DE60207678T2

DE60207678T2 - Isolierung von lectinen

Info

Publication number: DE60207678T2
Application number: DE60207678T
Authority: DE
Inventors: Finn Matthiesen
Original assignee: NatImmune AS
Current assignee: NatImmune AS
Priority date: 2001-10-19
Filing date: 2002-10-18
Publication date: 2006-08-24
Anticipated expiration: 2022-10-19
Also published as: CN100447150C; ES2254759T3; EP1335932A1; DE60207678D1; EP1335932B1; WO2003033522A1; US7049414B2; DK1335932T3; JP4241377B2; US20040019186A1; ATE311400T1; CN1599747A; JP2005511537A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Isolieren einer Lektin-Zusammensetzung, die insbesondere das Mannose bindende Lektin (MBL) umfasst, welches geeignet ist zur Verwendung von rekombinant hergestellten Lektinen als Ausgangsmaterial, sowie Verfahren zum Anreichern einer Lektin-Zubereitung mit Lektinen mit hohem Molekulargewicht.
Hintergrund der Erfindung
Lektine sind Proteine die durch die Anwesenheit einer Kohlenhydrat-Bindungsdomäne gekennzeichnet sind. Collektine stellen eine Gruppe von Lektinen dar, die eine oligomere Struktur von Untereinheiten umfassen, wobei jede Untereinheit eine Kohlenhydrat-bindende Domäne aufweist. In vivo Lektine sind in mehreren Untereinheiten vertreten, was zu Lektin-Populationen mit unterschiedlichen Molekularmassen führt.
MBL ist ein Protein der Collektin-Familie und durch eine oligomere Struktur von Untereinheiten gekennzeichnet, wobei jede aus einer Calcium-abhängigen Kohlenhydrat-Erkennungsdomäne (CRD) vom Typ C besteht, die an ein Kollagen-Stäbchen angeheftet ist. MBL aktiviert das Komplementsystem mittels assoziierter Serinproteasen (MASP – mit Mannose bindendem Lektin assoziierte Serinproteasen), d. h. durch einen Mechanismus vergleichbar mit C1 q. Mannose-bindendes Protein (MBL) ist ein Protein, das zur Substitutions- oder Ersatz-Therapie bei Patienten mit vererbter oder erworbener MBL-Defizienz eingesetzt wird, die mit funktionellen und/oder klinischen Symptomen zusammenhängt.
Von menschlichem Blutplasma abgeleitetes MBL ist aus einem Oligomer von Untereinheiten zusammengesetzt, wobei jede aus drei identischen Polypeptidketten besteht. Die Anzahl an Untereinheiten in einem MBL-Molekül ist verschieden [Lipscombe RJ, et. Al.: Distinct physichemical characteristics of human mannose binding protein expressed by individuals of differing genotype; Immunology 85 (1995), 660-667], wobei jedoch vorgeschlagen wurde, dass das biologisch aktive Polypeptid ein Oligomer ist, das aus mehr als drei Untereinheiten besteht. Plasma umfasst Oligomere von mehr als drei Untereinheiten sowie denaturierte und strukturell beschädigte Proteinformen, was zu Banden auf beispielsweise SDS-Gelen zwischen den vorherrschenden MBL-Banden führt die den höheren Oligomeren entsprechen.
Rekombinant hergestelltes MBL zeigt eine Oligomer-Variation ähnlich zu von Plasma abgeleitetem MBL [Vorup-Jensen T et al: Recombinant expression of human mannanbinding lectin, Int. Immunopharm. 1 (2001), 677-687]. Rekombinant hergestelltes MBL weist jedoch für gewöhnlich einen höheren Gehalt von Formen mit geringerer Masse auf, als von Plasma abgeleitetes MBL. MBL-Formen mit geringerer Masse umfassen beispielsweise einzelne Polypeptidketten, einzelne Untereinheiten und dimere Untereinheiten.
Lektine werden für gewöhnlich durch Auftragen einer Lektine enthaltenden Zusammensetzung auf eine Säule isoliert, die mit einem Zucker modifiziert wurde an den die Lektine binden. Die Effizienz der Säulen variiert jedoch. In der PCT-Anmeldung WO 00/70043 ist ein Verfahren zur Trennung höherer Oligomere von Formen mit niedriger Masse beschrieben, worin rekombinant hergestelltes MBL einer Fraktionierung auf einer Spezialsäule unterzogen wird, und worin die Säule als solche keine Affinität für das MBL aufweist.
Haurum et al., Biochem. J. 293 (1993), 873-878 beschreibt die Kohlenhydrat-bindenden Eigenschaften der Collektine SP-A, des Mannan-bindenden Proteins (MBP) und Conglutinin. SP-A und MBP binden im Gegensatz zu Conglutin kein Glucosamin, Mannosamin oder Galactosamin (Tabelle 1).
Kenneth et al., J. Biol. Chem. 271 (1996), 663-674 beschreibt eine Analyse der Struktur der Kohlenhydratbindung durch Mannose-bindendes Protein (MBP). Die Druckschrift offenbart, dass MBP eine Vielzahl von Monosacchariden, einschließlich me-Man, N-Acetylglucosamin, Me-Fucose und Galactose bindet. Die Veröffentlichung diskutiert keine Assoziierung mit Aminozuckern.
Beschreibung der Erfindung
Ein schnelles und einfaches Verfahren zur Isolierung von Lektinen, wie beispielsweise Mannose-bindendem Lektin (MBL) oder Derivaten und Varianten davon (hier allgemein als Lektine bezeichnet) aus einer Lösung ist von größter Wichtigkeit.
Darüber hinaus ist es ebenso von größter Wichtigkeit, die Massenverteilung von Lektinen zu steuern, da unterschiedliche Oligomere der Lektin-Polypeptide verschieden biologische Funktionen und Aktivität aufweisen.
Die vorliegende Erfindung beschreibt ein Verfahren zur Isolierung von Lektinen, wie beispielsweise MBL, durch Auftragen der Zubereitung auf einen festen Träger, der daran gebunden eine bestimmte Konzentration eines Zuckerderivats aufweist. Das Verfahren kann während der Herstellung, Aufreinigung und/oder Formulierung des Polypeptids als einheitlicher Vorgang durchgeführt werden. Verglichen mit anderen Verfahren ist es von Vorteil, dass das erfindungsgemäße Verfahren zum Ändern der Zusammensetzung von Oligomeren des Polypeptids eingesetzt werden kann, so dass Oligomere des Polypeptids mit hoher Masse von Oligomeren des Polypeptids mit niedriger Masse getrennt werden, oder dass Oligomere mit mittlerer Masse von Oligomeren mit hoher Masse und Oligomeren mit niedriger Masse getrennt werden.
Daher besteht eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung in der Bereitstellung eines Verfahrens zum Isolieren von mindestens einem Lektin aus einer Zubereitung, die mehrere Lektin-Moleküle enthält, welches umfasst
Herstellen eines festen Trägers, der daran gebunden eine bestimmte Konzentration eines Zuckerderivats aufweist,
Auftragen der Zubereitung auf den festen Träger,
Binden lassen der Lektine an das an einen festen Träger gebundene Zuckerderivativ,
Waschen des festen Trägers mit einer Waschflüssigkeit um nicht gebundenen Verunreinigungen zu entfernen, und
wahlweise Gewinnen des/der Lektin(s/e) von dem festen Träger.
Der Ausdruck "bestimmte Konzentration" bedeutet, dass ein bestimmtes Volumen eines Zuckerderivats mit einer bestimmten Konzentration auf ein bestimmtes Volumen oder einen Bereich des festen Trägers aufgetragen wird, wobei das Zuckerderivat an den festen Träger binden gelassen wird. In einer Ausführungsform bedeutet der Ausdruck, dass eine bestimmte Konzentration eines Zuckerderivats an ein bestimmtes Volumen oder Bereich des festen Trägers gebunden/gekuppelt wird.
Der Ausdruck "Verunreinigung" bezeichnet Verunreinigungen in der Lektin-Zubereitung sowie Lektine die auf Grund ihres geringeren Molekulargewichts nicht an das Zuckerderivat gebunden haben. Insbesondere wenn Lektine mit mittlerem Molekulargewicht erwünscht sind, können die Verunreinigungen die erwünschten Lektine umfassen, wenn, wie nachstehend erläutert, Verfahren mit zwei oder mehr Schritten verwendet werden. Der Ausdruck "Verunreinigung" ist daher synonym zu nicht-gebundenem Material einschließlich nicht-gebundener Lektine.
Der Ausdruck "eine Vielzahl von Lektin-Molekülen" bezeichnet vorzugsweise eine Vielzahl von Oligomeren von Lektin-Molekülen, wobei die Lektin-Moleküle identische oder im Wesentlichen identische strukturelle Untereinheiten aufweisen, wie nachstehen beschrieben wird.
Eine zweite Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, derartige feste Träger bereit zu stellen, die kovalent daran gebunden eine bestimmte Konzentration eines Zuckerderivats aufweisen, worin das Zuckerderivat vorzugsweise ein Aminozucker ist.
In einer anderen Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Ändern der Oligomer-Verteilung von Lektinen in Lösungen. In einer Ausführungsform betrifft die Erfindung daher ein Verfahren zum Erhöhen des Verhältnisses R einer Zusammensetzung, die eine Vielzahl von Lektin-Molekülen umfasst, worin R das Verhältnis der Konzentration von Lektin-Molekülen mit einem hohen Molekulargewicht über einem bestimmten Molekulargewicht zu der Konzentration von Lektin-Molekülen mit einem geringem Molekulargewicht unter oder gleich dem bestimmten Molekulargewicht ist, wobei das Verfahren umfasst:
Erhalten einer Lektin-Zubereitung, umfassend Lektin mit geringem Molekulargewicht und Lektin mit hohem Molekulargewicht, wobei die Zubereitung das Verhältnis R = R₀ aufweist,
Verwenden der Zubereitung in einem Isolierungsverfahren, wobei das Verfahren zum Isolieren von mindestens einem Lektin aus einer Zubereitung vorstehend beschrieben wurde, Erhalten einer Zusammensetzung, die die gewonnenen Lektin-Moleküle umfasst.
Dadurch wird eine Zusammensetzung erhalten, die im Vergleich zu dem Anfangsmaterial einen erhöhten Gehalt an Lektinen-Oligomeren mit hoher Masse aufweist.
So führt das Ansteigen des Verhältnisses insbesondere zu Zusammensetzungen die Lektine umfassen, die ein Molekulargewicht über dem Molekulargewicht für dimere Lektine aufweisen. Daher betrifft die Erfindung in einer anderen Ausführungsform ein Verfahren zur Herstellung einer Zusammensetzungen, die eine Vielzahl von Lektin-Molekülen umfasst, wobei im Wesentlichen alle Lektin-Moleküle ein Molekulargewicht über dem bestimmten Molekulargewicht von dimeren Lektinen aufweisen, wobei das Verfahren umfasst:
Erhalten einer Lektin-Zubereitung die Lektin-Moleküle mit einem hohen Molekulargewicht über dem bestimmten Molekulargewicht umfasst, und Lektin-Moleküle mit einem geringen Molekulargewicht unter oder gleich dem bestimmten Molekulargewicht, wobei die Zubereitung das Verhältnis R = R₀ aufweist, worin R das Verhältnis der Konzentration der Lektin-Moleküle mit einem hohen Molekulargewicht über dem bestimmten Molekulargewicht zu der Konzentration von Lektin-Molekülen mit einem geringen Molekulargewicht unter oder gleich dem bestimmten Molekulargewicht ist,
Verwenden der Zubereitung in einem Isolierungsverfahren, vorzugsweise dem Verfahren zum Isolieren von mindestens einem Lektin aus einer hier vorstehend beschriebenen Zubereitung,
Erhalten einer Zusammensetzungen, die die gewonnenen Lektin-Moleküle enthält.
Da das Ausgangsmaterial für die Verfahren Lektine mit hoher Masse sowie Lektine mit geringer Masse umfasst, betrifft die Erfindung weiter ein Verfahren zum Auftrennen einer Zusammensetzung, die eine Vielzahl von Lektin-Molekülen umfasst, worin im Wesentlichen alle Lektin-Moleküle ein hohes Molekulargewicht über einem bestimmten Molekulargewicht aufweisen, von einer Lektin-Zubereitung, die Lektin-Moleküle umfasst, die ein hohes Molekulargewicht über dem bestimmten Molekulargewicht aufweisen und Lektin-Moleküle mit einem niedrigen Molekulargewicht unter oder gleich dem Molekulargewicht von dimeren Lektinen, wobei die Zubereitung das Verhältnis R = R₀ aufweist, worin R das Verhältnis der Konzentration von Lektin-Molekülen mit einem hohen Molekulargewicht über dem bestimmten Molekulargewicht zu der Konzentration von Lektin-Molekülen mit einem niedrigen Molekulargewicht unter oder gleich dem Molekulargewicht ist, wobei das Verfahren umfasst:
Erhalten der Lektin-Zubereitung,
Verwenden der Zubereitung in einem Isolierungsverfahren, vorzugsweise in dem Verfahren zum Isolieren von mindestens einem Lektin aus einer vorstehend beschriebenen Zubereitung,
Erhalten einer Zusammensetzung, die die gewonnenen Lektin-Moleküle enthält.
Für die meisten Zwecke sind die Lektine mit hoher Masse die gewünschten. Für manche Anwendungen sind jedoch Lektine mit niedriger Masse erwünscht. Demgemäß betrifft die Erfindung weiterhin ein Verfahren zur Herstellung einer Zusammensetzung, die eine Vielzahl von Lektin-Molekülen umfasst worin im Wesentlichen alle Lektin-Moleküle ein niedriges/geringes Molekulargewicht unter oder gleich einem bestimmten Molekulargewicht aufweisen, wobei das Verfahren umfasst
Erhalten einer Lektin-Zubereitung, die Lektin-Moleküle mit einem hohen Molekulargewicht über dem bestimmten Molekulargewicht umfasst und Lektin-Moleküle mit einem niedrigem Molekulargewicht unter oder gleich dem bestimmten Molekulargewicht, wobei die Zubereitung das Verhältnis R = R₀ aufweist, worin R das Verhältnis der Konzentration von Lektin-Molekülen mit einem hohen Molekulargewicht über dem bestimmten Molekulargewicht zu dem Verhältnis von Lektin-Molekülen mit einem niedrigen Molekulargewicht unter oder gleich dem Molekulargewicht ist,
Verwenden der Zubereitung in einem Isolierungsverfahren, vorzugsweise in dem Verfahren zum Isolieren von mindestens einem Lektin aus einer vorstehend beschriebenen Zubereitung,
Erhalten einer Zusammensetzungen, die nicht-gebundene Lektin-Moleküle der Waschflüssigkeit umfasst.
Für all die vorstehend aufgeführten Verfahren weist die Zusammensetzungen der gewonnenen Lektin-Moleküle vorzugsweise das Verhältnis R = R₀ auf, worin R₁ mindestens 1 ist, wie mindestens 1,05, wie mindestens 1,10, wie mindestens 1,15, wie mindestens 1,25, wie mindestens 1,50, wie mindestens 1,75, wie mindestens 2,0, wie mindestens 2,5, wie mindestens 3,0, wie mindestens 4,0, wie mindestens 5,0, wie mindestens 6,0, wie mindestens 7,0, wie mindestens 8,0, wie mindestens 9,0, wie mindestens 10,0, wie mindestens 15, wie mindestens 20, wie mindestens 30, wie mindestens 40, wie mindestens 50, wie mindestens 60, wie mindestens 70, wie mindestens 80, wie mindestens 90, wie mindestens 100, wie mindestens 100, wie mindestens 1000, wie mindestens 10000.
Für all die vorstehend offenbarten Verfahren ist das bestimmte Molekulargewicht vorzugsweise das Molekulargewicht von dinieren Lektinen mehr bevorzugt das von trimeren Lektinen.
Für die meisten Zwecke sind Lektine mit hoher Masse die erwünschten, wobei jedoch bei einigen Ausführungsformen Lektine mit mittlerer Masse erwünscht sein können. Demgemäß betrifft die vorliegende Erfindung in einer weiteren Ausführungsform ein Verfahren zum Erhöhen des Verhältnisses R einer Zusammensetzungen, die eine Vielzahl von Lektin-Molekülen umfasst, wobei R das Verhältnis der Konzentration von Lektinen mit mittlerer Molekular-Masse zu der Konzentration von Lektin-Molekülen mit einer hohen Molekular-Masse und einer niedrigen Molekular-Masse ist, worin eine mittlere Molekular-Masse unter einem bestimmten ersten Molekulargewicht und über einem bestimmten zweiten Molekulargewicht liegt, wobei die hohe Molekularmasse eine Molekularmasse über oder gleich dem ersten bestimmten Molekulargewicht ist und eine geringe molekulare Masse eine molekulare Masse unter oder gleich dem zweiten bestimmten Molekulargewicht ist.
Das Verfahren umfasst die Schritte, Erhalten einer Lektin-Zusammensetzung, die ein Lektin mit niedriger Molekular-Masse umfasst, ein Lektin mit mittlerer Molekular-Masse, und Lektin mit hoher Molekular-Masse, wobei die Zubereitung das Verhältnis R = R₀ aufweist,
Verwenden der Zusammensetzungen in einem Isolierverfahren, vorzugsweise dem Verfahren zum Isolieren von mindestens einem Lektin aus einer vorstehend beschriebenen Zubereitung, und
Erhalten einer Zusammensetzungen, die die gebundenen Lektin-Moleküle umfasst, und
wahlweise Wiederholen des Schrittes des Verwendens der Zusammensetzungen in einem Isolierungsverfahren, vorzugsweise dem Verfahren zum Isolieren von mindestens einem Mo lekül aus einer vorstehend beschriebenen Zubereitung.
In einer Ausführungsform kann das erste bestimmte Molekulargewicht das Molekulargewicht von Heptamer-Lektinen sein, und das zweite bestimmte Molekulargewicht ist das Molekulargewicht von dimeren Lektinen.
In einer anderen Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Isolieren von mindestens einem Lektin aus einer Zubereitung die eine Vielzahl von Lektin-Molekülen enthält, umfassend,
Herstellen eines festen Trägers, der mit mindestens einem Aminozucker der derivatisiert ist,
Auftragen der Zubereitung auf den festen Träger,
Binden lassen der Lektine an den Aminozucker, der mit dem festen Träger verbunden ist,
Waschen des festen Trägers mit einer Waschflüssigkeit um nicht-gebundene Verunreinigungen zu entfernen, und
wahlweise Gewinnen des/der Lektin(s/e) von dem festen Träger.
Der Ausdruck "derivatisiert" bedeutet, dass der Aminozucker mit dem festen Träger, wie vorstehend beschrieben, verbunden ist.
Das erfindungsgemäße Lektin kann irgendein Lektin sein, bei dem mehrere oligomere Formen hergestellt werden, beispielsweise Collektine, wie beispielsweise Mannose-bindende Lektine. Die Erfindung betrifft insbesandere ein Verfahren zum Herstellen von MBL-Zusammensetzungen. Der Ausdruck MBL bedeutet Mannose-bindendes Lektin (oder Mannosebindendes Protein, wie von manchen Autoren bezeichnet). MBL ist vorzugsweise menschliches MBL mit einer Proteinsequenz, wie beispielsweise in der PCT Anmeldung WO 00/70043 offenbart, oder Derivate oder Varianten davon, die funktionelle Equivalente von MBL sind. Nachstehend wird die Erfindung im Zusammenhang mit dem Lektin MBL beschrieben.
Die erfindungsgemäßen Verfahren ermöglichen die Herstellung der betreffenden Lektine im großen Maßstab. Eine andere Ausführungsform der Erfindung betrifft daher irgendein industrielles oder im grossen Maßstab durchzuführendes Verfahren zur Herstellung von MBL, das die Verwendung der Verfahren während der Herstellung des MBL's umfasst.
Zeichnungen
1 zeigt das Elutionsprofil von rekombinant hergestelltem MBL, das aufgetragen auf und eluiert wurde von einer Säule mit immobilisiertem D-Mannosamin, wie in Beispiel 1 beschrieben. Die Figur zeigt ein SDS-PAGE Western unter Verwendung monoklonaler Anti körper, die gegen von Plasma abgeleitetem abgeleiteten MBL gerichtet sind. MW = Marker (kDA), A = Auftragen (rekombinant abgeleitetes MBL vor dem Einsatz der Erfindung), R = Durchflussfraktion, erhalten während der Verwendung, E = Elutionsfraktion nach Waschen mit EDTA (rekombinant abgeleitetes MBL nach Einsatz der Erfindung).
2 zeigt das Flutionsprofil von rekombinant hergestelltem MBL, das auf eine Säule mit immobilisiertem D-Mannosamin, wie in Beispiel 2 beschrieben, aufgetragen und von dieser eluiert wurde. Die Figur zeigt ein SDS-PAGE Western unter Verwendung monoklonaler Antikörper, die gegen von Plasma abgeleitetem MBL gerichtet sind. "Kontrolle (Dummy)": eine Säule ohne daran gebundem Aminozucker, "Low-Sub" = Säule mit einer geringen Menge an daran gebundem Aminozucker, "High-Sub" = Säule mit einer großen Menge an daran gebundenem Aminozucker, "High-Sub R" = Säule mit einer großen Menge an daran gebundenem Aminozucker nach Regenerierung mit NaOH. MW = Marker (kDA), A = Auftragen, R = Durchflussfraktion erhalten während der Verwendung, E = Elutionsfraktion nach Waschen mit EDTA, PL = von Plasma abgeleitetes MBL (Kontrolle).
3 zeigt das Elutionsprofil von rekombinant hergestelltem MBL das auf eine mit daran in zwei Konzentrationen immobilisiertem D-Glucosamin, wie in Beispiel 5 beschrieben, Säule aufgetragen und von dieser eluiert wurde. Die Figur zeigt ein SDS-PAGE Western unter Verwendung monoklonarer Antikörper die gegen von Plasma abgeleitetes MBL gerichtet sind. A = Auftragen (rekombinant abgeleitetes MBL vor dem Einsatz der Erfindung), R = Durchflussfraktion erhalten während des Einsatz, E = Elutionsfraktion nach Waschen mit EDTA (rekambinant abgeleitetes MBL nach Einsatz der Erfindung), PL = von Plasma abgeleitetes MBL (Kontrolle).
Zuckerderivate
In einer bevorzugten Ausführungsform bedeutet der Ausdruck Zuckerderivat eine von einem Zucker abgeleitete Verbindung, worin die abgeleitete Verbindung an den festen Träger in einer bestimmten, ausgerichteten Art binden kann. Die hier genannten Erfinder identifizierten eine der Gründe, warum Isolierungsverfahren des Standes der Technik nicht so effizient waren.
Dadurch wurde gefunden, dass Lektine an spezifische Bindestellen auf den Sacchariden binden, während bei der Verwendung von auf zufällige Art und Weise an Säulen und andere feste Träger gebundenen Zuckern gemäß des Standes der Technik ein bestimmter Prozentsatz der gebundenen Saccharide Lektine nicht binden können, da die Bindestellen nicht derart positioniert sind, dass sie das Lektin binden können.
Daher umfasst das erfindungsgemäße Zuckerderivat vorzugsweise eine reaktive Gruppe die ein ausgerichtetes Binden an einen festen Träger ermöglicht. Das Zuckerderivat kann jedes Derivat sein, das das Lektin binden kann, wenn das Zuckerderivat an den festen Träger gebunden ist. Zuckerderivate, die das Lektin nicht binden können, wenn das Derivat in seiner freien Form vorliegt, d.h. nicht-gebunden ist, können ebenso erfindungsgemäß verwendet werden, wenn sie das Lektin in gebundener Form binden können.
Die bestimmte Ausrichtung des Zuckers kann durch Einbringen einer reaktiven Gruppe in den Zucker erhalten werden, vorzugsweise an einer spezifischen Position, wodurch es ebenso möglicht ist, das Zuckerderivat an einen festen Träger in einer spezifisch ausgerichteten Art zu binden, so dass das Binden an dem festen Träger über die reaktive Gruppe stattfindet. Der Ausdruck "ausgerichtetes binden" bedeutet daher, dass der Zucker an einen festen Träger über eine spezifische, bestimmte Gruppe in dem Zuckermolekül gebunden wird, so dass der freie Teil des Zuckermoleküls auf eine bestimmte Position ausgerichtet ist.
In einem Monosaccharide liegen die Bindestelle und die reaktive Gruppe in der gleichen Monosaccharidstruktur vor, während in Disacchariden und höheren Oligosacchariden und Polysacchariden die Bindestelle jedoch in einer anderen Monosaccharidstruktur vorliegen kann als die reaktive Gruppe. Im vorliegenden Zusammenhang bedeutet der Ausdruck "Monosaccharidstruktur", dass die Struktur in dem Saccharid einen Ring bilden kann. Ein Disaccharid umfasst beispielsweise zwei Monosaccharidstrukturen. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die reaktive Gruppe fern von der Bindestelle positioniert wodurch die besten Möglichkeiten erhalten werden, eine Bindestelle zu erhalten, die nicht sterisch behindert ist.
Zucker
Der Ausdruck Zuckerderivat bezeichnet irgendeine Verbindung, die von einem Zucker abgeleitet ist. Im vorliegenden Zusammenhang bezeichnet Zucker irgendein Kohlenhydrat, einschließlich Monosaccharide, Disaccharide, Oligosaccharide und Polysaccharide, ob ein fünfgliedriger Ring (Pentose) oder ein sechsgliedriger Ring (Hexose) oder Kombinationen davon, oder ob eine D-Form oder L-Form, sowie Substanzen, die von Monosacchariden durch Reduktion der Carbonylgruppe (Alditole), durch Oxidation von endständigen Gruppen zu Carboxysäuren oder durch Ersetzen von Hydroxygruppen durch eine andere Gruppe abgeleitet sind. Derivate dieser Verbindungen sind ebenfalls umfasst.
Monosaccharide schließen Polyhydroxyaldehyde H-[CHOR]_n-CHO und Polyhydroxyketone H-[CHOH]_n-CO-[CHOH]_m-H ein, d.h. Aldosen, Dialdosen, Aldoketosen, Ketosen, Diketosen, Deoxyzucker, Aminozucker und deren Derivate.
Aldosen schließen Monosaccharide mit einer aldehydischen Carbonylgruppe ein, d.h. Polyhydroxyaldehyde H-[CHOH]_n-CHO. Aldosen schließen ebenso Monosaccharide mit einer möglichen aldehydischen Carbonylgruppe – einer Hemiacetalgruppe – ein die aus dem Ringschluss der Aldose entsteht.
Ketosen schließen Monosaccharide mit einer Ketogruppe ein, d.h. Polyhydroxyketone H-[CHOH]_n-CO-[CHOH]_m-H, d.h. Ketone schließen weiter Monosaccharide mit einer möglichen Keto-Carbonylgruppe ein – einer Hemiketalgruppe-, die aus dem Ringschluss der Ketose entsteht.
Pyranosen sind cyklische Hemiacetale oder cyklische Hemiketale mit einem Tetrahydrofuran (fünfgliedriger Ring).
Furanosen sind cyklische Hemiacetale oder cyklische Hemiketale mit einem Tetrahydrofuran (fünfgliedriger Ring).
Dialdosen, Diketosen, Ketoaldosen (Aldoketosen, Aldosulosen), Alditole sind Monosaccharide mit mehr als einem Aldehyd und/oder Keton.
Aldonsäuren, Ketonsäuren sind Aldosen, in denen die Aldehydgruppe durch eine Carboxygruppe ausgetauscht wurde.
Beispiele für Zuckerderivate sind Uronsäuren, Aldosen in denen die erste CH₂OH-Gruppe mit einer Carboxygruppe ausgetauscht wurde; Aldaricsäuren, Aldonsäuren, in denen die erste CH₂OH-Gruppe mit einer Carboxygruppe ausgetauscht wurde; Deoxyzucker, Monosaccharide, in denen eine Hydroxygruppe mit einem Wasserstoff ausgetauscht wurde, Aminozucker, Monosaccharide, in denen eine Hydroxygruppe mit einer Aminogruppe ausgetauscht wurde.
Darüber hinaus sind Glycosylamine umfasst, die Aminozucker sind, in denen die Hydroxygruppe an der Hemiacetalgruppe (nach Ringschluss gebildet) mit einer Aminogruppe ausgetauscht wurde.
In dem vorliegenden Zusammenhang wird der Begriff Acetal in seiner gewöhnlichen Bedeutung verwendet, d.h. Monosaccharide, die aus einem Ringschluss der Aldose oder Ketose entstehen. Glycoside sind weiter Acetale, die aus einer Eliminierung von Wasser zwischen der Hemiacetal- und der Hemiketal-Hydroxygruppe eines Monosaccharids, Oligosaccharids und Polysaccharids, und der Hydroxygruppe eines anderen Monosaccharids, Oligosaccharids und Polysaccharids entstehen. Eine glycosidische Bindung ist die Bindung zwischen dem Monosacchariden in einem Glycosid.
In dem vorliegenden Zusammenhang umfasst der Begriff Zucker oder eines der hier aufgeführten Saccharide und Derivative, alle die verschiedenen sterischen Formen der Zucker, einschließlich der D-Form und der L-Form, α-Form und β-Form. Daher bezeichnet der Ausdruck Mannosamin beispielsweise Mannosamin in irgendeiner der sterischen Formen einschließlich D-Mannosamin, L-Mannosamin und (D, L)-Mannosamin. Nur wenn eine spezifische sterische Form verwendet wird, wird dies angegeben, beispielsweise das D-Mannosamin.
Spezifische Derivate
Die Erfindung betrifft insbesondere Zuckerderivate mit einer reaktiven Gruppe, die ausgewählt ist unter Aminogruppen, worin die Aminogruppe beispielsweise ausgewählt sein kann aus der Gruppe bestehend aus primären Aminogruppen, sekundären Aminagruppen und tertiären Aminogruppen.
Die Erfindung betrifft insbesondere die Verwendung von Aminozuckern als das Zuckerderivat. Die Aminozucker können Monosaccharide, Aminodisaccharide, Aminooligosaccharide und Aminopolysaccharide sein, worin mindestens eine Aminogruppe in einer Art und Weise eingefügt ist, so dass diese als reaktive Gruppe wirken kann, wenn der Aminozucker an einen festen Träger gebunden wird.
Beispiele für geeignete Monosaccharide sind:
Aminoaldosen, wie beispielsweise Mannosamin, Glucosamin, Allosamin, Altrosamin, Ribosamin, Arabinosamin, Gulosamin, Idosamin, Galactosamin, Talosamin, Xylosamin, Lyxosamine. Insbesondere D-Mannosamin, D-Glucosamin, D-Allosamin, D-Altrosamin, D-Ribosamin, D-Arabinosamin, L-Gulosamin, L-Idosamin, L-Galactosamin, L-Talosamine, L-Xylosamin, L-Lyxosamin.
Aminoketosen, wie beispielsweise Sorbosamin, Tagatosamin, Psicosamin, Fructosamin. Insbesondere D-Sorbosamin, D-Tagatosamin, L-Psicosamin, L-Fructosamin. Aminodeoxyaldosen, wie beispielsweise Derivative von Fucose, beispielsweise Fucosamin und Fucosylamin, vorzugsweise L-Fucosamin.
Hinsichtlich einer Isolierung von MBL sind insbesondere die nachstehenden Beispiele von Aminozucker geeignet: Mannosamin, Glucosamin, Galactosamin, Fructosamin. Insbesondere D-Mannosamin, D-Glucosamin, L-Galactosamin, L-Fucosamin.
Mehr bevorzugt sind die Aminozucker ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Glucosamin und Mannosamin, noch mehr bevorzugt können Aminozucker ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus L-Fucosamin, D-Glucosamin und D-Mannosamin verwendet werden, insbesondere D-Glucosamin und D-Mannosamin. Die Formel von D-Mannosamin wird nachstehend als freies D-Mannosamin und als an ein Harz gebundenes D-Mannosamin gezeigt.
Darüber hinaus können Disaccharide, Oligosaccharide und Polysaccharide mit einer Aminogruppe, die als eine reaktive Gruppe in einem Teil des Moleküls vorhanden ist, und mit einer Lektin-Bindestelle, insbesondere einer MBL-Bindestelle in einem anderen Teil des Moleküls verwendet werden.
So kann beispielsweise der Aminozucker jedes Disaccharid-Derivat sein, das eine Aminogruppe umfasst, worin mindestens eine der Monosaccharid-Untereinheiten des Disaccharides ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Mannose und Glucose. Beispiele für bevorzugte Disaccharide umfassen Saccharose-Derivate, beispielsweise Saccharosamin, und Maltose-Derivate, wie beispielsweise Maltosamin, das eine Aminogruppe umfasst, sowie Agarosamin, Cellulosamin und Amylosamin. Ein bevorzugtes Disaccharid-Derivat ist ein Saccharosamin.
Darüber hinaus kann der Zucker beispielsweise ein Multimer von Glucosamin sein, wie beispielsweise ein Glucosamin-Dimer, Glucosamin-Oligomer oder ein Glucosamin-Polymer.
Fester Träger
Der feste Träger kann jeder Träger sein, der zum Fangen und/oder Isolieren von Lektinen verwendet wird. Der feste Träger kann daher jede Säule, Filter oder Teilchen sein, die zum Isolieren und Reinigen verwendet werden, wie beispielsweise Chromotographieharze und magnetische Teilchen.
Der feste Träger kann weiter eine Oberfläche sein, die das Lektin binden kann, beispielsweise für weitere Analysen, wie Kunststoffoberflächen und Glasoberflächen. Kunststoffoberflächen können beispielsweise ausgewählt sein aus der Gruppe bestehend aus Mikrotiterplatten, ELISA-Vertiefungen und aktivierten Mikrotiterplatten. Aktivierte Mikrotiterplatten können beispielsweise mit Cyanurchlorid aktiviertes Covalink^TM NH₂ primäres Amin von Life Technologies sein.
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann irgendein fester Träger, der Amine, vorzugsweise primäre Amine, kovalent binden kann, in der Erfindung verwendet werden.
Nützliche Säulen können jede Säulen sein, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus N-N-Hydroxysuccinimid aktivierten Harzen (beispielsweise NHS-Sepharose 4 FF von APBiotech, Affi-Gel 10 von BioRad, Affi-Gel 15 von BioRad oder Affi-Prep von BioRad), Cyanogenbromid aktivierten Harzen (beispielsweise CNBr-aktivierte Sepharose 4 FF von APBiotech), ECH Sepharose 4 von APBiotech, aktivierte CH-Sepharose 4B von AP-Biotech und Epoxyd aktivierten Harzen (sowie Epoxyd-aktivierter Sepharose 6B) sowie deren entsprechenden vernetzten Harzen.
Eine bestimmte Konzentration eines Zuckerderivats kann gemäß der vorliegenden Erfindung an den festen Träger gebunden werden. Die bestimmte Konzentration des Zuckerderivats sollte gemäß dem für die bestimmte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung bestimmten gewünschten Molekulargewicht gewählt werden.
Die Konzentration des Zuckerderivats wird durch zwei Faktoren bestimmt:

1) Konzentration von Positionen (Ligandenarme) auf dem festen Träger, die ein Zuckerderivat binden können,
2) Konzentration eines Zuckerderivats pro Ligandenarm.

Die Konzentration von Ligandenarmen pro Volumen fester Trägers wird hauptsächlich durch das Herstellungsverfahren des festen Trägers bestimmt und kann durch Binden eines markierten Liganden an einen festen Träger gesteuert werden.
Die Konzentration des Zuckerderivats pro Ligandenarm wird durch Regulieren des Volumens und der Konzentration des Zuckerderivats reguliert, das an die Ligandenarme binden kann.
Im Allgemeinen wird eine hohe bestimmte Konzentration an Zuckerderivat verwendet, wenn ein vergleichsweise geringes, bestimmtes Molekulargewicht gewünscht wird, und eine geringe bestimmte Konzentration an Zuckerderivat, wenn ein vergleichsweise hohes bestimmtes Molekulargewicht gewünscht wird.
Die bestimmte Konzentration an Zuckerderivat kann beispielsweise durch die Menge an Zuckerderivat bestimmt werden, die an eine spezifische Menge des festen Trägers gebunden ist. Wenn beispielsweise der feste Träger ein Chromotographie-Säulenharz ist, beträgt die bestimmt Konzentration an Monosaccharid-Derivat vorzugsweise von 0,1 mg Zuckerderivat pro ml Harz bis 1000 mg Zuckerderivat pro ml Harz, mehr bevorzugt zwischen 0,5 mg Zuckerderivat pro ml Harz und 500 mg Zuckerderivat pro ml Harz, noch mehr bevorzugt von 2 mg Zuckerderivat pro ml Harz bis 100 mg Zuckerderivat pro ml Harz.
In dem vorliegenden Zusammenhang ist ein Standard für den festen Träger ein vernetztes Sepharose-Harz, das mit N-Hydroxysuccinimid (NHS) Resten modifiziert wurde, wie in den Beispielen beschrieben. So wird beispielsweise von 15-25 μmol Ligandenarme pro ml entwässertem Harz verwendet. Ein derartiger fester Träger wird soll 5 μmol Dipeptid pro ml entwässertes Harz binden können oder 1-2 μmol alfa-Chymotrypsinogen pro ml entwässertes Harz.
Von diesem standardisierten festen Träger ausgehend werden Intervalle für die bestimmten Konzentrationen an Zuckerderivat gegeben, das an das Harz gekoppelt wird, um die Lektine zu erhalten, die aus der Vielzahl von Lektinen gewünscht sind.
Eine Isolierung von hochmolekularen Lektinen, wie hier definiert über dem Molekulargewicht von dinieren Lektinen liegend, wird erreicht durch Einsatz der Standardsäule mit einem daran gekoppelten Zuckerderivat in einer bestimmten Konzentration von 10 μmol pro ml entwässertem Harz bis 100 μmol pro ml entwässertem Harz, wie beispielsweise von 20 μmol pro ml entwässertem Harz bis 80 μmol pro ml entwässertem Harz, wie beispielsweise von 30 μmol pro ml entwässertem Harz bis 70 μmol pro ml entwässertem Harz, wie beispielsweise von 40 μmol pro ml entwässertem Harz bis 60 μmol pro ml entwässertem Harz. Für Monosaccharide entsprechen diesen Konzentrationen von 2 mg pro ml entwässertem Harz zu 20 mg pro ml entwässertem Harz, wie beispielsweise von 4 mg pro ml entwässertem Harz bis 16 mg pro ml entwässertem Harz, wie beispielsweise von 6 mg pro ml entwässertem Harz bis 14 mg pro ml entwässertem Harz, wie beispielsweise von 8 mg pro ml entwässertem Harz bis 12 mg pro ml entwässertem Harz.
Die Isolierung von hochmolekularen Lektinen, wie hier definiert über dem Molekulargewicht für trimere Lektine liegend, wird erreicht durch Einsatz der Standardsäule, die daran gebunden ein Zuckerderivat in einer bestimmten Konzentration aufweist, von 10 μmol pro ml entwässertem Harz bis 80 μmol pro ml entwässertem Harz, wie beispielsweise von 20 μmol pro ml entwässertem Harz bis 70 μmol pro ml entwässertem Harz, wie beispielsweise von 30 μmol pro ml entwässertem Harz bis 70 μmol pro ml entwässertem Harz, wie von 40 μmol pro ml entwässertem Harz bis 60 μmol pro ml entwässertem Harz.
Eine Isolierung von hochmolekularen Lektinen, wie hie definiert über dem Molekulargewicht für tetramere Lektine liegend, wird durch erreicht durch Einsatz der Standardsäule, die daran gebunden ein Zuckerderivat in einer bestimmten Konzentration aufweist, von 10 μmol pro ml entwässertem Harz bis 60 μmol pro ml entwässertem Harz, wie beispielsweise von 20 μmol pro ml entwässertem Harz bis 60 μmol pro ml entwässertem Harz, wie beispielsweise von 30 μmol pro ml entwässertem Harz bis 50 μmol pro ml entwässertem Harz.
Ein fester Hochligand-Träger, der auch niedermolekulargewichtige Lektine binden kann, wie dimere Lektine, wird unter Verwendung der Standardsäule hergestellt, welche daran gekoppelt ein Zuckerderivat in einer bestimmten Konzentration von über 200 μmol pro ml entwässertem Harz, wie von 300 μmol pro ml entwässertem Harz, wie von über 400 μmol pro ml entwässertem Harz, wie von 500 μmol pro ml entwässertem Harz aufweist.
Waschflüssigkeit
Die erfindungsgemäße Waschflüssigkeit kann jede geeignete Waschflüssigkeit sein, die dem Durchschnittsfachmann bekannt ist. Der Puffer kann insbesondere ein oder mehrere Komponenten umfassen, welche mit der Assoziation zwischen Lektin und dem Zuckerderivat, wie dem Aminozucker, interferieren kann.
In einer erfindungsgemäßen Ausführungsform umfasst die Waschflüssigkeit ein oder mehrere Komponenten, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Zuckern, welche Lektine binden können, Zuckerderivaten, welche Lektine binden können, und Chelatierungsmitteln für zweiwertige Metallionen.
Zucker und/oder Zuckerderivate, die Lektine binden können, können beispielsweise jedes Monosaccharid und/oder Monosaccharid-Derivat sein, welches Lektine binden kann. So kann beispielsweise jedes Zuckerderivat, das zur Kupplung an den erfindungsgemäßen fest Träger nützlich ist (siehe vorstehend) oder ein entsprechend nicht-derivatisierter Zucker oder ein entsprechender Zucker, welcher weiter modifiziert ist in der Waschlösung enthalten sein.
Derartige Monosaccharide können beispielsweise ausgewählt werden aus der Gruppe bestehend aus Mannose, N-Acetylmannosamin, Glucose, N-Acetylglucosamin, Frucose, N-Acetylfrucosamin, Galactose und N-Acetylgalactosamin. Monosaccharide können insbesondere ausgewählt werden aus der Gruppe bestehend aus, D-Glucose, D-Mannose, L-Fucose und L-Galactose.
Zucker und/oder Zuckerderivate, die das Lektin binden können, können auch jedes Disaccharid, Disaccharid-Derivat, Trisaccharid, Trisaccharid-Derivat, Oligosaccharid, Oligosaccarid-Derivat, Polysaccharid oder Polysaccharid-Derivat sein, worin mindestens ein Teil des Zuckers das Lektid binden kann. Beispiele für geeignete Oligosaccharide umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, Saccharose und Maltose.
Chelatierungsmittel für zweiwertige Metallionen sind jede Mittel, die ein zweiwertiges Metallion chelatieren können. Das zweiwertige Metallion kann beispielsweise Ca²⁺ sein. Beispiele für Chelatierungsmittel für zweiwertige Metallion umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, EDTA und Zitrat.
Darüber hinaus kann die Waschflüssigkeit in jeder anderen Art und Weise hergestellt werden, die für die Elution von Lektinen geeignet und dem Durchschnittsfachmann bekannt ist. So kann beispielsweise die Waschflüssigkeit eine Hochsalzkonzentration oder einen sauren pH-Wert umfassen.
Lektine
Die erfindungsgemäß isolierten Lektine können jede Lektine sein. So kann das Lektin beispielsweise ein Collektin sein, wie beispielsweise MBL (Mannose-bindendes Lektin), SP-A (Lungen-Oberflächenprotein A), SP-D (Lungen-Oberflächenprotein D), BK (oder BC, bovines Conglutinin) und CL-43 (Collektin-43). Alle Collektine zeigen den folgenden Aufbau: Sie haben am N-Terminus eine Cystein-reiche Region, welche zur Bildung von Disulfidbrücken neigt, gefolgt von einer Kollagen-ähnlichen Region, einer α-helikalen Spiralregion und schließlich einer C-Typ Lektin-Domäne, welche der Muster-Erkennungsbereich ist und als die Kohlenhydrat-Erkennungsdomäne (CRD) bezeichnet wird. Der Ausdruck Collektin ist von der Anwesenheit von Kollagen- und Lektin-Domänen abgeleitet. Der α-helikale Spiralbereich initiiert die; Trimerisierung der einzelnen Polypeptiden unter Bildung von Kollagen dreifach-Spiralen, wobei Collektin-Untereinheiten mit jeweils 3 unabhängigen Polypeptiden gebildet werden, während der N-terminale Bereich die Bildung von Oligomeren der Untereinheiten vermittelt. Unterschiedliche Collektine zeigen unterschiedliche Strukturen höherer Ordnung, gewöhnlich entweder Tetramere der Untereinheiten oder Hexamere der Untereinheiten.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das Lektin MBL oder Ficolin. In einer mehr bevorzugten Ausführungsform ist das Lektin MBL.
Der Ausdruck Lektine kann natürlich vorkommende Lektine, sowie Varianten davon bezeichnen, wie Mutanten, wobei die Varianten Zucker binden können.
Die Erfindung ist insbesondere zur Isolierung von MBL geeignet, was nachstehend ausführlicher als ein Beispiel der Erfindung beschrieben wird, und das nicht als Begrenzung der Erfindung verstanden werden soll.
Erfindungsgemäße Lektine können ein oder mehrere Untereinheiten umfassen. So können Collektine, wie MBL, insbesondere ein oder mehrere Untereinheiten umfassen, wobei jede Untereinheit eines Collektins normalerweise aus 3 einzelnen Polypeptiden besteht. So können Collektine, wie MBL, beispielsweise monomere, dimere, trimere, tetramere, pentamere, hexamere, heptamere, octamere, nonamere, decamere, 11-mere, 12-mere von Untereinheiten sein, wobei Collektine wie MBL, sogar mehr als 12 Untereinheiten umfassen können.
Zusammensetzung
Das hier erläuterte Verhältnis R kann unter Verwendung jedes geeigneten Verfahrens berechnet werden. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform kann eine quantitative Schätzung des Wertes für R einer Probe wie folgt erfolgen:
Der SDS-PAGE Immunoblot wird in eine TIFF Datei gescannt oder eine andere, nicht komprimierte Bitmap Datei. Die Pixel-Dichte entlang der Proben-Banden werden in einem Bildbewertungsprogramm, wie Scion Image für Windows 4.0 (Scion Corporation, freie beta Version auf www.scioncorp.com), bestimmt und in ein Datenbewertungsprogramm (wie Excel) exportiert.
Die Wanderung entsprechend einem bestimmten Molekulargewicht wird aus der Wanderung von Markern bestimmt. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das bestimmte Molekulargewicht das Molekulargewicht des dimeren Lektins (für MBL etwa 200 kDA), wobei die Wanderung entsprechend des dimeren Lektins aus der Wanderung des Markers entsprechend abgeleitet werden kann (beispielsweise Precision Protein Standards, BioRad). Der Wert für R wird als Gesamtpixel-Signal über dem Referenz-Wanderungspunkt (für dimeres MBL 200 kDA) berechnet, durch das Gesamtpixel-Signal unterhalb des Referenz-Wanderungspunktes (für dimeres MBL 200 kDA) geteilt. R₀ wird als das Verhältnis im Ausgangsmaterial definiert, während R₁ das Verhältnis entlang der entsprechenden Bewertungslinie in der Lektinprobe, gewonnen nach der Durchführung eines erfindungsgemäßen Verfahrens, ist.
Das Mass des Anstieges des Verhältnis R hängt von dem Ausgangsmaterial mit dem Verhältnis R₀ ab, wobei das Ausgangsmaterial die Lektin-Zubereitung ist, beispielsweise eine MBL-Zubereitung. Es ist bevorzugt, dass mindestens 50 % des Lektins mit hohem Molekulargewicht der Zusammensetzung ein Molekulargewicht über dem Molekulargewicht des Dimer-Lektins aufweist, vorzugsweise über dem Molekulargewicht für trimere Lektine. Ist das Lektin MBL, dann ist es bevorzugt, dass mindestens 50 % des MBL's mit hohem Molekulargewicht der Zusammensetzung ein Molekulargewicht über 200 kDA aufweist, wie über 225 kDA, wie über 250 kDA, wie über 300 kDA.
Bei der Herstellung einer erfindungsgemäßen MBL-Zusammensetzung ist die MBL-Zusammensetzung vorzugsweise im Wesentlichen frei von jeglichen Verunreinigungen, mit denen MBL bei Herstellungen in einem nativen Wirtsorganismus assoziiert ist, beispielsweise Verunreinigungen, mit denen MBL assoziiert ist, wenn MBL aus Plasma-MBL gereinigt wird.
Das Verfahren kann zur Herstellung von MBL-Zusammensetzungen in hoher Menge aus jeder MBL-Quelle eingesetzt werden, wie jedem rekombinanten Säuger-MBL, oder aus Plasma. Die MBL-Quelle ist jedoch vorzugsweise rekombinantes MBL, mehr bevorzugt ist das MBL der Zusammensetzung menschlich, wie MBL, bei dem die MBL-Untereinheit aus 3 Peptidsequenzen zusammengesetzt ist, welche die als SEQ ID NO:1 in der PCT Anmeldung WO 00/70043 gezeigte Sequenz umfasst, oder ein funktionelles Äquivalent davon.
Rekombinante Produktion
Obwohl das Verfahren auf jedes Lektin-Ausgangsmaterial mit Lektin geringer und hoher Masse, wie MBL, angewendet werden kann, ist es besonders geeignet, Lektin mit hoher Masse, wie MBL aus einer rekombinant hergestellten Zubereitung, zu gewinnen.
Die MBL-Zubereitung ist daher vorzugsweise eine rekombinante-Zubereitung, worin die MBL-Zubereitung erhalten wird durch:

– Herstellen eines Genexpression-Konstrukts, welches humanes MBL-Peptid oder ein funktionelles Equivalent davon kodiert,
– Transformieren einer Wirts-Zellkultur mit dem Konstrukt,
– Züchten der Wirts-Zellkultur in einem Kulturmedium, wobei Expression und Sekretion des Polypeptids in dem Kulturmedium erhalten wird,
– Erhalten einer Zubereitung, welche mehrere MBL-Moleküle enthält.

Erfindungsgemäß können die Sequenzen des MBL-Gens von dem humanen MBL-Gen oder von MBL-Genen anderer tierischer Spezies sein, in denen das Immunsystem wie das humane Immunsystem agiert. Ein Beispiel einer bevorzugten Ausführungsform einer Zubereitung eines rekombinanten, erfindungsgemäßen MBL's ist im Beispiel 1 der PCT Anmeldung WO 00170043 beschrieben, welche hier durch Bezugnahme mit aufgenommen wird. In dem Beispiel wird das rekombinante MBL unter Verwendung eines Vektors hergestellt, welche Sequenzen des humanen MBL-Gens enthält.
Die Erfindung betrifft weiter die Verwendung von Expressionsvektoren, welche Sequenzen aufweisen, die funktionelle Derivate der Sequenzen des humanen-MBL-Gens sind. Mit dem Begriff funktionelle Derivate werden Sequenzen bezeichnet, die Basenpaaränderungen aufweisen, welche zu keinen funktionellen oder zu keinen wesentlichen funktionellen Unterschieden des Expressionsvektors fuhren, wobei das auf diese Art und Weise hergestellte MBL eine Funktionalität aufweist, welche vergleichbar ist zu der von MBL, hergestellt unter Verwendung eines Expressionsvektors, welcher eine nicht-geänderte Sequenz des humanen MBL-Gens aufweist.
Zusätzlich zu dem Reinigungsverfahren ist es bevorzugt, dass das Gen-Expressions-Konstrukt und die Wirtszelle die Herstellung höherer Oligomere ebenfalls fördern. Das Gen-Expressions-Konstrukt umfasst daher vorzugsweise mindestens eine Intron-Sequenz aus dem humanen MBL-Gen oder ein funktionelles Equivalent davon. Darüber hinaus kann das Gen-Expressions-Konstrukt mindestens zwei Exon-Sequenzen aus dem humanen MBL-Gen oder ein funktionelles Equivalent davon umfassen. Mehr bevorzugt umfasst das Gen-Expressions-Konstrukt mindestens drei Exon-Sequenzen aus dem humanen MBL-Gen oder ein funktionelles Equivalent davon. Falls mehr als ein Exon vorhanden ist, sind die Exon-Sequenzen vorzugsweise wie in dem humanen MBL-Gen angeordnet.
Obwohl bevorzugt ist, dass die Sequenz Intron-Sequenzen aufweist, kann es für einige Anwendungen zweckmäßig sein, dass das Expressions-Konstrukt eine cDNA-Sequenz aufweist, welche eine MBL-Untereinheiten oder ein funktionelles Equivalent davon kodiert.
Die Erfindung betrifft eher die Verwendung eines MBL-Gen-Expressions-Konstruktes als die eines MBL-cDNA-Konstruktes zur Expression von rMBL in Säuger-Zelllinien oder transgenen Tieren, um rekombinantes MBL mit strukturellen Eigenschaften unter nicht-denaturierenden und denaturierenden Bedingungen zu erhalten, welche im Wesentlichen vergleichbar sind mit natürlichem, humanen MBL. Mit dem Ausdruck "rekombinantes humanes MBL" wird humanes MBL bezeichnet, das aus technisch umgearbeiteten Nukleinsäuren exprimiert wurde, und mit dem Ausdruck "MBL-Gen-Expressions-Konstrukte" wird ein Expressionsvektor bezeichnet, der zur Expression in Säuger-Zelllinien geeignet ist und Exon-Sequenzen und mindestens eine Intron-Sequenz aus dem humanen MBL-Gen oder von MBL-Genen anderer Tierarten enthält, wie, ohne darauf beschränkt zu sein, Schimpansen und Rhesusaffen.
Die DNA-Sequenzen kodieren vorzugsweise eine Polypeptidsequenz, wie in der SEQ ID NO:1 der PCT Anmeldung WO 00/70043 gezeigt, oder ein funktionelles Equivalent, worin ein funktionelles Equivalent wie vorstehend definiert ist. SEQ ID NO:1 entspricht der MBL-Sequenz mit der Datenbank-Zugangsnummer: P11226. Das Equivalent kann durch eine Modifikation der als SEQ ID NO:1 gezeigten Peptidsequenz erhalten werden, wie als eine Sequenz, die eine entsprechende Eigenschaft wie die in der vorliegenden Erfindung aufgeführten Sequenzen innehat, worin jedoch ein oder mehrere Aminosäuren mit anderen substituiert wurden. Ein funktionelles Equivalent enthält vorzugsweise konservative Substitutionen, d.h. worin ein oder mehrere Aminosäuren durch eine andere Aminosäure mit ähnlichen Eigenschaften ersetzt sind, so dass ein Durchschnittsfachmann der Proteinchemie davon ausgeht, das die Sekundär- und Tertiär-Struktur des Proteins unverändert bleibt. Aminosäuren, welche für konservative Substitutionen geeignet sind umfassen jene, mit funktionell vergleichbaren Seitenketten. So können beispielsweise hydrophobe Reste beispielsweise Glycin, Alanin, Valin, Leucin, Isoleucin, und Methionin einen anderen derartigen Rest ersetzen. In vergleichbarer Art und Weise können konservative Substitutionen ein Austausch hydrophiler Reste beinhalten (beispielsweise Arginin und Lysin, Glutamin und Aspargin, Threonin und Serin), basische Reste (beispielsweise Lysin, Arginin und Histidin) und/oder saure Reste (beispielsweise Asparginsäure und Glutaminsäure). Funktionelle Equivalente können darüber hinaus, oder alternativ, durch beispielsweise die Entfernung oder Addition von Aminosäuren oder durch chemische Modifikation von Aminosäuren modifiziert werden, solange die Funktion des Polypeptids erhalten bleibt.
Das isolierte MBL-Peptid, einschließlich jeder funktionellen Equivalente davon, kann in einer Ausführungsform mindestens 80 Aminosäuren-Reste, wie mindestens 100 Aminosäure-Reste, wie mindestens 150 Aminosäure-Reste, wie mindestens 200 Aminosäure-Reste, beispielsweise mindestens 220 Aminosäure-Reste, wie mindestens 250 Aminosäure-Reste umfassen.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Expressionsvektor zur Expression in Säuger-Zelllinien oder transgenen Tieren geeignet, welche Exon-Sequenzen und mindestens eine Intron-Sequenz aus dem humanen MBL-Gen oder von MBL-Genen anderer Tierarten aufweisen, ohne darauf beschränkt zu sein, Schimpansen und Rhesus-Affen. In einer Ausführungsform wird die Wirts-Zellkultur in einem transgenen Tier gezüchtet. Mit dem Ausdruck transgenes Tier wird in diesem Zusammenhang ein Tier bezeichnet, das genetisch modifiziert wurde, um das humane MBL-Gen oder Fragmente oder Imitationen davon zu enthalten und zu exprimieren.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das erfindungsgemäße Expressions-Konstrukt einen auf einem Virus basierenden Vektor, wie einen auf einem DNA-Virus basierenden Vektor, einen auf einem RNA-Virus basierenden Vektor oder einen auf einem Chimären basierenden Vektor. Beispiele für DNA-Viren sind Cytomegalovirus, Herpes Simplex Virus, Epstein-Barr Virus, Simian Virus 40, Bovines Papilloma Virus, Adenoassoziierter Virus, Adenovirus, Vaccinia Virus und Baculo Virus.
In Säuger-Wirtszellen können eine Anzahl von auf Viren-basierenden Expressionssystemen verwendet werden. In Fällen bei denen ein Adenovirus als Expressionsvektor eingesetzt wird, kann das erfindungsgemäße Nukleinsäuremolekül an einen Adenovirus-Transkriptions/Translations-Steuerkomplex ligiert werden, beispielsweise dem späten Promoter und der Tripartit-Leader-Sequenz. Dieses chimäre Gen kann dann in das Adenovirus-Genom durch in vitro- oder in vivo-Rekombination eingebracht werden. Ein Einbringen in einen nicht wesentlichen Bereich des viralen Genoms (beispielsweise in die Region E1 oder E3) führt zu einem rekombinanten Virus, der lebensfähig und in der Lage ist, ein MASP-3-Genprodukt im infizierten Wirt zu exprimieren (siehe beispielsweise Logan und Shenk, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984), 3655-3659). Spezifische Startsignale können für eine wirksame Transaktion der inserierten Nukleinsäuremoleküle ebenfalls erforderlich sein. Diese Signale umfassen das ATG-Startcodon und benachbarte Sequenzen. In Fällen, bei denen das gesamte Gen oder die cDNA, einschließlich deren eigenes Startcodon und benachbarte Sequenzen in den entsprechenden Expressionsvektor inseriert wird, können keine zusätzlichen Translations-Steuersignale erforderlich sein. In Fällen, bei denen nur ein Teil der codierenden Sequenz inseriert wird, müssen jedoch exogene Translations-Steuersignale, einschließlich gegebenenfalls das ATG-Startcodon, bereitgestellt werden. Darüber hinaus muss das Startcodon mit dem Leseraster der gewünschten kodierenden Sequenz in Phase sein, um eine Translation des gesamten Inserts sicher zu stellen. Diese exogenen Translations-Steuersignale und Startcodons können vielerlei Ursprungs sein, natürlichen und synthetischen. Die Expressionswirksamkeit kann durch Vorsehen von geeigneten Transkriptions-Enhancer-Elementen, Transkriptions-Terminatoren usw. verstärkt werden (siehe Bittner et al., Methods in Enzymol. 153 (1987), 516-544).
Beispiele für RNA-Viren sind Semliki Forest Virus, Poko Virus, Rabies Virus, Influenza Virus, SV5, Respiratory Syncytial Virus, Venezuela Pferd Encephalitis Virus, Kunjin Virus, Sendai Virus, Vesicular Stomatitis Virus und Retroviren.
Beispiele für chimäre Viren sind Adenovirus, Sindbis-Virus und Adenovirus-Adenoassoziierter Virus.
Hinsichtlich spezifischer Vektoren wird auf Makrides, S.C., "Components of vectors for Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells" Bezug genommen, welche hierin durch Bezugnahme mit aufgenommen wird.
So wird insbesondere ein Ursprung der Replikation des Epstein-Barr Virus oder funktionelle Derivate oder Imitationen davon, einschließlich des pREP9-Vektors verwendet. In einem Aspekt liefert die Erfindung ein Expressions-Konstrukt, welches humanes MBL codiert, und ein oder mehrere Intron-Sequenzen aus dem humanen MBL-Gen umfasst, einschließlich funktioneller Derivate davon. Darüber hinaus erhält sie eine Promoterregion, ausgewählt unter Genen von Viren und Eukaryoten, einschließlich Säugern und Insekten.
Die Promoterregion wird vorzugsweise verschieden von dem humanen MBL-Promoter gewählt. Um die Ausbeute an MBL und Größenverteilung von MBL-Oligomeren zu optimieren, wird die Promoterregion vorzugsweise derart gewählt, dass sie mit dem Vektor und der in den betreffenden Wirtszellen optimal funktioniert. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Promoterregion aus einer Gruppe gewählt umfassend den langen terminalen sich wiederholenden Promoter des Rous Sarcom Virus, und des unmittelbaren frühen Promoters des Cytomegalo Virus und des Promoters des Elongationsfaktors-1 Alpha.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Promoterregion gewählt unter Genen von Mikroorganismen wie anderen Viren, Hefen und Bakterien.
Um eine größere Ausbeute an rekombinantem MBL zu erzielen, kann die Promoterregion Enhancer-Elemente umfassen, wie das QBI SP163-Element des 5'-End nicht translatierten Bereichs des Maus Vascular Endothel-Wachstumsfaktor-Gens. Das Konstrukt wird zur Transformierung einer Wirtszelle verwendet, um eine Wirtszellkultur zu erhalten, die MBL exprimieren kann. Die Wirtszellkultur ist vorzugsweise eine eukaryotische Wirtszellkultur. Durch Transformation einer eukaryotischen Zellkultur wird in diesem Zusammenhang Einbringen rekombinanter DNA in Zellen bezeichnet. Das bei diesem Verfahren verwendete Expressions-Konstrukt ist gekennzeichnet durch die MBL-codierende Region, welche ausgewählt ist unter Tiersäuger-Genen, einschließlich menschlichen Genen und Genen mit einer hohen Ähnlichkeit dazu, wie die Gene aus dem Schimpansen. Das verwendete Expressions-Konstrukt ist darüber hinaus durch die Promoterregion gekennzeichnet, welche unter denen von Viren und Eukaryoten gewählt wird, einschließlich Säuger-Zellen und Insektenzellen.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von rekombinantem MBL ist gekennzeichnet, dass die Wirtszell-Kultur vorzugsweise eukaryotisch ist, und beispielsweise eine Säuger-Zellkultur ist. Eine bevorzugte Wirts-Zellkultur ist eine Kultur humaner Nierenzellen, und in einer noch mehr bevorzugten Form ist die Wirts-Zellkultur eine Kultur humaner embryonaler Nierenzellen (HEK Zellen). Die Erfindung betrifft die Verwendung von HEK 293-Zelllinien zur Herstellung von rekombinantem, humanem MBL. Mit "HEK 293- Zelllinien" wird jede Zelllinie bezeichnet, die von humanem, embryonalen Nierengewebe abgeleitet ist, wie, ohne darauf beschränkt zu sein, die, die bei der American Type Culture Collection mit der Hinterlegungsnummer CRL-1573 und CRL-10852 hinterlegten Zelllinien.
Andere Zellen können Hühner-Embryofibroblasten, Hamster-Eierzellen, Babyhamster-Nierenzellen, humane cervicale Carcinomzellen, humane Melanomzellen, humane Nierenzellen, humane vaskuläre Nabelschnur-Endothelzellen, humane Hirn-Endothelzellen, humane Tumorzellen des Mundraums, Affen-Nierenzellen, Maus-Fibroblasten, Maus-Nierenzellen, Maus-Verbindungsgewebe-Zellen, oligodendrische Maus-Zellen, Maus-Makrophagen, Maus-Fibroblasten, Maus-Neuroblastom-Zellen, Maus-pre-B-Zellen, Maus-B-Lymphom-Zellen, Plasmacytom-Maus-Zellen, Teratocarcinom-Maus-Zellen, Astrocytom Ratten-Zellen, Ratten Säugerepithelzellen, COS, CHO, BHK, 293, VERO, HeLa, MDCK, WI38 und NIH3T3 Zellen.
Darüber hinaus kann eine Wirts-Zelllinie gewählt werden, welche die Expression der inserierten Sequenz moduliert oder modifiziert, und das Genprodukt in einer gewünschten, bestimmten Weise verarbeitet. Derartige Modifikationen (beispielsweise Glycosylierung) und Verarbeitung (beispielsweise Spaltung) von Proteinprodukten können für die Funktion des Proteins wichtig sein. Unterschiedliche Wirts-Zellen weisen Charakteristika und spezifische Mechanismen zur post-translationalen Verarbeitung und Modifizierung von Proteinen und Genprodukten auf. Geeignete Zelllinien oder Wirts-Systeme können gewählt werden, um die korrekte Modifizierung und Verarbeitung des exprimierten Fremdproteins sicherzustellen. Diesbezüglich können eukaryotische Wirts-Zellen, welche die zelluläre Maschinerie für eine richtige Verarbeitung des primären Transkripts, Glycosylierung und Phosphorylierung des Genprodukts aufweisen, verwendet werden. Die vorstehend aufgeführten Säuger-Zelltypen sind unter jenen, die als geeignete Wirts-Zellen dienen können.
Die Wirts-Zellkultur kann in jedem geeigneten Kulturmedium gezüchtet werden. Beispiele für Kulturmedien sind RPMI-1640 oder DMEM, ergänzt mit beispielsweise Insulin, Transfenin, Selen und fötalem Kälberserum.
Reinigung
Wie vorstehend erläutert ermöglicht die vorliegende Erfindung eine schnelle Produktion von MBL. Die Produktion von MBL kann durch die folgenden Schritte durchgeführt werden:

– Fermentation – Züchten von MBL exprimierenden Zellen
– Isolierung – Einsetzen des erfindungsgemäßen Verfahrens.

In Folge dessen kann die Lektin Zusammensetzung durch jedes geeignete Mittel weiter gereinigt werden, entweder vor der Isolierung unter Verwendung der erfindungsgemäßen Verfahren oder nach der Isolierung unter Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens. So kann beispielsweise die Lektin-Zusammensetzung durch jedes physiko-chemische Isolierungsverfahren weiter gereinigt werden, einschließlich, ohne darauf beschränkt zu sein, Filtrationsverfahren, Ausfällungsverfahren, Chromatographie, wie Ionenaustausch, basierend auf Ladung, Gelpermeation basierend auf Größe, hydrophoben Interaktionen basierend auf Hydrophobizität oder Affinitäts-Chromatographie.
Darüber hinaus ist es möglich, die erfindungsgemäßen Verfahren während des Isolierungsverfahrens mehr als einmal einzusetzen. So können insbesondere zwei oder mehrere unterschiedliche erfindungsgemäße Verfahren in einem Isolierungsverfahren zum Einsatz gebracht werden, wobei die Verfahren durch Wahl des festen Trägers, Wahl des Zuckerderivats und/oder Wahl der bestimmten Konzentration eines an den festen Träger gekuppel-ten Zuckerderivats unterscheiden können.
Es ist beispielsweise möglich, die Isolierung von Lektinen zuerst unter Verwendung eines festen Trägers durchzuführen, welcher daran gekoppelt eine erste bestimmte Konzentration eines Zuckerderivats aufweist und anschließend die Isolierung von Lektinen unter Verwendung eines festen Trägers durchzuführen, welcher gekoppelt daran ein zweite bestimmte Konzentration eine Zuckerderivats aufweist, wobei die erste bestimmte Konzentration höher oder niedriger sein kann als die zweite bestimmte Konzentration.
So kann insbesondere bei der Isolierung von Lektinen mit einem mittleren Molekulargewicht ein Zwei-Stufen-Isolierungsverfahren unter Verwendung von mindestens zwei unterschiedlichen festen Trägern mit zwei unterschiedlichen Konzentrationen an Zuckerderivaten verwendet werden. In einem Beispiel eines Zwei-Stufen-Isolierungsverfahrens werden die gewünschten Lektine in der kontaminierten Fraktion erhalten, d.h. die nicht-gebundene Fraktion mit einem Molekulargewicht unter dem bestimmten Molekulargewicht in dem ersten Schritt, beispielsweise jede Lektine kleiner als Heptamere. In dem zweiten Schritt wird die nicht-gebundene Fraktion auf einen unterschiedlich festen Träger mit einem anderen Ausschluss (cut-off) hinsichtlich des bestimmten Molekulargewichts aufgetragen, welcher beispielsweise jede Lektine über dem Molekulargewicht eines Dimers bindet. Dadurch wird die Zusammensetzung mit dem gewünschten Molekulargewicht an trimeren, tertrameren, Pentameren und Hexameren beim Eluieren von Lektinen erhalten, die an den zweiten festen Träger gebunden sind. Es ist dem Fachmann klar, dass die zwei Schritte natürlich in umgekehr ter Reihenfolge durchgeführt werden können, um die gleiche Zusammensetzung zu erhalten.
Funktionalität
Die Funktionalität der erfindungsgemäß erhaltenen rekombinanten MBL-Zusammensetzung ähnelt vorzugsweise der Funktionalität von Plasma- oder Serum-MBL. Im vorliegenden Zusammenhang bedeutet der Ausdruck "Funktionalität von MBL" die Fähigkeit, das Komplementsystem, wie vorstehend aufgeführt, in Bezug auf funktionelle Equivalente zu aktivieren. Die Funktionalität kann als die spezifische Aktivität von MBL ausgedrückt werden, die Einheiten von MBL-Aktivität pro ng MBL. Die Funktionalität der rekombinanten MBL-Zusammensetzung ausgedrückt als spezifische Aktivität, ist vorzugsweise mindestens 25 % der spezifischen Aktivität von MBL, welches aus Serum gereinigt wurde, wie mindestens 50 % der spezifischen Aktivität von MBL, welches aus Serum gereinigt wurde, mehr bevorzugt mindestens 75 % der spezifischen Aktivität von MBL, welches aus Serum gereinigt wurde.
Die Funktionalität von MBL kann durch dessen Fähigkeit bewertet werden, einen MBL/MASP Komplex zu bilden, welcher zur Aktivierung des Komplementsystems führt. Wird C4 durch MBL/MASP gespalten, wird ein aktivierter Thiolester exponiert, und C4 wird kovalent an benachbarten nukleophilen Gruppen befestigt. Ein wesentlicher Teil des C4b wird dadurch an beschichtete Kunststoff-Wells angeheftet, und kann durch anti-C4-Antikörper nachgewiesen werden.
Ein quantitativer TRIFMA für die funktionelle Aktivität von MBL wurde erstellt durch:
1) Beschichten von Mikroplatten-Wells mit 1 mg Mannan in 100 ml Puffer; 2) Blockieren mit Tween-20; 3) Auftragen von Testproben, beispielsweise verdünntem MBL Zubereitungen; 4) Auftragen von Serum ohne MBL (dies führt zur Bildung des MBL/MASP Komplexes); alternativ kann das MBL und das Serum ohne MBL vor Auftragen auf dem Mikrotiter-Wells vermischt werden; 5) Auftragen von gereinigtem Komplementfaktor C4 in einer Menge von 5 mg/ml; 6) Inkubieren für eine Stunde bei 37 °C; 7) Auftragen von Eumarkiertem anti-C4-Antikörper; 8) Auftragen einer Verstärkerlösung; 9) Ablesen des Eumittels zeitaufgelöster Fluorometrie. Zwischen jedem Schritt wird die Platte bei Raumtemperatur inkubiert und gewaschen, mit der Maßgabe zwischen den Schritten 8 und 9.
Eine Einschätzung durch ELISA kann in vergleichbarer Art und Weise ausgeführt werden, beispielsweise durch Auftragen von mit Biotin markiertem anti-C4 in Schritt 7; 8) Auftragen von mit alkalischer Phosphatase markiertem Avidin; 9) Auftragen des Substrats; und 10) Ablesen der Farbintensität. Eine Kalibrierungskurve kann unter Verwendung von Verdünnungen eines gewählten normalen Plasmas erstellt werden. Auf Hinblick auf die vorliegende Erfindung ist das folgende Serum ein Beispiel nützlicher Sera: Plasma Pool LJ 6.57 28/04/97. Die Funktionalität kann als die spezifische Aktivität von MBL, wie in Einheiten von MBL-Aktivität pro ng MBL ausgedrückt werden.
Ein weiterer Assay zur Bestimmung eines funktionellen Equivalent von MBL besteht in der Bestimmung der Fähigkeit an einen Rezeptor/an Rezeptoren auf Zellen zu binden.
Die Interaktion von MBL mit dem Rezeptor/den Rezeptoren auf Zellen kann durch Cytofluorometrie analysiert werden. 1) MBL bei einer Konzentration von 50 μg/ml wird mit 2 × 10⁵ Zellen inkubiert. Der Bindungsvorgang wird in einer Phosphat gepufferten Salzlösung (PBS) durchgeführt, welche 1 % FCS und 0,1 % Na-Azid enthielt. 2) Zum Nachweis von zellgebundenem MBL wird biotinylierter anti-MBL Antikörper eingesetzt; 3) gefolgt von der Zugabe von Strepavidin-FITC und 4) Analyse des Gemisches mittels Fluorometrie.
Die Erkrankungen, Störungen und/oder Zustände, die einer Behandlung mit den erfindungsgemäßen Verbindungen bedürfen, umfassen beispielsweise die Behandlung von Zuständen einer MBL-Defizienz, Behandlung von Krebs und von Infektionen in Verbindung mit immunsupprimierender Chemotherapie, einschließlich insbesondere jener Infektionen, die in Verbindung während der Krebsbehandlung oder in Verbindung bei der Einpflanzung und/oder Transplantation von Organen auftreten. Die Erfindung umfasst weiterhin die Behandlung von Zuständen in Verbindung mit wiederkehrender, vorzeitiger Fehlgeburt.
Die pharmazeutische Zusammensetzungen kann daher insbesondere zur Behandlung und/oder Verhinderung von klinischen Zuständen ausgewählt, unter Infektionen, MBL-Defizienz, Krebs, Störungen, die mit Chemotherapie assoziiert sind, wie Infektionen, Erkrankungen, die mit dem humanen Immunschwächevirus (HIV) assoziiert sind, Erkrankungen, die mit angeborener oder erworbener Immunodefizienz verbunden sind, eingesetzt werden. Insbesondere chronische, entzündliche demyelinierende Polyneuropathie (CIDP, multifokale motorische Neuropathie, Multiple Sklerose, Myasthenia Gravis, Eaton-Lambert's Syndrom, Opticus Neuritis, Epilepsie, primäres Antiphosholipid Syndrom, rheumatoide Arthritis, systemischer Lupus erythematosus, systemisches Scleroderma, Vascultis, Wegner's Granulomatosis, Sjørgen's Syndrom, Juvenile rheumatoide Arthritis, autoimmune Neutropenie, autoimmune haemolytische Anämie, Neutropenia, Crohn's Erkrankung, Colitis ulcerosus, Coeliac Erkrankung, Asthma, septisches Schocksyndrom, chronisches Erschöpfungssyndrom, Psoriasis, toxisches Schocksyndrom, Diabetes, Sinuitis, dilatierte Cardiomypathie, Endocarditis, Atherosklerosis, primäre Hypo/agammaglobulinamie einschließlich normaler variabler Immunodefizienz, Wiskot-Aldrich Syndrom und schwere kombinierte Immun schwäche (SCID), sekundäre Hypo/agammaglobulinamie in Patienten mit chronischer lymphatischer Leukämie (CLL) und multiplem Myelom, akuter und chronischer idiopathischer Thrombozytopenie Purpura (ITP), allogenischer Knochenmarkstransplantation (BTM), Kawasaki's Erkrankung und Guillan-Barre's Syndrom.
Der Verabreichungsweg kann jeder geeignete Weg sein, wie intravenös, intramuskulär, subkutan und intradermal. Darüber hinaus wird durch die vorliegende Erfindung pulmonale oder topikale Verabreichung umfasst.
Die MBL-Zusammensetzungen kann insbesondere verabreicht werden, um Infektionen in Patienten mit klinischen Symptomen zu verhindern und/oder zu behandeln, die mit angeborener oder erworbener MBL-Defizienz assoziiert sind, oder welche derartige Symptome gegebenenfalls entwickeln können. Eine Vielzahl von Zuständen können in MBL-defizienten Individuen zu einer erhöhten Neigung führen, Infektionen zu entwickeln, wie Chemotherapie oder andere therapeutische, zelltoxische Behandlungen, Krebs, AIDS, genetische Disposition, chronische Infektionen und Neutropenie.
Es scheint, dass Krebs-Patienten, die mittels Chemotherapie behandelt werden, auf Grund der schädlichen Wirkung des Arzneimittels auf Zellen des Immunsystems oft Infektionen entwickeln können, welches den Hintergrund der Verwendung der MBL-Therapie bei der Behandlung dieses Zustands darstellt. Die beobachteten geringen Plasma-Konzentrationen von MBL (unter 500 ng/ml) zeigen eine erhöhte Neigung für klinisch signifikante Infektionen, wobei die Immunabwehr dieser Patienten durch Verabreichung von rekombinantem oder von natürlichem Plasma abgeleitetem MBL verstärkt werden kann.
Die pharmazeutische Zusammensetzung kann daher für eine Zeitspanne vor dem Beginn der Verabreichung der Chemotherapie oder dergleichen und während zumindest eines Teils der Chemotherapie verabreicht werden.
Die MBL-Zusammensetzungen kann als allgemeiner "Booster" vor der Chemotherapie verabreicht werden oder sie kann lediglich an solche verabreicht werden, die ein Risiko der Entwicklung einer MBL-Defizienz aufweisen. Die Gruppe von Patienten, die ein Risiko darstellen, kann durch Messen des MBL-Spiegels vor der Behandlung bestimmt werden, und nur jene können einer Behandlung unterworfen werden, bei denen der MBL-Spiegel unter einem bestimmten Niveau liegt. Die Grenze zur Bestimmung eines geringen MBL-Spiegels wird für die meisten Gruppen auf unter 500 ng/ml gesetzt. Der MBL-Spiegel kann durch einen zeitaufgelösten Immunofluoreszenz-Aassay, wie in Beispiel 9 beschrieben, ELISA, RIA oder Nephelometrie bestimmt werden.
Ein weiterer Hinweis für die Verabreichung von MBL ist, wenn der MBL-Spiegel unter 50 % des normalen Niveaus liegt, wie unter 300 ng/ml oder unter 200 ng/ml.
Die MBL-Zusammensetzungen wird in geeigneten Dosen verabreicht, wobei es insbesondere normal ist, diese in geeigneten Intervallen, beispielsweise einmal oder zweimal pro Woche während der Chemotherapie zu verabreichen.
Normalerweise werden von 1-100 mg pro Dosis verabreicht, wie von 2-10 mg, meistens von 5-10 mg pro Dosis. Am häufigsten wird etwa 0,1 mg/kg Körpergewicht verabreicht.
Die Erfindung betrifft daher in einem Aspekt MBL, einschließlich rMBL, Fragmente oder Imitationen davon zur Verwendung bei der Behandlung von Krebs und von Erkrankungszuständen und Störungen von beispielsweise dem Immunsystem und dem Fortpflanzungssystem, wobei die Behandlung in der Erzeugung, Wiederherstellung, Verstärkung und/oder Stimulierung der opsonischen und/oder bakteriziden Aktivität des Komplementsystems beruht, d.h. Verstärken der Fähigkeit der Immunabwehr mikrobielle Pathogene zu erkennen und abzutöten.
Darüber hinaus besteht ein Aspekt der vorliegenden Erfindung in der Verwendung einer rekombinanten Zusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung in einem Kit aus Teilen, welche ein weiteres Medikament umfasst. Das andere Medikament kann insbesondere ein anti-mikrobielles Medikament, wie Antibiotika sein.
In Bezug auf Fehlgeburten wurde berichtet, dass die Häufigkeit von geringen Plasma-Spiegeln an MBL in Patienten gesteigert ist, bei denen eine wiederkehrende Fehlgeburt anders nicht erklärt werden kann, was den Hintergrund zur Senkung der Neigung von Fehlgeburten durch Wiederherstellung des MBL-Spiegels durch Verabreichung einer rekombinanten MBL in diesen Fällen darstellt.
Hinsichtlich der Natur der erfindungsgemäßen Verbindung scheint es, dass die Erfindung im weitesten Sinne Verbindungen betrifft, welche als Opsonine wirken können, d.h. in der Lage ist, die Aufnahme durch Makrophagen entweder durch direkte Interaktion zwischen der Verbindung und dem Makrophagen oder durch Vermitteln der Komplement-Ablagerung auf der Zieloberfläche zu verstärken. Ein bestimmtes Beispiel hierfür ist MBL, ein Fragment oder ein Imitat hierfür. Die vorliegende Erfindung basiert auf der Offenbarung einer Synthese von rekombinantem humanen MBL, welche der Struktur von natürlichem humanen MBL näher zu sein scheint als in der Vergangenheit erreicht wurde.
Die Erfindung wurde nun für die verschiedenen Aspekte und in ausreichendem Detail erläutert und erklärt, wird jedoch zusätzlich nachstehend durch die nicht-begrenzenden Bei spiele bevorzugter Ausführungsformen beschrieben.
Beispiele
Beispiel 1:
Reinigung von MBL unter Verwendung von immobilisiertem Aminozucker
MBL wurde durch humane Zelllinien, wie eine auf HEK 293 basierende Zelllinie, die ein MBL-codierendes Expressions-Konstrukt, wie in der WO 00/70043 beschrieben, enthielt, in einem auf HyQ basierendem Medium (HyClone) rekombinant hergestellt, wobei MBL dann durch Affinität unter Verwendung von immobilisiertem Aminozucker gereinigt wurde.
Eine D-Mannosamin-Säule wurde durch Kuppeln von 1,0 g D-Mannosamin (ICN Biomedicals, Kat. Nr. 102252) an 13,5 ml suspendierte, NHS-aktivierte Sepharose FF (Amersham Biosciences, Kat. Nr. 17-0906-02) hergestellt.
Die Kupplungsbedingungen für das NHS-aktivierte Gel waren exakt wie in den Verkaufsinstruktionen beschrieben. Zuerst wurde das Harz mit eiskaltem 1 mM HCl gewaschen. Anschließend wurde das Harz mit dem Aminozucker (100 mg/ml D-Mannosamin, 10 mM NaH₂PO₄, pH = 7,0) über Nacht bei 4 °C inkubiert. Am nächsten Tag wurde das Harz mit Ethanolamin-Puffer (100 mM, pH 7,0) blockiert und in eine HR10/10 Säule gepackt. Schließlich wurde die Säule 3-mal mit schwachem Tris Puffer (pH 7,4) und einem schwachem Acetat Puffer (pH = 3,1) in alternierendem Muster gewaschen.
Ein Liter der Zellkulturlösung wurde auf die Säule gegeben und unter Verwendung eines EDTA enthaltenen Puffers eluiert.
Ein MBL-spezifischer Immunassay der entsprechenden Anwendung, des Durchlaufs, und des eluierenden Hauptpeaks zeigen, dass MBL fast ausschließlich in dem eluierenden Hauptpeak (1) gefunden wird. Der MBL-Gehalt wird durch chromatographische Technik leicht verifiziert, wie Größenausschluss-Chromatographie auf Superose 6 (vorgepackt HR 10/30 von Amersham Biosciences), oder MALDI-MS Untersuchungen nach Reduktion.
Beispiel 2:
Reinigung einer gewählten Größenfraktion von MBL unter Verwendung eines immobilisierten Aminozuckers
Ausgewählte Fraktionen von Lektin-Oligomeren können durch Einstellen der Aminozucker-Ligandenkonzentration erhalten werden.
Ein Harz mit einer relativ geringen Liganden-Konzentration wurde durch Kuppeln von 0,1 g D-Mannosamin (Sigma, Kat. Nr. M4674) an 12,0 ml suspendiertem NHS-aktivierte Sepharose FF (Amersham Biosciences, Kat. Nr. 17-0906-02) hergestellt.
Ein vergleichbares Harz mit relativ hoher Liganden-Konzentration wurde durch Kuppeln von 1,0 g D-Marmosamin (Sigma, Kat. Nr. M4670) an 12,5 ml suspendierter NHS-aktivierter Sepharose FF (Amersham Biosciences, Kat. Nr. 17-0906-02) hergestellt.
Eine "Kontroll"-Säule ohne Liganden wurde unter Verwendung eines Kupplungspuffers ohne den Aminozucker während der Kupplung von 12,5 ml suspendierter NHS-aktivierter Sepharose FF (Amersham Bioscienics, Kat. Nr. 17-0906-02) hergestellt.
In allen Fällen waren die Kupplungsbedingungen für das NHS-aktivierte Gel genau wie in den Verkäuferinstruktionen beschrieben. Ein Liter der Zellkulturlösung (wie in Beispiel 1 beschrieben) wird zu jeder Säule gegeben und unter Verwendung eines EDTA-enthaltenden Puffers eluiert. Ein MBL spezifischer Immunassay der entsprechenden Anwendung, des Durchlaufs, und des eluierenden Hauptpeaks zeigt, das MBL fast ausschließlich in dem eluierenden Hauptpeak aus der Säule mit einer hohen Liganden-Konzentration ("High-Sub"-Säule) aufzufinden ist.
Eine gewählte MBL-Fraktion mit hoher Masse wird in dem eluierenden Hauptpeak von der Säule mit geringer Liganden-Konzentration ("Low-Sub"-Säule) gefunden, während der Rest an MBL in der Durchlauf-Fraktion gefunden wird. Das gesamte MBL wird in der Durchlauf-Fraktion "Kontroll"-Säule gefunden, was zeigt, dass die MBL-Affinität Ligandenspezifisch ist (2).
Beispiel 3:
Reinigung einer gewählten Größenfraktion von MBL unter Verwendung einer Reihe von Säulen mit immobilisierten Aminozucker
Spezifische Fraktionen von Lektin-Oligomeren werden durch Einsatz einer Reihe von Säulen mit unterschiedlichen Liganden-Konzentrationen erhalten.
Ein Liter der Zellkulturlösung (wie in Beispiel 1 beschrieben) wird nacheinander auf zwei Säulen gegeben: Die erste Säule ist eine Säule mit einer geringen Aminozucker-Liganden-Konzentration (eine "Low-Sub"-Säule, wie in Beispiel 2 beschrieben), während die zweite eine Säule mit einer hohen Aminozucker-Liganden-Konzentration (eine "High-Sub"-Säule, wie in Beispiel 2 beschrieben) ist.
Die Durchlauffraktion von MBL aus der "Low-Sub"-Säule wird auf der "High-Sub"-Säule gefangen. Jede Säule wird dann mit EDTA Puffer (50 mM, pH 7,4) eluiert. Die eluierende Fraktion der "Low-Sub"-Säule enthält MBL mit hoher Massengröße mit einer mittleren Größenverteilung über der der ursprünglichen Auftragung. Die eluierende Fraktion aus der "High-Sub"-Säule enthält eine MBL-Fraktion mit einer Masse von unter dem des "Low-Sub"-Säuleneluats liegt, jedoch ohne MBL mit geringer Massengröße wie monomeren MBL oder dimeren MBL.
Beispiel 4:
Reinigung von von Plasma abgeleitetem MBL unter Verwendung eines immobilisierten Aminozuckers
Lektine aus Plasma können unter Verwendung von immobilisierten Aminozuckern gereinigt werden.
Eine D-Mannosamin-Säule wird, wie in Beispiel 1 beschrieben, hergestellt. Ein halber Liter Blutplasma wird von einer Blutbank erhalten, und durch schwaches Erhitzen nach Zugabe von CaCl₂ koaguliert. Das erhaltene Serum wird der Säule zugesetzt und nach einem kurzen Waschen wird das Protein unter Verwendung eines EDTA enthaltenen Puffers eluiert. Ein für MBL spezifischer Immunoassay der entsprechenden Anwendung, des Durchlaufs, und des eluierenden Hauptpeaks zeigt, das MBL fast ausschließlich in dem von der Säule eluierenden Hauptpeak gefunden wird.
Der MBL-Gehalt wird durch chromatographische Technik verifiziert, wie Größenausschluss-Chromatographie auf Superose 6 (vorgepackt HR 10/30 von Amersham Biosciences), Anionenaustausch-Chromotographie auf MonoQ (HR 515 von APBiotech) oder MBL ELISA (Statens Serum Institute, Copenhagen) verifiziert.
Beispiel 5:
Reinigung von MBL unter Verwendung von immobilisierten Aminozuckern, die nicht D-Mannosamin sind
Immobilisiertes D-Mannosamin kann durch jeden Aminozucker ersetzt werden, der das Lektin nach Immobilisierung über die NH₂-Gruppe binden kann. Dieselbe Wirkung von Liganden-Konzentration wird verzeichnet.
Ein Harz mit einer relativ geringen Liganden-Konzentration wurde durch Kuppeln von 0,1 g D-Glucosamin (Sigma, Kat. Nr. G4875) an 12,5 ml suspendierte NHS-aktivierte Sepharose FF (Amersham Biosciences, Kat. Nr. 17-0906-02) hergestellt. Ein vergleichbares Harz mit relativ hoher Liganden-Konzentration wurde durch Kuppeln von 1,0 g D-Glucosamin (Sigma, Kat. Nr. G4875) an 12,5 ml suspendierte NHS-aktivierter Sepharose FF (Amersham Biosciences, Kat. Nr. 17-0906-02) hergestellt. In beiden Fällen waren die Kupplungsbedingungen für das NHS-aktivierte Gel genau wie in den Verkäufer-Instruktionen angegeben.
Ein Liter der Zellkulturlösung (wie in Beispiel 1 beschrieben) wird zu jeder Säule gegeben und unter Verwendung eines EDTA- enthaltenen Puffers eluiert.
Ein für MBL-spezifischer Immunoassay der entsprechenden Anwendung, des Durchlaufs, und des eluierenden Hauptpeaks zeigt, das MBL fast ausschließlich in dem eluierenden Hauptpeak von der Säule mit einer hohen Liganden-Konzentration ("High-Sub"-Säule) (3) gefunden wird.
Beispiel 6:
Reinigung von Lektinen unter Verwendung von immobilisiertem Aminozucker
Die Affinität Chromatographie wird leicht um den Faktor zehn vergrößert.
Eine große D-Glucosamin Säule wird durch Kuppeln von 5,0 D-Glucosamin (Sigma, Kat. Nr. G4875) an 100 ml suspendierte NHS-aktivierte Sepharose FF (Amersham Biosciences, Kat. Nr. 17-0906-02) hergestellt. Die Kupplungsbedingungen für das NHS-aktivierte Gel waren genau wie in den Verkäufer-Instruktionen beschrieben. Zehn Liter der Zellkulturlösung mit rekombinant hergestelltem MBL wurden zu der Säule gegeben und unter Verwendung eines EDTA- enthaltenen Puffers eluiert.
Ein für MBL-spezifischer Immunoassay der entsprechenden Anwendung, des Durchlaufs, und des eluierenden Hauptpeaks zeigt, dass MBL fast ausschließlich in dem eluierenden Hauptpeak gefunden wird. Der MBL-Gehalt wird durch chromatographische Technik verifiziert, wie Größenausschluss-Chromatographie auf Superose 6 (vorgepackt HR 10/30 von Amersham Biosciences), Anionenaustausch-Chromotographie auf MonoQ, SDS-PAGE mit Western unter Verwendung von Hyb131-01 (Statens Serum Institute), MBL spezifischen ELISA's (Statens Serum Institute), Aminosäurezusammensetzungs-Analyse und MALDI-MS Untersuchung nach Reduktion verifiziert.
Beispiel 7:
Nachweis von Lektinen unter Verwendung von immobilisiertem Aminozucker
Aminozucker können auf Mikrotiter-Wells immobilisiert werden und zum Nachweis von Lektinen eingesetzt werden.
D-Glucosamin wird an Mikrotiter-Wells gekuppelt (Cyanurchlorid-aktiviertes Covalink NH₂ von Life Technologies) durch Inkubieren der Wells (Vertiefungen) mit 1,0 μg Aminozucker pro Well über Nacht, wie vom Verkäufer beschrieben. Verdünnungen von MBL enthaltenen Proben werden in die Wells gegeben und für 3 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wird ein Nachweis-Antikörper, wie Hyb131-01 (Statens Serum Institute), für 3 Stunden bei Raumtemperatur eingesetzt, gefolgt von Inkubation mit einem HRP- oder AP-markierten zweiten Antikörper (anti-IgG, Dako) für 1 Stunde. Nach Zusatz des Enzymsubstrats wird die Menge an MBL in einer ELISA-Lesevorrichtung bestimmt.

Claims

Verfahren zur Isolierung von mindestens einem Mannose bindenden Lektin (MBL) aus einer Zubereitung, die eine Vielzahl von Lektin-Molekülen enthält, welches umfasst: – Herstellen eines festen Trägers, der mit mindestens einem Aminozucker, der eine primäre Aminogruppe als einen reaktiver Teil in einem Bereich des Moleküls und eine MBL-Bindungstelle in einem anderem Bereich des Moleküls aufweist, derivatisiert ist, und worin der Aminozucker über die Aminogruppe an den festen Träger gekoppelt ist, – Auftragen der Zubereitung auf dem festen Träger, – Binden lassen der Lektine an die an den festen Träger gekuppelten Aminozucker, – Waschen des festen Trägers mit einer Waschflüssigkeit, wobei nicht-gebundene Verunreinigungen entfernt werden, – wahlweise Gewinnen des Lektins/der Lektine von dem festen Träger.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Aminozucker ein Monosaccharid ist ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Mannosamin, Glucosamin, Galactosamin, Fructosamin, D-Mannosamin, D-Glucosamin, L-Galactosamin und L-Fucosamin.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Aminozucker ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend D-Mannosamin und D-Glucosamin.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der feste Träger ein Chromatographiesäulen-Harz ist und wobei eine bestimmte Konzentration von 0,1 mg bis 1000 mg Aminozucker pro ml Harz an den festen Träger gekoppelt ist.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei MBL von dem festen Träger gewonnen wird.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei MBL im Wesentlichen in reiner Form gewonnen wird.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei der feste Träger ausgewählt ist unter Chromatographiesäulen, Chromatographie-Harzen, Filtern, Kunststoffoberflächen, Glasoberflächen und magnetischen Teilchen.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei die Säule ausgewählt ist unter aktivierten N-Hydroxysuccinimid-Harzen, aktivierten Cyanogenbromid-Harzen, aktivierten Epoxy-Harzen, ECH Sapharose 4B von Amersham Biosciences und aktivierter CH-Sapharose 4B von Amersham Biosciences.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei die Kunststoffoberfläche eine aktivierte Mikrotiterplatte ist.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Waschflüssigkeit ein oder mehrere Komponenten umfasst, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Chellatoren für zweiwertige Metallionen, und Zucker, die an MBL binden können, wobei der Zucker ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Mannose, N-Acetylmannosamin, Glucose, N-Acetylglucosamin, Fructose, N-Acetylfructosamin, Galactose und N-Acetylgalactosamin, Saccharose und Maltose.
Verfahren zur Erhöhung des Verhältnisses R einer Zusammensetzung, welche eine Vielzahl von MBL-Molekülen enthält, wobei R das Verhältnis der Konzentration an MBL-Molekülen mit einem hohen Molekulargewicht über einem bestimmten Molekulargewicht zu der Konzentration an MBL-Molekülen mit einem geringen Molekulargewicht kleiner oder gleich dem bestimmten Molekulargewicht ist, wobei das Verfahren umfasst: – Erhalten einer MBL-Zubereitung, welche MBL mit niedrigem Molekulargewicht und MBL mit hohem Molekulargewicht enthält, wobei die Zubereitung das Verhältnis R = R₀ aufweist, – Verwenden der Zubereitung in einem Isolierungsverfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei der feste Träger ein Chromatographiesäulen-Harz ist, und wobei eine bestimmte Konzentration von 0,1 mg bis 1000 mg Zuckerderivat pro ml Harz an den festen Träger gekoppelt ist, – Erhalten einer Zusammensetzung, welche die gewonnenen MBL-Moleküle umfasst.
Verfahren zur Herstellung einer Zusammensetzung, welche eine Vielzahl an MBL-Molekülen aufweist, wobei im Wesentlichen alle die MBL-Moleküle ein Molekulargewicht über einem bestimmten Molekulargewicht für Dimer-MBL aufweisen, wobei das Verfahren umfasst: – Erhalten einer MBL-Zubereitung, welche MBL-Moleküle mit einem hohen Molekulargewicht über dem bestimmten Molekulargewicht und MBL-Moleküle mit einem geringen Molekulargewicht kleiner oder gleich dem bestimmten Molekulargewicht enthält, wobei die Zubereitung das Verhältnis R = R₀ aufweist, wobei R das Verhältnis der Konzentration an Lektin-Molekülen mit einem hohen Molekulargewicht über dem bestimmten Molekulargewicht zu der Konzentration an Lektin-Molekülen mit einem geringen Molekulargewicht kleiner oder gleich dem bestimmten Molekulargewicht ist, – Verwenden der Zubereitung in einem Isolierungsverfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei der feste Träger eine Standardsäule ist, an die ein Aminozucker in einer bestimmten Konzentration von 10 μmol pro ml entwässertem Harz bis 100 μmol pro ml entwässertem Harz gekoppelt ist, – Erhalten einer Zusammensetzung, welche die gewonnenen Lektin-Moleküle enthält.
Verfahren zum Trennen einer Zusammensetzung, welche eine Vielzahl von MBL-Molekülen umfasst, wobei im Wesentlichen alle die MBL-Moleküle ein hohes Molekulargewicht über einem bestimmten Molekulargewicht aufweisen, von einer MBL-Zubereitung, welche MBL-Moleküle mit einem hohen Molekulargewicht über dem bestimmten Molekulargewicht und MBL-Moleküle mit einem geringen Molekulargewicht kleiner oder gleich dem Molekulargewicht für Dimer-Lektine aufweisen, wobei die Zubereitung das Verhältnis R = R₀ aufweist, wobei R das Verhältnis der Konzentration an MBL-Molekülen mit hohen Molekulargewicht über dem bestimmten Molekulargewicht zu der Konzentration an MBL-Molekülen mit einem geringen Molekulargewicht kleiner oder gleich dem bestimmten Molekulargewicht ist, wobei das Verfahren umfasst: – Erhalten der MBL-Zubereitung, – Verwenden der Zubereitung in einem Isolierungsverfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei der feste Träger ein Chromatographiesäulen-Harz ist, und wobei eine bestimmte Konzentration von 0,5 mg bis 500 mg Zuckerderivat pro ml Harz an den festen Träger gekoppelt ist, – Erhalten einer Zusammensetzung, welche die gewonnenen MBL-Moleküle umfasst.
Verfahren zur Herstellung einer Zusammensetzung, welche eine Vielzahl an MBL-Molekülen enthält, wobei im Wesentlichen alle die MBL-Moleküle ein geringes Molekulargewicht kleiner oder gleich einem bestimmten Molekulargewicht aufweisen, wobei das Verfahren umfasst: – Erhalten einer MBL-Zubereitung, welche Lektin-Moleküle mit einem hohen Molekulargewicht über dem bestimmten Molekulargewicht und Lektin Moleküle mit einem geringen Molekulargewicht kleiner oder gleich dem bestimmten Molekulargewicht aufweisen, wobei die Zubereitung das Verhältnis R = R₀ aufweist, wobei R das Verhältnis der Konzentration der Lektin-Moleküle mit einem hohen Molekulargewicht über dem bestimmten Molekulargewicht zu der Konzentration an Lektin-Molekülen mit einem geringen Molekulargewicht kleiner oder gleich dem bestimmten Molekulargewicht ist, – Verwenden der Zubereitung in einem Isolierungsverfahren nach einem der Ansprüche 1-9, wobei der feste Träger eine Chromatographiesäulen-Harz ist, und wobei eine bestimmte Konzentration von 0,1 mg bis 1000 mg Zuckerderivat pro ml Harz an den festen Träger gekoppelt ist, – Erhalten einer Zusammensetzung, welche die ungebundenen MBL-Moleküle der Waschflüssigkeit umfasst.
Verfahren zur Erhöhung des Verhältnisses R einer Zubereitung, welche eine Vielzahl von MBL-Molekülen umfasst, wobei R das Verhältnis der Konzentration an MBL mit einer mittleren Molekularmasse zu der Konzentration an MBL-Molekülen mit hoher Molekularmasse und einer niedrigen Molekularmasse ist, wobei die mittlere Molekularmasse ein Molekulargewicht unter einem ersten bestimmten Molekulargewicht und über einem zweiten bestimmten Molekulargewicht ist, wobei die hohe Molekularmasse eine Molekularmasse grösser oder gleich dem ersten bestimmten Molekulargewicht ist, und die niedrige Molekularmasse eine Molekularmasse kleiner oder gleich dem zweiten bestimmten Molekulargewicht ist, wobei das Verfahren die Schritte umfasst: a) Erhalten einer Lektin-Zubereitung, welche Lektin mit geringer Molekularmasse, Lektin mit mittlerer Molekularmasse und Lektin mit hoher Molekularmasse umfasst, wobei die Zubereitung das Verhältnis R = R₀ aufweist, b) Verwenden der Zubereitung in einem Isolierungsverfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, und c) Erhalten einer Zusammensetzung, welche die gewonnenen Lektin Moleküle umfasst, und d) Wiederholen des Schritt b) unter Verwendung eines festen Trägers mit unterschiedlicher Konzentration an Aminozucker.
Verfahren nach Anspruch 15, wobei mindestens 50% des MBL mit hoher Molekularmasse der Zusammensetzung ein Molekulargewicht über 200 kDa aufweist, wie über 225 kDa, wie über 250 kDa, wie über 300 kDa.
Verfahren nach Anspruch 15, wobei das MBL mit geringem Molekulargewicht MBL mit einem Molekulargewicht unter 200 kDa aufweist.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die MBL-Zubereitung eine rekombinante MBL Zubereitung ist.
Verfahren nach Anspruch 18, wobei die MBL-Zubereitung erhalten wird durch – Herstellen eines Genexpresssionskonstruktes, das humanes MBL-Peptid kodiert, – Transformieren einer Wirtzell-Kultur mit dem Konstrukt, – Züchten der Wirtzell-Kultur in einem Kulturmedium, wobei Expression und Sezernierung des Polypeptids in das Kulturmedium erhalten wird, – Erhalten einer Zubereitung, welche eine Vielzahl von MBL-Molekülen umfasst.
Verfahren nach Anspruch 19, wobei das Genexpressionskonstrukt mindestens eine Intron-Sequenz des humanen MBL-Gens aufweist.
Verfahren nach Anspruch 20, wobei das Genexpressionskonstrukt mindestens zwei Exon-Sequenzen des humanen MBL-Gens aufweist.
Verfahren nach Anspruch 19, wobei das Genexpressionskonstrukt eine cDNA aufweist, die eine MBL-Untereinheit kodiert.
Verfahren nach Anspruch 19, wobei die Wirtzell-Kultur in vitro gezüchtet wird.
Verfahren nach Anspruch 19, wobei die Wirtzell-Kultur eine eukaryotische Wirtzell-Kultur ist.
Verfahren nach Anspruch 19, wobei die Wirtzell-Kultur eine Säuger-Wirtzell-Kultur ist.
Fester Träger, wobei der feste Träger ein Chromatographiesäulen-Harz ist, und wobei der feste Träger kovalent gekoppelt daran eine bestimmte Konzentration von 0,1 mg bis 1000 mg Aminozucker pro ml Harz von mindestens einem Aminozucker mit einer primären Aminogruppe aufweist, welche ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Mannosamin, Glucosamin, Galactosamin, Fructosamin, D-Mannosamin, D-Glucosamin, L-Galactosamin und L-Fucosamin und wobei der Aminozucker über die Aminogruppe an den festen Träger gekoppelt ist.
Fester Träger nach Anspruch 26, wobei der Aminozucker ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus D-Mannosamin und D-Glucosamin.
Fester Träger nach Anspruch 26, wobei die Säule ausgewählt ist unter aktivierten N-Hydroxysuccinimid-Harzen, aktivierten Cyanogenbromid-Harzen, aktivierten Epoxy-Harzen, ECH Sepharose 4B von APBiotech und aktiviertem CH-Sepharose 4B von AP-Biotech.