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Diese
Erfindung betrifft ein neues Pigment in Futtermitteln für Salmonide,
ein neues Futtermittel, das dieses Pigment umfasst, und Verwendung
des Pigments. Dieses Pigment ist auch als Mittel zum Erhöhen des Wachstums
der Zuchtfische nützlich.
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In
Futtermitteln für
Zuchtsalmonide muss Pigment zugefügt werden, um die gewünschte Farbe
des Fischfleisches zu erhalten. Das am häufigsten verwendete Pigment
ist Astaxanthin, aber andere Pigmente wie zum Beispiel Cantaxanthin
können
verwendet werden. Diese Pigmente alle sind Carotinoide. Derartige
Pigmente sind hinsichtlich der Einwirkung von Luft und erhöhten Temperaturen
sehr instabil. Die Pigmente sind deshalb während der Futtermittelverarbeitung
und -lagerung bis zu einem gewissen Grad abgebaut.
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Im
Handel erhältliche
Astaxanthinprodukte sind ausserdem sehr teuer und ihre biologische
Retention ist sehr gering. Astaxanthin ist, wie vorstehend erwähnt, eine
ziemlich instabile Verbindung, welches selbstverständlich ein
weiterer Nachteil ist. Die geringe Stabilität des Astaxanthins liegt an
der Oxidation. Kommerzielle Pigmentprodukte werden formuliert, um
Oxidation zu vermeiden oder zu verringern. Eine typische Formulierung
für Astaxanthin
ist mit Gelatine und Stärke.
Die verwendeten Formulierungen sind in Bezug auf die biologische
Verfügbarkeit
des Pigments häufig
jedoch nicht optimal.
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In
WO-A 0062625 wurde ein neues Pigment, das gewissermaßen die
vorstehend angegebenen Probleme löste, offenbart. Dieses Pigment
umfasst einen Diester von Astaxanthin, hergestellt mit einer Carbonsäure, wobei
die Carbonsäure
eine ù-3-Fettsäure und/oder
eine Carbonsäure
mit 1–12
Kohlenstoffatomen ist. Ein Futtermittel für Salmoniden, die den Diester
von Astaxanthin umfassen, und die Verwendung des Diesters von Astaxanthin
als Pigment in Futtermitteln für
Salmoniden sind auch in WO-A-0062625 offenbart.
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In
EP-A-1404187 ist die Verwendung des Diesters von Astaxanthin von
WO-A-0062625 zum Erhöhen des
Wachstums von Zuchtfischen offenbart.
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Es
wird erwartet, dass Diester von Cantaxanthin und anderen Carotinoiden,
die mit denselben Carbonsäuren,
wie in WO-A-0062625 und EP-A-1404187 definiert, ähnliche Wirkungen verleihen,
wie in den beiden Patentbeschreibungen beschrieben, wenn sie als
Pigmente beziehungsweise Wachstumsverstärker verwendet werden.
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Mit
WO-A-0062625 wurde ein stabileres und biologisch verfügbareres
Pigment als freies Astaxanthin und andere kommerzielle Pigmentprodukte
gefunden. Auch wenn das Pigment gemäß WO-A-0062625 eine Verbesserung
ist, verglichen mit freiem Astaxanthin und anderen kommerziellen
Pigmentprodukten, ist es nicht optimal, und es ist noch ein starker
Wunsch und eine Notwendigkeit in der Aquakulturindustrie, stabile
und biologisch noch wirksamere Pigmente, die bei der Herstellung
von Futtermitteln für
Salmoniden nützlich
sind, zu finden.
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Astaxanthin
weist zwei asymmetrische Kohlenstoffatome an den 3- und 3'-Positionen auf und
kann als drei optische Isomere vorkommen; die Enantiomere (3R,3'R) und (3S,3'S) und die meso-Form
(3R,3'S) (Fig. 1).
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Fig.
1: Optische Isomere von Astaxanthin
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Die
chemische Synthese ergibt gleiche Gemische dieser optischen Isomere.
Kommerziell hergestelltes synthetisches Astaxanthin, welches gegenwärtig die
Form des Pigments ist, das vorwiegend Futtermitteln in der Salmoniden-Aquakultur
zugefügt
wird, ist folglich ein Gemisch von (3R,3'R)-, meso- und (3S,3'S)-Astaxanthin im ungefähren Verhältnis von
1:2:1. Astaxanthin aus natürlichen
Quellen auf der anderen Seite variiert weit in der Zusammensetzung
der optischen Isomere in Abhängigkeit
von der fraglichen Quelle. Das vorwiegende Isomer in den Algen Haematococcus
pluvialis ist (3S,3'S),
während
die Hefe Phaffia rhodozyma hauptsächlich (3R,3'R)-Astaxanthin aufweist
(Johnson, E.A. und An, G.H., CRC Critical Reviews in Biotechnology 11
(1991) 297).
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Es
herrscht allgemein Einigkeit darüber,
dass, wenn eine Diät,
die Astaxanthin in freier Form, d.h. nicht verestert, enthält, zugeführt wird,
werden die optischen Isomere von Astaxanthin gleich gut absorbiert
und im Fleisch der Salmonidenfische abgelagert (Foss, P. et al.,
Aquaculture 41 (1984) 213–226;
Kamata et al., Nippon Suisan Gakkaishi 56 (1990) 789). Die Salmoniden
können
auf der anderen Seite eine bestimmte Selektivität hinsichtlich der Absorption
und Ablagerung der optischen Isomere des Astaxanthins zeigen, wenn
eine Diät
zugeführt
wird, die die Esterform des Pigments enthält. Es ist bekannt, dass Salmoniden
einen Diester, Dipalmitat, von (3R,3'R)-Astaxanthin besser verwenden als
Dipalmitat von (3S,3'S)-Astaxanthin
(Torrissen, O.J. et al., CRC Critical Reviews in Aquatic Sciences
1 (1989) 209; Foss, P., et al., Aquaculture 65 (1987) 293; Katsuyama
et al., Comp. Biochem. Physiol. 86B (1987) 1; Schiedt, K., et al.,
Pure & Appl.
Chem. 57 (1985) 685). Jedoch weist Wildlachs ungefähr die gleiche
Astaxanthin-Stereoisomerverteilung im Fleisch auf, wie die, die
in ihrer Nahrung vorliegt, auch wenn die Nahrung hauptsächlich Diester
enthält
(Lura, H., et al., Can. J. Fish Aquat. Sci., 48 (1991) 429; Turujman,
S.A., et al., JAOAC 80 (1997) 622). Dieses legt nahe, dass der mögliche isomere
Effekt mäßig ist.
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Wie
nachstehend in Beispiel 1 beschrieben, wurden Hydrolyseexperimente
mit einem Diester von synthetischem Astaxanthin mit ù-3-Fettsäuren und
einer Rohenzympräparation
aus Lachsdärmen
auf dieselbe Art und Weise, wie vorher (WO-A-0062625) beschrieben,
durchgeführt.
Die Reaktionsprodukte wurden hinsichtlich der Stereoisomerzusammensetzung
analysiert. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 angegeben.
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Beispiel 1
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Ein
Diester von Astaxanthin wurde durch herkömmliche chemische Synthese
aus kommerziell erhaltenem synthetischem Astaxanthin und einem ù-3-Fettsäure-Konzentrat,
das mehr als 90% ù-3-Fettsäuren, hauptsächlich EPA
(Eicosapentaensäure)
und DNA (Docosahexaensäure)
enthält,
hergestellt. Das verwendete Astaxanthin ist durch chemische Synthese
hergestellt worden, und die Verteilung der optischen Isomere (3R,3'R), meso beziehungsweise
(3S,3'S) betrug
25,9:50,2:23,9, bestimmt, wie für
die Diol-Fraktion beschrieben.
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Der
Ausgangsastaxanthindiester wurde mit einem frisch hergestellten
Enzymgemisch aus den Därmen
von vor kurzem gefüttertem
Lachs (Salmo salar) 48 Stunden lang behandelt. Das Pigment wurde
dann durch präparative
Dünnschicht-Chromatographie
in drei Fraktionen getrennt; einer Diol-Fraktion mit beiden Hydroxylresten
hydrolysiert, einer Monoester-Fraktion mit einem Hydroxylrest hydrolysiert
und einer verbleibenden Diester-Fraktion.
Das Astaxanthin in der Diol-Fraktion wurde durch Umsetzung mit (–)-Camphanoylchlorid
in die entsprechenden Diester von (–)-Camphansäure umgewandelt, und die Verteilung
der optischen Isomere des Astaxanthins wurden durch Hochleistungsflüssigkeits-Chromatographie
(HPLC) der Dicamphanate bestimmt. Das Astaxanthin in der Monoester-Fraktion
wurde zuerst in einer Hydrolysereaktion, die durch das Enzym Cholesterinesterase
katalysiert wurde, in Diol umgewandelt und anschließend mit
(–)-Camphansäure behandelt
und analysiert, wie vorstehend beschrieben. Versuche, das Astaxanthin
in der verbleibenden Diester-Fraktion unter Verwendung der Cholesterinesterase
in Diol umzuwandeln, waren nicht erfolgreich, weil eine vollständige Umwandlung
nicht erhalten wurde. Die Verteilung der optischen Isomere des Astaxanthins in
der verbleibenden Diester-Fraktion wurde deshalb nicht bestimmt.
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Das
Lachsdarmenzymgemisch zeigte eine unerwartet hohe Enantioselektivität in Richtung
der R-Konfiguration des Astaxanthins an (Tabelle 1). Die Astaxanthindiol-Fraktion,
d.h. freies Astaxanthin, wies fast ausschließlich die (3R,3'R)-Konfiguration
mit Spuren der meso-Form auf. Die Monoester-Fraktion enthielt vorwiegend
die meso-Form des Astaxanthins. Die Verteilung der optischen Isomere
des Astaxanthins in der verbleibenden nicht hydrolisierten Diester-Fraktion
wurde nicht erhalten, aber unter Berücksichtigung der Zusammensetzung
der Ausgangsdiester, der Diol- und der Monoester-Fraktion, ist es
höchst
wahrscheinlich, dass die verbleibende Diester-Fraktion vorwiegend
die (3S,3'S)-Form
von Astaxanthin aufweist. Die relativen molaren Mengen des Pigments
in den verschiedenen Fraktionen stimmten mit dem überein,
was erwartet wurde, bezogen auf die Verteilung der optischen Isomere.
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Tabelle
1. Ergebnisse von der Untersuchung der Enantioselektivität von Enzymen
aus Lachsdärmen
zur Hydrolyse von Astaxanthin-ù-3-Fettsäurediester.
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Bezogen
auf die vorstehend zitierte Literatur, konnte man einen gewissen
Grad an Enantioselektivität in
Richtung der R-Konfiguration erwarten. Jedoch ist, weil die Isomerzusammensetzung
des Astaxanthins im Wildlachs ungefähr dieselbe ist, wie in der
Nahrung, die hohe Spezifität,
die mit den Estern der vorliegenden Erfindung dargelegt worden ist,
höchst überraschend.
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Diese
unerwartete Feststellung ist sehr wichtig. Von WO-A-0062625 ist
bekannt, dass es eine Beziehung zwischen erhöhter enzymatischer Hydrolyse
und erhöhter
Ablagerung des Astaxanthins im Lachsmuskel gibt. Die sehr verschiedene
Geschwindigkeit der Hydrolyse zwischen (3R,3'R)- und (3S,3'S)-Isomeren, die in der vorliegenden
Erfindung dargelegt ist, zeigt, dass der Astaxanthindiester auf
Basis des (3R,3'R)-Isomers eine
erheblich höhere
biologische Aufnahme aufweist als ein Diester auf Basis des (3S,3'S)-Isomers. Wie ein Fachmann
weiß,
zeigt eine hohe biologische Aufnahme des Astaxanthins gute Pigmentationswirkung
an.
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Ein
Astaxanthindiesterprodukt auf Basis einer gereinigten Stereoisomerie-Zusammensetzung ist
offensichtlich teurer als ein racemisches oder weniger gereinigtes
Produkt. Die Angaben in der Literatur bezüglich einer bestimmten Präferenz der
Aufnahme des (3R,3'R)-Isomers
sind nicht vorhanden, um dem Fachmann nahezulegen, dass die hohen
Kosten der Herstellung eines (3R,3'R)-Diesters durch erhöhte Bioverfügbarkeit kompensiert
werden würde.
Dieses wird durch eine Aussage von einem Produzenten von Astaxanthin
aus der Hefe Phaffia rhodozyma unterstrichen. Es ist bekannt, dass
Astaxanthin aus P. rhodozyma hauptsächlich das (3R,3'R)-Isomer enthält. Der
Produzent gibt an, dass ein Vorteil der Verwendung des Phaffia-Produkts
der ist, dass es hauptsächlich
nicht verestertes Astaxanthin enthält, von welchem bekannt ist,
dass es besser als verestertes Astaxanthin verwendet wird (Broschüre der Igene
Biotechnology Inc.:,AstaXin® Naturally!', welche bei der
Aquanor-Ausstellung in Trondheim, August 2001, verteilt wurde).
Im Gegensatz dazu haben die Erfinder gezeigt, dass die Herstellung
eines Diesters von (3R,3'R)-Astaxanthin,
der ù-3-Fettsäuren enthält, eine
erheblich höhere
Aufnahme ergibt als die, die mit dem (3S,3'S) veresterten Produkt gefunden wird.
Dieselbe Wirkung wird selbstverständlich unter Verwendung eines
Diesters von synthetischem oder natürlichem (3R,3'R)-Astaxanthin beobachtet.
Bezogen auf die Lehre von WO-A-0062625 haben die Erfinder angenommen,
dass die Verwendung eines Diesters von (3R,3'R)-Astaxanthin und einer kurzkettigen
Fettsäure ähnliche
Nutzen hat.
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Astaxanthin
ist sehr teuer und es wird angenommen, dass die Zugabe von Astaxanthin
oder anderen Carotinoiden der höchste
Kostenfaktor bei der Herstellung von Lachsfuttermitteln ist. Die
vorliegende Erfindung zeigt, dass sie von kommerziellem Wert ist,
ein Pigment herzustellen, das aus dem Diester von (3R,3'R)-Astaxanthin mit
einer Carbonsäure
besteht, wobei die Carbonsäure
eine ù-3-Fettsäure und/oder
eine kurzkettige Säure
ist.
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Zur
Vereinfachung wird im Folgenden die Formulierung „ù-3-Fettsäure" auch verwendet,
um ein Konzentrat von ù-3-Fettsäuren zu
bezeichnen. Dieses ist für
den Fachmann naheliegend.
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Es
ist eine Hauptaufgabe der Erfindung, ein Pigment für Futtermittel
für Salmoniden
bereitzustellen, das stabil und biologisch wirksamer ist als vorher
bekannte Pigmente für
Salmoniden.
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Ein
anderes Ziel dieser Erfindung ist, ein Pigment bereitzustellen,
das Futtermitteln in geringeren Mengen als vorher bekannte Pigmente
zugefügt
werden kann und noch immer eine zufriedenstellende Pigmentation
des Fleisches erhalten wird. Diese und andere Aufgaben werden durch
die angefügten
Patentansprüche gelöst.
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Eine
bevorzugte Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung ist ein Diester von (3R,3'R)-Astaxanthin, wobei
der Diester mit einer ù-3-Fettsäure hergestellt
wird, die eine Gesamtmenge Eicosapentaensäure (EPA) (all-cis C20:5 n-3)
und/oder Docosahexaensäure
(DHA) (all-cis C22:6 n-3) von 18 bis 100% umfasst.
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Eine
stärker
bevorzugte Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung ist ein Diester von (3R,3'R)-Astaxanthin, wobei
der Diester mit einer ù-3-Fettsäure hergestellt
wird, die eine Gesamtmenge Eicosapentaensäure (EPA) (all-cis C20:5 n-3)
und/oder Docosahexaensäure
(DHA) (all-cis C22:6 n-3) von 40 bis 100% umfasst.
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Eine
andere bevorzugte Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung ist ein Diester von (3R,3'R)-Astaxanthin, wobei
der Diester mit einer ù-3-Fettsäure hergestellt
wird, die eine Menge Eicosapentaensäure (EPA) (all-cis C20:5 n-3)
von 8 bis 98% und/oder eine Menge Docosahexaensäure (DHA) (all-cis C22:6 n-3)
von 8 bis 98% umfasst.
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Eine
stärker
bevorzugte Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung ist ein Diester von (3R,3'R)-Astaxanthin, wobei
der Diester mit einer ù-3-Fettsäure hergestellt
wird, die eine Menge Eicosapentaensäure (EPA) (all-cis C20:5 n-3)
von 25 bis 98% und/oder eine Menge Docosahexaensäure (DHA) (all-cis C22:6 n-3)
von 15 bis 98% umfasst.
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Noch
eine andere bevorzugte Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung ist ein Diester von (3R,3'R)-Astaxanthin, wobei
der Diester mit einer ù-3-Fettsäure hergestellt
wird, die ungefähr
50% Eicosapentaensäure
(EPA) (all-cis C20:5 n-3) und ungefähr 35% Docosahexaensäure (DHA)
(all-cis C22:6 n-3) umfasst.
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Noch
eine andere bevorzugte Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung ist ein Diester von (3R,3'R)-Astaxanthin, wobei
der Diester mit einer kurzkettigen Carbonsäure hergestellt wird, die Methansäure ist.
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Das
Astaxanthinprodukt gemäß der vorliegenden
Erfindung kann aus freiem Astaxanthin hergestellt werden, das durch
die chemische, biochemische oder enzymatische Synthesen erhalten
wird. Vorzugsweise wird das Astaxanthin, das zur Herstellung der
Astaxanthinprodukte gemäß der vorliegenden
Erfindung verwendet wird, aus natürlichen Quellen erhalten.
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Es
ist bekannt, dass der Pilz Phaffia rhodozyma einen hohen Gehalt
von (3R,3'R)-Astaxanthin in nicht veresterter
Form produziert. Eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden
Erfindung ist deshalb ein Diester von (3R,3'R)-Astaxanthin, wie vorstehend definiert,
der aus Astaxanthin hergestellt wurde, der von P. rhodozyma produziert
wurde.
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Das
Astaxanthinprodukt gemäß der vorliegenden
Erfindung umfasst einen Diester von vorwiegend (3R,3'R)-Astaxanthin, der
mit einer Carbonsäure
hergestellt wurde, wobei die Carbonsäure eine ù-3-Fettsäure und/oder eine Carbonsäure mit
1–12 Kohlenstoffatomen
ist.
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Vorzugsweise
umfasst das Astaxanthinprodukt einen Diester von 50–100% (3R,3'R)-Astaxanthin, stärker bevorzugt
umfasst das Astaxanthinprodukt einen Diester von 80–100% (3R,3'R)-Astaxanthin und
am meisten bevorzugt umfasst das Astaxanthinprodukt einen Diester
von 90–100%
(3R,3'R)-Astaxanthin.
