ES2254759T3 - Aislamiento de lectinas. - Google Patents

Abstract

Un método para aislar al menos una lectina de unión a manosa (MBL) a partir de una preparación que comprende una variedad de moléculas de lectina, que comprende - establecer un soporte sólido que está derivatizado con al menos un aminoazúcar que tiene un grupo amino primario dispuesto como parte reactiva en una parte de la molécula y un sitio de unión a MBL en otra parte de la molécula, y en el que dicho aminoazúcar está acoplado mediante el grupo amino al soporte sólido, - aplicar la preparación a dicho soporte sólido, - permitir que las lectinas se unan al derivado de azúcar acoplado al soporte sólido, - lavar el soporte sólido con un líquido de lavado retirando los contaminantes no unidos, y - recuperar opcionalmente dicha(s) lectina(s) a partir del soporte sólido.

Description

Aislamiento de lectinas.

La invención se refiere a un proceso para aislar una composición de lectina, que comprende en particular la lectina de unión a manosa (MBL), adecuado para utilizar lectinas producidas recombinantemente como material de partida, así como a métodos para enriquecer una preparación de lectina con respecto a lectinas de alto peso molecular.

Antecedentes de la invención

Las lectinas son proteínas caracterizadas por la presencia de un dominio de unión a carbohidrato. Las colectinas son un grupo de lectinas que comprenden una estructura oligomérica de subunidades, teniendo cada subunidad un dominio de unión a carbohidrato. Las lectinas in vivo están representadas por una variedad de series de subunidades que conducen a poblaciones de lectinas de diferente masa molecular.

La MBL es una proteína de la familia de la colectina y está caracterizada por una estructura oligomérica de subunidades consistente cada una en un dominio de reconocimiento de carbohidrato de tipo C (CRD) dependiente de calcio, unido a un bastón de colágeno. La MBL activa el sistema de complemento mediante serinproteasas asociadas (MASP- serinproteasas asociadas a lectina de unión a manosa), concretamente mediante un mecanismo similar a C1q. La proteína de unión a manosa (MBL) es una proteína para utilizar en terapia de sustitución o reemplazo en pacientes con deficiencia de MBL heredada o adquirida asociada a síntomas funcionales y/o clínicos.

La MBL derivada de plasma sanguíneo humano se ensambla en un oligómero de subunidades, consistente cada una en tres cadenas polipeptídicas idénticas. El número de subunidades en una molécula de MBL es variable [Lipscombe R.J. et al.,: "Distinct physicochemical characteristics of human mannose binding protein expressed by individuals of differing genotype", Immunology 85 (1995), 660-667], pero se ha sugerido que el polipéptido biológicamente activo es un oligómero que consiste en más de tres subunidades. El plasma comprende oligómeros de más de tres subunidades, así como formas de proteína desnaturalizadas y estructuralmente dañadas que, por ejemplo, conducen a bandas en geles SDS entre las bandas de MBL dominantes correspondientes a los oligómeros superiores.

La MBL producida recombinantemente revela una variación oligomérica similar a la MBL derivada de plasma [Vorup-Jensen, T. et al.: "Recombinant expression of human mannan-binding lectin", Int. Immunopharm. 1 (2001), 677-687]. Sin embargo, la MBL producida recombinantemente tiene habitualmente un contenido mayor de formas de masa baja de que la MBL derivada de plasma. Las formas de masa baja de MBL incluyen, por ejemplo, cadenas polipeptídicas sencillas, subunidades sencillas y subunidades diméricas.

Las lectinas se aíslan típicamente aplicando una composición que comprende las lectinas a una columna que se ha modificado con un azúcar al que se unen las lectinas. Sin embargo, la eficacia de las columnas varía. En la solicitud PCT WO 00/70043, se describe un método para separar oligómeros de masa alta de las formas de masa baja, en el que se somete una MBL producida recombinantemente a fraccionamiento en una columna especial, en el que la columna como tal no tiene afinidad por la MBL.

Haurum et al., 1993, Biochem. J., 293: 873-878 describen las características de unión a carbohidrato de las colectinas SP-A, proteína de unión a manano (MBP) y conglutina. SP-A y MBP no se unen a glucosamina, manosamina ni galactosamina, en contraposición con la conglutina (tabla 1).

Kenneth et al., 1996, J. Biol. Chem. 271: 663-674 describen un análisis de la estructura de la unión a carbohidrato de la proteína de unión a manosa (MBP). El documento da a conocer que la MBP se une a una variedad de monosacáridos que incluye me-Man, N-acetilglucosamina, Me-fucosa y galactosa. El documento no discute la asociación con aminoazúcares.

Descripción de la invención

Es de gran importancia un método rápido y sencillo para aislar lectinas, tales como lectina de unión a manosa (MBL) o derivados y variantes de las mismas (designados colectivamente en la presente memoria como lectinas) de una solución.

Además, controlar la distribución de masas de las lectinas es también de gran importancia, porque diferentes oligómeros de dichos polipéptidos de lectina poseen diferentes funciones y actividad biológicas.

La presente invención describe un método para aislar lectinas, tales como MBL, aplicando la preparación a un soporte sólido que tiene acoplado al mismo una concentración predeterminada de un derivado de azúcar. El método puede utilizarse como operación unitaria durante la preparación, purificación y/o formulación de dicho polipéptido. Comparado con otros métodos, es ventajoso que el método de la invención pueda aplicarse para cambiar la composición de oligómeros de dicho polipéptido, de modo que los oligómeros de masa alta de dicho polipéptido se separan de los oligómeros de masa baja de dicho polipéptido, o los oligómeros de masa intermedia se separan de los oligómeros de masa alta y de los oligómeros de masa baja.

Por tanto, es un objetivo de la presente invención proporcionar un método para aislar al menos una lectina a partir de una preparación que comprende una variedad de moléculas de lectina, que comprende

establecer un soporte sólido que tiene acoplado al mismo una concentración predeterminada de un derivado de azúcar,

aplicar la preparación a dicho soporte sólido,

permitir que las lectinas se unan al derivado de azúcar acoplado al soporte sólido,

lavar el soporte sólido con un líquido de lavado retirando los contaminantes no unidos, y

recuperar opcionalmente dicha(s) lectina(s) a partir del soporte sólido.

Por el término "concentración predeterminada" se quiere indicar que se aplica un volumen predeterminado de derivado de azúcar que tiene una concentración predeterminada a un volumen o área predeterminado de soporte sólido, permitiendo que el derivado de azúcar se acople al soporte sólido. En una realización, el término significa que se acopla una concentración predeterminada de derivado de azúcar a un volumen o área predeterminado de soporte sólido.

Por el término "contaminante" se quiere indicar contaminantes en la preparación de lectina, así como lectinas que no están unidas al derivado de azúcar debido a su menor peso molecular. En particular, cuando se desean lectinas de peso molecular intermedio, los contaminantes pueden comprender las lectinas deseadas cuando se utilizan procedimientos de dos o más etapas como se discute a continuación. Por tanto, el término "contaminante" es sinónimo de material no unido, incluyendo lectinas no unidas.

Por el término "una variedad de moléculas de lectina", se quiere indicar preferiblemente una variedad de oligómeros de moléculas de lectina, teniendo dichas moléculas de lectina subunidades estructurales idénticas o sustancialmente idénticas, tales como se describen a continuación.

Es un segundo objetivo de la presente invención proporcionar dichos soportes sólidos, que tienen acoplados covalentemente a los mismos una concentración predeterminada de un derivado de azúcar, en los que el derivado de azúcar es preferiblemente un aminoazúcar.

En otro aspecto, la invención se refiere a un método para cambiar la distribución oligomérica de las lectinas en solución. Por tanto, en una realización la invención se refiere a un método para aumentar la relación R de una composición que comprende una variedad de moléculas de lectina, en el que R es la relación de la concentración de moléculas de lectina que tienen un peso molecular alto superior a un peso molecular predeterminado a la concentración de moléculas de lectina que tienen un peso molecular bajo menor o igual al peso molecular predeterminado, comprendiendo dicho método

obtener una preparación de lectina que comprende lectina de bajo peso molecular y lectina de alto peso molecular, teniendo dicha preparación la relación R = R_{0},

aplicar la preparación a un método de aislamiento, preferiblemente el método para aislar al menos una lectina a partir de una preparación descrito anteriormente en la presente memoria,

obtener una composición que comprende las moléculas de lectina recuperadas.

Así, se obtiene una composición que tiene un contenido aumentado de oligómeros de lectinas de masa alta en comparación con el material de partida.

En particular, el aumento de la relación conduce a composiciones que comprenden lectinas con un peso molecular superior al peso molecular para las lectinas diméricas. Por tanto, en otro aspecto, la invención se refiere a un método para producir una composición que comprende una variedad de moléculas de lectina, en el que sustancialmente todas dichas moléculas de lectina tienen un peso molecular superior a un peso molecular predeterminado para lectinas diméricas, comprendiendo dicho método

obtener una preparación de lectina que comprende moléculas de lectina que tienen un peso molecular alto superior al peso molecular predeterminado y moléculas de lectina que tienen un peso molecular bajo inferior o igual al peso molecular predeterminado, teniendo dicha preparación la relación R= R_{0}, en la que R es la relación de la concentración de moléculas de lectina que tienen un peso molecular alto superior al peso molecular predeterminado a la concentración de moléculas de lectina que tienen un peso molecular bajo inferior o igual al peso molecular predeterminado,

aplicar la preparación a un método de aislamiento, preferiblemente el método para aislar al menos una lectina a partir de una preparación descrito anteriormente en la presente memoria,

obtener una composición que comprende las moléculas de lectina recuperadas.

Puesto que el material de partida para los métodos comprende lectinas de masa alta así como lectinas de masa baja, la invención se refiere también a un método para separar una composición que comprende una variedad de moléculas de lectina, en la que sustancialmente todas dichas moléculas de lectina tienen un peso molecular alto superior a un peso molecular predeterminado, a partir de una preparación de lectina que comprende moléculas de lectina que tienen un peso molecular alto superior al peso molecular predeterminado y moléculas de lectina que tienen un peso molecular bajo inferior o igual al peso molecular de lectinas diméricas, teniendo dicha preparación la relación R= R_{0}, en la que R es la relación de la concentración de moléculas de lectina que tienen un peso molecular alto superior al peso molecular predeterminado a la concentración de moléculas de lectina que tienen un peso molecular bajo inferior o igual al peso molecular predeterminado, comprendiendo dicho método

obtener dicha preparación de lectina,

aplicar la preparación para un método de aislamiento, preferiblemente el método para aislar al menos una lectina a partir de una preparación descrito anteriormente en la presente memoria,

obtener una composición que comprende las moléculas de lectina recuperadas.

Para la mayoría de los fines, las lectinas de masa alta son las deseadas; sin embargo, para algunas aplicaciones se quieren la lectinas de masa baja y, en consecuencia, la invención se refiere adicionalmente a un método para producir una composición que comprende una variedad de moléculas de lectina en la que sustancialmente todas dichas moléculas de lectina tienen un peso molecular bajo inferior o igual a un peso molecular predeterminado, comprendiendo dicho método,

obtener una preparación de lectina que comprende moléculas de lectina que tienen un peso molecular alto superior al peso molecular predeterminado y moléculas de lectina que tienen un peso molecular bajo inferior o igual al peso molecular predeterminado, teniendo dicha preparación la relación R= R_{0}, en la que R_{0} es la relación de la concentración de moléculas de lectina que tienen un peso molecular alto superior al peso molecular predeterminado a la concentración de moléculas de lectina que tienen un peso molecular bajo inferior o igual al peso molecular predeterminado,

aplicar la preparación a un método de aislamiento, preferiblemente el método para aislar al menos una lectina a partir de una preparación descrito anteriormente en la presente memoria,

obtener una composición que comprende las moléculas de lectina no unidas del líquido de lavado.

Para todos los métodos citados anteriormente, la composición de moléculas de lectina recuperadas tiene preferiblemente la relación R= R_{1}, en la que R_{1} es al menos 1, tal como al menos 1,05, tal como al menos 1,10, tal como al menos 1,15, tal como al menos 1,25, tal como al menos 1,50, tal como al menos 1,75, tal como al menos 2,0, tal como al menos 2,5, tal como al menos 3,0, tal como al menos 4,0, tal como al menos 5,0, tal como al menos 6,0, tal como al menos 7,0, tal como al menos 8,0, tal como al menos 9,0, tal como al menos 10,0, tal como al menos 15, tal como al menos 20, tal como al menos 30, tal como al menos 40, tal como al menos 50, tal como al menos 60, tal como al menos 70, tal como al menos 80, tal como al menos 90, tal como al menos 100, tal como al menos 1.000, tal como al menos 10.000.

Para todos los métodos descritos anteriormente, el peso molecular predeterminado es preferiblemente el peso molecular para lectinas diméricas, más preferiblemente para lectina triméricas.

Para la mayoría de los fines, las lectinas de masa alta son las deseadas; sin embargo, en ciertas realizaciones, pueden quererse lectinas de masa intermedia. En consecuencia, un aspecto adicional de la presente invención se refiere a un método para aumentar la relación R de una composición que comprende una variedad de moléculas de lectina, en el que R es la relación de la concentración de lectinas que tienen una masa molecular intermedia a la concentración de moléculas de lectina que tienen una masa molecular alta y una masa molecular baja,

en el que la masa molecular intermedia es un peso molecular inferior a un primer peso molecular predeterminado y superior a un segundo peso molecular predeterminado, la masa molecular alta es una masa molecular superior o igual al primer peso molecular predeterminado y la masa molecular baja es una masa molecular inferior o igual al segundo peso molecular predeterminado,

comprendiendo dicho método las etapas de obtener una composición de lectina que comprende lectina de masa molecular baja, lectina de masa molecular intermedia y lectina de masa molecular alta, teniendo dicha preparación la relación R= R_{0},

aplicar la composición a un método de aislamiento, preferiblemente el método para aislar al menos una lectina a partir de una preparación descrito anteriormente en la presente memoria; y

obtener una composición que comprende las moléculas de lectina recuperadas; y

repetir opcionalmente la etapa de aplicar la composición a un método de aislamiento, preferiblemente el método para aislar al menos una lectina a partir de una preparación descrito anteriormente en la presente memoria.

En una realización, el primer peso molecular predeterminado puede ser el peso molecular para lectinas heptaméricas, y el segundo peso molecular predeterminado es el peso molecular para lectinas diméricas.

En otro aspecto, la invención se refiere a un método para aislar al menos una lectina a partir de una preparación que comprende una variedad de moléculas de lectina, que comprende

establecer un soporte sólido que está derivatizado con al menos un aminoazúcar,

aplicar la preparación a dicho soporte sólido,

permitir que las lectinas se unan al aminoazúcar acoplado al soporte sólido,

lavar el soporte sólido con un líquido de lavado retirando los contaminantes no unidos, y

recuperar opcionalmente dicha(s) lectina(s) del soporte sólido.

Por el término "derivatizado" se quiere indicar que el aminoazúcar está acoplado al soporte sólido como se describe anteriormente.

La lectina según la invención puede ser cualquier lectina en la que se producen varias formas oligoméricas, por ejemplo, colectinas, tales como lectinas de unión a manosa. En particular, la invención se refiere a un método para producir composiciones de MBL. Por el término MBL se quiere indicar lectina de unión a manosa (o proteína de unión a manosa, como designan algunos autores). La MBL es preferiblemente MBL humana que tiene una secuencia proteica como se muestra, por ejemplo, en la solicitud PCT WO 00/70043 o derivados o variantes de la misma que son equivalentes funcionales de la MBL. A continuación, la invención se describirá con relación a la lectina MBL.

Los métodos según la presente invención permiten la fabricación a gran escala de las lectinas en cuestión. Por tanto, en otro aspecto la invención se refiere a cualquier método industrial o a gran escala de fabricación de MBL, que comprende la aplicación de dichos métodos durante la fabricación de dicha MBL.

Dibujos

La Figura 1 ilustra el perfil de elución de MBL producida recombinantemente aplicada a y eluida de una columna con D-manosamina inmovilizada como se describe en el ejemplo 1. La figura muestra una Western PAGE-SDS que utiliza anticuerpos monoclonales creados contra MBL derivada de plasma. PM= marcador (kDa), A= aplicación (MBL derivada recombinantemente antes del uso de la invención), R= fracción de lavado obtenida durante la aplicación; E= fracción de elución después de lavado con EDTA (MBL derivada recombinantemente después del uso de la invención).

La Figura 2 ilustra el perfil de elución de MBL producida recombinantemente aplicada a y eluida de una columna con D-manosamina inmovilizada como se describe en el ejemplo 2. La figura muestra una Western PAGE-SDS que utiliza anticuerpos monoclonales creados contra MBL derivada de plasma. "Ficticio": columna no acoplada a aminoazúcar. "Bajo-sub.": columna acoplada a una baja cantidad de aminoazúcar, "Alto-sub.": columna acoplada a una gran cantidad de aminoazúcar, "Alto-sub. R"= columna acoplada a una gran cantidad de aminoazúcar después de regeneración con NaOH, PM= marcador (kDa); A= aplicación, R= fracción de lavado obtenida durante la aplicación; E= fracción de elución después de lavado con EDTA, Pl= MBL derivada de plasma (control).

La Figura 3 ilustra el perfil de elución de MBL producida recombinantemente aplicada a y eluida de una columna con D-glucosamina inmovilizada a dos concentraciones, como se describe en el ejemplo 5. La figura muestra una Western PAGE-SDS que utiliza anticuerpos monoclonales creados contra MBL derivada de plasma. A= aplicación (MBL derivada recombinantemente antes del uso de la invención); R= fracción de lavado obtenida durante la aplicación; E= fracción de elución después de lavado con EDTA (MBL derivada recombinantemente después del uso de la invención); Pl= MBL derivada de plasma (control).

Descripción detallada de la invención Derivado de azúcar

En una realización preferida, el término derivado de azúcar significa un compuesto derivado de un azúcar, en el que el compuesto derivado posee la capacidad de acoplarse al soporte sólido de una manera orientada predeterminada. Los presentes inventores han identificado una de las razones por la que los métodos de aislamiento previos pueden carecer de eficacia. Por tanto, se ha encontrado que las lectinas se unen a sitios de unión específicos en los sacáridos, y cuando la técnica anterior utiliza azúcares acoplados a columna y otros soportes sólidos de manera aleatoria, un porcentaje de los sacáridos acoplados no son capaces de unirse a las lectinas puesto que los sitios de unión no están dispuestos para unión a lectina.

Por tanto, el derivado de azúcar según la presente invención comprende preferiblemente un grupo reactivo que permite el acoplamiento orientado al soporte sólido. El derivado de azúcar puede ser cualquier derivado capaz de unirse a la lectina cuando el derivado de azúcar se acopla al soporte sólido. Los derivados de azúcar no capaces de unirse a la lectina cuando el derivado está en forma libre, concretamente no acoplada, pueden utilizarse también según la invención, cuando son capaces de unirse a la lectina en forma acoplada.

La orientación predeterminada del azúcar puede obtenerse incorporando un grupo reactivo al azúcar, preferiblemente en una posición específica mediante la que sea posible acoplar el derivado de azúcar al soporte sólido de manera orientada específicamente, en la que el acoplamiento tiene lugar a través del grupo reactivo con el soporte sólido. Por tanto, por el término "acoplamiento orientado" se quiere indicar que el azúcar está acoplado al soporte sólido a través de un grupo predeterminado específico en la molécula de azúcar, de modo que la parte libre de la molécula de azúcar está orientada en una posición predeterminada.

En un monosacárido, el sitio de unión y el grupo reactivo se disponen en la misma estructura monosacárida; sin embargo, en disacáridos y oligosacáridos superiores y polisacáridos, el sitio de unión puede estar dispuesto en otra estructura monosacárida que el grupo reactivo. En el presente contexto, el término "estructura monosacárida" significa la estructura capaz de formar un anillo en el sacárido. Por ejemplo, un disacárido comprende dos estructuras monosacáridas. En una realización preferida, el grupo reactivo se dispone alejado del sitio de unión, obteniéndose así mejores posibilidades de tener un sitio de unión no impedido estéricamente.

Azúcares

El término derivado de azúcar significa cualquier compuesto que está derivado de un azúcar. En el presente contexto, azúcar significa cualquier carbohidrato, incluyendo monosacáridos, disacáridos, trisacáridos, oligosacáridos y polisacáridos, sea un anillo de cinco miembros (pentosa) o un anillo de seis miembros (hexosa) o combinaciones de los mismos, o sea una forma D o una forma L, así como sustancias derivadas de monosacáridos mediante reducción del grupo carbonilo (alditoles), mediante oxidación de grupos terminales a ácidos carboxílicos, o mediante reemplazo de grupos hidroxi por otro grupo. Incluye también derivados de estos compuestos.

Los monosacáridos incluyen polihidroxialdehídos H-[CHOH]_{n}-CHO y polihidroxicetonas H-[CHOH]_{n}-CO-
[CHOH]_{m}-H, concretamente aldosas, dialdosas, aldocetosas, cetosas, dicetosas, desoxiazúcares, aminoazúcares y sus derivados.

Las aldosas incluyen monosacáridos con un carbonilo aldehídico, concretamente polihidroxialdehídos H-[CHOH]_{n}
-CHO. Las aldosas incluyen también monosacáridos con un grupo carbonilo aldehídico potencial, un grupo hemiacetal, que surge del cierre de anillo de la aldosa.

Las cetosas incluyen monosacáridos con un grupo cetónico, concretamente polihidroxicetonas H-[CHOH]_{n}-CO-[CHOH]_{m}-H, concretamente las cetonas incluyen también monosacáridos con un grupo carbonilo cetónico potencial, un grupo hemicetal, que surge del cierre de anillo de la cetosa.

Las piranosas son hemiacetales cíclicos o hemicetales cíclicos con un tetrahidrofurano (anillo de cinco miembros).

Las furanosas son hemiacetales cíclicos o hemicetales cíclicos con un tetrahidrofurano (anillo de cinco miembros).

Las dialdosas, dicetosas, cetoaldosas (aldocetosas, aldosulosas) y alditoles son monosacáridos con más de un aldehído y/o cetona.

Los ácidos aldónicos y ácidos cetónicos son aldosas en los que el grupo aldehído se ha intercambiado por un grupo carboxi.

Son ejemplos de derivados de azúcares ácidos urónicos, aldosas en las que el primer grupo CH_{2}OH se ha intercambiado por un grupo carboxi; ácidos aldáricos, ácidos aldónicos en los que el primer grupo CH_{2}OH se ha intercambiado por un grupo carboxi; desoxiazúcares, monosacáridos en los que un grupo hidroxilo se ha intercambiado por un hidrógeno; aminoazúcares, monosacáridos en los que un grupo hidroxilo se ha intercambiado por un grupo amino.

También se incluyen glicosilaminas, que son aminoazúcares en los que el grupo hidroxilo en el grupo hemiacetal (formado después del cierre de anillo) se ha intercambiado por un grupo amino.

En el presente contexto, el término acetal se utiliza con su significado normal, concretamente, monosacáridos que surgen del cierre de anillo de aldosa o cetosa. Además, los glicósidos son acetales que surgen de la eliminación de agua entre el grupo hidroxi de hemiacetal y hemicetal de un monosacárido, oligosacárido y polisacárido y el grupo hidroxi de otro monosacárido, oligosacárido y polisacárido. Un enlace glicosídico es el enlace entre los monosacáridos en un glicósido.

En el presente contexto, el término azúcar, o cualquiera de los sacáridos y derivados citados en la presente memoria, incluye todas las diversas formas estéricas de los azúcares, incluyendo la forma D y la forma L, la forma \alpha y la forma \beta. Por tanto, como ejemplo, manosamina significa manosamina en cualquier forma estérica, incluyendo D-manosamina, L-manosamina y (D,L)-manosamina. Sólo cuando se utiliza una forma estérica específica se cita ésta, como por ejemplo la D-manosamina.

Derivados específicos

La invención se refiere en particular a derivados de azúcar que tienen un grupo reactivo seleccionado de grupos amino, en los que el grupo amino puede seleccionarse, por ejemplo, del grupo consistente en grupos amino primarios, grupos amino secundarios y grupos amino terciarios.

En particular, la invención se refiere al uso de aminoazúcares como derivado de azúcar. Los aminoazúcares pueden ser aminomonosacáridos, aminodisacáridos, aminooligosacáridos y aminopolisacáridos, en los que se incorpora al menos un grupo amino de manera que le permite actuar como grupo reactivo cuando se acopla el aminoazúcar al soporte sólido.

Son ejemplos de aminomonosacáridos adecuados:

aminoaldosas tales como manosamina, glucosamina, alosamina, altrosamina, ribosamina, arabinosamina, gulosamina, idosamina, galactosamina, talosamina, xilosamina, lixosamina. En particular, D-manosamina, D-glucosamina, D-alosamina, D-altrosamina, D-ribosamina, D-arabinosamina, L-gulosamina, L-idosamina, L-galactosamina, L-talosamina, L-xilosamina, L-lixosamina,

aminocetosas tales como sorbosamina, tagatosamina, psicosamina, fructosamina. En particular, D-sorbosamina, D-tagatosamina, L-psicosamina, L-fructosamina,

aminodesoxialdosas tales como derivados de fucosa, por ejemplo, fucosamina y fucosilamina, preferiblemente L-fucosamina.

En particular, en relación con el aislamiento de MBL, son adecuados los siguientes ejemplos de aminoazúcares: manosamina, glucosamina, galactosamina, fructosamina. En particular, D-manosamina, D-glucosamina, L-galactosamina, L-fucosamina.

Más preferiblemente, pueden utilizarse aminoazúcares seleccionados del grupo consistente en glucosamina y manosamina, lo más preferiblemente aminoazúcares seleccionados del grupo consistente en L-fucosamina, D-glucosamina y D-manosamina, en particular D-glucosamina y D-manosamina. La fórmula de la D-manosamina se indica a continuación en la presente memoria como D-manosamina libre y como D-manosamina unida a una resina.

1

También pueden utilizarse disacáridos, oligosacáridos y polisacáridos que tienen un grupo amino dispuesto como grupo reactivo en una parte de la molécula y un sitio de unión a lectina, en particular un sitio de unión a MBL, en otra parte de la molécula.

Por ejemplo, el aminoazúcar puede ser cualquier derivado disacárido que comprende un grupo amino, en el que al menos una de las subunidades monosacáridas del disacárido se selecciona del grupo consistente en manosa y glucosa. Los ejemplos de disacáridos preferidos incluyen derivados de sacarosa, tales como sacarosamina, y derivados de maltosa, tales como maltosamina, que comprenden un grupo amino, así como agarosamina, celulosamina y amilosamina. Es un derivado disacárido preferido la sacarosamina.

Además, el aminoazúcar puede ser, por ejemplo, un multímero de glucosamina, tal como un dímero de glucosamina, un oligómero de glucosamina o un polímero de glucosamina.

Soporte sólido

El soporte sólido puede ser cualquier soporte utilizado para capturar y/o aislar lectinas. Por tanto, el soporte sólido puede ser cualquier columna, filtro o partícula utilizado para aislamiento y purificación tales como resinas cromatográficas y partículas magnéticas.

Además, el soporte sólido puede ser una superficie capaz de unirse a la lectina, por ejemplo para análisis adicionales, tal como superficies de plástico y superficies de vidrio. Las superficies de plástico pueden seleccionarse, por ejemplo, del grupo consistente en placas de microvaloración, pocillos ELISA y placas de microvaloración activadas. Las placas de microvaloración activadas pueden ser, por ejemplo Covalink™ NH_{2} Primary Amine activada con cloruro de cianuro de Life Technologies.

En una realización de la presente invención, puede utilizarse con la invención cualquier soporte sólido capaz de unirse covalentemente a aminas, preferiblemente aminas primarias.

Pueden ser columnas útiles cualquiera de las columnas seleccionadas del grupo consistente en resinas activadas con N-hidroxisuccinimida (por ejemplo NHS-Sepharose 4 FF de APBiotech, Affi-Gel 10 de BioRad, Affi-Gel 15 de BioRad o Affi-Prep de BioRad), resinas activadas con bromuro de cianógeno (por ejemplo, Sepharose 4 FF activada con CNBr de APBiotech), ECH Sepharose 4B de APBiotech, CH-Sepharose 4B activada de AP-Biotech y resinas activadas con epoxi (tales como Sepharose 6B activada con epoxi), así como sus correspondientes resinas reticuladas.

Puede acoplarse una concentración predeterminada de un derivado de azúcar al soporte sólido según la presente invención. La concentración predeterminada del derivado de azúcar debería seleccionarse según qué peso molecular predeterminado sea deseable para la realización particular de la presente invención.

La concentración de derivado de azúcar se determina mediante dos factores:

1)

concentración de posiciones (brazos de ligando) sobre el soporte sólido capaces de acoplar un derivado de azúcar,

2)

concentración de derivado de azúcar por brazo de ligando.

La concentración de brazos de ligando por volumen de soporte sólido está determinada principalmente por el proceso de producción del soporte sólido, y puede controlarse acoplando un ligando marcado al soporte sólido.

La concentración de derivado de azúcar por brazo de ligando se regula regulando el volumen y la concentración de derivado de azúcar que se permite acoplar a los brazos de ligando.

En general, se utiliza una concentración predeterminada alta de derivado de azúcar cuando es deseable un peso molecular predeterminado relativamente bajo, y se utiliza una concentración predeterminada baja de derivado de azúcar cuando es deseable un peso molecular predeterminado relativamente alto.

La concentración predeterminada de derivado de azúcar puede determinarse, por ejemplo, mediante la cantidad de derivado de azúcar acoplada a una cantidad específica de dicho soporte sólido. Por ejemplo, cuando el soporte sólido es una resina de columna cromatográfica, la concentración predeterminada de derivado de monosacárido es preferiblemente de 0,1 mg de derivado de azúcar por ml de resina a 1.000 mg de derivado de azúcar por ml de resina, más preferiblemente entre 0,5 mg de derivado de azúcar por ml de resina y 500 mg de derivado de azúcar por ml de resina, aún más preferiblemente de 2 mg de derivado de azúcar por ml de resina a 100 mg de derivado azúcar por ml de resina.

En el presente contexto, es un estándar para el soporte sólido una resina Sepharose reticulada modificada con restos N-hidroxisuccinimida (NHS), como se describe en los ejemplos. Preferiblemente, se utilizan 15-25 \mumol de brazo de ligando por ml de resina desecada. Dicho soporte sólido se especifica que es capaz de unir 5 \mumol de dipéptido por ml de resina desecada, o 1-2 \mumol de alfa-quimotripsinógeno por ml de resina desecada.

A partir de este soporte sólido estandarizado, se dan los intervalos para la concentración predeterminada de derivado de azúcar para acoplar con la resina para obtener las lectinas deseadas de la variedad de lectinas.

El aislamiento de lectinas de alto peso molecular como se define en la presente memoria que tengan un peso molecular superior a las lectinas diméricas se obtiene utilizando la columna estándar, habiéndose acoplado a la misma un derivado de azúcar en una concentración predeterminada de 10 \mumol por ml de resina desecada a 100 \mumol por ml de resina desecada, tal como de 20 \mumol por ml de resina desecada a 80 \mumol por ml de resina desecada, tal como de 30 \mumol por ml de resina desecada a 70 \mumol por ml de resina desecada, tal como de 40 \mumol por ml de resina desecada a 60 \mumol por ml de resina desecada. Para los monosacáridos, dichas concentraciones corresponden a 2 mg por ml de resina desecada a 20 mg por ml de resina desecada, tal como de 4 mg por ml de resina desecada a 16 mg por ml de resina desecada, tal como de 6 mg por ml de resina desecada a 14 mg por ml de resina desecada, tal como de 8 mg por ml de resina desecada a 12 mg por ml de resina desecada.

El aislamiento de lectinas de alto peso molecular como se definen en la presente memoria que tengan un peso molecular superior al de lectinas triméricas se obtiene utilizando la columna estándar, habiéndose acoplado a la misma un derivado de azúcar en una concentración predeterminada de 10 \mumol por ml de resina desecada a 80 \mumol por ml de resina desecada, tal como de 20 \mumol por ml de resina desecada a 70 \mumol por ml de resina desecada, tal como de 30 \mumol por ml de resina desecada a 70 \mumol por ml de resina desecada, tal como de 40 \mumol por ml de resina desecada a 60 \mumol por ml de resina desecada.

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El aislamiento de lectinas de alto peso molecular como se definen en la presente memoria que tienen un peso molecular superior al del lectinas tetraméricas se obtiene utilizando la columna estándar, habiéndose acoplado a la misma un derivado de azúcar en una concentración predeterminada de 10 \mumol por ml de resina desecada a 60 \mumol por ml de resina desecada, tal como de 20 \mumol por ml de resina desecada a 60 \mumol por ml de resina desecada, tal como de 30 \mumol por ml de resina desecada a 50 \mumol por ml de resina desecada.

Se produce un soporte sólido rico en ligando capaz de unirse también a lectinas de bajo peso molecular, tales como lectinas diméricas, utilizando la columna estándar y habiéndose acoplado a la misma un derivado de azúcar en una concentración predeterminada superior a 200 \mumol por ml de resina desecada, tal como superior a 300 \mumol por ml de resina desecada, tal como superior a 400 \mumol por ml de resina desecada, tal como superior a 500 \mumol por ml de resina desecada.

Líquido de lavado

El líquido de lavado según la presente invención puede ser cualquier líquido de lavado adecuado conocido por el experto en la técnica. En particular, el tampón puede comprender uno o más componentes capaces de interferir con la asociación entre la lectina y el derivado de azúcar, tal como el aminoazúcar.

En una realización de la presente invención, el líquido de lavado comprende uno o más componentes seleccionados del grupo consistente en azúcares capaces de unirse a la lectina, derivados de azúcar capaces de unirse a la lectina y agentes quelantes de ión metálico divalente.

Los azúcares y/o derivados de azúcar capaces de unirse a la lectina pueden ser, por ejemplo, cualquier monosacárido y/o derivado de monosacárido capaz de unirse a la lectina. Por ejemplo, puede estar comprendido en el líquido de lavado cualquier derivado de azúcar útil para acoplarse al soporte sólido según la presente invención (véase anteriormente en la presente memoria) o un azúcar no derivatizado correspondiente, o un azúcar correspondiente modificado adicionalmente.

Dichos monosacáridos pueden seleccionarse, por ejemplo, del grupo consistente en manosa, N-acetilmanosamina, glucosa, N-acetilglucosamina, frucosa, N-acetilfrucosamina, galactosa y N-acetilgalactosamina. En particular, los monosacáridos pueden seleccionarse del grupo consistente en D-glucosa, D-manosa, L-fucosa y L-galactosa.

Los azúcares y/o derivados de azúcar capaces de unirse a la lectina pueden ser también cualquier disacárido, derivado de disacárido, trisacárido, derivado de trisacárido, oligosacárido, derivado de oligosacárido, polisacárido, o derivado de polisacárido, en los que al menos parte del azúcar es capaz de unirse a la lectina. Los ejemplos de oligosacáridos útiles incluyen, pero sin limitación, sacarosa y maltosa.

Los agentes quelantes de ión metálico divalente son cualquier agente capaz de quelar un ión metálico divalente. El ión metálico divalente puede ser, por ejemplo, Ca^{2+}. Los ejemplos de quelantes de ión metálico divalente incluyen, pero sin limitación, EDTA y citrato.

Además, el líquido de lavado puede prepararse de cualquier otra manera adecuada para la elución de lectinas conocida por el experto en la técnica. Por ejemplo, el líquido de lavado puede comprender una concentración salina alta o un pH ácido.

Lectinas

Las lectinas aisladas según la presente invención pueden ser cualquier lectina. Por ejemplo, la lectina puede ser una colectina, tal como por ejemplo MBL (lectina de unión a manosa), SP-A (proteína tensioactiva pulmonar A), SP-D (proteína tensioactiva pulmonar D), BK (o BC, conglutinina bovina) y CL-43 (colectina 43). Las colectinas exhiben todas la siguiente arquitectura: tienen una región N-terminal rica en cisteína que parece formar enlaces disulfuro intercatenarios, seguida de una región similar a colágeno, una región enrollada en hélice \alpha y finalmente un dominio de lectina de tipo C, que es la región reconocedora del patrón y se designa como el dominio de reconocimiento de carbohidrato (CRD). El nombre colectina deriva de la presencia de dominios tanto de colágeno como de lectina. La región enrollada en hélice \alpha inicia la trimerización de los polipéptidos individuales para formar triples hélices de colágeno, generando así subunidades de colectina consistentes cada una en 3 polipéptidos individuales, mientras que la región N-terminal media la formación de oligómeros de subunidades. Las diferentes colectinas exhiben distintas estructuras de orden superior, típicamente tetrámeros de subunidades o hexámeros de subunidades.

En una realización preferida de la presente invención, la lectina es MBL o ficolina; en una realización más preferida, la lectina es MBL.

El término lectinas puede ser lectinas de origen natural así como variantes de las mismas tales como mutantes, siendo capaces dichas variantes de unirse a un azúcar.

En particular, la invención es adecuada para aislar MBL, que se discutirá más completamente a continuación como ejemplo de la invención, y no como limitación de la invención.

Las lectinas según la presente invención pueden comprender una o más subunidades. En particular, las colectinas tales como MBL pueden comprender una o más subunidades, y cada subunidad de una colectiona consiste normalmente en 3 polipéptidos individuales. Por ejemplo, las colectinas tales como MBL pueden ser monómeros, dímetros, trímeros, tetrámeros, pentámeros, hexámeros, heptámeros, octámeros, nonámeros, decámeros, undecámeros, dodecámeros de subunidades, o las colectinas tales como MBL pueden comprender incluso más de 12 subunidades.

Composición

La relación R discutida en la presente memoria puede calcularse utilizando cualquier método adecuado. En una realización preferida, podría hacerse una estimación cuantitativa del valor de R del modo siguiente:

Se escanea la inmunotransferencia PAGE-SDS en un fichero TIFF, u otro fichero de mapa de bits no comprimido. Se mide la densidad de píxel a lo largo de las bandas de muestra con un programa de evaluación fotográfica tal como Scion Image for Windows 4.0 (Scion Corporation, versión beta freeware en www.scioncorp.com) y se exporta a un programa de evaluación de datos (como Excel).

Se fija la migración correspondiente al peso molecular predeterminado a partir de la migración de los marcadores. En una realización preferida, el peso molecular predeterminado es el peso molecular de la lectina dimérica (para MBL, aproximadamente 200 kDa) y, en consecuencia, la migración correspondiente a la lectina dimérica puede fijarse a partir de la migración de marcadores (por ejemplo, Precision Protein Standards, BioRad). Se calcula el valor de R como la señal de píxel total por encima del punto de migración de referencia (para MBL dimérica, 200 kDa), dividida entre la señal de píxel total por debajo del punto de migración de referencia (para MBLS dimérica, 200 kDa). R_{0} se define como la relación en el material de partida, mientras que R_{1} es la relación a lo largo de la línea de evaluación correspondiente en la muestra de lectina recuperada después de la actuación de un método según la presente invención.

El grado de aumento de la relación R depende del material de partida que tiene la relación R_{0}, siendo el material de partida la preparación de lectina, por ejemplo una preparación de MBL. Se prefiere que al menos un 50% de la lectina de alto peso molecular de la composición tenga un peso molecular superior al peso molecular para lectinas diméricas, preferiblemente superior al peso molecular para lectinas triméricas. Cuando la lectina es MBL, se prefiere por tanto que al menos un 50% de la MBL de alto peso molecular de la composición tenga un peso molecular superior a 200 kDa, tal como superior a 225 kDa, tal como superior a 250 kDa, tal como superior a 300 kDa.

Al producir una composición de MBL según la presente invención, preferiblemente la composición de MBL está sustancialmente libre de cualquier impureza asociada naturalmente a la MBL cuando se produce en un organismo hospedador nativo, por ejemplo, impurezas asociadas a MBL cuando la MBL se purifica a partir de MBL plasmática.

El método puede utilizarse para producir composiciones de MBL de masa alta a partir de cualquier fuente de MBL, tal como cualquier MBL recombinante de mamífero o de plasma. Sin embargo, la fuente de MBL es preferiblemente MBL recombinante, más preferiblemente la MBL de la composición es humana, tal como MBL en la que la subunidad MBL está ensamblada en tres secuencias peptídicas que comprenden las secuencias mostradas en la SEC ID Nº 1 en la solicitud PCT WO 00/70043 o un equivalente funcional de las mismas.

Producción recombinante

Aunque el método puede aplicarse a cualquier material de partida de lectina que tenga tanto lectina de masa baja como alta, tal como MBL, es particularmente adecuado para producir lectina de masa alta, tal como MBL, a partir de una preparación producida recombinantemente.

Por tanto, la preparación de MBL es preferiblemente una preparación recombinante, en la que la preparación de MBL se obtiene:

-

preparando un constructo de expresión génica que codifica un péptido MBL humano o un equivalente funcional del mismo,

-

transformar un cultivo de célula hospedadora con el constructo,

-

cultivar el cultivo de célula hospedadora en un medio de cultivo, obteniendo así la expresión y secreción del polipéptido en el medio de cultivo,

-

obtener una preparación que comprende una variedad de moléculas de MBL.

Según la invención, las secuencias del gen MBL pueden ser del gen MBL humano o de genes MBL de otras especies animales en las que el sistema inmune está actuando a este respecto como el sistema inmune humano. Se describe un ejemplo de una realización preferida de una preparación de una MBL recombinante según la invención en el ejemplo 1 de la solicitud PCT WO 00/70043, que se incorpora a la presente memoria como referencia. En el ejemplo, la MBL recombinante se prepara mediante el uso de un vector de expresión que comprende secuencias del gen MBL humano.

La invención se refiere también al uso de vectores de expresión que comprenden secuencias que son derivados funcionales de las secuencias del gen MBL humano. Por dichos derivados funcionales se quieren indicar secuencias que contienen alteraciones de pares de bases que conducen a diferencias no funcionales o esencialmente no funcionales del vector de expresión, y la MBL preparada de este modo tiene una funcionalidad comparable con la MBL preparada mediante el uso de un vector de expresión que comprende las secuencias inalteradas del gen MBL humano.

Además del método de purificación, se prefiere que el constructo de expresión génica y la célula hospedadora favorezcan también la producción de oligómeros superiores. En consecuencia, el constructo de expresión génica comprende preferiblemente al menos una secuencia de intrón del gen MBL humano o un equivalente funcional del mismo. Además, el constructo de expresión génica puede comprender al menos dos secuencias de exón del gen MBL humano o un equivalente funcional del mismo. Más preferiblemente, el constructo de expresión génica comprende al menos tres secuencias de exón del gen MBL humano o un equivalente funcional del mismo. Cuando comprende más de un exón, las secuencias de exón están preferiblemente alineadas como en el gen MBL humano.

Aunque se prefiere que la secuencia comprenda secuencias de intrón, para algunas aplicaciones puede ser conveniente que el constructo de expresión comprenda una secuencia de ADNc que codifica una subunidad MBL o un equivalente funcional de la misma.

La invención se caracteriza por el uso de constructos de expresión del gen MBL en lugar de constructos de ADNc de MBL para la expresión de MBLr en estirpes celulares de mamíferos o animales transgénicos para obtener MBL recombinante con propiedades estructurales en condiciones no desnaturalizantes y desnaturalizantes que son sustancialmente similares a las de MBL humana natural. Por "MBL humana recombinante" se quiere indicar MBL humana que se expresa a partir de ácidos nucleicos modificados por ingeniería genética, y por "constructos de expresión del gen MBL" se quiere indicar un vector de expresión adecuado para expresión en estirpes celulares de mamífero, y que contiene secuencias de exón y al menos una secuencia de intrón del gen MBL humano o de genes MBL de otras especies animales tales como, pero sin limitación, chimpancés y monos Rhesus.

Preferiblemente, las secuencias de ADN codifican una secuencia polipeptídica como se muestra en la SEC ID Nº 1 de la solicitud de patente WO 00/70043 o un equivalente funcional, en la que un equivalente funcional es como se define anteriormente. La SEC ID Nº 1 corresponde a la secuencia de MBL que tiene el número de acceso a la base de datos P11226. El equivalente puede obtenerse mediante una modificación de la secuencia peptídica mostrada en la SEC ID Nº 1, tal como una secuencia que procesa una propiedad correspondiente a las secuencias citadas en la presente invención, pero en la que uno o más aminoácidos se han sustituido por otros. Preferiblemente, un equivalente funcional contiene sustituciones conservativas, concretamente, en las que uno o más aminoácidos están sustituidos por un aminoácido que tiene propiedades similares, de tal modo que un experto en la técnica de la química de proteínas esperaría que la estructura secundaria y terciaria de la proteína no cambiara. Los aminoácidos adecuados para sustituciones conservativas incluyen aquellos que tienen cadenas laterales funcionalmente similares. Por ejemplo, los restos hidrófobos, por ejemplo, glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina y metionina, pueden reemplazar a otro de dichos restos. De forma similar, las sustituciones conservativas pueden implicar intercambiar restos hidrófilos (por ejemplo arginina y lisina, glutamina y asparagina, treonina y serina), restos básicos (por ejemplo lisina, arginina e histidina) y/o restos ácidos (por ejemplo ácido aspártico y ácido glutámico). Los equivalentes funcionales pueden modificarse también, o como alternativa, por ejemplo mediante la deleción o adición de aminoácidos, o la modificación química de aminoácidos, siempre que se conserve la función del polipéptido.

El péptido MBL aislado, incluyendo cualquier equivalente funcional del mismo, puede comprender en una realización al menos 80 restos aminoacídicos, tal como al menos 100 restos aminoacídicos, tal como al menos 150 restos aminoacídicos, tal como al menos 200 restos aminoacídicos, por ejemplo al menos 220 restos aminoacídicos, tal como al menos 250 restos aminoacídicos.

En una realización preferida, el vector de expresión es adecuado para expresión en estirpes de célula de mamífero o animales transgénicos que contienen secuencias de exón y al menos una secuencia de intrón del gen MBL humano o de genes MBL de otras especies animales tales como, pero sin limitación, chimpancés y monos Rhesus. En una realización, el cultivo de célula hospedadora se cultiva en un animal transgénico. Por un animal transgénico en este contexto, se quiere indicar un animal que se ha modificado genéticamente para contener y expresar el gen MBL humano o fragmentos o imitaciones del mismo.

En una realización preferida, el constructo de expresión de la presente invención comprende un vector basado en virus, tal como un vector basado en virus de ADN, un vector basado en virus de ARN o un vector basado en virus quimérico. Son ejemplos de virus de ADN citomegalovirus, herpesvirus simplex, virus de Epstein-Barr, virus de simio 40, papilomavirus bovino, virus adenoasociados, adenovirus, virus Vaccinia y baculovirus.

En células hospedadoras de mamífero, pueden utilizarse una serie de sistemas de expresión basados en virus. En los casos en que se utilice un adenovirus como vector de expresión, la molécula de ácido nucleico de la invención puede estar ligada a un complejo de control de la transcripción/traducción de adenovirus, por ejemplo, el promotor tardío y la secuencia líder tripartita. Este gen quimérico puede insertarse después en el genoma de adenovirus mediante recombinación in vitro o in vivo. La inserción en una región no esencial del genoma vírico (por ejemplo, la región E1 o E3) dará como resultado un virus recombinante que es viable y capaz de expresar un producto del gen MASP-3 en hospedadores infectados (por ejemplo, véase Logan y Shenk, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 3655-3659, 1984). Pueden requerirse también señales de iniciación específicas para una traducción eficaz de las moléculas de ácido nucleico insertadas. Estas señales incluyen el codón de iniciación ATG y secuencias adyacentes. En los casos en que se inserta el gen o ADNc entero, incluyendo su propio codón de iniciación y secuencias adyacentes, en el vector de expresión adecuado, pueden no necesitarse señales de control de la traducción adicionales. Sin embargo, en los casos en que sólo se inserta una porción de la secuencia de codificación, deben proporcionarse señales de control de la traducción exógenas incluyendo, quizás, el codón de iniciación ATG. Además, el codón de iniciación debe estar en fase con el marco de lectura de la secuencia de codificación deseada para asegurar la traducción del inserto completo. Estas señales de control de la traducción y codones de iniciación exógenos pueden ser de una variedad de orígenes, tanto natural como sintético. La eficacia de la expresión puede potenciarse mediante la inclusión de elementos potenciadores de la transcripción apropiados, terminadores de transcripción, etc. (véase Bittner et al., Methods in Enzymol. 153: 516-544, 1987).

Son ejemplos de virus de ARN virus del bosque Semliki, virus Sindbis, virus Poko, virus de la rabia, virus de la gripe, SV5, virus respiratorio sincitial, virus de la encefalitis equina venezolana, virus Kunjin, virus Sendai, virus de la estomatitis vesicular y retrovirus.

Son ejemplos de virus quiméricos adenovirus, virus Sindbis y adenovirus-virus adenoasociados.

Respecto a vectores específicos, se hace referencia a Makrides, S.C., "Components of vectors for Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells", que se incorpora a la presente memoria como referencia.

En particular, se utiliza un origen de replicación del virus de Epstein-Barr o derivados funcionales o imitaciones del mismo, incluyendo el vector pREP9.

En un aspecto, la invención proporciona un constructo de expresión que codifica MBL humana, caracterizado porque comprende una o más secuencias de intrón del gen MBL humano, incluyendo derivados funcionales del mismo. Adicionalmente, contiene una región promotora seleccionada de genes de virus o eucariontes, incluyendo mamíferos e insectos.

La región promotora se selecciona preferiblemente por ser diferente del promotor MBL humano; y preferiblemente para optimizar el rendimiento de la MBL y la distribución de tamaño de los oligómeros de MBL, la región promotora se selecciona para funcionar lo más óptimamente con el vector y las células hospedadoras en cuestión.

En una realización preferida, se selecciona la región promotora de un grupo que comprende promotor de la repetición terminal larga del virus del sarcoma de Rous y promotor inmediato temprano de citomegalovirus y promotor \alpha del factor de elongación 1.

En otra realización, la región promotora se selecciona de genes de microorganismos, tales como otros virus, levaduras y bacterias.

Para obtener un rendimiento mayor de la MBL recombinante, la región promotora puede comprender elementos potenciadores, tales como el elemento QBI SP163 de la región no traducida del extremo 5' del gen del factor de crecimiento endotelial vascular de ratón. Se utiliza el constructo para transformar una célula hospedadora, obteniéndose un cultivo de célula hospedadora capaz de expresar MBL. El cultivo de célula hospedadora es preferiblemente un cultivo de célula hospedadora eucariótica. Transformación de un cultivo de célula eucariótica significa en este contexto la introducción de ADN recombinante en las células. El constructo de expresión utilizado en el proceso se caracteriza por tener la región de codificación de MBL seleccionada de genes de mamífero, incluyendo genes humanos y genes con gran parecido con estos tales como los genes de chimpancé. El constructo de expresión utilizado se caracteriza además porque la región promotora está seleccionada de genes de virus o eucariontes, incluyendo células de mamífero y células de insectos.

El procedimiento para producir MBL recombinante según la invención se caracteriza porque el cultivo de célula hospedadora es preferiblemente eucariótico, y por ejemplo un cultivo de célula de mamífero. Es un cultivo de célula hospedadora preferido un cultivo de células de riñón humano, y en una forma aún más preferida, el cultivo de célula hospedadora es un cultivo de células de riñón embrionario humano (células HEK). La invención se caracteriza por el uso de estirpes de células HEK 293 para la producción de MBL humana recombinante. Por "estirpes de células HEK 293" se quiere indicar cualquier estirpe celular derivada de tejido de riñón embrionario humano tal como, pero sin limitación, las estirpes celulares depositadas en la "American Type Culture Collection" con el número de acceso CRL-1573 y CL-10852.

Pueden ser otras células fibroblasto de embrión de pollo, células de ovario de hámster, células de riñón de hámster recién nacido, células de carcinoma cervical humano, células de melanoma humano, células de riñón humano, células de endotelio vascular umbilical humano, células de endotelio cerebral humano, células de tumor de cavidad oral humano, células de riñón de mono, fibroblasto de ratón, células de riñón de ratón, células de tejido conectivo de ratón, células oligodendrocíticas de ratón, macrófago de ratón, fibroblasto de ratón, células de neuroblastoma de ratón, células pre-B de ratón, células de linfoma B de ratón, células de plasmacitoma de ratón, células de teratocarcinoma de ratón, células de astrocitoma de rata, células de epitelio mamario de rata, células COS, CHO, BHK, 293, VERO, HeLa, MDCK, WI38 y NIH 3T3.

Además, puede elegirse una cepa de célula hospedadora que modula la expresión de las secuencias insertadas o modifica y procesa el producto génico de la forma específica deseada. Dichas modificaciones (por ejemplo glicosilación) y procesamiento (por ejemplo escisión) de los productos proteicos pueden ser importantes para la función de la proteína. Diferentes células hospedadoras tienen mecanismos característicos y específicos para el procesamiento post-traduccional y la modificación de proteínas y productos génicos. Pueden elegirse las estirpes celulares o sistemas hospedadores apropiados para asegurar la correcta modificación y procesamiento de la proteína extraña expresada. Con este fin, pueden utilizarse células hospedadoras eucarióticas que poseen la maquinaria celular para un procesamiento apropiado del transcripto primario, glicosilación y fosforilación del producto génico. Los tipos de célula de mamífero enumerados anteriormente están entre aquellos que podrían servir como células hospedadoras
adecuadas.

El cultivo de célula hospedadora puede cultivarse en cualquier medio de cultivo adecuado. Son ejemplos de medio de cultivo RPMI-1640 o DMEM suplementados, por ejemplo, con insulina, transferrina, selenio y suero bovino fetal.

Purificación

Como se discutió anteriormente, la presente invención permite una producción rápida de MBL. La producción de MBL puede realizarse mediante las siguientes etapas:

fermentación, cultivo de células que expresan MBL,

aislamiento, aplicación del método de la invención.

En consecuencia, la composición de lectina puede purificarse adicionalmente mediante cualquier medio adecuado, antes del aislamiento aplicando los métodos de la presente invención o después del aislamiento según el método de la invención. Por ejemplo, la composición de lectina puede purificarse adicionalmente mediante cualquier método de aislamiento fisicoquímico incluyendo, pero sin limitación, métodos de filtración, métodos de precipitación, cromatografía tal como intercambio iónico basado en la carga, permeación en gel basada en el tamaño, interacción hidrófoba basada en la hidrofobicidad, o cromatografía de afinidad.

Además, es posible aplicar los métodos según la presente invención más de una vez en un procedimiento de aislamiento. En particular, pueden aplicarse dos o más métodos diferentes según la presente invención en un procedimiento de aislamiento, en el que los métodos pueden diferir por la elección del soporte sólido, la elección del derivado de azúcar y/o la elección de la concentración predeterminada del derivado de azúcar acoplado al soporte sólido.

Por ejemplo, es posible realizar el aislamiento de lectinas utilizando en primer lugar un soporte sólido que tiene acoplado al mismo una primera concentración predeterminada de un derivado de azúcar, y realizando después el aislamiento de lectinas utilizando un soporte sólido que tiene acoplado al mismo una segunda concentración predeterminada de un derivado de azúcar, en el que la primera concentración predeterminada puede ser superior o puede ser inferior a la segunda concentración predeterminada.

En particular, cuando se aíslan lectinas de peso molecular intermedio, puede utilizarse un proceso de aislamiento de dos etapas que utiliza al menos dos soportes sólidos diferentes con dos concentraciones de derivado de azúcar diferentes. En un ejemplo de un proceso de aislamiento en dos etapas, las lectinas deseadas se obtienen en la fracción contaminante, concretamente la fracción no unida que tiene un peso molecular inferior al peso molecular predeterminado en la primera etapa, por ejemplo, cualquier lectina por debajo de heptámero. En la segunda etapa, la fracción no unida se aplica a un soporte sólido diferente que tiene otro punto de corte con respecto al peso molecular predeterminado, por ejemplo, que se une a cualquier lectina superior a un peso molecular dimérico. Así, se obtiene la composición de peso molecular intermedio deseada de trímeros, tetrámeros, pentámeros y hexámeros cuando se eluyen las lectinas unidas al segundo soporte sólido. Resulta evidente para el experto en la técnica que las dos etapas pueden realizarse por supuesto en orden inverso para obtener la misma composición.

Funcionalidad

La funcionalidad de la composición de MBL recombinante obtenida según la invención preferiblemente se asemeja a la funcionalidad de la MBL plasmática o sérica. En el presente contexto, la funcionalidad de MBL significa la capacidad de activar el sistema de complemento como se discute anteriormente con relación a equivalentes funcionales. La funcionalidad puede expresarse como la actividad específica de la MBL, tal como unidades de actividad MBL por ng de MBL. La funcionalidad de la composición de MBL recombinante expresada como actividad específica es preferiblemente al menos un 25% de la actividad específica de la MBL purificada a partir de suero, tal como al menos un 50% de la actividad específica de MBL purificada a partir de suero, más preferiblemente al menos un 75% de la actividad específica de MBL purificada a partir de suero.

La funcionalidad de la MBL puede estimarse por su capacidad de formar un complejo MBL/MASP que conduce a la activación del sistema de complemento. Cuando se escinde C4 mediante MBL/MASP, se expone un tioléster activo y C4 se une covalentemente a grupos nucleofílicos cercanos. Por tanto, una parte sustancial de C4b se unirá al pocillo de plástico, y puede detectarse mediante anticuerpo anti-C4.

Se construyó un TRIFMA cuantitativo para la actividad funcional de MBL mediante 1) recubrimiento de los pocillos de microvaloración con 1 mg de manano en 100 ml de tampón; 2) bloqueo con Tween-20; 3) aplicación de muestras de ensayo, por ejemplo, preparaciones de MBL diluidas; 4) aplicación de suero deficiente en MBL (esto conduce a la formación del complejo MBL/MASP); como alternativa, la MBL y el suero deficiente en MBL pueden mezclarse antes de la aplicación con los pocillos de microvaloración; 5) aplicar el factor de complemento C4 purificado a 5 mg/ml; 6) incubar durante 1 hora a 37ºC; 7) aplicar anticuerpo anti-C4 marcado con Eu; 8) aplicar solución de potenciación; y 9) leer el Eu mediante fluorometría de resolución temporal. Entre cada etapa, se incuba la placa a temperatura ambiente y se lava, excepto entre la etapa 8 y 9.

La estimación por ELISA puede llevarse a cabo de forma similar, por ejemplo, aplicando anti-C4 marcado con biotina en la etapa 7); 8) aplicar avidina marcada con fosfatasa alcalina; 9) aplicar sustrato; y 10) leer la intensidad de color. Puede construirse una curva de calibración utilizando diluciones de un plasma normal seleccionado. Con relación a la presente invención, el siguiente suero es un ejemplo de suero útil: colección de plasma LJ 6.57 28/04/97. La funcionalidad puede expresarse como la actividad específica de la MBL, tal como en unidades de actividad MBL por ng de MBL.

Otro ensayo para determinar un equivalente funcional de MBL es determinar la capacidad de unirse a receptor/receptores en células.

La interacción de MBL con receptor/receptores en células puede analizarse mediante citofluorimetría. 1) Se incuba MBL a una concentración de 50 \mug/ml con 2 x 10^{5} células. Se lleva a cabo la unión en solución salina tamponada con fosfato (PBS) que contiene 1% de FCS y 0,1% de azida de sodio. 2) Para la detección de MBL unida a célula, se aplica anticuerpo anti-MBL biotinilado; 3) seguido de la adición de estreptavidina-FITC y 4) análisis de la mezcla mediante fluorimetría.

Dichas enfermedades, trastornos y/o afecciones necesitadas de tratamiento con los compuestos de la invención comprenden, por ejemplo, el tratamiento de afecciones de deficiencia de MBL, el tratamiento de cáncer y de infecciones en relación con quimioterapia inmunosupresora, incluyendo en particular aquellas infecciones que se observan en relación con afecciones durante el tratamiento del cáncer o en relación con el implante y/o transplante de órganos. La invención comprende también el tratamiento de afecciones en relación con aborto recurrente.

Por tanto, en particular, la composición farmacéutica puede utilizarse para el tratamiento y/o la prevención de afecciones clínicas seleccionadas de infecciones, deficiencia de MBL, cáncer, trastornos asociados a quimioterapia tales como infecciones, enfermedades asociadas al virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), enfermedades relacionadas con inmunodeficiencia congénita o adquirida. Más particularmente, polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica (PDIC), neuropatía motora multifocal, esclerosis múltiple, miastenia grave, síndrome de Eaton-Lambert, neuritis óptica, epilepsia, síndrome antifosfolipídico primario, artritis reumatoide, lupus sistémico eritematoso, escleroderma sistémico, vasculitis, granulomatosis de Wegner, síndrome de Sjøgren, artritis reumatoide juvenil, neutropenia autoinmune, anemia hemolítica autoinmune, neutropenia, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, enfermedad celíaca, asma, síndrome del shock séptico, síndrome de fatiga crónica, psoriasis, síndrome del shock tóxico, diabetes, sinusitis, cardiomiopatía dilatada, endocarditis, aterosclerosis, hipo/agammaglobulinemia primaria incluyendo inmunodeficiencia variable común, síndrome de Wiskot-Aldrich e inmunodeficiencia combinada grave (IDCG), hipo/agammaglobulinemia secundaria en pacientes con leucemia linfática crónica (LLC) y mieloma múltiple, púrpura trombocitopénica idiopática (PTI) aguda y crónica, transplante de médula ósea alogénica (TMO), enfermedad de Kawasaki y síndrome de Guillan-Barre.

La vía de administración puede ser cualquier vía adecuada, tal como intravenosa, intramuscular, subcutánea o intradérmica. Además, se concibe la administración pulmonar o tópica por la presente invención.

En particular, la composición de MBL puede administrarse para prevenir y/o tratar infecciones en pacientes que tienen síntomas clínicos asociados a deficiencia de MBL congénita o adquirida o que tienen riesgo de desarrollar dichos síntomas. Una amplia variedad de afecciones puede conducir a una susceptibilidad aumentada a afecciones en individuos deficientes en MBL, tales como quimioterapia u otros tratamientos tóxicos celulares terapéuticos, cáncer, SIDA, disposición genética, infecciones crónicas y neutropenia.

Parece que los pacientes de cáncer tratados con quimioterapia son a menudo susceptibles de infección debido a los efectos adversos del régimen de fármacos sobre las células del sistema inmune, que es la razón de fondo para utilizar la terapia con MBL en el tratamiento de esta afección. Las bajas concentraciones plasmáticas de MBL observadas (inferiores a 500 ng/ml) son indicativas de una susceptibilidad aumentada a infecciones clínicas significativas, y la defensa inmune de estos pacientes puede reforzarse mediante la administración de MBL recombinante o derivada de plasma natural.

La composición farmacéutica puede administrarse por tanto durante un periodo antes del inicio de la administración de quimioterapia o similar y durante al menos una parte de la quimioterapia.

La composición de MBL puede administrarse como un "refuerzo" general antes de la quimioterapia, o puede administrarse a aquellos que sólo tienen riesgo de desarrollar deficiencia en MBL. El grupo de pacientes que tiene riesgo puede determinarse midiendo el nivel de MBL antes del tratamiento, y sometiendo sólo a tratamiento a aquellos cuyo nivel de MBL es inferior a un nivel predeterminado. El límite para determinar un nivel bajo de MBL se ha evaluado que es inferior a 500 ng/ml para la mayoría de los grupos. El nivel de MBL puede determinarse mediante ensayo inmunofluorescente de resolución temporal como se describe en el ejemplo 9, ELISA, RIA o nefelometría.

Otra indicación para administrar MBL es cuando el nivel de MBL es inferior a un 50% del nivel normal, tal como inferior a 300 ng/ml, o inferior a 200 ng/ml.

La composición de MBL se administra en regímenes de dosificación adecuados, particularmente se administra habitualmente a intervalos adecuados, por ejemplo, una o dos veces por semana durante la quimioterapia.

Normalmente, se administran 1-100 mg por dosificación, tal como 2-10 mg, la mayoría de las veces 5-10 mg por dosificación. La mayoría de las veces se administra aproximadamente 0,1 mg/kg de peso corporal.

Por tanto, en un aspecto, la invención se refiere a MBL, incluyendo MBLr, fragmentos o imitaciones de la misma para uso en el tratamiento de cáncer y de afecciones o enfermedades y trastornos, por ejemplo, del sistema inmune y el sistema reproductivo, consistiendo dicho tratamiento en la creación, reconstitución, potenciación y/o estimulación de la actividad opsónica y/o bactericida del sistema de complemento, concretamente, potenciando la capacidad de la defensa inmune de reconocer y matar patógenos microbianos.

Además, es un aspecto de la presente invención el uso de una composición recombinante según la presente invención en un kit de artículos que comprende adicionalmente otro medicamento. En particular, el otro medicamento puede ser un medicamento antimicrobiano, tal como antibióticos.

Con respecto al aborto, se ha reseñado que la frecuencia de niveles plasmáticos bajos de MBL aumenta en pacientes de abortos recurrentes no explicados de otro modo, que es la razón de fondo para reducir la susceptibilidad al aborto mediante una reconstitución del nivel de MBL mediante la administración de MBL recombinante en estos casos.

En cuanto a la naturaleza de los compuestos de la invención, parece que en su aspecto amplio la presente invención se refiere a compuestos que son capaces de actuar como opsoninas, es decir, capaces de potenciar la captación por macrófagos mediante interacción directa entre el compuesto y el macrófago o mediante la mediación de la deposición de complemento sobre la superficie diana. Es un ejemplo particular de esto la MBL, un fragmento o una imitación de la misma. La presente invención está basada en la descripción de una síntesis de una MBL humana recombinante que parece estar más cercana a la estructura de la MBL humana natural que lo conseguido en el pasado.

La invención se ha explicado ahora y se ha dado cuenta con diversos aspectos y detalles adecuados, pero se ilustrará adicionalmente a continuación mediante los ejemplos no limitantes de realizaciones preferidas.

Ejemplos Ejemplo 1 Purificación de MBL utilizando un aminoazúcar inmovilizado

Se produjo recombinantemente MBL mediante estirpes celulares humanas como una estirpe celular basada en HEK 293 que comprende un constructo de expresión que codifica MBL como se describe en el documento WO 00/70043, en un medio basado en HyQ (HyClone), y se purificó posteriormente la MBL mediante cromatografía de afinidad utilizando un aminoazúcar inmovilizado.

Se preparó una columna de D-manosamina acoplando 1,0 g de D-manosamina (ICN Biomedicals, nº de cat 102252) a 13,5 ml de Sepharose FF activada con NHS (Amersham Biosciences, nº cat. 17-0906-02).

Las condiciones de acoplamiento fueron exactamente como se describen en las instrucciones del vendedor para el gel activado con NHS: en primer lugar, se lavó la resina con HCl 1 mM enfriado con hielo. Posteriormente, se incubó la resina con el aminoazúcar (D-manosamina 100 mg/ml, NaH_{2}PO_{4} 10 mM, pH= 7,0) durante una noche a 4ºC. El día siguiente, se bloqueó la resina con tampón etanolamina (100 mM, pH 7,0) y se empaquetó en una columna HR10/10. Finalmente, se equilibró la columna 3 veces con un tampón Tris débil (pH 7,4) y un tampón acetato débil (pH= 3,1) en un patrón alternativo.

Se añadió un litro de caldo de cultivo celular a la columna, y se eluyó utilizando un tampón que contenía EDTA.

Un inmunoensayo específico de MBL de la correspondiente aplicación, lavado y elución del pico principal revela que la MBL se encuentra casi totalmente en el pico principal de elución (Figura 1). El contenido de MBL se verifica fácilmente mediante una técnica cromatográfica, tal como cromatografía de exclusión por tamaño en Superose 6 (HR 10/30 preempaquetada de Amersham Biosciences) o investigaciones EM MALDI después de la reducción.

Ejemplo 2 Purificación de una fracción de tamaño seleccionado de MBL utilizando un aminoazúcar inmovilizado

Pueden obtenerse fracciones seleccionadas de oligómeros de lectina ajustando la concentración de ligando aminoazúcar.

Se preparó una resina de concentración relativamente baja de ligando acoplando 0,1 g de D-manosamina (Sigma, nº cat. M4670) a 12,5 ml de Sepharose FF activada con NHS suspendida (Amersham Biosciences, nº cat. 17-0906-02).

Se preparó una resina similar de concentración relativamente alta de ligando acoplando 1,0 g de D-manosamina (Sigma, nº cat. M4670) a 12,5 ml de Sepharose FF activada con NHS suspendida (Amersham Biosciences, nº cat. 17-0906-02).

Se preparó una columna "ficticia" sin ligando utilizando un tampón de acoplamiento sin el aminoazúcar durante el acoplamiento a 12,5 ml de Sepharose FF activada con NHS suspendida (Amersham Biosciences, nº cat. 17-0906-02).

En todos los casos, las condiciones de acoplamiento fueron exactamente como se describen en las instrucciones del vendedor para el gel activado con NHS. Se añade un litro de caldo de cultivo celular (preparado como se describe en el ejemplo 1) a cada columna, y se eluye utilizando un tampón que contiene EDTA. Un inmunoensayo específico de MBL de la correspondiente aplicación, lavado y elución del pico principal revela que la MBL se encuentra casi totalmente en el pico principal de elución de la columna con alta concentración de ligando (columna "alto-sub.").

Se encuentra una fracción seleccionada de masa alta de MBL en el pico principal de elución de la columna con baja concentración de ligando (columna "bajo-sub."), y se observa la MBL restante en la fracción de lavado. Toda la MBL se encuentra en la fracción de lavado de la columna "ficticia", mostrando que la afinidad de MBL es específica de ligando (Figura 2).

Ejemplo 3 Purificación de una fracción de tamaño seleccionado de MBL utilizando una serie de columnas con aminoazúcares inmovilizados

Se obtienen fracciones específicas de oligómeros de lectina aplicando una serie de columnas con diferentes concentraciones de ligando.

Se añade un litro de caldo de cultivo celular (preparado como se describe en el ejemplo 1) a dos columnas en serie: la primera columna es una columna con una baja concentración de ligando aminoazúicar (una columna "bajo sub." como se describe en el ejemplo 2), mientras que la segunda es una columna con una alta concentración de ligando aminoazúcar (una columna "alto-sub." como se describe en el ejemplo 2).

La fracción de lavado de MBL de la columna "bajo-sub." se captura en la columna "alto-sub.". Cada columna se eluye después con tampón EDTA (50 mM, pH 7,4). La fracción de elución de la columna "bajo-sub." contiene el tamaño de masa alta de MBL con una distribución media del tamaño mayor que la aplicación original. La fracción de elución de la columna "alto-sub." contiene una fracción de MBL con menos masa que el eluido de la columna "bajo-sub.", pero sin MBL de tamaño de masa bajo, como MBL monomérica o MBL dimérica.

Ejemplo 4 Purificación de una MBL derivada de plasma utilizando un aminoazúcar inmovilizado

Las lectinas de plasma podrían purificarse utilizando aminoazúcares inmovilizados.

Se prepara una columna de D-manosamina como se describe en el ejemplo 1. Se obtiene medio litro de plasma sanguíneo de un banco de sangre, y se coagula mediante calentamiento débil después de la adición de CaCl_{2}. Se añade el suero obtenido a la columna y, después de un lavado corto, se eluye la proteína utilizando un tampón que contiene EDTA. Un inmunoensayo específico de MBL de la correspondiente aplicación, lavado y elución del pico principal revela que la MBL se encuentra casi enteramente en el pico principal de elución de la columna.

El contenido de MBL se verifica fácilmente mediante una técnica cromatográfica, tal como cromatografía de exclusión por tamaño en Superose 6 (HR 10/30 preempaquetado de Amersham Biosciences), cromatografía de intercambio aniónico en MonoQ (HR 5/5 de APBiotech) o ELISA de MBL (Statens Serum Institute, Copenhague).

Ejemplo 5 Purificación de MBL utilizando aminoazúcares inmovilizados distintos de D-manosamina

La D-manosamina inmovilizada puede intercambiarse por cualquier aminoazúcar capaz de unirse a lectina después de inmovilización mediante el grupo NH_{2}. Se observan los mismos efectos de la concentración de ligando.

Se preparó una resina de concentración relativamente baja de ligando acoplando 0,1 g de D-glucosamina (Sigma, nº cat. G4875) a 12,5 ml de Sepharose FF activada con NHS suspendida (Amersham Biosciences, nº cat. 17-0906-02). Se preparó una resina similar de concentración relativamente alta de ligando acoplando 1,0 g de D-glucosamina (Sigma, nº cat. G4875) a 12,5 ml de Sepharose FF activada con NHS suspendida (Amersham Biosciences, nº cat. 17-0906-02). En ambos casos, las condiciones de acoplamiento fueron exactamente como se describen en las instrucciones del vendedor para el gel activado con NHS.

Se añade un litro de caldo de cultivo celular (preparado como se describe en el ejemplo 1) a cada columna, y se eluye utilizando un tampón que contiene EDTA.

Un inmunoensayo específico de MBL de la correspondiente aplicación, lavado y elución del pico principal revela que la MB se encuentra casi enteramente en el pico principal de elución de la columna con alta concentración de ligando (columna "alto-sub.") (Fig. 3).

Ejemplo 6 Purificación a gran escala de lectinas utilizando un aminoazúcar inmovilizado

Se escala fácilmente la cromatografía de afinidad hasta diez veces.

Se prepara una columna grande de D-glucosamina acoplando 5,0 g de D-glucosamina (Sigma, nº de cat. G4875) a Sepharose FF activada con NHS suspendida (Amersham Biosciences, nº de cat. 17-0906-02). Las condiciones de acoplamiento fueron exactamente como se describe en las instrucciones del vendedor para el gel activado con NHS. Se añaden 10 litros de caldo de cultivo celular con MBL producida recombinantemente a la columna, y se eluye utilizando un tampón que contiene EDTA.

Un inmunoensayo específico de MBL de la correspondiente aplicación, lavado y elución del pico principal revela que la MBL se encuentra casi enteramente en el pico principal de elución. El contenido de MBL se verifica fácilmente mediante técnicas cromatográficas tales como cromatografía de exclusión por tamaño en Superose 6 (HR 10/30 preempaquetado de Amersham Biosciences), cromatografía de intercambio aniónico en MonoQ (Amersham Biosciences), PAGE-SDS con Western utilizando Hyb131-01 (Statens Serum Institute), ELISA específica de MBL (Statens Serum Institute), análisis de la composición de aminoácidos e investigaciones de EM MALDI después de reducción.

Ejemplo 7 Detección de lectinas utilizando aminoazúcares inmovilizados

Los aminoazúcares pueden inmovilizarse en placas de microvaloración y aplicarse para la detección de lectinas.

Se acopla D-glucosamina a pocillos de microvaloración (CovaLink NH_{2} activado con cloruro de cianuro de Life Technologies) incubando los pocillos con 1,0 \mug de aminoazúcar por pocillo durante una noche, como se describe por el vendedor. Se añaden diluciones de muestras que contienen MBL a los pocillos y se incuban durante 3 horas a temperatura ambiente. Posteriormente, se aplica un anticuerpo de detección como Hyb131-01 (Statens Serum Institute) durante 3 horas a temperatura ambiente, seguido de incubación con un anticuerpo secundario marcado con HRP o AP (anti-Ig, Dako) durante 1 hora. Después de la adición del sustrato de enzima, se estima la cantidad de MBL en un lector ELISA.

Claims (28)

1. Un método para aislar al menos una lectina de unión a manosa (MBL) a partir de una preparación que comprende una variedad de moléculas de lectina, que comprende

-

establecer un soporte sólido que está derivatizado con al menos un aminoazúcar que tiene un grupo amino primario dispuesto como parte reactiva en una parte de la molécula y un sitio de unión a MBL en otra parte de la molécula, y en el que dicho aminoazúcar está acoplado mediante el grupo amino al soporte sólido,

-

aplicar la preparación a dicho soporte sólido,

-

permitir que las lectinas se unan al derivado de azúcar acoplado al soporte sólido,

-

lavar el soporte sólido con un líquido de lavado retirando los contaminantes no unidos, y

-

recuperar opcionalmente dicha(s) lectina(s) a partir del soporte sólido.

2. El método según la reivindicación 1, en el que el aminoazúcar es un monosacárido seleccionado del grupo consistente en manosamina, glucosamina, galactosamina, fructosamina, D-manosamina, D-glucosamina, L-galactosamina y L-fucosamina.

3. El método según la reivindicación 1, en el que el aminoazúcar se selecciona del grupo consistente en D-manosamina y D-glucosamina.

4. El método según la reivindicación 1, en el que el soporte sólido es una resina de columna cromatográfica, y en el que se acopla una concentración predeterminada de 0,1 mg a 1.000 mg de aminoazúcar por ml de resina al soporte sólido.

5. El método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la MBL se recupera a partir de dicho soporte sólido.

6. El método según la reivindicación 5, en el que la MBL se recupera sustancialmente en forma pura.

7. El método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el soporte sólido se selecciona de columnas cromatográficas, resinas cromatográficas, cargas, superficies plásticas, superficies de vidrio y partículas magnéticas.

8. El método según la reivindicación 7, en el que la columna se selecciona de resinas activadas con N-hidroxisucci-
nimida, resinas activadas con bromuro de cianógeno, resinas activadas con epoxi, ECH Sepharose 4B de Amersham Biosciences y CH-Sepharose 4B activada de Amersham Biosciences.

9. El método según la reivindicación 6, en el que la superficie plástica es una placa de microvaloración activada.

10. El método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el líquido de lavado comprende uno o más componentes seleccionados del grupo consistente en agentes quelantes de ión metálico divalente y azúcares capaces de unirse a MBL, en el que el azúcar se selecciona del grupo consistente en manosa, N-acetilmanosamina, glucosa, N-acetilglucosamina, fructosa, N-acetilfructosamina, galactosa y N-acetilgalactosamina, sacarosa y maltosa.

11. Un método para aumentar la relación R de una composición que comprende una variedad de moléculas de MBL, en el que R es la relación de la concentración de moléculas de MBL que tienen un peso molecular alto superior a un peso molecular predeterminado a la concentración de moléculas de MBL que tienen un peso molecular bajo inferior o igual al peso molecular predeterminado, comprendiendo dicho método

obtener una preparación de MBL que comprende MBL de bajo peso molecular y MBL de alto peso molecular, teniendo dicha preparación la relación R= R_{0},

aplicar la preparación a un método de aislamiento como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que el soporte sólido es una resina de columna cromatográfica, y en el que se acopla una concentración predeterminada de 0,1 mg a 1.000 mg de derivado de azúcar por ml de resina al soporte sólido,

obtener una composición que comprende las moléculas de MBL recuperadas.

12. Un método para producir una composición que comprende una variedad de moléculas de MBL, en el que sustancialmente todas dichas moléculas de MBL tienen un peso molecular superior a un peso molecular predeterminado para MBL dimérica, comprendiendo dicho método

obtener una preparación de MBL que comprende moléculas de MBL que tienen un peso molecular alto superior al peso molecular predeterminado y moléculas de MBL que tienen un peso molecular bajo inferior o igual al peso molecular predeterminado, teniendo dicha preparación la relación R= R_{0}, en la que R es la relación de la concentración de moléculas de lectina que tienen un peso molecular alto superior al peso molecular predeterminado a la concentración de moléculas de lectina que tienen un peso molecular bajo inferior o igual al peso molecular predeter-
minado,

aplicar la preparación a un método de aislamiento como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que el soporte sólido es una columna estándar que tiene acoplada a la misma un aminoazúcar en una concentración predeterminada de 10 \mumol por ml de resina desecada a 100 \mumol por ml de resina desecada,

obtener una composición que comprende las moléculas de lectina recuperadas.

13. Un método para separar una composición que comprende una variedad de moléculas de MBL, en el que sustancialmente todas dichas moléculas de MBL tienen un peso molecular alto superior a un peso molecular predeterminado, a partir de una preparación de MBL que comprende moléculas de MBL que tienen un peso molecular alto superior al peso molecular predeterminado y moléculas de MBL que tienen un peso molecular bajo inferior o igual al peso molecular para lectinas diméricas, teniendo dicha preparación la relación R= R_{0}, en la que R es la relación de la concentración de moléculas de MBL que tienen un peso molecular alto superior al peso molecular predeterminado a la concentración de moléculas de MBL que tienen un peso molecular bajo o igual al peso molecular predeterminado, comprendiendo dicho método

obtener dicha preparación de MBL,

aplicar la preparación a un método de aislamiento como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que el soporte sólido es una resina de columna cromatográfica, y en el que se acopla una concentración predeterminada de 0,5 mg a 500 mg de derivado de azúcar por ml de resina al soporte sólido,

obtener una composición que comprende las moléculas de MBL recuperadas.

14. Un método para producir una composición que comprende una variedad de moléculas de MBL, en el que sustancialmente todas dichas moléculas de MBL tienen un peso molecular bajo inferior o igual al peso molecular predeterminado, comprendiendo dicho método

obtener una preparación de MBL que comprende moléculas de lectina que tienen un peso molecular alto superior al peso molecular predeterminado y moléculas de lectina que tienen un peso molecular bajo inferior o igual al peso molecular predeterminado, teniendo dicha preparación la relación R= R_{0}, en la que R es la relación de la concentración de moléculas de lectina que tienen un peso molecular alto superior al peso molecular predeterminado a las concentración de moléculas de lectina que tienen un peso molecular bajo inferior o igual al peso molecular predetermi-
nado,

aplicar la preparación a un método de aislamiento como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que el soporte sólido es una resina de columna cromatrográfica, y en el que se acopla una concentración predeterminada de 0,1 mg a 1.000 mg de derivado de azúcar por ml de resina al soporte sólido,

obtener una composición que comprende las moléculas de MBL no unidas a partir del líquido de lavado.

15. Un método para aumentar la relación R de una preparación que comprende una variedad de moléculas de MBL, en el que R es la relación de la concentración de MBL que tienen una masa molecular intermedia a la concentración de moléculas de MBL que tienen una masa molecular alta y una masa molecular baja,

en el que la masa molecular intermedia es un peso molecular inferior a un primer peso molecular predeterminado y superior a un segundo peso molecular predeterminado, la masa molecular alta es una masa molecular superior o igual al primer peso molecular predeterminado y la masa molecular baja es una masa molecular inferior o igual al segundo peso molecular predeterminado,

comprendiendo dicho método las etapas de:

a)

obtener una preparación de lectina que comprende lectina de bajo peso molecular, lectina de masa molecular intermedia y lectina de masa molecular alta, teniendo dicha preparación la relación R= R_{0}; y

b)

aplicar la preparación a un método de aislamiento como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9; y

c)

obtener una composición que comprende las moléculas de lectina recuperadas; y

d)

repetir la etapa b) utilizando un soporte sólido con diferente concentración de aminoazúcar.

16. El método según la reivindicación 15, en el que al menos un 50% de la MBL de peso molecular alto de la composición tiene un peso molecular superior a 200 kDa, tal como superior a 225 kDa, tal como superior a 250 kDa, tal como superior a 300 kDa.

17. El método según la reivindicación 15, en el que la MBL de peso molecular bajo comprende MBL que tiene un peso molecular inferior a 200 kDa.

18. El método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la preparación de MBL es una preparación de MBL recombinante.

19. El método según la reivindicación 18, en el que la preparación de MBL se obtiene

-

preparando un constructo de expresión génica que codifica el péptido de MBL humana,

-

transformar un cultivo de célula hospedadora con el constructo,

-

cultivar el cultivo de célula hospedadora en un medio de cultivo, obteniendo así la expresión y secreción del polipéptido en el medio de cultivo,

-

obtener una preparación que comprende una variedad de moléculas de MBL.

20. El proceso según la reivindicación 19, en el que el constructo de expresión génica comprende al menos una secuencia de intrón del gen MBL humano.

21. El proceso según la reivindicación 20, en el que el constructo de expresión génica comprende al menos dos secuencias de exón del gen MBL humano.

22. El proceso según la reivindicación 19, en el que el constructo de expresión génica comprende una secuencia de ADNc que codifica una subunidad MBL.

23. El proceso según la reivindicación 19, en el que el cultivo de célula hospedadora se cultiva in vitro.

24. El proceso según la reivindicación 19, en el que el cultivo de célula hospedadora es un cultivo de célula hospedadora eucariótica.

25. El proceso según la reivindicación 19, en el que el cultivo de célula hospedadora es un cultivo de célula hospedadora de mamífero.

26. Un soporte sólido, en el que el soporte sólido es una resina de columna cromatográfica, y en el que dicho soporte sólido tiene acoplada covalentemente al mismo una concentración predeterminada de 0,1 mg a 1.000 mg de aminoazúcar por ml de resina de al menos un aminoazúcar que tiene un grupo amino primario, seleccionado del grupo consistente en manosamina, glucosamina, galactosamina, fructosamina, D-manosamina, D-glucosamina, L-galactosamina y L-fucosamina, y en el que dicho aminoazúcar está acoplado mediante el grupo amino al soporte sólido.

27. El soporte sólido según la reivindicación 26, en el que el aminoazúcar se selecciona del grupo consistente en D-manosamina y D-glucosamina.

28. El soporte sólido según la reivindicación 26, en el que la columna se selecciona de resinas activadas con N-hidroxisuccinimida, resinas activadas con bromuro de cianógeno, resinas activadas con epoxi, ECH Sepharose 4B de APBiotech y CH-Sepharose 4B activada de AP-Biotech.