CH678492A5 - - Google Patents

Description

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CH 678 492 A5

Beschreibung

Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein Tumorvakzinen.

Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine Vakzine, die aus einem nicht toxischen und hoch wirksamen Hilfsstoff aus mikrobieilen Quellen und tumorassoziierten Antigenen zusammengesetzt ist. Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von Tumorvakzinen. Erfindungsgemässe Vakzinen können zur Behandlung und Vorbeugung von Tumoren eingesetzt werden, wobei durch deren Verabreichung die Wirksamkeit der immunogenen Tumorantigene gesteigert wird.

Es wurde während der letzten neunzig Jahre festgestellt, dass Endotoxin ein wirksamer Immunaktivator ist. In der Veröffentlichung von W.B. Coley in Ann. Surg. 14 199 (1891) wird die Verwendung von «bakteriellen Toxinen» bei der Behandlung von Krebs beschrieben. In der Veröffentlichung in JAMA 54250 (1919) wird ferner erwähnt, dass die Heilungsrate bei nicht operierbaren Patienten, bei Verwendung einer derartigen gemischten mikrobieilen Vakzine 4-7% beträgt.

Anschliessend wurden dann Endotoxinextrakte anhand verschiedener Tiermodelle untersucht. Gratia und Linz beschreiben in Comp, Rend. Soc. de Biol. 108:427 (1931) haemorrhagische Nekrosen und einen diese begleitenden Tumor-Rückgang bei einem transplantierbaren Liposarcom-Modell bei Meerschweinchen. Andere Nagetier-Tumormodelle folgten, wobei auf die folgenden Veröffentlichungen verwiesen sei:

Sarcom 180 bei Mäusen (Shwartzman, G. und Michailovsky, N., Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 29: 737 (1932), Ehrlich-carcinome bei Mäusen (Berendt, M.J. und North, R.J., Exp. Med., 151: 69 (1980) und transplantierbare Tumore bei Ratten (private Mitteilung von Berendt, M.J. und North, R.).

Neue Arbeiten betreffend die Beobachtung von Tumornekrosen bei Tieren, die mit Endotoxin behandelt wurden, deuten darauf hin, dass die Endotoxinfraktion selbst möglicherweise nicht direkt verantwortlich für Nekrosen ist. Es sei in diesem Zusammenhang auf die Veröffentlichung von Carswell, E.A., Old, L.J., Kassel, R.L., Green, S., Liore N., und Williamson, B. in Proc. Nat'l Acad. Sei. USA 72: 3668 (1975) verwiesen. Anstatt dessen kann die Nekrosebildung durch einen Faktor vermittelt oder hervorgerufen- werden, der Tumor-Nekrose-Faktor genannt wird und der in der Folge als TNF abgekürzt wird. Dieser TNF wurde aus Mäusen isoliert, die vorher durch Makrophagen-Aktivatoren, wie BCG, C. par-vum oder Zymosan angeregt worden waren. Ausserdem konnte gezeigt werden, dass TNF gegenüber bestimmten Tumorarten (Tumorlinien) in vitro cytotoxisch ist und dieser Substanz wurde auch eine in vivo Antitumoraktivität zugeschrieben.

Bevor die vorliegende Erfindung gemacht wurde und während der Suche nach mikrobieilen Komponenten, die eine Antitumoraktivität besitzen, zeigte es sich, dass dann, wenn bestimmte Präparate von Endotoxin mit Trehalose-dimycolat, das in der Folge als TDM abgekürzt wird, sowie Öltröpfchen kombiniertwerden und diese Präparate in entwickelte maligne Tumore der Linie 10 bei einem Stamm 2 von Meerschweinchen injiziert wurden, eine hohe Rate an Heilungen auftrat und sich eine systemische Tumorimmunität entwickelte. Dies führte zu einer erneuten Erforschung des Wertes von Endotoxin als immunothe-rapeutisches Mittel.

Die wirksamsten Endotoxinhilfsstoffe waren Phenol-Wasser, abgekürzt als PW, oder Chloroform-Methanol-Extrakte, abgekürzt als CM-Extrakte, von heptosefreien Re-Mutanten und gram-negativen Bakterien. Diese Extrakte enthielten endotoxische Lipopolysaccharide, die in der Folge mit LPS abgekürzt werden, welche in Phenol-Wasser-Extrakten von in der Natur vorkommenden Typen (wilden Typen) von Bakterien enthalten waren.

Sowohl ReGl als auch Lipopolysaccharide verursachten eine rasche Entwicklung einer Shwartzman-ähnlichen nekrotischen Reaktion in Tumoren, wenn sie in Kombination mit Trehalose-dimycolat, abgekürzt als TDMJ, und Öltröpfchen injiziert wurden. Anschliessend an diese Reaktion führte die Lipopoly-saccharid-Kombination, abgekürzt als LPS-Kombination, nur zu einer teilweisen RückentwiGklung der Tumore, in die injiziert worden war und das Wachstum setzte sich nach etwa zwei Wochen fort. Im Gegensatz dazu, führte die Injektion der Kombination ReGI-TDM zu hohen Raten einer dauernden Rück-entwicklung der Tumore und zur Ausbildung einer systemischen Immunität gegen einen Angriff oder eine Herausforderung mit Tumoren der Linie 10. Die Tumorrückentwicklung konnte mit Hilfe von ReGl+TDM oder CWS+TDM mit grösserem Erfolg behandelt werden und es konnten so auch bereits weiter fortgeschrittene Tumore behandelt werden.

In der Veröffentlichung von Dr. J.L. Cantreil et al. in Cancer Research 39,1159-1167, April (1979) wurde beschrieben, dass eine Kombination einer Chemotherapie und einer Immunotherapie hoch wirksam ist, indem sie eine Rückentwicklung von bereits gut ausgebildeten Tumoren bei Mäusen hervorruft, während eine der beiden Behandlungen allein nicht wirksam war. in dieser Arbeit wurde eine Immunotherapie angewandt, bei der mit KCl extrahierte Tumorantigene in Öl in Wasser Emulsionen zusammen mit Trehalose-dimycolat oder ohne Trehalose-dimycolat injiziert wurden.

Auch in den USA Patenten 4 436 727 und 4 505 903 sind verschiedene Kombinationen an gereinigten und entgifteten Endotoxinen oder gereinigten pyridinlöslichen Extrakten von Mikroorganismen mit Zell-wand-Skeiett und/oder mit Trehalose-dimycolat beschrieben und es wird gesagt, dass diese nützlich bei der Behandlung von krebsartigen Tumoren sind.

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Vor der Entwicklung des Gegenstandes der vorliegenden Erfindung wurde jedoch eine Immunothérapie mit biologisch ansprechenden Modifikatoren durchgeführt, und zwar als nicht spezifische Immunotherapie, oder sie wurde nur mit Tumorantigenen durchgeführt. Eine nicht spezifische Immunotherapie hatte jedoch nur eine kurze Wirkung auf Tumore, und Tumorantigene waren bezüglich ihrer Immunogeni-5 tat gering. Ausserdem hatten die Hilfsstoffe, die bisher zur Verwendung in Vakzinen zur Behandlung menschlicher Patienten zur Verfügung standen, eine geringe Aktivität und dementsprechend war die Immunotherapie nicht völlig befriedigend. Obwohl es eine grosse Anzahl an Veröffentlichungen gibt, in denen Hilfsmittel und Tumorantigene beschrieben sind, war es bisher nicht bekannt, nicht toxische biologische Hilfsmittel zu verwenden, um die schützende Immunität zu erhöhen, wenn diese in Kombination mit 10 Tumorantigenen eingesetzt werden.

Ziel der vorliegenden Erfindung war es dementsprechend, ein wirksames nicht toxisches Immunostimulans zu entwickeln, das in Kombination mit tumorassoziierten Antigenen eingesetzt werden kann, um eine schützende und lang anhaltende Tumorimmunität hervorzurufen.

Diese Ziele wurden durch den Erfindungsgegenstand erreicht.

15 Das Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung einer Vakzine, die wirksam bei der Behandlung und prophylaktischen Behandlung, beziehungsweise Verhinderung von Tumoren ist, und die nicht toxische und hoch wirksame Hilfsstoffe aus mikrobieilen Quellen und Tumorantigenen enthält.

Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung war es, ein Verfahren zur Herstellung einer Tumorvakzine zu entwickeln, die gereinigte, entgiftete Endotoxine und Tumorantigene enthält. 20 Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine Vakzine, welche die folgenden Komponenten enthält:

(a) mindestens ein tumorassoziiertes Antigen,

(b) ein gereinigtes, entgiftetes Endötoxinimmunostimulans und

25 (c) mindestens ein weiteres Immunostimulans, das aus der Gruppe ausgewählt ist, welche die folgenden Komponenten umfasst:

(1 ) ein mycobakterielles Zellwandskelett,

(2) Trehalose-dimycolat, und 30 (3) einen pyridinlöslichen Extrakt eines Mikroorganismus.

Die erfindungsgemässen pharmazeutischen Präparate können verwendet werden, um Tumore zu behandeln oder die Ausbildung von Tumoren zu verhindern.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung einer erfin-35 dungsgemässen Vakzine, die zur Behandlung und prophylaktischen Behandlung von Tumoren bei menschlichen und tierischen Patienten geeignet ist. Dieses Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass man eine Mischung aus den folgenden Komponenten herstellt:

(a) mindestens einem tumorassoziierten Antigen,

40 (b) einem gereinigten und entgifteten Endotoxin, und

(c) mindestens einem biologischen Immunostimulans, das aus der Gruppe ausgewählt ist, welche die folgenden Bestandteile umfasst:

1) ein mycobakterielles Zellwand-Skelett,

45 2) Trehalose-dimycolat und

3) ein pyridinlöslicher Extrakt eines Mikroorganismus.

Die erfindungsgemässen Vakzinen enthalten ein tumorassoziiertes Antigen, das in der Folge als TAA abgekürzt wird, ein gereinigtes, entgiftetes Endotoxin-lmmunostimulans und mindestens ein weiteres 50 bakterielles Immunostimulans.

Die tumorassoziierten Antigene, die in den erfindungsgemässen Vakzinen eingesetzt werden, können ganze Zellen, Fraktionen von Zellen oder Extrakte aus Tumorzellen sein, die nach bekannten Arbeitsverfahren hergestellt werden. In manchen Fällen kann es wünschenswert sein, zwei oder mehr Antigene in der gleichen Vakzine einzusetzen.

55 Typische Beispiele für tumorassoziierte Antigene sind Antigene aus Tumoren warmblütiger Tiere, wie zum Beispiel Augenkarzinom, sarkoider Eierstockskrebs, Brusttumore, Adenokarzinome, Pankreaskarziome, Nierenkarzinome, Lungenkarzinome oder ähnliche.

Die Erfindung sei jedoch keineswegs auf die Verwendung dieser genannten tumorassoziierten Antigene beschränkt.

60 Gereinigte, entgiftete, also detoxifizierte Endotoxin-Immunostimulanzien, die in den erfindungsgemässen Vakzinen eingesetzt werden können, wurde als Monophosphoryl-lipid A identifiziert und sie werden in der Folge als MPL abgekürzt. Diese werden nach denjenigen Verfahren hergestellt, die in den USA Patenten Nr, 4 436 727 und Nr. 4 436 728 beschrieben sind und alles was dort über die Gewinnung gesagt wird, gilt auch für die Herstellung dieser Komponente der erfindungsgemässen Vakzinen. Endo-65 toxinextrakte derjenigen Art, die als Ausgangsmaterial zur Herstellung des MPL eingesetzt werden kön3

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nen, können aus irgendwelchen Enterobacteriaciaen gewonnen werden, einschliesslich der Stammorganismen und Mutanten derselben.

in den oben genannten Patentschriften werden die Typen an Mikroorganismen beschrieben, die zur Gewinnung des Ausgangsmaterials eingesetzt werden können und es werden auch verschiedene Methoden zur Herstellung dieses Ausgangsmaterials erläutert. Das entgiftete Endotoxin kann jedoch auch synthetisch oder nach dem Verfahren der Gentechnologie hergestellt werden. Ein zum gegenwärtigen Zeitpunkt bevorzugtes Verfahren zur Herstellung von Endotoxinextrakten ist dasjenige, das von Ghen et al. in j. Infect. Dis. 128 543 (1973) beschrieben wird.

Das Monophosphoryl-Iipid A, abgekürzt als MPL, ist eine Zusammensetzung, die dadurch charakterisiert ist, dass sie kein feststellbares 2-Keto-3-desoxyoctanoat besitzt, etwa 350-475 Nanomole Phosphor pro mg enthält und etwa 1700-2000 Nanomole Fettsäuren pro mg enthält. Die vollständige Struktur eines Monophosphoryl-lipides A, das aus den Lipopolysacchariden von Salmonella minnesota R575 erhalten wurde, sei durch die folgende Strukturformel veranschaulicht:

Das in der erfindungsgemässen Vakzine bevorzugt verwendete Monophosphoryl-Iipid A stellt eine deutliche Verbesserung gegenüber der Verwendung von Endotoxinextrakten, die aus Enterobacteriaciaen gewonnen wurden, dar, weil das MPL entgiftet ist und weil es deshalb keine stark toxischen Komponenten enthält, die dazu geführt hatten, dass entsprechende Endotoxinextrakte für die therapeutische Venwendung ungeeignet sind. Es sei in diesem Zusammenhang auf die Veröffentlichung mit dem Titel «Peptides as Requirements for Immunotherapy of the Guinea-Pig Line-10 Tumor with Endotoxins» von Ribi, et al. in Cancer Immunol. Immunother., Band 7, Seiten 43-58,1979 verwiesen und alles, was in dieser Veröffentlichung erläutert wird, ist auch im Zusammenhang mit dem vorliegenden Erfindungsgegenstand zu berücksichtigen. Die vorteilhaften Eigenschaften, die das MPL im Vergleich zu anderen Endotoxinextrakten aufweist, werden beispielsweise in den USA Patenten Nr. 4 436 727 und Nr. 4 436 728 und in der Veröffentlichung von Ribi, E. im Journal of Biological Response Modifiers, Band 3, Seiten 1— 9:1984 beschrieben, und alle die Fakten, die in diesen Publikationen klargelegt werden, gelten auch für den Gegenstand der vorliegenden Erfindung.

Wie bereits weiter oben erläutert wurde, wird das Endotoxin-lmmunostimulans, das in den erfindungsgemässen Vakzinen eingesetzt wird, nach denjenigen Arbeitsverfahren entgiftet oder detoxifiziert, die in den USA Patenten Nr. 4 436 727 und Nr. 4 436 728 beschrieben sind.

Unter dem Ausdruck «Entgiftung» oder «Detoxifizierung» versteht man, dass die Toxizität des Endo-toxines, also der Wert LD50, bezogen auf den Test der Letalität von Hühnerembryonen, 20 Mikrogramm oder mehr beträgt, während im Gegensatz dazu toxisches Endotoxin in dem angegebenen Test einen Wert für LDso von ungefähr 0,001 Mikrogramm aufweist.

Wie bereits erwähnt wurde, ist in den erfindungsgemässen Vakzinen zusätzlich zu dem darin enthaltenen Monophosphoryl-Iipid A-Immunostimulans noch mindestens ein weiterer bakterieller Hilfsstoff ebenfalls vorhanden. Wie bereits weiter oben erwähnt wurde, gehören diese Hilfsstoffe zu Produkten, die aus der Gruppe ausgewählt sind, welche umfasst:

(a) mycQbacterielles Zellwandskelett,

(b) Trehalose-dimycolat und

(c) pyridinlösliche Extrakte eines Mikroorganismuses.

Das erste bakterielle Adjuvans, das mit dem Antigen und mit dem MPL verwendet werden kann, ist

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das Zellwand-Skelett, das im wesentlichen aus der Zellwand besteht, von der grosse Mengen des Proteins und der Lipide, die normalerweise in der Zellwand vorhanden sind, entfernt worden waren. Dieses Zellwand-Skelett ist ein polymeres Mycolisäure-arabinogalactan-mucopeptid, das Restmengen, beziehungsweise Spurenmengen an Trehalose-mycolaten enthält, die in der Folge als «P3» abgekürzt werden, sowie ferner nicht abgebaute, also unverdaute Tuberculoproteine.

Das Zellwand-Skelett kann von jedem Mikroorganismus erhalten werden, einschliesslich der folgenden Mikroorganismen: M. smegmatis, M. phlei, Nocardia rubra, Nocardia asteroides, Corynebacterium diphtheria, Corynebacterium parvum, M. kansaii, M. tuberculosis (Stamm H 37 und RV und Ayoma B), und M. bovis Stamm BCG. Es sei jedoch darauf hingewiesen, dass auch weitere, hier nicht genannte Mikroorganismen zur Gewinnung des Zellwand-Skelettes herangezogen werden können. Als Beispiele für weitere Mikroorganismen, von denen das Zellwand-Skelett gewonnen werden kann, seien die folgenden Mikroorganismen genannt: E. coli, B. abortus und Coxiella burnettii.

Das Zëllwand-Skelett kann hergestellt werden, indem man Bakterien züchtet und dann gewinnt, beispielsweise ein M. bovis-Stamm BCG (Bacillus Calmette-Guerin). Der so gewonnene gesamte Zellrückstand wird dann mit Hilfe eines Zellfraktionators weiterbehandelt, beispielsweise dem Fraktionator mit der Bezeichnung Ribi Cell Fractionator (Sorvall. Model RF-1). Mit Hilfe dieses Zellfraktionators werden die Zellen aufgebrochen und die äussere Zellhülle oder die Zellwand wird von den protoplasmischen Verunreinigungen getrennt. Die so gewonnenen Zellwände werden dann einer Reihe von Lösungsmittelextraktionen und enzymatischen Behandlungen unterworfen, beispielsweise einer Behandlung mit Trypsin und/oder Chymotrypsin, und man erhält so das gereinigte Zellwand-Skelett.

Ein zweiter bakterieller Hilfsstoff, der in den erfindungsgemässen Vakzinen eingesetzt werden kann, sind die Trehalose-dimycolate, die in der Folge als TDM abgekürzt werden und diese können aus verschiedenen Organismen gewonnen werden, wie zum Beispiel M. avium. M. phlei, M. tuberculosis (Stamm H 37 RV und Ayoma 3), M. bovis BCG, M. smegmatis, M. kansaii, Nocardia rubra, M. bovinis und Corynebacterium diphtheriae.

Bakterien, wie zum Beispiel M. avium, werden gezüchtet, anschliessend isoliert oder geerntet und dann durch Hitzebehandlung abgetötet. Die Zellmasse wird dann mit verschiedenen Lösungsmitteln extrahiert und dann wird eine aktive, in dem angewandten Löungsmittel lösliche Fraktion extrahiert. Dieser Extrakt wird weiter gereinigt, indem man eine Reihe von Lösungsmittelextraktionen durchführt, wobei man dadurch das rohe TDM erhält. Es sei in diesem Zusammenhang auf die Veröffentlichung mit dem Titel Biologically Active Components from Mycobacterial Cell Walls. 1. Isolation and Composition of Cell Wall Skeleton and Component, P. 3; von Azuma et al., im Journal of the National Cancer Institute, Band 52, Seiten 95-101,1974, verwiesen, und alles, was dort über die Isolierung und Reinigung erläutert wird, gilt auch im Zusammenhang mit der vorliegenden Beschreibung. Wie bereits in dieser Veröffentlichung von Azuma et al. erläutert wird, kann das rohe TDM dann weiter gereinigt werden, indem man eine Chromato-graphy durch Zentrifugieren über fein verteiltes Silicagel (mit der englischen Bezeichnung «centrifugai microparticulate silica gel chromatography») durchführt, wobei durch dieses Behandlungsverfahren gereinigtes TDM erhalten wird. Das TDM kann auch nach demjenigen Arbeitsverfahren hergestellt werden, das in der USA Patentschrift Nr. 4 505 900 beschrieben ist, die am 19. März 1985 veröffentlicht wurde.

Der dritte bakterielle Hilfsstoff, der in den erfindungsgemässen Vakzinen enthalten sein kann, ist ein pyridinlöslicher Extrakt eines Mikroorganismuses, der etwa 3 bis etwa 20 Gew.-% an Protein, etwa 10 bis etwa 40 Gew.-% an Zucker und etwa 35 bis etwa 60 Gew.-% an Fettsäuren enthält. Dieser Extrakt enthält vorzugsweise etwa 5 Gew.-% an Protein, etwa 35 Gew.-% an Zucker und etwa 5 Gew.-% an Fettsäuren.

Das Protein enthält Aminosäuren und Ammoniak und beispielsweise kann die Aminosäurezusammensetzung dieses Proteins so sein, wie dies in der folgenden Tabelle zusammengestellt ist:

In der oben angegebenen Tabelle sind die Gehalte an Aminosäuren in Gewichtsprozent angegeben und der gesamte Proteingehalt der entsprechenden Extrakte betrug 6,34 Gew.-%.

Der pyridinlösliche Extrakt, der in den erfindungsgemässen Vakzinen eingesetzt wurde, lieferte bei der Elementaranalyse die in der folgenden Tabelle angeführten Ergebnisse:

Aminosäure

Gewichtsprozent

Asparginin

Threonin

Senn

Muraminsiure Glutaminsäure Glycin Alanin

0,273

0,108

0,585

0,219

0,267

0,39

0,173

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Element

Gewichtsprozent

Kohlenstoff

60,35

Wasserstoff

9,47

Sauerstoff

23,91

Des weiteren wurde das Infrarotspektrum dieses Extraktes aufgenommen und die wichtigen Peaks dieses Spektrums, die zur Identifizierung des Extraktes nützlich sind, sind in der folgenden Tabelle I angeführt. In dieser Tabelle sind in der linken Spalte die Lagen der Peaks bei der angegebenen Frequenz in cm-'1 angeführt und dabei bedeuten die in Klammer gesetzten Begriffe das folgende:

(b) = breit (s) = stark

(m) = mässig oder mittelstark.

Tabelle I

Peak Frequenz in cm"1 nähere Beschreibung des Peak

3400 (b) NH-Streckung

3200-2500 (b) Signal von Wasserstoffbrücken mit intra molekular gebundenen OH-Gruppen 2920 (s) CH-Streckung

1710 (s) Streckung des Estercarbonyls

1675 (s) Streckung des Amidcarbonyls

(Amid I Bande)

1541 (m) Amid II Bande

Beliebige Mikroorganismen können verwendet werden, um den pyridinlöslichen Extrakt herzustellen, und als Beispiele für Mikroorganismen seien genannt: M. bovis BCG, M. phlei, M. smegmatis, M. kansaii, Nocardia rubra, Corynebacterium diphtheriae und Corynebacterium parvum. Das Corynebacterium parvum ist besonders bevorzugt.

Die gesamten Zellen der Mikroorganismen, vorzugsweise in Form einer Paste, werden mit Pyridin vermischt. Die erhaltene Mischung wird getrennt, wobei man eine überstehende Fraktion erhält, die den pyridinlöslichen Extrakt enthält und wobei man ferner einen in Pyridin unlöslichen Rückstand erhält. Gegebenenfalls kann der in Pyridin unlösliche Rückstand mehreren Trennverfahren unterworfen werden, wie sie oben beschrieben werden, wobei man Pyridin verwendet um weitere Mengen des gewünschten Extraktes aus dem Rückstand zu entfernen.

Anschliessend wird dann das Pyridin aus dem Extrakt entfernt und der getrocknete Extrakt wird gegen eine geeignete Flüssigkeit dialysiert, beispielsweise gegen destilliertes Wasser. Durch eine Untersuchung mit dem Elektronenmikroskop wird festgestellt, dass Verunreinigungen aus ganzen Zellen und Zellfragmenten abwesend sind. Der so gewonnene gereinigte Extrakt kann dann nach bekannten Arbeitsverfahren lyophilisiert werden, wobei man ein beständiges Produkt erhält.

Die in den erfindungsgemässen Vakzinen enthaltenen immunologischen Hilfsstoffe erhöhen in Mischung oder Kombination mit den tumorassoziierten Antigenen die Immunreaktion oder Immunresponse derartiger Antigene und dementsprechend sind diese Hilfsstoffe in einer Vielzahl von Tumorvakzinen nützlich, und zwar sowohl solchen für die Anwendung bei Tieren als auch solchen für die Anwendung beim Menschen.

In der Praxis hat es sich gezeigt, dass das gereinigte, entgiftete Endotoxin vorzugsweise in einer Konzentration von etwa 10 bis etwa 500 Mikrogramm pro Dosis eingesetzt wird, wobei eine speziell erhöhte Immunreaktion dann hervorgerufen werden kann, wenn dieses in einer Konzentration von etwa 10 bis etwa 50 Mikrogramm pro Dosis eingesetzt wird. Das Zellwand-Skelett wird vorzugsweise in einer Konzentration von etwa 275 bis etwa 325 Mikrogramm pro Dosis eingesetzt.

Die Trehalose-dimycolate werden vorzugsweise in einer Konzentration von etwa 50 bis etwa 300 Mikrogramm pro Dosis eingesetzt und speziell bevorzugt in einer Konzentration von etwa 125 bis etwa 175 Mikrogramm pro Dosis.

Der pyridinlösliche Extrakt kann in einer Konzentration von etwa 500 bis etwa 2400 Mikrogramm pro Dosis eingesetzt werden, und speziell bevorzugt in einer Konzentration von etwa 750 bis etwa 1200 Mikrogramm pro Dosis.

Falls erwünscht, können noch weitere Komponenten oder Zusätze in Verbindung mit den in den erfindungsgemässen Vakzinen anwesenden Hilfsstoffen eingesetzt werden.

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in denjenigen Fällen, wo nur ein oder zwei der drei genannten Klassen an Hilfsstoffen in Kombination mit dem Antigen und dem MPL verwendet werden, können die Konzentrationen derartiger Hilfsstoffe in den höheren Bereichen, vorzugsweise in den höheren der oben angegebenen Bereiche liegen. Es muss lediglich beachtet werden, dass eine solche Menge an Hilfsstoff oder an mehreren Hilfsstoffen vorhanden ist, die ausreichend ist um die Immunreaktion zu erhöhen, nämlich die Immunreaktion der entsprechenden Vakzine gegen tumorassoziierte Antigene.

Die optimale Menge an Antigen, die in den erfindungsgemässen Vakzinen enthalten ist, hängt natürlich von dem jeweiligen Tumor ab, für dessen Bekämpfung die Vakzine vorgesehen ist. In der Praxis hat es sich jedoch herausgestellt, dass das Antigen in der Vakzine im allgemeinen in einer Konzentration im Bereich von etwa 1 bis etwa 100 mg pro Dosierung anwesend ist, und speziell bevorzugt in einer Menge von etwa 2 bis etwa 10 mg pro Dosis.

Die tumorassoziierten Antigene und die Hilfsstoffe werden vorzugsweise in einem pharmazeutisch annehmbaren Trägermaterial verwendet, so dass man die erfindungsgemässe Vakzine oder den erfindungsgemässen Impfstoff erhält. Typische Beispiele für pharmazeutisch annehmbare Trägermaterialien, die in den erfindungsgemässen Vakzinen eingesetzt werden können, sind physiologische Kochsalzlösung oder Emulsionen von Öltröpfchen. Die Menge an Öl, die eingesetzt wird, liegt im Bereich zwischen etwa 0,5 Vol.-% und etwa 3,0 Vol.-%, bezogen auf das Gesamtvolumen der Zusammensetzung.

Die Herstellung der erfindungsgemässen Vakzine kann durchgeführt werden, indem man das TÄA, das MPL und die biologischen Hilfsstoffe nach solchen Arbeitsverfahren mi$cht, die auf diesem Gebiete bereits bekannt sind.

Wie bereits weiter oben erwähnt wurde, können die Zusammensetzungen zur Behandlung von warmblütigen Tieren und Menschen in Form von Emulsionen von Öltröpfchen eingesetzt werden. Die Menge an Öl, die dabei angewandt wird, liegt im allgemeinen im Bereich von etwa 0,5 Vol.-% bis 3,0 Vol.-%, bezogen auf das Gesamtvolumen der Zusammensetzung. Es ist bevorzugt, 0,75 Vol.-% bis etwa 1,5 VoL-% an Öl, bezogen auf das Volumen der Zusammensetzung einzusetzen. Beispiele für Öle, die in derartigen Zusammensetzungen enthalten sein können, sind leichte Mineralöle, Squalan, 7-n-Hexyloctadecan, Co-noco-superöl und Drakeöl 6 VR Mineralöl, wobei das zuletzt genannte von der Pennreco Company, Butler, Pa. hergestellt wird.

Die homogenisierte Öl enthaltende Mischung kann dann mit einem Detergens kombiniert oder vermischt werden, wobei dieses gegebenenfalls vor dem Mischvorgang in der physiologischen Kochsalzlösung gelöst werden kann. Die Menge an Detergens, die eingesetzt wird, liegt im allgemeinen im Bereich von etwa 0,02 VoI.-% und 0,20 Vol.-%, bezogen auf das Gesamtvolumen der Zusammensetzung, und speziell bevorzugt im Bereich von etwa 0,10 Vol.-% und 0,20 Vol.-%, bezogen auf das Gesamtvolumen der Zusammensetzung. Ein übliches Detergensmaterial, das zu diesem Zweck eingesetzt werden kann, ist beispielsweise das Produkt mit der Markenbezeichnung Tween-80 und das Produkt mit der Markenbezeichnung Arlacei, das von der Atlas Chemical Company hergestellt wird.

Die Mischung, die man bei der Zugabe des Detergens erhält, wird dann homogenisiert, wobei sich eine Suspension bildet, die einen hohen Prozentsatz an Öltröpfchen, welche mit MPL und CWS beschichtet sind, enthält, wie dies durch eine Untersuchung dieser Suspension unter Verwendung eines Mikroskops festgestellt wurde.

Gemäss einem anderen Arbeitsverfahren können wässrige Suspensionen von TAA zu lyophilisierten Emulsionen, welche die biologischen Zusätze enthalten, zugesetzt werden und man vermischt dann oder man emulgiert durch sehr heftiges Durchrühren, bis man eine leicht milchige Suspension erhält. Die erwähnten lyophilisierten Emulsionen werden vorteilhafterweise nach bereits früher beschriebenen Verfahren hergestellt, beispielsweise demjenigen, das in der USA Patentschrift Nr. 4 520 019 erläutert ist.

Die erfindungsgemässen Vakzinen oder Impfstoffe werden üblicherweise an warmblütige Tiere durch intramuskuläre Injektion, intraperitoneale Injektion oder subkutane Injektion verabreicht, und zwar ein Mal wöchentlich bis zu insgesamt 15 Injektionen in den weiter oben beschriebenen Dosierungen.

Es hat sich herausgestellt, dass mit Hilfe der erfindungsgemässen Vakzinen die Immunreaktion gegen eine grosse Anzahl an natürlichen Tumoren, die mit Antigenen im Zusammenhang stehen, stark gesteigert werden kann, und zwar sowohl natürlichen Antigenen als auch synthetischen Antigenen und viralen Antigenen, bakteriellen Antigenen, pilzlichen Antigenen oder protozoischen Antigenen. Die einzige Anforderung, die an ein Antigen gestellt werden muss, welches in den erfindungsgemässen Vakzinen eingesetzt werden soll, ist diejenige, dass es in der Lage ist, die Immunreaktion eines tierischen oder menschlichen Patienten anzuregen und dass diese Anregung durch die Hilfsstoffe erhöht wird, die in den erfindungsgemässen Vakzinen ebenfalls enthalten sind.

Dementsprechend besitzen die erfindungsgemässen Vakzinen eine wirksame Antitumoraktivität und sie sind dementsprechend nützlich bei der Behandlung oder prophylaktischen Behandlung, also Vorbeugung, einer grossen Anzahl von Tumoren, die bei tierischen Patienten oder menschlichen Patienten auftreten können. Zu derartigen Tumoren gehören Geschwülste, die mit Hilfe dieser Vakzinen behandelt werden können, einschliesslich tierischer Tumore, wie zum Beispiel ein Karzinom der Schuppenzellen des Rindes, dem Rinderfibrosarkom, dem Pferde-sarcoid, dem Pferde-melanom, dem Schuppenzellenkarzinom der Pferde, den Brusttumoren der Hunde, dem Hundeadenom und dem Hundemelanom. Die erfindungsgemässen Impfstoffe können auch zur Bekämpfung oder Vorbeugung von menschlichen Tumo7

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ren eingesetzt werden, wie zum Beispiel dem Eierstockkrebs, Melanomen, Darmkrebs, Pankreaskrebs, Nierenkrebs und ähnlichem.

Die vorliegende Erfindung sei in keiner Weise durch irgendwelche theoretischen Überlegungen über den Wirkungsmechanismus der erfindungsgemässen Vakzinen bezüglich der Rückentwicklung von Tumoren eingeschränkt. Dennoch kann man eventuell annehmen, dass die Kombination der tumorassoziier-ten Antigene, also der mit Tumoren im Zusammenhang stehenden Antigene und Hilfsstoffe sowohl eine spezifische Immunreaktion als auch eine unspezifische Immunreaktion angeregt, also simuliert wird.

Obwohl die erfindungsgemässen Vakzine bei der Behandlung von Tumoren wirksam sind, können diese Antitumor-lmpfstoffe bei der klinischen Anwendung in Kombination mit anderen Formen der Therapie eingesetzt werden. Dies ist deshalb der Fall, weil eine Immunotherapie im allgemeinen dann besonders wirksam ist, sobald die Tumorbelastung des Patienten gering genug ist, so dass das Immunsystem des Patienten diese Tumore bekämpfen kann. Dementsprechend kann es vorteilhaft sein, wenn ein Patient, der an einem fortgeschrittenen Stadium einer Tumorkrankheit erkrankt ist, irgendeiner Behandlung unterworfen wird, um die Tumorbelastung zu vermindern, worauf dann anschliessend an diesen Patienten die Antitumorvakzine verabreicht wird, um die restlichen Tumorzellen aus seinem Körper zu entfernen. Die kombinierte Behandlung durch chirurgischen Eingriff, Chemotherapie, Strahlenbehandlung oder andere Methoden der wirksamen Verminderung einer Tumorbelastung kann angewandt werden. Diese begleitende Behandlung kann sogar eine andere Form der Immunotherapie mit umfassen, wie zum Beispiel die Verabreichung von Interieukin-2.

Die vorliegende Erfindung sei nun anhand von Beispielen näher erläutert. In diesen Beispielen wurden bakterielle Komponenten, Tumore, Tumorzellen und Tumorzellenvakzine nach bereits bekannten Verfahren hergestellt, und auch die Auswertung der Ergebnisse erfolgte nach Verfahren, die einem Fachmann auf diesem Gebiete bekannt sind.

Beispiel 1

Herstellung von bakteriellen Komponenten

1. Herstellung eines entgifteten Endotoxins oder Monophosphorvl-lioid A faboekürzt als MPÜ

Das rohe Endotoxin wird aus einer polysaccharid-freien und heptose-freien Re-Mutante (also einer heptose-frelen Re-Mutante mit Polysacchariddefizienz) des Mikroorganismuses Re-Mutante durch Extraktion mit einem organischen Lösungsmittel isoliert. Der genannte Mikroorganismenstamm wurde vom NIH, NIAID, Rocky Mountain Laboratorium, Hamilton, Montana, erhalten. Dieses Endotoxin, das nur aus KDO und Lipid A besteht, ist eher ein Glycolipid, als ein typisches endotoxisches Lipopolysaccharid. Es wird durch fraktionierte Fällung mit organischen Lösungsmitteln, die geeignete polare Eigenschaften besitzen, gereinigt.

Dann wird dieses Produkt mit siedender 0,1 normaler Chlorwasserstoffsäure behandelt, wobei man eine kompliziert aufgebaute Mischung erhält, die aus freien Fettsäuren und strukturellen Homologen des nicht-toxischen Monophosphoryl-Iipid A, abgekürzt als MPL, besteht. Diese Komponenten der Mischung werden durch eine Elutionssäulenchromatographie unter Anwendung von Druck getrennt. Die bei der Elution austretenden Fraktionen entsprechen den strukturellen Homologen von MPL, wie dies durch eine Dünnschichtchromatographie bewiesen werden konnte und diese Fraktionen werden miteinander vereinigt und auf ihre Toxizität getestet. Sie sind zur Durchführung weiterer Experimente geeignet, wenn die Dosis der 50%-igen Letalität bei der intravenösen Einimpfung in Hühnerembryonen, also die Dosis CELD50 höher liegt als 10 ng. Es sei darauf hingewiesen, dass die entsprechende letale Dosis für das als Ausgangsmaterial eingesetzte Endotoxin in diesem Test tiefer liegt als 0,001 {ig.

2. Herstellung eines mvcobacteriellen Zellwand-Skeletts, abgekürzt als CWS

Die Zellwände Macobacterium bovis, Stamm BCG wurden mit Hilfe eines Zellfraktionators, nämlich dem Fraktionator mit der Bezeichnung Sorvall-Ribi Cell Fractionator (Modell RF-1) gewonnen, wobei der genannte Mikroorganismenstamm von den NIH, NIAID, Rocky Mountain Laboratorium, Hamilton, Montana, erhältlich ist. Unter Anwendung eines Druckes von 35 000 PS! (2460 Atm.) werden bei einer Temperatur von 10—15°C die mycobacteriellen Zellwände aufgebrochen, und das Protoplasma wird in einem löslichen Zustand extrudiert. Die Zellwandhüllen werden dann durch Zentrifugieren gewonnen und sie werden durch mehrmaliges Zentrifugieren und erneutes Suspendieren in Wasser gereinigt. Anschliessend werden dann die Zellwände mit Hilfe von RNA-ase und DNA-ase behandelt, um Nukleinsäuren zu entfernen und es folgt dann eine Behandlung mit einer Reihe von proteolytischen Enzymen, sowie eine Deter-gensbehandlung um Proteine, beziehungsweise Peptide zu entfernen. Schliesslich werden diese Präparate sehr gründlich mit organischen Lösungsmitteln extrahiert, um sogenannte freie Lipide zu entfernen. Das so erhaltene CWS ist aus einem polymeren Mycolsäuren-Arabinogalactanmucopeptid-Komplex zusammengesetzt.

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3. Isolierung und Reinigung von Trehalose- Dimvcolat. abgekürzt als TDM

Die ganzen Zellen der Mycobakterien werden zuerst mit Äthanol, anschliessend mit Aceton und schliesslich mit einer Mischung von Chloroform plus Methanol im Mischungsverhältnis 2:1, die in der Folge als CM 2:1 bezeichnet wird, extrahiert. Dieser CM-Extrakt enthält das TDM, zusammen mit verunreinigenden Lipiden, die eine geringere Polarität oder eine höhere Polarität als TDM aufweisen. Diese Lipide werden selektiv abgetrennt, indem man sie mit Mischungen aus organischen Lösungsmitteln ausfällt, in welchen die entsprechenden Lipide unlöslich sind, während das TDM in der löslichen Phase zurückbleibt. Das so erhaltene «rohe TDM» wird dann durch Druck-EIutionschromatographie gereinigt. Diejenigen bei dieser Chromatographie aufgefangenen Fraktionen, die eine einzige Komponente des TDM enthalten, wie dies anhand der Dünnschichtchromatographie nachgewiesen werden kann, werden miteinander vereinigt und für die weiteren Arbeitsschritte und Untersuchungen verwendet.

4. Pvridinextraktion von Corynebacterium Parvum. abgekürzt als PE

Durch eine Hitzebehandlung abgetötete ganze Zellen von C. parvum VPI wurden von dem Dr. C. Cummings, Virginia polytechnischen Institut erhalten und diese abgetöteten Zellen wurden dreimal mit Pyridin bei einer Temperatur von 37°C extrahiert und die vereinigten pyridinlöslichen Extrakte werden dann durch eine Flashabdampfung konzentriert, dialysiert und schliesslich lyophilisiert. So wurde eine Substanz mit erhöhter Antitumoraktivität und stark verminderter Toxizität erhalten.

Beispiel 2

Herstellung eines auswertbaren Mäuse-Tumor- Modells (murine tumor modelt.

1. Beschreibuno der Tiere

Alle Tumorversuche wurden mit 6-8 Wochen alten weiblichen C3HB/FeJ Mäusen oder mit weiblichen und männlichen C57BL/10 und DBA/2 Mäusen durchgeführt. Die Mäuse wurden von den entsprechenden Zuchtstellen der Ribi Immuno-Chem Research, Inc., Hamilton, Montana, zur Verfügung gestellt. Die Mütternstämme der DBA/2 Mäuse und der C3HB/FeJ Mäuse wurden von dem Jackson Laboratorium (Bar Harbor, Maine), käuflich erworben.

Sewell-Wright Meerschweinchen des lnzuchtstammes-2 wurden von der Zuchtanstalt der Ribi Immuno-Chem Research, Inc., Hamilton, Montana, geliefert. Meerschweinchen weiblichen und männlichen Geschlechts, die jeweils 350-500 g wogen, wurden zur Durchführung der Versuche verwendet.

2. Tumore

Leukämie EL-4 (zur Verfügung gestellt von Dr. Bruce Chesebro NIAID, Rocky Mountain Laboratorium, Hamilton, Montana), Eierstocks MOT (zur Verfügung gestellt von Dr. J. Berek, UCLA, Los Angeles, Ca.) und Lymphom-P388-Zellen, die von der American Type Culture Collection erhalten wurden, werden in der aszitischen Form durch seriellen Transfer in C57BL/10, bzw. C3HB/FeJ, bzw. DBA/2 Mäuse aufrechterhalten. Tumorzellen, die aus der Bauchhöhle entnommen wurden, wusch man mit20 ml einer phosphatgepufferten Kochsalzlösung, die in der Folge als PBS abgekürzt wird. Rote Blutkörperchen, die in der Folge mit RBC abgekürzt werden, werden mit 10 ml 1 %-igem Ammoniumoxalat lysiert. Nach 30 Sekunden wird die physiologische Osmolarität wieder hergestellt, indem man 40 ml an PBS zusetzt. Die Zellen werden durch Zentrifugieren durch Pellets verdichtet, und die Zelldosierung wird so eingestellt, dass ein Impfmedium erhalten wird, mit dessen Hilfe 2 mal 104 Zellen bis 5 mal 104 Zellen in 0,1 ml an PBS verabreicht werden können.

Die Linie 10 der Hepatomzeilen wird in der aszitischen Form in dem syngeneischen Stamm 2 der Meerschweinchen durch seriellen intraperitonealen Transfer aufrecht erhalten. Die Tumorzellen werden von Asciten-tragenden Donatoren entnommen, 3 mal mit einer sterilen Kochsalzlösung gewaschen und dann wird die Zellkonzentration so eingestellt, dass man 20 x 1Öß Tumorzellen pro ml erhält.

3. Entwurf eines Immunotherapie-Versuches

EL-4, MOT, oder P388-Tumorzellen, die aus den gleichen Quellen gewonnen wurden, die weiter oben angegeben sind, wurden nach den oben beschriebenen Verfahren vorbereitet und 0,2 ml der Suspension der Tumorzellen wurden intraperitoneal in einen geeigneten syngeneischen Stamm von Mäusen am Tage Null eingeimpft. Bei den Tumoren zu Vergleichszwecken erfolgte dann keine weitere Behandlung.

Zu unterschiedlichen Zeitpunkten, nämlich am Tage 1 bis zum Tage 6 nach der Einpflanzung der Tumore, wurde an die Mäuse eine einzige infraperitoneale Injektion des immunotherapeutischen Mittels verabreicht. Die Tiere der Versuchsgruppen und der Gruppe des Vergleichsversuchs wurden täglich beobachtet, um den Prozentsatz der überlebenden Tiere und/oder die Verkleinerung der Grösse, bzw. Masse an Tumoren festzustellen.

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Der Tumor der Linie 10 wird bei Meerschweinchen hervorgerufen, indem man in die Haut (intradermal) eine Injektion von 10e in Asziten gezüchteten Tumorzellen verabreicht. Die immunotherapeutischen Mittel werden in Volumina von 0,4 ml durch intralaesionale Einimpfung nach 6 Tagen verabreicht, wobei zu diesem Zeitpunkt die Tumore bereits einen Durchmesser von 9—11 mm erreicht hatten.

Beispiel 3

Formulierunosverfahren zur Herstellung von Tumorzellen Vakzinen

1. Herstellung von löslich gemachten tumorassoziierten Antigenen

Das Tumorantrgen wird durch ein modifiziertes Arbeitsverfahren hergestellt, indem man eine Extraktion mit 3-moIarem Kaliumchlorid durchführt. Kurz zusammengefasst wird die 3-moIare Lösung von Kaliumchlorid in PBS zu einem Zellenpellet von lebenden Tumorzellen in einer Menge von 5 ml pro 3x 10& Zellen zugegeben. Diese Suspension wird 18-24 Stunden lang bei 4°C gerührt, und nach diesem Zeitraum werden die Pellets verworfen und die darüber stehende Flüssigkeit wird gegen destilliertes Wasser während 24 Stunden bei 4°C dïalysiert. Danach zentrifugiert man mit 100 000 • g während zwei Stunden bei 4°C, Das Dialysat wird schliesslich bei 100 000 • g während zwei Stunden bei 4°C zentrifugiert, um den feinen gelatineartigen Niederschlag zu entfernen, der sich nach der Dialyse gebildet hat. Das lösliche Material wird dann lyophilisiert.

Die Linie 10 des MeerschweinGhentumors, von Mäusen stammende EL-4, MOT, und P388, und auch das aus Rinderaugen stammende Schuppenzellenkarzinom, das in der Folge mit BOSCC abgekürzt wird, sowie ferner das Pferde-sarkoid, das in der Folge mit ES abgekürzt wird, wurden aus tumorbefallenen Wirtstieren gewonnen und diese Produkte wurden in der angegebenen Weise extrahiert. Ausserdem wurden Suspensionen der Rinderkarzinomzellen mit der Abkürzung BOSCC und des Pferde-sarkoides mit der Abkürzung ES extrahiert, indem man das modifizierte Phenolverfahren anwandte.

2. Herstellung von Öltröpfchen-Emulsionen

Öltröpfchen-Emulsionen, die lösliche Extrakte der Tumore enthalten, werden hergestellt, indem man unterschiedliche Kombinationen an CWS, TDM und MPL anwendet, wie dies bereits früher in der USA Patentschrift Nr. 4 520 019 beschrieben wurde.

3. Einleitendes Testen von Tumor Vakzinen

Die Methoden der Therapie sind im wesentlichen gleich, wie dies weiter vorne beschrieben wurde. Grundsätzlich werden die Tumore hervorgerufen, indem man eine subkutane Injektion an Mäuse oder Meerschweinchen verabreicht, wobei bei der Injektion 2 mal 104 bis 5 mal 10* in Asziten gewachsene Tumorzellen verabreicht werden. Mengen von 25 pg oder 100 (ig an Mitomycin C werden intralaesional 7 Tage nach der Implantation verabreicht, wobei zu diesem Zeitpunkt die Tumore einen Durchmesser von etwa 4 mm erreicht haben.

Zwei Tage später werden die Vakzinen auf verschiedene Weisen durch Injektion verabreicht. Die Anteile der geheilten Tiere werden mit den überlebenden Tieren derjenigen Gruppe verglichen, die einer Behandlung mit Tumorvakzinen unterworfen worden waren.

Die geheilten Tiere wurden getestet, ob sie die Fähigkeit besitzen, gegenüber einer anschliessenden Infektion mit homologen Tumorzellen resistent zu sein.

4. Spezifische Immunotherapie von spontan aufgetretenen Tumoren bei Rindern und Pferden

Das Schuppenzellenkanzinom des Auges von Rindern, abgekürzt als BOSCC, ist ein potentiell metastatisches von selbst entstehendes, also autochthones Karzinom, das natürlich in etwa 4,7% der Population des Hereford-Rindes vorkommt und in 0,8%-1,6% der allgemeinen Rinderpopulation zu finden ist Das Pferde-sarkoid, abgekürzt als ES, ist ein lokaler aggressiver Hauttumor, und dieses Sarkoid ist der am häufigsten spontan auftretende Tumor an Pferden. Diese Tumore bilden nicht leicht Metastasen, sondern sie sind lokal invasiv und nicht aggressiv.

Beispiel 4

Isolierung von mit Tumoren verbundenen Antigenen Es wurden zwei experimentelle Tumormodelle erhalten, und zwar

(a) Linie 10 des Leberzellen-karzinoms (hepatocellulares Karzinom), dessen Zuchtstammes 2 von Meerschweinchen und

(b) Eierstockstumor von Mäusen, abgekürzt als MOT des Mäuseinzuchtstammes C3HB/FeJ.

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Diese wurden von bestehenden Zuchtkolonien der Empfängertiere gewonnen, die bei der Ribi Immuno-Chem Research, Inc., Hamilton, Montana, vorhanden sind.

Drei weitere zusätzliche Zell-Linien von Mäusetumoren wurden von den folgenden Stellen bezogen;

L-1210 Leukämie-Zellen wurden von der Dr. Jerry Killion, Oral Roberts Universität, Tulsa, OK, bezogen;

EL-4 Lymphom-tumor Zellen wurden von Dr. Bruce Chesebro, NIAID, Rocky Mountain Laboratorium, Hamilton, Montana, bezogen;

P-388 Lymphom-tumor Zellen wurden von der American Type Culture Collection bezogen.

B6D2F1 Mäuse und C3HB/FeJ Mäuse wurden zur Aufrechterhaltung dieser Tumorzell-Linien und zur Durchführung der Untersuchungen der Tumorrückbildung käuflich von dem Jackson Laboratorium, Bar Harbor, Maine, erworben.

Tumorassoziierte Antigene, abgekürzt als TAA, die zur Verwendung in Kombination mit MPL und anderen bakteriellen Antitumorkomponenten in den erfindungsgemässen Präparaten vorgesehen sind, wurden aus MOT-Eierstocks-Tumorzellen, EL-4 Lymphomen, P-388 Lymphomen und L-1210 Leukämie-Zellen durch das Verfahren der Extraktion mit 3-molarem Kaliumchlorid isoliert.

Kurz gesagt wurden an die Gruppen der geeigneten Mausstämme durch intraperitoneale Injektion mit 0,5 mal 105 bis 1 mal 105 lebensfähige Tumorzellen verabreicht. Asziten-flüssigkeit wurde 8 bis 10 Tage später entnommen und die Zellen wurden durch Zentrifugieren entfernt. Markierte oder deutlich erkennbare Tumorzellen wurden über Nacht mit 3-molarem Kaliumchlorid extrahiert. Der wässrige Extrakt wurde durch Zentrifugieren, Dialysieren und Lyophilisieren gewonnen.

Zusätzlich wurde TAA auch in Asziten gewachsenen Tumorzellen der Linie 10 im Stamm 2 der Meerschweinchen gewonnen, und zwar indem man das oben beschriebene Verfahren anwandte.

TAA-Extrakte wurden auch aus spontan gebildeten Sarkoid-Tumoren bei Pferden gewonnen. Die festen Sarkoid-Tumore wurden in 3-molarem Kaliumchlorid homogenisiert und bei 4°C über Nacht extrahiert. Die wässrigen Extrakte wurden durch Zentrifugieren gewonnen, anschliessend dialysiert und lyophilisiert.

Beispiel 5

Antitumor-Aktivität von entgiftetem Endotoxin. abgekürzt als MPL bei alleiniger Verabreichung oder bei seiner Kombination mit einem Pvridinextraktvon P. acnes, abgekürzt als PA-PE.

Es wurden Versuche durchgeführt um zu zeigen, dass PA-PE und mycobacterielles Trehalose-dimy-colat, abgekürzt als TDM, bei Zellwand-Skelett, abgekürzt als CWS, wirksam waren, und zwar bezüglich einer Rückentwicklung von Linie-10 Tumoren in 2 Stämmen von Meerschweinchen, wenn diese Substanzen mit MPL kombiniert wurden. Die dabei erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 1 a zusammengestellt:

Tabelle 1a

Antitumoraktivitäten von Ölemulsionen, die nur MPL enthalten oder dieses kombiniert mit PA-PE +TDM enthalten bei einem Linie-10 Tumormodell

Injiziertes Material

Dosierung

Gesamtzahl der geheilten Tiere

%

der geheilten Tiere

PE C. parvum + MPL+TDM

500 + 50+100

17/19

89,5

PE C. parvum + MPL+TDM

100 + 50 + 50

5/10

50

PEG. parvum + TDM

500 + 100

3/9

33

PE C. parvum + MPL

500 + 50

1/9

11

PE C. parvum alleine

500

0/7

0

MPL+TDM

500 +100

0/6

0

Tumore der Vergleichsgruppe

—

0/18

0

Bei der in der Tabelle 1a Versuchen wurde der Stamm 2 der Meerschweinchen intradermal mit 2 x 106 Tumorzellen der Linie 10 am Tage Null geimpft. In der Gruppe zu Vergleichszwecken erfolgte keine Behandlung der Tumore. In den anderen Gruppen wurden die Immunostimulanzien intralaesional in einer Menge von 0,4 ml pro Tag an die Tiere verabreicht, und zwar am sechsten Tag, an dem die Tumore bereits einen Durchmesser von 8-10 mm erreicht hatten.

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Beispiel 6

Die nachfolgenden Untersuchungen wurden durchgeführt um die Wirksamkeit wässriger Lösungen zu untersuchen, die nur MPL enthalten, beziehungsweise die Wirksamkeit wässriger Lösungen, die dieses zusammen mit PA-PE enthalten, einen Rückgang von MOT der Eierstockszellen bei C3HB/FeJ Mäusen hervorrufen.

Bei diesem Versuch wurden weibliche Mäuse am Tage Null mit 2 x 104 MOT Zellen beimpft und das Präparat wurde 24 Stunden später verabreicht.

Die bei diesem Versuch erzielten Ergebnisse sind in Tabelle 2 zusammengefasst. Man sieht, dass nur eine geringe Antitumoraktivität oder überhaupt keine Antitumoraktivität bei denjenigen Mäusen festzustellen ist, an die entweder nur 1200 [ig an PA-PE oder nur 240 ng an MPL verabreicht wurde.

Im Gegensatz dazu konnte eine bedeutende Antitumoraktivität bei denjenigen Mäusen festgestellt werden, die mit einer Mischung aus PA-PE + MPL behandelt worden waren. In diesem Falle waren 88% der Tiere nach der Behandlung tumorfrei.

Ausserdem zeigte es sich, dass die Reaktion der Tiere dosisabhängig ist, und zwar so, dass weniger tumorfreie Tiere festgestellt werden konnten, wenn sinkende Dosierungen an den Immunostimulanzien verabreicht wurden.

Bei den in Tabelle 2 angeführten Tests wurden an weibliche C3HB/FeJ Mäuse durch intraperitoneale Einimpfung 1 mal 104 bis 2 mal 104 MOT-Tumorzellen am Tage Null verabreicht. Die Immunostimulanzien wurden 24 Stunden nach der Tumortransplantation intraperitoneal verabreicht, und zwar in einer Menge von 0,4 ml pro Maus.

Bei den in der dritten Spalte angeführten Ergebnissen wurde die Anzahl der tumorfreien Tiere 60 Tage nach der Tumortransplantation bestimmt.

Tabelle 2

Antitumoraktivität von entgiftetem Endotoxin, abgekürzt als MPL, bei alleiniger Verabreichung oder bei Verabreichung in Kombination mit dem Pyridinextraktvon P. acnes, abgekürzt als PA-PE

Injiziertes Material

Dosierung In {ig

Anzahl tumorfreier Tiere, bezogen auf die Gesamtzahl der behandelten Tiere

Prozentsatz tumorfreier Tiere

PAr-PE + MPL

1200 + 240

43/49

88

PAr-PE + MPL

600 +120

4/8

50

PA-PE + MPL

350 + 75

0/5

0

MPL

240

2/8

25

PA-PE

1200

0/8

0

keine Injektion

—

0/54

0

Beispiel 7

Um festzustellen, ob solubilisierte Tumorantigene, abgekürzt als TAA, die Antitumoraktivität der Kombination von PA-PE + MPL erhöhen oder diese Antitumoraktivität vergrössern, wurde an solche Mäuse, die MOT Tumore hatten, entweder nur MOT-TAA verabreicht, oder dieses wurde in Kombination mit einer nicht wirksamen Dosierung an PA-PE + MPL verabreicht. Es sei in diesem Zusammenhang auf die Ergebnisse der Tabelle 3 verwiesen.

Keine Antitumoraktivität wurde bei denjenigen Mäusen festgestellt, die mit 500 (ig oder 350 ng an TAA alleine behandelt wurden.

Wenn jedoch 500 jig an TAA mit PA-PE + MPL kombiniert wurden, dann waren 100% der Mäuse 60 Tage nach der Tumortransplantation tumorfrei. Die Überlebenszeit bei den nicht behandelten Mäusen der Gruppe zu Vergleichszwecken betrug lediglich 21 Tage.

Die erzielten Ergebnisse sind in der Tabelle 3 zusammengestellt.

Bei den dort gezeigten Versuchen wurden weibliche C3HB/FeJ Mäuse intraperitoneal mit 1 mal 10* bis 2 mal 10^ MOT Tumorzellen am Tage Null beimpft. Die Immunostimulanzien wurden interperitoneal in einer Menge von 0,5 m/l pro Maus 24 Stunden nach der Tumortransplantation verabreicht.

In der dritten Spalte der Tabelle ist die Anzahl der tumorfreien Tiere 60 Tage nach der Transplantation des Tumor angegeben. Dabei ist vor dem Schrägstrich die Anzahl der Tiere angegeben, die tumorfrei waren und nach dem Schrägstrich die Gesamtzahl der Tiere, die der Behandlung unterworfen waren.

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Tabelle 3

Wirksamkeit von tumorassoziiertem Antigen, abgekürzt als TAA alleine oder in Kombination mit PA-PE+ MPL bei der Rückbildung von MOT Tumoren bei C3HH/FeJ Mäusen Injiziertes Material Dosierung Anzahl tumorfreier Tiers Prozentsatz in|ig Anzahl behandelter Tiere tumorfreier Tiere

TAA

500

0/8

0

TAA

350

0/5

0

PA-PE + MPL

350 + 75

0/5

0

TAA+PA-PE + MPL

350 + 350 + 75

2/5

40

TAA+PA-PE+MPL

500 + 300 + 60

8/8

100

Beispiel 8

Obwohl eine bedeutende Antitumoraktivität festgestellt wurde, wenn TAA mit PA-PE + MPL kombiniert wurde, war es von Interesse, eine Antitumorwirksamkeit zu bestimmen, wenn es in steigenden Zeitabständen nach der Tumortransplantation verabreicht wurde.

An Mäuse wurden 2 mal 104 MOT-Zellen am Tag Null verabreicht und die Therapie, welche entweder mit PA-PE + MPL oder mit TAA + PA-PE + MPL durchgeführt wurde, erfolgte am ersten, am zweiten, am dritten oder am vierten Tag danach. Eine wirksame Therapie mit PA-PE + MPL alleine oder in Kombination mit TAA wurde festgestellt, wenn die Verabreichung am Tag 1 oder 2 nach der Einimpfung der Tumorzellen erfolgte. Doch an den Tagen 3 und 4 nach der Verabreichung der Tumorzellen war das Aus-mass der Antitumoraktivität, das durch die Anzahl der tumorfreien Tiere bestimmt wurde, wesentlich vermindert. Diese Abnahme der Antitumoraktivität ist vermutlich auf die stärkere Tumorbelastung zurückzuführen. Deshalb wurden Untersuchungen entworfen, um die Tumorbelastung mit Hilfe einer Chemotherapie, unter Verwendung von Mitomycin C zu vermindern.

Die bei diesem Versuch erzielten Ergebnisse sind in der Tabelle 4 zusammengestellt.

Bei den in Tabelle 4 angegebenen Resultaten wurden weibliche C3HB/FeJ Mäuse intraperitoneal mit 1 mal 104 bis 2 mal 104 MOT-Tumorzellen am Tage Null beimpft. Die Immunostimulanzien wurden intraperitoneal in einer Dosierung von 0,5 ml pro Maus 1, bezw. 2, bzw. 3, bzw. 4 Tage nach der Tumortransplantation verabreicht. Diese Zeiten sind in Spalte 2 der Tabelle 4 angeführt.

In der dritten Spalte der Tabelle 4 sind oberhalb des Bruchstrichs die Anzahl der Mäuse angegeben, die 60 Tage nach der Tumortransplantation tumorfrei waren und unterhalb des Bruchstrichs die Gesamtzahl der behandelten Mäuse.

Tabelle 4

Antitumoraktivität von MPL + PA-PE oder TAA+MPL+Pa-PE bei Verabreichung zu unterschiedli-chen Zeitpunkten nach der Tumortransplantation

Art und Dosierung in pg des injizierten Materials

Tage nach derTumor-transplantation

Tumorfreie Tiere/ Gesamtzahl der Tiere

Prozent der tumorfreien Tiere

PA-PE + MPL

1

5/6

83

(1200 + 240)

2

m

67

3

1/6

17

4

0/6

0

TAA + PA-PE + MPL

1

5/6

83

(500 + 300 + 60)

2

4/6

67

3

1/6

17

4

0/6

0

nur TAA (500)

1

0/6

0

keine

-

0/6

0

Beispiel 9

Anhand dieses Beispiels soll die Wirkung einer Kombination einer chemotherapeutischen Tumorbehandlung mit einer Tumorbehandlung unter Verwendung der erfindungsgemässen Vakzinen untersucht werden.

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Zu diesem Zweck wurden an Mäuse MOT-Tumorzellen am Tage Null verabreicht, und an den Tagen 2 bis 6 erfolgte dann die intraperitoneale Verabreichung des Chemotherapeutikums Mitomycin C. Das im-munötherapeutische Präparat wurde 30 bis 36 Stunden nach der Injektion des Mitomycins C verabreicht. Die Dosierung an dem Mitomycin C war dadurch vorgegeben, dass die tumoreaufweisenden Mäuse am Tage 6 mit unterschiedlichen Dosierungen dieses Präparates durch intraperitoneale Injektion behandelt wurden. Eine Dosierung von 100 [ig wurde ausgewählt, unter Berücksichtigung dessen, dass die Dosierung nicht toxisch sein sollte und einen minimalen therapeutischen Effekt aufweisen sollte, nämlich zu einem 20%igen Rückgang der Tumore führen sollte.

In der nachfolgenden Tabelle 5 werden die Ergebnisse dieser Versuche zusammengestellt. In diesem Falle wurde an die tumoreaufweisenden Mäuse am Tage 6 das Mitomycin C verabreicht und die immunothérapie erfolgte 31 Stunden später.

In derjenigen Gruppe an Mäusen, bei denen kein Mitomycin C verabreicht wurde und nur die Immunotherapie zu dem angegebenen Zeitpunkt begonnen wurde, sterben die Tiere aufgrund des fortschreitenden Tumorwachstums. Diese Ergebnisse sind in der Tabelle nicht veranschaulicht. Ein 50%iges Ansprechen auf die Behandlung konnte jedoch bei derjenigen Gruppe festgestellt werden, welche das Chemotherapeutikum und TAA + PA-PE + MPL bei einer hohen Dosis mit der minimalen Aktivität, die bei der niederen Dosis feststellbar ist, verabreicht wurde.

Bei den in der Tabelle 5 angeführten Ergebnissen wurden an weibliche C3HB/FeJ Mäuse am Tage Null intraperitoneal 1 mal 10* bis 2 mal 10* MOT-Tumorzellen injiziert. Das Chemotherapeutikum wurde am Tage 6 durch intraperitoneale Injektion verabreicht, und die Immunotherapie erfolgte 31 Stunden später.

In den Spalten 3 und 4 sind oberhalb des Bruchstrichs die Anzahl der tumorfreien Tiere und unterhalb des Bruchstrichs die Anzahl der behandelten Tiere angegeben, und zwar bei Beobachtung am Tage 34, bzw. bei Beobachtung am Tage 63.

Tabelle 5

Wirkung der Chemotherapie bei nachfolgender Behandlung mit PA-PE + MPL + MOT- TAA

31 Std. nach der Chemo- Dosierung in ng Tumorfreie Tiere / % der tumorfreien Tiere iherapie injiziertes Material Anzahl der Tiere

__ 34 Tg 63 Tg 34 Tg 63Tg

TAA

500

0/6

0

0

TAA+PA-PE+MPL

500 + 300 + 60

3/6

1/6

50

17

TAA+PAr-PE + MPL

500+1200 + 240

3/6

3/6

50

50

PA-PE+MPL

300 + 60

0/6

0

0

PA-PE + MPL

1200 + 240

2/6

1/6

33 .

17

nur MOT-Zellen

—

0/6

0

0

Beispiel 10

Das im Beispiel 9 beschriebene Verfahren wurde wiederholt, mit Ausnahme dessen, dass die Zeit zwischen der Tumortransplantation und der Chemotherapie variiert wurde. Das immunotherapeutische Präparat wurde 33 Stunden nach dem chemotherapeutischen Präparat Mitomycin C verabreicht. Die dabei erzielten Ergebnisse sind In der nachfolgenden Tabelle 6 zusammengestellt.

Die MOT-Zellen wurden am Tage Null injiziert, wobei in den Gruppen zu Vergleichszwecken G, M und R an die Tiere nur das Chemotherapeutikum verabreicht wurde und anschliessend bei Gruppe G am Tage 2, bei Gruppe M am Tage 4 und bei Gruppe R am Tage 6 das Mitomycin C. Bei den Tieren des Vergleichsversuches S wurden nur die MOT-Zellen verabreicht und überhaupt keine Medikamente. In den Gruppen A-G wurde das Mitomycin am Tag 2 gegeben.

In den Gruppen H-M wurde das Mitomycin am Tag 4 gegeben.

In den Gruppen N-R wurde das Mitomycin am Tag 6 gegeben.

In der nachfolgenden Tabelle 6 werden also die Ergebnisse der Behandlung mit dem Mitomycin bei Verabreichung am Tage 2, 4 oder 6 untersucht, wobei (ausgenommen die Versuche zu Vergleichszwecken) dann 33 Stunden später PA-PE + MPL oder TAA oder TAA + PA-PE + MPL verabreicht wurde.

Die untersuchten Tiere waren C3HB/FeJ Mäuse, an welche die MOT-Zellen am Tage Null verabreicht wurden.

In der Spatte 4 der Tabelle sind vor dem Schrägstrich die Anzahl der Tiere angegeben, die am Tag 54 tumorfrei waren, und hinter dem Schrägstrich die Gesamtzahl der Tiere, die untersucht wurden.

In der Tabelle 6 wird in der fünften Spalte der Prozentsatz der Tiere angeführt, die tumorfrei waren.

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50

55

60

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Tabelle 6

Gruppe Injizierte Vakzine Dosierung in ng tumorfrei Prozentsatz MST

A PA-PE + MPL 300 + 60 4/6 67 >54

B PA-PE + MPL 1200 + 240 5/6 83 >54

C TAA+PAr-PE + MPL 500 + 300 + 60 5/6 83 >54

D TAA + PA-PE + MPL 500 + 1200 + 240 6/6 100 >54

E TAA + PA-PE+MPL 1000 + 300 + 60 4/6 67 >54

F TAA + PA-PE + MPL 1000 + 1200 + 240 5/6 83 >54

G Vergleich — 4/6 67 >54

H PA-E+MPL 1200+240 5/6 83 >54

I TAA + PAr-PE+MPL 500 + 300+ 60 5/6 83 >54

J TAA+PA-PE+MPL 500 + 1200 + 240 6/6 100 >54

K TAA+PAr-PE+MPL 1000 + 300 + 60 4/6 67 >54

L TAA + PA-PE+MPL 1000 + 1200 + 240 5/6 83 >54

M Vergleich = 0/6 0 28

N TAA 1000 1/6 17 35

O TAA + PA-PE+MPL 500 + 1200 + 240 3/6 50 37

P TAA + PA-PE+MPL 1000+300 + 60 3/6 50 43

Q TAA + PA-PE+MPL 1000 + 1200 + 240 4/6 67 >54

R Vergleich — 0/6 0 24

S kein Medikament — 0/6 22

Aus den in der Tabelle 6 angeführten Ergebnissen sieht man, dass dann, wenn das Mitomycin C am Tage 2 verabreicht wurde, kein wesentlicher Unterschied zwischen denjenigen Gruppen feststellbar war, bei denen nur eine Chemotherapie durchgeführt wurde, und denjenigen Gruppen, in denen zusätzlich dann 33 Stunden später immunotherapeutische Medikamente verabreicht wurden. Man sieht daraus, dass die eine Chemotherapie eine sehr gute Wirkung aufweist, wenn das Chemotherapeutikum rasch verabreicht wird. Im Gegensatz dazu weist das Chemotherapeutikum keine Wirkung mehr auf, wenn es erst am 4. oder 6. Tag nach der Implantation der Tumorzellen verabreicht wird. Wird jedoch in diesem Fall nach der Chemotherapie auch noch eine Immunotherapie durchgeführt, dann ist eine deutliche Anti-tumorwirkung feststellbar.

Diese Antitumorwirkung konnte bei den Mäusen festgestellt werden, an die nur PA-PE + MPL verabreicht worden war und bei denjenigen, in denen dieses Präparat mit TAA kombiniert wurde,

Beispiel 11

Antitumoraktivität von TAA in Kombination mit anderen microbiellen Antitumorkomponenten bezüglich der Rückentwickluno von Tumoren der Linie 10 bei dem Meerschweinchenstamm 2

Frühere Untersuchungen haben gezeigt, dass die Kombination von MPL und Zellwand-Skelett, abgekürzt als CWS, eine deutliche Antitumorwirkung aufweist, wie dies durch einen Rückgang von entwickelten Tumoren der Linie 10 bei dem Stamm 2 von Meerschweinchen gezeigt werden konnte.

Die nachfolgenden Untersuchungen wurden durchgeführt, um festzustellen, wie durch die Zugabe von löslich gemachtem TAA zu MPL + CWS die Antitumoraktivität noch weiter erhöht werden kann.

Zu diesem Zwecke wurde der Inzuchtstamm 2 der Meerschweinchen mit 2 mal 106 lebensfähigen Tumorzellen der Linie 10 geimpft. Das immunotherapeutische Präparat wurde direkt in die Tumore in Form von Ql in Wasser Emulsionen am Tage 6 verabreicht, wobei zu diesem Zeitpunkt die Tumore einen Durchmesser von 8 bis 10 mm erreicht hatten.

Die erzielten Ergebnisse sind in der Tabelle 7 veranschaulicht.

Bei den in der Tabelle 7 angeführten Ergebnissen wurden sämtliche Injektionen in die Tumore hinein verabreicht. Hingegen konnte keine Antitumoraktivität festgestellt werden, d.h. keines der sieben untersuchten Tiere war tumorfrei, wenn diese Kombination in die gegenüberliegende Längsseite der Tiere verabreicht wurde.

In der Tabelle 7 sind also die Ergebnisse der Untersuchung der Antitumoraktivität von tumorassoziiertem Antigen in Kombination mit verschiedenen BRM-Formuiierungen zusammengestellt. Die untersuchten Tiere waren Meerschweinchen des Stammes 2, an welche vorher Leberkarzinomzelien der Linie 10 verabreicht worden waren.

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5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

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TafaelteT

Injiziertes Material

Dosierung in [ig tumorfreie Tiere

% tumorfreie Tiere

Gesamtzahl der Tiere

Tag 84

(CWS + MPL+TDM)

50 + 50 + 50

3/7

43

LIO—TAA +

1000

5/7

71

Dreikomponentenmischung

50 + 50 + 50

DETOX (CWS + MPL)

200 + 20

1/7

14

LIO—TAA+

1000

2/7

29

DETOX

200 + 20

nurL10-TAA

1000

0/7

0

Die vorangegangenen Beispiele sollen lediglich zu einer Erläuterung der Erfindung dienen, jedoch in keiner Weise als Einschränkung ausgelegt werden. Dem Fachmann auf diesem Gebiete ist klar, dass viele verschiedene Ausführungsarten und Modifikationen durchgeführt werden können, die alle erfin-dungsgemässe pharmazeutische Präparate betreffen.

Claims (8)

Patentansprüche 1. Vakzine, die nützlich bei der Behandlung und Vorbeugung von Tumoren bei menschlichen oder tierischen Patienten ist, dadurch gekennzeichnet, dass diese Vakzine die folgenden Bestandteile enthält: (a) mindestens ein tumorassoziiertes Antigen, (b) ein gereinigtes und entgiftetes Endotoxin-lmmunostimulans und (c) mindestens ein biologisches Immunostimulans, das aus der Gruppe ausgewählt ist, welche die folgenden Bestandteile enthält:

1) ein mycobacterielles Zellwand-Skelett,

2) Trehalose-dimycolat und

3) ein pyridinlöslicher Extrakteines Mikroorganismus.

2. Vakzine gemäss Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass sie ein pharmazeutisch annehmbares Trägermaterial enthält.

3. Vakzine gemäss Patentanspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das gereinigte, entgiftete Endotoxin kein feststellbares 2-Keto-3-desoxyoctanoat enthält und ferner zwischen 350 und 475 Nano-molen pro mg an Phosphor und zwischen 1700 und 2000 Nanomolen pro mg an Fettsäuren enthält und dass der pyridinlösliche Extrakt eines Mikroorganismus zwischen 7 und 20 Gew.-% an Protein, zwischen 10 und 16 Gew,-% an Zucker und zwischen 35 und 55 Gew.-% an Fettsäuren enthält.

4. Vakzine gemäss einem der Patentansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass das gereinigte, entgiftete Endotoxin das Monophosphoryl-Iipid A ist.

5. Vakzine gemäss einem der Patentansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Komponente (c) ein mycobacterielles Zellwand-Skelett, Trehalose-dimycolat, ein pyridinlöslicher Extrakt eines Mikroorganismus, eine Mischung aus einem mycobacteriellen Zellwand-Skelett und Trehalose-dimycolat, eine Mischung aus einem mycobacteriellen Zellwand-Skelett und einem pyridinlöslichen Extrakt eines Mikroorganismus oder bevorzugt eine Mischung aus Trehalose-dimycolat und einem pyridinlöslichen Extrakt eines Mikroorganismus ist

6. Verfahren zur Herstellung einer Vakzine gemäss Patentanspruch 1, die zur Behandlung und prophylaktischen Behandlung von Tumoren bei menschlichen und tierischen Patienten geeignet ist, dadurch gekennzeichnet, dass man eine Mischung aus den folgenden Komponenten herstellt:

(a) mindestens einem tumorassoziierten Antigen,

(b) einem gereinigten und entgifteten Endotoxin,

(c) mindestens einem biologischen Immunostimulans, das aus der Gruppe ausgewählt ist, welche die folgenden Bestandteile umfasst:

1) ein mycobacterielles Zellwand-Skelett,

2) Trehalose-dimycolat und

3) ein pyridinlöslicher Extrakt eines Mikroorganismus.

7. Verfahren nach Patentanspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass man die Vakzine gemäss Anspruch 2 herstellt, indem man der Mischung ausserdem ein pharmazeutisch annehmbares Trägermaterial zusetzt,

8. Verfahren nach Patentanspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, dass das gereinigte, entgiftete Endotoxin keine feststellbaren Mengen an 2-Keto-3-desoxyoctanoat enthält und einen Gehalt von 350 bis 475 Nanomolen pro mg an Phosphor, einen Gehalt von 1700 bis 2000 Nanomolen pro mg an Fettsäuren aufweist und das gereinigte Endotoxin vorzugsweise ein Monophosphoryl-Iipid A ist.

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9, Verfahren nach einem der Patentansprüche 6 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass man als Komponente (c) ein mycobacterielles Zellwand-Skelett oder Trehalose-dimycolat oder einen pyridinlöslichen Extrakt eines Mikroorganismus einsetzt oder eine Kombination eines mycobacteriellen Zellwand-Skelettes mit Trehalose-dimycolat, oder eine Kombination eines mycobacteriellen Zellwand-Skelettes mit einem Py-5 ridinextrakt eines Mikroorganismus, oder eine Kombination von Trehalose-dimycolat mit einem pyridinlöslichen Extrakt eines Mikroorganismus.

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