JPH0642838B2 - 抗酸菌の改良染色法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は抗酸菌の染色系に関する。特に、本発明は酸ま
たはアルコールを利用する別々の脱色工程を必要とせず
に、迅速に染色できる抗酸菌のための染料に関する。

従来の技術 結核菌(M.tuberculosis)のごときミコバクテリアの脂質
含有細胞壁は石炭酸フクシン染料の結合が非常に強いと
いう独特の性質を持つため、アルコールおよび強酸のご
とき強力な脱色剤による脱染色に抵抗する。それ故、術
語“抗酸”は、酸またはアルコールによる脱染色に抵抗
するミコバクテリアのごときある種の型の細菌に対する
石炭酸フクシン染色反応を記述するために使用されてき
た。ミコバクテリアの抗酸染色反応は、その独特なビー
ズ状のおよびわずかに湾曲した形と共に、感染の初期検
出および治療の監視に有益な助けとなる。痰中または他
のミコバクテリアの標本中に抗酸菌が発見されるという
事は、活性な結核の推定の根拠を与える証拠と考えら
れ、治療を開始しなければならない。

本発明はチール−ネールゼン(Ziehl-Neeleen)または
“熱染色”法およびキヌヨン(Kinyoun)または“冷染
色”法と一般的に称される抗酸染色の型の改良である。
両方の方法とも、痰または他の適したミコバクテリアの
標本の試料を培養の準備のため使用する。パンクレアチ
ン、トリプシンジチオスレイトールまたは他の粘液溶解
性物質による予備的消化は、病原性菌の有意な単離の確
率を増加せしめる。急性肺炎に見い出される細菌のほと
んどが血液寒天上で良く成育するので、この培地が選択
されるべき培地である。播種されたプレートは１８から
２４時間インキユベートした後試験する。典型的なコロ
ニーを拾い、グラム染料で染色し、グラム染色に感受性
のある微生物を暫定的に同定する。

ミコバクテリアおよび他の抗酸菌はグラム染料により染
色されないので、結核が疑われる場合、抗酸染色技術を
用いる。グラム染色と同じ方法で塗抹標本を新しいスラ
イド上に調製する。スライドをチール−ネールゼン法ま
たはキヌヨン法により処理する。

チール−ネールゼン法においては石炭酸フクシン染料が
最初に調製される。石炭酸フクシン染料は0.3グラムの
塩基性フクシン、10.0ミリリットルのエチルアルコール
および９０ミリリットルの５％石炭酸水溶液からなる。
スライド塗抹標本に石炭酸フクシン染料を加え、穏かに
湯気を立てるのに十分な熱を加えながら５分間保つ。染
料を蒸発乾固せしめてはならず、必要に応じ更に染料を
添加する。その後スライドを冷却し、水にて洗浄する。
スライドは、続いて容量で３％の濃塩酸を含有する９５
％エタノール溶液にて脱色する。脱色剤は石炭酸フクシ
ン染料がもはや溶出しなくなるまで添加する。スライド
を水道水で洗浄した後メチレンブルー溶液にて１−２分
間対比染色する。メチレンブルー溶液は、0.3グラムの
メチレンブルー（色素含量９０％）および１００ｍの
蒸留水からなる。スライドを洗浄し、乾燥した後検鏡す
る。

キヌヨン法においても、チール−ネールゼン法において
使用したものと同一の対比染色およびメチレンブルー処
理を用いる。しかしながら、キヌヨン法石炭酸フクシン
染料は、４グラムの塩基性フクシン、８ミリリットルの
液化石炭酸、２０ミリリットルのエチルアルコール（９
５％）および１００ミリリットルの水からなる。キヌヨ
ン法においては、熱にてスライドを穏かに固定した後、
加熱せずに、キヌヨン石炭酸フクシン染料で５分間染料
する。洗浄、脱色および対比染色工程はチール−ネール
ゼン法と同一である。

発明が解決しようとする課題 チール−ネールゼン法およびキヌヨン法に含まれる工程
の時間および数を最小にしようとする数々の試みがなさ
れてきた。特に、メチレンブルーによる対比染色に先だ
つ酸脱色工程を省く事が望まれるであろう。しかしなが
ら、この課題の解消はこれまでのどの方法においても十
分には成しとげられていない。

課題を解決するための手段 従つて、酸またはアルコールを利用する脱色工程を必要
としない、迅速な抗酸染色法を提供するのが本発明の第
一の目的である。約１０分以内に達成できる抗酸染色法
を提供するのが本発明のもう一つの目的である。加熱を
必要としない抗酸染色技術を利用できる第１次染色を提
供するのが本発明のいま一つの目的である。

これらおよび他の目的は以下の発明の記載からより明ら
かにされよう。

本発明は、加熱が不必要で、また酸またはアルコールで
の脱色という余分な工程を必要とせずに第２のメチレン
ブルー染料で対比染色できる、抗酸染色法において使用
するための第１次石炭酸染料を提供する。好適な実施態
様においては、第１次石炭酸フクシン染色は、2.0グラ
ムの塩基性フクシン（好ましくはＣ．Ｉ．４２５１
０）、17.5ミリリットルのエチルアルコール（９５
％）、1.0ミリリットルのイソプロピルアルコール、7.5
グラムの結晶石炭酸および９０ミリリットルの蒸留水か
らなる。第１次染料をスライド上の塗抹標本に加え、加
熱する事なく５分間保つ。塗抹標本を水道の流水で洗浄
し、脱色剤および対比染料の混合物にて2.5から３分間
対比染色する。好適な実施態様においては、第２次対比
染料は0.225グラムのメチレンブルー、23.5ミリリット
ルのエチルアルコール、１０ミリリットルのグリセロー
ル、0.01グラムの水酸化カリウム、4.5ミリリットルの
氷酢酸、0.00001ミリリットルのポリビニルピロリドン
を含み、水にて１００ミリリットルとする。

スライド上の塗抹標本を十分に洗浄した後風乾し、顕微
鏡下、スライドを観察し、ミコバクテリアの抗酸染色の
徴候を探す。

本発明に従うと、２工程での抗酸染色法が提供される。
染色法は迅速であり（即ち約１０分以下）。アルコール
に溶解した濃縮酸を利用する脱色工程を必要にしない。
本発明の染色法は以下に示した表１に示した成分を示し
た含量範囲で持つ第１次染料を利用する。

第１次染料は以下の一連の工程に従つて好適に調製され
る： ａ．適量の塩基性フクシン（好適であるのはＣ．Ｉ．４
２５１０）をエチルアルコールに添加し、十分に混合せ
しめる。溶液は室温にて４８時間放置し、その間周期的
に溶液を振とうする。

ｂ．溶液にイソプロピルアルコールを添加し、よく混合
せしめる。１時間室温にて放置する。

ｃ．プレフイルターを備えた1.0ミクロンのフイルター
を通して溶液を過する。

ｄ．適量の石炭酸結晶を蒸留水に添加する。すべての石
炭酸結晶が完全に溶解するまで十分混合せしめる。

石炭酸の水溶液を色素／エタノール混合物に添加する。
十分に混合し、４時間溶液を放置する。

プレフイルターを備えた1.0ミクロンのフイルターを通
して溶液を過する（２回）。

本発明の迅速抗酸染色法は、独特の第２次染料を利用
し、それは、ミコバクテリアの試料が塗布され石炭酸フ
クシンで染色されたスライドの脱色および対比染色とい
う２つの目的で作用する。脱色および対比染色の併合工
程に使用する第２次染料は表２に示した含量範囲で示さ
れる以下の成分を含有する。

対比染料は以下の方法に従つて調製される； ａ．必要量のエチルアルコールを適した容器に入れる。

ｂ．必要量のメチレンブルーを添加し、十分に混合して
溶解せしめる。

ｃ．必要量の水酸化カリウム溶液（別に調製）を添加
し、よく混合せしめる。

ｄ．プレフイルターを備えた1.0ミクロンのフイルター
を通して上記塩基試薬を過する。

ｅ．必要量の氷酢酸を添加し、よく混合せしめる。

ｆ．必要量のグリセロールを添加し、よく混合せしめ
る。

ｇ．必要量のＰＶＰの水溶液（別に調製）を添加し、十
分に混合せしめる。

ｈ．室温にて試薬を２−３時間放置する。1.0ミクロン
のフイルターで２度過する。

弱酸であるという理由から、対比染色におけるＨＣの
代わりの脱色剤の一つとして氷酢酸（4.5ｍ）が使用
される。適量の９５％エチルアルコールと混合した場
合、得られる酸とアルコールの混合物は最適な度合いの
脱色を提供する。他の酸では抗酸桿菌、特にいくつかの
異性型のミコバクテリア（非定型型抗酸菌、亀結核菌、
恥垢菌およびその他）の脱色の程度がよくない。本染色
処方はチール−ネールゼン、キヌヨンおよび細菌診断用
染料に比較してＭＯＴＴ（結核菌以外のミコバクテリ
ア）に対しより優れた染色反応を示す。

ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）は２つの理由で添加す
る； （１）塗抹標本の石炭酸誘導第１次染料の沈殿および不
純物を一掃し、第２次染料の能力を増強する浸潤剤とし
て、および （２）より深い青みを帯びた色合いを背景に出すため。
0.01（ｖ／ｖ％）ＰＶＰ水溶液が１ｍを越えると、対
比染色／脱色試薬は粘性が高くなりその最適な働きを妨
げる事となる。第２次染料中のグリセロールは安定剤と
して加えてある。

第２次染料中にエチルアルコールが入れてある事は重要
な点である。必要量のエチルアルコールがないと、塗抹
標本上に第１次染料の沈殿が残り、顕微鏡観察に適さな
くなる。エチルアルコールは氷酢酸と共同して対比染色
の時間を約2.5から３分に減少せしめるのに必要とされ
る。チール−ネールゼンおよびキヌヨン法は多脱色工程
（即ち対比染色する前に少くとも２から３の別々の酸ア
ルコールおよび水による洗浄工程）を必要とする。

多くの臨床塗抹標本はかなりの量のＮａＯＨを含有して
いる。塗抹標本中に多量のアルカリが存在すると、第１
次染色工程の間に塗抹標本の焼けを生じる傾向がある。
相当量の塩基性フクシン／石炭酸を含む第１次染料（テ
ルジトールのごとき界面活性剤が存在してもしなくて
も）が多量のアルカリを含有する塗抹標本と接触して残
ると、相当程度塗抹標本の焼けが起き；氷酢酸のみでは
５分後でさえも焼けた染料沈殿のすべてを除去する事が
できない。第１次染料中の塩基性フクシンの量は、キヌ
ヨン法で用いる4.0ｇの代わりに2.0ｇに減量してある。
塩基性フクシンの量が2.0ｇ以下では希薄すぎて、加熱
なしではミコバクテリア株を染色できない。17.5ｍの
９５％エチルアルコールに溶解した2.0ｇの塩基性フク
シン（Ｃ．Ｌ．４２５１０）および石炭酸の最終濃度を
第１次染料の約6.3パーセントから約6.7パーセントとす
る組合せにより、望ましくない染料の沈殿および特に濃
縮臨床標本から調製される塗抹標本の焼けを起こす事な
く、細胞内への色素挿入が受け入れられる程度達成され
る。ここで用いるすべてのパーセントは特に指示しない
かぎり重量による。

第２次染料は、本発明の第１次染料と共に使用し、推奨
された時間が守られた時にのみ最適の結果を与える。使
用に際しては、チール−ネールゼン法またはキヌヨン法
のための痰または他の標本のスライドを調製するのに使
用される既知の技術に従つてスライドを調製する。本発
明の第１次染料をスライド上の塗抹標本に加え、スライ
ドを約４から約６分の間インキユベートする。第１次染
料による染色は室温で実施し、加熱を必要としない。塗
抹標本はその後水道の流水にて約３０秒から約１分の間
洗浄する。塗抹標本は続いて表２に従つて調製された第
２次染料により対比染色し、スライドを約２から約４分
の間インキユベートする。塗抹標本はその後十分に洗浄
し、風乾するとチール−ネールゼンおよびキヌヨン法で
使用される過程に従つた顕微鏡下での観察の準備は整つ
ている。

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】第１次染料および第２次染料からなる抗酸
   菌のための染色系であり、前記第１次染料は塩基性フク
   シン、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、石
   炭酸および水からなり、前記第２次染料はメチレンブル
   ー、エチルアルコール、水酸化カリウム、グリセロー
   ル、酢酸、ポリビニルピロリドンおよび水からなる上記
   染色系。
2. 【請求項２】前記第２次染料の前記酢酸が氷酢酸である
   特許請求の範囲第１項記載の染色系。
3. 【請求項３】前記氷酢酸が１００ミリリットルの第２次
   染料当り約４ミリリットルから約５ミリリットルの含量
   で存在する特許請求の範囲第２項記載の染色系。
4. 【請求項４】前記第１次染料の前記塩基性フクシンが
   Ｃ．Ｔ．４２５１０塩基性フクシンである特許請求の範
   囲第１項記載の染色系。
5. 【請求項５】前記第１次染料および前記第２次染料の成
   分が表１および表２に示された含量の範囲で存在する特
   許請求の範囲第２項記載の染色系。
6. 【請求項６】１）適したミコバクテリア学上の試料によ
   りスライドを調製し； ２）前記スライドに特許請求の範囲第１項記載の第１次
   染料を加え； ３）約４分ないし約６分間前記スライドをインキユベー
   トし； ４）前記スライドを洗浄し； ５）前記スライドに特許請求の範囲第１項記載の第２次
   染料を加え； ６）約２分ないし約４分間前記スライドをインキユベー
   トし； ７）前記スライドを洗浄することを特徴とする抗酸菌の
   顕微鏡観察のためのスライドの染色方法。
7. 【請求項７】前記２回のインキユベーシヨンを室温で行
   う特許請求の範囲第６項記載の方法。
8. 【請求項８】特許請求の範囲第２項記載の第２次染料を
   使用する特許請求の範囲第６項記載の方法。
9. 【請求項９】特許請求の範囲第３項記載の第２次染料を
   使用する特許請求の範囲第６項記載の方法。
10. 【請求項１０】特許請求の範囲第４項記載の第１次染料
    を使用する特許請求の範囲第６項記載の方法。
11. 【請求項１１】特許請求の範囲第５項記載の第１次染料
    および第２次染料を使用する特許請求の範囲第６項記載
    の方法。