DE3875997T2

DE3875997T2 - Faerbeloesung fuer nicht durch saeuren entfaerbbare bazillen.

Info

Publication number: DE3875997T2
Application number: DE8888302363T
Authority: DE
Inventors: Jayakumar Reuben
Original assignee: Becton Dickinson and Co
Current assignee: Becton Dickinson and Co
Priority date: 1987-04-06
Filing date: 1988-03-17
Publication date: 1993-04-15
Anticipated expiration: 2008-03-18
Also published as: ATE82636T1; ES2052706T3; CA1317862C; DE3875997D1; EP0286255B1; US4857459A; EP0286255A3; JPH0642838B2; EP0286255A2; JPS63263096A

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Färbesystem für durch Säuren nicht entfärbbare Bazillen. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung ein rasches Anfärben für durch Säuren nicht entfärbbare Bazillen, welche keine getrennte Entfärbungsstufe unter Verwendung einer Säure oder eines Alkohols erfordert.
Die lipidhaltigen Zellwände von Mycobakterien wie M. tuberculosis, weisen die einzigartige Eigenschaft auf, daß sie Carbolfuchsinfärbemittel so fest binden, daß sie einer Entfärbung mit starken entfärbenden Mitteln wie Alkohol oder starken Säuren widerstehen. Daher wurde der Ausdruck "durch Säure nicht entfärbbar" zur Beschreibung einer Carbolfuchsinanfärbereaktion für bestimmte Typen von Bazillen wie Mycobakterien, welche einer Entfärbung durch Säuren oder Alkohol widerstehen, benutzt. Die durch Säuren nicht entfärbbare Färbereaktion von Mycobakterien zusammen mit ihrer einzigartigen perlenartigen und schwach gekrümmten Gestalt ist eine wertvolle Hilfe bei dem frühen Infektionsnachweis und bei der Therapieüberwachung. Das Auffinden von durch Säuren nicht entfärbbaren Bazillen im Sputum oder anderen mycobakteriologischen Proben wird als Indiziennachweis für aktive Tuberkulose angesehen und reicht aus, um die Therapie zu initiieren.
Die vorliegende Erfindung stellt eine Verbesserung des Typs der durch Säuren nicht entfärbbaren Anfärbung dar, welche im allgemeinen als Ziehl-Neelsen-Methode oder "Heißfärbemethode" und als Kinyoun-Methode oder "Kaltfärbemethode" bezeichnet wird. Für jede Methode wird/werden eine Sputumprobe oder andere geeignete mycobakteriologische Proben zur Herstellung einer Kultur verwendet. Die vorangehende Behandlung der Proben mit Pancreatin, Trypsin, Dithiothreit oder anderen mucolytischen Substanzen erhöht die Wahrscheinlichkeit der Isolierung signifikanter pathogener Bakterien. Da die meisten der Bakterien, welche bei akuter Pneumonie gefunden werden, gut auf Blutagar wachsen, ist dies das Medium der Wahl. Beimpfte Platten werden für 18 bis 24 h inkubiert und geprüft. Typische Kolonien werden aufgenommen und mit einer Gram-Färbung für die mögliche Identifizierung solcher Organismen, welche gegenüber Gram-Färbung empfänglich sind, angefärbt.
Bei verdächtigen Fällen von Tuberkulose werden durch Säure nicht entfärbbare Anfärbetechniken eingesetzt, da Mycobakterien und andere durch Säure nicht entfärbbare Organismen durch die Gram-Färbung nicht angefärbt werden können. Es werden ebenfalls in derselben Weise wie für die Gram-Färbung auf neuen Objektträgern Schmierpräparate hergestellt. Die Objektträger werden dann nach der Ziehl-Neelsen-Methode oder der Kinyoun-Methode behandelt.
Bei der Ziehl-Neelsen-Methode wird zuerst ein Carbolfuchsinfärbemittel hergestellt. Das Carbolfuchsinfärbemittel enthält 0,3 g basisches Fuchsin, 10,0 ml Ethylalkohol und 90 ml einer wässrigen 5%igen Phenollösung. Das Carbolfuchsinfärbemittel wird auf das Objektträger-Schmierpräparat während 5 min aufgebracht und es wird ausreichend Wärme für eine sanfte Dampfbildung zugeführt. Das Färbemittel wird nicht verdampfen gelassen und erforderlichenfalls wird mehr Färbemittel zugesetzt. Die Objektträger werden dann abgekühlt und in Wasser gespült. Die Objektträger werden dann in einer Lösung von 95%igem Ethylalkohol, welche 3 Vol.-% konzentrierte Salzsäure enthält, entfärbt. Die Entfärbungslösung wird zugesetzt, bis kein weiteres Carbolfuchsinfärbemittel herauskommt. Die Objektträger werden unter Leitungswasser gewaschen und dann mit einer Methylenblaulösung für 1-2 min gegengefärbt. Die Methylenblaulösung enthält 0,3 g Methylenblau (90 % Farbstoffgehalt) und 100 ml destilliertes Wasser. Die Objektträger werden dann gewaschen, getrocknet und untersucht.
Bei der Kinyoun-Methode werden dieselben Behandlungen des Gegenfärbens und mit Methylenblau wie bei der Ziehl-Neelsen- Methode angewandt. Jedoch enthält das Carbolfuchsinfärbemittel nach Kinyoun 4 g basisches Fuchsin, 8 ml verflüssigtes Phenol, 20 ml Ethylalkohol (95 %) und 100 ml Wasser. Bei der Kinyoun-Methode wird der Objektträger sanft mittels Wärme fixiert und dann mit dem Kinyoun-Carbolfuchsinfärbemittel für 5 min ohne Erwärmen gefärbt. Die Wasch-, Entfärbungs- und Gegenfärbungs-stufen sind dieselben wie bei der Ziehl-Neelsen-Methode.
Es wurden zahlreiche Versuche unternommen, um die Zeitdauer und die Anzahl der Stufen, welche bei der Ziehl-Neelsen- Methode und der Kinyoun-Methode erforderlich sind, zu minimieren. Insbesondere wäre es vorteilhaft, die Säureentfärbungsstufe vor der Gegenanfärbung mit Methylenblau auszuschalten. Keine der bislang verfügbaren Methoden haben jedoch zufriedenstellend funktioniert.
Primäre Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist daher die Bereitstellung einer schnellen durch Säuren nicht entfärbbaren Anfärbemethode, welche keine Entfärbungsstufe unter Verwendung von Säure oder Alkohol erfordert. Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung einer durch Säuren nicht entfärbbaren Anfärbemethode, welche in weniger als 10 min durchgeführt werden kann. Eine noch andere Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung eines primären Färbemittels, welches für die durch Säuren nicht entfärbbaren Anfärbetechniken angewandt werden kann, welche kein Erhitzen erfordern.
Gemäß der Erfindung wird ein Färbesystem für durch Säuren nicht entfärbbare Bazillen bereitgestellt, das ein primäres Färbemittel und ein sekundäres Färbemittel umfaßt und das dadurch gekennzeichnet ist, daß das primäre Färbemittel basisches Fuchsin, Ethylalkohol, Isopropylalkohol, Phenol und Wasser umfaßt, und daß das sekundäre Färbemittel Methylenblau, Ethylalkohol, Kaliumhydroxid, Glycerin, Eisessig, Polyvinylpyrrolidon und Wasser umfaßt.
Die vorliegende Erfindung ist auf die Bereitstellung eines primären Carbolfuchsinfärbemittels zur Verwendung bei durch Säuren nicht entfärbbaren Anfärbemethoden, die kein Erhitzen erfordern und die mit einem sekundären Methylenblaufärbemittel gegengefärbt werden können, gerichtet, ohne daß eine getrennte Entfärbungsstufe mit Säure oder Alkohol nötig ist. Bei einer bevorzugten Ausführungsform enthält das primäre Carbolfuchsinfärbemittel 2,0 g basisches Fuchsin (vorzugsweise C.I.42510), 17,5 ml Isopropylalkohol, 7,5 g Phenolkristalle und 90 ml destilliertes Wasser. Das primäre Färbemittel wird auf ein Schmierpräparat auf einem Objektträger für 5 min ohne die Notwendigkeit für ein Erhitzen aufgebracht. Das Schmierpräparat wird dann unter laufendem Leitungswasser abgespült und mit einer Kombination von Entfärber und Gegenfärbemittel für 2,5 bis 3 min gegengefärbt. Bei der bevorzugten Ausführungsform enthält das sekundäre Färbemittel 0,225 g Methylenblau, 22,5 ml Ethylalkohol, 10 ml Glycerin, 0,01 g Kaliumhydroxid, 4,5 ml Eisessig, 0,00001 ml Polyvinylpyrrolidon und ausreichend Wasser, um auf 100 ml aufzufüllen.
Nachdem das Schmierpräparat auf dem Objektträger gründlich gespült ist und nach dem Trocknen an Luft kann der Objektträger unter einem Mikroskop auf Anzeichen einer durch Säuren nicht entfärbbaren Anfärbung von Mycobakterien untersucht werden.
Weitere Einzelheiten der Anfärbemethoden und des primären Färbemittels und des sekundären Färbemittels der Erfindung ergeben sich aus der folgenden detaillierten Beschreibung.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein durch Säuren nicht entfärbbares Zweistufenfärbeverfahren bereitgestellt. Das Färbeverfahren ist rasch, d.h. weniger als 10 min, und erfordert keine Entfärbungsstufe unter Verwendung einer konzentrierten Säure in Alkohol. Das Färbeverfahren der vorliegenden Erfindung verwendet ein primäres Färbemittel, welches die in der folgenden Tabelle 1 aufgeführten Inhaltsstoffe in dem angegebenen Anwendungsbereich besitzt. Tabelle 1 Inhaltsstoff Anwendungswerte Basisches Fuchsin (vorzugsweise C.I.42510) Ethylalkohol (95 %) Isopropylalkohol Phenolkristalle Destilliertes Wasser
Das primäre Färbemittel wird vorzugsweise nach der folgenden Stufenfolge hergestellt:
a. Zugabe geeigneter Mengen von basischem Fuchsin, vorzugsweise C.I.42510, zu Ethylalkohol und gründliches Vermischen. Stehenlassen der Lösung bei Zimmertemperatur unter periodischem Schütteln der Lösung für 48 h.
b. Zugabe des Isopropylalkohols zu der Lösung und gutes Durchmischen. Stehenlassen bei Zimmertemperatur für 1 h.
c. Filtrieren der Lösung durch ein 1,0 um Filter, das mit einem Vorfilter ausgerüstet ist.
d. Zugabe geeigneter Mengen von Phenolkristallen zu destilliertem Wasser. Gründliches Durchmischen bis zum vollständigen Auflösen sämtlicher Phenolkristalle.
Zugabe der wässrigen Phenollösung zu der Farbstoff/Ethanolmischung. Gründliches Durchmischen und Stehenlassen der Lösung für 4 h.
Zweimaliges Filtrieren der Lösung durch ein 1,0 um Filter, das mit einem Vorfilter ausgerüstet ist.
Das rasche durch Säure nicht entfärbbare Färbeverfahren der vorliegenden Erfindung bedient sich eines einzigartigen sekundären Färbemittels, welches dem doppelten Zweck der Entfärbung und der Gegenfärbung einer Objektträger-Schmierpräparation mit mycobakteriologischen Proben, die mit Carbolfuchsin gefärbt ist,dient. Das für die Kombinationsstufen des Entfärbens und des Gegenfärbens verwendete sekundäre Färbemittel enthält die folgenden Bestandteile in dem angegebenen Anwendungsbereich, wie in Tabelle 2 aufgeführt. Tabelle 2 Inhaltsstoffe Anwendungswerte Methylenblau Ethylalkohol Kaliumhydroxid Glycerin Eisessig Polyvinylpyrrolidon (0,01 Vol./Vol.-%ige Lösung) Destilliertes Wasser
Das Gegenfärbemittel wird nach folgender Arbeitsweise hergestellt:
a. Eingeben der erforderlichen Ethylalkoholmenge in ein geeignetes Gefäß.
b. Zugabe der erforderlichen Methylenblaumenge und gründliches Durchmischen zum Auflösen.
c. Zugabe der erforderlichen Menge einer Kaliumhydroxidlösung (getrennt hergestellt) und gutes Durchmischen.
d. Filtrieren dieses basischen Reagens durch ein 1,0 um Filter, das mit einem Vorfilter ausgerüstet ist.
e. Zugabe der erforderlichen Eisessigmenge und gutes Durchmischen.
f. Zugabe der erforderlichen Glycerinmenge und gutes Durchmischen.
g. Zugabe der erforderlichen Menge der wässrigen (getrennt hergestellten) PVP-Lösung und gründliches Durchmischen.
h. Stehenlassen des Reagens für 2-3 h bei Zimmertemperatur. Zweimaliges Filtrieren des Reagens mit einem 1,0 um Filter.
Eisessig (4,5 ml) wird als einer der Entfärber anstelle von HCl in dem Gegenfärbemittel verwendet, da es eine schwache Säure ist. Beim Vermischen mit geeigneten Mengen von 95%igem Ethylalkohol liefert die erhaltene Mischung aus Säure und Alkohol einen optimalen Wert der Entfärbung. Andere Säuren entfärben die weniger durch Säuren nicht entfärbbaren Bazillen, besonders einige der atypischen Mycobakteria (M.fortuitum, M.chelonei, M.smegmatis und andere). Die Färbemittelformulierungen ergeben bessere Anfärbereaktionen für MOTT (andere Mycobakterien als Tuberkulosis) im Vergleich zu den Anfärbemitteln nach Ziehl-Neelsen, Kinyoun oder den mikrodiagnostischen Anfärbemitteln.
Polyvinylpyrrolidon (PVP) wird zu den sekundären Färbemitteln aus zwei Gründen zugesetzt; (1) als Benetzungsmittel zur Erhöhung der Fähigkeit des sekundären Färbemittels zum Klären des Schmierpräparates von durch Phenol induzierten Niederschlägen des primären Färbemittels und Verunreinigungen, und (2) zur Bereitstellung eines tiefer bläulichen Farbtones zum Hintergrund. Mengen von PVP in Überschuß von 1 ml einer 0,01 (Vol./Vol.-%igen) wässrigen Lösung ergeben eine Verdickung des Gegenfärbe/Entfärbungs-Reagens, was weniger als optimales Leistungsverhalten ergibt. Glycerin liegt in dem sekundären Färbemittel als stabilisierendes Mittel vor.
Die Anwesenheit von Ethylalkohol in dem sekundären Färbemittel ist wichtig. Ohne die erforderliche Menge von Ethylalkohol werden Niederschläge des primären Färbemittels auf dem Schmierpräparat zurückgelassen, wodurch dieses für die Mikroskopie unbrauchbar gemacht wird. Ethylalkohol in Kombination mit Eisessig ist erforderlich, um die Zeit für das Gegenfärben auf etwa 2,5 bis 3 min herabzusetzen. Die Methoden nach Ziehl-Neelsen und Kinyoun erfordern vielfach Entfärbungsstufen, d.h. ein Minimum von 2 bis 3 getrennten Waschvorgängen mit saurem Alkohol und Wasser, bevor das Gegenfärbemittel aufgebracht wird.
Die meisten klinischen Schmierpräparate enthalten signifikante Mengen an NaOH. Die hohen Mengen von in den Schmierpräparaten vorliegendem Alkali neigen dazu, die Schmierpräparate während des Prozesses des primären Anfärbens "auszubrennen". Primäre Anfärbemittel, welche signifikante Mengen an basischem Fuchsin/Carbolsäure (mit oder ohne Tensiden wie Tergitol) enthalten, ätzen die Schmierpräparate in einem signifikanten Ausmaß, wenn sie in Kontakt mit Schmierpräparaten mit einem hohen Alkaligehalt belassen werden; Eisessig selbst ist nicht in der Lage, alle der geätzten Färbemittelniederschläge, selbst nach 5 min, zu entfernen. Die Menge an basischem Fuchsin in dem primären Färbemittel wird auf 2,0 g reduziert, anstelle der 4,0 g, die bei dem Kinyoun-Verfahren vorliegen. Mengen von weniger als 2,0 g an basischem Fuchsin ohne Anwendung von Hitze sind zu verdünnt, um die Mycobakterien effektiv anzufärben. Die Kombination von 2,0 g basischem Fuchsin (C.I. 42510) in 17,5 ml 95%igem Ethylalkohol und einer Endkonzentration von Phenol von etwa 6,3 % bis etwa 6,7 % in dem primären Färbemittel scheint ein primäres Färbemittel zu ergeben, das einen annehmbaren Wert des Farbstoffeindringens in die Zellen ohne unerwünschten Färbemittelniederschlag und Verätzen oder Verbrennen der Schmierpräparate ergibt, insbesondere von solchen, die aus konzentrierten klinischen Proben präpariert wurden. Alle hier verwendeten Prozentsätze beziehen sich auf Gewicht, falls nichts anderes angegeben ist.
Das sekundäre Färbemittel ergibt optimale Ergebnisse nur, wenn es mit dem primären Färbemittel der Erfindung verwendet wird, und wenn die empfohlenen Zeitspannen eingehalten werden.
Beim Gebrauch wird ein Objektträger gemäß bekannter Technologie, wie sie zur Präpatation von Sputum-Präparaten oder anderen Präparaten für die Ziehl-Neelsen-Methode oder die Kinyoun-Methode angewandt wird, präpariert. Das primäre Färbemittel der Erfindung wird dann auf das Schmierpräparat auf dem Objektträger aufgebracht, und der Objektträger wird für eine Zeitspanne von etwa 4 bis etwa 6 min inkubiert.
Das Aufbringen des primären Färbemittels erfolgt bei Umgebungstemperatur und es ist kein Erhitzen erforderlich. Das Schmierpräparat wird dann unter laufendem Leitungswasser für eine Zeitspanne von etwa 30 sec bis etwa 1 min gespült. Das Schmierpräparat wird dann mit dem sekundären Färbemittel, das gemäß Tabelle 2 hergestellt wurde, gegengefärbt, und der Objektträger wird für eine Zeitspanne von etwa 2 bis etwa 4 min inkubiert. Das Schmierpräparat wird dann gründlich abgespült, und nach dem Trocknen an Luft ist es fertig zur Beobachtung unter einem Mikroskop entsprechend den Arbeitsweisen, die für die Ziehl-Neelsen-Methode und die Kinyoun- Methode angewandt werden.

Claims

1. Färbesystem für durch Säuren nicht entfärbbare Bazillen, umfassend ein primäres Färbemittel und ein sekundäres Färbemittel, dadurch gekennzeichnet, daß das primäre Färbemittel basisches Fuchsin, Ethylalkohol, Isopropylalkohol, Phenol und Wasser umfaßt, und daß das sekundäre Färbemittel Methylenblau, Ethylalkohol, Kaliumhydroxid, Glycerin, Eisessig, Polyvinylpyrrolidon und Wasser umfaßt.

2. Färbesystem nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Eisessig mit einem Gehalt von 4 bis 5 ml pro 100 ml des sekundären Färbemittels vorhanden ist.

3. Färbesystem nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das primäre Färbemittel pro 100 ml enthält: 1,75 - 2,25 g basisches Fuchsin, 16 - 18,5 ml Ethylalkohol (95%), 0,975 - 1,025 ml Isopropylalkohol, 7,2 - 7,8 g Phenolkristalle und als Rest auf 100 ml destilliertes Wasser, und

daß das sekundäre Färbemittel pro 100 ml enthält: 0,2 - 0,25 g Methylenblau, 20 - 25 ml Ethylalkohol, 0,0025 - 0,0125 g Kaliumhydroxid, 9,5 - 10,5 ml Glycerin, 4 - 5 ml Eisessig, 0,05 - 0,1 ml Polyvinylpyrrolidon (0,01 Vol./Vol.-%ige Lösung) und als Rest auf 100 ml Wasser.

4. Färbesystem nach einem der vorhergehrenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das basische Fuchsin in dem primären Färbemittel C.I. 42510 basisches Fuchsin ist.

5. Verfahren zum Anfärben eines Objektträgers bei der Präparation zur mikroskopischen Beobachtung von durch Säuren nicht entfärbbaren Bazillen, umfassend:

(i) Präparation eines Objektträgers mit einer geeigneten mycobakteriologischen Probe;

(ii) Aufbringen eines primären Färbemittels nach einem der vorhergehenden Ansprüche auf den Objektträger;

(iii) Inkubation des Objektträgers für eine erste Periode von 4 bis 6 Minuten;

(v) Aufbringen eines sekundären Färbemittels nach einem der vorhergehenden Ansprüche auf den Objektträger;

(vi) Inkubieren des Objektträgers für eine zweite Periode von 2 bis 4 Minuten; und

(vii) Abspülen des Objektträgers.