DE60009529T2

DE60009529T2 - Pharmazeutische zusammensetzung aus fibrinolytischem mittel

Info

Publication number: DE60009529T2
Application number: DE60009529T
Authority: DE
Inventors: S. Brent KENDRICK; Brian Peterson
Original assignee: Amgen Inc
Current assignee: Amgen Inc
Priority date: 1999-10-01
Filing date: 2000-09-29
Publication date: 2005-04-14
Anticipated expiration: 2020-09-30
Also published as: AU769313B2; DK1220685T3; DE60009529D1; NZ518007A; ATE262923T1; KR100717435B1; ES2224917T1; ZA200202400B; JP2003510369A; PT1220685E; HUP0202654A2; EP1438967A2; SG148823A1; NZ530959A; EP1220685B1; NZ540967A; US20060263347A1; EA004627B1; CN100353999C; HUP0202654A3

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft neue pharmazeutische Zusammensetzungen eines fibrinolytischen Mittels. Genauer betrifft die vorliegende Erfindung gefrorene flüssige und lyophilisierte Zusammensetzungen von Fibrolase und, getrennt, „neuem wirksamem Thrombolytikum" („novel acting thrombolytic") (NAT), ebenso wie Verfahren zur Herstellung und Verwendung davon.
Hintergrund der Erfindung
Im allgemeinen sind Polypeptide im wäßrigen Zustand nur in geringem Umfang stabil und durchlaufen einen chemischen und physikalischen Abbau, der zu einem Verlust an biologischer Aktivität während der Verarbeitung und Lagerung führt. Ein anderes Problem, auf das man in insbesondere wäßriger Lösung stößt, ist die Hydrolyse, wie etwa eine Deamidierung und Spaltung der Peptidbindung. Diese Effekte stellen ein ernsthaftes Problem für therapeutisch aktive Polypeptide dar, die an Menschen innerhalb eines definierten Dosierungsbereiches, basierend auf der biologischen Aktivität, verabreicht werden sollen.
Um den Abbau von Polypeptiden zu verringern, werden pharmazeutische Zusammensetzungen auf Wasser-Basis allgemein gekühlt oder eingefroren gehalten, bis sie gebrauchsfertig sind. Als eine Alternative wird oft der Prozeß der Gefriertrocknung verwendet, um Polypeptide für eine langfristige Lagerung zu stabilisieren, insbesondere wenn das Polypeptid in flüssigen Zusammensetzungen relativ instabil ist. Ein Lyophilisierungszyklus umfaßt gewöhnlich drei Schritte: Einfrieren, primäres Trocknen und sekundäres Trocknen; Williams and Polli, Journal of Parenteral Science and Technology, Band 38, Nummer 2, Seiten 48–59 (1984).
In dem Einfrierschritt wird die Lösung abgekühlt, bis sie adäquat gefroren ist. Das Wasser im Hauptteil der Lösung („bulk water") bildet in diesem Stadium Eis. Das Eis sublimiert in dem primären Trocknungsstadium, welches durch eine Verringerung des Kammerdrucks unter den Dampfdruck des Eises durchgeführt wird, unter Verwendung eines Vakuums. Schließlich wird sorbiertes oder gebundenes Wasser im sekundären Trocknungsstadium unter verringer tem Kammerdruck und einer erhöhten Lagerungstemperatur entfernt. Das Verfahren erzeugt ein Material, das als lyophilisierter Kuchen bekannt ist. Danach kann der Kuchen vor der Verwendung rekonstituiert werden.
Die Standardrekonstituierungspraxis für lyophilisiertes Material ist es, ein Volumen reinen Wassers (typischerweise äquivalent dem Volumen, das während der Lyophilisierung entfernt worden ist) wieder hinzuzufügen, obwohl verdünnte Lösungen von antibakteriellen Mitteln manchmal bei der Herstellung von Pharmazeutika zur parenteralen Verabreichung verwendet werden; Chen, Drug Development and Industrial Pharmacy, Band 18, Nummer 11 und 12, Seiten 1311–1354 (1992).
Lyophilisierung wird als eine der besten Arten angesehen, um überschüssiges Wasser aus Polypeptidlösungen zu entfernen. Der Gefriertrocknungsprozeß kann Produkte ergeben, die stabil und einer Behandlung für eine langfristige Lagerung zugänglich sind. Lyophilisierte Produkte können bei Zimmertemperatur gelagert werden und sind deshalb leichter zu handhaben und über einen weiteren geographischen Markt zu verteilen, wie etwa ausländische Märkte, bei denen eine Kühlung möglicherweise nicht zur Verfügung steht.
In einigen Fällen ist festgestellt worden, daß Bindemittel als Stabilisatoren für gefriergetrocknete Produkte fungieren; Carpenter et al., Developments in Biological Standardization, Band 74, Seiten 225–239 (1991). Zum Beispiel schließen bekannte Bindemittel Polyole (einschließlich Mannitol, Sorbitol und Glyzerin); Zucker (einschließlich Glukose und Saccharose); und Aminosäuren (einschließlich Alanin, Glycin und Glutaminsäure) ein.
Zusätzlich werden Polyole und Zucker oft auch verwendet, um Polypeptide vor Gefrietrocknungs-induzierter Schädigung zu schützen und die Stabilität während der Lagerung im getrockneten Zustand zu verbessern. Im allgemeinen sind Zucker, insbesondere Disaccharide sowohl bei dem Gefriertrocknungsprozeß als auch während der Lagerung effektiv. Über andere Klassen von Molekülen, einschließlich Mono- und Disacchariden, und Polymeren, wie etwa PVP, ist ebenso als Stabilisatoren von lyophilisierten Produkten berichtet worden.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft stabile pharmazeutische Zusammensetzungen von Fibrolase und „neuem wirksamem Thrombolytikum" (NAT), von denen einige flüssige Zusammensetzungen sind, die für die Lagerung im gefrorenen Zustand geeignet sind, und von denen andere für die Lyophilisierung geeignet sind.
Wegen der fibrinolytischen Eigenschaften von Fibrolase und NAT sind die Zusammensetzungen dieser Erfindung nützlich, um Blutgerinnsel in vivo zu lysieren, und können für einen solchen Zweck therapeutisch verabreicht werden.
Für die Zwecke dieser Erfindung bezieht sich der Begriff „NAT" auf die Metalloproteinase mit fibrinolytischer Aktivität, die durch SEQ ID NO:1 charakterisiert ist. Das NAT-Polypeptid wird durch das cDNA-Molekül von SEQ ID NO:2 kodiert, obwohl jedes DNA-Molekül einer variierenden Sequenz, die für dasselbe Polypeptid kodiert, zur Expression und Herstellung in Übereinstimmung mit Verfahren, auf die hierin unten Bezug genommen wird, verwendet werden kann.
Fibrolase ist eine bekannte Metalloproteinase, die in der wissenschaftlichen und Patentliteratur beschrieben worden ist; siehe Randolph et al., Protein Science, Cambridge University Press (1992), Seiten 590–600, und Europäische Patentanmeldung Nr. 0 323 722 (Valenzuela et al.), veröffentlicht am 12 Juli 1989. Typischerweise wird die bei den Zusammensetzungen dieser Erfindung verwendete Fibrolase die SEQ ID NO:3 haben, die durch das cDNA-Molekül von SEQ ID NO:4 kodiert wird (oder Varianten davon, die für dieselbe Aminosäuresequenz kodieren).
Fibrolase und NAT müssen von anderen therapeutischen Mitteln zur Behandlung von Blutgerinnseln in vivo, wie etwa Urokinase, Streptokinase und tPA, unterschieden werden, die Plasminogen-Aktivatoren sind. Anders als diese anderen Mittel wirken Fibrolase und NAT direkt auf das Gerinnsel, um sowohl Fibrin als auch Fibrinogen abzubauen.
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen dieser Erfindung können zusätzlich zu einer therapeutisch wirksamen Menge von Fibrolase oder NAT einen Zinkstabilisator und, fakultativ, ein Füllmittel mit oder ohne andere Bindemittel in einem pharmazeutisch annehmbaren Puffer enthalten, die in Kombination ein stabiles, gefrorenes oder lyophilisiertes Produkt bereitstellen, das für eine ausgedehnte Zeitperiode gelagert werden kann.
Unter einem Aspekt stellt die vorliegende Erfindung eine einfrierbare flüssige medizinische Zusammensetzung bereit, umfassend Fibrolase oder NAT, ein wasserlösliches Zinksalz, einen Zitronensäurepuffer, fakultativ einen zusätlichen Stabilisator, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus wasserlöslichen Calciumsalzen und, fakultativ, einem Füllmittel (z.B. Mannitol). Ein oberflächenaktives Mittel, wie etwa Tween 80 (BASF, Gurnee, Illinois) kann ebenso zugegeben werden, um die Einfrier-Auftau-Stabilität zu erhöhen. Tris-Puffer (Sigma, St. Louis, Missouri) oder ein anderer Puffer mit einer Pufferkapazität oberhalb pH 7,0 können zugegeben werden, um den pH bei oder oberhalb von pH 7,4 zu stabilisieren.
Unter einem anderen Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung kann die pharmazeutische Zusammensetzung eine lyophilisierbare oder lyophilisierte pharmazeutische Zusammensetzung sein, umfassend Fibrolase oder NAT, einen Zinkstabilisator, (z.B. wasserlösliches Zinksalz), und einen Zitronensäurepuffer mit oder ohne andere Bindemittel (z.B. Füllstoff, wie etwa Mannitol, Glycin oder ähnliches). Die lyophilisierte Zusammensetzung kann ebenso einen Disaccharid-Zucker enthalten, wie etwa Saccharose oder Trehalose, als ein Lyo-Schutzmittel („lyoprotectant"). Ein oberflächenaktives Mittel, wie etwa Tween 80, kann zugegeben werden, um gegen Lyophilisierungsbelastungen an der Metalloproteinase (Fibrolase oder NAT) zu schützen. Der pH wird idealerweise bei pH 8,0 ± 0,5 unter Verwendung eines geeigneten Puffers mit einem pK_a in diesem Bereich (z.B. Tris) gehalten werden.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zum Herstellen einer lyophilisierten Zusammensetzung, umfassend die Schritte von (i) Mischen von Fibrolase oder NAT mit einem Puffer und einem wasserlöslichen Zinksalz ebenso wie alle beliebigen fakultativen Inhaltsstoffe und (ii) Lyophilisieren dieser Mischung.
Zusätzlich betrifft die Erfindung einen Kit zum Herstellen einer wäßrigen pharmazeutischen Zusammensetzung, umfassend einen ersten Behälter mit der zuvor erwähnten lyophilisierten Zusammensetzung und einem zweiten Behälter mit einem physiologisch annehmbaren Lösungsmittel dafür.
Noch ein weiterer Aspekt dieser Erfindung betrifft ein Verfahren, umfassend die Schritte des Rekonstituierens der lyophilisierten Zusammensetzung und der Verabreichung der rekonstituierten Zusammensetzung an einen Patienten, der eine Lyse von Blutgerinnseln benötigt.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird eine pharmazeutische Zusammensetzung bereitgestellt, umfassend ein fibrinolytisches Metalloproteinase-Mittel, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Fibrolase und neuem wirksamem Thrombolytikum (NAT), einem Zinkstabilisator und, fakultativ, einem Füllmittel in einem pharmazeutisch annehmbaren Puffer.
Die vorliegende Erfindung stellt ebenso ein Verfahren zum Herstellen einer lyophilisierten Zusammensetzung bereit, umfassend die Schritte:

(a) Bilden einer Mischung aus einem fibrinolytischen Metalloproteinase-Mittel, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Fibrolase und neuem wirksamem Thrombolytikum (NAT), einem Zinksalz, einem Füllmittel, einem stabilisierenden Disaccharid und einem oberflächenaktiven Mittel in einem Puffer, und
(b) Lyophilisieren der Mischung aus Schritt (a).

Zusätzlich stellt die vorliegende Erfindung einen Kit zum Herstellen einer wäßrigen pharmazeutischen Zusammensetzung bereit, umfassend einen ersten Behälter mit einer lyophilisierten Zusammensetzung eines Zink-Stabilisators und einem fibrinolytischen Metalloproteinase Mittel, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Fibrolase und neuem wirksamen Thrombolytikum (NAT), und einen zweiten Behälter mit einem physiologisch annehmbaren Lösungsmittel für die lyophilisierte Zusammensetzung.
Ebenso werden Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung zur Verwendung bei der Lyse-Behandlung von Blutgerinnseln sowie die Verwendung der Zusammensetzungen der Erfindung zur Herstellung eines Medikaments zur Verwendung bei der Lysebehandlung von Blutgerinnseln bereitgestellt.
Die vorliegende Erfindung stellt zusätzlich ein in-vitro-Verfahren zum Lysieren eines Fibringerinnsels bereit, wobei das Verfahren darin besteht, das Fibringerinnsel mit einem fibrinolytischen Metalloproteinase-Mittel, ausgewählt aus der Gruppe, umfassend Fibrolase und neu em wirksamem Thrombolytikum (NAT), einem Zinkstabilisator und fakultativ einem Füllmittel in einem pharmazeutisch annehmbaren Puffer in Kontakt zu bringen.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Eine Vielzahl von Wirt-Vektor-Systemen können verwendet werden, um die kodierende Sequenz für Fibrolase oder NAT-Polypeptid in Übereinstimmung mit Standardverfahren für die rekombinante Expression zu exprimieren, die Fachleuten gut bekannt sind, und dadurch das fibrinolytisch aktive Polypeptid für die Zusammensetzungen zu erhalten. Solche Systeme schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf eukaryotische Zellsysteme, wie etwa Säugetierzellsysteme, die mit Virus infiziert sind (z.B. Vaccinia-Virus, Adenovirus etc.); Insektenzellsysteme, die mit Virus infiziert sind (z.B. Baculovirus); Mikroorganismen, wie etwa Hefe, die Hefevektoren enthalten; oder prokaryotische Zellsysteme, wie etwa Bakterien (z.B. E. coli), die mit Bakteriophagen-DNA, Plasmid-DNA oder Cosmid-DNA transformiert sind. Die Expressionselemente dieser Vektoren variieren hinsichtlich ihrer Stärken und Spezifitäten. Abhängig von dem verwendeten Wirt-Vektor-System kann irgendein beliebiges aus einer Anzahl von geeigneten Transkriptions- und Translationselementen verwendet werden.
Bevorzugt wird ein Hefeexpressionssystem (z.B. Pichia pastoris) zur rekombinanten Expression wegen seiner größeren Effizienz verwendet. Eine detaillierte Beschreibung eines solchen Systems kann in US-Patent Nr. 4,855,231 (Stroman et al.), US-Patent Nr. 4,812,405 (Lair et al.), US-Patent Nr. 4,818,700 (Cregg et al.), US-Patent Nr. 4,885,242 (Cregg) und US-Patent Nr. 4,837,148 (Cregg) gefunden werden, deren Offenbarungen hierin durch Bezugnahme eingebaut werden. Die Expression von Fibrolase in einem solchen System wird typischerweise ein DNA-Molekül der SEQ ID NO:5 beinhalten, das für die „Präpro"-Sequenz (Nukleotide 1–-783) zusätzlich zu dem „reifen" Polypeptid (Nukleotide 784–1392) kodiert. Die Expression von NAT in einem solchen System wird typischerweise ein DNA-Molekül von SEQ ID NO:6 beinhalten, das für die „Präpro"-Sequenz (Nukleotide 1–783) zusätzlich zu dem „reifen" Polypeptid (Nukleotide 784–1386) kodiert.
Weitere Einzelheiten im Hinblick auf NAT und Verfahren zu seiner Herstellung können in zeitgleich anhängiger Patentanmeldungsveröffentlichungs-Nr. WO 0125445 mit gemeinsamer Inhaberschaft gefunden werden, die zusammen mit dieser Anmeldung eingereicht worden ist.
Wenn das Polypeptid (Fibrolase oder NAT) hergestellt, aufgereinigt und dann auf seine Aktivität getestet worden ist (unter Verwendung von Prozeduren für fibrinolytische Mittel, die Fachleuten bekannt sind), kann es zu pharmazeutischen Zusammensetzungen in Übereinstimmung mit dieser Erfindung formuliert werden.
In den vorliegenden Zusammensetzungen (ob gefroren oder lyophilisiert), wird ein Stabilisator (der ebenso als ein „glasbildender Zusatzstoff" bezeichnet werden kann) zugegeben, um die Fällung und den chemischen Abbau von Fibrolase oder NAT zu verhindern oder zu reduzieren, was immer zutreffend sein mag. Eine verschwommene oder trübe Lösung bei Zimmertemperatur zeigt an, daß das Polypeptid ausgefallen ist. Der Begriff „Stabilisator" bedeutet ein Bindemittel, das in der Lage ist, die Aggregation oder einen anderen physikalischen Abbau ebenso wie einen chemischen Abbau (z.B. Autolyse, Deamidierung, Oxidation etc.) von Fibrolase oder NAT in einem wäßrigen Medium zu verhindern.
Es ist gefunden worden, daß der Einschluß eines Zinkstabilisators und genauer eines wasserlöslichen Zinksalzes, die Stabilität der Metalloproteinase (Fibrolase oder NAT) in jedem Typ von Zusammensetzung erhöht, im Vergleich zu Formulierungen, bei denen anorganische oder andere Typen von organischen Verbindungen verwendet werden, um die Aggregation und/oder den Polypeptid-Abbau zu verhindern. Genauer werden Zinkkonzentrationen oberhalb von 0,01 millimolar (mM) die Metalloproteinase stabilisieren, unter der Voraussetzung, daß Zinkkonzentrationen oberhalb von 1 mM die Löslichkeit von Fibrolase oder NAT signifikant beschränken. Daher wird ein Bereich von ungefähr 0,01 mM bis ungefähr 1 mM angeraten. Beispiele für geeignete Zinksalze sind Zinkacetat, Zinksulfat und Zinkchlorid.
Insbesondere gefrorene Flüssigzusammensetzungen in Übereinstimmung mit dieser Erfindung können fakultativ (aber nicht notwendigerweise) ebenso ein wasserlösliches Calciumsalz als einen zusätzlichen Stabilisator enthalten. Beispiele sind Calciumacetat, Calciumsulfat oder Calciumchlorid, die bevorzugt in einer Konzentration von ungefähr 0,001 bis ungefähr 0,02 mM vorhanden sind und bevorzugter bei einer Konzentration von ungefähr 0,01 ± 0,002 mM.
Wenn erwünscht, können andere Stabilisatoren, die üblicherweise in pharmazeutischen Zusammensetzungen verwendet werden, wie etwa Saccharose, Trehalose oder Glycin, zusätzlich zu den oben erwähnten verwendet werden. Typischerweise werden solche Stabilisatoren in geringeren Mengen im Bereich von z.B. ungefähr 0,1% bis ungefähr 0,5% (w/v) zugegeben. Oberflächenaktive Stabilisatoren, wie etwa Tween 20 oder Tween 80 (BASF), können ebenso in herkömmlichen Mengen zugegeben werden.
Wenn erwünscht, können die gefrorenen flüssigen und lyophilisierten Zusammensetzungen ebenso ein Füll/Osmolaritäts-regulierendes Mittel einschließen. Bevorzugt wird Mannitol in einer Konzentration von ungefähr 2 Gew.% bis ungefähr 8 Gew.%, bezogen auf das Volumen (w/v), eingebaut und gewöhnlich in einer Konzentration von ungefähr 5% (w/v).
Es ist gefunden worden, daß die Wahl eines pharmazeutisch annehmbaren Puffers und pH ebenso die Stabilität der vorliegenden Zusammensetzungen beeinflußt. Fibrolase oder NAT ist am stabilsten oberhalb eines neutralen pH (7,0). Eine signifikante Fällung von beiden Metalloproteinasen findet bei einem pH unterhalb von 7,0 statt, wenn die gefrorene Zusammensetzung aufgetaut wird oder die lyophilisierte Zusammensetzung rekonstituiert wird. Das Puffersystem, das in den Zusammensetzungen vorhanden ist, wird so ausgewählt, daß es physiologisch kompatibel ist, und um einen erwünschten pH in der rekonstituierten Lösung ebenso wie in der Lösung vor der Lyophilisierung aufrechtzuerhalten. Bevorzugt haben die Puffer eine pH-Pufferungskapazität im Bereich von ungefähr pH 7,0 bis ungefähr pH 8,5.
Insbesondere werden Zitronensäurepuffer (d.h. Zitronensäure oder ein Zitronensäuresalz) bevorzugt in einer Konzentration von ungefähr 20 mM bis ungefähr 110 mM eingebaut und am bevorzugtesten bei ungefähr 100 mM in der gefrorenen flüssigen Zusammensetzung und ungefähr 20 mM in der lyophilisierten Zusammensetzung. Zitronensäuresalze werden als sowohl Puffermittel als auch Stabilisierungsmittel in den Zusammensetzungen dieser Erfindung verwendet. Ob eine Säureform selbst oder ein Salz davon verwendet wird, wird der Zitronensäurepuffer so ausgewählt, daß er den pH der Zusammensetzung auf einen Wert innerhalb des erwünschten Bereichs, wie oben angezeigt, einstellt (im Falle der lyophilisierten Zusammensetzung nach der Rekonstituierung). Zusätzliche Pufferungsmittel, wie etwa Tris, können in geeignet wirksamen Mengen zugegeben werden, um eine adäquate Pufferungskapazität oberhalb von pH 7,0 aufrecht zu erhalten.
Eine bevorzugte, einzufrierende flüssige Zusammensetzung wird zusätzlich zu solubilisierter Fibrolase oder NAT Zinkacetat in einer Konzentration von ungefähr 0,08 mM bis ungefähr 0,12 mM, Calciumacetat in einer Konzentration von ungefähr 0,008 mM bis ungefähr 0,012 mM und Zitronensäure (oder Natriumcitrat) in einer Konzentration von ungefähr 95 mM bis ungefähr 105 mM bei ungefähr pH 7,4 enthalten. Eine andere bevorzugte flüssige Zusammensetzung wird Fibrolase oder NAT, Zinkacetat in einer Konzentration von 0,08 mM bis ungefähr 0,12 mM, Zitronensäure (oder Natriumcitrat) in einer Konzentration von ungefähr 18 mM bis ungefähr 22 mM, Tris in einer Konzentration von 0,02 mM bis ungefähr 0,06 mM, Mannitol in einer Konzentration von ungefähr 3% bis ungefähr 6% (w/v) und Tween 80 in einer Konzentration von ungefähr 0,008% bis ungefähr 0,012% (w/v) bei einem pH von ungefähr 8,0 enthalten.
Eine bevorzugte lyophilisierbare Zusammensetzung wird zusätzlich zu Fibrolase oder NAT Zinksulfat in einer Konzentration von ungefähr 0,08 mM bis ungefähr 0,12 mM, Zitronensäure (oder Natriumcitrat) in einer Konzentration von ungefähr 18 mM bis ungefähr 22 mM, Tris in einer Konzentration von ungefähr 3 mM bis 6 mM, Mannitol in einer Konzentration von ungefähr 3% bis ungefähr 6% (w/v) und Tween 80 in einer Konzentration von ungefähr 0,008% bis ungefähr 0,012% (w/v) bei einem pH von ungefähr 8,0 enthalten.
Für alle Zusammensetzungen in Übereinstimmung mit dieser Erfindung ist Fibrolase oder NAT in einer Konzentration von 0,1 mg/ml bis ungefähr 50 mg/ml bevorzugt vorhanden, wobei eine Konzentration von ungefähr 5 mg/ml bis ungefähr 40 mg/ml bevorzugter ist, und eine Konzentration von ungefähr 10 mg/ml bis ungefähr 15 mg/ml am bevorzugtesten ist.
Die relativen Anteile der Bindemittel in diesen Zusammensetzungen werden von mehreren Faktoren abhängen. Zum Beispiel hat die Menge der Metalloproteinase und des Füllmittels (z.B. Mannitol) einen Effekt auf die Menge an Zink (und Calcium, sofern vorhanden), die benötigt wird, um die Zusammensetzung zu stabilisieren. Die Menge an Stabilisator, die von den Zusammensetzungen verwendet wird, wird von der Menge abhängen, die benötigt wird, um die strukturelle Integrität der Fibrolase oder NAT während der Lyophilisierung oder anderer Verarbeitung oder bei der Lagerung aufrechtzuerhalten.
Noch weitere Bindemittel, die auf dem Gebiet bekannt sind, können ebenso in der Zusammensetzung eingeschlossen sein, vorausgesetzt, daß sie physiologisch kompatibel sind und in keiner Weise gegenüber Fibrolase oder NAT schädlich sind. Zum Beispiel kann die Zusammensetzung geringe Mengen an Zusatzstoffen wie etwa Konservierungsmitteln, Tonizitätseinstellenden Mitteln, Antioxidantien, oder andere Polymere (z.B. Viskositäts-einstellende Mittel oder Streckmittel) enthalten. Fachleute können in leichter Weise geeignete Reagenzien bestimmen, die pharmazeutisch nützlich wären, basierend auf der Kenntnis von und der Erfahrung mit anderen pharmazeutischen Zusammensetzungen. Siehe z.B. Remington's Pharmeceutical Sciences (neueste Auflage), Mack Publishing Company, Easton, PA.
Es wird erwartet, daß die Zusammensetzungen für wenigstens zwei Jahre bei –30°C für die gefrorene Zusammensetzung und zwei Jahre bei 2°C bis 8°C für die lyophilisierte Zusammensetzung stabil sind. Diese langfristige Stabilität ist zum Verlängern der Haltbarkeit des pharmazeutischen Produkts und für Transporte über lange Distanz von Vorteil.
Unter einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ebenso ein Verfahren zum Herstellen einer lyophilisierten Zusammensetzung bereit, umfassend die Schritte:

(a) Einstellen des pH einer Mischung, enthaltend die Zusammensetzungsinhaltsstoffe ohne Fibrolase oder NAT auf zwischen pH 7,6 und pH 8,2,
(b) Pufferaustausch einer Fibrolase- oder NAT-enthaltenden Lösung in die Zusammensetzungslösung aus Schritt (a) und dann Zugeben einer wirksamen Menge eines oberflächenaktiven Mittels und
(c) Lyophilisieren der Mischung aus Schritt (b)

Fibrolase oder NAT und wirksame Mengen der Bindemittel werden unter Bedingungen bei gemischt, die wirksam sind, um die Aggregation des getrockneten Fibrolase- oder NAT-Polypeptids bei der Rekonstituierung mit dem Rekonstituierungsmedium zu verringern, z.B. einem Lösungsmittel, das mit der ausgewählten Verabreichungsroute kompatibel ist und die Metalloproteinase nicht negativ beeinträchtigt, wie etwa steriles Wasser, physiologische Salzlösung, Glucoselösung oder andere wäßrige Lösungsmittel (z.B. Alkohole, wie etwa Ethyl-, n-Propyl- oder Isopropyl-, Butylalkohol oder Mischungen davon) und fakultativ andere Bestandteile, wie etwa antibakterielle Mittel.
Die Bindemittel können der Metalloproteinase zu einer geeigneten Zeit vor der Lyophilisierung beigemischt werden. Die Zeit, die benötigt wird, um die Bindemittel und die Metalloproteinase zu mischen, sollte ausreichen, um eine geeignete Mischung herzustellen; bevorzugt wird das Mischen für ungefähr eine bis ungefähr 30 Minuten durchgeführt.
Danach kann die formulierte Metalloproteinase lyophilisiert, gelagert und unter Verwendung von Standardmethoden rekonstituiert werden; siehe Pikal, oben. Die spezifischen Bedingungen, unter denen Fibrolase oder NAT gefriergetrocknet und rekonstituiert wird, sind nicht besonders kritisch, vorausgesetzt, daß die ausgewählten Bedingungen die Metalloproteinase nicht abbauen und für den Stabilisator nicht nachteilhaft sind. Ein bevorzugter Lyophilisierungszyklus umfaßt das Einfrieren der Zusammensetzung bei –40°C, das Tempern der gefrorenen Probe bei –12°C und das Durchführen der primären Trocknung bei –30°C bis –35°C für zwanzig bis fünfzig Stunden und der sekundären Trocknung bei 20°C für zwanzig bis vierzig Stunden. Im allgemeinen wird die rekonstituierte Zusammensetzung bald nach der Rekonstituierung verwendet werden.
Sowohl NAT als auch Fibrolase werden am besten lokal an die Stelle des Gerinnsels für die wirksamste Behandlung abgegeben. Ebenso wie Fibrolase wird NAT durch α₂-Makroglobulin im allgemeinen Kreislauf kovalent gebunden. Im Komplex mit α₂-Makroglobulin können weder Fibrolase noch NAT auf das Zielsubstrat Zugriff haben (d.h. Fibrin oder Fibrinogen) und sind weitgehend unwirksam, es sei denn und bis die maximalen angeborenen Konzentrationen von α₂-Makroglobulin überschritten werden. Daher wird bevorzugt, daß die Zusammensetzungen dieser Erfindung direkt an das Blutgerinnsel über eine intraarterielle oder intravenöse Katheterisierung verabreicht werden.
Beschreibung spezifischer Ausführungsformen
Die folgenden Beispiele veranschaulichen die vorliegende Erfindung näher.
Das rekombinante NAT (SEQ ID NO:1), das in den Beispielen 1–3 verwendet wurde, wurde durch Expression in P. pastoris erzeugt. Details im Hinblick auf ein geeignetes Expressionssystem und Verfahren können in den Patenten von Stroman et al., Lair et al., Cregg et al. und Cregg gefunden werden, auf die oben Bezug genommen worden ist. Alle Chemikalien hatten entweder Analyse-Qualität oder USP-Qualität.
Beispiel 1
Herstellung einer gefrorenen Flüssigzusammensetzung
Eine wäßrige Lösung, enthaltend 100 mM Zitronensäure, 0,01 mM Calciumacetat und 0,1 mM Zinksulfat wird durch Beimischung der Inhaltsstoffe hergestellt, wobei der pH auf 7,4 eingestellt wird. Eine NAT-enthaltende Lösung wird in die Lösung mittels Dialyse pufferausgetauscht (alternativ kann Ultrafiltration verwendet werden). Die resultierende NAT-Lösung wird auf 10 mg/ml konzentriert und gefroren bei einer Temperatur von –30°C gelagert, bis sie zur Verwendung bereit ist.
Beispiel 2
Herstellung einer lyophilisierten Zusammensetzung
Herstellung einer lyophilisierbaren Zusammensetzung. Eine wäßrige Lösung, enthaltend 5 mM Tris, 20 mM Zitronensäure, 5% (w/v) Mannitol, 0,5% (w/v) Saccharose und 0,1 mM Zinksulfat wurde durch Beimischung der Inhaltsstoffe hergestellt, wobei der pH auf 8,0 eingestellt wurde. Eine NAT-enthaltende Lösung wurde in die Zusammensetzungslösung mittels Dialyse (Ultrafiltration kann stattdessen verwendet werden) pufferausgetauscht. Die resultierende NAT-Lösung wurde auf 10 bis 12 mg/ml konzentriert. Tween 80 wurde auf eine Endkonzentration von 0,01 % (w/v) zugegeben. Die Lösung wurde bei einer Temperatur von 2–-8°C gelagert, bis sie zur Lyophilisierung bereit war.
Gefriertrocknungszyklus für lyophilisiertes Produkt. Die oben hergestellte Zusammensetzung wurde zuerst bei einer Temperatur von –40°C im Lyophilistor eingefroren. Die Temperierungstemperatur („annealing temperature") wurde auf –12°C eingestellt; die primäre Trocknungstemperatur wurde auf –30°C eingestellt und die sekundäre Trocknungstemperatur wurde auf 20°C eingestellt. Der resultierende gefriergetrocknete Kuchen zeigte eine gute Morphologie und enthielt weniger als 3% Wasser, nachgewiesen mit der Titrationsmethode nach Karl Fischer; siehe Fischer, Angew Chemie, Band 48, Seite 394 (1935). Nachdem der Gefriertrocknungsprozeß beendet war, wurde der lyophilisierte Kuchen in Gefäße eingebracht, und Gummistopfen wurden vollständig unter Vakuum versiegelt, indem man die oberen Metallböden in dem Lyophilisator unterdrückte. Die Gefäße wurden dann mit 13-mm ent fernbaren Aluminiumversiegelungen („Flip-off aluminum seals") gebördelt und in auf unterschiedliche Temperaturen eingestellte Inkubatoren gebracht.
Beispiel 3
Analysen von rekonstituierten lyophilisierten Proben
Analyse der Probenzeitpunkte. Probengefäße wurden aus den Inkubatoren zu vorbestimmten Zeitintervallen für die Analyse der Zeitpunkte entnommen. Der lyophilisierte Probenkuchen wurde zuerst mit 0,9 ml sterilem Wasser rekonstituiert, d.h. „Wasser-zur-Injektion" (McGaw Inc., Irvine, CA). Die Klarheit der rekonstituierten Probelösungen wurde visuell untersucht. Die gefilterte Lösung wurde mittels HPLC, UV-Vis-Spektroskopie und Enzymaktivität analysiert, um das verbleibende lösliche NAT in diesen lyophilisierten Proben zu quantifizieren.
Auf der Grundlage der obigen Analysen wurde mehr als 90% NAT nach Rekonstitution des lyophilisierten Produktes wiedergewonnen.
UV/Vis-Absorption. 150–200 μl NAT-Lösung wurde in eine Quarzglas-Suprasil-Ultra-Mikrozelle mit 1-cm Weglänge geladen. Die UVNis-Absorption wurde auf einem HP 8452A-Dioden-Array-Spektrophotometer gemessen (Hewlett-Packard Co., Wilmington, DE). NAT-Konzentrationen wurden bestimmt unter Verwendung von A^0,1% = 1,05 bei 280 nm, auf der Grundlage einer Berechnung anhand der Aminosäurezusammensetzung; für eine Literaturangabe siehe Edelhoch, Biochemistry, Band 6, Seiten 1948–1954 (1967). Nach Rehydratisierung des lyophilisierten Produktes wurde keine nachweisbare Trübung beobachtet, wenn die Absorption bei 350 Nanometer (nm) gemessen wurde.
Hochleistungsflüssigchromatographie. HPLC-Analysen der NAT-Proben wurden unter Verwendung eines HP-1050-Flüssigchromatographiesystems durchgeführt, das mit einer HP-3D-Chemstation zur Datensammlung ausgestattet war (Hewlett-Packard Co.). Die NAT-Spezies wurden mittels Absorption bei 280 nm und 214 nm unter Verwendung eines HP-Dioden-Array-Detektors nachgewiesen.
Für Umkehrphasen-HPLC (RP-HPLC), wurden Proben auf eine Zorbax 300SB-C8-Säule (4,6 × 250 nm) (Hewlett-Packard Co.) in einer mobilen Phase, bestehend aus 51,5% Puffer A (2% Isopropanol, 0,1 % TFA) und 48,5% Puffer B (90% Acetonitril, 2% Isopropanol, 0,1 % TFA) bei einer Durchflußrate von 0,6 ml/min injiziert. Der Puffer B wurde für sechs Minuten gehalten und dann auf 51 % über zwanzig Minuten hochgefahren („ramped up"). Diese Konzentration wurde für eine Minute gehalten, gefolgt von einer achtminütigen Erhöhung („ramp") und einem fünfminütigem Halten bei 90%. Schließlich wurde Puffer B auf 48,5% über eine Periode von drei Minuten zurückgefahren. Die Wiedergewinnung von NAT nach der Lyophilisierung, nachgewiesen mit diesem Verfahren, war größer als 92%.
Für Ionenaustausch-HPLC (IEX-HPLC) wurden Proben auf eine Tosohaas-DEAE-SPW-Säule (7,5 × 75 mm) (Tosohaas, Montgomeryville, Alabama) in einer mobilen Phase injiziert, bestehend aus 90% Puffer A (20 mM Tris, pH 8,5) und 10% Puffer B (20 mM Tris, 250 mM NaCl, pH 8,5) bei einer Durchflußrate von 0,5 ml/min. Dann wurde ein Gradient aufgetragen, ansteigend von 10% Puffer B auf 75% Puffer B in zwanzig Minuten, dann von 75% B auf 90% Puffer B in einer Minute. Der Puffer B wurde dann für fünf Minuten gehalten, gefolgt von einer Senkung („ramp") auf 10% Puffer B in vier Minuten. Die Wiedergewinnung von NAT nach der Lyophilisierung, nachgewiesen mit diesem Verfahren, war größer als 90%.
Für Größenausschluß-HPLC (SEC-HPLC), wurden Proben in eine Tosohaas G-2000SWXL-Säule geladen (300 × 7,8 mm). Eine isokratische Elution wurde bei einer Durchflußrate von 0,8 ml/min unter Verwendung eines Puffers, enthaltend 15 mM Natriumphosphat, pH 7,0, und 0,140 M Natriumchlorid aufgetragen. Die Wiedergewinnung von NAT nach der Lyophilisierung, wie nachgewiesen mit diesem Verfahren, war größer als 95%.
Bioassay. Die Proben wurden auf eine Aktivität gegen Fibringerinnsel gescreent. Kleine Aliquots einer seriellen Verdünnung von NAT im Bereich von 0,01 bis 1,0 mg/ml wurden auf vorgeformte Fibringerinnsel in 96-Napf-Platten geladen. Die Proben wurden für achtzehn Stunden inkubiert, und die Lyse der Gerinnsel wurde mittels Absorption bei 500 nm quantifiziert. Ein Graph von Absorption gegen NAT-Konzentration für verschiedene Formulierungen wurde mit einem hergestellten NAT-Standard für die relative Aktivität verglichen. Es gab keinen meßbaren Unterschied hinsichtlich der fibrinolytischen Aktivität des NAT nach der Lyophilisierung, relativ zu der Kontrollprobe (nicht-lyophilisiert).
Ähnliche Testresultate werden auch mit der gefrorenen Flüssigzusammensetzung erhalten, nachdem die letztere bei 4°C aufgetaut und unter Verwendung dieser selben Protokolle getestet wird.
Die vorhergehende Erfindung ist mit einigen Einzelheiten zu Zwecken der Klarheit und des Verständnisses beschrieben worden. Es wird auch klar sein, daß verschiedene andere Kombinationen in der Form und den Einzelheiten gemacht werden können, ohne vom Umfang der Erfindung, wie in den angehängten Ansprüchen definiert, abzuweichen.
Beispiel 4
Die Prozeduren aus den Beispielen 1 und 2 werden mit rekombinanter Fibrolase anstelle von NAT wiederholt, um ähnliche gefrorene Flüssig- und lyophilisierte pharmazeutische Zusammensetzungen zu erzeugen.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Eine pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend ein fibrinolytisches Metalloproteinase-Mittel, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Fibrolase und neuem wirksamem Thrombolytikum (NAT), einen Zinkstabilisator und, fakultativ, einen Füllstoff, in einem pharmazeutisch akzeptablen Puffer.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei der Zinkstabilisator ein wasserlösliches Zinksalz ist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Zinksulfat, Zinkacetat und Zinkchlorid.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei der Puffer Zitronensäure oder ein wasserlösliches Zitronensäuresalz ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei der Füllstoff Mannitol ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 1, die einen pH im Bereich von 6,5 bis 8,5 hat.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 1, die in der Form einer gefrorenen Flüssigkeit ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 6, die fakultativ ein wasserlösliches Calciumsalz enthält.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 7, in der das wasserlösliche Calciumsalz ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Calciumacetat, Calciumsulfat und Calciumchlorid.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 1, die lyophilisiert ist.
Wäßrige pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei das fibrinolytische Metalloproteinase-Mittel in einer Menge von 0,1 bis 50 mg/ml vorliegt; wobei der Zinkstabilisator 0,08 bis 0,12 mM Zinksulfat umfaßt; wobei der pharmazeutisch akzeptable Puffer 0,008 mM bis 0,012 mM Calciumacetat und 95 bis 110 mM Zitronensäure oder Natriumcitrat umfaßt; und wobei der pH besagter Zusammensetzung 7,4 ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 10, wobei die Metalloproteinase in einer Menge von 10 mg/ml vorliegt; wobei besagte Zitronensäure in einer Konzentration von 100 mM vorliegt; wobei besagtes Calciumacetat in einer Konzentration von 0,01 mM vorliegt; und wobei besagtes Zinksulfat in einer Konzentration von 0,1 mM vorliegt.
Wäßrige pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei das fibrinolytische Metalloproteinase-Mittel in einer Menge von 0,1 bis 50 mg/ml vorliegt; wobei der Zinkstabilisator 0,08 bis 0,12 mM Zinkacetat umfaßt; wobei der pharmazeutisch akzeptable Puffer 18 bis 22 mM Zitronensäure oder Natriumcitrat und 0,02 bis 0,06 mM Tris umfaßt; wobei das fakultative Füllmittel vorhanden ist und besagtes Füllmittel 3 bis 6 Prozent (Gew./Vol.) Mannitol umfaßt; wobei ein weiterer Stabilisator vorhanden ist, umfassend 0,008 bis 0,012 Prozent (Gew./Vol.) oberflächenaktives Mittel; und wobei der pH besagter Zusammensetzung 8,0 ist.
Wäßrige pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei das fibrinolytische Metalloproteinase-Mittel in einer Menge von 0,1 bis 50 mg/ml vorliegt; wobei der Zinkstabilisator 0,08 bis 0,12 mM Zinksulfat umfaßt; wobei der pharmazeutisch akzeptable Puffer 18 bis 22 mM Zitronensäure oder Natriumcitrat und 3 bis 6 mM Tris umfaßt; wobei das fakultative Füllmittel vorhanden ist und besagtes Füllmittel 3 bis 6 Prozent (Gew./Vol.) Mannitol umfaßt; wobei ein weiterer Stabilisator vorhanden ist, umfassend 0,008 bis 0,012 Prozent (Gew./Vol.) oberflächenaktives Mittel und, fakultativ, 0,1 bis 0,5 Prozent (Gew./Vol.) Saccharose; und wobei der pH besagter Zusammensetzung 8,0 ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 13, wobei die Metalloproteinase in einer Konzentration von 12 mg/ml vorliegt; wobei besagtes Tris in einer Konzentration von 5 mM vorhanden ist; wobei besagte Zitronensäure in einer Konzentration von 20 mM vorhanden ist; wobei besagtes Mannitol in einer Konzentration von 5 Prozent (Gew./Vol.) vorhanden ist; wobei besagte Saccharose in einer Konzentration von 0,5 Prozent (Gew./Vol.) vorhanden ist; wobei besagtes oberflächenaktives Mittel in einer Konzentration von 0,01 Prozent (Gew./Vol.) vorhanden ist; wobei besagtes Zinksulfat in einer Konzentration von 0,1 mM vorhanden ist; und wobei der pH besagter Zusammensetzung 8,0 ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 14, wobei die Metalloproteinase NAT mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:1 ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 14, wobei die Metalloproteinase Fibrolase mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:3 ist.
Ein Verfahren zum Herstellen einer lyophilisierten Zusammensetzung, umfassend die Schritte: (a) Bilden einer Mischung aus einem fibrinolytischen Metalloproteinase-Mittel, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Fibrolase und neuem wirksamem Thrombolytikum (NAT), einem Zinksalz, einem Füllmittel, einem stabilisierenden Disaccharid und einem oberflächenaktiven Mittel in einem Puffer, und (b) Lyophilisieren der Mischung aus Schritt (a).
Verfahren nach Anspruch 17, in dem der pH besagter Zusammensetzung auf zwischen 7,8 und 8,2 vor der Lyophilisierung eingestellt wird.
Verfahren nach Anspruch 17, umfassend die Schritte: (a) Einstellen des pHs einer Lösung, enthaltend das Zinksalz, Füllmittel und stabilisierendes Disaccharid, auf einen pH zwischen 7,6 und 8,2, (b) Austauschen des Puffers der Mischung, enthaltend die Metalloproteinase, in die Lösung aus Schritt (a) und dann Zugeben einer wirksamen Menge des oberflächenaktiven Mittels, und (c) Lyophilisieren der Mischung aus Schritt (b).
Verfahren nach einem der Ansprüche 17 bis 19, bei dem die Metalloproteinase NAT mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:1 ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 17 bis 19, bei dem die Metalloproteinase Fibrolase mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:3 ist.
Eine lyophilisierte pharmazeutische Zusammensetzung, erhältlich durch das Verfahren nach einem der Ansprüche 17 bis 21.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 16 zur Blutgerinnsel-Lyse-Behandlung.
Verwendung der Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 16 zur Herstellung eines Medikaments zur Blutgerinnsel-Lyse-Behandlung.
Ein Kit zum Herstellen einer wäßrigen pharmazeutischen Zusammensetzung, umfassend einen ersten Behälter mit einer lyophilisierten Zusammensetzung aus einem Zinkstabilisator und einem fibrinolytischen Metalloproteinase-Mittel, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Fibrolase und neuem wirksamem Thrombolytikum (NAT), und einen zweiten Behälter mit einem physiologisch akzeptablen Lösungsmittel für die lyophilisierte Zusammensetzung.
Kit nach Anspruch 25, wobei das fibrinolytische Metalloproteinase-Mittel NAT mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:1 ist.
Kit nach Anspruch 25, wobei das fibrinolytische Metalloproteinase-Mittel Fibrolase mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:3 ist.
Ein in-vitro Verfahren zum Lysieren eines Fibringerinnsels, wobei das Verfahren umfaßt: In-Kontakt-Bringen des Fibrin-Gerinnsels mit einem fibrinolytischen Metalloproteinase-Mittel, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Fibrolase und neuem wirksamem Thrombolytikum (NAT), einem Zinkstabilisator und, fakultativ, einem Füllmittel, in einem pharmazeutisch akzeptablen Puffer.
Verfahren nach Anspruch 28, wobei das fibrinolytische Metalloproteinase-Mittel NAT mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:1 ist.
Verfahren nach Anspruch 28, wobei das fibrinolytische Metalloproteinase-Mittel Fibrolase mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:3 ist.
Ein Verfahren, umfassend den Schritt des Rekonstituierens der lyophilisierten pharmazeutischen Zusammensetzung nach Anspruch 9 oder Anspruch 22.
Zusammensetzung, erhältlich durch das Verfahren nach Anspruch 31 zur Verwendung bei der Blutgerinnsel-Lyse-Behandlung.
Verwendung des Verfahrens nach Anspruch 31 zur Herstellung eines Medikaments zur Blutgerinnsel-Lyse-Behandlung.