeignetes Substrat für das Screening bei den Verfahren der Erfindung aufgebracht ist. Zu geeigneten Analysesatz- Strukturen zählen Mikrotiterplatten, Nitrocellulose, aktivierte Formen von Nylon oder anderen Polymeren, die als Platten zur Verfügung stehen, und derivatisierte Agarose, die sich in Filterpapier erhärtet hat.
Da davon ausgegangen wird, daß das willkührliche Ausgangspanel eine Ansammlung von Antikörpern darstellt, bei der Spezifität und Affinität dem Umfang geopfert wird, da hierbei große Elementzahlen erforderlich sind, ist dieses Panel zur Verwendung in einem Analysesatz für ein bestimmtes Analyt weniger nützlich; es erweist seinen Nutzen eher als Mittel zur Herstellung zusätzlicher, bei der Analyse eines breiten Bereichs von Analyten nützlicher Stoffe. Demgemäß wird dieses Panel besser als Instrument für Herstellung und Forschung aufbewahrt denn als Analysesatz aufbereitet. Ein Subset dieser ursprünglich erzeugten Antikörper kann jedoch ein ausreichend charakteristisches Muster bezüglich eines bestimmten Analyts erzielen, so daß es auch als Testsubstrat dienen kann.

Die Mimotope

In den Anfangsphasen der Verfahren der Erfindung ist außerdem ein Gemisch von Mimotopen erforderlich, von denen einige zumindest zu einem zufriedenstellenden Grad zur Nachahmung der Bindungsfähigkeit des Analyts fähig sind. Ein früher Versuch, synthetische Epitope für ein Antigen einer bekannten dreidimensionalen Struktur bereitzustellen, wurde beschrieben zum Beispiel von Atassi, M.Z., et al, J Biochem (1977) 252:8784- 8787.
Wie oben erwähnt, ist die chemische Beschaffenheit der Mimotope eher eine Frage der Handlichkeit als von theoretischer Signifikanz. Es können zwei extreme Ansätze zur Herstellung eines Set potentieller Mimotope gewählt werden. Bei einem Ansatz umfaßt ein willkührliches Set sehr große Elementzahlen. Eine geeignete Quelle eines willkührlichen und breitgefächerten Sets einer dreidimensionalen Molekularstruktur ist die Synthese von 3-6 Aminosäure-Peptiden einer willkührlichen Sequenz. Werden lediglich die 20 formal codierten Aminosäuren verwendet, so ergeben sich 20³ oder 8.000 mögliche Tripeptide. Ein Gemisch von mindestens 500 Tripeptiden ist notwendig, 5.000 oder 10.000 sind bevorzugt. Die tatsächlich erforderliche Zahl kann durch Optimierung der Wahl der Reste minimiert werden. So ergibt beispielsweise die Substitution von Alanin durch Valin kein materiell verschiedenes Peptid, wohingegen die Substitution von Alanin durch Tyrosin einen starken Unterschied macht. Natürlich kann die Zahl der theoretisch möglichen Mimotope für eine 3-Aminosäure-Sequenz durch Verdopplung der Zahl der Aminosäure-Kandidaten um mindestens 8 multipliziert werden, wenn synthetische Peptidverfahren verwendet werden. Dies kann durch Hinzunahme weiterer 20 Aminosäuren mit modifizierten Seitenketten als Kandidaten für die Aufnahme in die Sequenz oder durch Aufnahme des D-Isomers vorgenommen werden. In diesem Fall würde man 40³ mögliche Tripeptide erhalten. Ein Ansatz zur Bereitstellung großer Anzahlen von Mimotopstrukturen wurde beschrieben von Geysen, H.M., WO6/00991 (supra), wobei multiple Peptide durch Einführung multipler Reste beim Kettenverlängerungsschritt auf multiplen Trägern für die Festphasensynthese gleichzeitig erhalten werden. Geysen hat auch das Testen eines Antikörpers gegen alle 400 möglichen "natürlichen" Dipeptide als Ausgangspunkt für das Mimotop-Design beschrieben. Die Zahl der verfügbaren Peptide, wenn die Peptidkette über den Bereich der Epitopgröße (bis zu sechs Aminosäuren) hinaus verlängert wird, steigt natürlich entsprechend.
Ein sogar noch willkührlicher aufgebautes, aber nicht notwenigerweise diversifizierteres Panel multipler Mimotope kann durch drastische Hydrolyse der in der Natur vorkommenden Proteingemische erhalten werden. So kann zum Beispiel Hefeextrakt durch Behandlung mit einem Proteasengemisch oder einer Abfolge von Proteasen, zum Beispiel Trypsin, Chymotrypsin, Collagenase, Chymosin, Enterokinase und so weiter, hydrolysiert werden. Das Resultat besteht in einer großen Anzahl niedermolekularer Proteine, die, wenn gewünscht, auf SDS-Gelen getrennt und unter Verwendung zum Beispiel des Bolton-Hunter-¹²&sup5;I-Verfahrens markiert werden können. Diese individuellen SDS-Streifen haben sich als übertragungsfähig auf Western-Blot-Papier erwiesen, um dadurch ein Panel individueller Mimotope zu erhalten. Die unmarkierten, übertragenen Mimotope oder in einer Weise markierten Mimotope, die mit einer anschließenden Markierung kompatibel ist, wenn die Mimotope an Kandidat-Antikörper gebunden sind, kann als Methode zur Identifizierung von Kandidat-Mimotopen gegenüber zuvor gewählten Elementen des Basal-Repertoires verwendet werden.
Ein unterschiedlicher und bevorzugter Ansatz zur Herstellung eines Sets von Mimotopen ist die Herstellung eines maximal verschiedenen Sets. Mit diesem Set wird die oben angesprochene zahlenmäßige Minimierung durch Optimierung der Wahl der Reste auf einen gereinigten Grad erzielt. Konzeptuell betrachtet, wird der Aufbau eines diversifizierten Sets von Mimotopen, zum Beispiel Peptiden, durch ein Peptid-Design erzielt, bei dem bestimmte definierte Eigenschaften systematisch über den Gesamtbereich variiert werden. Zur Erwägung geeignete Eigenschaften sind die Gesamtladung auf dem Peptid, die Gesamthydrophobizität, das hydrophobe Moment, die allgemeine Beschaffenheit seiner Konturen (d.h. glatt oder rauh) und die Ladungsverteilung Werden Peptide verwendet, was die geeignetste Verkörperung der Mimotope wäre, so sind diese Eigenschaften aus den Aminosäure-Sequenzen vorherbestimmbar, wenn die bekannten Eigenschaften der verwendeten Aminosäuren und die aus einer Röntgenstrahl-kristallographischen Analyse der Proteine gewonnenen Daten zugrundegelegt werden.
Da außerdem die dreidimensionale Struktur der Peptide aufgrund von Wärmebewegung schwankt, kann die Anwendung von Stabilisierungsmaßnahmen für die gewünschte Struktur sinnvoll sein.
Diese Maßnahmen zur Stabilisierung der Struktur von Peptiden sind im Fachbereich bekannt (siehe zum Beispiel Weber, D.F., et al, Nature (1981) 292:55-58; Friedinger, R.M., et al, Science (1980) 210:656-658).
Veranschaulichend dargestellt, ist eine Ausführungsform dieses Ansatzes für ein Panel von 6-meren die folgende: Die Parameter, die die Elektronenwolkenmuster bestimmen, sollten unter den Kandidaten breit variiert sein. So sollten beispielsweise die vorbereiteten Kandidat-Peptide so gewählt werden, daß der Hydrophobizitäts-Index innerhalb des Panels ständig steigt. Eine Erörterung der Hydrophobizitäts-Indizes, bezogen auf die Struktur, ist zu finden bei Janin, J., Nature (1979) 277:491-492. Außerdern können die amphipatischen Qualitäten der Proteine durch Einstellen der periodischen Hydrophobizität der Reste variiert werden (Eisenberg, D., et al, Proc Natl Acaci Sci USA (1984) 81:140-144; Eisenberg, D., et al, Nature (1982) 299:371-374). Die amphipatische Eigenschaft ist in der Sekundär- oder Tertiärstruktur des Peptids ansässig, was einerseits zu wasserlöslichen, andererseits zu hydrophoben Abschnitten oder Flächen des Moleküls führt. Außerdem kann auch das Ladungsmuster aufgrund des Vorhandenseins positiv oder negativ geladener Aminosäure- Reste systematisch im Kandidat-Panel variiert werden.
Ein Ausgangs-Kandidat-Panel, das bei diesen Parametern diversifiziert ist, kann geeigneterweise aus 90-100 Peptiden unter Berücksichtigung der Auslegung der handelsüblichen Mikrotiterplatten und Proteinsynthesestäbe (Cambridge Research Biochemicals) bestehen. Diese Zahl reicht aus, um die Eigenschaften des gewünschten Mimotops zu umspannen. Die Synthese wird unter Verwendung herkömmlicher, im allgemeinen im Handel verfügbarer Verfahren durchgeführt, woraufhin das Panel einzelner Kandidat-Mimotope dann zum Screening bereit ist.
Eine vollständigere Diversifikation kann unter Einbeziehung weiterer Eigenschaften der Aminosäuren erzielt werden. Bei der Herstellung dieses diversifizierteren Panels werden die aus der Literatur einzeln bekannten Arninosäure-Eigenschaften verwendet. Die untenstehende Tabelle 1 zeigt eine Zusammenstellung dieser Eigenschaften für 19 der 20 codierten Aminosäuren. Cystein ist in der Tabelle oder im Set nicht enthalten, da sich dieser Rest besser zur Konjugation an zusätzliche Komponenten eignet, zum Beispiel an Marker, Träger, Feststoffträger etc. Tabelle 1
Die 5 Parameter aus Tabelle 1 können dann innerhalb des Sets variiert werden. Diese Parameter sind die folgenden:
1) Hydrophober Index (hi) ist die Summe für die Aminosäuren im Peptid der einzelnen hydrophoben Indizes der Aminosäure- Komponenten. Dies kann für ein Peptid aus n Aminosäuren dargestellt werden durch die Formel:
2) Isoelektrischer Punkt (oder pI) läßt sich annähernd als der Durchschnitt der pKas der ionisierbaren Gruppen ausdrücken.
Die dritten, vierten und fünften Parameter sind strukturabhängig; sie können jeweils als hydrophobes Moment (hm), Dipolmoment (dm) und "Korrugationsfaktor" (cf), mit welchem die Glätte bewertet wird, bezeichnet werden. Diese Parameter werden mittels ähnlicher Ansätze errechnet, bei denen es sich um den Absolutwert der Fourier-Transformation der entsprechenden Eigenschafts-Funktion handelt - d.h. die Stärke der Komponente der Periodizität der Periode-δ, wobei δ auf die Anpassung an eine α-Helix (100º) oder ein β-Faltblatt (170º) hin definiert ist. Die Zuordnung des geeigneten δ-Werts hängt von der normalerweise durch das Peptid angenommenen Struktur ab oder von der, die es durch den Designer des Peptids erhält.
Es ist jedoch anerkannt, daß die allgemeinen Beziehungen der resultierenden Parametern unter den Elementen eines Sets sich, unabhängig von den über die Struktur angestellten Annahmen, nicht nennenswert verändern. Werden daher die obigen Parameter für alle Elemente des Sets errechnet und dabei beispielsweise eine α-Helix-Struktur vorausgesetzt, so wird das Ergebnismuster nicht nennenswert vorn "wahren" Muster abweichen, und zwar selbst dann nicht, wenn die Peptide in Wirklichkeit nicht in -Helixform vorliegen. Dieses Ergebnis ist besonders wichtig im Hinblick auf sehr kurze Peptide, deren Länge nicht ausreicht, um eine anerkannte, geordnete Struktur zu erreichen.
Daher sind die Berechnungen der drei Parameter hydrophobes Moment (hm), Dipolmoment (dm) und Korrltgationsfaktor (cf) die folgenden:
worin für hm, H = hi, für dm, H = Gesamtladung bei pH 7 und für cf, H = Volumen.
Der Aufbau des diversifizierten Sets, basierend auf einer Maximierung der Variation dieser 5 Parameter, kann unter Verwendung einer Vielfalt von Sortiermethoden erreicht werden, doch ist ein besonders bevorzugter Ansatz der im folgenden beschriebene: Die Kandidat-Peptidsequenzen werden willkührlich aufgebaut und dann nach Verschiedenheiten von zuvor gewählten Kandidaten hinsichtlich jedes der 5 Parameter sortiert. Die Kandidat-Peptide werden willkührlich aus einem Pool einer geeigneten Anzahl ausgewählt, zum Beispiel 90-100 Quellen für 19 individuelle Aminosäuren, die in den 90-100 Quellen entsprechend ihrer Häufigkeit in natürlich vorkommenden Proteinen verteilt sind. Wie in Tabelle 1 gezeigt, kommen einige Aminosäuren in natürlichen Proteinen häufiger vor als andere, eine Häufigkeit, die generell anhand des Grades der Redundanz des Codons gemessen wird, das mit dieser Aminosäure im genetischen Code assoziiert ist.
Beim ersten aufgebauten 6-mer zum Beispiel wird jede Position durch eine aus dem Panel der 90-100 Quellen willkührlich gewählte Aminosäure besetzt. Der nächste Kandidat, der ebenfalls durch willkührliche Auswahl aus den 90-100 Quellen hergestellt wurde, wird mit dem ersten Kandidat auf die Unterschiede bei den 5 gemessenen und errechneten Parametern hin verglichen. Je nachdem, ob wesentliche Unterschiede vorliegen, wird dieses Kandidat-Peptid einbehalten oder aussortiert. Je mehr Kandidaten getestet werden, umso größer ist natürlich die Wahrscheinlichkeit, daß der Kandidat zu ähnliche Eigenschaften zu einem bereits im Set vorhandenen Kandidat aufweist, um seine Einbehaltung zu rechtfertigen, und umso größer die Zahl der Kandidaten, die aufgebaut und gescreent werden müssen, bevor einer als Element im Set aufgenommen wird. Dieser Vorgang wird fortgeführt, bis die Zahl der untersuchten Kandidaten seit Einbehaltung des letzten inakzeptabel wird. Im all£emeinen ist das erwartete Muster das folgende: Zahl der erwogenen Peptide seit letztakzeptiertem zu unhanlich Zahl der erwogenen Peptide
wobei der Aufbau- und Auswahlprozeß irgendwo im angegebenen Bereich enden sollte.
Um ein Endpanel von 48 Elementen zu erhalten, ist die Bereitstellung von ursprünglich etwa 96 verschiedenen Kandidaten bevorzugt, um eine abschließende Feinabstimmung von Hand zu gestatten. So können beispielsweise die Dipolmomente der Seitenketten im Vergleich zum Dipolmoment des Rückgrats erwogen werden. Das Endpanel sollte darauf hin nachgeprüft werden, daß eine Verteilung der Eigenschaften für alle Parameter vorliegt - d.h. daß jedes Peptid von allen anderen um mindestens X% abweicht (nach Normalisierung der Skala auf den Bereich 0-100 Einheiten) wobei der Wert von X durch die "unhandliche" Zone des Graphen bestimmt wird. So ist jedes Peptid von allen anderen Peptiden im Set bezüglich mindestens eines der 5 Parameter wesentlich verschieden. Dieser Ansatz ist vorteilhaft, da eine Berechnung einfacher als die Synthese ist. Eine völlige Verschiedenheit wird jedoch bis zu einem gewissen Grade durch die thermisch induzierten Strukturschwankungen untergraben.
Die Gültigkeit der Verwendung repräsentativer Proben zur Verminderung der Gesamtzahl der Elemente eines Panels bei einem Screening-Assay ist für eine Reihe von Zusammenhängen anerkannt. Siehe zum Beispiel Carey, W.P., et al, Anal Chem (1987) 59:1529-1534; Skilling, J., Nature (1984) 309:748-749.
Wurden die Peptide im Set der Kandidat-Mimotope gewählt, so sind die einzelnen Peptide mittels bekannter Methoden leicht zu erhalten. So gestattet beispielsweise d25 "T-Bag"-Syntheseverfahren von Houghten, R., Proc Natl Acad Sci USA (1985) 82:5131-5135, die Synthese makroskopischer Quantitäten dieser Stoffe. Außerdem wurde die Synthese großer Anzahlen von an einen festen Polyethylenträger zur Untersuchung der Antigenstruktur gebundener Peptide, wodurch Erkenntnisse über die Antigen-Antikörper-Interaktionen gewonnen werden sollten, berichtet von Geysen, H.M., Immunol Today (1985) 6:364-369; Geysen, H.M., et al, Molecular Immunol (1986) 23:709-715; Geysen, H.M., Australische Patentbeschreibung 25429/84.
Das synthetische Mimotopgemisch kann auch unter Verwendung willkührlich synthetisierter DNA-Sequenzen hergestellt werden, die in λ-Phagenvektoren zum Beispiel zur Expression in Phagentransfizierten Wirten Shotgun-geklont werden. Bei diesem Ansatz werden standardmäßige, handelsübliche Festphasen-DNA- Synthesemethoden zur Synthetisierung von 9-meren, 12-meren, 15-meren und 18-meren einer willkührlichen Sequenz verwendet, wobei weitere Verlängerungen einer gleichförmigen Sequenz möglich sind, und an standardmäßige Expressionssysteme zur Tranfektion in Wirtszellen ligiert. Es könnte jeglicher rekombinante Wirt verwendet werden, doch umfaßt ein geeignetes Expressionssystem λ-Phagenvektoren und bakterielle Wirtszellen. Solch transfizierte Stoffe können dann unter geeigneten Expressionsbedingungen kultiviert werden, um ein Mimotopgemisch zu erhalten; ist allerdings ein Panel statt eines Gemischs erwünscht, wie später erörtert, so kann das transfizierte E. Goh als individuelle Kolonien zum Erhalt individueller Peptide ausplattiert werden. Geeignete Expressionssysteme für Peptidsequenzen sind im Fachbereich allgemein bekannt und zu finden beispielsweise bei Maniatis, Laboratory Cloning Manual (1982), Cold Spring Harbor Press. Rekombinant hergestellte Peptide können auch als Gemische oder als individuelle Peptidsequenzen erhalten werden.
Es sollte nochmals betont werden, daß Polypeptide zwar extrem bequem synthetisierbar sind, doch sich die Wahl der potentiellen Mimotope nicht auf Aminosäure-Sequenzen beschränken sollte. Die Aminosäure-Sequenzen selbst können sowohl von natürlich vorkommenden Aminosäuren als auch nicht natürlich vorkommenden Aminosäuren als auch solchen, die natürlich vorkommen können, aber nicht durch den genetischen Code codiert sind, abgeleitet sein. Außerdem könnten auch Polysaccharidkomplex-Strukturen und chemisch synthetisierte Variationen polyzyklischer Strukturen verwendet werden, die eine Vielzahl von Substituenten zur Veränderung ihrer Form und Elektronenverteilung enthalten. Die Verwendung von Polypeptiden jedoch ermöglicht den Zugriff auf die derzeit verfügbare Technologie und eine schnelle Verwirklichung einer großen Zahl von Varianten, die möglicherweise das Spektrum der gesuchten Formen bieten, ohne daß die Zuhilfenahme anderer synthetischer Ansätze zum Erhalt einer repräsentativen Probe der Antigen-Oberflächenkonturen erforderlich wäre.

D. Screening-Verfahren

Mit dem Zielanalyt reaktionsfähige Immunglobuline

Eine Phase des Verfahrens der Erfindung betrifft eine Technik zum Erhalt von mit einem Analyt reaktionsfähigen Antikörpern. In einigen Fällen reicht hierzu möglicherweise eine einzige Wiederholung unter Verwendung des willkührlich erzeugten Antikörper-Panels aus, da bei diesem Verfahren das Antikörper- Panel vermutlich direkt mit dem Analyt gescreent werden könnte. Dies zeigt jedoch den Nachteil, daß das Analyt in großen Mengen vorliegen muß und zur Bindung mit dem Marker chemisch verändert oder ansonsten an einen modifizierenden Stoff konjugiert werden muß, der dann mit dem Marker binden kann. Beim Verfahren der Erfindung wird dies durch Konkurrenz des unmarkierten Analyts mit einem markierten Gemisch der Mimotope vermieden. Die Markierung des Mimotopgemischs läßt sich leicht erzielen durch Konjugation an die Peptidkette eines Linkermoleküls, das einfach ein Cystein-Rest sein kann, welches dann wiederum an einen Marker unter Verwendung handelsüblicher Linker, zum Beispiel von Pierce Chemical Co., konjugiert werden kann. Alternativ dazu kann das Peptid an andere Proteine konjugiert werden, zum Beispiel Avidin, welches dann zur Anbringung der Markierung verwendet werden kann. Für den Marker steht eine vielfältige Auswahl zur Verfügung, umfassend Enzyme, Fluorophore, radioaktive Komponenten, Chromophore und ähnliches. Zu typischen Enzym- Markern zählen Meerrettich-Peroxidase, Trypsin, Katalase und Alkoholdehydrogenase. Zu den Fluorophoren zählen Fluoreszein und Dansyl. Auch Chromophore, zum Beispiel verschiedene Farbstoffe, können verwendet werden. Die Zahl der möglichen Markierungen ist groß und im Fachbereich wohlbekannt. Der Marker kann an das Mimotop mittels eines Spacers konjugiert werden, welcher gewöhnlich ein Peptid-Homopolymer oder ein anderes einfaches Peptid oder kurze Oligomere einer entsprechenden Löslichkeit, zum Beispiel Polyethylenglycol, umfaßt.
Dann wird das Panel zur Kontrolle seiner Bindungsfähigkeit an das Mimotopgemisch vorab getestet. Bindungmuster und die Intensität der Markierung werden überwacht und bei einem bevorzugten Verfahren die Antikörper, die schlecht an die Mimotope binden, außer acht gelassen. Unter diese Kategorie fällt kein großer Prozentsatz des Antikörper-Panels, da das Mimotopgemisch von ausreichender Anzahl ist, um eine große Vielfalt möglicher Konturen vorzuweisen, weshalb es zumindest ein Paar Elemente enthalten sollte, die zur Bindung an jeden denkbaren Antikörper fähig sind. Dies trifft besonders auf ein Mimotopgemisch maximaler Verschiedenheit zu. Das Panel, bei dem die Fähigkeit aller Elemente zur Bindung des Mimotopgemischs nachgewiesen wurde, wird nochmals unter Verwendung unmarkierten Analyts in Konkurrenz mit dem Mimotopgemisch gescreent. Serienverdünnungen des Analyts und der Mimotopgemische (oder einzelner Bestandteile) werden zur Ermittlung jener Antikörper eingesetzt, um die das Analyt am erfolgreichsten konkurriert.
Ausführlicher gesagt wird das Gemisch der erforderlichen Anzahl von Mimotopen (etwa in der Größenordnung von 10-1.000 je nach vorliegender Verschiedenheit; für diversifiziertere Gemische reichen die Anzahlen vom unteren Ende des Bereichs aus) in geeigneter Weise markiert, zum Beispiel unter Verwendung des Acyliodierungs-Verfahrens mit dem Iod-Isotop 125, wie beschrieben von Bolton, A.E., et al, Biochem J (1973) 529-539, und im Handel von ICN Radiochemicals zu beziehen. Weitere Markierungsverfahren, zum Beispiel Avidin/Biotinverknüpftes Fluoreszein, können ebenfalls verwendet werden. Wie oben angemerkt, kann ein Gemisch von Peptiden direkt hergestellt werden, indem die einzelnen Elemente synthetisiert und miteinander gemischt werden, oder können hergestellt werden, indem große Proteine zu kleinen willkührlichen Peptiden hydrolysiert werden. Bei einer Methode beispielsweise wird ein partielles Trypsin-Hydrolysat (Cleveland, D.W., et al, J Biol Chem (1977) 252:1102-1106) eines Hefe-Lysats verwendet. Hierdurch wird eine große Anzahl von Peptiden bereitgestellt, die als Gemisch markiert werden können oder die unter Verwendung beispielsweise der SDS-Gelelektrophorese getrennt und auf einen Testträger, zum Beispiel Immunodyne (Burnette, W.N. Anal Biochem (1981) 112:195-203) übertragen werden können, wenn deren Bindung einzeln ausgewertet werden soll.
Es kann bei Verwendung des markierten Peptidgemischs erforderlich sein, sicherzustellen, daß eine zufriedenstellende Bindung in Bezug auf alle Kandidat-Antikörper im Panel stattgefunden hat. Auch die Bedingungen zur Bewirkung dieser gleichwertigen Bindung im gesamten Panel sollten empirisch festgelegt werden. Bei einer perfekten Situation bindet das Peptidgemisch gleichmäßig an alle Panel-Elemente. Häufig werden jedoch lediglich ähnliche Bindungsgrade festgestellt. Dies bietet eine absolut brauchbare Basis für die Konkurrenz mit dem Analyt, da die Interpretation der Ergebnisse bei der kompetitiven Situation vereinfacht werden kann, indem die Bindungswerte der Panel-Elemente an das Gemisch auf denselben Wert normalisiert werden, d.h. 100%, bevor die Konkurrenz ausgewertet wird.
Wenn bestätigt ist, daß das markierte Peptidgemisch annähernd gleichwertig an alle Kandidat-Antikörper in Abwesenheit des Analyts bindet, oder eine ähnliche Bindung normalisiert wurde, so wird das Screening in Gegenwart des Analyts wiederholt. Die Kandidaten, die eine spezifische Affinität für das Analyt besitzen, zeigen eine verminderte Bindung des markierten Peptidgemischs, wobei die Verminderung proportional zur spezifischen Affinität des Kandidats für das Analyt vorliegt.
Die Antikörper mit größter Affinität zum Analyt zeigen die geringsten Markierungsgrade, da hier eine erfolgreiche Konkurrenz des Analyts mit dem markierten Mimotopgemisch um den Antikörper vorliegt. Durch Auswertung der Konkurrenzfähigkeit des Analyts werden die Antikörper, die die größte Abnahme bei der Markerbindung zeigen, als die mit den günstigsten Parametern zur Bindung von Analyt gewählt.
Manchmal kommt es vor, daß eine Antikörper-produzierende Zelle oder ein Subsets des auf diese Weise erkannten Panels eine ausreichende Spezifität und Affinität für das gewünschte Analyt aufweist, so daß es für Immunoassays ohne weitere Verfahrensschritte nützlich ist. Ist dies der Fall, so stellen die immortalisierte(n) Zellinie(n) eine permanente Quelle für den erwünschten Antikörper oder das Subset dar, weshalb Immunoassays für das Analyt unter Verwendung dieses Antikörpers oder Subsets als der spezifischen Reagenz durchgeführt werden können.
Eine Auswahl von Protokollen für solche Assays steht zur Verfügung, wie im Fachbereich wohlbekannt. So kann zum Beispiel die zu testende Probe auf Mikrotiterplatten aufgegeben werden, die Platten dann mit dem identifizierten Antikörper behandelt und anschließend gewaschen werden.
Markierte Antikörper, die mit den Eigenschaften der Spezies (Anti-Murin oder Anti-Ziege) dieses Antigen-spezifischen Antikörpers reaktionsfähig sind, können dann zum Nachweis des Vorhandenseins gebundenen Antikörpers verwendet werden. Dieses Protokoll ist natürlich nur eines von vielen, das angewandt werden kann, und Variationen sind im Fachbereich wohlbekannt.
Bei einem anderen Protokoll könnte das Analyt zum Beispiel unter Verwendung eines kompetitiven Assays gemessen werden, bei dem normalerweise ein markiertes Analyt zur Konkurrenz mit dem unmarkierten Analyt in der Probe verwendet wird. Dies zeigt auch hier den Nachteil, das große Mengen des Analyts und dessen chemische Modifikation erforderlich sind; der Bedarf an zusätzlichem Analyt kann jedoch durch Verwendung des geeigneten Mimotops (wie nachfolgend bestimmt) als Konkurrent umgangen werden.
Für ein in dieser Weise gewähltes Subset oder ein willkührlich gewähltes Subset kann die Spezifität in einigen Fällen durch das Muster der Bindungsintensität des Analyts in Bezug auf die einzelnen Elemente des Panels bereitgestellt werden. Wie durch die in Abbildung 2 aufgeführten Ergebnisse gezeigt, kann für einfache Analyte ein charakteristisches Muster in einem relativ kleinen willkührlichen Subset erhalten werden. Zur Anwendung dieses Konzepts wird das Subset in einem geeigneten Muster auf ein Substrat aufgebracht und die Bindungsintensität des Analyts in Bezug auf jeden Antikörpers gemessen, so daß ein Muster entsteht. Wenn richtig ausgelegt, kann dies direkt abgelesen werden, zum Beispiel von einer Karte, die eine Matrix aus zum Beispiel 10-10.000, bevorzugt 10-100 solcher Antikörper aufweist. So werden bei einer bevorzugten Methode ein oder multiple Träger mit musterartigen Anordnungen des Subsets entweder durch Auftropfen oder durch anderweitiges übertragen der Flüssigkeitsüberstände aus den einzelnen Zellinien erhalten.
Das Musterpanel wird für das Analyt üblicherweise durch ein geeignetes Protokoll standardisiert, welches die Bindungsintensität des Analyts an jedes Element des Panels einwandfrei feststellt. Ein Ansatz für diese Kalibrierung ist die Behandlung des Panels mit gereinigtem Analyt und die Verwendung eines quantitativen Nachweissystems, wie beispielsweise die oben beschriebenen Antispezies-markierten Antikörper. Alternativ dazu kann ein umgekehrtes Standardisierungsmuster durch Konkurrenz von unmarkiertem Analyt mit dem markierten Mimotopgemisch erhalten werden. Das kalibrierte Panel kann dann zur Analyse der Probe auf das Analyt hin durch das beschriebene direkte oder kompetitive Protokoll und durch Überwachen eines gleichmäßigen Musters der quantitativen Bindung, das mit dem des Kalibrierungspanels übereinstimmt, verwendet werden. Dort, wo die Schwankungen bei den erhaltenen Mengen an Markierung entweder direkt, wie beschrieben, oder kompetitiv zwischen der Probe und dem markierten Analyt, dem markierten Mimotop, das das Analyt nachahmt, wie in der nachfolgend beschriebenen Weise identifiziert, oder dem markierten Gemisch gemessen wurden, weist dies auf Schwankungen bei der Menge des Analyts hin. In jedem Fall wäre das erhaltene Muster charakteristisch für das individuelle Analyt, weshalb durch dasselbe Panel oder Gruppe von Panelen ein geeignetes Testsystem durch Mustererkennung zur Verfügung gestellt wird.
Das erkannte Muster kann ebenfalls zur Verwendung bei der Überwachung der Analytgehalte in einer Probenreihe quantitativ gemacht werden, zum Beispiel der Überwachung chemischer Verarbeitung, Abfallverarbeitung oder anderer fortlaufender Verfahren. Liegt-das Analyt in verschiedenen Mengen vor, so ist die Bindungsintensität beim erkannten Muster eine Funktion der Analytkonzentration bei der Probenreihe. Mehrere Analyte können gleichzeitig bis zu dem Umfang gemessen werden, daß sich ihre Erkennungsmuster auf demselben Panel nicht überlappen und keine Signale von irrelevanten, nichtcharakterisierten Kontaminanten stören, wenn deren Schwankungen, relativ zu denen des Analyts, gering sind.
Eine Veranschaulichung der Verwendung der diversifizierten Antikörper-Panele zur Bereitstellung eines charakteristischen Profils für ein bestimmtes Analyt ist in Abbildung 5 gezeigt. Ein Antikörper-Panel wird unter Verwendung eines diversifizierten Sets ausgewählter Antikörper beispielsweise aus einem oder mehreren willkührlichen Panelen derart aufgebaut, daß jeder Antikörper im Panel eine unterschiedliche qualitative oder quantitative Reaktivität mit einem oder mehreren bestimmten Analyten zeigt. In Abbildung 5 besteht das Antikörper-Panel aus 20 Antikörpern; es kann jedoch eine größere oder kleinere Zahl von Antikörpern verwendet werden.
Um die Differentialwirkung mit den verschiedenen Mimotopen in einem Gemisch von N Mimotopen nachzuweisen, wird jeder Antikörper des Panels mit jedem der N Mimotope umgesetzt, die in geeigneter Weise markiert sind, zum Beispiel durch Radioaktivität, um ein nachweisbares Signal zu erhalten. Jedes dieser mit dem Panel der Antikörper umgesetzten Mimotope (Mtp) ergibt ein Bindungsprofil für das Panel, welches charakteristisch für das jeweilige Mimotop Mtp-1, Mtp-2, ...Mtp-N ist (Abbildung 5, Panele A-C). Die Bindungssignale für jedes der Mimotope 1-N werden dann für jeden Antikörper des Panels dazugefügt, um ein charakteristisches Summierungsprofil (Panel D) für das Set der N Mimotope in Bezug auf jeden Antikörper des Panels zu erhalten. So stellt Panel D auch ein Gemisch der N Mimotope dar. Die Summierungen der Mimotop- Bindungssignale für jeden der Antikörper werden dann derart "normalisiert", daß das Summierungssignal die maximale Bindung (100%) für jeden Antikörper (Panel E) darstellt.
Die Profile der Fingerabdruck-Eigenschaft für ein gegebenes Analyt oder Antigen von Interesse ("Ag A") wird durch kompetitives Umsetzen von Ag A und einem markierten Gemisch der Mimotope 1-N mit jedem Antikörper im Panel erhalten. Das durch Ag A (Panel F) erzeugte Konkurrenzprofil führt generell zu einer Abnahme bei der Bindung markierter Mimotope mit einem Teil der Antikörper im Panel aufgrund der erfolgreichen Konkurrenz von Ag A um bestimmte Antikörper des Panels. Panel F der Abbildung 5 zeigt, daß Ag A zu einer verminderten Bindung des markierten Gemischs von N Mimotopen mit drei Antikörpern des Panels führte.
Der Umfang (oder die Reduzierung) der Bindung, die jene Antikörper zeigen, um die Ag A erfolgreich mit dem markierten Mimotopgemisch konkurrierte, wird bestimmt (Panel G) und der Umfang (oder die Reduzierung) der Bindung für jeden Antikörper im Panel nochmals aufgetragen, um ein Antikörper-Bindungsprofil (Panel H) zu erhalten, welches charakteristisch für Ag A ist, wenn mit anderen Profilen für andere Analyte (Ag B, Panel I) unter Verwendung desselben Referenzpanels von Antikörpern und desselben kompetitiven Sets des Mimotopgemischs verglichen.
Es ist leicht zu ersehen, daß die Wahl eines diversifizierten Sets von Antikörpern zur Verwendung im Antikörper-Panel ein individualisiertes Panel für ein Analyt ergeben kann, das für dessen Nachweis und quantitative Bestimmung von Wert sein kann.

Wahl eines mit dem Analyt kompetitiven Mimotops

Um das/die geeignete(n) kompetitive(n) Mimotop(e) auszuwählen, muß das Mimotopgemisch selbst zu einem Panel aufgetrennt und gescreent werden. Das Screening-Instrument (Sonde) steht bereits in Form des/der Antikörper zur Verfügung, der/die aus dem Ausgangs-Panel ausgewählt wurde(n). In dieser Phase werden die Mimotope als einzelne Verbindungen üblicherweise auf einem festen Träger, zum Beispiel Nitrocellulose, Mikrotiterplatten oder das "vielnadelige" System von Geysen, bereitgestellt. Wird das Panel auf einen festen Träger aufgebracht, so wird in geeignetster Weise unmarkiertes (oder unwirksam markiertes) Mimotop verwendet und die Markierung in Konjugation an den ausgewählten Screening-Antikörper oder an einen sekundären Nachweis-Antikörper bereitgestellt. Die einzelnen Mimotope werden dann direkt oder indirekt mit markiertem Antikörper gescreent. Es kann ein einzelner Antikörper oder ein mehrere Antikörper enthaltendes Subset verwendet werden. Ein Subset kann angesichts des allgemeinen Fehlens von Spezifität der einzelnen Elemente des Ausgangs-Panels von Vorteil sein. Diejenigen, die am erfolgreichsten binden, werden für das Screening-Subset verwendet. Bei einer alternativen Methode kann das Mimotopgemisch unter Verwendung zunehmend kleinerer Subsets des Mimotopgemischs gescreent werden, bis ein geeignetes Bindungs-Mimotop erhalten wird.
Es ist von Vorteil, das Mimotop-Panel sowohl direkt mit markiertem Antikörper als auch in einem kompetitiven Assay zu screenen. Das Subset der Mimotope, die in zufriedenstellender Weise Antikörper binden, wird nochmals im Hinblick auf die Fähigkeit des Analyts zur Zerstörung dieser Bindung gescreent. Diejenigen, mit denen das Analyt am erfolgreichsten konkurriert, ahmen das Analyt offensichtlich am vollkommensten nach, weshalb diese die geeigneten Kandidaten für eine weitere Verfeinerung der Antikörperspezifität unter Anwendung der Immunisierung darstellen. Diese stellen auch die geeignete Wahl für die Direktverwendung bei Immunoassays dar, wie im folgenden Abschnitt beschrieben.
Die Wahl der geeigneten Subgruppe oder des einzelnen Mimotops -stellt somit das erforderliche Reagenz für kompetitive Immunoassays zur Verfügung, wobei das markierte Mimotop als der Konkurrent für das Analyt dient.
Geeignete Analysesätze zur Durchführung eines Assays für das Analyt stellen ebenfalls Teil der Erfindung dar. Die Inhaltsstoffe des Analysesatzes hängen von der Auslegung des Assay-Protokolls zur Detektion oder Messung ab. Alle Analysesätze enthalten Anweisungen zur Durchführung des Assays, geeignete Reagenzien und Marker, und feste Träger je nach Bedarf. Ist der Analysesatz auf einen einfachen Detektions-Assay für das Analyt unter Verwendung eines einzelnen, hochspezifischen Antikörper ausgelegt, so enthält der Analysesatz diesen hochspezifischen Antikörper und einige Stoffe zum Nachweis der Reaktion dieses Antikörpers mit dem Analyt. So kann das Nachweisreagenz zum Beispiel einfach die Markierung des spezifischen Antikörpers selbst umfassen, wenn der Assay durch nicht-spezifische Bindung des Analyts an einen festen Träger und Nachweis der Haltefähigkeit des festen Trägers für den markierten Antikörper durchgeführt wird. Wird mehr als ein für das Analyt spezifischer Antikörper festgestellt und liegt keine sterische Hinderung vor, die mehr als eine Antikörperbindung gleichzeitig verhindert, so kann ein Sandwich-artiger Assay unter Verwendung eines unmarkierten spezifischen Antikörpers zum Einfangen des Antigens und eines zweiten zum Nachweisen des eingefangenen Antigens verwendet werden. Alternativ dazu können die Analysesätze Panele von Antikörpern umfassen, deren Erkennungsmuster für das gesuchte Analyt kalibriert ist. Außerdem kann ein markiertes, kompetitives Mimotop oder Gemisch hinzugefügt werden, um die Durchführung der Assays durch Konkurrenz des unmarkierten Analyts in der Probe mit dem markierten Mimotop zu ermöglichen.
Alternativ dazu kann das Muster umgekehrt und ein einzelner Antikörper sein, der hinsichtlich seines Bindungsmusters an mehrere Mimotope, wenn erwünscht, sowohl mit als auch ohne konkurrierendes Analyt, charakterisiert ist. Dieses Muster stellt auch ein für das Analyt charakteristisches Profil bereit. Wenn mit einem diversifizierten Panel einer begrenzten Anzahl von Mimotopen, zum Beispiel etwa 40-100, bevorzugt etwa 50-60, bei maximaler Verschiedenheit der Eigenschaften durchgeführt, so kann dieses Verfahren auch zur Herstellung eines Erkennungsprofils für jeden einer Vielzahl von Antikörpern verwendet werden. Die Erkennungsprofile können in einer Qomputerdatei gespeichert werden. Da für jedes Profil nur wenige Assays erforderlich sind, kann eine große Sammlung von Profilen aufgezeichnet werden. Antikörper, die möglicherweise ein neuartiges Analyt binden, können durch Vergleich der gespeicherten Erkennungsprofile für die Antikörper mit einem Mimotop-Homologieprofil für das neuartige Analyt elektronisch ausgewählt werden, wie nachfolgend weiter beschrieben.
Das Analyt-Mimotop-Homologieprofil läßt sich am einfachsten mittels eines Referenz-Sets von Inversmotiv-Antikörpern bestimmen, das bezüglich des Mimotop-Panels hergestellt wurde. Für ein Panel von 50 Mimotopen umfaßt dieses 50 Antikörper, wobei jeder der 50 Antikörper 10-100mal stärker an eines der 50 Mimotope bindet als an irgendeines der anderen 49. So kann beispielsweise jeder monoklonale Antikörper eine Bindungsaffinität von mehr als 10&sup8; l/Mol für das Mimotop aufweisen, zu dem er paßt, aber weniger als 10&sup6; l/Mol für irgendeines der verbliebenen 49 Mimotope.
Das Inversmotiv-Panel kann mittels standardmäßiger monoklonaler Antikörper-Produktionsmethoden erhalten werden, indem mit dem Mimotop immunisiert und mit dem gewünschten Mimotop bei einem der herkömmlichen Screening-Assays gescreent wird. Die monoklonalen Antikörper, die die geeignete Spezifität aufweisen, werden ausgewählt, indem ihre Unfähigkeit zur Reaktion mit den verbliebenen 49 Mimotopen festgestellt wird. Ein geeignetes Vorab-Screening kann daher eine Konkurrenz zwischen einem Gemisch der 49 markierten Nicht-Kandidat-Mimotope und dem unmarkierten gewünschten Mimotop in einer Weise umfassen, die der für die Identifikation von Antikörpern im oben beschriebenen willkührlichen Panel ähnlich ist.
Bei einem sehr einfachen Anwendungsbeispiel dieses Konzepts zeigt ein neuartiges Analyt, das einzig und allein durch Antikörper #7 des Inversmotiv-Referenzpanels nachgewiesen wird, offensichtlich ein stark analoges Strukturprinzip zu Referenz-Mimotop #7, relativ zu den anderen 49 Mimotopen. Für einen Antikörper, dessen gespeichertes Erkennungsprofil eine starke Bindung an Mimotop #7 anzeigt, relativ zu den anderen 49 Mimotopen, besteht daher eine hohe Wahrscheinlichkeit der Erkennung des neuartigen Analyts. Zeigt das neuartige Analyt dementsprechend gleichermaßen eine Bindung an die Antikörper #7 und #11 des Inversmotiv-Referenzpanels und eine geringe gegenüber allen anderen, so besteht für Antikörper, die die Mimotope #7 und #11 gleichermaßen erkennen und die anderen nur in geringfügigem Maße, eine hohe Wahrscheinlichkeit der Erkennung des Analyts.
Allgemeiner gesagt können auch komplexere Erkennungsmuster verwendet werden. Für jeden Antikörper in der großen Sammlung könnte ein Muster des Bindungskoeffizients oder der Immunreaktivität mit jedem der zum Beispiel fünfzig Elemente des Mimotop-Panels erhalten werden. Zum Beispiel könnte Antikörper #664 des großen Panels einen Bindungskoeffizient von 50 mit Mimotop #1, von 25 mit Mimotop #2, von 122 mit Mimotop #3, von 10 mit Mimotop #4, von 200 mit Mimotop #5 und so weiter zeigen. Das resultierende Muster aus 50 Punkten definiert den indiviuellen Antikörper.
Da das Inversmotiv-Referenzpanel der monoklonalen Antikörper dieselbe Beziehung zu jeglichem potentiellen Analyt oder Zielantigen hegt wie das Ausgangs-Panel der 50 Mimotope zu den Antikörpern in der großen Antikörpersammlung, kann ein beliebiges Analyt indirekt mit seinem engsten Gegenstück unter der großen Sammlung der Antikörper zusammengepaßt werden, indem das Analyt gegen die 50 Elemente des Inversmotiv- Antikörper-Sets zur Bestimmung von Profil oder Signatur- Eigenschaft des Analyts getestet wird. Das erhaltene Profil, wenn jeder monoklonale Antikörper im Inversmotiv-Set mit dem Zielanalyt umgesetzt wird, paßt mit dem erhaltenen Profil zusammen, wenn sein idealer Antikörper-Partner mit dem Mimotop-Panel aus 50 Elementen getestet wird. Im Idealfall zeigt ein Analyt, das von Antikörper #664 erkannt wird, ein Muster der Reaktivität, das Bindungskoeffizienten von etwa 50 für MAk #1, 25 für MAk #2, 122 für MAk #3, 10 für MAk #4, 200 für MAk #5 und so weiter aufweist.
Diese Abwandlung der Screeningmethode kann daher zur Identifizierung eines bestimmten Antikörpers aus dem Basal-Set oder aus jeglichem großen Set verwendet werden, welches mit einem beliebigen Analyt reaktionsfähig ist, wobei komplementäre kleinere Sets von diversifizierten Mimotopen und Inversmotiv-Antikörpern als Referenz-Index eingesetzt werden. Von jedem Element des ursprünglich großen Antikörper-Sets wird bezüglich (zum Beispiel) eines diversifizierten Mimotop-Panels von 50 Elementen ein Profil erstellt, dann ein Inversmotiv- Antikörper-Set des Mimotop-Panels der 50 Elemente erhalten und das Inversmotiv-Antikörper-Panel gegen das potentielle Analyt oder Antigen zum Erhalt zusammenpassender Profile getestet.
Ein nützlicher Fall der Anwendung dieser Methode ist der, bei dem es sich bei dem neuartigen Analyt um ein Patientspezifisches Tumorzell-Oberflächenantigen handelt und die Antikörpersammlung die gesamte angehäufte Gruppierung der monoklonalen Anti-Tumor-Antikörper darstellt, die zu diesem Zeitpunkt auf viele Tausende geschätzt werden können. Die Gruppe der Anti-Tumor-Antikörper wird zunächst gegen ein kleines Set von Mimotopen typisiert, um ein Set der Referenzprofile zu erhalten. Von jedem Zell-Oberflächenantigen wird mit dem Inversmotiv dieses Mimotop-Sets ein Profil erstellt und die resultierenden Profile mit den gespeicherten Profilen der Elemente der Antikörpergruppe verglichen. Die engste Entsprechung beim Profil zeigt den bevorzugten Antikörper an. Die Vorteile dieser Methode zur Charakterisierung von Antigenen sind: (i) winzige Biopsie- Proben können gegen eine große Anzahl von Antikörpern typisiert werden; (ii) die Biopsie-Probe muß nicht chemisch modifiziert werden, da die Nachweis-Markierungen zur Messung der Bindung an das Referenzpanel von Antikörpern an die Antikörper gebunden werden können; und (iii) die Kandidatengruppe der Antikörper kann schnell und preiswert geprüft werden.

E. Verbesserung der Antikörper-Eigenschaften unter Ausnutzung des Immunsystems

Ist das vorläufige Set der Mimotope einmal ausgewählt, so kann es zum Screening einer großen Anzahl von B-Zellen auf jene verwendet werden, die eine höhere Affinität/Spezifität als die im ersten Reihenscreening-Panel aufweisen. Im einfachsten Fall kann das gesamte ruhende B-Zell-Repertoire von etwa 10&sup7; Zellen auf einem fluoreszenzaktivierten Zellsorter unter Verwendung der an ein Fluorophor als Sonde gebundenen Mimotope gescreent werden.
Die Analyse der "Reifung" der normalen in vivo-Immunantwort läßt darauf schließen, daß Klone einer höheren Affinität durch Untersuchung weiterer B-Zellen des Basal-Repertoires nicht am günstigsten erzeugt werden, sondern durch Aufnehmen der Randomisierung der hypervariablen Sequenzen entsprechend der Analyt-Bindungsstelle.
Bei einer direkten Methode ist das gewählte Mimotop oder Subset daher, über seine Nützlichkeit als kompetitives Reagenz beim Immunoassay hinaus, als ein Immunogen zur Verbesserung der Antikörperspezifität und/oder affinität nützlich. In gewissem Sinne ähnelt diese Methode einer standardmäßigen in vivo-Immunisierung mit Analyt oder Antigen, außer, daß keine Zugabe von Antigen erforderlich ist, wodurch der Toxizität des Antigens vorgebeugt wird. Außerdern wird die Unterdrückung und Normalisierung der Anti-Selbst-T-Zell-Antwort durch Konjugation der Mimotope an einen geeigneten Carrier, zum Beispiel Weinbergschnecken-Hämocyanin (KLH) oder Tetanus- Toxoid, möglich gemacht.
Die Immunisierung eines Versuchssäugetiers mit dem immunogenen Mimotop oder an einen Qarrier geknüpften Subset-Gemisch führt daher zu einer B-Zell-Zufuhr, die dann immortalisiert und auf hohe Affinität und Spezifität für das jeweilige Analyt unter Anwendung beispielsweise des oben eingesetzten Verfahrens gescreent werden können, wobei die Analyt/Mimotop-Konkurrenz für Spezifität und Affinität bestimmend ist. Alternativ dazu können die produzierten B-Lymphozyten zunächst unter Verwendung eines fluoreszenzaktivierten Zellsorters (FACS) gescreent werden, wie oben vorgeschlagen, indem das Mimotop an einen fluoreszenten Marker konjugiert und damit die beim Screening ausgenützte Reaktion vor der Sortierung durchgeführt wird. Die identifzierten, markierten Zellen können dann immortalisiert und, wenn erwünscht, nochmals gescreent werden.
Das Panel der Antikörper enthält zu diesem Zeitpunkt einige Antikörper, die spezifischer sind und stärker an die Mimotope binden als bei den Antikörpern des Ausgangs-Screenings der Fall. Normalerweise gehören diese auch der IGG-Klasse und nicht der im Basal-Repertoire üblichen IgM-Klasse an. Wird das Immunsystem des Versuchssäugetiers als somatischer Mutationsmechanismus für die B-Zell-Differenzierung und als Auswahlsystem für die differenzierten, zu vermehrenden B-Zellen eingesetzt, so ergibt sich für das resultierende Panel ein viel geringerer Umfang im Sinne der immunreaktiven Komplernente, doch eine viel höhere Spezifität und Affinität für das komplementäre Analyt, auf das sich das Interesse richtet. In dem Maße, in dem die Mimotope die relevanten Merkmale des Analyts nachahmen, weisen die resultierenden Antikörper eine höhere Spezifität und Affinität für das Analyt auf.
Der erste Aspekt dieser Verarbeitung durch das Immunsystem, d.h. die Differenzierung der B-Zellen zur Erzielung voneinander abweichender Konturen der variablen Regionen der Immunglobuline, kann unter Anwendung rekombinanter DNA- Techniken nachgeahmt werden, indem Immunglobulin- oder Immunglobulinfragment-codiernde DNAs in einer Reihe von Abwandlungen von den die Kandidat-Antikörper des Ausgangs- Panels codierenden DNAs geschaffen werden. Daher wird unter Verwendung bekannter Isolierungsmethoden die DNA, welche die Immunglobuline codiert, die von den aus dem Basal-Repertoire- Panel gewählten Zellen ausgeschieden wird, als das Set der Ausgangsstoffe isoliert. Die in den isolierten DNAs enthaltenen Sequenzen, die die hypervariablen Regionen der Immunglobuline codieren, können dann entweder willkührlich oder durch positionsgerichtete Mutagenese verändert werden, um Abwandlungen in den hypervariablen Regionen der resultierenden Antikörper zu bewirken. Die Methoden zur Identifizierung und Veränderung der hypervariablen Regionen sind im Fachbereich bekannt. Die mutierte DNA wird dann in Hefe oder Bakterien exprimiert, um das zweite Reihenpanel zu erhalten, welches den Umfang, doch nicht die Selektivität des durch das Immunsystem erzeugten Panels bereitstellt.
Mit dem zweiten Reihenpanel, das entweder durch das Immunsystem oder durch rekombinante Techniken geschaffen wurde, kann also ein einzelner Antikörper mit besonders günstigen Eigenschaften gewählt werden, oder noch bevorzugter, ein Subset erhalten werden, das ein Panel bereitstellt, welches ein bestimmtes Profil bezüglich der Affinität für ein gegebenes Analyt zeigt. Die Verwendung des ausgewählten Panels bei allgemeinen Assay-Verfahren wird nachfolgend eingehender beschrieben.

F. Verwendung der Antikörper-Panele in der Analyse

Das durch Screening oder durch Immunisierung mit Mimotop (oder Analyt) erhaltene Repertoire von Antikörpern (dessen Produktion durch Immortalisierung der sie produzierenden B-Zellen permanent gemacht werden kann), kann ebenfalls als ein Identifikations-Diagnostikurn für das Analyt in Testsubstanz verwendet werden. Gewöhnlich wird ein geeignetes kleines Subset verwendet, doch besteht kein theoretischer Grund dafür, daß nicht auch eine große Zahl wie nachfolgend beschrieben manipuliert werden kann, wenn sie richtig formatiert ist. Das Analyt zeigt ein bestimmtes Bindungsprofil, welches für das Analyt charakteristisch ist.
Wie oben ausgeführt, können Inversmotiv-Panele zur Charakterisierung entweder des Analyts oder des Antikörpers verwendet werden. Die Anzahl der Elemente der Inversmotiv- Panele ist vorzugsweise klein genug, um ein praktisches Set zu ergeben, aber groß genug, um ein aussagefähiges Muster zu erhalten. Solche Panele sollten daher gewöhnlich 30-100 Elemente, und vorzugsweise etwa 50 Elemente, umfassen Die Reaktivität des Analyts mit dem monoklonalen Antikörper- Inversmotiv-Referenzpanel (oder des Antikörper mit dem Mimotop-Referenzpanel) kann unter Verwendung einer Vielzahl von im Fachbereich bekannten Methoden ausgewertet werden, zum Beispiel durch direkte oder kompetitive Markerbindung.
Viele Protokolle können ins Auge gefaßt werden, doch wird durch das musterartig aufgetragene Panel zumindest ein geeignetes Instrument zum Erhalt eines oder einer Vielzahl von Profilen der Reaktivität für ein bestimmtes Analyt zur Verfügung gestellt. Da die Profile so individuell sind, können die Unterschiede zwischen ihnen zur Unterscheidung von Elementen engverwandter Analytklassen, zum Beispiel den verschiedenen Prostaglandinen, verschiedenen Isoenzymen oder sich einander stark ähnelnden Arzneistoffe, ausgenützt werden.
So ist auch ein Panel von 10 bis etwa 10.000, vorzugsweise etwa 50 maximal verschiedenen Antikörpern einer variierenden Affinität oder Spezifität für das Analyt, in musterartiger Anordnung auf einen festen Träger aufgebracht, Teil der Erfindung. Der feste Träger kann dann zur Auswertung der Probe auf das Vorhandensein des Analyts durch Messung seiner Bindungsaffinität und/oder -spezifität, indem beispielsweise Serienverdünnungen des markierten Mimotops als Konkurrent eingesetzt werden, oder auch in einem direkten Assay verwendet werden. Ein charakteristisches Muster solcher Affinität weist auf das Vorhandensein des Analyts hin, da das erhaltene Muster einzigartig und charakteristisch für eine bestimmte Substanz ist. Die unten beschriebene Art und Weise der Panel- Präsentation erlaubt große Elementzahlen im Panel. Das Muster kann visuell abgelesen werden oder kann Scanningmethoden unterzogen und digital oder analog ausgegeben werden.
Die Erfindung umfaßt auch Analysesätze, die dieses Repertoire von Antikörpern oder Mimotopen in einer geeigneten Anordnung, wahlweise zusammen mit dem/den geeigneten Mimotop(en), in einer handlichen Packungsstruktur und zusammen mit Anweisungen für die Durchführung des Tests, enthalten.

G. Präsentation der Panele

Es wird zu erkennen sein, daß viele der Schritte bei den Verfahren der Erfindung als auch die durch die Erfindung bereitgestellten Analysesätze die Anordnung der Mimotope oder Antikörper-produzierenden Zellen in einer organisierten Gruppierung der einzelnen Elemente oder einzelnen Pools erfordert. Standardmäßige Verfahren zur Erzielung solcher Anordnungen stehen zur Verfügung, wie oben ausgeführt, einschließlich der Verwendung von Mikrotiterplatten und deren Replicas auf Nitrocellulose oder Polystyrol.
Ein bevorzugtes Verfahren zum Schutz dieser ordentlichen Gruppierung umfaßt die Verwendung aktivierter Membranen, einschließlich im Handel verfügbarer oder wie nachfolgend beschriebener Membranen, die unter Verwendung derivatisierter Agarose hergestellt werden, zum Beispiel der handelsüblichen "NuFix "-Agarose Dieses Material wurde als ein Träger in Gelen in einer Dicke von etwa 1,5 mm verwendet von Shainoff, J.R., et al, Biotechniques (1986) 4:120-128. Die derivatisierte Agarose bietet eine größere Bindungsstabilität von Proteinen und Peptiden als die Adsorption an Polystyrol und Nitrocellulose, da kovalente Bindungen hergestellt werden.
Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung besteht in einem verbesserten Verfahren zur Nutzung der derivatisierten Agarose als festen Träger für die erforderlichen Panele.
Anstelle der Verwendung der derivatisierten Agarose-Gele, die schwer handhabbar sind und Ergebnisse erzielen, die nicht vollständig reproduzierbar sind, wird bei dieser Verbesserung die Agarose in einen inerten festen Träger imprägniert, zum Beispiel in ein Glasfaser-Filterpapier. Durch Verwendung des imprägnierten festen Trägers wird die Handhabung stark vereinfacht und die Reproduzierbarkeit stark verbessert.
Zur Herstellung der Träger der Erfindung wird die derivatisierte Agarose, zum Beispiel NuFix -Agarose, in einer geeignete Menge Wassers auf etwa 0,1-0,5%, bevorzugt 0,3%, gelöst und vor der Zugabe von Alkali, zum Beispiel eine Endkonzentration von 0,1 M Natriumborat, gekocht. Das Festphasen-Adsorbens, zum Beispiel Glasfaser-Filterpapier der geeigneten Größe, wird in die gelöste Agarose eingetaucht und Überschußflüssigkeit entfernt. Die fertiggestellten Platten werden zur Verfestigung der Agarose abgekühlt und unter Feuchtbedingungen bei 4ºC gelagert.
Zum Gebrauch werden die Platten aus Agarose-imprägniertem Papier in frischem Natriumborat äquilibriert, das das Bindungsreagenz, frisch gelöstes Natriumcyanoborhydrid (1 mg/ml) , enthält, die Überschußflüssigkeit entfernt und die Proben im gewünschten Muster auf dem Träger ausplattiert. Dies läßt sich mittels einer Vielzahl handelsüblicher Methoden bewerkstelligen. Hierzu zählt CloneMaster (Immunsine Corporation), eine Anordnung von 96 flachbödigen Metallstäben im Muster von 96-Well-Mikrotiterplatten, doch eignen sich auch alternative Transfermechanismen. Die übertragenen Stoffe werden mit dem Papier 5-15 Min. lang, bevorzugt etwa 10 Min. lang, umgesetzt, dann in einer Lösung fixiert, die Puffer und ein geeignetes Protein, zum Beispiel BSA, enthält. Die Tüpfel werden unter Verwendung passender Reagenzsysteme entwickelt, die sich für den in der Probe nachzuweisenden Stoff eignen.

Beispiele

Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung veranschaulichen, doch nicht einschränken. In Beispiel 1 ist ein spezielles Verfahren zur Bereitstellung eines Panels Antikörperausscheidender Zellen beschrieben, die ein Subset des vollständigen B-Zell-Repertoires darstellen, welches repräsentativ für dieses Repertoire ist. Weitere Verfahren, wie in der obigen Beschreibung ausgeführt, könnten ebenfalls zur Erzeugung dieses Panels verwendet werden. Außerdem ist ein spezielles Verfahren zur Herstellung eines repräsentativen Mimotopgemischs beschrieben; auch dies könnte mittels einer Vielfalt von Verfahren und unter Verwendung einer Reihe von Markierungsmethoden durchgeführt werden, wie oben beschrieben.
In Beispiel 2 ist die Herstellung der aufgetragenen Antikörper-Panele der Erfindung beschrieben.

Beispiel 1

Herstellung eines Panels Antikörper-ausscheidender, immortalisierter Zellen

Von 10 Wochen alten männlichen BALB/c-Mäusen wurden mittels standardmäßiger Verfahren Milzzellen erhalten und in einen 650-ml-Kolben eingebracht, der 200 ml Vollmedium (Iscove's modifiziertes Dulbecco-Medium (IDMD), 10% fötales Rinderserum, 0,4 mM 2-Mercaptoethanol, 2 mM L-Glutamin) enthielt. Den Zellen wurde bakterielles Gleitadjuvans (2 mg) als polyklonales Stimulans zugegeben, und die stimulierten Kulturen wurden bei 37ºC über 4 Tage hinweg inkubiert.
Die Zellen wurden mittels 10minütiger Zentrifugation bei 1.000 UpM geerntet und mit 10&sup8; Myelom-Zellen, P3X63AG8.653, kombiniert, die in ähnlicher Weise in Dulbecco's divalentem Kation-freiem PBS geerntet und 8 Min. bei 500 UpM geschleudert worden waren. Der Überstand wurde entfernt und das Pellet in 0,6 ml 50% Gew./Vol. PEG 4000 (Gaschromatographie-Grad) über einen Zeitraum von 1 Min. resuspendiert. Das Rohr, das das resuspendierte Pellet enthielt, wurde langsam über 45 Sek. hinweg bei 37ºC gewirbelt und weitere 45 Sek. lang stehengelassen. Die Zellen wurden über 3 Min. hinweg bei 500 UpM repelletiert, 15 ml an 37ºC warmem IMDM langsam dem Rohr zugegeben, ohne das Pellet zu zerstören, und dann über weitere 5 Min. hinweg bei 500 UpM geschleudert.
Der Überstand wurde entfernt und das Pellet nochmals in 15 ml Vollmedium (37ºC), das 0,4 mM Hypoxanthin und 1,6 × 10&supmin;&sup5; Mol Thymidin (Vollmedium + HT) enthielt, resuspendiert. Der Suspension wurden 155 ml des 37ºC warmen Vollmediums plus HT, zusammen mit 30 ml des Milz-Aktivierungsmediums (der Überstand aus der Milzzellenernte), zugegeben. Die Suspension wurde in einen 650-ml-Kolben gegossen und über 12-18 Std. hinweg bei 37ºC inkubiert. Die suspendierten Zellen wurden unter Verwendung von Makrophagen und Milzzellen zweier 10 Wochen alter männlicher BALB/c-Mäuse, zusammen mit 2 × 10&supmin;&sup7; Mol Aminopterin (A) , zugespeist, und die Suspension wurde bei 200 ml pro Well bei 96-Well-Gewebekulturplatten auf insgesamt 10 Platten ausplattiert. Pro Well wurden 5-10 Klone erhalten. Auf diese Weise wurden über 5000 Antikörper-produzierende Zellen aus der einen ursprünglich aktivierten Milzzelle erhalten. Die Kolonien können weiter in einzelne Zellinien getrennt oder als Pools für das Ausgangs-Screening verwendet werden.

Beispiel 2

Herstellung eines Panels auf unterstützter Agarose

NuFix -Agarose wurde bei etwas mehr als 0,3% in Wasser bei 70ºC über 10 Min. hinweg gelöst und dann über 10 Min. hinweg gekocht, wie vom Hersteller beschrieben. Ein Zehntel des Volumens von 0,1 M Natriumborat, pH 9, wurde zugegeben, und die Lösung in in 55ºC warmes Wasserbad eingetauchte Schalen gegossen. Auf 3" × 5" geschnittene Bogen aus Glasfaser- Filterpapier (Schleicher und Scheull) wurden in die Agarose getaucht und überschüssige Flüssigkeit durch Aufsaugen mit Löschpapier entfernt. Die Bogen wurden auf Wachspapier aufgelegt und über 10 Min. gekühlt, damit sich die Agarose verfestigen konnte; diese Platten wurden in einer Feuchtbox bei 4ºC verwahrt.
Zum Gebrauch wurde das imprägnierte Papier über 5 Min. hinweg in 0,1 M Natriumborat, pH 9, das 1 mg/ml Natriumcyanoborhydrid enthielt, äquilibriert Die Überschußflüssigkeit wurde abgelesen und aufgesaugt und die Platte auf eine Kunststoffeinhüllung aufgebracht. Ein-Mikroliter-Proben aus jedem Well der 96-Well-Platte wurden, mit oder ohne Züchtung muriner Zellen, auf das Papier in einem standardmäßigen 96-Punkte-Muster übertragen und die übertragenen Punkte der Kulturplattenmedien mit dem Papier über 10 Min. hinweg umgesetzt. Um überzählige Bindungsstellen zu blockieren, wurde die Platte dann in einer Lösung von 0,1 M Tris-HCl, pH 8, 0,1 M NaCl, enthaltend 1% Gew./Vol. Rinderserumalbumin, getränkt. Nach Entfernung der Flüssigkeit wurden 5 ml Peroxidase-gekoppeltes Ziegen-Anti-Maus-Serum (Zymed), das 1:3000 im gleichen Puffer verdünnt worden war, auf die Platte pipettiert und diese bei Raumtemperatur über 15 Min. hinweg inkubiert, oder das Reagenz wurde durch Aufsaugen durch Filterpapier, das mit Reagenz durchtränkt war, aufgebracht. Ungebundener Antikörper wurde durch Absaugen entfernt, und das Papier wurde 5-10 Min. lang bei multiplen Wechseln einer Phosphat-gepufferten Kochsalzlösung, die 0,1% BSA enthielt, gewaschen.
Die gebundene Peroxidase wurde unter Verwendung von 10 mg/ml Tetramethylbenzidin in 50% Methanol, 50% Zitronensäure, dem Wasserstoffperoxid bei einer Endkonzentration von 0,1% zugefügt worden war, sichtbar gemacht. Die Ergebnisse wurden mittels eines Reflexions-Densitometers oder durch Photographie aufgezeichnet.
In Abbildung 1 sind die Ergebnisse der Serienverdünnungen einer Hybridomkultur über aufeinanderfolgende Reihen der Platte hinweg gezeigt. Die Schwankung bei der Intensität ist deutlich zu erkennen.
Die Panele der Teststoffe können manuell oder unter Verwendung quantitativer Nachweisverfahren abgelesen werden. So kann das angeordnete Panel beispielsweise in einem Spezialapparat zur Digitalisierung des Signals, etwa eines Fluoreszenz-Signals, von jedem einzelnen der Flecke abgelesen werden und in Computer-lesbarem Format ausgegeben werden. Auf diese Weise kann ein quantitatives Maß jedes einzelnen Flecks erhalten werden.
Zu besonderen Anordnungen des Panels, die beim Verfahren der Erfindung nützlich sind, gehören kleinformatige Karten von zum Beispiel 3" × 3", die 100 Reihen zu 100 Tüpfelspalten umfassen. Diese Gesamtstruktur der 10.000 getrennten, einzelnen Antikörper, oder Pools von Antikörpern, ergibt ein charakteristisches Muster der Reaktivität mit bestimmten Analyten.

Beispiel 3

Synthese eines diversifizierten Mimotop-Panels

Ein Panel von 88 Pentapeptiden wurde auf der Basis abnehmender Hydrophobizität und periodischer Variation des hydrophoben Moments ausgelegt. In Abbildung 3 ist die Liste der synthetisierten Pentapeptide gezeigt, beziffert mit 1-88; in Abbildung 4 sind der hydrophobe Index und die hydrophoben Momente innerhalb dieses Panels gezeigt.
Das Panel wird unter Verwendung des Verfahrens von Geysen, H.M., et al, Proc Natl Acad Sci USA (1984) (supra) synthetisiert, bei dem Partien von 96 Nadeln verwendet werden. Die verbliebenen acht Polyethylen-Nadeln werden als Kontrollen der durch Aminosäure-Analyse zu analysierenden Synthese verwendet.
Die Mimotope des Panels werden dann gemischt, mit 125-I unter Verwendung des Bolton-Hunter-Reagenz, wie oben beschrieben, markiert und mit den einzelnen Elementen des Basal-Antikörper- Repertoires in Mikrotiter-Wells getestet. Es wird eine nahezu gleichmäßige Bindung an alle Antikörper-Elemente des Repertoires festgestellt. Der Test wird dann unter Zugabe einer definierten Menge an Analyt zum Gemisch in den Mikrotiter-Wells wiederholt. Eine kleine Anzahl der Wells zeigt eine stark verminderte Markierung. Diese Antikörper stellen das erfolgreiche Ergebnis eines Ausgangs-Screenings auf jene dar, die bevorzugt Analyt binden.

Beispiel 4

Es wurde die Wirksamkeit von markiertem Mimotop als dem Konkurrent für nicht-identisches Analyt beim Screening von Antikörpern getestet. Zwei verschiedene monoklonale Antikörper wurden in Doppelreihen zu 12 Tupfen pro Reihe auf ein Filterpapier-Substrat aufgebracht. Die Reihen 1 und 2 wurden mit MAk 33-6 und die Reihen 3 und 4 mit MAk 9-7-9 betupft, und Reihe 5 diente als Kontrolle ohne Antikörper. Rinderserumalbumin wurde auf alle Tupfen zur Blockierung überzähliger Bindungsstellen gebracht. Tupfen von markiertem Peptid/Mimotop, MB4-FITC (MB4 = Cys-Asn-Tyr-Ser-Lys-Tyr*-Trp- Tyr-Leu-Glu-His-Ala-Lys) in Spalten 2-11 des Panels wurden bei einer Set-Konzentration von 2 × 10&supmin;&sup5; M aufgebracht. Die Spalten 2-11 enthielten außerdem unmarkiertes Konkurrenz- Peptid/Analyt MB3 (MB3 = Cys-Asn-Tyr-Ser-Lys-Phe*-Trp-Tyr-Leu- Glu-His-Ala-Ile-Ser) (* = Abweichung beim Aminosäure-Rest) in zunehmend geringeren Verdünnungen, beginnend mit einer Konzentration von 4 × 10&supmin;&sup4; M in Spalte 2 und sukzessive 1:1- Verdünnungen in Spalten 3-11. Das resultierende Substrat wurde dann inkubiert und gewaschen (Bio-Dot-Apparat).
Bezüglich jedes MAk konkurrierte das markierte MB4-Peptid erfolgreich mit dem unmarkierten Konkurrenzpeptid MB3, als der MB3-Konkurrent verdünnt wurde, was ein charakteristisches Muster auf dem Panel für jeden der beiden getesteten MAks ergab.

Beispiel 5

In diesem Beispiel wird nachgewiesen, daß selbst eine kleine Anzahl diversifizierter Mimotope ein geeignetes Peptid zur Bindung an einen der beliebig gewählten Antikörper zu enthalten in der Lage ist. In Abbildung 6 sind die Aminosäure- Sequenzen für 24 Nonapeptide gezeigt, die gemäß des Verfahrens von Houghten (supra) synthetisiertwurden. Diese Peptide wurden so ausgelegt, daß sie eine hohe Diversifikation bei hydrophobem Moment und hydrophobem Index, als auch bei Ladungsverteilung und Größe zeigten.
Sechzehn dieser Peptide wurden auf ihre Fähigkeit zur Bindung des murinen, beliebig ausgewählten Antikörpers MAk 33-6 getestet, der für seine Bindung an die Peptide MB3 und MB4 bekannt ist, wie in Beispiel 4 beschrieben. Die Bindung wurde unter Verwendung des handelsüblichen Dot-Blot-Apparates von Bio-Rad getestet, der ein aktiviertes Papier oder Nitrocellulose-Substrat mit einer gemusterten Auflage aufweist, welche Reihen und Spalten der Testtüpfelstellen auf dem Substrat definiert. Die Ergebnisse sind in Abbildung 7 gezeigt.
Kurz gesagt wurde der Test durch Pipettieren von 1 λ der zu testenden Peptidlösung auf einen vorgegebenen Fleck, in diesem Fall auf Triplikatflecke, vorgenommen. Das Substrat wurde mit Casein oder BSA blockiert, woraufhin der Antikörper aufgebracht wurde, indem das Substrat auf einen Saran- Hüllträger gepreßt wurde, auf den 25λ einer Lösung, die 1 µm/ml MAk 33-6 enthielt, aufgetragen worden waren. Das Substrat wurde bei Raumtemperatur in Kontakt mit der Antikörperlösung über etwa 1 Std. hinweg inkubiert und dann entfernt und in Puffer gewaschen. Das Substrat wurde dann mit markiertem Ziegen-Anti-Maus-Ig inkubiert, das mit Meerrettich- Peroxidase markiert worden war, und das Vorhandensein der Markierung mittels standardmäßiger Methoden nachgewiesen.
Wie in Abbildung 7 gezeigt, enthalten die letzten drei Tüpfel in Reihe 2 des aktivierten Substrats das Peptid MB3, das für seine Bindung an MAk 33-6 bekannt ist, begründet durch die Homologie des Peptids zur Sequenz des bekannten Epitops. Die Reihen 3-6 enthalten jeweils 4 Triplikatproben verschiedener Peptide 1-16 des in Abbildung 6 gezeigten diversifizierten Sets. Reihen 7 und 8 enthalten zusätzliche Kontrollen. Die Ergebnisse in Abbildung 7 zeigen, daß 3 der 16 getesteten Peptide erfolgreich MAk 33-6 banden. Ein ähnlicher Assay unter Verwendung von MAk 9-7-9 anstelle von MAk 33-6 ergab ein Peptid, das von den getesteten 16 zur Bindung dieses Antikörpers fähig war.

Claims

1. Verfahren zum Auswählen einer Kandidat-Substanz aus einem Kandidatenarsenal, die spezifisch mit einem Ziel reagiert, welches Verfahren umfaßt:

(a) Bereitstellen eines Panels von Antikörpern oder immunologisch reaktiven Fragmenten davon, welches ein Umkehrbild eines Panels darin maximal verschiedener Mimotope umfaßt, daß jeder Antikörper oder jedes Fragment davon des Umkehrbild-Panels an eines der Mimotope bei einer Bindekonstante von mindestens dem 20fachen dessen mit jeglichem anderen Mimotop bindet;

(b) Erhalten eines Profils der Reaktivität des Ziels gegenüber dem Panel der Antikörper oder Fragmenten davon;

(c) Vergleichen des in Schritt (b) erhaltenen Profils mit den Profilen der Reaktivität der Bestandteile des Kandidatenarsenals mit dem Panel der Mimotope; und

(d) Auswählen eines Kandidaten aus dem Arsenal, der ein ähnliches Profil der Reaktivität gegenüber dem Mimotop- Panel wie das bei (b) erhaltene Profil aufweist.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Kandidat-Substanzen Antikörper sind und die Zielsubstanz ein Antigen ist.

3. Verfahren zum Auswählen einer Kandidat-Substanz aus einem Kandidatenarsenal, die spezifisch mit einem Ziel reagiert, welches Verfahren umfaßt:

(b) Erhalten eines Profils der Reaktivität des Ziels gegenüber dem Panel der Mimotope;

(c) Vergleichen des in Schritt (b) erhaltenen Profils mit den Profilen der Reaktivität der Bestandteile des Kandidatenarsenals mit dem Panel der Antikörper oder Fragmente davon; und

(d) Auswählen eines Kandidats aus dem Arsenal, der ein ähnliches Profil der Reaktivität gegenüber dem Umkehrbild- Panel wie das bei (b) erhaltene Profil aufweist.

4. Verfahren zum Auswählen einer Kandidat-Substanz aus einem Kandidatenarsenal, die spezifisch mit einem Ziel reagiert, welches Verfahren umfaßt:

(b) Erhalten eines Profils der Reaktivität eines Ligands, der bekanntermaßen an das Ziel bindet, gegenüber dem Panel der Antikörper oder Fragmente davon;

(c) Vergleichen des in Schritt (b) erhaltenen Profils mit den Profilen der Reaktivität der Bestandteile des Kandidatenarsenals mit dem Umkehrbild-Panel der Antikörper oder Fragmente davon; und

5. Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, wobei die Zielsubstanz ein Antikörper ist.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei jedes Mimotop ein Peptid von 3 bis 10 Aminosäuren umfaßt, wobei die Peptide im Panel maximal verschieden sind hinsichtlich des hydrophoben Index und pI, und wahlweise außerdem maximal verschieden sind hinsichtlich des hydrophoben Moments, Dipolmoments und Korrugationsfaktors.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das Mimotop-Panel 40 bis 100 Mimotope umfaßt.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei das Profil der Reaktivität der Bestandteile der Arsenals der Kandidat-Substanzen vorab bestimmt wird.

9. Verfahren zum Erhalt eines charakteristischen Profils einer Substanz, welches Verfahren umfaßt:

Inkontaktbringen der Substanz mit jedem Bestandteil eines Panels der Antikörper oder immunologisch reaktiven Fragmenten davon, welche Antikörper oder Fragmente davon in einer Vielzahl verschiedener Grade mit der Substanz reagieren;

Nachweisen des Grads der Reaktivität der Substanz gegenüber jedem Bestandteil des Panels, wobei das Nachweisen im kompetitiven Umsetzen der unmarkierten Substanz mit einem Gemisch verschiedener markierter Mimotope bezüglich jedes Bestandteils des Panels besteht, welches Gemisch mit jedem Bestandteil des Panels etwa gleichermaßen reaktionsfähig ist, und Messen der Abnahme der Bindung des markierten Gemischs an jedes Bestandteil bei Vorhandensein, verglichen zur Abwesenheit, der Substanz;

Aufzeichnen des Grads der Reaktivität der Substanz gegenüber dem Bestandteil; und

Anordnen der aufgezeichneten Grade der Reaktivität, um ein charakteristisches Profil der Substanz zur Verfügung zu stellen.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei das Panel der Mimotope mittels eines Verfahrens erhalten wird, das umfaßt:

Bereitstellen von mit Espressionsvektoren transfizierten Wirtszellen, die zum Exprimieren der DNA, die durch die Mimotope codiert wird, fähig sind, und entweder:

1) um ein Gemisch zu erhalten, Kultivieren der transfizierten Wirtszellen unter Bedingungen, die zum Bewirken der Expression und Ruckgewinnen des Gemischs der erzeugten Mimotope geeignet sind; oder

2) um ein Panel zu erhalten, Plattieren der transfizierten Wirtszellen bei beschränkender Verdünnung, Kultivieren jedes resultierenden Klons unter Bedingungen, die zur Expression führen; und

Rückgewinnen der einzelnen erzeugten Mimotope;

wobei das Gemisch der Expressionsvektoren wahlfreie Nukleotidsequenzen von 9 bis 60 Nukleotiden umfaßt, beginnend mit einem ATG-Startcodon und operabel verknüpft mit Kontrollsequenzen zur Bewirkung der Expression.