DD219505A5 - Verfahren zur herstellung von schweine-wachstumshormonaehnlichen polypeptiden - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von neuen Schweinewachstumshormon aehnlichen Polypeptiden durch Zuechtung eines mit einem DNS-Rekombinant-Molekuel transformierten Wirts und die Isolierung des entstandenen Polypeptids. Diese Polypeptide sind anabol wirksame Hormone fuer Schweine zur Erhoehung der Wachstumsgeschwindigkeit, der Gewichtszunahme und der Fleischproduktion.

Description

Titel der Erfindung;. ,

Verfahren zur Herstellung von Schweine-Wachstumshormonähnlichen Polypeptiden :

. ' ' . .".' . ^:'' '; ' , ' ' ': .. . ; - . .,Anwendungsgebiet der Erfindung:. .

Die Anwendung der vorliegenden Erfindung erfolgt auf dem

Gebiet anabol wirksamer Peptidhormone für Schweine, insbe- "^ sondere zur Beschleunigung des Wachstums, der Gewichtszunahme und Erhöhung der Fleischproduktion..

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen: 30

Schweinewachstumshormon "(SGH) ist ein im Hypophysen-Vorderlappen gebildetes Proteohormon.'SGH. wird vermutlich als Vorläuferprotein synthetisiert und während der Sekretion.aus den Zellen und der Freisetzung in die Blutbahn in das reife ' ' '' ' '· .'

Schweinewachstumshormon überführt. Ein Teil der Aminosäuresequenz von Schweinewachstumshormon ist¹ bekannt; vgl.

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J. B. Mills und Mitarb.,."Cyanogen Bromide Cleavage And Partial Amino Acid Sequence Of Porcine Growth Hormone", J. Biol. Ghem..:, Bd. 245 (1970) S. 3407-15, A. E. Wilhelmi und J.B. Mills, "Studies On The.Primary Structure Of .

₅ Porcine Growth Hormone", in Growth and Growth Hormone, Herausg. A. Pecile und E. E. .Muller, Amsterdam, Excerpta Medica Foundation, 1972, S. 38 - 41 Intern. Congr. Ser.

Wachstumshormone werden normalerweise während des gesamten Lebenszyklus gebildet, in der juvenilen Entwicklung anscheinend jedoch in höheren Mengen. Diese iHormone fördern das Knochenwachstum, die Stickstoffretention, die Proteinsynthese und sie haben einen Einfluß auf den Glukose- und Lipid-Stoffwechsel. Dementsprechend sind Wachstumshormone anabol wirksame Mittel. . ,

Wachstumshormone zeigen eine gewisse:. Spezies-Spezifität. Jedoch können Wachstumshormone einer Spezies auch in einer . . anderen, in der Evolutionsskala tiefer angeordneten Spezies biologisch aktiv sein. Der Mechanismus der Wirkung, des Wachstumshormons ist zwar nicht vollständig geklärt, doch •wurde gezeigt, daß die Verabfdlgung von Wachstumshormon das Wachstum, die Gewichtszunahme und die Fleischproduktion bei Tieren erheblich erhöht. Beispielsweise betrug bei einem Versuch bei Schweinen, denen täglich gereinigtes Schweinewachstümshörmon injiziert wurde, die durchschnittli che Gewichtszunahme 1,02 kg pro Tag im Vergleich zu einer durchschnittlichen Gewichtszunahme von 0,99 kg pro Tag bei der Kontrollgruppe. Wichtiger ist dabei, daß'die behandelten Schweine wesentlich weniger Futter pro Tag als die Kontrollgruppe verbrauchten, nämlich 3,18 kg gegenüber 3,81 kg. Die behandelten Schweine sind von wesentlich besse rer Körperqualität. Die Körper der mit Wachstumshormon behandelten Schweine haben eine durchschnittliche Länge von 77,5 cm und 3,54 cm .Rückenfett, während die Kontrollgruppe eine durchschnittliche Länge von 74,5 cm und eine Rücken-

2.7.SER-1933*Ü8^:;2C

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1. fettdicke von 4,5 cm aufweist. Die chemische Zusammensetzung ^:. des genießbaren Fleisches ist bei den mit Wachstumshormon behandelten Schweinen ebenfalls deutlich verbessert, nämlich 13,50 % Protein, 49,13 % Was.ser und 36,76 % Fett, im^; Vergleich zur Kontrollgruppe mit.10,8 % Protein, 39,43 % . Wasser und 49,27 % Fett; vgl. E.J. Truman, "Some Effects Of Pituitary Anterior. Growth Hormone On Swine", Dissertation, Purdue university (April 1953).

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Das vorstehend beschriebene verbesserte Wachstum und die erhöhte Fleischproduktion unter Verwendung von Schweinewachstumshormon, kann jedoch bei Schweinen nicht in großem Umfang verwirklicht werden, weil SGH nicht in ausreichenden Mengen zur Verfugung steht. SGH wird durch Extraktion aus den .

,Hypophysen von Schweinen gewonnen. Diese Quelle reicht aber nicht annähernd aus, um die erforderlichen Mengen an SGH zu gewinnen. .' " . ^:

Die jüngsten Fortschritte in der Molekularbiologie haben die Einführung.von für bestimmte nicht-bakterielle Proteine kodierender DNS in Bakterienzellen ermöglicht. Allgemein umfaßt die Konstruktion solcher DNS-Rekombinant-Moleküle bei nicht auf chemischem Weg synthetisierter DNS folgende Stufen: Herstellung einer Einzelstrang-DNS-Kopie (cDNS) einer Boten-RNS (mRNS) -Matrize, die für das gewünschte Protein kodiert; Umwandlung der cDNS in doppelsträngige DNS; Einbau, der doppelsträngigen cDNS an.geeigneter Stelle in ein geeignetes . ,: Klonierungsvehikel, -wobei ein DNS-Rekombinantr-Molekül entsteht, und Transformation eines geeigneten Wirts mit dem DNS-Rekombinant-Molekül. Die Kultur des transformierten Wirts ermöglicht dann die Expression der DNS-Sequenz durch den Wirt und die Erzeugung des gewünschten Proteins.

Unter Anwendung'der DNS-Rekombinant-Technologie wurden bereits verschiedene nicht-bakterielle Proteine hergestellt. Dazu gehört die Vorstufe des Rinderwachstumshormons; vgl.

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27.SEß1933*il872C

W.L. Miller und .Mitarb. , J. Biol.Chem. , Bd. 255, (1980)/

S. 7521-7524, EP-A 47 600 und GB 2 073,245A, und die Vorstufe des Wachstumshormons des Menschen; vgl. z.B. .;

J. A. Martial und Mitärb., "Human Growth Hormone: Comple-' . '' .

5·· mentary DNA Cloning And Expression in Bacteria" , Science BD. 205 (1979) ,. S. 602 bis 606 und EF-A. ;20 147.

Keines dieser DNS-Rekombinänt-Verfahren ist jedoch auf die Herstellung von Schweinewachstümshormon, von Schweinewachsturnshormon-ähnlichen Polypeptiden oder auf die erhebliche Verbesserung der Fleischproduktion gerichtet, die erreichbar wäre, wenn technische Mengen von Schweinewachstumshormon .. oder Schweinewachstumshormon-ähnlichen Polypeptiden zur Ver-fügung stünden.

' ' "' · .' : "^Λ ' / Ziel der Erfindung:

Ziel der Erfindung ist es, neue änabol wirksame Schweinewachstumshormon-ähniiche Polypeptide bereitzustellen. ;

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Darlegung des Wesens der Erfindung: ,.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, neue Schweinewachstutnshoriron(SGH)-ähnliche polypeptide mit anaboler Wirkung, die die. Aktivität von Schweinewachstumshormon zeigen, in technischen Mengen bereitzustellen, so daß sie auf verschiedenen Gebieten beispielsweise zur Erhöhung des Wachstums - und zur Steigerung der Fleischproduktion bei Schweinen eingesetzt werden können. : ..

Die Erfindung betrifft somit ein Verfahren' zur Herstellung von Schweinewachstumshormon(SGH)-ähnlichen Polypeptiden, das gekennzeichnet ist dadurch, daß man einen Wirtsorganismus züchtet, der. mit einem DNS-Rekombinant-Molekül transformiert, ist, welches eine funktionsfähig an eine Expressions-

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kontrollsequenz gebundene DNS-Sequenz enthält, die für ein

SGH-ähnliches Polypeptid kodiert,, und die DNS-Sequenz . das Insert pSGH-9D, pSGH-£ 7, pSGH-(Met-Phe) oder ·.

eine DNS-Sequenz, die mit einem der genannten Inserts hybridisiert, oder eine DNS-Sequenz darstellt, die bei der • Expression für ein SGH-ähnliches Polypeptid kodiert,, für das auch bei der Expression durch die Kodons einer der vorstehend genannten DNS-Sequenzen oder Inserts kodiert wird, und daß man das genannte Polypeptid aus der Kulturlösung gewinnt.

Ferner betrifft die Erfindung das gesamte Verfahren mit der Besonderheit, daß man ein DNS-Rekombinant-Molekül verwendet, das als DNS-Sequenz das Insert pSGH-9D, pSGH-^7 oder pSGH-(Met-Phe) oder ein für ein SGH-ähnliches Polypeptid kodierendes Fragment oder Derivat davon enthält. .

Ferner-betrifft die Erfindung das genannte Verfahren mit der Besonderheit, daß man ein DNS-Rekombinant-Molekül ver-20. wendet, das für ein Polypeptid der For-

mel Met-AA. bis M_inn von SGH, Met-AA_O bis ΑΑ._ηΛ von SGH, ι ι y υ ο ι y υ

AA₁ bis AA„ _nn von SGH, AA₀ bis AA_10n von SGH, ein anderes ι jyu ο iyu

Polypeptid, für das DNS-Sequenzen kodieren, die eine Deletion am 5'-terminalen Ende der für reifes SGH kodierenden DNS-Sequenzen aufweisen, oder ein SGH-ähnliches Fragment oder Derivat der gesamten Polypeptide kodiert-

Außerdem betrifft die Erfindung das genannte; Verfahren mit der Besonderheit, daß man eine DNS-Sequenz der Folge

.ATGTTCCCAGGCATGCCCTTGTCCÄGC"'' CTATTTGCCAACGCCGTGCTCCGGGCCCAGCACCTGCACCAACTGGCTGCTGACACCTACAA GGAGTTTGAGCGCGCCTACATCCCGGAGGGACAGAGGTACTCCATCCAGAACGCCCAAGCTG .CCTTCTGCTTCTCGGAGACGATCCCGGCCCCCACGGGCAAGGACGAGGCCCAGCAGAGATCG'

gacgtggagctgctgcgcttctcgctgctgctcatccagtcgtggctcgggcccgtgcagtt CCTCAGCAGGGTCTTCACCAÄCAGCTTGGTGTTTGGCACCTCAGACCGCGTCTACGÄGAäGC TGAAGGACCTGGAGGAGGGCATCCAGGCCCTGATGCGGGAGCTGGAGGATGGCAGCCCCCGG GCAGGCCAGATCCTCAAGCAAACCTACGACAAATTTGACACAAACTTGCGCAGTGATGACGC GCTGCTTAAGAACTACGGGCTGCTCTCCTGCTTCAAGAAGGACCTGCACAAGGCTGAGACAT ACCTGCGGGTCATGAAGTGTCGCCGCTTCGTGGAGAGCAGCTGTGCCTCC,

oder TTCCCAGC ,, catgcccttgtccagcctatttgccaacgccgtgctccgggcccagcacctg'caccaactgg ctgctgacacctacaaggagtttgagcgcgcctacatcccggagggacagaggtactccatc.

. ' cagaacgcccaagctgccttctgcttctcggägacgatcccggcccccacgggcaaggacga GGCCCAGCAGAGäTCGGACGTGGAGCTGCTGCGCTTCTCGCTGCTGCTCATCCAGTCGTGGC tcgggcccgtgcagttcctcagcagggtcttcaccaacagcttggtgtttggcacctcagac cgcgtctacgagaagctgaaggacctggaggagggcatccaggccctgatgcgggagctgga ggatggcagcccccgggcaggccagatcctcaagcaaacctacgacaaätttgacacaaact tgcgcagtgatgacgcgctgcttaagaactacgggctgctctcctgcttcaagaaggacctg cacaaggctgagacatacctgcgggtcatgaagtgtcgccgcttcgtggagagcagctgtgc

CTCC, oder . .

atgagcctatttgccaacgccgtgctccgggcccagcäcctgcaccaäctggctgc tgacacctacaaggagtttgagcgcgcctacatcccggagggacagaggtactccatccaga acgcccaagctgccttctgcttctcggagacgatcccggcccccacgggcaaggacgaggcc cagcagagatcggacgtggagctgctgcgcttctcgctgctgctcatccagtcgtggctcgg GCCCGTGCAGTTCCTCAGCAGGGTCTTCACCAACAGCTTGGTGTTTGGCACCTCAGACCGCG tctacgagaagctgaaggacctggaggagggcatccaggccctgatgcgggagctggaggat ggcagcccccgggcaggccagatcctcaagcaaacctacgacaaatttgacacaaacttgcg

' cagtgatgäcgcgctgcttaagaactacgggctgctctcctgcttcaagaaggacctgcaca aggctgagacatacctgcgggtcatgaagtgtcgccgcttcgtggagagcagctgtgcctcc

oder agcctatttgccaacgccgtgctccgggcccagcacctgcaccaactgdctgctgaca cctacaaggagtttgagcgcgcctacatcccggagggacagaggtactccatccagaacgcc caagctgccttctgcttctcggagacgatcccggcccccacgggcaaggacgaggcccagca GAGATCGGACGTGGAC-CTGCTGCGCTTCTCGCTGCTGCTCATCCAGTCGTGGCTCGGGCCCG

L TGCAGTTCCTCAGCAGGGTCTTCACCAACAGCTTGGTGTTTGGCACCTCAdACCGCGTCTAC GAGAAGCTGAAGGACCTGGAGGAGGGCATCCAGGCCCTGATGCGGGAGCTGGAGGATGGCAG CCCCCGGGCAGGCCAGATCCTCAAGCAAACCTACGACAAATTTGACACAAACTTGCGCAGTG

1 ATGäCGCGCTGCTTAAGAACTACGGGCTGCTCTCCTGCTTCAAGAA.GGACCTGCACAAGGCT GAGACATACCTGCGGGTCATGAAGTGTCGCCGCTTCGTGGAGAGCAGCTGTGCCTCC verwendet.. _

5 Schließlich betrifft die Erfindung das genannte Verfahren

man mit der Besonderheit, daß/als Expressionskontrollsequenz

. das lac-System, das trp-Systern, die Haupt-Operator- und . Promotor-Regionen des Phagen ^₁., die Kontrollregion des fd-Hüllproteins, eine andere bekannte Sequenz, die die

10 Expression' von Genen prokaryotischer oder eukaryotisCher Zellen und ihrer Viren steuert, oder eine Kombination davon verwendet. ^;

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Durch -die Erfindung werden die vorstehend genannten Schwie- . rigkeiten dadurch gelöst,, daß DNS-Sequenzen bereitgestellt werden, die für SGH oder SGH-ähnliche Polypeptide kodieren und diese Sequenzen in geeigneten Wirtszellen zur Expression gebracht werden, wobei Polypeptide erhalten werden, die die • Wachstums-steigernde biologische Aktivität von SGH aufweisen.

Durch das erfindungsgemäße Verfahren gelingt es zum ersten Mal, Polypeptide mit SGH-Aktivität.in den^für die Verwendung auf verschiedenen Gebieten zur Erhöhung der Wachstumsgeschwindigkeit und Fleischprodüktion von Schweinen erforderlichen Mengen' herzustellen.

Die verwendeten DNS-Sequenzen und DNS-Rekombinant-Moleküle der Erfindung sind in der' Lage, in geeigneten Wirtszellen Schweinewachstumshdrmon oder S.chweinewachstumshormon-ähnliche Polypeptide, d.h. Polypeptide mit der das Wachstum fördernden biologischen Aktivität von SGH, zu erzeugen. Die erfindungsgemäß herstellbaren Polypeptide eignen sich entweder so wie sie in der Wirtszelle gebildet werden oder nach Überführung in Derivate oder Modifizierung als Mittel zur Erhöhung des Wachstums und der Fleischproduktion von Schweinen.

Ein wesentlicher Gesichtspunkt der Erfindung ist die Herstellung von DNS-Sequenzen, die für ein Polypeptid kodieren, das die wachsturnsfördernde biologische Aktivität von SGH aufweist. Diese DNS-Sequenzen enthalten ein eingebautes Stück DNS (Insert), nämlich DNS-Inserts von pBR322 (Pst)/SGH-9D/ pSGH-Δ", pSGH-(Met-Phe), DNS-Sequenzen, die mit den vorstehenden Inserts hybridisieren und die_tfür SGH-ähnliche Polypeptide- kodieren, , und, DNS-Sequenzen, die bei der Expression für ein Polypeptid kodieren,' für das auch bei der Expression einer der vorstehenden DNS-Sequenzen oder Inserts kodiert wird. : . · . . - '

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-ΟΙ Figur 1 zeigt schematisch eine Ausführungsform des Verfahrens der Erfindung zur Herstellung eines Gemisches von DNS-Rekombinant-Molekülen, von denen einige eingebaute DNS-Sequenzen enthalten, die für die Polypeptide der Erfindung kodieren.

Figur 2 zeigt schematisch¹ zwei Ausführungsformen von Klon-Screening-Verfahren zur Auswahl der DNS-Sequenzen der Erfindung. Im ,ersten Verfahren wird eine cDNS-Sequenz mit Be-. Ziehung zu SGH durch' Hybridisierung mit einer Probe von Rinderwachstumshormori-ausgewählt. Im zweiten Verfahren wird eine durch Verdau der cDNS mit Beziehung zu SGH erzeugte Probe . verwendet. . . ^;

Figur...3 zeigt das Vorgehen bei der Sequenzierung zur Bestim^-

mung der Nucleotidsequenz der DNS-Sequenz SGH-9D der Erfin- . dung. - : - ; . . '.

Figuren 4 und 5 zeigen die Nucleotidsequenz und die Amino-20. säuresequenz der DNS-Sequenz SGH-9D der Erfindung.

Figur 6 ist eine durch Computeranalyse bestimmte partielle Liste der Restriktionsstellen der Nucleotid-Sequenz von

Figur 4 und 5. -

' .- :'. . .' ^{; ;} ' " Figur 7 zeigt schematisch eine Ausführungsform der Herstellung des DNS-Rekombinant-Moleküls pSGH-/^7 der Erfindung.

Figur 8 zeigt die wesentlichen Nucleotid-und Aminosäuresequ'en-30" zen von pBGH-A 9 (Ser) , pSGH-9D und pSGH-A7..

Figuren 9 und 10 zeigen schematisch eine Ausführungsform der Herstellung des DNS-Rekombinant-Moleküls pSGH-(Met-Phe) der Erfindung.

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In der Beschreibung werden folgende Ausdrücke verwendet:

Nucleotid: Ein monomeren Baustein von DNS oder RNS. Ein Nucleotid besteht aus drei Komponenten, einer Purin- oder Pyriinidinbase, einem Phosphatrest und einem Fünf-Kohlenstoff Zucker. Die Base ist über eine N-glykosidische Bindung an die 1-Stellung des Zuckers gebunden. Die Kombination einer Base mit dem Zucker wird Nucleosid genannt. Jedes Nucleotid ist durch seine Base gekennzeichnet. Die vier DNS-Basen sind Adenin (A), Guanin (G), Cytosin (C) und Thymin (T). Die vier RNS-Basen sind A, G, C und Uracil (U).

DNS-Sequenz: Die einzelnen Nucleotide sind durch Phosphatbrücken zwischen dem 3V-C-Ätom und dem S'-C-Atom des .bengchbarten-Zuckerrestes (Desoxyribose bzw. Ribose) verbunden.

Codon: Eine DNS-Sequenz von drei Nucleotiden (ein Triplett), das über m-RNS für eine Aminosäure, ein Translations-Startsignal oder ein Translatipns-Stoppsignal kodiert. Beispiels- ^ weise kodieren die Nucleotid-Trippletts TTA, TTG, CTT, CTC, CTA unc CTG für die Aminosäure Leucin (Leu), TAG, TAA und TGA sind Translations-Stoppsignale und ATG ist ein Translations-Startsignal. . · ."

Leseraster: Die Gruppierung von Codpns während der Translation von m-RNS in Aminosäure-Sequenzen. Während der Translation muß der ,richtige Leseraster beibehalten werden. Beispielsweise kann die Sequenz . G¹CTGGTT-GTAAG in drei Leseraster übersetzt we'rden, von denen jeder eine andere Aminosäure-'

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., Sequenz ergibt:

GCT GGT TGT AAG —,' Ala-Gly-Cys-Lys G CTG GTT GTA AG ~ Löu-Val-Val .GC TGG TTG TAA G — Trp-Leu-(STOP) '

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Polypeptid: Eine Anordnung von Aminosäure-Einheiten,

.die miteinander durch.Peptid-Bindungen zwischen der α-ständigen Aminogruppe und der Carboxylgruppe der nächsten Aminosäure verbunden sind.

Genom: Die gesamte DNS einer Zelle, oder<eines Virus. Das Genom umfaßt unter anderem die für die Polypeptide des Organismus kodierenden Gene sowie Operator, Promotor und Ribosomen-Bindungssequenzen und Wechselwirkungssequenzen, einschließlich solcher Sequenzen,, wie der Shine-Dalgarno-Sequenzen. „

Gen: Eine DNS-Sequenz, die über, ihre Matrizen- oder Boten-RNS (m-RNS) eine Sequenz von Aminosäuren kodiert, die für ein bestimmtes Polypeptid charakteristisch ist.

Transkription: Das Verfahren der Synthese von m-RNS .^an einem Gen.

Translation: Das Verfahren der Synthese eines Polypeptids ^an m-RNS. ' . . ' . . ' . '.;;..

Expression: Das Verfahren der Erzeugung eines Polypeptids an einer DNS-Sequenz oder einem Gen.' Es ist die Kombination von Transkription und Translation.

P.lasmid: Eine extrachromosomale doppelsträngige DNS-Sequenz mit einem intakten Replikon, so daß sich das Plasmid in einer Wirtszelle vermehrt. Beim Einbringen des Plasmids in einen einzelligen Organismus können die Eigenschaften dieses Organismus als Folge der Plasmid-DNS geändert oder transformiert werden. Beispielsweise transformiert ein Plasmid, das. ein Gen für Tetracyclinresistenz (Tet^x) trägt, eine vorher Tetracyclin-empfindliche Zelle in eine Tetracyclin-resistente. Eine durch ein Plasmid transformierte Zelle wird als Transformante bezeichnet.

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Phage oder Bacteriophage: Ein bakterielles Virus, das gewöhnlich aus DNS-Sequenzen besteht, die ineine.Proteinhülle (Kapsid) verpackt sind. '·.

Kloniervehikel:" Ein.Plasmid, eine Phagen-DNS oder eine andere DNS-Sequenz, die sich in einer Wirtszeile vermehren kann, die durch eine oder eine geringe Anzahl von Restriktionsendo-¹ nucrease-Erkennungsstellen gekennzeichnet ist, an denen diese DNS-Sequenzen in bestimmter Weise ohne gleichzeitigen Ver-

]q lust einer wesentlichen biologischen Funktion der DNS, wie der Replikation, der Bildung von Hüllproteinen oder von Promotor- oder Bindungsstellen, geschnitten werden können, und die zum Transformationsnachweis ein Markergen enthalten, z.B. ein Gen für Tetracyclin- öder Ampicillinresistenz. Ein . Kloniervehikel wird häufig auch als Vektor bezeichnet.

Klonieren: Das Verfahren zur Herstellung einer Population von Organismen oder DNS-Sequenzen, die sich von einem einzigen Organismus oder.einer Sequenz durch asexuelle Reproduktion

ableitet. -' : ' . . . . ' . ..

DNS-Rekombinant-Molekül oder Hybrid-DNS: Ein Molekül, das aus Segmenten von DNS unterschiedlicher Genome besteht, die Ende an Ende außerhalb lebender Zellen miteinander verbunden worden sind, und das in der Lage ist, bestimmte Wirts-zellen zu infizieren und sich dort aufhalten kann. "

Expressions-Kontrollsequenz: Eine Nucleotid-Sequenz, welche die Expression von DNS-Sequenzen oder Genen steuert und regu-

30/ liert,· wenn sie an derartige Sequenzen funktionsfähig gebunden ist. Beispiele für diese Sequenzen sind das lac-System, das trp-System, die Haupt-Operator- und -Promotorbereiche des Phagen ^, die Kontrollregion des fd-Hüllproteins und andere Sequenzen, von denen bekannt ist, daß sie. die Genexpression proparyotischer oder eukaryotischer Zellen und ihrer Viren steuern, oder deren Kombinationen. , '

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.1 SGH: Schweinewachstumshormon.

Unter Bezugnahme auf Figur 1 wird nun eine Ausführungsform. des Verfahrens der Erfindung zur Herstellung eines Gemisches von DNS-Rekombinant-Molekülen erläutert, von denen einige ·

eingebaute DNS-Sequenzen aufweisen, die für SGH oder SGH- ähnliche Polypeptide kodieren.

Herstellung von- Schweinewachstumshormon-mRNS (SGH-mRNS) enthaltender -Poly A⁺ . RNS / . ;

4 bis 6 g in Trockeneis gefrorene Schweine-Hypophysenvorderlappen (PeIfreeze, Arkansas) werden in eine Lösung von 5 M Guanidiniumthiocyanat, 50 mM Natriumeitrat, 0,5 % Natrium- laurylsarcosyl und 0,1 M ß-Mercaptoäthanol (10 ml/g Hypophyse) eingebracht, vgl. J.M Chirgwin und Mitarb., Biochemistry, Bd. 18 (1979), S. 5294 bis 5299. Dann wird die Hypophyse in dieser Lösung auf 4°C .auftauen gelassen und das Gemisch mit 6 Stoßen von je 20 Sekunden homogenisiert (Polytron).Nach dem Zentrifugieren des Homogenisates (Sorvall, 6000 UpM, . 5 Minuten, Raumtemperatur) werden 7,0 ml des nucleinsäurehaltigen überStandes auf 2,5 ml CsCl (5,7 M in 0,1 M EDTA) geschichtet und'mit Paraffinöl bedeckt. Dann wird das Rohr zentrifugiert ( SW 41, 30 000 U.p.M., 18 Stunden, 20⁰C) um die RNA-haltige Fraktion zu pelletisieren. . . '

Der Überstand wird verworfen und das die gesamte RNS enthal-, tende Pellet'wieder in Wasser suspendiert. Die wäßrige Lösung wird zweimal mit gleichen Volumina Phenol/Chloroform im Verhältnis 1 : 1 und zweimal mit gleichen Volumina Diäthyläther extrahiert. Anschließend wird die RNS mit 3 Volumina Äthanol aus der wäßrigen Phase ausgefällt und der erhaltene Niederschlag durch Zentrifugieren abgetrennt. Gesamtausbeute an RNS: 8 mg. .

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4 mg der vorstehend erhaltenen gesamten RNS werden in 1 ml .;, Tris-HCl (10 mM, pH 7,5) - EDTA (1 mM) ("TE-Puff er") resuspendiert und 10 Minuten auf 65⁰C erhitzt. Nach der Zugabe von 2 M KCl zu einer Endkonzentration von 0,5 M wird das Gemisch auf eine Oligo-dT-rCeliulös'esäule gebracht, die zur Entfernung der gesamten ribosomalen RNS mit 0,5 M KCl gewaschen wird. Schließlich wird die Poly A RNS, die· an die Säule gebunden ist, mit 10 mM Tris-HCl (pH 7,5) bei Raumtemperatur eluiert. Die Poly A RNS-haltigen Fraktionen werden gesammelt. Aus der vereinigten Fraktion wird die RNS wie vorstehend durch /. Fällung mit Äthanol und Salzen, Zentrifugieren und Resuspendieren in Wasser gewonnen.. Ausbeute an Poly A RNS: 200 \ig.

Zur Prüfung der Aktivität der gewonnnen Poly A RNS werden 2 \iq dieser Poly A RNS in vitro unter Verwendung eines Kaninchen-Reticulocyten-Lysat-³⁵S-methionin-zellfreien Systems' (NEN) nach H.R.B. Pelham und R. J. Jackson, Eur. J. Biochem., Bd. 67 (1976), S. 247 ff. translatiert und das Produkt an einem SDS/Polyacrylamid-Gel autoradiographisch getestet. . Dieser Test zeigt, daß die isolierte Poly A RNS translatiert wird und ein Polypeptid mit einem Molekulargewicht erzeugt, das der für aas Schweinewachstums-prähormon erwarteten Größe entspricht (etwa 24 000) .

Die vorstehend gewonnene Poly. A RNS ist natürlich ein Gemisch 'aus einer großen Anzahl unterschiedlicher RNSen (Figur 1). Außer der für SGH oder SGH-ähnliche Polypeptide spezifischen mRNS sind diese RNSen unerwünschte Verunreinigungen (Figur 1). Ungünstigerweise verhalten sich jedoch, diese RNS-Verunreinigungen während des restlichen Klonierverfahrens ähnlich wie SGH-mRNS. Ihre Gegenwart ⁱⁿ der Poly A RNS führt deshalb zu einer großen Anzahl wertloser Klone und zu einem komplexen Screening-Problem·' für die ' Auswahl eines richtigen Klons, d.h. eines für SGH kodieren-' den, aus den viel zahlreicheren ..Verunreinigungen.

Synthese eines SGH-cDNS enthaltenden cDNS-Gemisches

Zur Herstellung einsträngiger DNS-Komplemente zu den vorstehend beschriebenen Poly A RNSen werden 20 μΐ Poly Ä RNS (10 \ig in HO) und 2 μΐ 0,15 M CH₃Hg vermischt. Die erhaltene Lösung wird 15 Minuten bei Raumtemperatur stehen-• gelassen. Dann wird sie mit 10 μΐ Oligo.dT (1 ug/ml). 100 μΐ dNTPs (2,5 mM, d.h. auf eine Endkonzentration von 0,5 mM) ,

32 20 μΐ α- P-dATP (10 mCi/ml), 50 ^!reverse Transkriptase (16 Einheiten/μΐ, Life Sciences) und einem gleichen Volumen Pufferlösung (100 mM Tris-HCl (pH 8,5), 20 mM MgCl , 140 mM KCl und 50 mM DTT in H-O) versetzt.- Das Gesamtvolu- : men der Lösung beträgt 404,4 μΐ. Nach 90 Minuten Inkubieren " der Lösung bei 42°C wird sie für einige Minuten auf 100⁰C erhitzt und zentrifugiert (10 000 χ g, 5 Minuten). Der Überstand enthält die zu den Poly A RNSen komplementären.einzelsträngigen cDNSen. Ausbeute an cDNS: 1,438 μg (über - TCA-Fällung eines kleinen Anteils).

,20 Auch die einzelsträngige cDNS ist tatsächlich ein komplexes Gemisch einer großen- Anzahl von verschiedenen cDNSen, die aus den in dem Poly A RNS-Gemisch vorhandenen entsprechenden mRNSen transkripiert wurden (Figur 1). Ein weiterer Umstand bewirkt' jedoch' noch eine größere Komplexität des ·'. cDNS-Gemisches. Jede der m-RNS-Spezies im Poly A RNS-^Gemisch kann auch unvollständig transkribiert werden.¹ Somit kann eine große Vielfalt von cDNSen aus jeder mRNS-Spezies erzeugt werden (in Figur 1 nicht gezeigt). Da solche unvollständigen cDNSen sich im weiteren Verfahren ähnlich verhal-

3® ten wie die gewünschte cDNS, hat ihre Gegenwart im cDNS-Gemisch 'nur eine weitere Erschwerung des Screening-Verfahrens für gewünschte Klone zur Folge.

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Herstellung von doppelsträngiger cDNS . '.

Zur Umwandlung der vorstehend erhaltenen cDNS in doppel- . strängige cDNS wird die Hälfte der cDNS (0,7 ug) mit 50 μΐ Klenow (0,7 Einheiten/μΐ), 1,5 ^g MgCl- (1 M) und einem gleichen Volumen DNS-Polymerase-Puffer (400 mM Tris-HCl (pH 6,9), 150 mM KCl, 1 mM dNTPs und 20 mM ß-Mercaptoäthanol) versetzt. Das Gemisch wird 17 Stunden bei 16°C und dann weitere 30 Minuten'bei 37⁰C inkubiert. Hierauf wird die DNS durch Zugabe von 1/8 Volumen 2 M Natriumacetat (pH 5,5) und 2,5 Volumen Äthanol und 15 Minuten Kühlen auf -70⁰C ausgefällt. Der erhaltene Niederschlag wird abzentrifugiert (10 000 χ g, 10 Minuten), das Pellet/ mit Äthanol gewaschen, in Wasser resuspendiert und'auf eine Sephadex G.-75 Säule aufgebracht. Die DNS wird mit 1OmM Tris-HCl-0,1 mM EDTA eluiert.,Die DNS-haltigen Fraktionen werden gesammelt. Gesamtvolumen der DNS-haltigen Fraktionen: 377 μΐ.

Die vereinigten DNS-haltigen Fraktionen werden mit 42 μΐ einer Lösung von 2 M NaCl, 500 mM Natriuitiacetat (pH 4,5), 10 mM Zinksulfat und 8 μΐ S1 (1000 Einheiten/μΐ, Boehringer-Mannheim) versetzt. Die Lösung wird dann 30 Minuten bei 30⁰C stehengelassen. Anschließend wird das Gemisch dreimal mit gleichen Volumina Phenol und dann mit Diäthyläther extrahiert ·. Die erhaltene wäßrige Phase wird auf eine Sephadex .. G-75 Säule aufgebracht und die DNS mit 5 mM KCl eluiert. Die DNS-haltigen Fraktionen werden gesammelt und. das Produkt wie vorstehend mit Äthanol ausgefällt.

Klonierung der doppelsträngigen PNS

Für die Klonierung und Expression der doppelsträngigen.cDNS kann eine Vielzahl von Wirt/Klonierungsvehikel-Kombinationen verwendet werden. Außerdem können innerhalb eines jeden Klonierungsvehikels verschiedene Stellen für den Einbau der doppelsträngigen cDNS gewählt werden. Die genaue Wahl für

- -. 16' - / '

] die Klonierung und Expression kann dem Durchschnittsfachmann überlassen werden. .

Die Klonierung wird beispielhaft anhand des bakteriellen' Plasmids pBR322 [F. Bolivar und Mitarb., "Construction And Characterization Of New Cloning Vehicles II. A Multi-Purpose Cloning System", Gene (1977) S. 95 - 113; J. G. Sutcliffe, "pBR322 Restriction Map Derived From The DNA Sequence Accurate DNA Size Markers Up To 4361 Nucleotide Pairs Long", Nucleic Acids-Research, 5 (1978) S.. 2721-28] , und · " zwar an dessen Pst I-Schnittstelle [L. Villa-Komaroff und Mitarb., "A Bacterial Clone Synthesizing Proinsulin", Proc. Natl. Acad. Sei. USA 75 (1978) S. 3727-31] _/ und von E. coli K12 MC1061 [M. Casadaban und S.N. Cohen, J. Mol. Biol., . 138 (1980) S. 179-207] erläutert.

1 . Herstellung von mit Pst !-^-geschnittenem pBR322 mit ' .·' dG-Schwanζen · · _; ,

Plasmid pBR322 wird an zwei aufeinanderfolgenden CsCl-Gradienten gereinigt. Dann werden 25 μ9 davon mit der Endonuclease Pst-I unter üblichen Bedingungen (Figur 1) verdaut. Das mit Pst I geschnittene Plasmid wird dann mit 50 μΐ H₂O, 3 μΐ DTT (10 mM) , 1,5 μΐ dGTP (10 mM), 10 μΐ Gelatine (.1 mg/ml), 10 μΐ terminale Transferase Pufferlösung (10 mM CoCl₂, 1,4 M Kaliumcacodylat und 0,3 M Tris-HCl , (pH 7,6)) und 0,9 μΐ terminale Desoxynucleotidyltransferase (1.60 Einheiten/ml /Ratcliff Biochemicals) versetzt. Die Lösung wird 13 Minuten bei 10⁰C inkubiert, dann mit 5 μΐ EDTA (250 mM) versetzt und zweimal mit gleichen Volumina Phenol/Chloroform im Verhältnis 1 : 1 und dreimal mit gleichen Volumina Diäthyläther extrahiert. Die wäßrige Phase wird für die anschließende Kombination mit doppelsträngiger cDNS mit' dC-Schwänzen aufbewahrt.

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r ^v . π

²· Herstellung von cDNS mit dC-Schwänzen .

An die.doppeisträngige cDNS werden dC-Schwänze angefügt. Dazu wird etwa 1/5 der _: vorstehend' hergestellten cDNS (100 ng) in 25 μΐ.H_O resuspendiert und die Suspension mit 50 ill H₂O, 3 μIDTT (10 inM), 1,5 μΐ dCTP (10 mM) , 10 μΐ Gelatine (1 mg/ml), 10 μΐ terminale Transferase Pufferlösung (10 HiM GoCl-, 1/4 m Kaliumcacodylat und 0,3 M Tris-HCl (pH 7,6)) und 0,9 μΐ terminale Desoxynucleotidyltransferase (160 Einheiten/ml, Ratcliff Biochemicals) versetzt (Figur 1). Das Gemisch wird 13 Minuten bei 10⁰C inkubiert, dann mit 5 μΐ EDTA (250 mM) versetzt und anschließend zweimal mit gleichen Volumina · Phenol/Chloroform im Verhältnis 1. : 1 und dreimal mit gleichen Volumina- Diäthyläther extrahiert. Wieder wird die wäßrige Phase für die Kombination mit dem mit Pst I ger schhittenen pBR322 mit dG-Schwänzen aufbewahrt. ' '

3. Verbindung des pBR322 mit dG-Schwänzen mit der cDNS mit.. dC-Schwänzen

; . .. . '.. '. ' .' ' '

Ι.μΐ mit" Pst I geschnittenes Plasmid pBR322 mit dG-Schwänzen (50 ng) werden mit 2,5 μΐ cDNS mit dC-Schwänzen (1 ng) in 5 μΐ Legierungspuffer (1 M NaCl, 200 mM Tris-HCl (pH 7,6), 10 mM EDTA) und Wasser bis zum Endvolumen von 50 μΐ vermischt. Das Gemisch wird 3 Minuten auf 80⁰C und dann weitere 2 Stunden auf 45°C erwärmt, Danach wird die Temperatur der . Lösung auf 4°C gesenkt und die Lösung etwa 15 Stunden stehengelassen. . ·

Nur sehr wenige der DNS-Rekombinant-Moleküle, die durch die-. se Ligation erzeugt werden, enthalten ein cDNS-Insert mit einem Bezug zu SGH (Figur 1).

4. Transfektion von E. coli K12 MC1061 mit Hybrid-DNS _; . . . ' ·

( Die vorstehend beschriebene Hybrid-DNS aus pBR322 mit dG-

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. Schwänzen und DNS mit «dC-Schwänzen wird in Collodiumbeuteln (UH 100-25) 2 Stunden bei.4°C gegen 1/10 Volumen der vorstehend beschriebenen Legierungspufferlösung dialysiert, , um alle Stoffe mit niedrigem Molekulargewicht auszuschließen. Dann wird das Gemisch zu 200 μΐ E. coli K12 MC1061 gegeben, die vorher im wesentlichen gemäß der. Beschreibung von G.N. Buell und Mitarb., J. Biol.Chem., Bd..254 (1979)·, S. 9279 bis 83 vorbehandelt worden sind. .

Das Plasmid pBR322 enthält ein für Tetracyclinresistenz kodierendes und ein für Ampicillinresistenz kodierendes Gen (Figur 1) . Das letztere wird beim Einbau der cDNS in die Pst I-Schnittstelle inaktiviert. Kolonien, die mit DNS-Re- kombinant-Molekülen transformiert worden sind, welche DNS-inserts an der Pst I-Schnittstelle aufweisen, können'somit aus Kolonien selektioniert werden, die nicht in dieser Weise transformiert worden sind (Figur 1). Es werden etwa 10 000 transformierte Kolonien aus den verwendeten 1 ng cDNS. gewonnen.

.

. Diese Kolonien enthalten eine Vielzahl von DNS-Rekombinant-Molekülen, die vollständige oder teilweise Kopien des RNS-Gemisches in der Poly A RNS darstellen (Figur 1). Die Mehrzahl dieser Moleküle enthält allerdings kein DNS-Insert mit · Bezug zu SGH. .

Screening für einen SGH-cDNS enthaltenden Klon :

Es gibt mehrere Möglichkeiten, eine Klonbibliothek auf einen ein bestimmtes DNS-Rekombinant-Molekül enthaltenden Klon zu screenen, d.h. hier auf einen ein DNS-Insert mit Bezug zu

SGH. Bei einem solchen. Klon-Screening-Verfahren wird beispielsweise ein Pst I-Fragment mit 4oo Basenpaaren (bp), der für Rinderwachs- - [

tunshormon kodierenden cDNS verwendet; vgl. z.B. Miller und

Mitarb. J. Biol. Chem., Bd. 255 (1980), S. 7521 - 7524 und Figur 2 . Diese Sequenz ist auch durch Restriktion von

L .· .· ' J

2ZSER1983*ii8V2C

ι . - 19. - .

1. pBGH-(Met-Äla) mit Pst I verfügbar., das am 16. August 1982 bei American Type Culture Collection unter der Nr'..- ATCC 39173 hinterlagt worden ist. . . .·

5. Diese Probe wird zur Hybridisierungsselektion' an einer in ähnlicher Weise wie vorstehend beschrieben hergestellten Klonbibliothek verwendet (Figur 2).Zunächst wird die Probe im wesentlichen in der von M. Grünstein und D. D. Hogness, "Colony Hybridization: A Method For The Isolation Of ... ; Cloned DNA's That Contain A Specif ic Gene" , Proc. Nat!..

Acad. Sei. USA, Bd. 72 (1975), S. 3961-3965 beschriebenen Weise markiert und dann zum Screening der vorstehend erhaltenen· Klonbibliothek im wesentlichen gemäß der nachstehenden. <Beschreibung unter Verwendung, der SGH-Msp-Fragment-Probe verwendet. -

Aus einem der Klone mit positiver Hybridisierung wird ein . DNS-Rekombinant-Molekül isoliert, das ein inseriertes cDNS-Fragment aufweist, von dem durch Nucleotid-Sequenzanalyse nachgewiesen wird, das es für einen Teil der Aminosäure-

. sequenz. von. SGH kodiert (durch Vergleich mit der bekannten . Aminosäure-Teilsequenz; siehe vorstehend) (Figur 2).

Sodann wird ein 200 bp-Fragment dieser positiven cDNS ^ (durch Verdauung mit Msp; vgl. Figur 2) hergestellt und für die Verwendung als Hybridisxerungsprobe für die vorstehend erhaltene Klonbibliothek von 10 000 Klonen markiert (Figur 2). Zur Hybridisierung werden die TO 000 Kolonien, auf Nitrocellulosefilter (Millipore) übertragen. Die Filter werden etwa 15 Stunden bei 37°C inkubiert. Die Kolonien werden sodann 7 Minuten mit .0,5 M NaOH lysiert. Hierauf werden die Filter mit 1 M Tris-HCl (pH 7,5)·,.0,6.M NaCl neutralisiert (zweimal, jeweils 3 Minuten) und in 2 X SSC .' (0,15 M NaCl-0,015M Natriumeitrat . (pH 7)) eingeweicht. Nach

dem Trocknen der Filter an der Luft werden sie 2 Stunden

im Ofen unter vermindertem Druck.auf 80⁰C erhitzt und ;dann.zwei-

-. 27.SER1983*ii-H^:;--2"C ". '"-.' ' '

_Γ mal in 4Χ SSC (wie oben), 10Χ Denhardt's Lösung und 0,1 % SDS 2 Stunden bei 65⁰C eingeweicht. Dann werden die vorstehend beschriebene 200 bp Probe in einer Menge von 32

25 000 p-Impulse pro Filter (2 Minuten gekocht und dann

rasch abge- ^:

kühlt) und 4X SSC, 10X De.nhardt's Lösung und 0,1 % SDS zugegeben. Die Filter werden 12 bis 14 Stunden bei 65⁰C

hybridisiert, in 4X SSC, 10X Denhardt's Lösung und 0,1'% SDS . 2 Stunden bei 65°C gewaschen, mit 2X SSC 30 Minuten bei 65°C gewaschen und dann getrocknet. Nach 1 Tag Belichtung auf einem Röntgenfilm werden etwa TOO. Kolonien gefunden, die DNS-Inserts enthalten, die mit der Probe hybridisiert haben.

40 dieser positiven Klone werden für die Restriktionsanalyse und Größenfraktionierung ausgewählt (Pvu I/Bgl I) (Figur 3) . Aus dieser Analyse ergibt sich, daß einer der Klone ein DNS-Insert von etwa 750 bp aufweist. Dieser Klon wird ^: als E. coli K12 MC1061 (pBR322(Pst)/SGH-9D), das DNS-Rekombinant-rMo.lekül davon als pBR322(Pst)/SGH-9D und sein Insert als SGH-9D bezeichnet. Diese Nomenklatur zeigt an, daß der Klon E. coli K12 MC1061, transformiert mit einem DNS-Rekombinant-Molekül aus pBR322 und SGH-9D darstellt, bei dem sich das Insert SGH-9D an der Pst I-Schnittstelle des pBR322 befindet (Figur 3).

Bestimmung, der Nucleotidsequenz des Inserts SGH-9D

' Da eine für· SGH kodierende DNS-Sequenz und ihre mutmaßliche Signalsequenz etwa 648 Nucleotide enthalten sollte, wird das Insert SGH-9D zur Analyse.durch Aufzeichnung^:einer Restriktionskarte und Bestimmung der Nucleotidsequenz ausgewählt.

Das zur Bestimmung der Nucleotidsequenz von SGH-9D angewendete Verfahren wird an Hand von Figur 3 erläutert. Zur DNS-Sequenzierung wird im wesentlichen das von A.M. Maxam und W. Gilbert, "A New Method For Sequencing DNA", Proc. Natl.

L . . · . ..' J

^{Γ :} - V - 21 - .--Ζ / - "I

_Ί Acad. Sei. USA, Bd. 74 (1977), S. 560 - 564 verwendet. Die meisten Abschnitte des Inserts SGH-9D werden von beiden Strängen sequenziert und die meisten Restriktions-Schnittstellen, die als markierte Endpunkte dienen (die schwarzen Punkte in Figur 3) werden unter Verwendung von sie. überspannenden Fragmenten sequenziert. Die so erhaltene Nuci.ee— tidsequenz ist in den,Figuren 4 und 5 dargestellt.

In den Figuren 4 und 5 ist zu sehen, daß das Insert yon 11 G-Resten am 5'-Ende und 10 Α-Resten (welche vermutlich das Poly A -E.nde der mRNS wiederspiegeln) ,gefolgt von 24C-Resten am 3'-Ende flankiert ist. Zur Bezugnahme ist das Insert beginnend mit dem ersten.Nucleotid nach dem dG-Schwanz bis zum', letzten Nucleotid vor den Poly-A-Resten numeriert.

' : ."...·. ' ·. .' . ' . ' ··. .. ' ;.. . Durch Vergleich mit der bekannten Aminosäure-Teilsequenz von SGH zeigt sich, daß anscheinend die Nucleotide 1 bis 570 für SGH kodieren und die Nucleotide 571 bis /573 ein Stöppkodon darstellen. SGH ist also anscheinend ein Protein aus .1-90 .

Aminosäuren. Aus der Sequenz geht auch hervor, daß anscheinend' ,ein. Schweinewachstums-Pxähormon existiert. Die tatsächliche Länge und die Zusammensetzung der mutmaßlichen Signaloder Vorsequenz von SGH ist jedoch noch nicht bestimmt worden, da SGH-9D anscheinend nicht das gesamte kodierende und nicht kodierende 5'-Ende des Schweinewachstums-Prähormons umfaßt. Die ersten drei Aminosäuren der mutmaßlichen Signal— Sequenzen werden als Säuren -T, -2 und;-3 bezeichnet (Figuren 4 und 5). SGH-9D umfaßt wegen der Lage der Poly A-Reste anscheinend den gesamten nicht kodierenden' 3'-Bereich.

. . ..·' ·

Die Auswahl von Klonen mit dem gesamten kodierenden., und. nicht kodierenden 5'-Bereich und. die Identifizierung de.r vollständigen Präsequenz des Schweinewachsturns-Prähormons kann . vom Fachmann leicht ohne den Umfang der Erfindung zu ü-berschreiten durchgeführt werden. Beispielsweise können die positiven Klone, die vorstehend bestimmt wurden,, im wesent-

27.SER-1933*il8^!i2C

^Γ . ' .. - 22 - ; /., ^: ..- -.· \^

•j lichen wie vorstehend, jedoch unter Verwendung einer vom 5'-Ende des Inserts SGH-9D entnommenen Probe einem Screening unterzogen werden. Eine solche Probe kann beispielsweise durch Verdau von SGH-9D mit Nar I und Abtrennen des Fragments zwischen den Nucleotiden -5 und -60 hergestellt werden

(Figur 4). Dieses Fragment kann dann wie vorstehend markiert und zur Auswahl eines Klons benützt werden, der einen vollstandigeren 5'-Bereich von SGH enthält. Dieser Klon kann . dann, wenn er nicht auch das' vollständige 3' -Ende von SGH-9D {θ umfaßt, über eine gemeinsame Restriktionsschnittstelle mit dem gesamten SGH-9D oder einem Teil davon in bekannter Weise kombiniert werden, wobei eine einzige DNS-Sequenz ,erhalten wird, die den vollständigen kodierenden, und nicht kodierenden Bereich von SGH umfaßt. . ;

.15 ' . ' · .·. -. . .. ' - . ; ' ' Die in den Figuren 4 und 5,für SG^-9D gezeichnete Polypeptidstruktur berücksichtigt natürlich nicht irgendwelche Modifizierungen des Proteinsy die iii vivo durch Wechselwirkung mit in vivo-Enzymen, besipielsweise Glykosilierung, verursacht werden. Diese Struktur ist deshalb nicht notwendigerweise . identisch mit dem im Schwein erzeugten SGH. Das Protein hat jedoch:sehr ähnliche, wenn nicht identische wachstumserhöhende ^J biologische Eigenschaften. Die in den Figuren 4 und 5 gezeichnete Proteinstruktur schließt auch nicht die Mögliohkeit aus, daß andere Modifizierungen, entweder auf der . Ebene des Gens oder in den Aminosäuren selbst, wie Mutationen, einschließlich Substitutionen einzelner oder mehrerer Basen, Deletionen, Insertionen oder Inversionen, chemische Derivat- . ,bildung, oder Selektion von aktiven Fragmenten solcher Struktüren ebenfalls Verbindungen ergeben, die die Aktivität des SGH zeigen..

Die Nueleotidsequenz des SGH-9D wurde ferner zur Bestimmung - der Identität und der Lage einiger Restriktionsendonuclease-Schnittstellen einer Computeranalyse unterzogen. Die Ergeb- : nisse dieser Analyse sind in Figur 6 dargestellt.

.-27,3ER19-33 *ilB'^!;-2G,- ' . ;

- ./. ^! \ - 2'3 - ; . . . .· . ., ' Synthese, eines'SGH-ähnlichen Polypeptids .

Das Ausmaß, in dem ein Protein erzeugt wird, wird von zwei Hauptfaktoren bestimmt: Die Anzahl der Kopien seines Gens innerhalb der Zelle und der Wirkungsgrad, mit dem diese Genkcpien transkribiert und tränslatiert werden. Die Wirksamkeit von Transkription und Translation, die zusammen die Expression ergeben, hängt ihrerseits von Nucleotidsequenzen ab,, die sich normalerweise vor der ..gewünschten Kodierungssequenz befinden. Diese Nucleotidsequenzen oder Expressions-Kontrollsequenzen bestimmen unter anderem die Stelle, an der die-RNS-Polymerase zum. Start der Transkription angreift (die Promotorsequenz) und an der' die Ribosomen gebunden werden und mit der mRNS (dem Produkt der Transkription) zum

^ Start der Translation in Wechselwirkung treten. Nicht alle diese Expressions-Kontrollsequenzen besitzen die gleiche Wirksamkeit^ Es ist deshalb von Vorteil,; die spezifischen, für ein bestimmtes Protein kodierenden Sequenzen von ihren benachbarten Nucleotidsequenzen abzutrennen und sie statt ... dessen mit anderen Expressions-Kontrollsequenzen. zu verbinden, um ein höheres Maß an Expression zu erreichen. Danach kann das neu geschaffene DNS-Fragment in ein Mehrkopien-Plas-, mid oder ein Bakteriophägen-Derivat eingebaut werden, um. die Anzahl der Genkopien innerhalb der Zelle zu erhöhen'und da-

durch die Ausbeute an expremiertem Protein.weiter zu steigern.

Zur Herstellung von SGH-ähnlichen Polypeptiden nach den Verfahrender Erfindung .kann somit eine. Vielzahl von Wirt-Expressionskontrolisequenz-Vektor-Kombinationen verwendet

werden. Geeignete Vektoren können beispielsweise aus Segmenten von chromosomalen, nicht-chromosomalen und synthetischen DNS-Sequenzen, wie den verschiedenen bekannten bakteriellen Plasiüiden von E. coli einschließlich col E1 , pCR1, pBR322 und ihren ;Derivaten, Plasmiden.mit breiterem Wirtsbereich,

'

wie RP4, Phagen-DNS, beispielsweise die zahlreichen Derivate von Phage "λ und Vektoren, die sich von Kombinationen der vor-

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stehend genannten ableiten, wie Vektoren, die einen Bereich von pBR322, einen Bereich von Phage Λ und einen synthetischen Bereich umfassen, bestehen. Geeignete Wirtsorganismen sind bakterielle Wirte, wie die E. coli-Stämme, ζ.B. E. coli K12

5. MC1061, E^coli HB101, E. coli XI776, E. coli X2282, E_₁_co_li MRCI, sowie Stämme von Pseudomonas/ Bacillus subtilis, Bacillus;stearothermophilus, und.anderen Bazillen, Hefen und andere. Pilze, tierische oder pflanzliche Wirte, wie tierische (einschließlich menschliche) oder pflanzliche Zellen in KuI-tür oder andere Wirtsorganismen · Geeignete Expressionskontrollsequenzen können die Operator-, Promotor- und Ribosomenbindungs- und -WechselwirkungsSequenzen (einschließlich Sequenzen-wie Shine Dalgarno Sequenzen) des Lactose-Operons von E. coli (das lac-System), die entsprechenden- Sequenzen des Tryptophan-Synthetase-Systems von, E. coli (das trp-System) die Haupt-Operator- und Promotor-Bereidhe ^: des Phagen γ\ (0_TP_T und O₁₃P ), den Kontrollbereich des Phage . fd-Hüllproteins,\oder andere Sequenzen/ die die Expression von Genen proparyotischer :.oder eukaryotischer .

Zellen und deren Viren steuern oder unterstützen, oder ver-schiedene Kombinationen davon umfassen» .

Natürlich sind nicht alle Kombinationen vor Wirtsorganismen, Expressionskontrollsequenzen und Vektoren bei einer bestimmten kodierenden DNS-Sequenz gleich wirksam. Jedoch ist der Fachmann in der Lage,·eine geeignete Kombination aufgrund der vorliegenden Beschreibung auszuwählen und dabei folgende Gesichtspunkte zu,beachten: Biosicherheit, die in den für SGH-kodierenden DNS-Sequenzen der Erfindung für bestimmte

;30 Konstruktionen verfügbaren Schnittstellen, die Größe der zu exprimierenden SGH-artigen Polypeptide, die Anfälligkeit dieser Polypeptide für protyolytisehen Abbau durch Enzyme der Wirtszelle, die mögliche Verunreinigung dieser Polypeptide durch Proteine der Wirtszelle, die während der Reinigung schwer abzutrennen sind, die .Expressionseigenschaften der für SGH und SGH-ähnliche Polypeptide kodierenden Sequenzen, .

L ' /. ·

27.3tR198'3*ll8<2C

' · wie die Struktur der DNS-Sequenz und die Lage der Start- und . Stopp-Kodons im Hinblick auf die Expressionskontrollsequenzen, sowie andere vom Fachmann als wesentlich erkannte Faktoren.

Ebenfalls bekannt sind verschiedene Verfahren zum Einbau einer DNS-Sequenz und einer Expressionskontrollsequenz in einen Vektor« Dazu gehören beispielsweise direkte Ligation, synthetische Linker, mit E'xonuclease und Polymerase verbundene Ausbesserungsreaktionen und .anschließende Ligation oder Erweiterung des DNS-Strangs mit DNS-Polymerase und einer geeigneten einsträngigen Matrize und anschließende Ligation Alle diese Verfahren können für die Synthese der SGH-ähnlichen Polypeptide der Erfindung benutzt werden. . -.''..

Die Expression der DNS-Sequenz in einer gegebenen Kombination von Wirtsorganismus, Expressionskontrollsequenz und Vektor führt möglicherweise zu Produkten, die nicht mit reifern SGH identisch sind.'"'Beispielsweise'kann, die exprimierende DNS-Sequenz für reifes SGH plus ein Methionin oder einen Teil oder die gesamte mutmaßliehe Signalsequenz von SGH oder andere Aminosäuren ohne Bezug zu SGH kodieren. Die zur Expression kommende DNS-Sequenz kann auch für nur einen Teil oder Teile des SGH allein oder zusammen mit Methionin oder anderen Aminosäuren kodieren. Beide Möglichkeiten gehören zum Gegenstand der Erfindung. Beispielsweise kann ein Wirtsorganismus, der mit einer Nucleotidsequenz transformiert worden ist, die für ein Schweinewachstums-Prehormon oder für F-met-SGH kodiert, diese SGH-ähnliche Verbindung allein oder an andere Aminosäuren gebunden erzeugen, oder kann _ej._n reifes SGH-Produkt sekretieren. Erforderlich im Rahmen der Er- findung ist nur,, daß das Produkt entweder.nach dem Abtrennen von der' Fermentationskultur oder nach einer üblichen Behandlung, wie Spaltung, synthetische Verbindung oder andere bekannte Verfahren, die Wachstums fördernde biologische. Wirksamkeit von SGH zeigt (das f-met oder andere Aminosäuren ohne Bezug zu SGH sowie essentielle Aminosäuren'des SGH, die aber

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Γ . . - 26 ν ; '

keine Wirksamkeit haben, können vor der Verwendung des Produktes chemisch oder enzymatisch entfernt werden.. Sie können auch bereits von der Wirtszelle während der Expression abgespalten werden.)* . \

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Ausführungsbeispiel

' Es wird die Konstruktion des in Figur 7 dargestellten DNS-

< Rekombinant-Moleküls erläutert, das zur Expression des Schweinewachstumshormon-ähnlichen Polypeptids SGH-A7 in der Lage ist. .

Zunächst wird pBGH-^9(ser) aus E. coli K12 X (pBGH-A 9 (Ser) )

(hinterlegt am ': - '' ... *'-.

16. August 1982 bei American Type Culture Collection unter der Nummer 39174) unter Anwendung eines Verfahrens zur Gewinnung von Plasmiden, im wesentlichen wie von R. D. Klein und Mitarb. Plasmid Bd. 3 (1980) S. 88 bis 91 beschrieben, isoliert. Dann wird dieses Plasmid mit den Restriktionsendonucleasen. EcoRI und BamHI geschnitten und. das EcoRI-BamHI-Fragment (Fragment A) labgetrennt (Figur 7). Das gleiche Plasmid wird ferner mit EcoRI und HgIA₁ geschnitten und das EcoRI-HgiA^-Fragment mit etwa 88 Basenpaaren (Fragment B) wird abgetrennt (Figur 7). Schließlich wird . das gleiche Plasmid mit PvuII und BamHI geschnitten und das PvuII-BamHI-Fragment mit etwa 103 Basenpaaren (Fragment C) abgetrennt (Figur 7). .

Sodann wird das vorstehend beschriebene pSGH-9D mit HgIA₁. - 3Ö

und PvuII unter im wesentlichen gleichen Bedingungen geschnitten- Der Teil, der für SGH kodierenden Sequenz, der sich von der HgiA.-Schnittstelle (GTGCTiC) bis zur PvuII-Schnittsteile (CAG-ACTG) erstreckt, wird, abgetrennt (Figuren 7 und 8). Anschließend wird dieses Fragment.mit den drei

' '· ' '

Fragmenten A, B und C, die vorher aus pBGH-A9(ser) hergestellt worden sind, unter Anwendung üblicher Bedingungen mit T4 DNS-Ligase bei 16⁰C etwa 15 Stunden ligiert.

is ^!. Z C :

^Γ ' . ' '. :- ^2Ί -.. ' :. ' · ^π

Wegen der Ähnlichkeiten zwischen der für BGH kodierenden Sequenz von pBGH-Ä 9(Ser) und pSGH-9D und den Degenerierungserscheinungen des genetischen Kodes kodiert das bei der .vorstehend beschriebenen Ligation' erhaltene DNS-Rekombinant-Molekül für ein SGH-ähnliches Polypeptid, bei dem nach einem f-Met-Start die ersten sieben Aminosäuren fehlen (Figuren 7 und 8) . . . , .. ·.

Die für SGH kodierende Sequenz, die dieses Molekül kennzeichnet, -weist drei Nucleotide auf, die verschieden sind von derjenigen, die für SGH in pSGH-9D kodieren- -(Figuren 4 und .5). Zwei dieser drei Unterschiede ergeben sich aus Unterschieden zwischen der für BGH kodierenden .Sequenz und der für SGH kodierenden Sequenz (A und C, Figur 8). Der dritte Unterschied stammt von der besonderen Konstruktion, die bei der Herstellung des pBGH-A 9(Ser) verwendet, wurde (C, Figur 8). Keiner dieser Unterschiede in der Nucleotidsequenz ändert - die Aminosäuresequenz des SGH-ähnlichen Polypeptids, für ; das die inserierte DNS-Sequenz von pSGH- A7 kodiert.

Sodann werden 200 μΐ vorbehandelte E. cpli K12 \ in Gegen-. wart von TO μΐ 0,1 M MgCl_ durch 15. Minuten Abschrecken, der Zellen in Eis, 2 Minuten Inkubieren bei 42⁹C und dann 10 Minuten Inkubieren bei Raumtemperatur transformiert. Nach der·

Nährlösung Zugabe von 2 ml L- / werden die Zellen 1 Stunde bei 37°G gezüchtet. Mengen von 200 μΐ werden danach in Petrischalen verbracht, die mit 50 μg/ml Ampicillin ergänzte L- / ' enthält. Die Kolonien werden 16 Stunden bei 37⁰C wachsen gelassen.. Danach werden willkürlich 24 Ampicillin-resistente Klone ausgewählt.

Alle diese Klone werden Ί2 Stunden bei 37⁰C in 5 ml mit

. Nährlösung 5Ö μσ/ml Ampicillin ergänzter L-' /'; · gezüchtet. Die Plasmid-DNS von 1 ml Zellen aus jeder Kultur wird.nach dem von Klein und Mitarb., a.a.O. beschriebenen Verfahren gereinigt. Dann wird eine Großenfraktionxerung der EcoRI-BamHI-Inserts

27.SER1983*ilBi^;2C

^Γ -28 -

.. ¹ in den 24 Plasmiden durch EcoRI-BamHI-Restriktion und. PoIy-'·.. acrylamid-Gelfraktionierung durchgeführt. Es werden neun Fragmente ausgewählt, die Inserts"mit geeigneter Größe aufweisen- Dann wird E- coil MC1061 im wesentlichen wie von 5- G.N- Buell und Mitarb., J. Biol. Chem., Bd. 254 (1979),

S. 9279 bis 9283 beschrieben mit einem dieser Klone, der als .pSGH-A7 bezeichnet wird, transformiert. Ferner werden die Zellen auch mit pci857 (ein kleines Plasmid, das eih temperaturempfindliches. P -Repressor-Gen und ein für Kanamycinresistenz kodierendes Gen trägt) transformiert. Mit pSGH-Δ und pci 857 transformierte Zellen werden durch 16 Stunden Züchten der Kolonien bei 30⁰C in mit Ampicillin (50 μg/ml) und Kanamycin (40 \ig/ml) ergänzter L-Nährlösung selektioniert.

^ Hierauf werden willkürlich Ampicillin-und Kanamycinresistente Kolonien ausgewählt und etwa 15 Stunden bei 30⁰C in 5 ml L-Nährlösung, die wie vorher mit Ampicillin und Kanamycin ergänzt ist, gezüchtet. Die Kulturen werden dann bei 42°C mit 25 ml L-Nährlösung verdünnt und die Zellen 2 Stünden bei 42°C bis zu einer optischen Dichte von 1 ge-

züchtet. , ' - " '

ur Gewinnung der von den transformierten Zellen erzeugten SGH-ähnlichen Polypeptide wird 1 ml Zellen entnommen,. 4 Minuten bei 8000 U.p.M. zentrifugiert und mit 50 μΐ Laemmli-Pufferlösung versetzt (1 % SDS); .vgl.. Laemmli, Nature,. Bd. (1970), S. 681 ff·. Das Gemisch wird 15 Minuten zum Sieden erhitzt und dann werden die Zellen erneut 4 Minuten bei 8000 U.p.M. zentrifugiert, um die. zellulären Bruckstücke zu entfernen. Der überstand wird durch kompetitives-Radio-

3Q immunoassay -für SGH· unter Verwendung von Kaninchen-Antisera gegen authentisches BGH geprüft. Ausbeute: SGH-Aktivitat (mg/1): 32; SGH-ähnliche Moleküle pro Zelle: 1,6 χ 10 .

Die DNS-Sequenzen und DNS-Rekombinant-Moleküle der Erfin-

' '

dung ermöglichen also die Herstellung von SGH-ähnlichen Poly-, peptiden in hoher Ausbeute. Außerdem ermöglichen die Seguen-

• 2/.St:Ri98S*118.72G

zen, Moleküle und Verfahren der Erfindung die Herstellung neuer .SGH-ähnlicher Polypeptide, die sich nach einer üblichen Reinigung als allgemeine anabole Wirkstoffe für Schweine eignen, insbesondere zur Erhöhung des Wachstums, der Gewichtszunahme und der,Fleischproduktion dieser Tiere. ' .

/ Das vorstehend beschriebene Beispiel, für ein Verfahren zur Erzeugung eines SGH-ähnlichen Polypeptids gemäß vorliegender Erfindung ergibt ein, SGH-ähnliches Polypeptid, bei dem im Vergleich mit dem authentischen SGH die ersten 7 Amino- säuren fehlen und ein f-Met vorhanden ist. Im Rahmen der Erfindung kann der Fachmann ohne weiteres Konstruktionen aus-ϊ führen, mit denen andere SGH-artige Polypeptide erzeugt wer-· den können. Beispielsweise kann eine Konstruktion hergestellt werden, in der ein ATG-Startkodon oder ein AGT-Startkodon und andere Kodons direkt mit dem TTC-Kodon verbunden sind, das für die erste Aminosäure des authentischen SGH kodiert. Eine solche Konstruktion ermöglicht die Erzeugung von reifem SGH-, das an ein f-Met oder über andere Aminosäuren an .ein f-met gebunden ist (alle Aminosäuren, die nicht Teil des reifen SGH sind oder essentielle Aminosäuren des SGH, die keine Wirksamkeit haben, können während der Expression oder danach/bevor das Polypeptid zur Behandlung von Tieren verwendet wird, entfernt werden) · Die Verwendung von¹ pSGH-^7 in E-coli HB101 ist infolge der hohen Ausbeuten für die Herstellung von SGH-ähnlichen Polypeptiden der Erfindung bevorzugt. .

Ein für die Herstellung einer Konstruktion, die für f-metreifes SGH kodiert ,nützliches Verfahren ist in- den Figuren 9 und 10 dargestellt. Bei dieser Ausführungsform wird pSGH-9D mit Haell geschnitten. Die.Nucleotide, die vor dem TTC-Kodon, das für die Aminosäure I des reifen SGH kodiert, verbleiben, werden entfernt. Das verbleibende Fragment wird ³⁵· mit Aval geschnitten, um ein kodierendes 5^r-Ende des reifen SGH, beginnend mit TCC, zu .isolieren. Dieses Fragment wird

'., dann mit Aval-BamHI-Fragment von ,pSGH- Δ 7, das fiir das . kodierende 3'-Ende von reifem SGH kodiert, verbunden. Das dabei erhaltene Fragment wird dann in einen von pBGH-ZU9 (Ser) abgeleiteten, vorstehend beschriebenen Klonierungsvektor eingebaut, so daß das TTC-Kodon über ^ei* stumpfes Ende mit einem, ATG-Kodon verbunden wird. Dementsprechend ermöglicht diese Konstruktion (pSGH-(Met-Phe)) die Erzeugung von'f-met-reifes SGH .in entsprechenden Wirtsorganismen. . . :"... ;

Nach anderen Ausfuhrungsformen der Erfindung können weitere neue SGH-ähnliche Polypeptide, die Deletionen aus dem authen tischen SGH oder Aminosäure-Modifikationen im Vergleich zu ·. authentischem SGH aufweisen, durch entsprechende Konstruktionen in der DNS-Ebene oder durch chemische oder enzymatisehe Umsetzung nach der Polypeptidheistellung.erzeugt werden . Beispielsweise wird in einer Ausführungsform unter Anwendung der vorstehend beschriebenen Verfahren ein Δ 3-SGH erhalten. Alle diese Konstruktionen und Polypeptide sind Teil der Erfindung. · .. . . ·. ·

Natürlich sind nicht alle diese Konstruktionen gleich wirk-,, sam'bei der Herstellung der gewünschten SGH-ähnlicheri- Poly-· peptide der Erfindung. Der Fachmann kann aber ohne weiteres eine Konstruktion und ein Polypeptid. auswählen, das für ein bestimmtes Expressionssystem, Wirtsorganismus und Anwendung geeignet ist, wenn die hier beschriebenen Verfahren und Assays angewendet werden. . .

Die vorstehend beschriebenen SGH-ähnlichen Polypeptide können nach ihrer Reinigung zur Behandlung von Schweinen verwen det werden. Dabei werden die üblicherweise für die Verabreichung von Wachstumshormonen an Tiere zur Erhöhung'ihres Wachstums und der Fleischproduktion benutzten Mittel und Verfahren angewendet; vgl. z.B. E. J. Truman, a.a.O. Beispielsweise zeigt das gemäß vorstehender Beschreibung hergestellte SGH-A7 im Rattentest eine ähnliche Wirkung auf die Erhöhung der Gewichtszunahme wie natürliches SGH.

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·] Spezielle Beispiele für die nach dem Verfahren der Erfindung hergestellten Mikroorganismen und DNS-Rekombinant-Moleküle sind die bei American Type Culture Collection am 15. September 1982 hinterlegten Kulturen, die als. SGHr-A und

5 B bezeichnet werden: A: E. coli K12 MC1061 (pSGH-9D) B: E. coli K12^-(pSGH-"Δ7)

Diese Kulturen haben die Hinterlegungsnummern ATCC 39191. 10 bzw. 39192.

27.SE.Ri9a3*ilS-;2'C

Claims (5)

Γ -32- T fErfindungsanspruch

1 ATGACGCGCTGCTTAAGAACTACGGGCTGCTCTCCTGCTTCAAGAAGGACCTGCACAAGGCT GAGACATACCTGCGGGTCATGAAGTGTCGCCGCTTCGTGGAGAGCAGCTGTGCCTCC verwendet.

; - ' ' ' -1.10.B4- 02 01347 '

] ' . .' ,'.'· . ATGTTCCCAGCCATGCCCTTGTCCAGC."

CTATTTGCCAACGCCGTGCTCCGGGCCCAGCACCTGCACCAACTGGCTGCTGACACCTACAA

GGAGTTTGAGCGCGCCTACATCCCGGAGGGACAGAGGTACTCCATCCAGAACGCCCAAGCTG CCTTCTGCTTCTCGGAGACGATCCCGGCCCCCACGGGCAAGGACGAGGCCCAGCAGAGATCG

GACGTGGAGCTGCTGCGCTTCTCGCTGCTGCTCATCCAGTCGTGGCTCGGGCCCGTGCAGTT CCTCAGCAGGGTCTTCACCAACAGCTTGGTGTTTGGCACCTCAGACCGCGTCTACGAGAÄGC TGÄAGGACCTGGAGGAGGGCATCCAGGCCCTGATGCGGGAGCTGGAGGATGGCAGCCCCCGG GCAGGCCAGATCCTCAAGCAAACCTACGACAAATTTGACACAAACTTGCGCAGTGATGACGC GCTGCTTAAGAACTACGGGCTGCTCTCCTGCTTCAAGAAGGACCTGCACAAGGCTGAGACAT ACCTGCGGGTCATGAAGTGTCGCCGCTTCGTGGAGAGCAGCTGTGCCTCC,

; . ' oder TTCCCAGC

CATGCCCTTGTCCAGCCTATTTGCCAACGCCGTGCTCCGGGCCCAGCACCTGCACCAACTGG CTGCTGACACCTACAAGGAGTTTGAGCGCGCCTACATCCCGGAGGGACAGAGGTACTCCATC CAGAACGCCCAAGCTGCCTTCTGCTTCTCGGAGACGATCCCGGCCCCCACGGGCAAGGACGA

15 · · . . ' ' ·. : ·: . ' ' . - -

. GGCCCAGCAGAGATCGGACGTGGAGCTGCTGCGCTTCTCGCTGCTGCTCATCCAGTCGTGGC TCGGGCCCGTGCAGTTCCTCAGCAGGGTCTTCACCAACAGCTTGGTGTTTGGCACCTCAGAC cgcgtctacgagaagctgaaggacctggaggagggcatccaggccctgatgcgggagctgga ggatggcagcccccgggcaggccagatcctcaagcaaacctacgacaaatttgacacaaact tgcgcagtgatgacgcgctgcttaagaactacgggctgctctcctgcttcaagaaggacctg

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CACAAGGCTGAGACATACCTGCGGGTCATGAAGTGTCGCCGCTTCGTGGAGAGCAGCTGTGC CTCC, oder

ATGAGCCTATTTGCCAACGCCGTGCTCCGGGCCCAGCACCTGCACCAACTGGCTGC TGACACCTACAAGGAGTTTGAGCGCGCCTACATCCCGGAGGGACAGAGGTACTCCATCCAGA ACGCCCAAGCTGCCTTCTGCTTCTCGGAGACGATCCCGGCCCCCACGGJGCAAGGACGAGGCC CAGCAGAGATCGGACGTGGAGCTGCTGCGCTTCTCGCTGCTGCTCATCCAGTCGTGGCTCGG GCCCGTGCAGTTCCTCAGCAGGGTCTTCACCAACAGCTTGGTGTTTGGCACCTCAGACCGCG TCTACGAGAAGCTGAAGGACCTGGAGGAGGGCATCCAGGCCCTGATGCGGGAGCTGGAGGAT GGCAGCCCCCGGGCAGGCCAGATCCTCAAGCAAACCTACGACAAATTTGACACAAACTTGCG CAGTGATGACGCGCTGCTTAAGAACTACGGGCTGCTCTCCTGCTTCAAGAAGGACCTGCACA AGGCTGAGACATACCTGCGGGTCATGAAGTGTCGCCGCTTCGTGGAGAGCAGCTGTGCCTCC

oder AGCCTATTTGCCAACGCCGTGCTCCGGGCCCAGCACCTGCACCAACTGGCTGCTGACA CCTACAAGGAGTTTGAGCGCGCCTACATCCCGGAGGGACAGAGGTACTCCATCCAGAACGCC CAAGCTGCCTTCTGCTTCTCGGAGACGATCCCGGCCCCCACGGGCAAGGACGAGGCCCAGCA

GAGATCGGACGTGGAGCTGCTGCGCTTCTCGCTGCTGCTCATCCAGTCGTGGCTCGGGCCCG

TGCAGTTCCTCAGCAGGGTCTTCACeAACAGCTTGGTGTTTGGCACCTCAGACCGCGTCTAC GAGAAGCTGAAGGACCTGGAGGAGGGCATCCAGGCCCTGATGCGGGAGCTGGAGGATGGCAG

_L CCCCCGGGCAGGCCAGATCCTCAAGCAAACCTACGACAAATTTGACACAAACTTGCGCAGTG

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1 . . Verfahren, zur Herstellung von Schweinewachstumshormon·(SGH).-ähnlichen Polypeptiden, gekennzeichnet dadurch, daß man einen Wirtsorganismus züchtet, der mit einem DNS-Rekombinant-Molekül transformiert ist, _r welches eine funktionsfähig an eine Expressionskontrollsequenz gebundene DNS-Sequenz enthält, die für ein SGH-ähnliches Polypeptid kodiert, und die DNS-Sequenz das Insert pSGH-9D , pSGH-^Δ. 7 , pSGH- (Met-Phe) / oder eine DNS-Sequenz , die mit einem der genannten Inserts hybridisiert, oder eine DNS-Sequenz darstellt, die bei der Expression für ein SGH-ähnliches Polypeptid kodiert -, für das auch bei der Expression durch die Kodoni einer der vorstehend genannten DNS-Sequenzeh oder Inserts

kodiert wird, ' . . . :' ·..·

und daß man das genannte Polypeptid aus der Kulturlösung gewinnt. - .

2. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß. man ein DNS-Rekombinant-Molekül verwendet, das als DNS-Sequenz das Insert pSGH-9D, pSGH-A7 oder pSGH-(Met-Phe) oder ein für ein SGH-ähnliches Polypeptid kodierendes Fragment oder Derivat davon enthält.

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3. Verfahren nach Punkt 1 oder 2, gekennzeichnet dadurch, daß man ein DNS-Rekombinant-Molekül verwendet, das für •'ein Polypeptid der Formel Met-AA1

bis AA₁₉₀ von SGH, Met-AA- bis AA _9Q von SGH, AA₁ bis. AA₁₉₀ von SGH, AA_g bis AA₁₉₀ von SGH, ein anderes Polypeptid, für das DNS-Sequenzen kodieren, die eine Deletion am 5'-terminalen Ende der für reifes SGH kodierenden DNS-Sequenzen aufweisen, oder ein SGH-ähnliches Fragment oder Derivat der genannten Polypeptide kodiert.

4. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß man

eine DNS-Sequenz der Folge

L · . J

5 5. Verfahren nach Punkt 1 bis 4gekennzeichnet dadurch, daß man als .' · . Expressionskontrollsequenz das lac-System, das tr ρ -Sy stem, die Haupt-Operator- und Promotor-Regioneri des Phagen /\, die Kontrollregion des fd-Hüllproteins, eine andere bekann-~ te Sequenz, die die Expression von Genen prokaryotischer 10 oder eukaryotischer Zellen und ihrer Viren steuert, oder eine Kombination davon verwendet. '

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