DE4342012A1

DE4342012A1 - Cholesterinoxidase aus Brevibacterium sterolicum

Info

Publication number: DE4342012A1
Application number: DE4342012A
Authority: DE
Inventors: Michael Dipl Biol Dr Jarsch
Original assignee: Boehringer Mannheim GmbH
Current assignee: Roche Diagnostics GmbH
Priority date: 1993-05-05
Filing date: 1993-12-09
Publication date: 1994-11-17

Description

Die Erfindung betrifft eine Cholesterinoxidase aus Brevibac terium sterolicum, ein Verfahren zur Herstellung einer rekom binanten Cholesterinoxidase aus Brevibacterium sterolicum, eine für dieses Verfahren geeignete DNA-Sequenz, welche eine zytoplasmatische Expression der rekombinanten Cholesterinoxi dase im Wirtsbakterium bewirkt, sowie die so erhältliche rekombinante Cholesterinoxidase.

Für die enzymatische Bestimmung von Cholesterin ist die Cholesterinoxidase von großer Bedeutung. Sie katalysiert die Oxidation von Cholesterin zu Cholesten-3-on und H₂O₂. Cho lesterinoxidase aus verschiedenen Organismen wie Pseudomonas, Mycobacterium, Nocardia, Arthrobacter und Brevibacterium sind bereits beschrieben worden (T. Uwajima et al., Agr. Biol. Chem. 37 (1973), 2345-2350). Alle diese bekannten Choleste rinoxidasen sind sezernierte Proteine. Das Bodenbakterium Brevibacterium sterolicum KY 3643 (ATCC 21387) zeigt eine besonders hohe Aktivität der Cholesterinoxidase. Aus diesem Bakterium sind drei Isoenzyme der Cholesterinoxidase bekannt, die sich in ihrem isoelektrischen Punkt, der Substratspezifi tät gegenüber verschiedenen Steroiden, der Affinität gegen über Cholesterin im pH-Optimum und der DNA bzw. Aminosäure sequenz unterscheiden (EP-A 0 452 112 und EP-A 560 983). Die Cholesterinoxidase 1 aus Brevibacterium sterolicum zeigt eine geringe Affinität zu Cholesterin (K_M 1,1 × 10^-3 mol/l) und ist aus Brevibacterium sterolicum nur in geringer Ausbeute erhältlich. Die Expression einer kompletten für die Chole sterinoxidase 1 kodierenden DNA in E. coli wurde bereits versucht, ist jedoch bislang nicht gelungen (K. Fujishiro et al., Biochem. Biophys. Res. Com. 172 (1990), 721-727, T. Ohta et al., Gene 103 (1991), 93-96). Auch die Expression spezieller Deletionsmutanten der für die Cholesterinoxidase I kodierenden DNA, welche mit Teilen des lac z Gens fusioniert wurden, führte zu keiner befriedigenden Expression in E. coli (T. Ohta et al., Biosci. Biotech. Biochem. 56 (1992), 1786-1791). In der EP-A 0 452 112 wird die Klonierung und Expres sion von weiteren Cholesterinoxidasen aus Brevibacterium sterolicum beschrieben. Die Expression dieser DNAs führt jedoch ebenfalls nicht zu einer ausreichenden Menge an akti ver Cholesterinoxidase.

Aufgabe der Erfindung war es, eine Cholesterinoxidase mit hoher Affinität zu Cholesterin in großen Mengen und in akti ver Form zur Verfügung zu stellen.

Diese Aufgabe wird gelöst durch eine Cholesterinoxidase, welche die in SEQ ID NO 2 gezeigte Aminosäuresequenz auf weist. Diese Cholesterinoxidase ist aus Brevibacterium stero licum erhältlich oder auch rekombinant herstellbar.

Es hat sich überraschenderweise gezeigt, daß eine derartige Cholesterinoxidase rekombinant in großer Menge und in aktiver Form hergestellt werden kann. Diese Cholesterinoxidase weist ein Molekulargewicht von 60 kD, einen isoelektrischen Punkt von ca. 5,5 (jeweils gemessen im Phast-System, Pharmacia-LKB) sowie einen K_M-Wert für Cholesterin von 1 × 10^-4 mol/l (in 0,5 mol/l Kaliumphosphatpuffer pH 7,5 bei 25°C) auf und ist in einem pH-Bereich von 5,5 bis 8,0 wirksam.

Es hat sich gezeigt, daß diese Cholesterinoxidase in großer Menge in aktiver Form erhalten werden kann, wenn für eine heterologe Expression eine DNA verwendet wird, welche für ein Peptid mit Cholesterinoxidase-Aktivität kodiert und ausge wählt ist aus der Gruppe

a) der in SEQ ID NO 1 gezeigten DNA-Sequenz oder der dazu komplementären DNA-Sequenz,
b) DNA-Sequenzen, die mit der in SEQ ID NO 1 gezeigten DNA- Sequenz oder Fragmenten dieser DNA-Sequenz hybridisieren,
c) DNA-Sequenzen, die ohne die Degeneration des genetischen Codes mit den in a) oder b) definierten Sequenzen hybridisie ren würden und für ein Polypeptid mit derselben Aminosäure sequenz kodieren,

wobei diese DNA eine der in SEQ ID NO 3, 4 und/oder 5 gezeig ten Sequenzen aufweist. Vorzugsweise wird eine DNA verwendet, welche die in SEQ ID NO 1 gezeigte Sequenz aufweist. In dem Fachmann geläufiger Weise können jedoch degenerierte Codons durch andere Codons, welche für die gleiche Aminosäure kodie ren, ersetzt werden. Weiterhin können für zusätzliche Amino säuren kodierende Codons am 5′-Ende, am 3′-Ende oder auch innerhalb der in SEQ ID NO 1 gezeigten Sequenz eingefügt werden, solange die so erhaltenen DNA-Varianten mit der in SEQ ID NO 1 gezeigten DNA-Sequenz unter üblichen Bedingungen (siehe T. Maniatis et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York 1989) hybridisieren. Zusätzlich soll die verwendete DNA eine der in SEQ ID NO 3, 4 und/oder 5 gezeigten DNA- Sequenzen aufweisen und für ein Peptid mit Cholesterin oxidase-Aktivität kodieren. Unter einem Peptid mit Choleste rinoxidase-Aktivität ist ein solches Peptid zu verstehen, welches die Oxidation von Cholesterin (5-Cholesten-3-β-ol) zu 4-Cholesten-3-on und H₂O₂ katalysiert.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist daher eine DNA, welche für ein Peptid mit Cholesterinoxidase-Aktivität kodiert und ausgewählt ist aus der Gruppe

a) der in SEQ ID NO 1 gezeigten DNA-Sequenz oder der dazu komplementären DNA-Sequenz,
b) DNA-Sequenzen, die mit der in SEQ ID NO 1 gezeigten DNA- Sequenz oder Fragmenten dieser DNA-Sequenz hybridisieren,
c) DNA-Sequenzen, die ohne die Degeneration des genetischen Codes mit den in a) oder b) definierten Sequenzen hybridisie ren würden und für ein Polypeptid mit derselben Aminosäure sequenz kodieren, wobei diese DNA eine der in SEQ ID NO 3, 4 und/oder 5 gezeig ten Sequenzen aufweist.

Mit einer solchen DNA kann eine mindestens 10fach höhere Aktivität der rekombinant hergestellten Cholesterinoxidase im Rohextrakt erhalten werden als mit den bislang beschriebenen Verfahren und Cholesterinoxidasen.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung einer rekombinanten Cholesterinoxidase durch Transformation einer geeigneten Wirtszelle mit einer erfin dungsgemäßen DNA, welche in einem geeigneten Expressions system vorliegt, Kultivierung der transformierten Wirtszellen und Isolierung der gebildeten Cholesterinoxidase aus dem Zytoplasma der transformierten Zellen.

Mit diesem Verfahren ist es überraschenderweise möglich, eine rekombinante Cholesterinoxidase in großer Menge und aktiver Form aus dem Zytoplasma der transformierten Wirts zelle zu erhalten. Dabei kann die verwendete DNA am 5′-Ende eine zusätzliche Nukleotidsequenz enthalten, die ein Trans lations-Startcodon, jedoch kein Stopcodon aufweist, wobei diese zusätzliche Nukleotidsequenz nicht zu einer Leseraster verschiebung führt und keine für die Sekretion des gebildeten rekombinanten Enzyms funktionell aktive Signalsequenz dar stellt. Die Länge dieser Nukleotidsequenz beträgt etwa 3 bis 90 Basenpaare.

Vorzugsweise weist die zusätzliche Nukleotidsequenz eine der in den Sequenzprotokollen 6, 8, 10, 12, 14 und 16 gezeigten Sequenzen anstelle der nativen Signalsequenz auf.

Ein bevorzugter Gegenstand der Erfindung ist daher ein Ver fahren zur Herstellung einer rekombinanten Cholesterinoxida se, wobei eine erfindungsgemäße DNA verwendet wird, welche am 5′-Ende eine der in SEQ ID NO 6, 8, 10, 12, 14 oder 16 gezeigten Sequenzen aufweist.

Die Transformation der für die rekombinante Herstellung verwendeten Wirtszellen erfolgt nach bekannten Verfahren (siehe z. B. Sambrook, Fritsch und Maniatis, "Molecular Cloning, A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor 1989). Die transformierten Wirts zellen werden dann unter Bedingungen kultiviert, die eine Expression des Cholesterinoxidase-Gens erlauben. Je nach dem verwendeten Expressionsvektor ist hierfür in bekannter Weise gegebenenfalls die Zugabe eines Induktors (z. B. Lactose oder Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG)) zum Kulturmedium, eine Temperaturerhöhung oder eine limitierte Glucosezufuhr zweckmäßig. Die Isolierung der rekombinanten Cholesterinoxi dase aus dem Zytoplasma der transformierten Zellen erfolgt dann nach bekannten Verfahren.

Mit diesem Verfahren ist es möglich, die erfindungsgemäße Cholesterinoxidase als rekombinantes Enzym in einer Ausbeute von 8-20 U/ml zu erhalten. Die Expression des vollständigen Cholesterinoxidase-Gens, welches die Signalsequenz enthält, ergibt dagegen lediglich eine Ausbeute von unter 0,1 U/ml.

Ein bevorzugter Gegenstand der Erfindung ist eine erfindungs gemäße, für ein Peptid mit Cholesterinoxidase-Aktivität kodierende DNA, welche am 5′-Ende eine der in SEQ ID NO 6, 8, 10, 12, 14 und 16 gezeigten Sequenzen aufweist. Besonders bevorzugt sind die in den Sequenzprotokollen 18, 20, 22, 24, 26 und 28 gezeigten Sequenzen. Vorzugsweise liegen diese erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen in einem Expressionsvektor kloniert vor. Mit Hilfe dieser DNA kann die erfindungsgemäße Cholesterinoxidase in beliebigen Mengen in den für die rekom binante Herstellung von Proteinen üblicherweise verwendeten Bakterien gewonnen werden. Vorzugsweise erfolgt die Expres sion in E. coli.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist daher eine rekombi nante Cholesterinoxidase, welche von einer erfindungsgemäßen DNA kodiert wird und am N-terminalen Ende eine der in SEQ ID NO 7, 9, 11, 13, 15 oder 17 gezeigten Aminosäuresequenzen aufweist.

Diese rekombinante Cholesterinoxidase ist für einen enzymati schen Test zur Bestimmung von Cholesterin ebenso geeignet wie die übrigen aus dem Stand der Technik bekannten Cholesterin oxidasen. Falls erforderlich können in dem Fachmann geläufi ger Weise durch in-vitro-Mutagenese zwischen diesen N- terminalen Sequenzen und der Aminosäuresequenz der reifen Cholesterinoxidase Erkennungssequenzen für spezifische Proteasen wie z. B. der IgA-Protease, der Enterokinase oder des Faktors Xa integriert werden, so daß auch nach der zyto plasmatischen Expression der um diese N-terminalen Sequenzen verlängerten Cholesterinoxidase eine Abspaltung solcher anfusionierter N-terminaler Sequenzen möglich ist.

Ein bevorzugter Gegenstand der Erfindung ist eine rekombi nante Cholesterinoxidase, welche die in SEQ ID NO 21, 23, 25, 27 oder 29 gezeigte Aminosäuresequenz aufweist, sowie die Verwendung einer solchen rekombinanten Cholesterinoxidase in einem enzymatischen Test zum Nachweis von Cholesterin. Dabei wird vorzugsweise das in der Cholesterinoxidasereaktion gebildete H₂O₂ in einer nachgeschalteten Indikatorreaktion als Maß für das in der Probe vorhandene Cholesterin bestimmt.

Die in den Beispielen genannten Plasmide pUC-Chol-B2-BB (DSM 8274), pmgl-SphI (DSM 8272) und pfl-20AT1-SD (DSM 8273) wurden am 05.05.1993 bei der Deutschen Sammlung für Zellkul turen und Mikroorganismen GmbH, Mascheroder Weg Ib, D - 3300 Braunschweig hinterlegt.

Die Anmeldung wird durch die folgenden Beispiele in Verbin dungen mit den Sequenzprotokollen und Figuren näher erläu tert:

SEQ ID NO 1
zeigt die Nukleinsäuresequenz der erfindungsgemäßen Cholesterinoxidase.
SEQ ID NO 2	zeigt die Aminosäuresequenz der erfindungsgemäßen Cholesterinoxidase.
SEQ ID NO 3-5	zeigen Nukleotidsequenzen aus erfindungsgemäßen, für ein Peptid mit Cholesterinoxidase-Aktivität kodierenden DNA′s.
SEQ ID NO 6-17	zeigen die N-terminalen Sequenzen der erfindungsgemäßen rekombinanten Cholesterinoxidasegene (SEQ ID NO 6, 8, 10, 12, 4 und 16) bzw. der dazugehörigen N-terminalen Aminosäuresequenzen (SEQ ID NO 7, 9, 11, 13, 15 und 17).
SEQ ID NO 18-29	zeigen die Nukleinsäuresequenzen und dazugehörigen Aminosäuresequenzen von erfindungsgemäßen rekombinanten Cholesterinoxidasen.

Dabei bedeuten:

SEQ ID NO 30-33
zeigen vier Oligonukleotide für die Amplifikation eines Fragments des erfindungsgemäßen Cholesterinoxidase-Gens.
SEQ ID NO 34	zeigt die Sequenz eines Adapteroligonukleotids für die in vitro-Mutagenese des Cholesterinoxidase-Gens gemäß Beispiel 5.

Fig. 1 zeigt das Plasmid pUC-Chol-B2-BB.

Fig. 2 zeigt das Plasmid plac-Chol-cyt.

Fig. 3 zeigt das Plasmid ppfl-Chol-cyt.

Fig. 4 zeigt das Plasmid ppfl-MSN3H-Chol-cyt.

Beispiel 1 Klonierung des Gens für Cholesterinoxidase aus Brevibacterium sterolicum

Brevibacterium sterolicum (BMTU 2407) wird in 500 ml nutrient broth" (Difco) 20 h bei 30°C angezüchtet. Die Zellen werden durch Zentrifugation geerntet. Die so gewonnene Zellmasse wird in 20 mmol/l Tris/HCl pH 8,0 zu 0,4 g Zell- Naßgewicht/ml resuspendiert. 2,5 ml dieser Suspension werden mit 5 ml 24% (w/v) Polyethylenglycol 6000, 2,5 ml 20 mmol/l Tris/HCl pH 8,0 und 10 mg Lysozym versetzt und 14 h bei 4°C inkubiert. Dann erfolgt die Lyse der Zellen durch Zugabe von 1 ml 20% (w/v) SDS und 2 mg Protease K und Inkubation für 1 h bei 37°C. Diese Lösung wird mit dem gleichen Volumen 20 mmol/l Tris/HCl pH 8,0 versetzt und dann pro ml 1 g CsCl sowie 0,8 mg Ethidiumbromid zugegeben. Diese Lösung wird durch Ultrazentrifugation 24 h bei 40.000 Upm in einem TV850 Vertikal-Rotor (DuPont) aufgetrennt. Die DNA-Bande wird dann mit einer Injektionsspritze abgezogen. Die Entfernung des Ethidiumbromids und Ethanol-Fällung der DNA erfolgt wie bei Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (1989) beschrieben.

7 µg der so gewonnenen DNA werden partiell mit der Restrik tionsendonuklease NlaIII (New England Biolab) geschnitten, auf einem 0,8% Agarosegel elektrophoretisch aufgetrennt und ein Größenbereich von ca. 2-12 kb ausgeschnitten. Die DNA- Fragmente werden aus dem Gel isoliert, mit SphI geschnitten und anschließend in einen mit alkalischer Phosphatase aus Kälberdarm behandelten Plasmidvektor pUC19 ligiert. Dieser Ligationsansatz wird in kompetente E. coli K12 XL1-blue (Stratagene, Katalog-Nr. 200268) transformiert. Die transfor mierten Zellen werden auf Agarplatten mit LB-Medium, das 100 µg/ml Ampicillin enthält, ausplattiert und über Nacht bei 37°C inkubiert. Die hochgewachsenen Kolonien werden auf Nitrocellulosefilter (Schleicher und Schüll) übertragen, durch Behandlung mit Toluol/Chloroform-Dampf lysiert und die Filter mit der Kolonieseite auf Indikatorplatten (s. u.) übertragen. Auf diesen Indikatorplatten erfolgt der Nachweis auf eine Cholesterinoxidase-Aktivität durch 15- bis 30-minü tige Inkubation bei Raumtemperatur.

Klone, die eine Farbreaktion zeigen, werden ausgewählt und isoliert. Zur Kontrolle werden diese E. coli-Klone auf einer Agarplatte mit LB-Medium, das 100 µg/ml Ampicillin enthält, ausgestrichen, über Nacht bei 37°C inkubiert, die angewachse nen Kolonien zur Verifizierung nochmals auf zwei verschiedene Nitrozellulosefilter transferiert und wie oben beschrieben mit Toluol/Chloroformdampf aufgeschlossen. Ein Filter wird wieder auf eine der oben beschriebenen Indikatorplatten aufgelegt, der andere Filter auf eine Indikatorplatte ohne Cholesterin. Eine positive Farbreaktion zeigt sich nur auf den kompletten Indikatorplatten mit dem Substrat Cholesterin. Damit wird nachgewiesen, daß die durch den entsprechenden E. coli-Klon hervorgerufene Farbreaktion tatsächlich durch aktive Cholesterinoxidase verursacht wird.

Herstellung der Indikatorplatten

Für den Plattentest zur Bestimmung von Cholesterinoxidase- Aktivität werden 100 ml 2%ige low-melting-point-Agarose (Sea Plaque BIOzym 50113) aufgeschmolzen und bei einer Temperatur von 42°C eine vorgewärmte Lösung von:

- 48 mg 4-Aminoantipyrin (Boehringer Mannheim GmbH, Katalog-Nr. 073474)
- 306 mg EST (N-Ethyl-N-sulfoethyl-3-methylanilinkalium salz (Boehringer Mannheim GmbH, Katalog-Nr. 586854))
- 2,5 mg Meerrettichperoxidase Reinheitsgrad II (ca. 260 U/mg (Boehringer Mannheim GmbH, Katalog-Nr. 005096))
- 60 µl Natriumazidlösung (20%ig)
- 10 ml 1 mol/l Kaliumphosphat pH 7,2
- 150 mg Cholsäurenatriumsalz (Merck, Katalog-Nr. 12448)
- 10 ml Cholesterinsubstratlösung (s. u.)
- H₂O ad 100 ml

zu der aufgeschmolzenen Agarose gegeben, vorsichtig gemischt, jeweils 10 ml in Petrischalen gegossen und zur Aufbewahrung dunkel gehalten.

Cholesterinsubstratlösung

500 mg Cholesterin (Boehringer Mannheim GmbH, Katalog-Nr. 121312) werden in 12,5 ml 1-Propanol (Merck, Katalog-Nr. 997) gelöst, nach Zugabe von 10 g Thesit (Boehringer Mannheim GmbH, Katalog-Nr. 006190) gut gemischt und H₂O ad 100 ml zugegeben. Die Substratlösung kann bei Raumtemperatur mehrere Monate aufbewahrt werden.

Beispiel 2 Charakterisierung des Cholesterinoxidase-Gens

Das Plasmid eines gemäß Beispiel 1 erhaltenen Klons (pUC-Chol-B2) wird nach Standardmethoden isoliert und einer Restriktionskartierung mit den Restriktionsendonukleasen BamHI, EcoRI, KpnI, XhoI, PstI unterzogen. Es zeigt sich, daß ein DNA-Fragment aus dem Genom von Brevibacterium in der Größe von ca. 5,5 kb in dem Plasmid pUC-Chol-B2 insertiert ist. Durch Subklonierung verschiedener Teilfragmente dieses 5,5 kb-Stückes und anschließender Bestimmung der Cholesterin oxidase-Aktivität der erhaltenen E. coli-Klone kann das Cholesterinoxidase-Gen auf ein BamHI-Fragment von 2,3 kb- Größe eingeengt werden. Das Plasmid mit diesem Fragment wird pUC-Chol-B2-BB genannt (Fig. 1). Die DNA-Sequenz dieses Fragmentes wird bestimmt und auf einem Leseraster, das für Cholesterinoxidase kodiert, hin untersucht. Die Sequenz dieses Leserahmens für die reife Cholesterinoxidase ist in SEQ ID NO 1 wiedergegeben.

Beispiel 3 Konstruktion eines Plasmids zur Expression des Cholesterinoxidase-Gens mit heterologer Signalsequenz

Ein Vergleich der N-terminalen Aminosäuresequenz von Chole sterinoxidase, die aus Brevibacterium isoliert wurde, mit dem gesamten für Cholesterinoxidase kodierenden Leseraster von pUC-Chol-B2-BB zeigt, daß im reifen Protein die ersten 52 kodierten Aminosäuren der Gensequenz fehlen. Diese 52 Amino säuren zeigen die Struktur einer typischen Exportsignal sequenz gram-positiver Prokaryonten (von Heÿne, Biochim. Biophys. Acta 947 (1988), 307-333). Für die Konstruktion von rekombinanten Cholesterinoxidase-Genen, bei denen diese Signalsequenz gegen andere Sequenzen ersetzt ist, wird zunächst ein 387 bp großes DNA-Fragment aus dem Plasmid pUC- Chol-B2-BB unter Verwendung der in SEQ ID NO 30 und 31 gezeigten Oligonukleotide mittels PCR amplifiziert. Dieses Fragment enthält den für den N-terminalen Teil der reifen Oxidase kodierenden Bereich mit einer neuen SphI-Schnittstel le direkt vor dem N-Terminus der Aminosäuresequenz des reifen Enzyms. Dieses PCR-Fragment wird mit SphI und PstI gespalten und zusammen mit einem PstI EcoRI-Fragment aus pUC-Chol-B2- BB, das den restlichen Anteil des Cholesterinoxidase-Gens enthält, in den mit SphI und EcoRI gespaltenen Expressions vektor pmglSphI ligiert und so der Vektor pmgl-Chol-SB erhal ten. In diesem Vektor enthält das Cholesterinoxidase-Gen eine in E. coli funktionelle Signalsequenz aus Salmonella typhi murium (beschrieben in WO 88/093773).

Beispiel 4 Konstruktion eines Plasmids zur Expression des Cholesterin oxidase-Gens ohne Signalpeptid-kodierende Sequenz unter Kontrolle des lacUV5-Promotors

Aus dem Plasmid pmgl-Chol-SB wird durch Behandlung mit den Restriktionsendonukleasen SphI und BamHI ein DNA-Fragment von ca. 1,85 kb Größe herausgeschnitten, das den gesamten Anteil der kodierenden Sequenz der reifen Cholesterinoxidase, aber nicht die für das Signal-Peptid kodierende Sequenz enthält. Dieses Fragment wird in den vorher mit SphI und BamHI geschnittenen Plasmidvektor pUC19 eingesetzt. In dem so erhaltenen Plasmid plac-Chol-cyt liegt das Cholesterin oxidase-Gen im korrekten Leseraster an die ersten zehn Codons des lacZ′-Gens aus pUC19 anfusioniert vor und liegt unter der Kontrolle des lacUV5-Promotors (Fig. 2).

Beispiel 5 Konstruktion eines Plasmids zur Expression des Cholesterin oxidase-Gens ohne Signalpeptid-kodierende Sequenz unter Kontrolle des sauerstoffregulierten pfl-Promotors

Durch PCR-Technik wird aus dem Plasmid plac_Chol_cyt unter Verwendung der in SEQ ID NO 32 und 33 dargestellten Oligo nukleotide ein DNA-Fragment von 432 bp Größe erzeugt, das vor dem ATG-Startcodon eine ClaI-Schnittstelle enthält. Dieses PCR-Fragment wird mit ClaI und PstI geschnitten. Durch Behandlung mit den Restriktionsendonukleasen PstI und BamHI wird aus dem Plasmid plac-Chol-cyt weiterhin ein Fragment mit dem restlichen C-terminalen Anteil des Cholesterinoxidase- Gens herausgeschnitten. Beide Fragmente werden simultan in den mit BamHI und ClaI gespaltenen Expressionsvektor pfl 20AT1-SD einligiert. Das korrekte Ligationsprodukt enthält nun den Leserahmen der reifen Cholesterinoxidase anfusioniert an die ersten zehn Codons des lacZ′-Gens aus pUC19 unter der Kontrolle des sauerstoffregulierten pfl-Promotors (Fig. 3). Dieses Plasmid trägt die Bezeichnung ppfl-Chol-cyt.

Beispiel 6 Konstruktion eines Plasmids zur Expression des Cholesterin oxidase-Gens mit alternativer N-terminaler Fusionssequenz

Zur Entfernung der im 3′ untranslatierten Bereich des Cholesterinoxidase-Gens gelegenen SphI-Schnittstelle des Plasmids ppfl-Chol-cyt wird die Plasmid-DNA mit 5mal und EcoRV geschnitten und wieder religiert. 100 ng des so ent standenen Plasmids ppfl-Chol-cyt-Aterm werden dann mit den Restriktionsenzymen ClaI und SphI gespalten. Das entstandende 4,76 kb große DNA-Fragment wird in low-melting-point Agarose elektrophoretisch aufgetrennt, ausgeschnitten und eluiert (Glassmilk®-Kit, Bio 101). 100 ng des so gereinigten DNA- Fragment s werden mit 50 pmol eines Adapter-Oligonukleotids mit der in SEQ ID NO 34 dargestellten Sequenz (wobei "N" eine äquimolare Mischung aller 4 Basen bedeutet) versetzt und 2 Stunden bei 37°C mit T4-DNA-Ligase behandelt. Anschließend wird der Ansatz mit einer Mischung aus 4 dNTP′s (Endkonz. 0,125 mmol/l) versetzt und 40 Minuten bei 37°C mit Klenow- DNA-Polymerase behandelt. Die so erhaltene Plasmid-DNA wird in E. coli XL1-blue (Stratagene) transformiert. Mit Hilfe des in Beispiel 1 beschriebenen Kolonie-Aktivitätstest werden einzelne Kolonien von erhaltenen Klonen bezüglich ihrer Cholesterinoxidase-Aktivität verglichen. Klone mit hoher Cholesterinoxidase-Aktivität werden isoliert und die Plasmid- DNA durch Restriktionsanalyse und DNA-Sequenzierung charakte risiert. Für das Plasmid eines Klons mit besonders hoher Cholesterinoxidase-Aktivität wird die Sequenz SEQ ID NO 23 ermittelt. Das betreffende Plasmid wird ppfl-MSM3H-Chol-cyt-Aterm genannt. Es ist zu erwarten, daß in der dargestellten Art und Weise nach Isolierung und Charakte risierung genügend vieler verschiedener Klone auch noch weitere für eine besonders hohe Expression geeignete Klone gefunden werden können. Zur Wiedervervollständigung des 3′- untranslatierten Anteils wird das Plasmid ppfl-MSN3H-Chol-cyt-Δterm mit ClaI und XhoI geschnitten. Ein DNA-Fragment von ca. 1,1kb mit der Translationsinitiations region und dem N-terminalen Anteil des Cholesterinoxidase- Gens wird isoliert und in das ebenfalls mit ClaI und XhoI geschnittene plasmid ppfl-Chol-cyt einligiert (Fig. 4). Das erhaltene Plasmid trägt die Bezeichnung ppfl-MSN3H-Chol-cyt.

Beispiel 7 Vergleich der Bildung von Cholesterinoxidase durch die verschiedenen Expressionsplasmide in E. coli

Die Plasmide pUC-Chol-B2, pUC-Chol-B2-BB, pmgl-Chol-SB, plac-Chol-cyt, ppfl-Chol-cyt, ppfl-MSN3H-Chol-cyt werden jeweils in E. coli K12 XL1-blue transformiert. Zum Vergleich der gebildeten Enzymmenge werden die Klone jeweils 15 Stunden bei 30°C in LB-Medium, das 200 µg/ml Ampicillin und folgende weiteren Zusätze enthält, angezogen:

Klone mit den Plasmiden pUC-Chol-B2, pUC-Chol-B2-BB, plac-Chol-cyt, bei denen das Cholesterinoxidase-Gen jeweils unter der Kontrolle des lacUV5-Promotors steht, bekommen zusätzlich 1 mmol/l IPTG, der Klon mit dem Plasmid pmgl-Chol- SB mit dem Glucose-reprimierten mgl-Promotor erhält keinen weiteren Zusatz, Klone mit den Plasmiden ppfl-Chol-cyt, ppfl-MSN3H-Chol-cyt mit dem sauerstoffregulierten pfl-Pro motor erhalten 0,4% Glucose und werden in Stickstoff begasten verschlossenen Serumflaschen angezogen, wobei das Medium mit KOH auf pH 7,0 eingestellt wurde. Nach erfolgter Anzucht wird die erreichte Zelldichte durch photometrische Messung der Trübung bei 420 nm bestimmt. Die Zellen von 1 ml Kulturbrühe werden dann durch Zentrifugation in einer Mikrozentrifuge bei 10.000 g sedimentiert und wieder in 0,5 ml H₂O bidest resus pendiert. Der Zellaufschluß erfolgt durch 2 × 30 Sekunden Ultraschallbehandlung (Branson Sonfier, Modell 450, Standard- Microtip, Konisch). Die so erhaltenen Zellextrakte werden nach entsprechender Verdünnung in den folgenden Enzymtest eingesetzt. Hierzu werden in Quartz-Küvetten pipettiert: 3 ml Kaliumphosphatpuffer (0,5 mol/l, pH 7,5), der 0,4% Thesit® (Boehringer Mannheim GmbH, Katalog-Nr. 006190) enthält, 0,1 ml Cholesterinlösung (0,4% Cholesterin, 10% 1-Propanol, 10% Thesit®), 0,02 ml H₂O₂ (0,49 mol/l in bidest. Wasser), es wird gemischt, nach Zugabe von 0,02 ml Katalase (aus Rinderleber, 20 mg Protein/ml, spezifische Aktivität ca. 65.000 U/mg, Boehringer Mannheim GmbH, Katalog-Nr. 0156744 unmittelbar vor Messung mit eiskaltem Kaliumphosphatpuffer, der 0,4% Thesit enthält, auf 0,075-0,15 U/ml verdünnt) erneut gemischt, die Lösung auf eine Temperatur von 25°C gebracht und anschließend die Reaktion durch Zugabe von 0,05 ml Probelösung gestartet. Nach vorsichtigem Mischen wird die Absorptionsänderung bei 240 nm verfolgt und die Aktivität der Cholesterinoxidase aus dem linearen Bereich der Absorptions kurve ermittelt:

wobei ∈ 240 = 15,5 mmol^-1 × 1 × cm^-1 ist.

Die erhaltenen Werte für Zelldichte und Enzymaktivität sind in Tabelle 1 dargestellt.

Tabelle 1

Die erhaltenen Ergebnisse zeigen, daß mit solchen Konstrukten, die eine zytoplasmatische Expression der Cholesterinoxidase bewirken, eine deutlich höhere Aktivität der rekombinant hergestellten Cholesterinoxidase erhalten werden kann als mit solchen Konstruk ten, die zu einer Sekretion der rekombinant hergestellten Chole sterinoxidase führen.

SEQUENZ PROTOKOLL

Claims

1. Cholesterinoxidase, dadurch gekennzeichnet, daß sie die in SEQ ID NO 2 gezeigte Aminosäuresequenz aufweist.

2. DNA, welche für ein Peptid mit Cholesterinoxidase-Akti vität kodiert und ausgewählt ist aus der Gruppe

a) der in SEQ ID NO 1 gezeigten DNA-Sequenz oder der dazu komplementären DNA-Sequenz,
b) DNA-Sequenzen, die mit der in SEQ ID NO 1 gezeigten DNA-Sequenz oder Fragmenten dieser DNA-Sequenz hybridisieren,
c) DNA-Sequenzen, die ohne die Degeneration des gene tischen Codes mit den in a) oder b) definierten Sequenzen hybridisieren würden und für ein Poly peptid mit derselben Aminosäuresequenz kodieren,

wobei diese DNA eine der in SEQ ID NO 3, 4 und/oder 5 gezeigten Sequenzen aufweist.

3. Verfahren zur Herstellung einer rekombinanten Choleste rinoxidase durch Transformation einer geeigneten Wirts zelle mit einer DNA gemäß Anspruch 2, welche in einem geeigneten Expressionssystem kloniert vorliegt, Kulti vierung der transformierten Wirtszellen und Isolierung der exprimierten Cholesterinoxidase aus dem Zytoplasma der transformierten Zellen.

4. Verfahren gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die verwendete DNA am 5′-Ende eine der in SEQ ID NO 6, 8, 10, 12, 14 oder 16 gezeigten Sequenzen aufweist.

5. DNA gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß sie am 5′-Ende eine der in SEQ ID NO 6, 8, 10, 12, 14 oder 16 gezeigten Sequenzen aufweist.

6. DNA gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine der in SEQ ID NO 18, 20, 22, 24, 26 oder 28 gezeig ten Sequenzen aufweist.

7. Rekombinante Cholesterinoxidase, dadurch gekennzeichnet, daß sie von einer DNA gemäß Anspruch 2 kodiert wird und am N-terminalen Ende eine der in SEQ ID NO 7, 9, 11, 13, 15 oder 17 gezeigten Sequenzen aufweist.

8. Rekombinante Cholesterinoxidase gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine der in SEQ ID NO 21, 23, 25, 27 oder 29 gezeigten Sequenzen aufweist.

9. Verwendung einer rekombinanten Cholesterinoxidase gemäß einem der Ansprüche 7 oder 8 in einem enzymatischen Test zur Bestimmung von Cholesterin.