ES2200845T3 - Utilizacion de trehalosa para estabilizar una vacuna liquida. - Google Patents

Abstract

Procedimiento de estabilización de una composición vacunal líquida, que comprende al menos un antígeno constituido por un polisacárido unido a una proteína portadora, caracterizado porque consiste en añadir trehalosa a la composición vacunal.

Description

Utilización de la trehalosa para estabilizar una vacuna líquida.

La invención se refiere al campo de las vacunas. Más particularmente, la invención se refiere a un procedimiento de estabilización de composiciones vacunales líquidas que comprenden, entre sus antígenos, al menos un polisacárido unido a una proteína portadora.

Se conocen, en la técnica anterior, dichas composiciones vacunales, en las que ciertos antígenos, para ser inmunógenos, deben estar unidos a proteínas portadoras. Es el caso principalmente de las composiciones destinadas a la vacunación contra las infecciones provocadas por la bacteria Haemophilus influenzae de tipo b, que comprende, como antígeno vacunal, el polisacárido capsular de la bacteria o polirribosilribitol-fosfato (PRP) acoplado al toxoide tetánico T. Dichas composiciones vacunales tienen tendencia a perder su inmunogenicidad, y por consiguiente su eficacia con el tiempo. Para paliar este inconveniente, la solución propuesta en general en la técnica anterior es la liofilización. Esta solución, satisfactoria desde el punto de vista del resultado obtenido en materia de conservación del poder inmunógeno, presenta sin embargo el inconveniente de alargar el procedimiento de fabricación y por consiguiente aumentar el coste. Además, en el momento de la administración de la vacuna, es necesario efectuar una operación suplementaria de recuperación del liofilizado por un líquido estéril, lo que por una parte representa una molestia más para el práctico facultativo y por otra parte, comprende, como cualquier manipulación, el riesgo de ser mal efectuada. Por consiguiente es deseable buscar otra solución al problema de la pérdida de poder inmunógeno durante los tiempos de antígenos polisacarídicos unidos a una proteína portadora cuando están presentes en una composición vacunal líquida.

Con este fin, la invención propone un procedimiento de estabilización de una composición vacunal líquida que comprende al menos un antígeno constituido por un polisacárido unido a una proteína portadora, caracterizado porque consiste en añadir a la composición vacunal trehalosa.

Así, se obtiene una composición vacunal que, aunque líquida, conserva su poder inmunógeno con el tiempo, incluso cuando se conserva a temperatura ambiente.

El procedimiento según la invención presenta la ventaja de ser sencillo y rápido, lo que le convierte en un procedimiento elegible para uso industrial.

Otras numerosas ventajas de la presente invención surgirán con la lectura de la descripción detallada siguiente.

El procedimiento de estabilización de una composición vacunal líquida se caracteriza porque dicha composición vacunal puede ser una composición monovalente, es decir que esté destinada a la protección contra una sola enfermedad, o plurivalente, es decir que esté destinada a proteger al individuo al que se le va a administrar, contra varias enfermedades. En todos los casos, al menos una de las valencias vacunales está representada por un antígeno polisacárido unido a una proteína portadora. Entre los antígenos polisacáridos susceptibles de entrar en la composición de una vacuna y de ser estabilizados según la invención, se pueden citar los polisacáridos presentes en las cápsulas de bacterias, los polisacáridos presentes en las paredes de bacterias Gram-negativas o incluso los polisacáridos presentes en las paredes de hongos. Así, es posible utilizar polisacáridos encontrados en los microorganismos siguientes: Pseudomonas (por ejemplo P. aeruginosa; Staphylococcus, Streptococcus (por ejemplo S. pneumoniae), Klebsiella (por ejemplo, K. pneumonia), Salmonella (por ejemplo S. Typhi y S. paratyphi), Escherichia coli, Neisseria (por ejemplo N. meningitidis), Shigella (por ejemplo S. dysenteria, somnei o flexneri), Haemophilus (por ejemplo H. influenzae de tipo b), Moraxella, Vibrio Cholerae, Mycobacterium tuberculosis, Candida, Cryptococcus neoformans así como Hansenula.

La presente invención muestra todo su interés para un procedimiento de estabilización de composiciones vacunales que comprenden el polisacárido capsular de Haemophilus influenzae tipo b o polirribosilribitol-fosfato.

Los polisacáridos utilizados generalmente como antígenos vacunales presentan generalmente la característica de ser independientes de T, es decir principalmente que la memoria del sistema inmunitario frente a dichos antígenos es débil y que estos polisacáridos no son generalmente inmunógenos en niños pequeños. Con el fin de hacerlos dependientes de T, es corriente asociarlos a proteínas portadoras (por proteína, en el sentido de la presente invención, se incluyen igualmente péptidos o polipéptidos) con el fin de obtener un conjugado polisacárido-proteína portadora. Estas proteínas son principalmente las utilizadas habitualmente en el campo de las vacunas: toxoide diftérico, toxoide tetánico, forma mutante no tóxica de CRM_{197} del toxoide diftérico, proteína de la membrana externa de tipo 1 (OMP1) de Neisseria meningitidis, así como cualquier péptido o polipéptido natural o de síntesis susceptible de realizar la misma función, por ejemplo los péptidos descritos en la solicitud de patente WO98/31393.

La unión del polisacárido a la proteína portadora puede variar según el polisacárido y la proteína utilizada. Generalmente se trata de enlace covalente, para hacer intervenir un brazo espaciador. Según el modo de unión empleado, el antígeno obtenido que se denomina generalmente conjugado, es un antígeno en el que el polisacárido está unido a la proteína portadora por una única función química (conjugados del tipo sol o neoglicoconjugados) o por varias funciones (conjugados de tipo raqueta o pelota).

El procedimiento de estabilización de una composición vacunal líquida se caracteriza porque dicha composición vacunal que puede ser plurivalente, es posible añadir al antígeno constituido por el conjugado polisacárido-proteína portadora uno u otras varias valencias constituidas igualmente por un conjugado polisacárido-proteína portadora, o por cualquier otro antígeno de tipo diferente. Entre las otras valencias susceptibles de entrar en la composición vacunal según la invención, se pueden citar principalmente: tos ferina, poliomielitis, difteria, tétanos, hepatitis (A, B, C...), varicela, paperas, sarampión, Dengue, encefalitis japonesa, fiebre amarilla, rubéola, gripe, meningitis, neumonías, ... etc.

Según la invención este procedimiento de estabilización de una composición vacunal comprende la adición de trehalosa en cantidad suficiente para permitir el mantenimiento con el tiempo del poder inmunógeno del antígeno constituido por el conjugado polisacarídico.

La trehalosa o \alpha-D-glucopiranosilo-\alpha-D-glucopiranosido es un disacárido conocido por su acción protectora de proteínas cuando se someten a temperaturas elevadas, principalmente durante las operaciones de secado o liofilización. Según las enseñanzas de la patente de EE.UU. 4.891.319 su acción protectora podrá explicarse por una sustitución de las moléculas del agua por moléculas de trehalosa, comprendiendo los dos compuestos funciones OH.

La trehalosa se conoce igualmente en la técnica anterior como protector de las células.

De manera sorprendente y sin que esto pueda deducirse de las propiedades conocidas de la trehalosa, se ha encontrado ahora que este compuesto permite conservar el poder inmunógeno de las composiciones vacunales, incluso en el caso en el que estas no sean sometidas a una elevación de la temperatura o a un procedimiento de secado.

Por el contrario, otros azúcares ensayados conocidos por tener propiedades próximas a la trehalosa, principalmente la lactosa, no conducen a resultados satisfactorios.

Según una característica particular de la invención, se ha observado que una cantidad de trehalosa comprendida entre 3 y 12%, y preferiblemente 5, era adecuada para resolver el problema de estabilidad de la composición vacunal. A esta concentración, no se ha presentado ninguna reacción de toxicidad.

La trehalosa que interesa para los fines de la invención debe ser una trehalosa de calidad farmacéutica, sin que sea sin embargo necesario que presente un grado de pureza absoluto. La trehalosa proporcionada por la Sociedad SIGMA con la referencia T9531 interesa mucho.

La adición de trehalosa puede efectuarse al comienzo del procedimiento de fabricación; igualmente puede añadirse en la formulación al final del procedimiento, sola o mezclada con otros excipientes.

Los ejemplos siguientes ilustran más particularmente el modo de realización de la invención.

Ejemplo 1

Se preparan 3 composiciones vacunales diferentes procediendo de la siguiente manera:

a- Fabricación de 4 soluciones madres de los excipientes

\bullet Solución de Tris-hidroxilamino-metano 50 mM-sacarosa al 42,5%

Composición para un litro:

6,06 g de Tris-hidroxilamino-metano

425 g de sacarosa

Agua PPl c.s.p. 1 litro

\bullet Solución de trehalosa al 20%

Composición para 400 ml

Trehalosa: 80 g

Agua PPl c.s.p. 400 ml

pH = 7 \pm 0,1 después de ajuste con una solución de sosa 2,5N

\newpage

\bullet Solución de cloruro de sodio 2M

Composición para 1 litro

Cloruro de sodio: 117 g

Agua PPl c.s.p. 1 litro

\bullet Solución de Tris-hidroxilamino-metano 50 mM

Composición para 1 litro

Tris-hidroxilamino-metano: 6,06 g

HCl 5N: 8,54 ml

Agua PPl c.s.p. 1 litro

b- Fabricación de 3 soluciones de excipientes (A, B, C) a partir de 4 soluciones madres precedentes. Los volúmenes de las soluciones madres utilizadas se indican en la tabla siguiente:

Soluciones madre	Excipiente 1	Excipiente 2	Excipiente 3
Solución de Tris-hidroxilaminometano	72,6 ml	0	0
50 mM, sacarosa al 42,5%
Solución de trehalosa al 20%	0	100 ml	200 ml
Solución de cloruro de sodio 2M	0	19 ml	0
Solución de Tris-hidroxilaminometano	0	72,6 ml	72,6 ml
50 mM
Agua PPl	c.s.p. 363 ml	c.s.p. 363 ml	c.s.p. 363 ml

c-

Cada solución de excipiente se esteriliza por filtración por un filtro Millipack 60 de 0,22 \mum de umbral de corte

d-

Para obtener cada una de las composiciones vacunales, se añaden en un frasco Schott de 500 ml esterilizado en autoclave, en el siguiente orden: 290 ml de cada una de las soluciones de excipientes preparadas y luego 29,6 ml de una composición que contiene PRP-T y sacarosa. Los frascos se colocan con agitación 5 minutos a temperatura ambiente y luego 2 horas a 4ºC.

e-

Cada composición se reparte en frascos revestidos de vidrio que se mantienen 6 meses a 25ºC.

La composición final de cada formulación se resume en la Tabla siguiente:

	Composición A	Composición B	Composición C
PRP-T (\mug de poliósido/ml)	20	20	20
Tris-hidroxilaminometano (mM)	10 mM	10 mM	10 mM
Sacarosa (%)	8,5%	0,78%	0,78%
Trehalosa (%)	0%	5%	10%
NaCl (mM)	0	0,095 mM	0

\newpage

Ejemplo 2

Se disponen de 5 lotes de 8 ratones hembras OF 1, de un peso de 22 a 24 gramos. Los ratones se reparten en lotes de 8. Cada lote se utiliza para ensayar unas composiciones vacunales A, B o C obtenidas según el ejemplo 1, una composición vacunal que sirve de control negativo (que contiene únicamente PRP no conjugado), así como una composición vacunal que sirve de control positivo que está constituida por la vacuna Act-Hib^{R} comercializada por la Sociedad PASTEUR MERIEUX Serums et Vaccins.

A cada ratón se administra, por vía subcutánea, 0,5 ml de la composición vacunal de ensayo correspondiente a 2,5 \mug de poliósido. Cada ratón recibe una inyección el día 0 y una inyección de recuerdo el día 14.

El suero de cada ratón se toma los días 0, 14 y 21.

Ejemplo 3

Los sueros recogidos son valorados por radioinmunoensayo. Los resultados obtenidos se aprovechan de la siguiente manera:

\bullet

Se calcula la media geométrica a partir de la valoración de 8 sueros

\bullet

Se determina el % de ratones que responden (suero que tiene un título >0,5).

\bullet

Se calcula la diferencia de los títulos obtenidos el día 14 y el día 21 para evaluar el efecto de la inyección de recuerdo.

El producto se declara apto cuando se cumplen las 3 condiciones siguientes:

\bullet

El día 21, al menos el 75% de los ratones tiene un título >=0,5.

\bullet

La diferencia entre los títulos obtenidos el día 14 y el día 21 es estadísticamente significativa.

\bullet

La diferencia del título entre el producto ensayado y el control positivo no es estadísticamente significativa el día 21.

Los resultados obtenidos se resumen en la Tabla siguiente:

	GMT a J14	GMT a J21	De acuerdo con
			el producto
Control negativo	<0,09	0,05	-
Control positivo	<0,1	1,3	+
Composición A	0,33	0,99	-
Composición B	0,13	1,6	+
Composición C	0,11	2,9	+

Estos resultados muestran que las composiciones vacunales según la invención conservan su poder inmunógeno después de almacenamiento durante 6 meses a 25ºC.

Los ensayos efectuados de la misma forma en composiciones almacenadas a 37ºC, muestran que una composición según la invención, que comprende 5% de trehalosa, conserva su poder inmunógeno incluso después de 3 meses de conservación.

Claims (8)

1. Procedimiento de estabilización de una composición vacunal líquida, que comprende al menos un antígeno constituido por un polisacárido unido a una proteína portadora, caracterizado porque consiste en añadir trehalosa a la composición vacunal.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque la cantidad de trehalosa que hay que añadir está comprendida entre 3 y 12% en peso.

3. Procedimiento según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque dicho polisacárido es el polisacárido capsular de Haemophilus influenzae tipo b o polirribosilribitol-fosfato.

4. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizado porque dicho polisacárido es un polisacárido de neumococos.

5. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizado porque dicho polisacárido es un polisacárido de meningococo.

6. Procedimiento según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque dicha proteína portadora es toxoide tetánico.

7. Procedimiento según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque dicha proteína portadora es toxoide diftérico.

8. Procedimiento según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la cantidad de trehalosa que se añade es aproximadamente 5%.