DE60004496T2

DE60004496T2 - Verwendung von threalose zur stabilisierung von einem flüssigen impfstoff

Info

Publication number: DE60004496T2
Application number: DE60004496T
Authority: DE
Inventors: Sandrine Lentsch Graf; Jean-Rene Cartier
Original assignee: Aventis Pasteur SA
Current assignee: Sanofi Pasteur SA
Priority date: 1999-03-23
Filing date: 2000-03-23
Publication date: 2004-04-08
Anticipated expiration: 2020-03-24
Also published as: DE60004496D1; WO2000056365A1; AU3438900A; ES2200845T3; JP2002540079A; ATE246937T1; EP1163008B1; PT1163008E; FR2791895A1; FR2791895B1; EP1163008A1; DK1163008T3; CA2366869A1

Description

Die Erfindung bezieht sich auf das Gebiet der Impfstoffe. Spezieller betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Stabilisierung von flüssigen Impfstoffzusammensetzungen, die unter ihren Antigenen wenigstens ein an ein Trägerprotein gebundenes Polysaccharid umfassen.
Man kennt im Stand der Technik solche Impfstoffzusammensetzungen, bei denen bestimmte Antigene, um immunogen zu sein, an Trägerproteine gebunden sein müssen. Dies ist insbesondere der Fall bei den Zusammensetzungen, die für die Impfung gegen die Infektionen, die von dem Bakterium Haemophilus influenzae vom Typ b hervorgerufen werden, bestimmt sind, die als Impfstoffantigen Kapselpolysaccharid des Bakteriums oder Polyribosylribitolphosphat (PRP), gekoppelt an das Tetanus-Anatoxin T, umfassen. Solche Impfstoffzusammensetzungen neigen dazu, ihre Immunogenizität und folglich ihre Wirksamkeit im Laufe der Zeit zu verlieren. Um diesen Nachteil zu beheben, ist die im Stand der Technik allgemein vorgeschlagene Lösung die Lyophilisierung. Diese Lösung, die vom Standpunkt des hinsichtlich der Erhaltung der Immunogenizität erhaltenen Ergebnisses zufriedenstellend ist, weist jedoch den Nachteil auf, das Herstellungsverfahren zu erschweren und folglich seine Kosten zu erhöhen. Außerdem ist es zum Zeitpunkt der Verabreichung des Impfstoffes notwendig, einen zusätzlichen Arbeitsschritt zur Aufnahme des Lyophilisats mit einer sterilen Flüssigkeit auszuführen, was einerseits eine zusätzliche Belastung für den Arzt darstellt und andererseits, wie jedes Hantieren, die Gefahr, schlecht ausgeführt zu werden, beinhaltet. Es ist folglich wünschenswert, eine andere Lösung für das Problem des Verlusts der Immunogenizität der an ein Trägerprotein gebundenen Polysaccharid-Antigene im Laufe der Zeit, wenn sie in einer flüssigen Impfstoffzusammensetzung vorliegen, zu finden.
Dazu schlägt die Erfindung ein Verfahren zur Stabilisierung einer flüssigen Impfstoffzusammensetzung vor, die wenigstens ein Antigen, das aus einem an ein Trägerprotein gebundenem Antigen besteht, umfasst, dadurch gekennzeichnet, dass es darin besteht, der Impfstoffzusammensetzung Trehalose zuzufügen.
So erhält man eine Impfstoffzusammensetzung, die, obwohl sie flüssig ist, ihre immunogene Eigenschaft im Laufe der Zeit behält, selbst wenn sie bei Raumtemperatur aufbewahrt wird.
Das erfindungsgemäße Verfahren weist den Vorteil auf, einfach und schnell zu sein, was daraus ein Verfahren der Wahl für ein Industrieunternehmen macht.
Zahlreiche weitere Vorteile der vorliegenden Erfindung werden beim Lesen der folgenden detaillierten Beschreibung hervortreten.
Das Verfahren zur Stabilisierung einer flüssigen Impfstaffzusammensetzung ist dadurch gekennzeichnet, dass besagte Impfstoffzusammensetzung eine monovalente Zusammensetzung, das heißt, dass sie für den Schutz gegen eine einzige Krankheit bestimmt ist, oder plurivalente Zusammensetzung, das heißt, dass sie zum Schutz der Person, der sie verabreicht wurde, gegen mehrere Krankheiten bestimmt ist, sein kann. In allen Fällen stellt wenigstens eine der Impfstaffvalenzen ein Polysaccharid-Antigen dar, das an ein Trägerprotein gebunden ist. Unter den Polysaccharid-Antigenen, die in die Zusammensetzung eines Impfstoffs eingehen und erfindungsgemäß stabilisiert werden können, kann man die Polysaccharide anführen, die in den Kapseln von Bakterien vorliegen, die Polysaccharide, die in den Wänden von gramnegativen Bakterien vorliegen oder auch die Polysaccharide, die in den Wänden von Pilzen vorliegen. So ist es möglich, die Polysaccharide zu verwenden, die man in den folgenden Mikroorganismen antrifft: Pseudomonas (beispielsweise P. aeruginosa), Staphylococcus, Streptococcus (beispielsweise S. pneumoniae), Klebsiella (beispielsweise K. pneumonia), Salmonella (beispielsweise S. typhi und S. paratyphi), Escherichia coli, Neisseria (beispielsweise N. meningitidis), Shigella (beispielsweise S. dysenteria, somnei oder flexneri), Haemophilus (beispielsweise H. influenzae vom Typ b), Moraxella, Vibrio cholerae, Mycobacterium tuberculosis, Candida, Cryptococcus neoformans sowie Hansenula.
Die vorliegende Erfindung hat ihre ganze Bedeutung für ein Verfahren zur Stabilisierung der Impfstoffzusammensetzungen, die das Kapselpolysaccharid von Haemophilus influenzae Typ b oder Polyribosylribitolphosphat umfassen, gezeigt.
Die allgemein als Impfstoffantigene verwendeten Polysaccharide weisen im Allgemeinen das Merkmal auf, T-unabhängig zu sein, das heißt insbesondere, dass das Gedächtnis des Immunsystems gegenüber solchen Antigenen schwach ist und dass diese Polysaccharide bei den Kleinkindern im Allgemeinen nicht immunogen sind. Um sie T-abhängig zu machen, ist es üblich, sie mit Trägerproteinen (unter Protein sind im Sinne der vorliegenden Erfindung auch die Peptide oder Polypeptide eingeschlossen) zu kombinieren, um ein Polysaccharid-Trägerprotein-Konjugat zu erhalten. Diese Proteine sind insbesondere diejenigen, die üblicherweise auf dem Gebiet der Impfstoffe verwendet werden: Diphtherie-Anatoxin, Tetanus-Anatoxin, mutante, nicht toxische Form CRM₁₉₇ des Diphtherie-Anatoxins, Protein aus äußerer Membran vom Typ 1 (OMP1) von Neisseria meningitidis sowie jedes native oder synthetische Peptid oder Polypeptid, das die gleiche Funktion erfüllen kann, beispielsweise die in der Patentanmeldung WO98/31393 beschriebenen Peptide.
Die Bindung des Polysacchands an das Trägerprotein kann je nach dem Polysaccharid und dem verwendeten Protein variieren. Es handelt sich im Allgemeinen um eine kovalente Bindung, die einen Spacer beteiligen kann. Je nach der verwendeten Bindungsart ist das erhaltene Antigen, das man allgemein konjugiert nennt, ein Antigen, in dem das Polysaccharid über eine einzige chemische Funktion (Konjugate vom Typ Sonne oder Neoglyookonjugat) oder über mehrere Funktionen (Konjugate vom Typ Rechen oder Knäuel) an das Trägerprotein gebunden ist.
Da das Verfahren zur Stabilisierung einer flüssigen Impfstoffzusammensetzung dadurch gekennzeichnet ist, dass besagte Impfstoffzusammensetzung plurivalent sein kann, ist es möglich, dem aus dem Polysaccharid-Trägerprotein-Konjugat bestehenden Antigen eine oder mehrere weitere Valenzen zuzufügen, die ebenfalls aus einem Polysaccharid-Trägerprotein-Konjugat oder aus jedem anderen Antigen unterschiedlichen Typs bestehen. Unter den weiteren Valenzen, die in die erfindungsgemäße Impfstoffzusammensetzung eingehen können, kann man insbesondere anführen: Keuchhusten, Polio, Diphtherie, Tetanus, Hepatitis (A, B, C ...) Windpocken, Mumps, Masern, Dengue-Fieber, japanische Enzephalitis, Gelbfieber, Röteln, Grippe, Meningitis, Pneumonien ... usw.
Erfindungsgemäß umfasst dieses Verfahren zur Stabilisierung einer Impfstoffzusammensetzung die Zugabe von Trehalose in ausreichender Menge, um das Aufrechtehalten der Immunogenizität des aus dem Polysaccharidkonjugat bestehenden Antigens im laufe der Zeit zu ermöglichen.
Trehalose oder α-D-Glucopyranosyl-α-D-glucopyranosid ist ein Disaccharid, das für seine Schutzwirkung auf die Proteine bekannt ist, wenn sie hohen Tempe raturen ausgesetzt werden, insbesondere bei Trocknungs- oder Lyophilisierungsvorgängen. Nach der Lehre der Schrift US 4 891 319 könnte ihre Schutzwirkung durch eine Substitution der Wassermoleküle durch Trehalosemoleküle erklärt werden, da beide Verbindungen OH-Funktionen umfassen.
Trehalose ist im Stand der Technik auch als zellschütrend bekannt.
Überraschenderweise und ohne dass dies von den bekannten Eigenschaften der Trehalose abgeleitet werden kann, wurde jetzt gefunden, dass diese Verbindung es ermöglichte, die Immunogenizität von Impfstoffzusammensetzungen zu erhalten, selbst in dem Fall, wo diese keiner Temperaturerhöhung oder einem Trocknungsverfahren unterzogen worden wären.
Im Gegensatz dazu haben andere untersuchte Zucker, die dafür bekannt sind, Eigenschaften zu haben, die denen der Trehalose nahe sind, nicht zu zufriedenstellenden Ergebnissen geführt.
Gemäß einem besonderen Merkmal der Erfindung wurde festgestellt, dass eine Trehalosemenge zwischen 3 und 12% und vorzugsweise 5 zur Lösung des Problems der Stabilität der Impfstoffzusammensetzung zufriedenstellend war. Bei dieser Konzentration wurde keinerlei Toxizitätsreaktion festgestellt.
Die Trehalose, die sich für die Zwecke der Erfindung eignet, muss eine Trehalose mit pharmazeutischer Qualität sein, ohne dass es jedoch notwendig ist, dass sie einen Grad absoluter Reinheit aufweist. Die von der Firma SIGMA unter der Bezeichnung T9531 gelieferte Trehalose eignet sich bestens.
Die Zugabe der Trehalose kann zu Beginn des Herstellungsverfahrens ausgeführt werden; sie kann auch am Ende des Verfahrens zu der Formulierung, allein oder im Gemisch mit den anderen Hilfsstoffen, zugefügt werden.
Die folgenden Beispiele veranschaulichen spezieller eine Ausführungsform der Erfindung.
Beispiel 1
Man stellt 3 verschiedene Impfstoffzusammensetzungen her, indem man folgendermaßen vorgeht:

a – Herstellung von 4 Hilfsstoff Vorratslösungen
– Lösung von 50 mM Tris-hydroxyl-amino-methan – 42,5% Saccharose Zusammensetzung für 1 Liter: 6,06 g Tris-hydroxyl-amino-methan 425 g Saccharose Wasser PPI q. s. p. 1 Liter
– 20%ige Trehaloselösung Zusammensetzung für 400 ml Trehalose: 80 g Wasser PPI q. s. p. 400 ml pH = 7 ± 0,1 nach Einstellen mit einer 2,5 N Natriumhydroxidlösung
– 2M Natriumchloridlösung Zusammensetzung für 1 Liter Natriumchlorid: 117 g Wasser PPI q. s. p. 1 Liter
– Lösung von 50 mM Tris-hydroxyl-amino-methan Zusammensetzung für 1 Liter Tris-hydroxyl-amino-methan: 6,06 g HCl 5 N: 8,54 ml Wasser PPI q. s. p. 1 Liter
b – Herstellung von 3 Hilfsstofflösungen (A, B, C) aus den vorherigen 4 Vorratslösungen. Die verwendeten Volumina an Vorratslösungen sind in der folgenden Tabelle angegeben:
c – Jede Hiffsstafflösung wird durch Filtration über einen Filter Millipack 60 mit 0,22 μm Trenngrenze sterilisiert.
d – Um jede der Impfstoffzusammensetzungen zu erhalten, fügt man in einen im Autoklaven sterilisierten 500 ml Schott-Kolben der Reihe nach zu: 290 ml von jeder der hergestellten Hiffsstofflösungen, dann 29,6 ml einer Zusammensetzung, die PRP-T und Saccharose enthält. Die Kolben werden 5 Minuten bei Raumtemperatur, dann 2 Stunden bei 4°C gerührt.
e – Jede Zusammensetzung wird in Serumflaschen aus Glas verteilt, die 6 Monate bei 25°C gehalten werden.

Die Endzusammensetzung jeder Formulierung ist in der folgenden Tabelle zusammengefasst:
Beispiel 2
Man verfügt über 5 Sätze mit 8 weiblichen Mäusen OF 1 mit einem Gewicht von 22 bis 24 Gramm. Die Mäuse werden in 8er Gruppen aufgeteilt. Jede Gruppe wird verwendet, um eine der gemäß Beispiel 1 erhaltenen Impfstoffzusammensetzungen A, B oder C zu untersuchen, wobei eine Impfstoffzusammensetzung als negative Kontrolle (die nur nicht konjugiertes PRP enthält) dient und eine Impfstoffzusammensetzung als positive Kontrolle dient, die aus dem Impfstoff Act-Hib^TM, verkauft von der Firma PASTEUR MERIEUX Sérums et Vaccins, besteht.
Man verabreicht jeder Maus subkutan 0,5 ml der zu untersuchenden Impfstoffzusammensetzung, entsprechend 2,5 μg Polyosid. Jede Maus erhält eine Injektion bei J0 und eine Wiederholungsinjektion bei J14.
Das Serum jeder Maus wird bei J0, J14 und J21 entnommen.
Beispiel 3
Die entnommenen Seren werden durch Radioimmunoassay titriert. Die erhaltenen Ergebnisse werden folgendermaßen ausgewertet:

– Das geometrische Mittel wird aus dem Titer der 8 Sera berechnet.
– Die % Mäuse mit Reaktion (Serum hat einen Titer > 0,5) wird bestimmt.
– Die erhaltene Differenz der Titer bei J14 und J21 wird berechnet, um die Wirkung der Wiederholungsimpfung zu bestimmen.

Das Produkt wird als konform bezeichnet, wenn die 3 folgenden Bedingungen erfüllt sind:

– Bei J21 haben wenigstens 75% der Mäuse einen Titer >= 0,5.
– Die Differenz zwischen den bei J14 und J21 erhaltenen Titem ist statistisch signifikant.
– Die Titerdifferenz zwischen dem untersuchten Produkt und der positiven Kontrolle ist bei J21 nicht statistisch signifikant.

Die erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle zusammengefasst:
Diese Ergebnisse zeigen, dass die erfindungsgemäßen Impfstoffzusammensetzungen ihre Immunogenizität nach 6-monatiger Lagerung bei 25°C behalten.
Untersuchungen, die auf die gleiche Weise an Zusammensetzungen ausgeführt wurden, die bei 37°C gelagert wurden, haben gezeigt, dass eine erfindungsgemäße Zusammensetzung, die 5% Trehalose umfasst, ihren immunogenen Charakter selbst nach 3 Monaten Lagerung behielt.

Claims

Verfahren zur Stabilisierung einer flüssigen Impfstoffzusammensetzung, die wenigstens ein Antigen, das aus einem an ein Trägerprotein gebundenen Polysaccharid besteht, umfasst, dadurch gekennzeichnet, dass es darin besteht, der Impfstoffzusammensetzung Trehalose zuzufügen.
Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die zuzufügende Trehalosemenge zwischen 3 und 12 Masse-% liegt.
Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass besagtes Polysaccharid Kapselpolysaccharid von Haemophilus influenzae Typ b oder Polyribosylribitolphosphat ist.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass besagtes Polysaccharid ein Pneumokokken-Polysaccharid ist.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass besagtes Polysaccharid ein Meningokokken-Polysaccharid ist.
Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass besagtes Trägerprotein Tetanus-Anatoxin ist.
Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass besagtes Trägerprotein Diphtherie-Anatoxin ist.
Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die zuzufügende Trehalosemenge etwa 5% beträgt.