DE4000247C2

DE4000247C2 -

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Publication number: DE4000247C2
Application number: DE19904000247
Authority: DE
Inventors: Klaus Dipl.-Biol. 6350 Bad Nauheim De Dreyer; Heinrich Prof. Dr. 4300 Essen De Schulte-Holthausen
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1990-01-06
Filing date: 1990-01-06
Publication date: 1992-09-03
Also published as: DE4000247A1

Description

Die Erfindung betrifft ein Enzymreaktionsverfahren mit einer die Enzymaktivität verbessernden Zusatzkomponente, wobei das betreffende Enzym nukleotidhaltige Moleküle, insbesondere Polynukleinsäuren als Substrat hat.

Reaktionslösungen für die obengenannten Enzymreaktionen ent halten neben den obligatorischen Pufferkomponenten: pH-ein gestellten Good-Puffer, NaCl, MgCl₂, etc. (siehe: Maniatis, T., Fritsch, E.F., Sambrook, J. (1982) "Molecular Cloning", S. 104ff, 453ff), oft auch Zusätze, die zwar kein Cofaktor oder Co substrat sind, aber die Enzymreaktion beschleunigen oder das Enzym in der Reaktionslösung stabilisieren (Davies,L.G., Dib ner, M.D., Battey, J.F. (1986) "Basic Methods in Molecular Bio logy" (Elsevier Science Publishing Co., Inc., New York) S. 52-53; McCelland, M., Hanish, J., Nelson, M., Patel, Y. (1988) Nucl. Acids Res., 18 (1), 364ff; Dillely, A.G., Woo, S.L.C. (1985) Focus (Bethesda Research Laboratories, USA) 7 (2), 1ff). Be kannte Zusätze sind bspw.: bovines Serumalbumin, Spermidin, Polyethylenglykol, Dithioerythrit, Mercaptoethanol, Inhibito ren, wie placentaler RNAse-Inhibitor, Proteaseinhibitoren, wie Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF), DNAse-Inhibitoren, etc.

Ferner können auch einzelne Komponenten der Pufferlösung, wie z. B. Natriumchlorid, durch physiologisch verwandte Substanzen ersetzt werden; anstelle von Natriumchlorid wird bspw. Kali umglutamat empfohlen. Solche Sonderzusätze sind aber nur bei bestimmten einzelnen Enzymreaktionen förderlich. Bei anderen Reaktionstypen besitzen sie hingegen zumeist eine schädliche, d. h. inhibierende Wirkung und können auch eine Reaktion voll ständig verhindern. So fördert bspw. dibasisches Spermidin die Ligation von Oligonukleotiden; es inhibiert aber die Re striktion von hochmolekularer DNA, weil damit die DNA-Stränge zu einem unlöslichen Präzipitat vernetzt werden. Manche der Zusätze, wie z. B. Kaliumglutamat oder PMSF, beeinflussen auch bei der gelelektrophoretischen Auftrennung das Laufverhalten der Reaktionsprodukte, z. B. DNA-Fragmente, so daß sie wegen der damit verbundenen Probleme zum allgemeinen Gebrauch unge eignet sind.

Kommerzielle Enzymhersteller vermeiden daher möglichst Son derzusätze in den Reaktionslösungen - bzw. den Vorschriften und Empfehlungen dazu -, weil stets Risiken und Nachteile damit verbunden sind: Unwissenheit der Anwender über die Be sonderheiten der einzelnen Enzyme; Verwechslungsgefahr; Kon taminationsgefahr; zusätzlicher Aufwand bei der Herstellung der Reaktionspuffer; ungenügender Reinheitsgrad der Sonder komponenten; Lagerinstabilitäten, etc. Außerdem sind einige der Sonderzusätze schwer herzustellen und sehr teuer.

Bei forensischen und klinischen Untersuchungen müssen aber oft große Mengen genomischer DNA mit verschiedenen DNA-Re striktionsendonukleasen gespalten werden. Da aber die meisten Restriktionsenzyme sehr teuer sind, ist es aus Kostengründen erwünscht, die Enzymaktivität mittels eines Sonderzusatzes zu stabilisieren oder ggf. zu erhöhen, wobei die Zusatzkomponen te vergleichsweise preiswert sein sollte. Da derartige Enzym reaktionen oft sehr schwer und nur bei großen Enzymmengen ab laufen, bestand deshalb ein Bedürfnis nach einem allgemein besseren und kostengünstigen Enzymreaktionsverfahren.

Diese Aufgabe wird durch das Enzymreaktionsverfahren nach Patentanspruch 1 gelöst. Weitere Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens ergeben sich aus den Unteransprüchen.

Die Zusatzkomponente bei dem erfindungsgemäßen Reaktionsverfahren besteht aus Milch oder deren Bestandteilen (vgl. Anspruch 1). Unter wirtschaftlichen Gesichtspunkten dürfte dabei Kuhmilch bevorzugt sein.

Die Zusatzkomponente bei dem erfindungsgemäßen Reaktionsverfahren bewirkt nicht nur eine Erhöhung der Enzymaktivität, insbesondere bei Restriktionsendonukleasen, sondern auch, daß die Reaktion mit dem Substrat vollständiger abläuft. So erfolgt bspw. in vielen Fällen der Restriktionsverdau von menschlicher genomischer DNA nur unvollständig - die Gründe hierfür sind nicht ganz verstanden -, was dann zu falschen Ergebnissen bei der Untersuchung der Restriktionsfragmentlängenpolymorphismen (RFLP′s) in der genomischen DNA führt. Die erfindungsgemäß eingesetzte Sonderkomponente im Restriktionspuffer bewirkt hingegen eine Stabilisierung und Erhöhung der eingesetzten Enzymaktivität, so daß die genomische DNA vollständig gespalten wird.

Die Zusatzkomponente für das erfindungsgemäße Verfahren ist preiswert zu gewinnen, problemlos in der Anwendung, und sie bewirkt eine erhebliche Reduzierung der Enzymkosten bei wissenschaftlichen, klinischen, forensischen oder anderen DNA/RNA-Untersuchungen, da die Aktivität der relativ teuren Enzyme besser genutzt werden kann.

Enzyme, bzw. Reaktionen, die durch die Zusatzkomponente im Reaktionspuffer begünstigt werden, sind DNA-Restriktionsendonukleasen, insbesondere Typ-II-Restriktionsendonukleasen, aber auch Typ-I-Restriktionsendonukleasen, die komplexe DNA- Muster erkennen, oder auch Typ-III-Restriktionsendonukleasen, die außerhalb der Erkennungssequenz schneiden. Also bspw. folgende Restriktionsendonukleasen:
Aac I, Aae I, Aat I, Aat II, Aca I, Acc I, Acc II, Acc III, Acy I, Afl I, Afl II, Afl III, Aha I, Aha II, Aha III, Aim I, Alu I, Ama I, Aor I, Aos I, Aos II, Apa I; Apy I, Aqu I, Asp AI, Ast AI, Asu I, Asu II, Asu III, Atu II, Atu AI, Atu BI, Atu BVI, Atu CI, Atu HAMI, Ava I, Ava II, Ava III, Avr I, Avr II, Bac I, Bal I, Bam FI, Bam HI, Bam KI, Bam NI, Bam Nx, Ban I, Ban II, Bam III, Bbe I, Bbe II, Bbe AI, Bbe AII, Bbi I, Bbi II, Bbi III, Bbi IV, Bbr I, Bbv SI, Bbv I, Bce 170, Bce 1229, Bce14579, Bce FI, Bce R, Bcl I, Bcn I, Bgl I, Bgl II, Bin I, Bin SI, Bin SII, Blo I, Blu I, Blu II, Bme I, Bme 205, Bme 899, Bpe I, Bpr I, Bpu I, Bsa PI, Bse I, Bse II, Bse PI, Bsm I, Bso PI, Bsp 1286, Bsp RI, Bsr HI, Bsr PI, Bsr PII, Bss CI, Bss GI, Bss GII, Bss HI, Bss HII, Bss PI, Bst I, Bst AI, Bsr CI, Bst EI, Bst EII, Bst EIII, Bst GI, Bst GII, Bst HI, Bst NI, Bst PI, Bst TI, Bst XI, Bst XII, Bsu 1076, Bsu 1114, Bsu 1145, Bsu 1192I, Bsu 1192II, Bsu 1193, Bsu 1247, Bsu A259, Bsu 6633, Bsu EII, Bsu FI, Bsu M, Bsu RI, Bth I, Bth II, Bvu I, Cal I, Cau I, Cau II, Cau III, Ccr I, Ccr II, Cfo I, Cfr I, Cfr 4I, Cfr 5I, Cfr 6I, Cfr 7I, Cfr 8I, Cfr 9I, Cfr 10I, Cfr 11I, Cfr 13I, Cfr 14I, Cfu I, Chi I, Chu I, Chu II, Cla I, Clm I, Clm II, Clt I, Clu I, Cpa I, Cpe I, Cpf I, Csc I, Cve I, Cvi I, Cvn I, Dde I, Dde II, Dds I, Dpn I, Dpn II, Dra I, Dra II, Dra III, Eae I, Eae PI, Eca I, Eca II, Ecc I, Ecl I, Ecl II, Eco A, Eco B, Eco DXI, Eco ICRI, Eco K, Eco PI, Eco P15, Eco RI, EcoRI⁽ⁱ⁾, Eco RII, Eco RV, Eco 24I, Eco 25I, Eco 26I, Eco 27I, Eco 32I, Eco 35I, Eco 36I, Eco 38I, Eco 39I, Eco 40I, Eco 41I, Eco 47I, Eco 47II, Eco 47III, Eco 48I, Eco 49I, Eco 50I, Fdi I, Fdi II, Fnu 48I, Fnu 4HI, Fnu AI, Fnu AII, Fnu CI, Fnu DI, Fnu DII, Fnu DIII, Fnu EI, Fok I, Gdi I, Gdi II, Gdo I, Ggl I, Gin I, Gox I, Gsb I, Gsu I, Hae I, Hae II, Hae III, Hag I, Hap I, Hap II, Hga I, Hgi AI, Hgi BI, Hgi CI, Hgi CII, Hgi CIII, Hgi DI, Hgi DII, Hgi EI, Hgi EII, Hgi FI, Hgi GI, Hgi HI, Hgi HII, Hgi HIII, Hgi JI, Hgi JII, Hgi KI, Hha I, Hha II, Hhg I, Hin 173, Hin 1056I, Hin 1056II, Hin bIII, Hin cII, Hin dI, Hin dII, Hin dIII, Hin dIV, Hin eI, Hin fI, Hin fII, Hin fIII, Hin GUI, Hin GUII, Hin HI, Hin JCI, Hin JCII, Hin P₁I, Hin S₁I, Hin S₂, Hpa I, Hpa II, Hph I, Hsu I, Kpn I, Mae I, Mae II, Mae III, Mau I, Mbo I, Mbo II, Mbv I, Mgl I, Mgl II, Mki I, Mla I, Mlu I, Mni I, Mni II, Mnl I, Mnn I, Mnn II, Mnn III, Mnn IV, Mno I, Mno II, Mno III, Mos I, Mph I, Mra I, Msi I, Msi II, Msp I, Mst I, Mst II, Mth I, Mva I, Mvi I, Mvi II, Nae I, Nam I, Nar I, Nba I, Nbl I, Nbr I, Nca I, Nci I, Nco I, Ncu I, Nda I, Nde I, Nde II, Nfl I, Nfl II, Nfl III, Ngi III, Ngo I, Ngo II, Nla I, Nla II, Nla III, Nla IV, Nla SI, Nla SII, Nmi I, Nmu I, Nmu DI, Nmu EI, Nmu EII, Nmu FI, Nmu SI, Noc I, Nop I, Nop II, Not I, Nov I, Nov II, Nru I, Nsi I, Nsi AI, Nsi HI, Nsp (7524)I, Nsp (7524)II, Nsp (7524)III, Nsp (7524)IV, Nsp (7524)V, Nsp BI, Nsp BII, Nsp HI, Nsp HII, Nsu I, Nsu DI, Nun I, Nun II, Oxa I, Oxa II, Pae R7, Pai I, Pal I, Pan I, Pfa I, Pfl I, Pgl I, Pgl II, Pma I, Ppu I, Psp I, Pst I, Pvu I, Pvu II, Rhe I, Rhp I, Rhp II, Rhs I, Rle I, Rlu I, Rme I, Rrb I, Rrh I, Rrh II, Rro I, Rsa I, Rsh I, Rsp I, Rsr I, Sac I, Sac II, Sac III, Sal I, Sal II, Sal PI, Sau I, Sau 3AI, Sau 96I, Sbo I, Sca I, Sci NI, Scr FI, Scu I, Sdu I, Sdy I, Sex I, Sex II, Sfa I, Sfa GUI, Sfa NI, Sfi I, Sfl I, Sfr I, Sga I, Sgo I, Sgr I, Shy I, Shy TI, Sin I, Sin MI, Sin MII, Ska I, Ska II, Sla I, Slu I, Sma I, Sna I, Sna BI, Sod I, Sod II, Spa I (Xho I), Spa I (Sph I), Sph I, Ssa I, Ssp I, Sst I, Sst II, Sst III, Sst IV, Stu I, Taq I, Taq II, Taq XI, Tfl I, Tgi I, Tha I, Tte I, Tth 111I, Tth 111II, Tth 111III, Tth HB8I, Ttn I, Ttr I, Vha I, Xam I, Xba I, Xho I, Xho II, Xma I, Xma II, Xma III, Xmn I, Xni I, Xor I, Xor II, Xpa I und analoge sowie isoschizomere Enzyme.

Bei allen bislang untersuchten Restriktionsendonukleasen wird beim erfindungsgemäßen Verfahren eine Steigerung der üblichen Enzymaktivität festgestellt. Eine Inhibierung der Reaktion durch die Zusatzkomponente war nie zu beobachten. Das Ausmaß der Aktivitätssteigerung ist vom jeweiligen Enzym abhängig, wobei auch der Hersteller eine Rolle spielt; gleiche Enzyme unterschiedlicher Hersteller werden durch die erfindungsgemäße Zusatzkomponente unterschiedlich aktiviert bzw. stabilisiert. Dies deutet darauf hin, daß die Zusatzkomponente vermutlich in der Lage ist, Verunreinigungen in der Enzym- und/oder DNA-Präparation zu binden und zu komplexieren.

Weitere für das erfindungsgemäße Verfahren geeignete Enzyme sind bspw.: Ligasen, wie die T4-DNA-Ligase, E.coli. DNA- Ligase, etc.; RNAsen, wie RNAse A, RNAse P, RNAse H; Kinasen, wie die DNA-Polynukleotidkinase I, RNA-Polynukleotidkinase, T4 Polynukleotidkinase, DNA- und RNA-Polymerasen, insbesondere Template abhängige Polymerasen, wie die DNA-Polymerase I, Klenow-Fragment der DNA-Polymerase I, Taq-DNA-Polymerase, gentechnisch modifizierte DNA-Polymerasen, wie Sequenase (Warenzeichen), etc.; aber auch Template unabhängige Polymerasen, wie terminale Transferasen; Exonukleasen, wie Bal 31 Nuklease, DNAsen aus Pankreas; oder auch Topoisomerasen, wie die DNA- Topoisomerase I, etc.

Für das erfindungsgemäße Verfahren sind auch Zusatzkomponenten geeignet, die aus Trockenmilchpulver, also getrockneter und entfetteter Milch bestehen. Geeignete Trockenmilchpräparate sind bspw. alle handelsüblichen Milchpulver.

Besonders geeignet sind auch Zusatzkomponenten aus Milcheiweiß. Dabei sind für das Enzymreaktionsverfahren proteasen-, DNAsen- und RNAsen-freie Milcheiweißfraktionen bevorzugt.

Die gezielte Suche nach wirksamen Zusätzen aus der Milch of fenbarte, daß insbesondere die Caseine - α- und β-Casein - der Milcheiweißfraktion hochwirksam und aktivitätssteigernd sind, während Lysozym und Lactalbumin nur geringe Wirkung besitzen.

Die Enzymaktivität in der Reaktionslösung wird verbessert, indem die erfindungsgemäße Zusatzkomponente zu einer wäß rigen Pufferlösung mit Enzym und Nukleotidsubstrat zugesetzt wird. Für die Steigerung und Stabilisierung der Enzymaktivi tät ist es dabei unerheblich, ob die erfindungsgemäße Zusatz komponente nachträglich oder gleichzeitig mit dem Enzym in die Reaktionsansätze gegeben wird oder ob die Zusatzkomponen te von Anfang an im Reaktionsansatz bzw. im Reaktionspuffer vorliegt.

Nichtsdestoweniger sind Reaktionsansätze bevorzugt, in denen die erfindungsgemäße Zusatzkomponente in einer Menge von 1 bis 10 000 mg/L, vorzugsweise von 30 bis 3000 mg/L, und be sonders bevorzugt von 50 bis 300 mg/L, vorliegt. Die Menge der Zusatzkomponente kann dabei sowohl vom Enzym als vom Sub strat abhängen. Generell sind aber physiologisch ähnliche Be reiche bevorzugt, da bei diesen Bedingungen zumeist auch das Aktivitätsmaximum der Enzyme liegt. Bevorzugte Konzentratio nen der Zusatzkomponente in der Reaktionslösung bei der DNA- Restriktion: 1-1000 mg Casein/L, wobei 10-100 mg Casein /L besonders bevorzugt sind.

Die obengenannte Zusatzkomponente wird erfindungsgemäß ver wendet, um die Aktivität der Enzyme in der Reaktionslösung zu verbessern und zu stabilisieren. Der aktivitätsverbessernde Zusatz ist dabei insbesondere vorteilhaft bei der enzymati schen Behandlung von Plasmid-DNA, Phagen-DNA sowie von geno mischer DNA aus Prokaryoten und Eukaryoten. Dabei ist der Reinigungsgrad der DNA unerheblich, d. h., die Zusatzkomponen te ist sowohl für im Handel erhältliche DNA als auch für selbst isolierte DNA geeignet.

Die erfindungsgemäß eingesetzte Zusatzkomponente wird zur Reaktions lösung vorteilhafterweise in Form einer gebrauchsfertigen oder mehrfach konzentrierten Pufferlösung gegeben. Die Mehr fachkonzentration der Pufferlösung liegt dabei vorteilhafter weise zwischen 2fach und 25fach, wobei 3fach, 5fach und 10fach besonders bevorzugt sind. Aus Löslichkeitsgründen kann es bevorzugt sein, wenn die Zusatzkomponente und die Puffer/ Salz-Lösung in separaten Behältern gelagert und versandt wer den. Generell sind aber gebrauchsfertige bzw. mehrfachkonzen trierte Lösungen aus Puffer, Salz und Zusatzkomponente bevor zugt. Es versteht sich dabei von selbst, daß alle Lösungen sterilisiert bzw. sterilfiltriert sind und RNAse-frei herge stellt werden.

Bei der Zubereitung der gebrauchsfertigen oder mehrfachkon zentrierten Puffer/Reaktionslösung kann es vorteilhaft sein, noch schwache, die Enzymreaktion nicht störende Detergentien zuzusetzen, damit die erfindungsgemäße Zusatzkomponente bzw. die Milchproteine beim mehrfachen Einfrieren und Auf tauen der mehrfach konzentrierten Reaktionslösung nicht aus fallen. Aus gleichem Grund kann es auch vorteilhaft sein, der gebrauchsfertigen oder mehrfachkonzentrierten Puffer/Reak tionslösung Antigefriermittel, wie Glycerin, Glykol, etc. zuzusetzen.

Die vorteilhaften Wirkungen der erfindungsgemäß eingesetzten Zusatzkom ponente werden nun nachstehend anhand der Beispiele unter Bezugnahme auf die Abbildungen näher beschrieben. Es zeigen:

Fig. 1 die mit Ethidiumbromid angefärbten Restriktions fragmente der Lambda-DNA nach Hin dIII-Verdau in An- und Abwesenheit der erfindungsgemäß eingesetzten Zusatzkomponente und nach gelelektrophoretischer Auftrennung auf einem 0,6%igen Agarosegel;

Fig. 2 die mit Ethidiumbromid angefärbten Restriktions fragmente der Lambda-DNA nach Eco RI-Verdau in An- und Abwesenheit der erfindungsgemäß eingesetzten Zusatzkomponente und nach gelelektrophoretischer Auftrennung auf einem 0,6%igen Agarosegel.

Fig. 3 die Aktivitäten von Hin dIII beim Verdau von Lamb da-DNA in Gegenwart und Abwesenheit der erfindungsgemäß eingesetzten Zusatzkomponente;

Fig. 4 die Aktivitäten von Eco RI beim Verdau von Lambda- DNA in Gegenwart und Abwesenheit der erfindungsgemäß eingesetzten Zusatzkomponente;

Fig. 5 die Aktivitäten von Pst I beim Verdau von Lambda- DNA in Gegenwart und Abwesenheit der erfindungsgemäß eingesetzten Zusatzkomponente;

Fig. 6 die Aktivitäten von Bam HI beim Verdau von Lambda- DNA in Gegenwart und Abwesenheit der erfindungsgemäß eingesetzten Zusatzkomponente.

Beispiel 1:

5 × 1 µg Lambda-DNA wurden in jeweils 50 µl 1 × Reaktionspuffer 100 mM NaCl; 10 mM Tris-HCl, pH 8,0 (37°C); 5 mM MgCl₂, 1 mM β-Mercapto ethanol) mit 100 µg/ml Casein bei 37°C eine Stunde mit fol genden Mengen Restriktionsenzym Hin dIII: 0,125 U, 0,25 U, 0,5 U, 1,0 U und 2 U, verdaut. Danach wurde die Reaktion durch Zugabe von EDTA (Ethylendiamintetra acetat-Dinatriumsalz) gestoppt - die Endkonzentration in der Reaktionslösung betrug 25 mM EDTA - und die Reaktion bis zur Analyse bei 0°C auf Eis aufbewahrt. Die Reaktionslösung wurde dann mit Bromphenolblau gefärbter 30%iger Saccharose-Lösung versetzt, und ein 20 µl Aliquot der angefärbten Lösung auf ein 0,6%iges Ethididumbromid-Agarosegel mit TAE-Laufpuffer: 40 mM Tris-Acetat, pH 8,2; 1 mM EDTA; aufgeladen und elek trophoretisch (100 V; 2-3 h) aufgetrennt. Die DNA-Banden im Agarosegel wurden während der Auftrennung durch das anwesende Ethididumbromid (1 µg/ml) angefärbt und das Gel unter UV-Licht (254 nm) mit einem entsprechenden UV-Filter foto grafiert.

Siehe Fig. 1: Die Spuren 7-11 zeigen Hin dIII-Restriktionen der Lambda-DNA, die in Gegenwart der erfindungsgemäß eingesetzten Zu satzkomponente erfolgt waren:

Spur
Einheiten (U) Hin dIII/µg Lambda-DNA
7\|2,0 U
8	1,0 U
9	0,5 U
10	0,25 U

Der Versuch zeigt, daß in Gegenwart der erfindungsgemäß eingesetzten Zu satzkomponente bereits 0,5 Einheiten Hin dIII ausreichen, um 1 µg Lambda-DNA vollständig innerhalb einer Stunde zu spal ten; die Aktivität von Hin dIII ist also gegenüber Standard bedingungen - gemäß der Definition der Enzymeinheit - etwa verdoppelt.

Vergleichsbeispiel 1:

5 × 1 µg Lambda-DNA wurden analog Beispiel 1 in je weils 50 µl 1 × Reaktionspuffer 100 mM NaCl; 10 mM Tris-HCl, pH 8,0 (37°C); 5 mM MgCl₂, 1 mM β- Mercaptoethanol) ohne Zusatzkomponente eine Stunde bei 37°C mit Restriktionsenzym Hin dIII verdaut und wie oben analysiert.

Siehe Fig. 1: Die Spuren 1-5 zeigen verschiedene Hin dIII- Restriktionen der Lambda-DNA, bei denen keine Zusatzkompo nente in der Reaktionslösung vorlag.

Spur
Einheiten (U) Hin dIII/µg Lambda-DNA
1\|2,0 U
2	1,0 U
3	0,5 U
4	0,25 U
5	0,125 U

Es wurde eine übliche Enzymaktivität festgestellt.

Beispiel 2:

5×1µg Lambda-DNA wurden analog Beispiel 1 in je weils 50 µl 1 × Reaktionspuffer 100 mM NaCl; 50 mM Tris-HCl, pH 7,5 (37°C); 10 mM MgCl₂, 1 mM β- Dithioerythritol) mit 100 µg/ml Casein bei 37°C eine Stunde mit verschiedenen Mengen Restriktionsenzym Eco RI verdaut und wie oben (siehe Fig. 2) analy siert. Die Spuren 7-12 zeigen die entsprechenden Eco RI-Re striktionen der Lambda-DNA mit der Zusatzkomponente in der Reaktionslösung:

Spur
Einheiten (U) Eco RI/µg Lambda-DNA
7\|2,0 U
8	1,0 U
9	0,5 U
10	0,25 U
11	0,125 U
12	0,0625 U

Der Versuch zeigt, daß in Gegenwart der erfindungsgemäß eingesetzten Zu satzkomponente bereits 0,25 Einheiten Eco RI ausreichen, um 1 µg Lambda-DNA vollständig innerhalb einer Stunde zu spalten; die Aktivität von Eco RI ist also gegenüber Standardbedingun gen - gemäß der Definition der Enzymeinheit - etwa vervier facht.

Vergleichsbeispiel 2

5×1 µg Lambda-DNA wurden analog Beispiel 2 in je weils 50 µ1 × Reaktionspuffer 100 mM NaCl; 50 mM Tris-HCl, pH 7,5 (37°C); 10 mM MgCl₂, 1 mM β- Dithioerythritol) ohne erfindungsgemäß eingesetzte Zusatzkomponente bei 37°C eine Stunde mit verschiedenen Mengen Restriktionsenzym Eco RI verdaut und wie oben (siehe Fig. 2) analysiert. Die Spuren 1-6 zeigen die entsprechenden Eco RI-Restriktionen der Lambda-DNA ohne Zusatzkomponente in der Reaktionslösung:

Spur
Einheiten (U) Eco RI/µg Lambda-DNA
1\|2,0 U
2	1,0 U
3	0,5 U
4	0,25 U
5	0,125 U
6	0,0625 U

Beispiel 3:

5×1 µg Lambda-DNA wurden analog Beispiel 1 in je weils 50 µl 1 × Reaktionspuffer 100 mM NaCl; 10 mM Tris-HCl, pH 8,0 (37°C); 5 mM MgCl₂, 1 mM β- Mercaptoethanol) mit 100 µg/ml Casein bei 37°C eine Stunde mit verschiedenen Mengen Restriktionsenzym Bam HI: 0,125 U; 0,25 U; 0,5 U; 1,0 U und 2,0 U; verdaut und wie oben analysiert (siehe Abb. 5).

Der Versuch zeigt, daß in Gegenwart der erfindungsgemäß eingesetzten Zu satzkomponente bereits 0,5 Einheiten Bam HI ausreichen, um 1 µg Lambda-DNA vollständig innerhalb einer Stunde zu spalten; die Aktivität von Bam HI wurde durch die Zusatzkomponente also in etwa verdoppelt (siehe Abb. 5).

Vergleichsbeispiel 3.

5 × 1 µg Lambda-DNA wurden analog dem Beispiel 3 in jeweils 50 µl 1 × Reaktionspuffer 100 mM NaCl; 10 mM Tris-HCl, pH 8,0 (37°C); 5 mM MgCl₂, 1 mM β-Mercaptoethanol) ohne erfindungsgemäß eingesetzten Zusatzkomponente bei 37°C eine Stunde mit verschiedenen Mengen Restriktionsenzym Bam HI: 0,125 U; 0,25 U; 0,5 U; 1,0 U und 2,0 U; verdaut und wie oben analysiert. Es wurde eine übliche Enzymaktivität festgestellt (siehe Abb. 5).

Beispiel 4:

5 × 1 µg Lambda-DNA wurden analog Beispiel 1 in je weils 50 µl 1 × Reaktionspuffer 100 mM NaCl; 50 mM Tris-HCl, pH 7,5 (37°C); 10 mM MgCl₂, 1 mM β- Dithioerythritol) mit 100 µg/ml Casein; bei 37°C eine Stunde mit verschiedenen Mengen Restriktionsenzym Pst I: 0,125 U; 0,25 U; 0,5 U; 1,0 U und 2,0 U; verdaut und wie oben analysiert (siehe Abb. 6).

Der Versuch zeigt, daß in Gegenwart der erfindungsgemäß eingesetzten Zu satzkomponente bereits 0,5 Einheiten Pst I ausreichen, um 1 µg Lambda-DNA vollständig innerhalb einer Stunde zu spalten; die Aktivität von Pst I wurde durch die Zusatzkomponente also in etwa verdoppelt (siehe Abb. 6).

Vergleichsbeispiel 4:

5 × 1 µg Lambda-DNA wurden analog Beispiel 4 in je weils 50 µl 1 × Reaktionspuffer 100 mM NaCl; 50 mM Tris-HCl, pH 7,5 (37°C); 10 mM MgCl₂, 1 mM β- Dithioerythritol) ohne erfindungsgemäß eingesetzten Zusatzkomponente bei 37°C eine Stunde mit verschiedenen Mengen Restriktionsenzym Pst I: 0,125 U; 0,25 U; 0,5 U; 1,0 U und 2,0 U; verdaut und wie oben analysiert. Es wurde eine übliche Enzymaktivität festgestellt (Abb. 6).

Vergleich der Enzymaktivitäten in Gegenwart und Abwesenheit der erfindungsgemäß eingesetzten Zusatzkomponente:

Aus den jeweiligen Fotografien der verschiedenen DNA-Re striktionen in Gegenwart und Abwesenheit der erfindungsge mäß eingesetzten Zusatzkomponenten (siehe Beispiele und Vergleichsbei spiele 1-4) wurde die Stärke der Lambda-DNA-Fragmente ermit telt und daraus jeweils der Anteil verdauter und unverdauter Lambda-DNA bei den verschiedenen Restriktionsversuchen be stimmt.

Die Ergebnisse sind in den Abbildungen 3 bis 6 dargestellt. Auf der Abszisse sind die Enzymeinheiten aufgetragen und auf der Ordinate der Prozentsatz der nach einer Stunde verdauten Lambda-DNA. Die unterbrochene Linie steht für Restriktionen in Gegenwart der erfindungsgemäß eingesetzten Zusatzkomponente (100 µg/ml Casein); die durchgezogene Linie für die zugehörigen Vergleichsbeispiele ohne die Zusatzkomponente.

Das Diagramm in Fig. 3 vergleicht die Aktivitäten von Hin dIII in Gegenwart (Beispiel 1) und Abwesenheit (Ver gleichsbeispiel 1) der erfindungsgemäß eingesetzten Zusatzkomponente.

Das Diagramm in Fig. 4 vergleicht die Aktivitäten von Eco RI in Gegenwart (Beispiel 2) und Abwesenheit (Vergleichsbeispiel 2) der erfindungsgemäß eingesetzten Zusatzkomponente.

Das Diagramm in Fig. 5 vergleicht die Aktivitäten von Pst I in Gegenwart (Beispiel 3) und Abwesenheit (Vergleichsbeispiel 3) der erfindungsgemäß eingesetzten Zusatzkomponente (das zugehörige Photo ist nicht gezeigt).

Das Diagramm in Fig. 6 vergleicht die Aktivitäten von Bam HI in Gegenwart (Beispiel 4) und Abwesenheit (Vergleichsbeispiel 4) der erfindungsgemäß eingesetzten Zusatzkomponente (das zugehörige Photo ist nicht gezeigt).

Die quantitative Bestimmung der DNA-Fragmente zeigt, daß ins besondere bei niederen Enzymkonzentrationen (siehe: Diagramme 3-4) eine besonders hohe Aktivierung und/oder Stabilisierung der Enzyme auftritt. Aus den Diagrammen ist auch ersichtlich, daß bei allen Konzentrationen eine - meist proportional - er höhte Enzymaktivität auftritt, so daß die vorteilhafte Wir kung der Zusatzkomponente vermutlich nicht allein auf einer Stabilisierung der Enzyme beruht, sondern zumindest teilweise auch auf einer positiven allosterischen Wirkung auf Enzym und/oder Substrat.

Claims

1. Enzymreaktionsverfahren mit einer die Enzymaktivität verbessernden Zusatzkomponente, wobei das Enzym nukleotidhaltige Moleküle, insbesondere Polynukleinsäuren, als Substrat hat, dadurch gekennzeichnet, daß einer wäßrigen Reaktionslösung mit Enzym und Substrat als Zusatzkomponente Milch, Trockenmilchpulver, Milcheiweiß oder proteasen- und DNAsen- und RNAsen-freie Milcheiweißfraktion zugesetzt wird.

2. Enzymreaktionsverfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Zusatzkomponente Casein zugesetzt wird.

3. Enzymreaktionsverfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Zusatzkomponente in einer Menge von 1 bis 10 000 mg/L zugesetzt wird.

4. Enzymreaktionsverfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Zusatzkomponente in einer Menge von 30 bis 3000 mg/L zugesetzt wird.

5. Enzymreaktionsverfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Zusatzkomponente in einer Menge von 50 bis 300 mg/L zugesetzt wird.

6. Enzymreaktionsverfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Zusatzkomponente als Lösung in einem gebrauchsfertigen oder mehrfach konzentrierten Enzympuffer zugesetzt wird.

7. Enzymreaktionsverfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Zusatzkomponente zusammen mit schwachen, die Reaktion nicht störenden Detergentien zugesetzt wird.

8. Enzymreaktionsverfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Zusatzkomponente zusammen mit Antigefriermitteln zugesetzt wird.