JPH0772151A - 被分析物を特徴付ける方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 本発明では，単一の被分析物を特徴付ける方
法であって，該単一の被分析物と異なった度合の多様性
で反応する，抗体あるいはその免疫学的に反応性のフラ
グメントのパネルの各々と，該被分析物とを，接触させ
る工程；抗体あるいはフラグメントの各々に対する，該
被分析物の反応性の度合を検出する工程；該抗体あるい
はフラグメントの各々に対する，該被分析物の反応性の
度合を記録する工程；該記録された反応性の度合をまと
め，該被分析物の特徴的プロフィールを得る工程；を含
む方法が提供される。 【効果】 任意の被分析物を，既存の抗体のセットを用
いて特徴付けることが出来，かつ，任意の被分析物に対
する最適の抗体を，免疫操作無しに得ることが出来る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は一般的には免疫学的分析
法の使用に関する。特に，本発明は，免疫学的分析が通
常行われない物質の検出および定量に，このような方法
を使用することに関する。例えば，水中，土壌中，およ
び空気中に存在する極微量の汚染物質は，通常，高速液
体クロマトグラフィーにより検出されるが，本発明の方
法で製造される物質により簡便に検出され得る。

【０００２】

【従来の技術】医学および獣医学の分野で広範囲の生物
学的化合物を検出するために免疫学的分析法を利用する
ことは非常に普及しており，分析を行うための方法およ
びその変法がよく知られている。実際，最近では，構成
を再設計することにより分析法の簡便さを向上させるこ
とに多くの努力が払われている。例えば，粒子凝集法を
記載した，米国特許第4,427,781 号を参照されたい。こ
の方法は，所望の低分子量のハプテンに対する抗体が，
これらのハプテンが付着している粒子を凝集させる能力
に依存する。米国特許第4,447,526 号には，別の変法が
開示されており，分析されるべきハプテンが試薬へ特異
的に結合する場合に，ラベルの性質が変化するという利
点を有する分析法が記載されている。これらの開示内容
は，分析の簡便さまたは感度を高めるための特異的分析
法を記載した何百ものうちの２つにしかすぎない。これ
らの分析法は抗体分子（または抗体のフラグメント）と
検出されるべき分析物との間における特異的な相互作用
に依存している。

【０００３】この特異的な相互作用に依存しているため
に，いかなる特定の分析物に免疫に基づく分析法を適応
できるかは，要求される特異的な相互作用に対して適切
な抗体が得られる可能性に依存する。注意すべき２つの
局面がある。第１に，抗体およびそのフラグメントが，
分析物と，分析される試料中の不純物であり得る他の物
質とを区別する能力が適切でなければならない。すなわ
ち，特異性が高くなくてはならない。第２に，抗体また
はそのフラグメントが分析物に強く結合する能力も重要
である。すなわち，親和性が分析法の感度を決定する。
例えば，Davidの米国特許第4,376,110 号には，モノク
ローナル抗体を使用して，所望の相互作用の親和性を向
上させることが開示されている。

【０００４】検出のための候補である分析物は多数存在
し，それに対して特異的に強く結合できる抗体を標準的
なインビボ法で産生させることは困難である。よく知ら
れているように，特定の物質に対する抗体を得る通常の
方法は，この物質をラットまたはマウスのような適切な
分析物に投与すること，および適切な抗体を分泌し得る
Ｂ細胞を生産する分析物の免疫系に依存することを含
む。力価が充分に高ければ，ポリクローナル抗血清が分
析に直接使用されるために得られ，結果が充分に満足な
ものであるか，あるいは脾臓のようなＢ細胞源が所望の
抗体を分泌し得るハイブリドーマを得るために融合パー
トナーを提供するために使用されるかのいずれかであ
る。これらのハイブリドーマは所望の分析物に特異的な
抗体を生産するためにスクリーニングされ得る。物質が
免疫原性であるのに充分に大きく，抗体を産生する前に
動物を殺さなくてよいように充分に毒性がなく，この方
法を実施するのに充分な量が得られるように充分に費用
がかからなければ，これらの方法は良好に行える。この
ことは，常にそうであるとは限らない。

【０００５】大きさが不充分であるという問題は，分析
物またはそれらを修飾した形態のものを担体と複合化さ
せることにより，しばしば解決され得る。担体は，小さ
すぎるので免疫系に無視されるものに，免疫原性を与え
るために必要な大きさを与える。現在では，このより便
利な方法を使用することにより，この範疇に属するある
種の特異的分子に対する抗体を産生することが可能であ
る。例えば，米国特許第4,456,691 号では，ポリ塩化ビ
フェニル（PCB ）を化学的に修飾し，それを担体に複合
化させることにより，PCB と反応する抗体を調製する方
法を開示している。除草剤のアトラジンについて類似し
た方法が米国特許第4,530,786 号に記載されている。し
かし，このような方法は繁雑であり，各分析物に対して
再設計されなければならない。また，複合体により産生
される抗体は，実際に，分析物に作用しないかもしれ
ず，むしろ分析物と担体との接合部分に作用するかもし
れないので，成功するとは限らない。この方法により，
「中和」抗体（すなわち，分析物自体と反応する抗体）
を得ることは，著しく困難である。

【０００６】もちろん，毒性の問題が充分に重大で，方
法全体を失敗に終らせるかどうかも，偶然の問題であ
る。必要とされる抗原量の利用度に関して，このパラメ
ーターを最小にするための必要生は，特定の抗原に依存
する。

【０００７】治療の分野においても，類似の問題が発生
する。まだ開発段階ではあるが，治療および／または診
断のために，分析物自身の腫瘍と免疫特異的な，標識ま
たは毒素と複合体を形成した，あるいは形成していない
モノクローナル抗体を投与する治療法が，ある程度は良
好な結果を与えてきた。この分野で有用なモノクローナ
ル抗体を得るためのある方法は，腫瘍組織を取り出し，
この組織を免疫原として使用し，そしてKohlerおよびMi
lsteinの方法と，適切なスクリーニング法とを用いて，
誘導されたモノクローナル抗体を調製して選び出す方法
である。明らかに，これは繁雑な方法である。というの
は，モノクローナル抗体パネルを構築するのに充分な免
疫処置を実施するには，数ヵ月が必要であるからであ
る。その時までに，被検体の病状が救済できないぐらい
に悪化し得るし，または腫瘍の抗原性のプロフィールが
実質的に変化し得る。適切な抗体が，既存の大きいパネ
ルから選択し得るならば，これらの困難を克服し得る。
腫瘍を治療するのに適切なパネルは，すでに存在する
（Oldham, R.K., J Biol Resp Mod(1987)６：227-23
4）。さらに大きなパネルはまた，組換えDNA 技術を使
用して調製され得る。適切な相手を得るためにこのパネ
ルをスクリーニングする方法は，治療のための正しい抗
体を選択するのに有用である。

【０００８】この後者の応用は，次のような事実を表し
ている。つまり，当該技術分野では，すべての可能な抗
原に対して有効であり，かつ繰り返すことができる一般
的な手法を使用して，任意の抗原に関して所望の親和性
および特異性を有する抗体を得るための一般的な方法
が，提供されないということである。

【０００９】しかし，逆の問題，すなわち所定の抗体に
対するミモトープを見い出すことが，Geysen, H.M., PC
T出願WO86/00991（1986年２月13日付で公開）により提
出されている。以下で使用される「ミモトープ」という
用語は，Geysenの出願におけるこの用語の使用法にほぼ
対応している。

【００１０】

【発明の要旨】本発明は，任意の所望分析物（以前は免
疫分析を実施し得なかった分析物を含む）に対する免疫
学的試薬を製造して，所望の標的を反応させるために既
存のセットから適切な抗体を選択する方法を提供する。
本発明の方法の様々な局面はすべて，原則としては，イ
ンビトロで行なわれる。しかし，場合によっては，イン
ビボでの免疫グロブリン体細胞多様化系（immunoglobul
in somatic diversification system ）を利用すると，
より便利であり得る。

【００１１】本発明はまた，様々な特異性を有する抗体
のパネルに対する反応性の特異的なパターンを利用する
ことにより，特定の分析物のプロフィールを表す方法を
提供する。本発明は，ミモトープの多様なセットと，分
析物との間の競合を使用した競合結合分析により，この
ようなプロフィールを確立する新規な方法を提供する。
それにより，本発明は，所望の分析物に対するミモトー
プを得るための新規な方法を提供する。これらのミモト
ープは，分析物と免疫反応する抗体の増大した特異性お
よび親和性を得る際に有用であり，そして競合分析用の
試薬としても有用である。本発明はまた，リバースイメ
ージモノクローナル抗体パネル（reverse image monocl
onalantibody panel）に対する標的をスクリーニングす
ることにより，所望の標的に対して高い特異性を有する
抗体を選択する方法を提供する。このように，ある局面
では，本発明は，所望の分析物と反応する抗体を得る方
法に関する。この方法は，無秩序に発生し，永久増殖化
された抗体産生細胞のパネルを，分析物と競合する代表
的なミモトープの混合物と反応させること；および，こ
の分析物が充分に競合するような抗体を産生する細胞を
取り出すことを包含する。ミモトープパネルは，無秩序
（random）から最大多様性(maximally diverse) に変化
し得る；ミモトープの最大多様性パネルは，わずかなメ
ンバーしか必要とせず，それゆえ有利である。適切な抗
体または抗体のセットが同定されているだけでなく，そ
のような抗体の連続した供給源が提供されることは，直
ちに理解される。このようにして得られた抗体は，この
時点で，所望の試薬を供給するのに充分に特異的であ
り，かつ充分に強く結合している。このことは，高濃度
の既知成分を定常的にモニターすることが意図された応
用であるような分野では，特に正しい。しかしそうでは
ない場合には，本発明はこれらの性質を最適にする別の
方法を提供する。

【００１２】第２の局面では，本発明は，所望の分析物
に対するミモトープを得る方法を提供する。この方法
は，上記の手法を実施すること；および選択された細胞
によって分泌される抗体の反応性について，ミモトープ
（一般的には，最初の混合物に含まれていたミモトー
プ）のパネルをスクリーニングすること包含する。選択
された抗体と反応するミモトープは，このように，ある
種の免疫グロブリンと結合することに関しては，分析物
と同様に挙動するが，毒性またはＴ細胞認識に関して
は，必らずしもそうではない。それゆえに，分析物と反
応するポリクローナル抗血清は，ミモトープを代用の免
疫原として投与することにより得ることができる。

【００１３】この可能性から本発明の第３の局面が導か
れる。すなわち，最初に得られた抗体の親和性および特
異性を向上させる方法である。ミモトープは分析物に対
する代用免疫原を与えるので，ミモトープは，ラット，
マウスまたはヒツジのような動物を免疫し，そして，従
来の永久増殖化法およびスクリーニング法を用いて，所
望の特異性を有する抗体を得るために使用され得る。後
者のインビボ法は，得られたＢ細胞のレパートリーを永
久増殖化してスクリーニングする方法に関しては従来の
ものであるが，ミモトープを使用するという点でユニー
クである。ミモトープが分析物の代用となる能力は，化
学的構造よりむしろ，相同性の機能試験により定義され
る。これらのミモトープは，分析物を免疫し，得られた
パネルをスクリーニングするのに使用される。分析物自
体は，これらの方法のいずれにも使用される必要はな
い。

【００１４】本発明はまた，上記の方法を実施するのに
有用なキットにも関する。

【００１５】簡単に言えば，本発明の一部をなす様々な
方法は，スクリーニング法に単一のミモトープまたは単
一の抗体を使用することとして説明してきた。しかし，
複数の成功する候補を表わすパネルのサブセットを利用
することも，本発明に含まれ，ある種の抗体あるいはあ
る種のミモトープを使用する方法の改良となる。この変
法では，永久増殖化された抗体産生細胞の最初のグルー
プから，単一の抗体を産生するものを選択する代わり
に，例えば，約10または15個のこのような細胞のサブセ
ットを使用する。このセットから産生される抗体は，次
いで，ミモトープのパネルをスクリーニングするための
混合物として使用され，そして再び，単一の最も反応性
を有するミモトープを選択する代わりに，例えば，10ま
たは15個のミモトープのサブセットが選択される。この
混合物は，次いで，免疫処置法に使用され，免疫された
生物は好ましいミモトープのグループに共通する特徴に
応答するＢ細胞を特異的に増殖させる。免疫された動物
のＢ細胞抗体分泌細胞を永久増殖化させることによって
得られたモノクローナルパネルは，ミモトープのサブセ
ットプールと抗原との間で競合を起こさせるととにより
再びスクリーニングされ得，そして最も成功したものが
選択される。

【００１６】分析物と非常に特異的にかつ強く結合する
単一の抗体を提供することに加え，スクリーニングは，
さらにサブセットを提供する。分析物に関するサブセッ
トの反応性パターンは保存され，特定の目的分析物の存
在を，不完全に交叉反応する同種のものと区別されるよ
うに特徴付けるのに利用され得る。

【００１７】この概念のある応用においては，例えば，
25〜75個の抗体の扱いやすいパネルが使用され得る。こ
のようなパネルのプロフィールは，従来の免疫分析法に
より形成され，あるいは標識も修飾されていない分析物
と，標識されたミモトープ混合物との競合分析により有
利に形成され得る。パネルは分析物の同定に使用される
か，あるいは特定の分析物との反応性により形成された
パターンの大きさを分析物の濃度の関数としてモニター
するために繰り返し使用され得る。

【００１８】このように，本発明の他の局面は，１つま
たはいくつかの無秩序パネルから選択された限られた抗
体パネルに関する特異的な分析物の反応性パターンを利
用することに関する。この局面では，本発明は，所望の
分析物に対して様々な反応性を有する抗体のパネルに関
する。また，必要に応じて，本発明は標識されたミモト
ープ混合物に関する。このミモトープ混合物は，それと
競合する分析物と，パネル上の各抗体との様々な反応性
レベルを確認するのに有用である。所望のプロフィール
を形成することを容易にするために，固体支持体上のパ
ネルを提供する新規な方法もまた本発明に含まれる。

【００１９】本発明のさらに他の局面では，モノクロー
ナル抗体の相補的なセットを形成するために，ミモトー
プの最大多様性セットが利用される。このモノクローナ
ル抗体の相補的なセットは，ミモトープのインパースイ
メージを構成する。これら２つの参照セット（一方はミ
モトープのセットであり，他方は抗体のセットである）
の間の厳密な相補性は，指標化システムを提供する点
で，さらに有用である。この指標化システムにより，交
叉反応を起こす可能性がある抗体の大きなコレクション
に対して，少量の分析物が間接的に試験される。このよ
うな予備選択法が低コストであり，かつ敏速に行えるこ
とは，例えば患者に特異的な腫瘍抗原に対する抗体を探
索するのに，しばしば有益である。本発明はまた，ミモ
トープの最大多様化セットを特定する方法に関し，そし
てこのように特定されたセットに関する。

【００２０】本発明では，単一の被分析物を特徴付ける
方法であって，該単一の被分析物と異なった度合の多様
性で反応する，抗体あるいはその免疫学的に反応性のフ
ラグメントのパネルの各々と，該被分析物とを，接触さ
せる工程；抗体あるいはフラグメントの各々に対する，
該被分析物の反応性の度合を検出する工程；該抗体ある
いはフラグメントの各々に対する，該被分析物の反応性
の度合を記録する工程；該記録された反応性の度合をま
とめ，該被分析物の特徴的プロフィールを得る工程；を
含む方法が提供される。この検出する工程は，パネル中
の抗体あるいはフラグメントの各々にほぼ等しい反応性
を示す標識した多様なミモトープの混合物と，前記抗体
あるいはフラグメントとに対して，非標識の被分析物を
競合的に反応させること，および，パネル中の抗体ある
いはフラグメントの各々に対する，該標識した混合物の
結合の減少を測定すること，で行われるのが好ましい。

【００２１】また，反応する既知のリガンドを有する標
的物質と有効に結合し得る候補物質を同定確認する方法
であって，該候補物質と異なった度合の多様性で反応す
る，抗体あるいはその免疫学的に反応性のフラグメント
のパネルの各々を，該候補物質と接触させる工程；抗体
あるいはフラグメントの各々に対する，該候補物質の反
応性の度合を検出する工程；該抗体あるいはフラグメン
トの各々に対する，該候補物質の反応性の度合を記録す
る工程；該記録された反応性の度合をまとめ，該候補物
質の特徴的プロフィールを得る工程；および，該リガン
ドと該多様な抗体あるいはそのフラグメントとから得ら
れた同様のプロフィールと，該特徴的プロフィールと，
を比較する工程，ここで，該候補物質のプロフィールと
該リガンドのプロフィールとの類似度が，該候補物質の
該標的物質に対する結合能力を示す；を含む方法がてい
きょうされる。この検出する工程は，抗体あるいはフラ
グメントの各々にほぼ等しい反応性を示す標識した多様
なミモトープの混合物と，抗体あるいはフラグメントの
各々とに対して，非標識の候補物質を競合的に反応させ
ること，および，抗体あるいはフラグメントの各々に対
する，該標識した混合物の結合の減少を測定すること，
で行われるのが好ましい。

【００２２】さらに，既知の標的物質と特異的に反応す
る候補物質のパネルから，１つの候補物質を選択する方
法であって，該標的物質あるいは該パネルの何れかの内
の１つが抗体からなり，最大限に多様なミモトープのパ
ネルに対する，該標的物質の反応性のプロフィールを得
る工程；各抗体が該ミモトープの１つにパネル中の他の
ミモトープよりも少なくとも20倍大きい結合定数で結合
する，該最大限に多様なミモトープのパネルのインバー
スイメージである，抗体のパネルを得る工程；該インバ
ースイメージの抗体パネルに対する，該候補物質の反応
性のプロフィールを得る工程；および，該ミモトープの
パネルに対する，該標的物質の反応性のプロフィール
と，インバースイメージのパネルに対する，該候補物質
の反応性のプロフィールと，を比較する工程，そして，
ここで，該インバースイメージのパネルのプロフィール
と，該ミモトープパネルのプロフィールの類似度が，標
的物質に対する候補物質の結合能力を示す；を包む方法
が提供される。このインバースイメージの抗体パネルに
対する，前記候補物質の反応性のプロフィールを得る工
程が，該候補物質と異なった度合の多様性で反応する多
様な抗体のパネルの各々と，該候補物質を接触させるこ
と；該抗体の各々に対する該候補物質の反応性の度合を
検出すること；該抗体の各々に対する該候補物質の反応
性の度合を記録すること；および，該記録された反応性
の度合をまとめ，該候補物質の特徴的プロフィールを得
ること；で行われるのが好ましい。また，検出する工程
は，抗体の各々にほぼ等しい反応性を示す標識した多様
なミモトープの混合物と，各抗体とに対して，非標識の
候補物質を競合的に反応させること，および，抗体の各
々に対する，該標識した混合物の結合の減少を測定する
こと，で行われるのが好ましい。

【００２３】さらに，被分析物と少なくとも３種類の異
なった度合で反応する多様な免疫グロブリンのパネル
を，規則的な配列で結合した固体支持体を含み，該差異
が，被分析物の特徴的なプロフィールを与える，被分析
物を検出するためのキットが提供される。このキット
は，前記被分析物と競合的で，かつ，各抗体とほぼ等し
い反応性を有する，標識したミモトープの多様な混合物
をさらに含むのが好ましい。

【００２４】さらに，目的の被分析物と反応性の抗体を
同定確認する方法であって，a) 哺乳類の休止Ｂ細胞の
レパートリーを代表する抗体を分泌する永久増殖性細胞
の個々のコロニーを複数含むパネルを，該被分析物との
競合下で，各メンバーが３次元的な電荷構造と空間的構
造の多様なセットを代表するミモトープの混合物と反応
させる工程；および，b) 被分析物が該ミモトープ混合
物とうまく競合する抗体を産生する，少なくとも１つの
コロニーからなるより小さな亜集合パネルを，該パネル
から同定確認する工程；を含む，方法が提供される。

【００２５】さらに，代表的なミモトープの混合物を得
る方法であって，a) 9-60ヌクレオチドのランダムなヌ
クレオチド配列を含む，多様なDNAフラグメントのセッ
トを調製する工程；b) ATG開始コドンを有し，リーデ
ィングフレームにペプチドをコードした別のDNAに，a)
のランダムなDNAフラグメントを，連結する工程；c)b)
のDNAを，宿主の発現ベクター中の制御配列と，機能し
得る様に結合することで，融合タンパク質をコードする
遺伝子を含み，N-末端あるいはC-末端の配列が保持され
た，発現ベクターのセットを得る工程；d) c)のベクタ
ーのセットを，適切な宿主にトランスフェクトする工
程；および，e) 発現を誘起するのに適した条件下で，
該トランスフェクトした宿主細胞を培養する工程；を含
む，方法が提供される。また，このトランスフェクトし
た宿主細胞を，限界希釈でプレーティングする工程を含
む，ミモトープのパネルを調製する方法が提供される。

【００２６】

【発明の構成】

Ａ．定義 ここで使用されているように，「ミモトープ」(mimotop
e)は，所望の抗原あるいは分析物と免疫特異的に結合す
る抗体の抗原結合領域に対して相補性を有する分子の部
分を意味する。すなわち，一般的には，分析物のエピト
ープに対応する領域を意味するミモトープは，一般的に
は，エピトープが示す空間的構造および電荷構造と正確
に同じものを有さない。しかし，ミモトープがまた，そ
れを有する分子を所望の抗原結合抗体に特異的に結合さ
せるのであれば，この定義が満足されるミモトープは短
いペプチド配列であるのが便利である。というのは，非
常に様々なペプチドが容易に合成され得るからである。
しかし，このことは理論的根拠に必要ではない。例え
ば，糖質または界面活性剤もまた，この定義を満足する
ように挙動する。このようなミモトープの無秩序パネル
(random panel)および多様性パネル(diverse panel) の
いずれもを得ない手段が，これらの分子に関連する現在
の利用可能な合成技術に含まれることは容易に理解され
る。もちろん，これらの化学的タイプの各ミモトープは
構築され得る。

【００２７】典型的には，抗体との反応性を有するエピ
トープは，大きな分子の内部に存在する。例えば，ペプ
チドの場合，この分子の部分はペプチド鎖の伸長部分で
あり得るか，あるいは同時にペプチドはある種の他の物
質と複合体を形成し得る。場合によっては，分子の付加
的な部分が特定の機能を果すこともある。ミモトープが
免疫原として使用されるべき場合には，付加的な大きさ
が必要とされる。というのは，たいていのミモトープ領
域は３〜６個のアミノ酸からなる比較的短いアミノ酸配
列によって表現されるからである。他方，ミモトープは
標識可能な物質と複合体を形成し得る。標識は，蛍光体
と複合体を形成する場合または放射標識された物質を隔
離(sequestering) する場合のように直接的であり得る
し，また，例えば，アビジンが標識を有するビオチン／
アビジン結合のビオチンと複合体を形成する場合のよう
に，標識された物質を引き続いて特異的結合により付着
させ得る。いずれにしても，ミモトープ自体は，しばし
ば付加的な分子構造の内部に見い出される。ミモトープ
という用語は抗体結合の原因となる領域に関連するもの
として定義されるが，この用語は，しばしば複合体を記
述するために互換的に使用される。ある特定の場合に，
複合体全体について言及されているのか，あるいは結合
特異的領域について言及されているかは文脈より明らか
である。

【００２８】「抗体フラグメント」は，抗体全体の特異
的結合性を保持している抗体のフラグメントを意味す
る。当該技術分野では，例えばF(ab')₂ ，Fab ，および
Fab'のような特定のフラグメントがよく知られている。
これらのフラグメントは様々なプロテアーゼの消化によ
り得られる。もちろん，組換えにより調製される場合に
は，抗原認識特性を保持している任意のフラグメントを
同様にして得ることができる。これらのフラグメント
は，抗体全体ほど免疫原性が高くないので，しばしばイ
ンビボで有用である。抗体に代えてフラグメントを使用
し，同様に特異的結合させる際に，いくつかの利点があ
るようである。特に断わらない限り，インビボあるいは
インビトロでの分析において，抗体について言及されて
いる場合には，免疫特異的フラグメントもまた使用され
得ることを理解すべきである。

【００２９】「無秩序に刺激された抗体産生細胞」は，
例えば培地に細菌性リポ多糖類（LPS ）を加えることに
よって非特異的に刺激され，永久増殖化された抗体分泌
細胞を意味する。このようにして得られた個々の哺乳類
の一般的なＢ細胞集団の標本抽出には，中程度の親和性
ではあるが，可能性のあるいかなる抗原とも特異的に反
応できる抗体を生産する細胞が含まれることが知られて
いる。

【００３０】「無秩序な構造を有するミモトープ」は，
様々な空間的構造および電荷構造を有する表面領域を含
むミモトープを意味する。以下に述べるように，このよ
うな任意の混合物は，アミノ酸配列からなるペプチドを
調製することにより得られる。個々の位置にあるアミノ
酸が数の候補の中から任意に選ばれるようなしかし，潜
在的なエピトープに対応する種々様々な表面領域を有す
る分子のあらゆる混合物が含まれる。

【００３１】「最大の多様性を有するミモトープ」は様
々な特性が最大の多様性を示す代表的な性質を有するパ
ネルを形成するように慎重に操作されるミモトープのセ
ットを意味する多様性パネルを構築する際に考慮される
適切な性質は次のものを含むが，必らずしもこれらに限
定されない：等電点（pI），疎水性指数（hi），疎水性
モーメント（hm），双極子モーメント（dm）および「平
滑度」。ミモトープパネルのメンバー間で，これらの性
質を多様化させることにより，ペプチドを無秩序に選択
して同等の多様性が得られるパネルに比べて，パネル中
のミモトープ数を劇的に減少させることができる。

【００３２】与えられたパラメーターのセットに関して
「最大の多様性を有する」ペプチドの混合物は各パラメ
ーターの全範囲にわたってメンバーが広がっている混合
物を意味し，この混合物のメンバーはその範囲内に均一
に位置する。様々なパラメーターの尺度の適切な規格化
は，多様性をもたらす方法を容易にする。例えば，疎水
性指数に関してメンバーが最大の多様性を示すペプチド
の混合物は，疎水性指数の全範囲内に見い出される混合
物であり，この混合物中の２個のメンバーが他の選択さ
れた任意の対よりも疎水性指数が互いにかなり接近して
いることはない。完全な最大の多様性を得ることは困難
であるで，この用語は特定のパラメーターについて最も
大きな多様性が得られる混合物に適用される。このよう
に，疎水性指数（hi）およびpIに関して最大の多様性を
有する混合物においては，類似pIを有するすべてのペプ
チドは疎水性指数に関して変化し，類似したhiを有する
すべてのペプチドはpIに関して変化する。

【００３３】「インバースイメージパネルまたはリバー
スイメージパネルあるいはその組合せ」は，抗原／抗体
間の相互作用のうちエピトープ／パラトープ間の相互作
用の電荷／空間的な相補性を意味する。このように，各
メンバーがミモトープパネルの他のメンバーに比べてミ
モトープパネルの単一メンバーに対して高い特異性を有
するようなモノクローナル抗体のパネルは，対応するミ
モトープパネルのリバースイメージを有するパネルとな
る。このようなリバースイメージは，例えば50個のメン
バーからなるパネルの各ミモトープに対して，特定のミ
モトープに対する高い親和性を有しているが，残りの49
個のいずれのミモトープともほとんど結合しないような
抗体が見い出され得ると考えられる。このようなパネル
は最大の多様性を有するミモトープのセットに対して最
も簡便に調製される。

【００３４】上で述べたように，インバースイメージパ
ネルは，例えば競合分析に使用して分析物または抗体の
いずれかを特徴付け得る。好ましくは，インバースイメ
ージパネルのメンバーは，実用的なセットを構成するよ
うに充分に少数ではあるが，意味するパターンを与える
のに充分に多数であるべきである。それゆえ，このよう
なパネルは，典型的には，10〜 100個のメンバーを含
み，好ましくは約40〜50個のメンバーを含む。モノクロ
ーナル抗体インバースイメージパネルに対する分析物の
反応性あるいはミモトープパネルに対する抗体の反応性
は，以下で述べるように，様々な方法を使用して評価さ
れ得る。

【００３５】Ｂ．一般説明 本発明は，免疫検定法に用いる所望の分析材料を得る方
法と，得られた材料に関する。その方法のいくつかの局
面には，多数のランダムに生成した抗体産生細胞および
多数の潜在的ミモトープの使用が含まれる。

【００３６】本発明の方法が進行するにつれて，特定の
パネルもしくはサブセット内の抗体とミモトープの数が
著しく減少する。得られた，分析に使用する材料は，高
度に特異的で，強い結合性のミモトープと抗体とを含有
し，あるいは，この材料は，さらに分析物に対して特徴
的な反応パターンを示す，これら材料のパネルであり得
る。得られた抗体のパネルは，目的とする分析法に対し
て，ますます特徴的かつ特異的になる。

【００３７】要約すれば，この方法は，特定の選択され
た分析物に対応する物質を産生する出発点の働きをす
る，永久増殖化モノクローナル抗体産生細胞のパネルの
生成によって開始される。反復してスクリーニングする
ために，このパネルは例えば10,000程度の処理し易い数
に制限することが好ましい。潜在的分析物の数は数百万
であるから，特異性が犠牲になるとしても，最初のパネ
ルは適切な範囲をもっているであろう。経験によれば，
パネルの数が，例えば 300〜 500のように非常に少なく
ても，初期のプロフィールに対する特異性をそれほど大
きく犠牲にしない。広い特異性は，ランダムに刺激され
たＢ細胞の固有の性質である。これらのクローンは主と
してIgM 免疫グロブリンを産生する。組換えにより産生
された免疫グロブリンのセットも使用することができ
る。

【００３８】所望の分析物のレパートリーに適確に適合
させるのに必要な，可能性のあるパラトープを何百万も
産生してスクリーニングすることが容易に実施できれ
ば，上記のことは直接に行うことができる。しかしこれ
は実際的ではない。したがって，本発明のシステムは，
スクリーニング法を実際的な選択範囲に集中させる方法
を提供する。

【００３９】本発明を最も簡単な形態で実施する場合で
は，必要な特異性に最も近い基礎パネル抗体が，ランダ
ムに生成したセットからミモトープを選択するのに利用
され，そのセットは，やはり妥当な数のメンバーを含有
していなければならないので，何百万もの利用しうる分
析物の構造の各々に完全に忠実であることはできない。
それ故に，広い範囲を持った候補ミモトープのパネルが
用いられ，最適な選択物が選ばれる。この“ブートスト
ラップ" 段階をすぎてから，本発明の方法は，その抗体
／ミモトープ結合反応における第１のパートナーを，次
いで他方のパートナーを体系的に最適化することを包含
する。最適化の基準は，分析物を検出する性能によって
機能的に定義される。

【００４０】初期のミモトープが選択されたならば，抗
原に応答して通常活性化される，動物の免疫系の体細胞
の多様化プロセスを刺激する際に，ミモトープが分析物
に代わり得る。この免疫化に応答して産生されるモノク
ローナル抗体のパネルは，次にミモトープもしくはミモ
トープの混合物と競合する分析物を用いるか，または分
析物を直接用いてスクリーニングして，最適な候補を選
択することができる。その抗体は，主としてIgG 形であ
るが，その基礎レパートリー前駆体より多様であること
は知られている。充分に試験された場合，いくつかは免
疫原に対して高い親和性を示し，いくつかは免疫原に対
して低い親和性を示す。ミモトープが有効な代替抗原で
ある範囲では，多様化されたクローンは，分析物自体に
対して高い親和性を有するメンバーを含む。あるいは，
抗体クローンは，免疫グロブリンをコードするDNA の部
位特異的変異導入法により，インビトロでランダム化す
ることができる。

【００４１】この改良法が不充分な場合は，改良抗体が
ミモトープパネルをスクリーニングするのに使用可能で
あり，その結果，恐らく先に利用したミモトープと異な
るミモトープが選択され，それは分析物に最も密接にマ
ッチするものである。この第２の選択されたミモトープ
は，インビボで発生するＢ細胞が分泌する，スクリーニ
ングされるべきモノクローナルの第２パネルを得るため
に第２免疫化を行うのに利用できる。この方法はさらに
繰返すことができる。

【００４２】この方法のさらに簡潔で有効な形態では，
各段階で選択された単一のミモトープまたは抗体が，分
析物に対して機能的に相同な共通の特徴を有するサブセ
ットに置き換えられる。これは好ましいことである。な
ぜならば，特定の分析物は，その全表面の構造を再生す
るために重なっている多数のエピトープを持ち得，その
コレクションは，コレクションの個々の部分より有用に
全表面を模倣することができるからである。逆にいえ
ば，ミモトープは，表面の一部だけが分析物に相同な，
広い表面を持っていてもよい。多数のミモトープおよび
／または抗体を用いることによって，共通の特徴が強調
される。さらに，抗体のサブセットは，関連する分析物
によって生成するものとは異なる，単一分析物との相互
作用の，特徴的で再現性のあるパターンを提供するの
で，特異性は，個々の抗体自体の反応性によるというよ
りもむしろ前記パターン自体によって与えることができ
る。

【００４３】したがって，この改変された方法では，少
数の，例えば10もしくは15の元の抗体パネルが，ミモト
ープのパネルをスクリーニングするのに使用される。こ
のミモトープパネルによってさらに別のサブセット，例
えば10もしくは15のミモトープのサブセットが得られ，
これは免疫化に使用できる。このように，免疫化された
動物の免疫系は，共通の形態(features)に最も強く曝さ
れ，免疫化された動物から得られたモノクローナルのパ
ネルは，これらの共通の形態の方向に充分にそれる（Ch
ua, M.M., J.Immunol(1987)，138：，1281-1288 ）。さ
らに，免疫化された動物から得たパネルは，この場合ま
たは単一のミモトープだけが使用される場合を問わず，
パネル全体にわたる結合特異性のパターンを用いて，特
定分析物を認識するパネルの結合配列によって，有用な
サブセットパネルを提供する。

【００４４】本発明の方法に包含される各段階につい
て，以下に詳細に説明する。

【００４５】Ｃ．出発物質の製造 初期の抗体パネル 抗体産生細胞のランダムパネルはいくつもの方法で作製
することができる。マイトジェンで活性化されたＢ細胞
が，可能性のある抗原と潜在的に結合できる抗体のラン
ダムセットを産生するということは，ほとんど10年前か
ら知られていた。しかし，これらの刺激された細胞から
分泌される免疫グロブリンの大部分は,IgM であり, 親
和性と特異性が比較的低い。前記の処理しやすいレパー
トリーでは, 抗原に対する防御が必要であり得るため
に, 交差反応性が要求されるような何百万もの抗原のい
ずれに対してもあるレベルで結合するのに充分なようで
ある。

【００４６】リポ多糖類(LPS) のようなマイトジェンを
用いて, 細胞融合もしくはウイルス感染によって予め刺
激された多数のＢ細胞を永久増殖化させると, 広範な種
類の多数の抗体のほぼ永久的な起源になる。LPS で刺激
するとＢ細胞は一部分が分化を起こして良好な融合の参
加体になる。抗体の産生を刺激し，かような融合を実施
する方法は，例えば，Andersson J.ら, Current Topics
on Microbiol and Immunol (1978年),81巻, 130 〜138
頁; Andersson, J. ら, Proc Natl Acad SciUSA (198
1年) 78巻, 2497-2501 頁; Goldsby, R. A.ら, Current
Microbiol(1979年) ２巻，157-162 頁に開示されてい
る。融合以外のリンパ球を保存する別の方法がHoward,
M.ら, Proc Natl Accad Sci USA (1981年) 78巻, 5788-
5792 頁,に報告され, これらのハイブリドーマを抗原特
異性について選別することが, Parks, D. R.らProc Nat
l Acad Sci USA (1979年) 1962-1966 頁, に報告されて
いる。免疫原としてインビトロで用いられている抗原に
特異的な免疫グロブリンを分泌するハイブリドーマの製
造についても報告されている(Luben, R.A.ら, Molecula
r Immunol, (1980年) 17巻, 635-639 頁) 。

【００４７】数をより処理しやすい数にするために, 大
きなランダムパネルを一般的に使用する改変では, 最高
の候補に対するパネルを狭くする予備選別が行われる。
例えば, Casali, P.ら, Science(1986年) 234巻, 476-4
79頁には, 標識を付けた抗原と結合できるヒトリンパ球
を分離するのに，蛍光で活性化された細胞のソータを使
用することが記載されている。その時, 個々の細胞は,
回収することができ，エプスタイン・バー (Epstein-Ba
r)ウイルスで形質転換され，微細培地で増殖される。こ
のような予備選択は, 所望の分析物に有効に標識を付け
ることができる場合, 本発明の範囲内に含めることがで
きる。このような標識付け, 例えば分析物をフルオレセ
インに直接接合させることによって，またはフルオレセ
インで標識を付けたビオチンと結合しているアビジンの
ようなリンカー部分に接合することによって行えるなら
ば，Casaliが報告した方法 (本願に援用する) が, ミモ
トープパネルの次のスクリーニングを行う為の, 制限さ
れたメンバー, 例えば10〜50のメンバーのモノクローナ
ルのパネルを得るのに使用できる。選択された細胞の永
久増殖化は, エプスタイン・バーウイルスを使用する場
合は必ずしも必要ではないが, 標準の融合技術, または
Biotechnologies and Experimental Research Incorpor
ated(カリフォルニア州, サン・ディエゴ) が市販して
いるような，現在入手可能な有効な電気融合技術を使う
場合は必要である。

【００４８】ごく最近に, 組換え技術を用いて免疫グロ
ブリンを産生することが可能になった。それ故に, 抗体
産生細胞のランダムパネルを得る他の方法は, 免疫グロ
ブリンをコードするDNA をランダムに変異させ，その変
異体混合物を, コードされた変異免疫グロブリンを発現
可能な細胞にトランスフェクトする方法を包含する。免
疫グロブリンのタンパクを, イー・コリ (E.Coli) 内お
よび酵母内で発現させるのに成功した。酵母は, 生産さ
れたタンパクを免疫学的に活性な形に加工する。例え
ば, 酵母内での免疫グロブリンの合成と, インビボでの
組立ては，Wood,C. R. ら, Nature (1980年) 314巻, 44
6-448 頁, に報告されている。抗原と結合可能な“本来
の”および“二量体”の抗体断片のイー・コリ内での合
成も報告さ れている(Skerra, A., Science,(1988年)
240巻, 1038-1041頁; Butler, M.ら, 上記文献1041-104
3 頁) 。

【００４９】上記の方法のいずれかによって，永久増殖
化されたＢ細胞，または免疫グロブリンの発現系を有す
る組換え体宿主細胞のいずれかの細胞パネルが得られ
る。全くランダムのパネルを 用いる場合，約10,000の
メンバーのパネルが必要であり得る。少なくとも50,000
のメンバーのパネルは, より良好な代表的な面(cross-s
ection) を提供する。しかし最近の実験結果は, 少ない
数でもいくつかの目的に対しては満足し得る状態である
ことを示している。

【００５０】このような実験の結果を第２図から第５図
に示す。第２図は，実施例１に記載したようにして生成
し，短いペプチドのカシニン(kassinin)に対して定量的
にスクリーニングして“結合係数”（すなわちその結合
はバックグランドに対して補正して観察された）を測定
した, 335 のモノクローナル抗体の結合定数を示す。(
スクリーニングは市販されているBio-Rad ドット・ブロ
ット法の変形法で行った。第２図に示すように，335のM
ab のうちわずかに１つだけが3500〜4000の結合係数を
有し，２つの別のMab が約1500の結合係数を有し, また
約1000の結合係数を有する抗体もいくつかあるが, 大部
分は, この非常に単純な抗原に対する結合性が非常に低
い。

【００５１】第３図は，より複雑な抗原すなわち単純な
フィラメント状のファージF1に対して試験した同じ結果
を示す。この例では, 多数回ランダムに反復された少数
のエピトープによって，ほとんどすべてのパネルは, Ig
M の多価性によって多分結合が増大する場合に，抗原に
対してかなりの結合性を有する。

【００５２】第４図は，高度に複雑な抗原であるキーホ
ール・リンペット・ヘモシアニン(KLH) に対して同様な
アッセイを行った場合の結果を示す。この場合, さらに
多くのエピトープが存在し，その結果, 抗原に対してか
なりの親和性をもった多数の抗体が存在する。

【００５３】第２図，第３図および第４図に示す結果
は，第５図に要約され，第５図には，これらの３物質の
ネズミに対する基礎レパートリーの結合係数の分布をプ
ロットしている。図に示すように，カシニンに対して高
い結合性を有するモノクローナルの割合は非常に小さ
い。それにもかかわらず，たった335 Mab のパネルの中
には, かなりの親和性を示す少なくとも少数の抗体が見
出されている。

【００５４】これらの結果には, いくつもの重要な結果
が含まれている。第１に，抗原が，正しい複雑性を有
し，第２図の場合のように，パネル内の少数の抗体に確
実に分離する場合，基礎パネルは過度に大きい必要はな
い。第２に，高結合性Mab 自体のサブセットパネルが，
有用な分析器具になる。このパネルに対するカシニンの
“フィンガープリント”は，第２図に示すパターン由来
のものであるが，試験試料中のカシニンの濃度をモニタ
ーするのに有効に使用できる。カシニンの濃度の増減
は，２もしくは３の高い結合性の抗体への結合の内部的
にばらつきの少ない測定値によって示すことができる。

【００５５】モノクローナル抗体の基礎パネルをどのよ
うにして作製しても，これらの培養物は，マイクロタイ
タープレート内か，または分析物もしくはミモトープと
結合する性能について上清を容易に分析できる他の通常
の基質上で，増殖させることができる。本発明のひとつ
の態様はキットに関し，このキットは，本発明の方法に
おいてスクリーニングするための適切な基質上に支持さ
れた抗体産生細胞のこのパネルまたはこのあとで製造さ
れたパネルで構成されている。適切な形態のキットは，
マイクロタイタープレート；ニトロセルロース；シート
として利用できる，活性化された形態のナイロンなどの
ポリマー；およびフィルター紙の中に固化させたアガロ
ース誘導体を含む。

【００５６】初期のランダムパネルは，目的に対する特
異性と親和性とを犠牲にした抗体のコレクションを表す
と考えられるので，多数のメンバーが必要な場合，それ
は，広範囲の分析物の分析に有用な追加の物質を産生す
る手段としてよりも，特定の分析物の分析用にキットに
入れることはそれほど有用ではない。したがってこのパ
ネルは，試験キットとして包装されるよりも，生産もし
くはリサーチ用器具として，より適切に保持される。し
かし，これらの最初に製造された抗体のサブセットは，
特定の分析物に関して，特徴的な充分なパターンを産生
し，同様に試験用基質としても役に立つ。

【００５７】ミモトープ類 本発明の方法の最初の段階で必要なのは，ミモトープ類
の混合物であり，そのいくつかは，少なくとも満足すべ
き程度に，分析物の結合能力に似せることができる。公
知の三次元構造の抗原に対する合成のエピトープを提供
しようとする初期の試みは，例えばAtassi, M. Z. ら,
J Biochem (1977年) 252 巻, 8784-8787頁, に記載され
ている。

【００５８】上記のように，ミモトープ類の化学的性質
は，理論的な異議よりもむしろ簡単さの問題である。潜
在的なミモトープのセットを構築する２つの極端な方法
を採用することができる。一方の方法では，ランダムセ
ットが非常に多数のメンバーを持っている。ランダムで
広範囲の三次元の分子構造（molecular architecture)
の好適な起源は, ランダム配列の３〜６アミノ酸ペプチ
ド類の合成である。単に20個の正式にコードされたアミ
ノ酸を利用した場合, 20³ すなわち8000の可能性がある
トリペプチドが存在する。少なくとも500 個のトリペプ
チドの混合物が必要であり, 5000もしくは10,000が好ま
しい。実際に必要な数は, 残基の選択を最適化すること
によって最少にすることができる。例えばバリンの代わ
りにアラニンを用いることは物質的に異なるペプチドを
示さないが, チロシンの代わりにアラニンを用いると大
きな問題になる。勿論, 3-アミノ酸配列に対する理論的
に可能なミモトープの数は, 合成ペプチド法を用いる場
合, アミノ酸の候補の数を２倍にすることによって少な
くとも８倍にすることができる。これは，配列に入れる
候補として修飾した側鎖を有する追加の20個のアミノ酸
を含めるか, またはそのD-異性体を含ませることによっ
て実施できる。この場合, 40³ の可能なトリペプチドが
得られる。多数のミモトープ構造を提供するひとつの方
法が, Geysen, H. M. の国際特許公開第Ｗ06/00991号
(前出) に記載されているが, この文献には, 固相合成
用の多数の支持体上での連鎖延長工程に多数の残基を導
入することによっ て多数のペプチドが同時に得られる
ことが記載されている。またGeysenは, ミモトープ構築
の出発点として全体で400 個の可能性のある“天然の”
ジペプチドに対する抗体の試験について記載している。
利用しうるペプチドの数は，ペプチド連鎖がエピトープ
の大きさの領域（６個のアミノ酸まで）を超えて増大す
ると，もちろんそれにしたがって増大する。

【００５９】さらに，ランダムに構築するが必ずしもそ
れほど多様でない場合，多数のミモトープのパネルが，
天然に見出されるタンパク混合物を激しく加水分解する
ことによって得ることができる。例えば，酵母エキス
は，トリプシン，キモトリプシン，コラゲナーゼ，キモ
シン，エンテロキナーゼなどのようなプロテアーゼの混
合物で加水分解するか，またはこれらで順に処理して加
水分解することができる。生成物は多数の小分子量のタ
ンパクであり，これらのタンパクは所望により，SDS ゲ
ル上で, 例えばBolton-Hunter の¹²⁵I法を用いて標識を
付けて分離することができる。これらの個々のSDS バン
ドは, ウエスタンブロット紙に転写させて個々のミモト
ープのパネルを得ることができることが示されている。
未標識の転写されたミモトープ, またはミモトープが候
補抗体に結合される場合に次の標識づけに競合した方法
で標識をつけたミモトープは, 候補ミモトープを, 基礎
レパートリーの予め選択されたメンバーについて同定す
る手段として用いることができる。

【００６０】１セットのミモトープを構築する別の好ま
しい方法は，最大限に多様なセットを構築する方法であ
る。このセットによって，残基の選択を改良されたレベ
ルに最適化することによる，上記の数の最少化を達成す
ることができる。概念的に，ペプチドのようなミモトー
プの多様なセットの構築は，ある定義された性質が，全
範囲にわたって組織的に変動するペプチドを設計するこ
とによって行われる。考慮すべき適切な性質は，ペプチ
ドの全体の電荷，全体の疎水性，その疎水性モーメン
ト，その形態の一般的な特性（すなわち滑らかか, もし
くは凹凸がある）および電荷の分布である。ペプチド
が，ミモトープの最も簡便な例として用いられる場合，
これらの特性は，利用されるアミノ酸の公知の特性と，
タンパクのＸ線結晶分析法由来のデータとを用いて，そ
のアミノ酸配列から予測することができる。

【００６１】さらに，ペプチドの三次元構造は熱撹拌で
変動するので，所望の形態を安定化する手段を利用する
ことが有用である。ペプチド類の形態を限定する方法
は，当該技術の分野で公知である（例えば，Weber, D.
F.ら, Nature (1981年) 292巻,55-58 頁; Friedinger,
R. M. ら, Science (1980年) 210巻, 656-658 頁, 参
照) 。

【００６２】6-mersのパネルを得るこの方法の１態様を
例示すれば以下の通りである。電子雲のパターンを決定
するパラメータは，候補によって広く変動するはずであ
る。例えば製造された候補のペプチドは，疎水性指数
が，パネルを横切って着実に増加するように選択されな
ければならない。構造に関連する疎水性指数の考察は，
Janin, J., Nature(1979年) 277巻, 491-492 頁に記載
されている。その上, タンパクの両親媒性は, 残基の周
期的な疎水性を調節することによって変動させることが
できる(Eisenberg, D.ら Proc Natl Acad Sci USA (198
4年) 81巻, 140-144頁; Eisenberg, D. ら Nature (19
82年) 299 巻 371-374頁) 。この両親媒性は, ペプチド
の二次または三次のコンホーメーションによってきま
り，分子の一部分もしくは面が水溶性で, 残りの部分が
疎水性であることによる。さらに, 正もしくは負に帯電
したアミノ酸残基が存在することによる電荷のパターン
は, 候補のパネルで組織的に変えることができる。

【００６３】最初の候補パネルは，これらのパラメータ
が多様であるが, 市販されているミクロタイタープレー
トとタンパク合成装置のロッド(Cambridge Research Bi
ochemicals) の設計を反映して, 簡便にするために, 約
90〜100 のペプチドで構成することができる。これは,
所望のミモトープの特徴を組み立てるのに充分な数であ
る。合成は, 通常の, 一般に商業的に入手できる方法を
用いて実施され，次に個々の候補のミモトープのパネル
をスクリーニングのために用意する。

【００６４】より完全な多様化は, アミノ酸の追加の性
能を用いて行うことができる。このより多様なパネルを
構築する際には, 文献で知られている個々のアミノ酸の
性質を利用する。以下の第１表は，20のコードされたア
ミノ酸のうちの19の性質を編集したものである。システ
インはこの表すなわちこのセットに含めなかった。とい
うのは, 標識, 担体, 固体支持体などのような付加部分
に接合させるためこの残基を用いることが好都合だから
である。

【００６５】

【表１】

【００６６】第１表のパラメータから，セットにわたっ
て変え得る５つのパラメータを得ることができる。これ
らのパラメータは以下のとおりである。

【００６７】1)疎水性指数(hi)は, アミノ酸成分の個々
の疎水性指数の, ペプチド内のアミノ酸についての合計
である。これは，ｎ個のアミノ酸からなるペプチドにつ
いて下記式で表すことができる。

【００６８】

【数１】

【００６９】2)等電点 (すなわちpI) は, イオン化可能
な基のpka の平均値で近似することができる。

【００７０】第３，第４および第５のパラメータは，コ
ンホーメーションに依存し，疎水性モーメント(hm), 双
極子モーメント(dm)および“波形因子”(corrugation f
actor) (cf) として標識をつけることができ，cfは平滑
性を評価する。これらのパラメータは, 類似の方法で計
算することができ, それぞれの場合について, 適切な性
能関数, すなわち周期δの周期性の要素の強度 (但しδ
はα−ヘリックス(100°) もしくはβ−シート(170°)
と一致すると定義する) のフーリエ変換のモジュラスで
ある。正しいδ値の指定は, そのペプチドによって通常
考えられるコンホーメーションか, またはペプチドの設
計者によって制御されるコンホーメーションによって決
まる。

【００７１】しかし，得られたパラメータのセットのメ
ンバーの間の一般的な関係は, コンホーメーションにつ
いてなされた仮定にかかわらず, 明らかな変化がないこ
とは明白である。したがって, 上記パラメータが, 例え
ばα−ヘリックスコンホーメーションを考慮してセット
の全メンバーについて計算された場合, 得られた結果の
パターンは, たとえペプチドが実際にα−ヘリックスの
形態でなくても“真の”パターンからそれほど変わらな
いであろう。この結果は，認識され，指令されたコンホ
ーメーションを得るのに不充分な長さの非常に短いペプ
チドについて特に重要である。

【００７２】それ故，３つのパラメータ，すなわち疎水
性モーメント(hm), 双極子モーメント(dm)および波形因
子(cf)の計算は次のようにして行われる。

【００７３】

【数２】

【００７４】式中でhmについてはＨ＝hi；dmについては
ＨはpH7 における全体の電荷；およびcfについてはＨは
体積である。

【００７５】これらの５つのパラメータの変化を最大に
することに基づいた多様なセットの生成は，種々の選別
法を用いて行われる が，特に好ましい方法は次のとお
りである。候補ペプチドの配列をランダムに作り，次い
で５つのパラメータの各々についてすでに選択した候補
からの差異について選別する。候補ペプチドを好都合な
数のプール，例えば天然に見い出されるタンパクでの頻
度によって，90〜100の起源中に分布している19個の個
々のアミノ酸の90〜100 の起源から, ランダムに選択さ
れる。第１表に示す様に，いくつかのアミノ酸は，天然
のタンパクで，他のアミノ酸より大きい頻度で出現す
る。この頻度は，遺伝子コード中のこのアミノ酸に関連
するコドンの重複性のレベルによって一般に測定され
る。

【００７６】例えば，最初に組み立てられた6-mer は,
各位置が, 90〜100 起源のパネルからランダムに選択さ
れたアミノ酸によって満たされている。次の候補も，90
〜100 起源からのランダム選択によって構築されるが５
つの測定・計算されたパラメータにおける差について,
第１の候補と比較される。かなりの差があるか否かによ
って，この候補のペプチドは残されるかまたは廃棄され
る。さらに次々に候補が試験されるにつれて，候補は，
そのセットにすでに入っている候補と非常に近い性質を
もっていいるので残留を保証されない可能性が大きくな
り，メンバーをセット中に残す前に多数の候補を組み立
ててスクリーニングする必要がある。このプロセスは，
すぐ前の候補が受容されてから，試験された候補の数が
受容されなくなるまで続けられる。一般に予測されるパ
ターンは次のとおりである。

【００７７】

【表２】

【００７８】上記の場合，組立てと選択のプロセスは提
示した領域のどこかで停止するはずである。

【００７９】48の最終パネルを得るためには, 手動で最
終的に良好な調製を行うことができるように最初に約96
の多様な候補を提供するのが好ましい。例えば, 主鎖の
双極子モーメントに匹敵する側鎖の双極子モーメントが
考慮される。最終パネルは,特性の分布がすべてのパラ
メータについて存在するように再調査しなければならな
い。すなわち各ペプチドは, 少なくともＸ％まで(0〜10
0 単位の範囲に目盛を規格化した後) 他のすべてのペプ
チドと異なりＸの値は前記グラフの“非常に扱いにくい
(cumbersome)”領域で決定される。したがって各ペプチ
ドは，５つのパラメータの少なくとも１つについて，そ
のセット中の他のすべてのペプチドと実質的に異なる。
この方法は，計算の方が合成より容易なので有利であ
る。しかし充分な多様性が，熱によってコンホーメーシ
ョン中に誘発される変動によってある程度損なわれる。

【００８０】スクリーニングアッセイにおいてパネルの
メンバーの総数を減らすために代表サンプルを使用する
ことの有効性は，多くの情況において認められている。
例えば，カレイら（W. P. Carey, et al), Anal Chem
(1987年) 59巻:1529-1534頁;スキリング(J. Skilling),
Nature (1987 年) 309 巻: 748-749 頁参照。

【００８１】候補のミモトープセットの中からペプチド
が選択されると, 個々のペプチドは既知の技術を用いて
容易に入手しうる。たとえば, ハウテン(R. Houghten).
Proc Natl Acad Sci USA (1985 年) 82巻 : 5131-5135
頁) の「Ｔ−バッグ」合成法によれば，これらの物質を
肉眼で見ることができる量の合成が可能である。さら
に，抗原構造の探索のためのポリエチレン固体支持体に
結合し，抗原／抗体相互作用についての理解を得るため
に使用される多数のペプチドの合成が，ゲイセン(H.M.
Geysen), Immunol Today (1985 年) 6巻: 364-369 頁;
ゲイセンら(H.M.Geysen et al), Molecular Immunol (1
986 年) 23巻 : 709-715頁; ゲイセン,オーストラリア
特許明細書25429/84によって報告されている。

【００８２】合成ミモトープ混合物は, たとえばファー
ジ形質移入宿主における発現のために, λファージベク
ター内にショットガンクローニングされた任意の合成DN
A 配列を使用して調製することもできる。このアプロー
チでは, 標準的な市販の固相DNA 合成手法を使用してラ
ンダム配列の9-mers, 12-mers, 15-mersまたは18-mers
を合成し，所望する場合にはさらに均一な配列に拡張
し，宿主細胞におけるトランスフェクションのために標
準発現系に連結する。どのような組換え宿主も使用しう
るが, 都合のよい発現系はλファージベクターおよび細
菌宿主細胞である。このようにしてトランスフェクトし
た物質を, 次に発現に適した条件下で培養して, ミモト
ープの混合物を得ることができる。あるいは, 混合物で
はなくパネルを所望する場合には, 以下に述べるよう
に, トランスフェクトしたイー・コリを，個々のペプチ
ドの生成のために個々のコロニーとしてプレーティング
することができる。ペプチド配列に適した発現系は当該
技術において既知であり, たとえば, マニアティス(Man
iatis), Laboratory Cloning Manual(1982 年) Cold Sp
ring Harbor Press中に認められ, 当該技術においては
周知である。組換え法によって得られるペプチドは, 混
合物としてあるいは個々のペプチド配列としても入手し
うる。

【００８３】ポリペプチドは極めて合成に都合がよい
が，潜在的なミモトープの選択は, アミノ酸配列に限定
すべきではないことを改めて強調しておかねばならな
い。アミノ酸配列自体は, 天然に見出されるアミノ酸と
天然には見出されないアミノ酸,及び天然に見い出しう
るが遺伝暗号によってコードされないアミノ酸から誘導
することができる。さらに, 多糖類複合体構造及び形状
や電子分布を変化させる様々な置換部を含む多環構造の
化学合成バリエーションも使用し得る。しかしながら,
ポリペプチドの使用は, 現在使用し得る技術の利用, 並
びにおそらく抗原の表面外形の代表的なサンプルを得る
為に他の合成アプローチの使用を必要とせずに, 所望す
る形状のスペクトルを提供する数多くの変種の速やかな
実現を可能にする。

【００８４】Ｄ．スクリーニング工程 標識分析物と反応性のある免疫グロブリン 本発明工程の１つの側面は，所望する分析物と反応する
抗体を得るための方法に関する。いくつかの場合には，
これは，任意に作製した抗体パネルを使用する単一の反
復しか必要としない。この工程では，おそらく，抗体パ
ネルを分析物で直接スクリーニングすることができるで
あろう。しかしながら，この方法は，分析物が大量に入
手できなければならず，標識を与えるために分析物を化
学的に変更するか，あるいはさもなければ，次に標識に
結合することができる何らかの修飾物質に分析物を接合
させなければならないという不利な点がある。本発明の
方法においては，標識していない分析物とミモトープの
標識付けされた混合物との競合によって，これが回避さ
れている。ミモトープ混合物の標識は，おそらくシステ
イン残基程度の簡単なリンカー分子をペプチド鎖に接合
し，それを，ピアース・ケミカル社（Pierce Chemical
Co. ）が販売しているような市販のリンカーを用いて標
識に接合させることにより容易に達成できる。その代り
に，ペプチドをアピジンのようなその他のタンパクに接
合し，それを標識に結合するための手段として使用する
こともできる。標識は，酵素，蛍光体，放射性成分，発
色団等を含めて，種々の選択か可能である。代表的な酵
素標識には，西洋ワサビのペルオキシダーゼ，トリプシ
ン，カタラーゼ，およびアルコールデヒドロゲナーゼが
包含される。蛍光体は，フルオレセインおよびダンシル
を包含する。種々の色素のような発色団も使用しうる。
可能な標識の数は多大であり，当業者にとっては周知で
ある。標識は代表的にはペプチドホモポリマーあるいは
その他の簡単なペプチド，あるいはポリエチレングリコ
ールのような適当な溶解度の短いオリゴマーを含むスペ
ーサーを通してミモトープに接合することができる。

【００８５】次にパネルを，対照として，ミモトープ混
合物と結合する能力に関して予備的に試験する。結合の
パターンおよび標識の強度を観察して，好ましい工程で
は，ミモトープに不十分にしか結合していない抗体は無
視される。無視されるカテゴリーに属する抗体パネルの
割合は大きくないであろう。その理由は，ミモトープの
混合物の数はおこりうる種々の外形を包含するのに十分
な数であり，従って想定されるいずれの抗体にも結合す
ることができる少なくとも２〜３のメンバーを含んでい
なければならないからである。これは特に最大の多様性
を持ったミモトープ混合物の場合にあてはまる。今，す
べてのメンバーがミモトープ混合物に結合することが証
明されたパネルを，標識していない分析物を使用してミ
モトープ混合物との競合により再びスクリーニングす
る。分析物とミモトープ混合物（あるいは個々の成分）
の連続的希釈を用いて，分析物が最も良好に競合する抗
体を確認する。

【００８６】さらに詳しくは，必要数のミモトープの混
合物（固有の多様性に応じておよそ10〜1000の；より多
様な混合物については，範囲の下限の数で十分であろ
う）を適当な方法，たとえばボルトンら（A.E.Boloton
et al），Biochem J （1973年)529 〜539 頁が述べてい
る，ICN レイディオケミカルズ(ICN Radiochemicals）
より市販のヨウ素同位体125 を用いたアシルヨウ素化法
によって標識する。アピジン／ビオチン結合フルオレセ
インのようなその他の標識方法も使用できる。上記に述
べたようにペプチドの混合物は，個々のメンバーの合成
とそれらの混合によって直接調製するか，あるいは大き
なタンパクを任意の小さなペプチドに加水分解すること
によって得られる。１つのアプローチは，たとえば，酵
母溶解産物の部分的なトリプシン加水分解産物を使用す
る（クリーブランドら(D.W. Cleveland et al)，J Biol
Chem （1977年）252 巻：1102〜1106頁）。これは混合
物として標識することができる多数のペプチドを提供す
る。あるいは，それらの結合が個々に評価されれば，た
とえば SDSゲル電気泳動を用いて分離し，Immunodyne
（バーネット(W.N. Burnette) ，Anal Biochem（1981
年）112 巻：195 〜203頁）のような試験支持体に移す
ことができる。

【００８７】標識ペプチド混合物を使用するにあたって
パネル中のすべての候補抗体に関して十分な結合が生じ
ることを確認する必要があると考えられる。パネル全体
を通じてこのように均等結合を生じさせるための条件
も，経験的に確立しなければならない。完全な条件下で
は，ペプチド混合物はパネルの全メンバーに均一に結合
する。しかしながら，多くの場合，類似のレベルの結合
だけが見い出される。これは分析物との競合に対して完
全に適用しうる基準を提供する。その理由は，混合物へ
のパネル・メンバーの結合体を，競合を評価する前と同
じ数値，すなわち100％に規格化することにより，単純
化することができるからである。

【００８８】標識したペプチド混合物が，分析物不在下
ですべての候補抗体におよそ同等に結合していることが
確認された場合，あるいは同様の結合が規格化された場
合に，分析物の存在下でスクリーニングを反復する。分
析物に対して特異的親和性を有する候補抗体は，標識ペ
プチド混合物の結合の低下を示し，その低下は分析物に
対する候補抗体の特異的親和性に比例する。これは，分
析物が抗体に関する標識ミモトープ混合物との競合に勝
利したことを示唆するので，分析物と最大の親和性を持
つ抗体最少レベルの標識を示す。分析物の競合能力を評
価することによって，標識取込みにおける最大の低下を
示す抗体が，分析物を結合するのに最も好適なパラメー
ターを持つものとして選択される。

【００８９】時として，このようにして識別した抗体産
生細胞あるいはパネルのサブセットが，それ以上に処理
を行なわずにイムノアッセイにおいて有用な所望分析物
に対して十分な特異性と親和性を持つ場合がある。この
ような場合には，永久増殖化された１つの細胞系または
複数の細胞系は，所望する抗体あるいはサブセットの永
久的な供給源を提供し，該分析物についてのイムノアッ
セイは，この抗体あるいはサブセットを特異的試薬とし
て用いて実施することができる。

【００９０】当該技術において広く理解されているよう
に，かかるアッセイについては様々なプロトコルが使用
できる。たとえば，試験するサンプルをマイクロタイタ
ープレートに被覆し，次に同定されている抗体でプレー
トを処理した後洗浄する。次にこの抗原特異的抗体の種
特性（たとえば抗マウスあるいは抗ヤギ）と反応性であ
る標識抗体を使用して，結合抗体の存在を検出すること
ができる。このプロトコルは，言うまでもなく，使用し
得る多くのもののうちの１つにすぎず，その変形は当該
技術において周知である。

【００９１】その他のプロトコルでは，たとえば，標識
された分析物を用いてサンプル中の未標識分析物と競合
させる競合アッセイを使用して，該分析物を測定するこ
とができる。これもやはり大量の分析物とその化学的修
飾を必要とするという不便さがある；追加的な分析物の
必要性は，しかしながら，適当なミモトープ（以下で定
められるような）を競合物として用いることにより回避
することができる。

【００９２】このような方法で選択されるサブセット，
あるいは任意に選択されるサブセットに関して，場合に
よっては，パネルの個々のメンバーに関する分析物の結
合強度のパターンにより，特異性を与えることができ
る。第２図から第５図に示す結果が示唆しているよう
に，簡単な分析物については，比較的小さな任意のサブ
セットの中で特性パターンを得ることができる。この概
念を用いるために，該サブセットを基質上の都合のよい
パターン内に支持し，パターンが現われるように，各抗
体についての分析物の結合強度を測定する。適切にデザ
インすれば，たとえば，仮に10〜10,000，好ましくは10
〜 100のかかる抗体のマトリックスを含むカードから，
直接パターンを読みとることができる。従って，好まし
いアプローチにおいては，ブロッティングあるいは個々
の細胞系からの上清を移すことにより，サブセットのパ
ターン化された配列を有する１つまたは複数の支持体が
得られる。

【００９３】パターンのパネルを，代表的にはパネルの
各メンバーへの分析物の結合強度を確立する適当なプロ
トコルによって，分析物に関して標準化する。このキャ
リブレーションへの１つのアプローチは，上記の抗種標
識抗体のような定量的検出系の使用である。その代り
に，標識していない分析物を標識したミモトープ混合物
と競合させることによって逆標準化パターンを得ること
もできる。このキャリプレートしたパネルを使用すると
次のようにしてサブセットを分析物に関して分析するこ
とができる。前述した直接的あるいは競合的プロトコ
ル，およびキャリプレーションパネル上のパターンと一
致する定量的結合の一貫したパターンをモニタすること
によって分析できる。得られた標識量の変動が，上述し
たように直接的に，あるいはサンプルと，標識分析物，
下記に述べるような方法で同定されるような，該分析物
を擬態する標識ミモトープ，または標識混合物との間で
競合的に測定される場合には，これらは分析物の量の変
動を示す。いかなる場合でも，得られるパターンは個々
の分析物に関しての特性であり，同じパネルあるいはパ
ネル群がパターン認識によって適切な試験システムを提
供する。

【００９４】認識されたパターンは，さらに，一連のサ
ンプル中の分析物レベルのモニタリング，たとえば化学
的処理，廃棄物処理，あるいはその他の進行中の工程の
モニタリングにおいて使用するために定量化することが
できる。該分析物が可変的レベルで存在する場合には，
認識されたパターンにおける結合強度が，その一連のサ
ンプル中の分析物濃度の関数となる。認識パターンが，
同じパネル上で重複しない範囲で，いくつかの分析物を
同時に測定することができる。そして無関係な特性づけ
られない夾雑物は，夾雑物の変動が該分析物の変動に比
べて小さければ干渉しない。

【００９５】特定の分析物についての特性プロフィール
を提供するための，多様な抗体パネルの使用の例を第８
図に示す。抗体パネルは，選択された抗体の多様なセッ
トを用いて，たとえば，パネル中の各々の抗体が１また
はそれ以上の特定分析物と異なる定性的あるいは定量的
反応性を持つように，１または複数のランダムパネルか
ら構築される。第８図においては，抗体パネルは20の抗
体から成っている；しかしながらそれ以上またはそれ以
下の数の抗体を使用してもよい。

【００９６】たとえばＮ個のミモトープの混合物中のい
くつかのミモトープに関して個別の活性を確認するに
は，パネルの各抗体を，検出可能なシグナルを与えるよ
うに放射能などによって適切に標識したＮ個のミモトー
プの各々と反応させる。抗体パネルと反応したかかる各
々のミモトープ（Mtp ）は，個々の特定ミモトープ，Mt
p-1，Mtp-2 …Mtp-N（第８図，パネルＡ〜Ｃ）の特徴を
示す，パネルについての結合プロフィールを生じる。次
に，ミモトープ１〜Ｎの各々に関する結合シグナルをパ
ネルの各抗体に対して添加し，パネルの各抗体に関する
Ｎミモトープのセットについての総和した特性プロフィ
ール（パネルＤ）を形成させる。従ってパネルＤはまた
Ｎミモトープの混合物を表わす。各抗体に関するミモト
ープ結合シグナルの総和を，該総和信号が各抗体に関し
て最大（ 100％）の結合を示すように「規格化」する
（パネルＥ）。

【００９７】与えられた分析物あるいは対象の抗原
（「AgA 」）についての特徴的なプロフィールあるいは
フィンガープリントは，AgA およびミモトープ１〜Ｎの
標識混合物をパネル中の各抗体と競合的に反応させるこ
とによって得られる。AgA によって形成される競合プロ
フィール（パネルＦ）は，一般に，パネル中の特定の抗
体に関してAgA が競合に成功したことにより，パネル中
のいくつかの抗体と標識ミモトープとの結合を低下させ
る。第８図のパネルＦは，AgA が，パネルの４つの抗体
に関してＮミモトープの標識混合物の結合を低下させる
原因となることを示している。

【００９８】AgA が，それに関する標識ミモトープ混合
物との競合に勝利した抗体によって示される結合の量
（あるいは低下）を測定し（パネルＧ），パネル中の各
抗体に関する結合の量（あるいは低下）を再びプロット
して，抗体結合プロフィールを作製する（パネルＨ）。
これは，同じ参照抗体パネルおよび同じミモトープ混合
物競合セットを使用して，他の分析物（AgB ，パネル
Ｉ）に関する他のプロフィールと比較した場合のAgG の
特徴を示す。

【００９９】抗体パネルにおいて使用する多様な抗体セ
ットの選択に応じて，検出およびその定量にとって有用
となり得る分析物に関して個別的なプロフィールが得ら
れることは明白である。

【０１００】分析物と競合するミモトープの選択 適切な競合ミモトープを選択するためには，ミモトープ
混合物自体をパネル内に分離し，スクリーニングしなけ
ればならない。スクリーニングのための道具（プロー
ブ）はもとのパネルから選択された抗体の形態で既に用
意されている。この段階では，ミモトープは，典型的に
は，ニトロセルロース，マイクロタイタープレート，あ
るいはゲイセン（Geysen）のマルチペッグドシステムな
どの固体支持体上に，個々の化合物として提供される。
パネルが固体支持体上に提供されれば，標識していない
（あるいは効果的に標識されていない）ミモトープを使
用して，選択されたスクリーニング抗体あるいは二次検
出抗体に接合する標識を得る上で最も都合がよい。個々
のミモトープを，次に標識抗体で直接あるいは間接的に
スクリーニングする。個々の抗体を使用してもよいし，
あるいは，いくつかの抗体を含むサブセットを使用して
もよい。一般的に初期のパネルの個々のメンバーの特異
性がないという観点から，サブセットの方が都合がよ
い。最も結合に成功しているものをスクリーニングサブ
セットのために選択する。あるいは，適当な結合ミモト
ープが得られるまで，より小さなサブセットのミモトー
プ混合物を順次使用して，ミモトープ混合物をスクリー
ニングすることもできる。

【０１０１】ミモトープのパネルを，標識抗体によって
直接スクリーニングすることも，競合的アッセイにおい
てスクリーニングすることも有用である。十分に抗体と
結合するミモトープのサブセットを，分析物がこの結合
を分断する能力に関して再びスクリーニングする。分析
物が最も競合に成功するものが，明らかに分析物を最も
完全に模倣しており，そしてこれらが，免疫化を用いて
抗体特異性をさらに精製するための適切な候補である。
これはまた，次の段落で述べるように免疫学的検定にお
いて直接使用するための適切な選択でもある。

【０１０２】従って，適切なサブグループあるいは個々
のミモトープの選択によって，標識ミモトープが分析物
に対する競合者の役割を果す，競合免疫測定法のために
必要な試薬が提供される。

【０１０３】分析物を分析するための適切なキットも本
発明の一部である。キットの内容物は，検出あるいは測
定のためのアッセイプロトコルのデザインに依存する。
すべてのキットは，アッセイを実施するための使用説明
書，適切な試薬と標識，および必要に応じて固体支持体
を含む。キットが，単一の高度に特異的な抗体を使用す
る，分析物の簡単な検出アッセイ用にデザインされてい
る場合には，このキットは，この高度に特異的な抗体お
よびこの抗体と分析物との反応を検出する何らかの手段
を含む。たとえば，検出試薬は，単にその特異的抗体自
体を標識することを包含し得る。その場合にはアッセイ
は，分析物を固体支持体に非特異的に結合させ，固体支
持体が標識された抗体を保持する能力を検出することに
よって実施される。分析物に特異的な１種以上の抗体が
認められ，１種以上の抗体が同時に結合することを防ぐ
立体障害がなければ，抗原を捕獲するための１種の未標
識特異的抗体と捕獲した抗原を検出するための第２の抗
体とを用いて，サンドイッチ型アッセイが使用できる。
あるいは，キットは，所望の分析物について認識パター
ンが較正されている抗体パネルを含んでもよい。さら
に，標識した競合ミモトープまたは混合物を含有させ
て，サンプル中の未標識分析物と標識ミモトープとの競
合によってアッセイを実施してもよい。

【０１０４】あるいは，パターンを逆にして，必要に応
じて，競合分析物の存在下および不存在下で，いくつか
のミモトープへの競合パターンに関して，単一の抗体を
特性付けることもできる。このパターンは，該分析物の
プロフィール特性も提供する。最大限に異なる特性を持
つ，限られた数のミモトープ，たとえば約40〜 100，好
ましくは約50〜60のミモトープの多様なパネルを用いて
実施する場合，この工程は，多数の抗体の各々に関する
認識プロフィールを構築するためにも使用できる。該認
識プロフィールはコンピュータファイルに保存すること
ができる。各々のプロフィールについて２〜３回のアッ
セイしか必要としないので，多くのプロフィールのコレ
クションが記録できる。新規の分析物に結合すると考え
られる抗体は，下記に詳述するように，抗体についての
保存されている認識プロフィールを，新規分析物につい
てのミモトープ相同性プロフィールと照合することによ
り，電子工学的に選択することができる。

【０１０５】分析物のミモトープ相同性プロフィール
は，ミモトープパネルに関して調製されたインバースイ
メージ参照抗体セットを用いて極めて容易に測定され
る。50ミモトープのパネルの場合，これは，50の抗体を
含有し，ここで，50の抗体の各々１つずつが，他の49の
いずれのミモトープよりも10〜 100倍強く50のミモトー
プの１つに結合する。従ってたとえば，各モノクローナ
ル抗体は，その抗体に適合するミモトープに対して10⁸l
/mole以上の結合力を持つが，残りの49のミモトープの
いずれに対しても 10⁶l／mole未満の結合力しか持たな
い。

【０１０６】インバースイメージパネルは，ミモトープ
で免疫し，従来のスクリーニングアッセイにおいて所望
のミモトープでスクリーニングすることによる，標準的
なモノクローナル抗体産生手法を用いて得られる。残り
の49のミモトープと反応性がないことを確認することに
より，適切な特異性を持つモノクローナルを選択する。
従って好適な予備スクリーニングは，上記のランダムパ
ネルにおける抗体の同定に関して述べたのと同様の方法
による，候補でない49の標識ミモトープの混合物と未標
識の所望ミモトープとの間の競合を包含する。

【０１０７】この概念の適用の非常に単純な例として，
インバースイメージ参照パネルの抗体＃７によって単独
で検出される新規分析物は，明らかに，他の49のミモト
ープに比べて，参照ミモトープ＃７に非常によく似たモ
チーフを示す。その保存されている認識プロフィール
が，他の49のミモトープに比較してミモトープ＃７と強
い結合を示唆している抗体は，従って該新規分析物を認
識する可能性が高い。同様に，新規分析物が，インバー
スイメージ参照パネルの抗体＃７および＃11に対して等
しい結合力を持ち，他のすべてに対しては低い結合力を
示す場合，ミモトープ＃７および＃11を等しく認識し，
その他については無視しうる程度である抗体は，該分析
物を認識する可能性が高い。

【０１０８】より一般的には，より複雑な認識パターン
も使用できる。上記大きなコレクションの中の各抗体に
関して，ミモトープパネルの，たとえば50のメンバーの
各々との結合係数あるいは免疫反応性のパターンが得ら
れる。たとえば，大きなパネルの抗体＃664 は，ミモト
ープ＃１とは50の結合係数を示し，ミモトープ＃２とは
25，ミモトープ＃３とは122 ，ミモトープ＃４とは10，
ミモトープ＃５とは200 などの結合係数を示す。得られ
る50点のパターンが個々の抗体を定義する。

【０１０９】モノクローナル抗体のインバースイメージ
参照パネルが，すべての潜在的分析物あるいは標的抗原
に対しても，最初の50ミモトープのパネルが上記大きな
抗体コレクション中の抗体に対して持つのと同じ関係を
有しているので，任意の分析物を，インバースイメージ
抗体セットの50のメンバーに対して試験することによ
り，この分析物を大きな抗体コレクションの中で最も緊
密に適合するものと間接的に照合することができ，該分
析物のプロフィールあるいはシグネチュア特性を決定す
ることができる。インバースイメージセット中の各モノ
クローナル抗体を標的分析物と反応させた場合に得られ
るプロフィールは，その理想的パートナー抗体を50メン
バーから成るミモトープパネルによって試験した場合に
得られるプロフィールとマッチする。理想的な場合に
は，抗体＃664によって認識される分析物は，Mab ＃１
について約50，Mab ＃２について25，Mab ＃３について
122 ，Mab ＃４について10，Mab ＃５について 200など
の結合係数を示す反応性パターンを持つであろう。

【０１１０】スクリーニングアプローチのこの修正法
は，従って，多様なミモトープおよびインバースイメー
ジ抗体の補足的な小さなセットを参照指標として使用し
て，基礎セット由来の，あるいは任意の分析物と反応性
である大きなセット由来の特定の抗体を同定するのに使
用することができる。最初の大きな抗体セットの各メン
バーを，（たとえば）50メンバーの多様なミモトープの
パネルに関してプロフィールを明らかにし，50メンバー
のミモトープパネルのインバースイメージ抗体セットを
得，そしてそのインバースイメージ抗体パネルを潜在的
分析物あるいは抗原に対して試験すると，適合するプロ
フィールが得られる。

【０１１１】このアプローチの適用に関する有用な例
は，新規分析物が患者に特異的な腫瘍の細胞表面抗原で
あって，抗体コレクションが，現在数千と推定される，
抗腫瘍モノクローナル抗体の蓄積された総配列にあたる
場合である。参照プロフィールのセットを得るために，
抗腫瘍抗体の配列は，最初に小さなセットのミモトープ
に対して分類される。このミモトープセットのインバー
スイメージによって各々の細胞表面抗原のプロフィール
を明らかにし，得られたプロフィールを抗体配列のメン
バーの保存プロフィールと比較する。プロフィールが非
常に適合することは好ましい抗体であることを示す。抗
原を特性付けるためのこのアプローチは次のような利点
を持つ：(i) ごくわずかな生検サンプルで，多数の抗体
に対して分類することができる；(ii)抗体の参照パネル
への結合を測定するための検出標識（Tag ）を抗体に連
結することができるので，生検サンプルを化学的に変性
させる必要がない；そして(iii) 抗体の候補配列を速や
かに且つ安価に検査することができる。

【０１１２】Ｅ．免疫系を使用した抗体特性の改良 ミモトープの予備セットが選択されると，第１段のスク
リーニングパネル中で得られるものよりも高い親和性／
特異性を持つものに関して，多数のＢ細胞をスクリーニ
ングするのにこのセットを使用することができる。最も
簡単な場合では，プローブとしての蛍光体に連結したミ
モトープを用いて，約107 細胞の完全な休止Ｂ細胞のレ
パートリーを蛍光活性化細胞ソーター上でスクリーニン
グすることができる。

【０１１３】通常のインビボでの免疫反応の「成熟」の
分析は，より親和性の高いクローンが，別の基礎レパー
トリーのＢ細胞を検査するのではなく，分析物の結合部
位に対応する超可変性配列のランダム化を開始させるこ
とによって最も良好に産生されることを示唆している。

【０１１４】従って，免疫学的検定における競合試薬と
して有用であることに加え，直接的なアプローチとし
て，選択したミモトープあるいはサブセットは，抗体特
異性および／あるいは抗体親和性を改善するための免疫
原として有用である。ある意味では，この局面は，抗原
の供給を必要とせず，抗原の毒性が回避されることを除
けば，分析物あるいは抗原による標準的なインビボでの
免疫に類似している。さらに，抗自己Ｔ細胞反応の抑制
および正規化が，キーホールリンペットヘモシアニン
（KLH ）あるいは破傷風トキソイドのような適当な担体
にミモトープを接合することによって可能となる。

【０１１５】従って，担体に連結した免疫原性ミモトー
プあるいはサブセット混合物による被検哺乳類の免疫
は，Ｂ細胞の供給を導き，次にこれらのＢ細胞を永久増
殖化して，たとえば上記で用いた方法を使用して，特定
分析物に関する高親和性および特異性をスクリーニング
することができる。この場合，分析物／ミモトープの競
合は，特異性および親和性が特徴的である。あるいは，
上記で示唆したように，ミモトープを蛍光標識に接合
し，選別の前にスクリーニングに使用される反応を実施
することにより，蛍光活性化セルソーター（FACS）を用
いて，産生されるＢリンパ球を最初にスクリーニングす
ることもできる。次に同定された標識細胞を永久増殖化
し，所望に応じて再スクリーニングすることができる。

【０１１６】このレベルの抗体パネルには，初期スクリ
ーニングで得られるよりもミモトープは特異的で，かつ
ミモトープに強く結合するものがいくらか含まれる。通
常，それらは基礎レパートリーにおいて一般的なIgM ク
ラスではなくIgG である。被検哺乳類の免疫系を，Ｂ細
胞分化のための体細胞変異システムとして，および，増
殖する分化Ｂ細胞のセレクターとして使用すると，得ら
れるパネルに，免疫反応性補体に関してははるかに範囲
が狭いが，焦点である補体分析物についてははるかに高
い特異性と親和性が与えられる。ミモトープが分析物の
適切な特徴を擬態する範囲で，得られる抗体は分析物に
関してより高い特異性と親和性を持つ。

【０１１７】免疫系によるこの工程の最初の局面，すな
わち免疫グロブリンの可変部の外形を変化させるＢ細胞
の分化は，最初のパネル由来の候補抗体をコードするも
のから，修飾される範囲において免疫グロブリンまたは
免疫グロブリン断片をコードするDNA を作製することに
より，組換えDNA 手法を用いて擬態することができる。
このように，既知の分離手法を使用して，基礎レパート
リーパネルから選択された細胞によって分泌される免疫
グロブリンをコードするDNA を，出発物質のセットとし
て単離する。分離したDNA に含まれる配列は，免疫グロ
ブリンの超可変部をコードしており，無作為にあるいは
部位特異的変異を通して，生じる抗体の超可変部を修飾
するように変化させることができる。超可変部を同定
し，変化させるための手法は，当該技術において既知で
ある。変異を起こしたDNA を，次に酵母あるいはバクテ
リアにおいて発現させ，第２段のパネルを得る。これは
免疫産生パネルの知見を提供するが，選択性は提供しな
い。

【０１１８】再び，免疫系あるいは組換え手法のいずれ
かによって作製された第２段のパネルを用いて，特に有
用な特性を持つ個々の抗体を選択することができ，ある
いはより好ましくは，所定の分析物に対する親和性に関
して特定のプロフィールを示すパネルを提供するサブセ
ットを得る。一般的なアッセイ工程に選択パネルを使用
することをさらに下記に詳述する。

【０１１９】Ｆ．分析における抗体パネルの使用 ミモトープ（または分析物）によるスクリーニングある
いは免疫化によって得られる抗体レパートリー（その産
生は，それらを産生するＢ細胞を永久増殖化することに
よって永続化し得る）は，被検物質中の分析物に関する
同定診断としても使用することができる。典型的には，
好適な小さなサブセットを使用するが，適切に形式化す
れば，多数のものを以下に述べるようにして操作できな
いという理論的根拠はない。分析物は，その分析物に特
徴的である特定の結合プロフィールを示すであろう。

【０１２０】上記に述べたように，インバースイメージ
パネルは分析物あるいは抗体のいずれかを特徴づけるの
に使用することができる。インバースイメージパネルの
メンバーの数は，実用的なセットを構成しうるに十分な
ほど少ないが，意味のあるパターンを与えるのに十分多
いことが好ましい。このようなパネルは，従って典型的
には30〜 100のメンバー，好ましくは約50のメンバーを
含んでいなければならない。モノクローナル抗体インバ
ースイメージ参照パネルと分析物（あるいはミモトープ
参照パネルと抗体）との反応性は，直接あるいは競合的
標識結合のような当該技術において既知の様々な手法を
用いて評価できる。

【０１２１】多くのプロトコールが想定できるが，少な
くとも，パターン化され，裏づけられたパネルは，特定
分析物に関する反応性の１つまたは複数のプロフィール
を得るために好適な道具を提供する。プロフィールは極
めて個別的であるので，その相違を利用して，様々なタ
イプのプロスタグランジン，種々のアイソエンザイム，
あるいは非常に類似した薬剤などの，密接に関係するク
ラスの分析物のメンバーを識別することができる。

【０１２２】従って，固体支持体上にパターン化された
形式で配置された，分析物に関して親和性あるいは特異
性の異なる10〜約10,000，好ましくは約50の最大限多様
な抗体から成るパネルも，本発明の一部である。次にそ
の固体支持体を使用して，たとえば競合物としての標識
ミモトープの連続希釈を用いて，結合親和力および／あ
るいは特異性を測定することにより，あるいは直接的な
分析において，分析物の存在に関してサンプルを評価す
ることができる。得られるパターンは特定の物質に固有
のものであり，特徴的なものであるので，このような親
和性の特徴的パターンは該分析物の存在を示す。以下に
述べるパネル表示(presentation)の方法は，パネル中に
多数のメンバーを許容する。パターンは肉眼で読み取ら
れるが，あるいはスキャニング手法に付してディジタル
またはアナログ読出し用に変換されてもよい。

【０１２３】簡便な包装形態で，必要に応じて適切な競
合ミモトープと共に，適当な配列でこの抗体あるいはミ
モトープのレパートリーを含有し，試験を実施するため
の使用説明書を添付したキットも本発明に包含される。

【０１２４】Ｇ．パネルの表示 本発明の方法中の多くのステップ，ならびに本発明によ
って提供されるキットが，個々のメンバーあるいは個々
のプールの体系的な配列としてミモトープあるいは抗体
産生細胞を配置することを必要とるすことは注目される
であろう。そのような配列を得る標準的方法が利用で
き，その方法には，上述のようにマイクロタイタープレ
ート，およびニトロセルロースまたはポリスチレン上の
それらの複製を使用することが包含される。

【０１２５】この順序正しい配列を保存する好ましい方
法は，活性な膜の使用を包含する。この活性な膜は，市
販のもの，あるいは市販の「 NuFix^TM」アガロースで例
示されるようなアガロース誘導体を使用して下記に述べ
るようにして調製されたものを含む。この材料を，シェ
イノフ，J.R.ら（Shainoff, J.R.et al ），Biotechniq
ues (1986)４：120 〜128 による厚さ約 1.5mmのゲル状
支持体として使用した。アガロース誘導体は，共有結合
が形成されるので，ポリスチレンおよびニトロセルロー
スへの吸着より，タンパクおよびペプチドの結合安定性
を提供する。本発明の他の局面は，アガロース誘導体を
必要なパネルのための固体支持体として使用する改良方
法である。

【０１２６】この改良においては，取り扱いが困難で，
完全に再現可能ではない結果を生じるアガロース誘導体
ゲルを使用せずに，アガロースをガラスファイバー濾紙
のような不活性固体支持体内に含浸させる。含浸した固
体支持体を使用することにより，取り扱いの容易さと再
現性が大きく改善される。

【０１２７】本発明の支持体を調製するために， NuFix
^TMアガロースなどのアガロース誘導体を適量の水に溶解
して約 0.1〜 0.5％，好ましくは 0.3％とし，煮沸した
後，最終濃度の 0.1Ｍのホウ酸ナトリウムなどのアルカ
リを添加する。適当な大きさのガラスファイバー濾紙な
どの固相吸着剤を，溶解したアガロース中に浸漬し，余
分な液体を除去する。完成したシートを冷却してアガロ
ースを固体化させ，４℃の湿潤条件下にて保存する。

【０１２８】使用時には，アッセイ含浸紙のシートを，
水素化シアノホウ酸ナトリウム（１mg／ml）を新たに溶
解させた，結合試薬を含有する新鮮ホウ酸ナトリウム中
で平衡化させ，余分な液体を除去し，サンプルを支持体
上に所望のパターンでプレーティングする。これは96ウ
エルのマイクロタイタープレートのパターン内に96の平
底金属ロッドの配列があるChoneMaster(登録商標)（イ
ミュンシン社(Immunsine Corporation) ）などの多くの
市販手段，あるいはその他の簡便な転移機構によって実
施され得る。転移した物質を５〜15分間，好ましくは約
10分間濾紙と反応させ，次に緩衝液，およびBSA などの
適当なタンパクを含む溶液中に固定する。サンプル中に
検出されるべき物質に適した試験系を用いて，スポット
を展開させる。

【０１２９】

【実施例】以下の実施例は本発明を例示することを意図
したものであって，本発明を制限すること意図したもの
ではない。実施例１は，完全なＢ細胞レパートリーを代
表するサブセットである，抗体分泌細胞のパネルを提供
するための特定方法を述べている。上記明細書中に概説
したように，その他の方法もこのパネルの作製に使用し
得る。また同時に，ミモトープの代表的混合物を生成す
るための特定方法についても述べている；これもやは
り，上述したように様々な工程によって，また多くの標
識方法を用いて実施し得る。

【０１３０】実施例２は，本発明の支持抗体パネルの調
製を述べている。

【０１３１】（実施例１）抗体分泌永久増殖化細胞のパネルの調製 標準的工程を用いて10週令の雄性BALB／c マウスから脾
細胞を得， 200mlの完全培地（イスコブの修正ダルベッ
コ培地（IMDM），10％胎仔ウシ血清，0.4mM 2-メルカプ
トエタノール，２mM L-グルタミン）を含む 650mlフラ
スコに入れた。すべり（gliding ）細菌アジュバント
（２mg）をポリクローナル刺激剤として細胞に添加し，
刺激された培養物を37℃で４日間インキュベートした。

【０１３２】1000rpm で10分間遠心分離して細胞を回収
し，あらかじめダルベッコ，の二価陽イオンを含まない
PBS 中で，同様にして回収し， 500rpmで８分間遠心分
離しておいた108の骨髄腫細胞，P3X63AG8.653と合わせ
た。上清を取り，ペレットを１分間50w/v ％のPEG4000
（ガスクロマトグラフィー規格）の0.6 ml中に再懸濁さ
せた。再懸濁したペレットを含む試験管を37℃で45秒間
ゆっくりと渦巻状に動かし，さらに45秒間休止させた。
細胞を再び500rpmで３分間ペレット化し，37℃のIMDM15
mlを，ペレットを乱さないようにしてゆっくり試験管に
加え，500rpmでさらに５分間遠心分離した。

【０１３３】上清を取り，ペレットをもう一度，0.4mM
ヒポキサンチンおよび 1.6×10^-5moleチミジンを含む完
全培地（完全培地＋HT）（37℃）15ml中に再懸濁させ
た。懸濁液を，脾活性化培地（脾細胞回収物由来の上
清）30mlと共に，37℃の完全培地＋HT 155mlに添加し
た。懸濁液を 650mlフラスコに注ぎ入れ，37℃で12〜18
時間インキュベートした。懸濁した細胞を，２×10^-7mo
leアミノプテリン(A) と共に，マクロファージと２匹の
BALB／c 10週令雄性マウスの脾細胞とを用いて提供し，
懸濁液を，合計10プレートの96ウエルの組織培養プレー
トに，ウエルあたり 200mlずつプレーティングした。ウ
エルあたり５〜10クローンを得た。従って最初の１つの
活性脾から5000以上の抗体産生細胞を得た。コロニーを
さらに個々の細胞系に分離するか，あるいは初期スクリ
ーニングのためのプールとして使用してもよい。

【０１３４】（実施例２）支持アガロース上のパネルの調製 NuFix^TMアガロースを，製造者が指示しているように，7
0℃で10分間， 0.3％よりわずかに高い濃度で水に溶解
させ，次に10分間煮沸した。1/10容量の0.1Ｍホウ酸ナ
トリウム(pH9) を添加し，溶液を55℃水浴中に置いた平
鉢に注ぎ入れた。３インチ×５インチに裁断したガラス
ファイバー濾紙のシート（シュレイチャーとシュール(S
chleicher and Scheull)）をアガロースに浸漬させ，余
分な液体を吸収紙に吸い取って除去した。シートをパラ
フィン紙の上に置き，10分間冷却してアガロースを固体
化させた；シートは湿潤箱の中で４℃で保存した。

【０１３５】使用時には，含浸させた紙を，水素化シア
ノホウ酸ナトリウム１mg／mlを含む0.1Ｍ ホウ酸ナト
リウム（pH９）中で５分間平衡化させた。余分な液体を
流出させ，吸い取って，シートをプラスチック製ラップ
の上に置いた。96ウエルプレートの各々のウエルからの
サンプル１μlを，増殖するマウス細胞と共に，あるい
はマウス細胞を伴わずに，標準96ドットパターンとして
紙に移し，移した培養プレート培地のドットを10分間紙
と反応させた。過剰な結合部位をブロックするために，
シートを，1w/v％ウシ血清アルブミンを含む 0.1Ｍ Tr
is-HCl（pH８）， 0.1Ｍ NaClの溶液中に浸した。液体
を除去した後，同じ緩衝液中で１：3000に希釈したペル
オキシダーゼ結合ヤギ抗マウス血清（ザイムド，Zymed
）５mlをシート上にピペット化し，シートを室温で15
分間インキュベートするか，あるいは，試薬を浸透させ
た濾紙に対してブロッティングすることにより，試薬を
付与した。結合していない抗体を吸引によって除去し，
0.1％ BSAを含むリン酸緩衝生理食塩水を何回も支換し
ながら，５〜10分間，紙を洗浄した。

【０１３６】結合したペルオキシダーゼを，あらかじめ
過酸化水素を0.1 ％の最終濃度で添加しておいた，50％
メタノール，50％クエン酸中10mg／mlのテトラメチルベ
ンジジンを用いて可視化した。反射濃度計あるいは写真
によって結果を記録した。

【０１３７】第１図は，プレート上の連続する横列のハ
イブリドーマ培養物を連続的に希釈した結果を示す。強
度の変動が明らかに認められる。

【０１３８】被検物質のパネルは手操作であるいは定量
的検出法を用いて読み取ることができる。たとえば，配
列させたパネルは，個々のスポット各々からの蛍光シグ
ナルのようなシグナルをディジタル化し，それをコンピ
ュータの判読可能な形式で出力するように設計された特
殊な装置で読み取ってもよい。従って，個々のスポット
について定量的測定が得られる。

【０１３９】本発明の工程において有用なパネルの特定
形状は， 100個の横列と 100個の縦列のドットを有する
小さな面積，たとえば３インチ×３インチのカードを包
含する。この合計10,000の個別抗体あるいは抗体プール
の配列は，特定分析物との反応性の特徴的パターンを導
く。

【０１４０】（実施例３）多様なミモトープパネルの合成 疎水性の低下および疎水性モーメントの周期的変動に基
づいて，88種のペンタペプチドのパネルをデザインし
た。第６図は，合成したペンタペプチドに１〜88の番号
を付したリストを示す；第７図は，このパネルを横切る
疎水性指数と疎水性モーメントを示す。

【０１４１】該パネルは，96ピンのロットを使用する，
ゲイセン，H.M.ら（Geysen H.M. etal ）Proc Natl Aca
d Sci USA(1984)（前出）の方法を用いて合成する。残
りの８個のポリエチレンピンは，アミノ酸分析によって
分析される，合成における対照として使用する。

【０１４２】次にパネルのミモトープを混合し，上述し
たようにボルトン−ハンター試薬を用いて125-I で標識
して，マイクロタイターのウエル中で基礎抗体レパート
リーの個々のメンバーを用いて試験する。レパートリー
のすべての抗体メンバーに対してほとんど均一な結合が
認められる。次にマイクロタイターウエル中の混合物に
所定量の分析物を添加して試験を繰り返す。少数のウエ
ルは標識が大きく低下する。これらの抗体が，分析物と
優先的に結合するものについての，成功した初期スクリ
ーニングの結果を表わしている。

【０１４３】（実施例４）抗体のスクリーニングにおけ
る，非同一分析物に対する競合物として標識ミモトープ
が有効であることを第９図に示す。２つの異なるモノク
ローナル抗体を，濾紙基質上の１横列あたり12スポット
の割合で２横列に付与した。第９図において，横列１と
２にはMab 33-6をスポットし，横列３と４にはMab 9-7-
9 をスポットして，横列５は抗体をスポットせずに対照
として使用する。ウシ血清アルブミンをすべてのスポッ
トに適用して過剰結合部位をブロックした。パネルの縦
列２〜11には，標識ペプチド／ミモトープのスポット，
MB4-FITC(MB4=Cys-Asn-Tyr-Ser-Lys-Tyr^*-Trp-Tyr-Leu-
Glu-His-Ala-Lys)を，２×10^-5Ｍのセット濃度で適用し
た。縦列２〜11は，縦列２の４×10^-4Ｍの濃度から始ま
って，縦列３〜11へ連続的に１：１希釈して順次より低
い濃度で，未標識競合ペプチド／分析物 MB3（MB3=Cys
-Asn-Tyr-Ser-Lys-Phe^*-Trp-Tyr-Leu-Glu-His-Ala-Ile-
ser)（ ^*＝アミノ酸残基の違い）を，同時に含む。生じ
た基質をインキュベートして洗浄した(Bio- Dot 装
置）。

【０１４４】第９図は，各々のMab に関して，MB3 競合
物が希釈されているので，標識MB4ペプチドが未標識競
合ペプチドMB3 との競合に成功したことを示しており，
試験した２つのMab の各々についてパネル上に特徴的な
パターンが生じている。

【０１４５】（実施例５）少数の多様のミモトープで
も，任意に選択した抗体との結合に適したペプチドを含
み得ることを本実施例において示す。第１０図は，ハウ
テン（Houghten）（前出）の方法に従って合成した24種
のノナペプチドに関するアミノ酸配列を示す。これらの
ペプチドは，疎水性モーメントおよび疎水性指数，なら
びに電荷の分布と電荷の大きさにおける高度の多様性を
示すためにデザインされた。

【０１４６】これらのペプチドのうちの16種を，任意に
選択した。実施例４で述べたようにペプチドMB3 とMB4
に結合することがわかっている，マウス抗体Mab 33-6に
結合する能力に関して試験した。結合は，市販のバイオ
−ラッド（Bio-Rad ）のドット−プロット装置を用いて
試験した。この装置は，基質上に試験ドット部位の横列
と縦列を定義するパターン化した上敷きを有する活性紙
またはニトロセルロース基質を提供する。結果を第１１
図に示す。

【０１４７】簡単に言えば，試験は，試験するペプチド
溶液１λを指定のスポット，この場合には３つのスポッ
ト上にピペットで付与することによって実施した。基質
をカゼインまたはBSA でブロックし，次に，あらかじめ
Mab 33-6 １μｇ／mlを含む溶液25λを付与しておいた
サランラップ支持体上に基質を押しあてることにより，
抗体を付与した。基質を抗体溶液に接触させて室温で約
１時間インキュベートした後，取り出して緩衝液中で洗
浄した。次に，あらかじめホースラディッシュペルオキ
シダーゼで標識しておいた標識ヤギ抗マウスIgと共に基
質をインキュベートし，標準的方法によって標識の存在
を検出した。

【０１４８】第１１図に示すように，刺激した基質の横
列２の最後の３ドットは，既知のエピトープの配列に対
するペプチドの相同性に基づきMab 33-6に競合すること
が知られている，ペプチドMB3 を含む。横列３〜６は各
々，第１０図に示す多様なセットの異なるペプチド１〜
16の４種類の各３つずつのサンプルを含む。横列７と８
は追加対照を含む。第１１図の結果は，試験した16ペプ
チドのうち３つがMab33-6との結合に成功したことを示
している。Mab 33-6の代わりにMab 9-7-9 を使用した同
様のアッセイは，試験した16のうち１つのペプチドだけ
がこの抗体に結合し得ることを示した。

【図面の簡単な説明】

【図１】第１図は本発明の方法による固形支持体に結合
した抗体のパネルを示す。

【図２】第２図は抗原カシニンに関する335 個のメンバ
ーからなる基礎抗体パネルの結合係数のパターンを示
す。

【図３】第３図は抗原ファージ１に関する335 個のメン
バーからなる基礎抗体パネルの結合係数のパターンを示
す。

【図４】第４図は抗原キーホール・リンペット・ヘモシ
アニンに関する335 個のメンバーからなる基礎抗体パネ
ルの結合係数のパターンを示す。

【図５】第５図は第２図から第４図の結果の要約であ
る。

【図６】第６図は疎水性指数（hi）および疎水性モーメ
ント（hm）に関して変化するように設計された多様性ミ
モトープのリストを示す。

【図７】第７図は第６図のペプチドにおけるhiおよびhm
の範囲を示す。

【図８】第８図は分析物のプロフィールの展開を示す。

【図９】第９図は２個のミモトープ間の競合分析を示
す。

【図１０】第１０図は24個の多様性ナノペプチドアミド
からなるセットのアミノ酸配列を示す。

【図１１】第１１図は第１０図に示すセットの16個のメ
ンバーが任意の抗体と結合することを試験した分析結果
を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 9282−4Ｂ // Ｃ１２Ｐ 21/08 9161−4Ｂ (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 単一の被分析物を特徴付ける方法であっ
   て，以下の工程：該単一の被分析物と異なった度合の多
   様性で反応する，抗体あるいはその免疫学的に反応性の
   フラグメントのパネルの各々と，該被分析物とを，接触
   させる工程；抗体あるいはフラグメントの各々に対す
   る，該被分析物の反応性の度合を検出する工程；該抗体
   あるいはフラグメントの各々に対する，該被分析物の反
   応性の度合を記録する工程；該記録された反応性の度合
   をまとめ，該被分析物の特徴的プロフィールを得る工
   程；を含む方法。
2. 【請求項２】 前記検出する工程が，パネル中の抗体あ
   るいはフラグメントの各々にほぼ等しい反応性を示す標
   識した多様なミモトープの混合物と，前記抗体あるいは
   フラグメントとに対して，非標識の被分析物を競合的に
   反応させること，および，パネル中の抗体あるいはフラ
   グメントの各々に対する，該標識した混合物の結合の減
   少を測定すること，で行われる，請求項１に記載の方
   法。
3. 【請求項３】 反応する既知のリガンドを有する標的物
   質と有効に結合し得る候補物質を同定確認する方法であ
   って，以下の工程：該候補物質と異なった度合の多様性
   で反応する，抗体あるいはその免疫学的に反応性のフラ
   グメントのパネルの各々を，該候補物質と接触させる工
   程；抗体あるいはフラグメントの各々に対する，該候補
   物質の反応性の度合を検出する工程；該抗体あるいはフ
   ラグメントの各々に対する，該候補物質の反応性の度合
   を記録する工程；該記録された反応性の度合をまとめ，
   該候補物質の特徴的プロフィールを得る工程；および該
   リガンドと該多様な抗体あるいはそのフラグメントとか
   ら得られた同様のプロフィールと，該特徴的プロフィー
   ルと，を比較する工程，ここで，該候補物質のプロフィ
   ールと該リガンドのプロフィールとの類似度が，該候補
   物質の該標的物質に対する結合能力を示す；を含む方
   法。
4. 【請求項４】 前記検出する工程が，抗体あるいはフラ
   グメントの各々にほぼ等しい反応性を示す標識した多様
   なミモトープの混合物と，抗体あるいはフラグメントの
   各々とに対して，非標識の候補物質を競合的に反応させ
   ること，および，抗体あるいはフラグメントの各々に対
   する，該標識した混合物の結合の減少を測定すること，
   で行われる，請求項３に記載の方法。
5. 【請求項５】 既知の標的物質と特異的に反応する候補
   物質のパネルから，１つの候補物質を選択する方法であ
   って，該標的物質あるいは該パネルの何れかの内の１つ
   が抗体からなり，以下の工程：最大限に多様なミモトー
   プのパネルに対する，該標的物質の反応性のプロフィー
   ルを得る工程；各抗体が該ミモトープの１つにパネル中
   の他のミモトープよりも少なくとも20倍大きい結合定数
   で結合する，該最大限に多様なミモトープのパネルのイ
   ンバースイメージである，抗体のパネルを得る工程；該
   インバースイメージの抗体パネルに対する，該候補物質
   の反応性のプロフィールを得る工程；および該ミモトー
   プのパネルに対する，該標的物質の反応性のプロフィー
   ルと，インバースイメージのパネルに対する，該候補物
   質の反応性のプロフィールと，を比較する工程，そし
   て，ここで，該インバースイメージのパネルのプロフィ
   ールと，該ミモトープパネルのプロフィールの類似度
   が，標的物質に対する候補物質の結合能力を示す；を包
   含する方法。
6. 【請求項６】 前記インバースイメージの抗体パネルに
   対する，前記候補物質の反応性のプロフィールを得る工
   程が，以下の：該候補物質と異なった度合の多様性で反
   応する多様な抗体のパネルの各々と，該候補物質を接触
   させること；該抗体の各々に対する該候補物質の反応性
   の度合を検出すること；該抗体の各々に対する該候補物
   質の反応性の度合を記録すること；および該記録された
   反応性の度合をまとめ，該候補物質の特徴的プロフィー
   ルを得ること；で行われる，請求項５に記載の方法。
7. 【請求項７】 前記検出する工程が，以下の：抗体の各
   々にほぼ等しい反応性を示す標識した多様なミモトープ
   の混合物と，各抗体とに対して，非標識の候補物質を競
   合的に反応させること，および，抗体の各々に対する，
   該標識した混合物の結合の減少を測定すること，で行わ
   れる，請求項５あるいは６に記載の方法。
8. 【請求項８】 被分析物と少なくとも３種類の異なった
   度合で反応する多様な免疫グロブリンのパネルを，規則
   的な配列で結合した固体支持体を含み，該差異が，被分
   析物の特徴的なプロフィールを与える，被分析物を検出
   するためのキット。
9. 【請求項９】 前記被分析物と競合的で，かつ，各抗体
   とほぼ等しい反応性を有する，標識したミモトープの多
   様な混合物をさらに含む，請求項８に記載のキット。
10. 【請求項１０】 目的の被分析物と反応性の抗体を同定
    確認する方法であって，以下の工程： a) 哺乳類の休止Ｂ細胞のレパートリーを代表する抗体
    を分泌する永久増殖性細胞の個々のコロニーを複数含む
    パネルを，該被分析物との競合下で，各メンバーが３次
    元的な電荷構造と空間的構造の多様なセットを代表する
    ミモトープの混合物と反応させる工程；および b) 被分析物が該ミモトープ混合物とうまく競合する抗
    体を産生する，少なくとも１つのコロニーからなるより
    小さな亜集合パネルを，該パネルから同定確認する工
    程；を含む，方法。
11. 【請求項１１】 代表的なミモトープの混合物を得る方
    法であって，以下の工程： a) 9-60ヌクレオチドのランダムなヌクレオチド配列を
    含む，多様なDNAフラグメントのセットを調製する工
    程； b) ATG開始コドンを有し，リーディングフレームにペ
    プチドをコードした別のDNAに，a)のランダムなDNAフラ
    グメントを，連結する工程； c) b)のDNAを，宿主の発現ベクター中の制御配列と，
    機能し得る様に結合することで，融合タンパク質をコー
    ドする遺伝子を含み，N-末端あるいはC-末端の配列が保
    持された，発現ベクターのセットを得る工程； d) c)のベクターのセットを，適切な宿主にトランスフ
    ェクトする工程；および e) 発現を誘起するのに適した条件下で，該トランスフ
    ェクトした宿主細胞を培養する工程；を含む，方法。
12. 【請求項１２】 請求項１１に記載のトランスフェクト
    した宿主細胞を，限界希釈でプレーティングする工程を
    含む，ミモトープのパネルを調製する方法。