JPH0657149B2 - ウレア−ゼ及びその製造法 - Google Patents
ウレア−ゼ及びその製造法Info
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- JPH0657149B2 JPH0657149B2 JP61003627A JP362786A JPH0657149B2 JP H0657149 B2 JPH0657149 B2 JP H0657149B2 JP 61003627 A JP61003627 A JP 61003627A JP 362786 A JP362786 A JP 362786A JP H0657149 B2 JPH0657149 B2 JP H0657149B2
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- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/78—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
- C12N9/80—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5) acting on amide bonds in linear amides (3.5.1)
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Description
【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は新規ウレアーゼ及びその製造方法に関する。ウ
レアーゼは尿素の定量や人工腎臓に使用されるが、本発
明ではこの用途に極めて適した性質を有するウレアーゼ
を好熱性微生物を用いて製造する。
レアーゼは尿素の定量や人工腎臓に使用されるが、本発
明ではこの用途に極めて適した性質を有するウレアーゼ
を好熱性微生物を用いて製造する。
［従来の技術及び発明が解決すべき問題点］ ウレアーゼ（E.C.3.5.1.5）は尿素を分解してアンモニ
アと炭酸ガスを生ずる反応を融媒する酵素で、植物，動
物，微生物等から広く検出されている。
アと炭酸ガスを生ずる反応を融媒する酵素で、植物，動
物，微生物等から広く検出されている。
既に、ナタマメ由来のウレアーゼ及び微生物由来のウレ
アーゼ（特開昭58-86081，特開昭59-17987）が工業的に
生産され、臨床検査試薬や人工腎臓装置等に利用されて
いる。
アーゼ（特開昭58-86081，特開昭59-17987）が工業的に
生産され、臨床検査試薬や人工腎臓装置等に利用されて
いる。
しかし、これら既知のウレアーゼに共通する欠点とし
て、その極端な不安定性があり、これに対しては各種の
対策が提案されている。
て、その極端な不安定性があり、これに対しては各種の
対策が提案されている。
具体的には、グルタチオン、エチレンジアミンテトラ酢
酸(EDTA)及びクエン酸塩を共存させる例（特開昭52-117
488）；チオール系化合物，キレート試薬，有機二塩基
酸あるいはその塩を共存させる例（特開昭57-13838
9）；ポリビニルアルコール，Ｎ−アチセル・システィ
ン及びEDTAを共存させる例（特開昭59-28498）；上記物
質にさらに２糖類を共存させる例（特開昭59-82318）等
があるが、これらによっても安定性は充分に改善された
とは云い難い。
酸(EDTA)及びクエン酸塩を共存させる例（特開昭52-117
488）；チオール系化合物，キレート試薬，有機二塩基
酸あるいはその塩を共存させる例（特開昭57-13838
9）；ポリビニルアルコール，Ｎ−アチセル・システィ
ン及びEDTAを共存させる例（特開昭59-28498）；上記物
質にさらに２糖類を共存させる例（特開昭59-82318）等
があるが、これらによっても安定性は充分に改善された
とは云い難い。
一方、好熱菌由来の酵素は一般に安定であることや培養
期間が短かい等の利点が考えられるが、ウレアーゼに関
しては好熱菌による生産の成功例は報告されていない。
期間が短かい等の利点が考えられるが、ウレアーゼに関
しては好熱菌による生産の成功例は報告されていない。
［問題点を解決するための手段］ 本発明者等は、上記の状況に鑑み、安定性の良好なるウ
レアーゼを生産する微生物を好熱菌中に探索した。
レアーゼを生産する微生物を好熱菌中に探索した。
その結果、バチルス（Bacillus）属に属するTB-90株
（以下、TB-90菌と略す。）がその培養物中に安定性の
良いウレアーゼを著量に生産することを見出し、本発明
を完成した。
（以下、TB-90菌と略す。）がその培養物中に安定性の
良いウレアーゼを著量に生産することを見出し、本発明
を完成した。
すなわち本発明は、バチルス属微生物に由来し、尿素を
加水分解する作用を有し、かつ溶液状態でpH5.8〜8.0あ
るいは56℃以下の温度で安定であり、至適pHが8.5付
近、至適温度が70℃付近であるウレアーゼと、バチルス
属に属し該ウレアーゼ生産能力のある好熱性微生物を培
養して該ウレアーゼを製造する方法とを提案するもので
ある。
加水分解する作用を有し、かつ溶液状態でpH5.8〜8.0あ
るいは56℃以下の温度で安定であり、至適pHが8.5付
近、至適温度が70℃付近であるウレアーゼと、バチルス
属に属し該ウレアーゼ生産能力のある好熱性微生物を培
養して該ウレアーゼを製造する方法とを提案するもので
ある。
TB-90菌は、本発明者等が既にウリカーゼ(E.C.1.7.3.3)
を生産することを見出して特許出願（特開昭61-280272
号公報）した発明に用いる菌株と同一である。したがっ
て、本菌株を用いてウリカーゼを発酵生産させる際、同
時に著量のウレアーゼを生産させることが出来る。これ
は、代謝経路上、尿酸がウリカーゼにより分解され、さ
らに尿素へと変換されるので、この尿素を分解するウレ
アーゼが効率よく誘導生産されるものと考えられる。し
かし、これ以外の培地組成でも本菌株がウレアーゼを生
産することは当然である。例えば、通常の培地で生育さ
せてもよいし、さらに尿素を添加すれば一層効果的であ
る。
を生産することを見出して特許出願（特開昭61-280272
号公報）した発明に用いる菌株と同一である。したがっ
て、本菌株を用いてウリカーゼを発酵生産させる際、同
時に著量のウレアーゼを生産させることが出来る。これ
は、代謝経路上、尿酸がウリカーゼにより分解され、さ
らに尿素へと変換されるので、この尿素を分解するウレ
アーゼが効率よく誘導生産されるものと考えられる。し
かし、これ以外の培地組成でも本菌株がウレアーゼを生
産することは当然である。例えば、通常の培地で生育さ
せてもよいし、さらに尿素を添加すれば一層効果的であ
る。
本発明に用いるウレアーゼ生産菌としては、バチルス属
に属し、上記したウレアーゼを生産しうる好熱性微生物
であればよい。したがって、TB-90菌のほかにその自然
的または人為的変異株ならびにこれらの菌株の遺伝子を
移された各種生物も本発明のウレアーゼ生産能を有する
限り本発明に使用することが出来る。
に属し、上記したウレアーゼを生産しうる好熱性微生物
であればよい。したがって、TB-90菌のほかにその自然
的または人為的変異株ならびにこれらの菌株の遺伝子を
移された各種生物も本発明のウレアーゼ生産能を有する
限り本発明に使用することが出来る。
次に、TB-90菌の菌学的性質を示す。本菌の菌学的性質
の検討には「微生物の分類と同定」（長谷川武治編著、
東京大学出版会）および「微生物同定法」（衛生技術
会）に記載されている方法，培地組成を用いた。
の検討には「微生物の分類と同定」（長谷川武治編著、
東京大学出版会）および「微生物同定法」（衛生技術
会）に記載されている方法，培地組成を用いた。
〔形態的所見〕（５５℃，１８時間培養） １．細胞の大きさ：短桿状、0.5〜0.8×1.3〜２μ ２．多形性：なし ３．運動性：なし ４．胞子：円形の内生胞子を細胞中央に形成する。胞子
のうはふくれない。
のうはふくれない。
５．グラム染色：陽性 ６．抗酸性：なし ７．カプセル：なし ８．異染顆粒：なし 〔生育状態〕（５５℃，１８時間培養） １．肉汁寒天平板培養 形状：円形 周縁：平滑 隆起：扁平 光沢：ややあり 表面：やや粗雑 色調：半透明 ２．肉汁寒天斜面培養 生育度：良好 形 状：糸状 ３．肉汁液体培養 表面生育：なし 濁 度：清澄 沈 渣：少量 着色，脱色：なし ４．肉汁ゼラチン穿刺培養（ゼラチンは３０％添加，５
５℃で適時培養後、冷却し固化状態を判定） 生育良好で沈渣大量であるが、ゼラチンは液化しない。
５℃で適時培養後、冷却し固化状態を判定） 生育良好で沈渣大量であるが、ゼラチンは液化しない。
５．肉汁寒天穿刺培養 形状：念珠状（表面付近） 表面生育：良好 ６．リトマスミルク リトマス褪色なく、pH不変化、ミルクの凝固，液化なし 〔生理学的性質〕（５５℃，１〜２日培養） １．硝酸塩の還元の有無：なし ２．ＭＲテスト：陰性 ３．ＶＰテスト：陰性 ４．インドールの生成：なし ５．硫化水素の生成：なし ６．デンプンの加水分解：あり ７．クエン酸の利用：なし ８．アンモニウム塩の利用：あり ９．色素の生成：なし 10.オキシダーゼ活性：あり 11.タカラーゼ活性：あり 12.生育pH：4.5〜7.5，至適pH範囲：5.0〜6.5 13.生育温度：３８〜６２℃，至適生育温度範囲：５０
〜６０℃ 14.嫌気性培地における発育性：なし 15.サブロー・デキストロース寒天培地における発育
性：良好 16.アジ化ナトリウム0.02％含有培地，５５℃培養下に
おける発育性：なし 17.リゾチーム0.001％存在下における発育性（４５℃で
試験）：なし 18.フェニルアラニンの脱アミノ反応：なし 19.塩化ナトリウムの耐性：３％では生育するが、５％
では生育しない 20.ビタミン要求性の有無：あり 21.チロジンの分解性：なし 〔炭素源の利用性〕 Ｄ−キシロース，Ｄ−グルコース，Ｄ−ガラクトース，
トレハロース，セロビオース，グリセリンを資化して増
殖し、酸を生成する。
〜６０℃ 14.嫌気性培地における発育性：なし 15.サブロー・デキストロース寒天培地における発育
性：良好 16.アジ化ナトリウム0.02％含有培地，５５℃培養下に
おける発育性：なし 17.リゾチーム0.001％存在下における発育性（４５℃で
試験）：なし 18.フェニルアラニンの脱アミノ反応：なし 19.塩化ナトリウムの耐性：３％では生育するが、５％
では生育しない 20.ビタミン要求性の有無：あり 21.チロジンの分解性：なし 〔炭素源の利用性〕 Ｄ−キシロース，Ｄ−グルコース，Ｄ−ガラクトース，
トレハロース，セロビオース，グリセリンを資化して増
殖し、酸を生成する。
アラビノース，マンノース，フラクトース，マルトー
ス，シュークロース，ラクトース，Ｄ−ソルビトール，
Ｄ−マンニトール，デンプン，２−ケトーグルコネー
ト，アドニトール，キシリトール，メチル−Ｄ−グルコ
シド，Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン，メレチトー
ス，ラフィノースの利用性は微弱またはなし。
ス，シュークロース，ラクトース，Ｄ−ソルビトール，
Ｄ−マンニトール，デンプン，２−ケトーグルコネー
ト，アドニトール，キシリトール，メチル−Ｄ−グルコ
シド，Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン，メレチトー
ス，ラフィノースの利用性は微弱またはなし。
以上の微生物の菌学的諸性質から、バージェイズ・マニ
ュアル・オブ・デタミナティブ・バクテリオロジー（第
８版，１９７４年）〔Bergey′s manual of Determinat
ive Bacteriology 8th edition(1974)〕の分類方法に従
って検索し、前記TB-90菌をバチルス属と同定した。次
に、公知のバチルス属の菌種と比較するとき、前記TB-9
0菌はその生育温度範囲からバチルス・ステアロサーモ
フィラス（Bacillus stearothermophilus），バチルス
・コアギュランス（B.coagnlans）およびバチルス・ブ
レビス（B.brevis）のいずれかと考えられるが、TB-90
菌は運動性がない点で上記いずれの菌とも異なってい
る。さらに、バチルス・ステアロサーモフィラスとはサ
ブロー・デキストロース培地で生育する点で、バチルス
・コアギュランスとは嫌気寒天培地および0.02％アジ化
ナトリウム存在下で生育しない点で、またバチルス・ブ
レビスとはキシロースから酸を生成する点、ＶＰ培地で
アルカリを生産しない点、カゼインおよびチロシンを分
解しない点でそれぞれ異なっている。
ュアル・オブ・デタミナティブ・バクテリオロジー（第
８版，１９７４年）〔Bergey′s manual of Determinat
ive Bacteriology 8th edition(1974)〕の分類方法に従
って検索し、前記TB-90菌をバチルス属と同定した。次
に、公知のバチルス属の菌種と比較するとき、前記TB-9
0菌はその生育温度範囲からバチルス・ステアロサーモ
フィラス（Bacillus stearothermophilus），バチルス
・コアギュランス（B.coagnlans）およびバチルス・ブ
レビス（B.brevis）のいずれかと考えられるが、TB-90
菌は運動性がない点で上記いずれの菌とも異なってい
る。さらに、バチルス・ステアロサーモフィラスとはサ
ブロー・デキストロース培地で生育する点で、バチルス
・コアギュランスとは嫌気寒天培地および0.02％アジ化
ナトリウム存在下で生育しない点で、またバチルス・ブ
レビスとはキシロースから酸を生成する点、ＶＰ培地で
アルカリを生産しない点、カゼインおよびチロシンを分
解しない点でそれぞれ異なっている。
以上の事項から明らかなように、TB-90菌は公知の菌種
と区別されるため、これを新菌種と判定することが適当
である。TB-90菌は工業技術院微生物工業技術研究所にF
ERM BP-795として寄託されている。
と区別されるため、これを新菌種と判定することが適当
である。TB-90菌は工業技術院微生物工業技術研究所にF
ERM BP-795として寄託されている。
本発明のウレアーゼ生産能を有する微生物を栄養培地に
培養し、培養物中に該ウレアーゼを生成せしめ、これを
採取することによって目的とするウレアーゼが得られ
る。
培養し、培養物中に該ウレアーゼを生成せしめ、これを
採取することによって目的とするウレアーゼが得られ
る。
本発明に使用する栄養培地としては、炭素源，窒素源，
無機物及び必要に応じ使用菌株の必要とする微量栄養素
を程よく含有するものであれば天然及び合成培地のいず
れでもよい。
無機物及び必要に応じ使用菌株の必要とする微量栄養素
を程よく含有するものであれば天然及び合成培地のいず
れでもよい。
炭素源としてはグルコース，キシロース，ガラクトー
ク，グリセリン等の炭水化物や尿酸などが用いられる。
ク，グリセリン等の炭水化物や尿酸などが用いられる。
窒素源としては硫安，塩安，硝酸ソーダ，尿素等の有機
化成品，グルタミン酸などのアミノ酸やペプチド，肉エ
キス，酵母エキス，大豆粉，鶏糞等の含窒素天然物や尿
酸などが使用出来る。
化成品，グルタミン酸などのアミノ酸やペプチド，肉エ
キス，酵母エキス，大豆粉，鶏糞等の含窒素天然物や尿
酸などが使用出来る。
その他無機物としては各種リン酸塩、硫酸マグネシウ
ム，硫酸第１鉄などの各種硫酸塩、塩化ナトリウム，塩
化カリウム等の各種塩酸塩やゼオライト，カオリン，そ
の他が用いられ、菌の増殖と酵素生成を促進する。
ム，硫酸第１鉄などの各種硫酸塩、塩化ナトリウム，塩
化カリウム等の各種塩酸塩やゼオライト，カオリン，そ
の他が用いられ、菌の増殖と酵素生成を促進する。
その他にビオチン，チアミン等の微量栄養素を必要に応
じて使用する。
じて使用する。
培養法としては、固体培養，液体培養のいずれも可能で
あるが、工業的には通気攪拌培養法が最も適している。
あるが、工業的には通気攪拌培養法が最も適している。
培養は38〜62℃の範囲の温度で行うことが出来るが、50
〜55℃が好適である。pHは中性乃至弱酸性が望ましい。
〜55℃が好適である。pHは中性乃至弱酸性が望ましい。
培養時間は条件によって変って来るが、通常は６時間か
ら20時間であり、ウレアーゼの生成が確認された時、好
ましくは生成が最大に達した時に培養を停止する。
ら20時間であり、ウレアーゼの生成が確認された時、好
ましくは生成が最大に達した時に培養を停止する。
本酵素は主として菌体中に生成されるが、培養後期には
培地中にも蓄積される。
培地中にも蓄積される。
培養物中からのウレアーゼの採取は適宜既知の方法を組
み合せて実施すれば、たとえば培養終了後、培養物中か
ら菌体を遠心分離などにより取得し、次いでこの菌体か
ら適当な手段でウレアーゼを抽出する。遠心分離等によ
ってこの抽出液を処理して不溶性成分を除去した後、酸
沈殿，有機溶媒沈殿，塩析，透析、さらには各種クロマ
トグラフィー（イオン交換法，ゲル過法，疎水クロマ
ト法，アフィニテイ・クロマト法等）によって精製す
る。かくして、純度の高いウレアーゼを取得することが
出来る。
み合せて実施すれば、たとえば培養終了後、培養物中か
ら菌体を遠心分離などにより取得し、次いでこの菌体か
ら適当な手段でウレアーゼを抽出する。遠心分離等によ
ってこの抽出液を処理して不溶性成分を除去した後、酸
沈殿，有機溶媒沈殿，塩析，透析、さらには各種クロマ
トグラフィー（イオン交換法，ゲル過法，疎水クロマ
ト法，アフィニテイ・クロマト法等）によって精製す
る。かくして、純度の高いウレアーゼを取得することが
出来る。
次に、本発明のウレアーゼの性質を示す。なお、標品と
しては後記実施例１で得られた酵素を使用した。また、
酵素力価の測定には以下の２種の方法を使い分けて実施
した。
しては後記実施例１で得られた酵素を使用した。また、
酵素力価の測定には以下の２種の方法を使い分けて実施
した。
力価の測定法： ClDH法 尿素（100mM），トリス塩酸緩衝液（40mM,pH8.0），α
−ケトグルタール酸（0.88mM），NADPH(0.31mM)，グル
タメート・デヒドロゲナーゼ（ClDH）（17.2U／ml）か
らなる反応液を37℃で恒温にした後、測定すべき酵素液
を添加して反応を開始し、37℃における吸光度Ｅ340nm
の減少速度を測定した（濃度はいずれも最終濃度で示し
た。）NADPHの減少速度を吸光度Ｅ340nmの減少速度より
求め、これからウレアーゼの作用により生成したアンモ
ニア量を計算した。
−ケトグルタール酸（0.88mM），NADPH(0.31mM)，グル
タメート・デヒドロゲナーゼ（ClDH）（17.2U／ml）か
らなる反応液を37℃で恒温にした後、測定すべき酵素液
を添加して反応を開始し、37℃における吸光度Ｅ340nm
の減少速度を測定した（濃度はいずれも最終濃度で示し
た。）NADPHの減少速度を吸光度Ｅ340nmの減少速度より
求め、これからウレアーゼの作用により生成したアンモ
ニア量を計算した。
なお、酵素活性は１分間に２μmoleのアニモニアを生成
する酵素量を１単位（１Ｕ）とした。この定義は前述の
ClDH法記載の条件で行った実験にもとづいて算出した。
する酵素量を１単位（１Ｕ）とした。この定義は前述の
ClDH法記載の条件で行った実験にもとづいて算出した。
また、ClDH法を適用出来ない場合、例えば至適pH，至適
温度，阻害剤の検討の際には、下記のインドフェノール
法で反応中に生産されるアンモニア量を測定した。
温度，阻害剤の検討の際には、下記のインドフェノール
法で反応中に生産されるアンモニア量を測定した。
インドフェノール法 後述の各実験条件で反応させて反応中に生じたアンモニ
アをインドフェノール法で測定した。具体的な測定に
は、「最新医学」21巻，３号，622頁（昭41）記載の方
法を用いた。本法の吸光度（Ｅ625nm）とアンニモア濃
度は直線関係にならないので、検量線を作成して用い
た。
アをインドフェノール法で測定した。具体的な測定に
は、「最新医学」21巻，３号，622頁（昭41）記載の方
法を用いた。本法の吸光度（Ｅ625nm）とアンニモア濃
度は直線関係にならないので、検量線を作成して用い
た。
酵素の性質： (1)作用 １モルの尿素より１モルの水を消費して２モルのアンニ
モアと１モルの炭酸ガスを生成する。
モアと１モルの炭酸ガスを生成する。
(2)至適pH 尿素濃度を100mMとし、バッファーは50mMのリン酸緩衝
液を使用した。試験したpHは第１図に示した。酵素は２
mlの反応液当り100mU使用した。
液を使用した。試験したpHは第１図に示した。酵素は２
mlの反応液当り100mU使用した。
反応は、37℃で５分間実施し、前述のインドフェノール
法で生じたアンモニアを定量した。最大活性を100と
し、各pHにおける相対活性を第１図に示した。
法で生じたアンモニアを定量した。最大活性を100と
し、各pHにおける相対活性を第１図に示した。
図から明らかな通り、本酵素の至適pHは8.5付近であっ
た。
た。
(3)至適温度 50mMリン酸緩衝液（pH7.5）を用い、第２図に示す各温
度で反応させた。その他の条件，測定法は前述(2)至適p
Hの場合と同様である。
度で反応させた。その他の条件，測定法は前述(2)至適p
Hの場合と同様である。
最も活性の高い値を100とした場合の各温度における相
対活性を第２図に示した。
対活性を第２図に示した。
図から明らかなように、本酵素の至適温度は70℃付近で
あることが判明した。
あることが判明した。
(4)安定pH範囲 酵素標品を第３図に示す各種pHの酸ユニバーサル緩衝液
（Data for Biochemical Research、R.M.C.Dawson等編、
Oxford Press、1969年、485頁）に200mU/mlになるように
溶解した。
（Data for Biochemical Research、R.M.C.Dawson等編、
Oxford Press、1969年、485頁）に200mU/mlになるように
溶解した。
次いで、各酵素溶液を37℃で17時間保った後、前述のCl
DH法で残存活性を測定した。試験開始時（すなわち、無
処理）の活性を100とした場合の各pHにおける相対残存
活性を第３図に示した。
DH法で残存活性を測定した。試験開始時（すなわち、無
処理）の活性を100とした場合の各pHにおける相対残存
活性を第３図に示した。
図から明らかなように、本酵素はpH5.8〜8.0の緩衝液中
で活性を完全に維持した。なお、対照としてナタマメ由
来の市販ウレアーゼを同時に供試したが、いずれのpHで
も活性は完全に消失し、本酵素の有用性が明らかとなっ
た。
で活性を完全に維持した。なお、対照としてナタマメ由
来の市販ウレアーゼを同時に供試したが、いずれのpHで
も活性は完全に消失し、本酵素の有用性が明らかとなっ
た。
(5)安定温度範囲 酵素標品を50mMリン酸緩衝液（pH7.0）に200mU/mlにな
るように溶解し、第４図に示した各温度で15時間保った
後、前述のClDH法により残存活性を測定した。
るように溶解し、第４図に示した各温度で15時間保った
後、前述のClDH法により残存活性を測定した。
試験開始時（すなわち、無処理）の活性を100とした場
合の各温度処理試料の相対残存活性を第４図に示した。
本酵素は50℃以下の温度処理では活性を完全に維持し
た。
合の各温度処理試料の相対残存活性を第４図に示した。
本酵素は50℃以下の温度処理では活性を完全に維持し
た。
(6)保存安定性 酵素標品を50mMのリン酸緩衝液（pH7.0）に180mU/mlに
なるように溶解し、20℃で保存した。経時的にClDH法を
用いて残存活性を測定し、実験開始時の活性を100とし
たときの活性の経時的変化を第５図に示した。対照のナ
タマメ由来のウレアーゼは速やかに活性を喪失したが、
TB-90株由来のウレアーゼは活性を完全に維持し、その
有用性が明らかとなった。
なるように溶解し、20℃で保存した。経時的にClDH法を
用いて残存活性を測定し、実験開始時の活性を100とし
たときの活性の経時的変化を第５図に示した。対照のナ
タマメ由来のウレアーゼは速やかに活性を喪失したが、
TB-90株由来のウレアーゼは活性を完全に維持し、その
有用性が明らかとなった。
(7)基質特異性 ClDH法を用いて尿素の代りに表１に記載した構造関連物
質に対する酵素標品の活性を示した。
質に対する酵素標品の活性を示した。
(8)阻害剤 500mMのリン酸緩衝液（pH8.5）に最終濃度１mMの各金属
塩化物及び100mMの尿素を溶解し、37℃で恒温にした
後、最終濃度3.6mU/mlの酸素標品を加えて15分間反応さ
せ、この間に生じたアンモニアをインドフェノール法で
測定した。マグネシウム，カルシウム，ストロンチウ
ム，バリウム，アルミニウム，スズ，鉛，銀，マンガ
ン，鉄（II），鉄（III），ナトリウム，カリウム，リ
チウムは殆んど阻害しないか、あるいは活性化した。し
かし、銅，亜鉛，水銀は著しく酵素活性を阻害したの
で、これらについて添加量を変えて阻害試験を行った。
結果を表２にまとめた。
塩化物及び100mMの尿素を溶解し、37℃で恒温にした
後、最終濃度3.6mU/mlの酸素標品を加えて15分間反応さ
せ、この間に生じたアンモニアをインドフェノール法で
測定した。マグネシウム，カルシウム，ストロンチウ
ム，バリウム，アルミニウム，スズ，鉛，銀，マンガ
ン，鉄（II），鉄（III），ナトリウム，カリウム，リ
チウムは殆んど阻害しないか、あるいは活性化した。し
かし、銅，亜鉛，水銀は著しく酵素活性を阻害したの
で、これらについて添加量を変えて阻害試験を行った。
結果を表２にまとめた。
(9)分子量 セファデックスG-200によるゲル過では約240,000であ
った。
った。
(10)Ｋｍ値 約0.3mM（前記GlOH法の条件による） なお、実用上の目的の為には、充分に精製されたが、単
一の酵素タンパクとして結晶化させるには至っていな
い。したがって、元素分析値，結晶構造等については明
らかにされていない。
一の酵素タンパクとして結晶化させるには至っていな
い。したがって、元素分析値，結晶構造等については明
らかにされていない。
本発明のウレアーゼは安全性に優れている。前述の(6)
保存安定性及び第５図にてナタマメ由来のウレアーゼと
比較した実験例を示したが、中温菌バチルス属によるウ
レアーゼの例（特開昭59-17987）では、５℃，４日間の
保存で活性が70〜75％に減少するとされていることから
も、本発明のウレアーゼの有用性は明らかである。な
お、本発明のウレアーゼは５℃で保存の場合、３ケ月間
全く活性を減じなかった。
保存安定性及び第５図にてナタマメ由来のウレアーゼと
比較した実験例を示したが、中温菌バチルス属によるウ
レアーゼの例（特開昭59-17987）では、５℃，４日間の
保存で活性が70〜75％に減少するとされていることから
も、本発明のウレアーゼの有用性は明らかである。な
お、本発明のウレアーゼは５℃で保存の場合、３ケ月間
全く活性を減じなかった。
また、本発明のウレアーゼはＫｍが小さい為、例えば人
工腎臓への組み込みや臨床検査薬として血清中の尿素定
量に利用することが出来る。
工腎臓への組み込みや臨床検査薬として血清中の尿素定
量に利用することが出来る。
［発明の効果］ 本発明の酵素ウレアーゼは、好熱性微生物に由来する
為、著しく安定性にすぐれている。しかも、Ｋｍ値が小
さい等の性質を有している。その為、従来のナタマメ由
来のウレアーゼを使用している各種製品、例えば人工腎
臓，臨床検査試薬キットが、特に安定化剤を配合した
り、低温保存を必要とするといった様な繁雑さを著しく
軽減することができる。また、Ｋｍが小さい為、酵素使
用量を著しく少なく出来ることも本発明の特色の１つで
ある。さらに、本酵素の製造にあたり好熱性微生物を用
いている為、短時間で効率よく行うことが出来る。
為、著しく安定性にすぐれている。しかも、Ｋｍ値が小
さい等の性質を有している。その為、従来のナタマメ由
来のウレアーゼを使用している各種製品、例えば人工腎
臓，臨床検査試薬キットが、特に安定化剤を配合した
り、低温保存を必要とするといった様な繁雑さを著しく
軽減することができる。また、Ｋｍが小さい為、酵素使
用量を著しく少なく出来ることも本発明の特色の１つで
ある。さらに、本酵素の製造にあたり好熱性微生物を用
いている為、短時間で効率よく行うことが出来る。
［実施例］ 次に、本発明を実施例により詳しく説明する。
実施例１ 種菌として、TB-90菌（FERM BP-795）を使用した。
グルコース１ｇ／dl，酵母エキス１ｇ／dl，ペプトン１
ｇ／dlからKH2PO4 1g/dl，K2HPO4 1g/dl，MgSO4・７H2O
0.5g/dl及び水道水からなる種培養培地(pH6.5)10mlを
大型試験管に入れ、121℃で15分間滅菌後、該培地に前
記菌株を１白金耳接種し、55℃で６時間振盪培養した。
ｇ／dlからKH2PO4 1g/dl，K2HPO4 1g/dl，MgSO4・７H2O
0.5g/dl及び水道水からなる種培養培地(pH6.5)10mlを
大型試験管に入れ、121℃で15分間滅菌後、該培地に前
記菌株を１白金耳接種し、55℃で６時間振盪培養した。
前記前培養30mlを５容のジャー・ファーメンター中の
1.5の生産培地（グルコース３ｇ／dl，酵母エキス１
ｇ／dl，ペプトン0.5g/dl，尿酸４ｇ／dl，KH2PO4 1g/d
l，Mgaso4・７H2O 0.5g/dl，大豆油0.5g/dl及び水道水
からなる）に加え、55℃，300rpm，通気量１／培地
の条件で本培養を行い、13時間で培養を終了した。
1.5の生産培地（グルコース３ｇ／dl，酵母エキス１
ｇ／dl，ペプトン0.5g/dl，尿酸４ｇ／dl，KH2PO4 1g/d
l，Mgaso4・７H2O 0.5g/dl，大豆油0.5g/dl及び水道水
からなる）に加え、55℃，300rpm，通気量１／培地
の条件で本培養を行い、13時間で培養を終了した。
培養終了後、この培養物の最終濃度0.1％相当のTritonX
-100を加えて、１晩７〜８℃でウレアーゼを抽出した。
この抽出物を遠心分離（10,000Ｇ，15分間）して、上清
液を得た。上清液中のウレアーゼ活性は20U/mlであった
（上清液1.3，全活性26,000Ｕ）。
-100を加えて、１晩７〜８℃でウレアーゼを抽出した。
この抽出物を遠心分離（10,000Ｇ，15分間）して、上清
液を得た。上清液中のウレアーゼ活性は20U/mlであった
（上清液1.3，全活性26,000Ｕ）。
この上清液をアミコン・ホロー・ファイバー・カートリ
ッジ（Ｈ10Ｐ10-20 25）で濃縮し、さらに10mMリン酸緩
衝液pH6.0と置換した（最終液量200ml）。この濃縮液に
80mlのDEAEトヨパール650Ｍ（Cl型）を投入し、30分間
室温で攪拌した後、ガラスフィルター上で未吸着部を10
mMリン酸バッファー（pH6.0）で洗滌除去した。紫外線
（280nm）の吸収が洗滌液中に検出されなくなる迄、該
樹脂を繰り返し洗滌した後、直径2.5cmのカラムに樹脂
を充填した。
ッジ（Ｈ10Ｐ10-20 25）で濃縮し、さらに10mMリン酸緩
衝液pH6.0と置換した（最終液量200ml）。この濃縮液に
80mlのDEAEトヨパール650Ｍ（Cl型）を投入し、30分間
室温で攪拌した後、ガラスフィルター上で未吸着部を10
mMリン酸バッファー（pH6.0）で洗滌除去した。紫外線
（280nm）の吸収が洗滌液中に検出されなくなる迄、該
樹脂を繰り返し洗滌した後、直径2.5cmのカラムに樹脂
を充填した。
酵素の回収は10mMリン酸緩衝液（pH6.0）500ml及びこれ
に、0.2Ｍ相当の食塩を加えた溶液を用いて直線濃度勾
配溶出により行った。ウレアーゼは食塩0.15Ｍ付近で溶
出した。
に、0.2Ｍ相当の食塩を加えた溶液を用いて直線濃度勾
配溶出により行った。ウレアーゼは食塩0.15Ｍ付近で溶
出した。
この分画を合せて１Ｍ相当になるように硫酸ナトリウム
を加えて溶解したのち、予め１Ｍ硫酸ナトリウムを含有
する10mMリン酸緩衝液（pH7.0）で平衡化したブチル・
トヨパール650Ｃのカラム（直径2.5cm、実効長さ10cm）
に通塔して酵素を吸着させた。１Ｍ硫酸ナトリウムを含
有する10mMリン酸緩衝液（pH7.0）で紫外線（280nm）吸
収がなくなる迄、通液して該樹脂を洗滌した後、硫酸ナ
トリウム濃度を減少させつつ溶出を行った。
を加えて溶解したのち、予め１Ｍ硫酸ナトリウムを含有
する10mMリン酸緩衝液（pH7.0）で平衡化したブチル・
トヨパール650Ｃのカラム（直径2.5cm、実効長さ10cm）
に通塔して酵素を吸着させた。１Ｍ硫酸ナトリウムを含
有する10mMリン酸緩衝液（pH7.0）で紫外線（280nm）吸
収がなくなる迄、通液して該樹脂を洗滌した後、硫酸ナ
トリウム濃度を減少させつつ溶出を行った。
ウレアーゼ分画を合せて限外過システム（旭化成ミニ
・モジュールMM-3）で濃縮した（約２ml）。これを10mM
リン酸緩衝液（pH7.0）で予め平衡化したトヨパールHW-
55Ｆ（直径2.5cm、実効長さ70cm）のカラムを用いてゲ
ル過してウレアーゼを得た。この分画を凍結乾燥し、
精製ウレアーゼ粉末を得た（比活性３Ｕ／mgタンパ
ク）。培養液抽出物からの活性回収率は40％であった。
なお、この酵素標品の性質は前記したとおりである。
・モジュールMM-3）で濃縮した（約２ml）。これを10mM
リン酸緩衝液（pH7.0）で予め平衡化したトヨパールHW-
55Ｆ（直径2.5cm、実効長さ70cm）のカラムを用いてゲ
ル過してウレアーゼを得た。この分画を凍結乾燥し、
精製ウレアーゼ粉末を得た（比活性３Ｕ／mgタンパ
ク）。培養液抽出物からの活性回収率は40％であった。
なお、この酵素標品の性質は前記したとおりである。
第１図は本発明のウレアーゼの至適pHを、第２図は該ウ
レアーゼの作用至適温度を、第３図は該ウレアーゼの安
定pH範囲を、第４図は該ウレアーゼの安定温度範囲を、
第５図は該ウレアーゼの保存安定性をそれぞれ示すグラ
フである。
レアーゼの作用至適温度を、第３図は該ウレアーゼの安
定pH範囲を、第４図は該ウレアーゼの安定温度範囲を、
第５図は該ウレアーゼの保存安定性をそれぞれ示すグラ
フである。
Claims (3)
- 【請求項１】バチルス属微生物に由来し、尿素を加水分
解する作用を有し、かつ溶液状態でpH5.8〜8.0あるいは
56℃以下の温度で安定であり、至適pHが8.5付近、至適
温度が70℃付近であるウレアーゼ。 - 【請求項２】バチルス属に属し、尿素を加水分解する作
用を有し、かつ溶液状態でpH5.8〜8.0あるいは56℃以下
の温度で安定であり、至適pHが8.5付近、至適温度が70
℃付近であるウレアーゼを生産する能力のある好熱性微
生物を栄養培地に培養し、培養物中に該ウレアーゼを生
成せしめ、これを採取することを特徴とするウレアーゼ
の製造法。 - 【請求項３】バチルス属に属するウレアーゼ生産能を有
する好熱性微生物が、バチルス・エスピーＴＢ−９０(F
ERM BP-795)である特許請求の範囲第２項記載の方法。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61003627A JPH0657149B2 (ja) | 1986-01-13 | 1986-01-13 | ウレア−ゼ及びその製造法 |
| US06/891,258 US4753882A (en) | 1986-01-13 | 1986-07-28 | Urease and process for preparation thereof |
| DE8686111018T DE3685209D1 (de) | 1986-01-13 | 1986-08-09 | Urease und verfahren zu deren herstellung. |
| EP86111018A EP0229219B1 (en) | 1986-01-13 | 1986-08-09 | Urease and process for preparation thereof |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61003627A JPH0657149B2 (ja) | 1986-01-13 | 1986-01-13 | ウレア−ゼ及びその製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS62175174A JPS62175174A (ja) | 1987-07-31 |
| JPH0657149B2 true JPH0657149B2 (ja) | 1994-08-03 |
Family
ID=11562732
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61003627A Expired - Lifetime JPH0657149B2 (ja) | 1986-01-13 | 1986-01-13 | ウレア−ゼ及びその製造法 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4753882A (ja) |
| EP (1) | EP0229219B1 (ja) |
| JP (1) | JPH0657149B2 (ja) |
| DE (1) | DE3685209D1 (ja) |
Families Citing this family (8)
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|---|---|---|---|---|
| JPH0671425B2 (ja) * | 1985-06-05 | 1994-09-14 | サッポロビール株式会社 | ウリカ−ゼおよびその製造法 |
| DE3884295T2 (de) * | 1987-07-09 | 1994-01-20 | Takeda Chemical Industries Ltd | Säure-Urease und ihre Herstellung. |
| JPH088867B2 (ja) * | 1987-11-17 | 1996-01-31 | サントリー株式会社 | 新規ウレアーゼ及びその製造方法 |
| US5298399A (en) * | 1990-08-10 | 1994-03-29 | Sapporo Breweries Limited | Gene and process for producing a thermostable urease |
| EP0654273A1 (en) * | 1993-11-18 | 1995-05-24 | Harry H. Leveen | Pharmaceutical product and method for treatment |
| JP3674015B2 (ja) * | 1996-10-02 | 2005-07-20 | 日東紡績株式会社 | 尿素窒素の測定方法およびその測定用キット |
| NO331200B1 (no) * | 2009-12-21 | 2011-10-31 | Temasi As | Framgangsmate for stabilisering av sand |
| CN107854495B (zh) * | 2017-08-04 | 2021-04-13 | 青岛东海药业有限公司 | 凝结芽孢杆菌在制备降低血尿酸制剂中的应用 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6055119B2 (ja) * | 1981-11-13 | 1985-12-03 | 協和醗酵工業株式会社 | 発酵法によるウレア−ゼの製造法 |
| JPS5917987A (ja) * | 1982-07-23 | 1984-01-30 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | ウレア−ゼおよびその製造法 |
| JPH0659216B2 (ja) * | 1985-05-10 | 1994-08-10 | 寶酒造株式会社 | 新規ウレア−ゼおよびその製造法 |
-
1986
- 1986-01-13 JP JP61003627A patent/JPH0657149B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1986-07-28 US US06/891,258 patent/US4753882A/en not_active Expired - Fee Related
- 1986-08-09 DE DE8686111018T patent/DE3685209D1/de not_active Expired - Fee Related
- 1986-08-09 EP EP86111018A patent/EP0229219B1/en not_active Expired
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0229219A3 (en) | 1988-12-21 |
| US4753882A (en) | 1988-06-28 |
| DE3685209D1 (de) | 1992-06-11 |
| EP0229219B1 (en) | 1992-05-06 |
| JPS62175174A (ja) | 1987-07-31 |
| EP0229219A2 (en) | 1987-07-22 |
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