JP4241377B2 - レクチンの単離 - Google Patents

Description

発明の詳細な説明

本発明は、出発物質として組換え生産されたレクチンを用いるのに適した、特にマンノース−結合レクチン（ＭＢＬ）を含むレクチン組成物の単離方法、ならびに高分子量レクチンに対してレクチン調製物を豊富化させる方法に関する。

発明の背景
レクチンは、炭水化物結合ドメインの存在によって特徴付けられる蛋白質である。コレクチンは、サブユニットのオリゴマー構造を含むレクチンの群であり、各サブユニットは炭水化物結合ドメインを有する。イン・ビボにおいては、レクチンは、異なる分子質量を持つレクチンの集団に導く種々の数のサブユニットに表れる。

ＭＢＬはコレクチンファミリーの蛋白質であって、サブユニットのオリゴマー構造によって特徴付けられ、各サブユニットはコラーゲン状ロッドに結合したカルシウム−依存性のＣ−型の炭水化物−認識ドメイン（ＣＲＤ）よりなる。ＭＢＬは、会合したセリンプリテアーゼ（ＭＡＳＰ−マンノース−結合レクチン会合セリンプロテアーゼ）を介して、すなわち、Ｃ１ｑと同様なメカニズムによって補体系を活性化する。マンノース−結合蛋白質（ＭＢＬ）は、機能的および／または臨床的兆候に関連する、遺伝したまたは獲得されたＭＢＬ−欠乏を持つ患者において置換または置換え療法で用いられる蛋白質である。

ヒト血漿に由来するＭＢＬはサブユニットのオリゴマーに組立てられ、各々は３つの同一のポリペプチド鎖よりなる。ＭＢＬ分子中のサブユニットの数は変化し［Lipscombe RJ, et al: Distinct physicochemical characteristics of human mannose binding protein expressed by individuals of differing genotype, Immunology 85 (1995) 660-667.］、しかし、生物学的に活性なポリペプチドは３を超えるサブユニットよりなるオリゴマーであることが示唆されている。血漿は３を超えるサブユニットのオリゴマーならびに変性し構造的に損なわれた蛋白質形態を含み、これは、より高次のオリゴマーに対応する支配的ＭＢＬバンドの間の例えばＳＤＳゲルでのバンドに導く。

組換え生産されたＭＢＬは、血漿由来ＭＢＬと同様なオリゴマー変動を明らかにしている［Vorup-Jensen T et al : Recombinant expression of human mannanbinding lectin, Int. Immunopharm. 1 (2001) 677-687］。しかしながら、組換えにより生産されたＭＢＬは、通常、血漿由来ＭＢＬよりも高い低質量形態の含有量を有する。ＭＢＬの低質量形態は、例えば、単一のポリペプチド鎖、単一のサブユニット、およびダイマーサブユニットを含む。

レクチンは、典型的には、それにレクチンが結合する糖で修飾されたカラムに、レクチンを含む組成物を適用することによって単離される。ＰＣＴ出願ＷＯ ００／７００４３において、低質量形態から高次オリゴマーを分離する方法が記載されており、そこでは、組換え生産ＭＢＬは特殊なカラムでの分画に付され、該カラムはそれ自体ＭＢＬに対していずれの親和性も有しない。

発明の記載
溶液からマンノース−結合レクチン（ＭＢＬ）、またはその誘導体および変種のごときレクチン（本明細書中では、集合的にレクチンと称する）を単離する速くて単純な方法はかなり重要である。

さらに、レクチンの質量分布の制御がなされることも非常に重要である。なぜならば、該レクチンポリペプチドの異なるオリゴマーは異なる生物学的機能および活性を有するからである。

本発明は、それに結合した所定濃度の糖誘導体を有する固体支持体に調製物を適用することによる、ＭＢＬのごときレクチンを単離する方法を記載する。該方法は、該ポリペプチドの調製、精製および／または処方の間に単位操作として用いることができる。他の方法と比較して、本発明の方法を適用して、ポリペプチドの高質量オリゴマーがポリペプチドの低質量オリゴマーから分離されるか、あるいは中間的質量オリゴマーが高質量オリゴマーおよび低質量オリゴマーから分離されるように、ポリペプチドのオリゴマーの組成を変化させることができるのは有利である。

かくして、本発明の１つの目的は、種々のレクチン分子を含む調製物から少なくとも１つのレクチンを単離することを提供することにあり、該方法は、
それに結合した、所定濃度の糖誘導体を有する固体支持体を確立し、
該調製物を該固体支持体に適用し、
固体支持体に結合した糖誘導体にレクチンを結合させ、
洗浄液で固体支持体を洗浄して、未結合汚染物を除去し、次いで、
所望により、固体支持体から該レクチン（類）を回収することを含む。

用語「所定の濃度」は、所定濃度を有する所定容量の糖誘導体を所定容量または面積の固体支持体に適用して、糖誘導体を固体支持体にカップリングさせることを意味する。１つの具体例においては、該用語は、所定濃度の糖誘導体が所定容量または面積の固体支持体にカップリングされることを意味する。

用語「汚染物」はレクチン調製物中の汚染物、ならびにそのより小さな分子量のため糖誘導体に結合していないレクチンを意味する。特に、中間的分子量のレクチンを望む場合、汚染物は、後記する２以上の工程手法を用いる場合には所望のレクチンを含み得る。かくして、用語「汚染物」は、未結合レクチンを含めた未結合物質と同義である。

用語「種々のレクチン分子」とは、好ましくは、レクチン分子の種々のオリゴマーを意味し、該レクチンの分子は後記するごとく同一または実質的に同一の構造サブユニットを有する。

本発明の第２の目的は、それに共有結合した所定濃度の糖誘導体を有する固体支持体を提供することにあり、ここに、該糖誘導体は好ましくはアミノ糖である。

もう１つの態様において、本発明は溶液中のレクチンのオリゴマー分布を変化させる方法に関する。よって、１つの具体例においては、本発明は種々のレクチン分子を含む組成物の比率Ｒを増加させる方法に関し、ここに、Ｒは所定の分子量未満またはそれと等しい低分子量を有するレクチン分子の濃度に対する所定の分子量を超える高分子量を有するレクチン分子の濃度の比率であり、当該方法は、
低分子量レクチンおよび高分子量レクチンを含むレクチン調製物を得、該調製物は比率Ｒ＝Ｒ_０を有し、
該調製物を単離方法、好ましくは、前記した調製物からの少なくとも１つのレクチンを単離する方法に適用し、
回収されたレクチン分子を含む組成物を得ることを含む。

それにより、出発物質を比較してレクチンの高質量オリゴマーの増大した含有量を有する組成物が得られる。

特に、該比率の増加は、ダイマーレクチンについての分子量を超える分子量を有するレクチンを含む組成物に導く。かくして、もう１つの態様において、本発明は種々のレクチン分子を含む組成物の製法に関し、ここに、該レクチン分子の実質的に全てはダイマーレクチンについての所定の分子量を超える分子量を有し、当該方法は、所定の分子量を超える高分子量を有するレクチン分子および所定の分子量未満またはそれと等しい低分子量を有するレクチン分子を含むレクチン調製物を得、該調製物は比率Ｒ＝Ｒ_０を有し、ここに、Ｒは所定の分子量未満またはそれと等しい低分子量を有するレクチン分子の濃度に対する所定の分子量を超える高分子量を有するレクチン分子の濃度の比率であり、
該調製物を単離方法、好ましくは、前記した調製物から少なくとも１つのレクチンを単離する方法に適用し、
回収されたレクチン分子を含む組成物を得ることを含む。

該方法のための出発物質は高質量レクチンならびに低質量レクチンを含むので、本発明は、所定の分子量を超える高分子量を有するレクチン分子およびダイマーレクチンについての分子質量未満またはそれと等しい低分子量を有するレクチン分子を含むレクチン調製物から、種々のレクチン分子を含む組成物を分離する方法にも関し、ここに、該レクチン分子の実質的に全ては所定の分子量を超える高分子量を有し、該調製物は比率Ｒ＝Ｒ_０を有し、ここに、Ｒは所定の分子量未満またはそれと等しい低分子量を有するレクチン分子の濃度に対する所定の分子量を超える高分子量を有するレクチン分子の濃度の比率であり、当該方法は、
該レクチン調製物を得、
該調製物を単離方法、好ましくは、前記した調製物から少なくとも１つのレクチンを単離する方法に適用し、
回収されたレクチン分子を含む組成物を得ることを含む。

ほとんどの目的では、高質量レクチンが望ましいものである；しかしながら、ある適用では、低質量レクチンが望まれ、従って、本発明は、さらに、種々のレクチン分子を含む組成物の製法に関し、ここに、該レクチン分子の実質的に全ては所定の分子量未満またはそれと等しい低分子量を有し、当該方法は、所定の分子量を超える高分子量を有するレクチン分子および所定の分子量未満またはそれと等しい低分子量を有するレクチン分子を含むレクチン調製物を得、該調製物は比率Ｒ＝Ｒ_０を有し、ここに、Ｒは所定の分子量未満またはそれと等しい低分子量を有するレクチン分子の濃度に対する所定の分子量を超える高分子量を有するレクチン分子の濃度の比率であり、
該調製物を単離方法、好ましくは、前記した調製物から少なくとも１つのレクチンを単離する方法に適用し、
洗浄液の未結合レクチン分子を含む組成物を得ることを含む。

前記した方法について、好ましくは、回収されたレクチン分子の組成物は、比率Ｒ＝Ｒ_１を有し、ここに、Ｒ_１は少なくとも１．０５、少なくとも１．１０、少なくとも１．１５、少なくとも１．２５、少なくとも１．５０、少なくとも１．７５、少なくとも２．０、少なくとも２．５、少なくとも３．０、少なくとも４．０、少なくとも５．０、少なくとも６．０、少なくとも７．０、少なくとも８．０、少なくとも９．０、少なくとも１０．０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも１００、少なくとも１０００、少なくとも１００００のごとく少なくとも１である。

前記開示の方法の全てについて、所定の分子量は好ましくはダイマーレクチンについての分子量、より好ましくはトリマーレクチンについての分子量である。

ほとんどの目的では、高質量レクチンが望ましいものであり；しかしながら、ある具体例においては、中間的な質量のレクチンが望まれるであろう。従って、さらなる態様において、本発明は種々のレクチン分子を含む組成物の比率Ｒを増加させる方法に関し、ここに、Ｒは高分子質量および低分子質量を有するレクチン分子の濃度に対する中程度分子質量を有するレクチンの濃度の比率であり、
ここに、中程度分子質量は第一の所定の分子量未満であって、第二の所定の分子量を超える分子量であり、高分子質量は第一の所定の分子量未満またはそれと等しい分子量であり、低分子質量は第二の所定の分子量未満またはそれと等しい分子質量であり、
当該方法は、低分子質量レクチン、中程度分子質量レクチンおよび高分子質量レクチンを含むレクチン組成物を得、該調製物は比率Ｒ＝Ｒ_０を有し、
該組成物の単離方法、好ましくは前記した調製物から少なくとも１つのレクチンを単離する方法に適用し、
回収されたレクチン分子を含む組成物を得、次いで、
所望により単離方法、好ましくは前記した調製物から少なくとも１つのレクチンを単離する方法に組成物を適用する工程を反復する；
工程を含む。

１つの具体例において、第一の所定の分子量はヘプタマーレクチンについての分子量とすることができ、第二の所定の分子量はダイマーレクチンについての分子量である。
もう１つの態様において、本発明は、
少なくとも１つのアミノ糖で誘導体化した固体支持体を確立し、
種々のレクチン分子を含む調製物を該固体支持体に適用し、
該レクチンを、固体支持体にカップリングしたアミノ糖に結合させ、
洗浄液で固体支持体を洗浄して、未結合汚染物を除去し、次いで、
所望により、固体支持体から該レクチン（類）を回収する；
ことを含む、該調製物から少なくとも１つのレクチンを単離する方法に関する。

用語「誘導体化」とは、アミノ糖が前記した固体支持体にカップリングすることを意味する。

本発明によるレクチンはいずれのレクチンであっても良く、ここに、いくつかのオリゴマー形態、例えばマンノース−結合レクチンのごときコレクチンである。特に、本発明はＭＢＬ組成物の製法に関する。用語ＭＢＬはマンノース−結合レクチン（またはある著者によってはマンノース−結合蛋白質と呼ばれる）を意味する。ＭＢＬは、好ましくは、例えば、ＰＣＴ出願ＷＯ ００／７００４３に示された蛋白質配列を有するヒトＭＢＬであり、あるいはＭＢＬの機能的同等体であるその誘導体または変種である。以下において、本発明はレクチンＭＢＬとの関係で記載する。

本発明による方法は、問題のレクチンの大規模製造を可能とする。かくして、もう１つの態様において、本発明は、該ＭＢＬの製造の間に該方法の適用を含むＭＢＬのいずれかの工業的または大規模製造方法に関する。

発明の詳細な記載
糖誘導体
好ましい具体例において、用語糖誘導体は糖に由来する化合物を意味し、ここに、誘導された化合物は、所定の向きに固体支持体にカップリングする能力を有する。本発明者らは、なぜ従来の単離方法が効率を欠くかの理由の１つを突き止めた。かくして、レクチンは糖上の特異的結合部位に結合し、先行技術からのおよび他の固体支持体にランダムにカップリングした糖を用いる場合、あるパーセンテイジのカップリングした糖は、結合部位がレクチンに結合する位置にはないのでレクチンに結合しないことが判明した。

かくして、本発明による糖誘導体は、好ましくは、固体支持体への配向したカップリングを可能とする反応性基を含む。糖誘導体は、該糖誘導体が固体支持体にカップリングした場合にレクチンに結合することができるいずれの誘導体であっても良い。レクチンに結合できない糖誘導体は、該誘導体が遊離形態である場合、すなわち、カップリングしていない場合に、カップリングした形態でレクチンに結合することができれば、本発明に従って用いることもできる。

糖の所定の配向は、反応性基を好ましくは特異的位置における糖に取り込むことによって得ることができ、それにより、カップリングが反応性基を介して固体支持体に対して起こる点で、糖誘導体を特異的な向きに固体支持体にカップリングさせることが可能である。かくして、用語「配向したカップリング」とは、糖分子の遊離部分が所定の位置において配向するように、糖分子中の特異的所定の基を介して糖が固体支持体にカップリングすることを意味する。

単糖においては、結合部位および反応性基は同一単糖構造に位置する；しかしながら、二糖およびより高次のオリゴ糖および多糖においては、結合部位は反応性基よりももう１つの単糖構造に位置することができる。本発明の意味においては、用語「単糖構造」とは、糖中に環を形成することができる構造を意味する。例えば、二糖は二つの単糖構造を含む。好ましい具体例においては、反応性基は結合部位から離れて位置し、それにより、立体的に障害とならない結合部位を有する良好な可能性を得る。

糖
用語糖誘導体は、糖から誘導されるいずれの化合物も意味する。本発明の意味においては、糖は、５−員環（ペントース）または６−員環（ヘキソース）またはその組合わせであるかを問わず、またＴ−形態またはＬ−形態であるかを問わず、単糖、二糖、三糖、オリゴ糖および多糖を含めたいずれの炭水化物も、ならびにカルボニル基の還元によって（アルジトール）、末端基のカルボン酸への酸化によって、またはもう１つの基によるヒドロキシ基の置換によって単糖から誘導される物質も意味する。それは、これらの化合物の
誘導体も含む。

単糖はポリヒドロキシアルデヒドＨ−［ＣＨＯＨ]ｎ−ＣＨＯおよびポリヒドロキシケトンＨ−[ＣＨＯＨ]ｎ−ＣＯ−[ＣＨＯＨ]ｍ−Ｈ、すなわち、アルドース、ジアルドース、アルドケトース、ジケトース、デオキシ糖、アミノ糖とおよびそれらの誘導体を含む。

アルドースはアルデヒド性カルボニル、すなわち、ポリヒドロキシアルデヒドＨ−[ＣＨＯＨ]ｎ−ＣＨＯを持つ単糖を含む。アルドースは、アルドースの閉環で生じる可能なアルデヒド性カルボニル基−へミアセタール基を持つ単糖も含む。

ケトースは、ケトン基を持つ単糖、すなわち、ポリヒドロキシケトンＨ−[ＣＨＯＨ]ｎ−ＣＯ−[ＣＨＯＨ]ｍ−Ｈを含み、すなわち、ケトンはケトースの閉環から生じる可能なケトン性カルボニル基−へミケタール基を持つ単糖も含む。

ピラノースはテトラヒドロフラン（５−員環）を持つ環状へミアセタールまたは環状へミケタールである。

フラノースはテトラヒドロフラン（５−員環）を持つ環状へミアセタールまたは環状へミケタールである。

ジアルドース、ジケトース、ケトアルドース（アルドケトース、アルドスロース）、アルジトールは１を超えるアルデヒドおよび／またはケトンを持つ単糖である。

アルドン酸、ケトン酸は、アルデヒド基がカルボキシ基で交換されているアルドースである。

糖の誘導体の例は、第一のＣＨ_２ＯＨ−基がカルボキシ基で交換されているウロン酸、アルドース；第一のＣＨ_２ＯＨ−基がカルボキシ基で交換されているアルダル酸、アルドン酸；ヒドロキシル基が水素で交換されているデオキシ糖、単糖；ヒドロキシル基がアミノ基で交換されているアミノ糖、単糖である。

また、（閉環後に形成された）へミアセタール基上のヒドロキシル基がアミノ基で交換されているアミノ糖であるグリコシルアミンも含まれる。

本発明の意味では、用語アセタールは、その通常の意味で用いられ、すなわち、アルドースまたはケトースの閉環から生じる単糖である。さらに、グリコシドは単糖、オリゴ糖および多糖のヘミアセタールおよびへミケタールヒドロキシ基、およびもう１つの単糖、オリゴ糖および多糖のヒドロキシ基の間の水の除去から生じるアセタールである。グリコシド結合はグリコシド中の単糖の間の結合である。

本発明の意味では、用語糖、または本明細書中で記載される糖および誘導体のいずれも、Ｄ−形態およびＬ−形態、α−形態およびβ−形態を含めた糖の全ての種々の立体的形態も含む。かくして、その例として、マンノサミンは立体的形態のいずれのマンノサミンも意味し、Ｄ−マンノサミン、Ｌ−マンノサミンおよび（Ｄ，Ｌ）−マンノサミンを含む。特異的立体的形態を用いる場合のみ、これは例えばＤ−マンノサミンとしての記載である。

具体的誘導体
本発明は、特に、アミノ基から選択される反応性基を有する糖誘導体に関し、ここに、該アミノ基は、例えば、第一級アミノ基、第二級アミノ基および第三級アミノ基よりなる群から選択することができる。

特に、本発明は、糖誘導体としてのアミノ糖の使用に関する。アミノ糖はアミノ単糖、アミノ二糖、アミノオリゴ糖、およびアミノ多糖とすることができ、ここに、少なくとも１つのアミノ基は、該アミノ糖を固体支持体にカップリングさせた場合にそれが反応性基として働くように取り込まれる。

適当なアミノ単糖の例は以下のものである：
マンノサミン、グルコサミン、アロサミン、アルトサミン、リボサミン、アラビノサミン、グロサミン、イドサミン、ガラクトサミン、タロサミン、キシロサミン、リキソサミンのごときアミノアルドース。特に、Ｄ−マンノサミン、Ｄ−グルコサミン、Ｄ−アドサミン、Ｄ−アルトロサミン、Ｄ−リボサミン、Ｄ−アラビノサミン、Ｌ−グロサミン、Ｌ−イドサミン、Ｌ−ガラクトサミン、Ｌ−タロサミン、Ｌ−キシロサミン、Ｌ−リキソサミン。
ソルボサミン、タガトサミン、サイコサミン、フルクトサミンのごときアミノケトース。特に、Ｄ−ソルボサミン、Ｄ−タガトサミン、Ｌ−サイコサミン、Ｌ−フルクトサミン。

フコースの誘導体のごときアミノデオキシアルドース、例えば、フコサミンおよびフコシルアミン、好ましくはＬ−フコサミン。
特に、ＭＤＬの単離に関し、アミノ糖の以下の例が適する：マンノサミン、グルコサミン、ガラクトサミン、フルクトサミン。特に、Ｄ−マンノサミン、Ｄ−グルコサミン、Ｌ−ガラクトサミン、Ｌ−フコサミン。
より好ましくは、グルコサミンおよびマンノサミンよりなる群から選択されるアミノ糖、最も好ましくはＬ−フコサミン、Ｄ−グルコサミンおよびＤ−マンノサミンなる群から選択されるアミノ糖を用いることができ、特にＤ−グルコサミンまたはＤ−マンノサミンを用いることができる。Ｄ−マンノサミンの式は、本明細書中においては、遊離Ｄ−マンノサミンおよび樹脂に結合したＤ−マンノサミンとして以下に示す。

分子の１つの部分における反応性基、および分子のもう１つの部分におけるレクチン結合部位、特に、ＭＤＬ結合部位として位置するアミノ基を有する二糖、オリゴ糖、および多糖も用いることができる。例えば、アミノ糖は、二糖の単糖サブユニットの少なくとも１つがマンノースおよびグルコースよりなる群から選択される、アミノ基を含むいずれの二糖誘導体であってもよい。好ましい二糖の例はアミノ基を含む、サッカロサミンのごときサッカロース誘導体、マルトサミンのごときマルトース誘導体、ならびにアガロサミン、セルロサミンおよびアミロサミンを含む。好ましい二糖誘導体はサッカロサミンである。

さらに、アミノ糖は、例えば、グルコサミンダイマー、グルコサミンオリゴマーまたはグルコサミンポリマーのごときグルコサミのマルチマーであってもよい。

固体支持体
固体支持体は、レクチンを捕獲し、および／または単離するのに用いられるいずれの支持体であってもよい。かくして、固体支持体は、クロマトグラフィー樹脂および磁性粒子のごとき単離および精製で用いるいずれのカラムまたはフィルターまたは粒子であっても良い。

また、固体支持体は、例えばプラスチック表面およびガラス表面のごとき、さらなる分析用にレクチンを結合させることができる表面であってよい。プラスチック表面は、例えば、マイクロタイタープレートＥＬＩＳＡウェルおよび活性化されたマイクロタイタープレートよりなる群から選択することができる。活性化されたマイクロタイタープレートは、例えば、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓからの塩化シアヌル活性化Ｃｏｖａｌｉｎｋ^ＴＭ ＮＨ_２第一級アミンであってよい。

本発明の１つの具体例においては、アミン、好ましくは第一級アミンに共有結合することができるいずれの固体支持体も本発明で用いることができる。

有用なカラムはＮ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド活性化樹脂（例えば、ＡＰＢｉｏｔｅｃｈからのＮＨＳ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ＦＦ、ＢｉｏＲａｄからのＡｆｆｉ−Ｇｅｌ１０、ＢｉｏＲａｄからのＡｆｆｉ−Ｇｅｌ１５またはＢｉｏＲａｄからのＡｆｆｉ−Ｐｒｅｐ）、臭化シアン活性化樹脂（例えば、ＡＰＢｉｏｔｅｃｈからのＣＮＢｒ−活性化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４ＦＦ）、ＡＰＢｉｏｔｅｃｈからのＥＣＨ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ、ＡＴ−Ｂｉｏｔｅｃｈからの活性化されたＣＨ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂおよびエポキシ活性化樹脂（例えば、エポキシ活性化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ６Ｂ）ならびにそれらの対応する架橋された樹脂よりなる群から選択されるカラムのいずれであってもよい。

所定濃度の糖誘導体を本発明に従って固体支持体にカップリングすることができる。糖誘導体の所定の濃度は、いずれの所定の分子量が本発明の特定の具体例で望ましいかに従って選択されるべきである。糖誘導体の濃度は２つの因子：
１）糖誘導体にカップリングすることができる固体支持体上の位置（リガンドアーム）の濃度、
２）リガンドアーム当たりの糖誘導体の濃度；
によって決定される。

固体支持体容量当たりのリガンドアームの濃度は、ほとんどの場合、固体支持体の製造プロセスによって決定され、固体支持体に標識されたリガンドをカップリングさせることによって制御することができる。

リガンドアーム当たりの糖誘導体の濃度は、リガンドアームにカップリングするように糖誘導体の容量および濃度を調節することによって調節される。

一般に、比較的低い所定の分子量が望ましい場合、糖誘導体の高い所定の濃度が用いられ、比較的高い所定の分子量が望ましい場合、糖誘導体の低い所定の濃度が用いられる。

糖誘導体の所定の濃度は、例えば、固体支持体の具体的量のカップリングした糖誘導体の量によって決定することができる。

例えば、固体支持体がクロマトグラフィーカラム樹脂である場合、単糖誘導体の所定の濃度は、好ましくは、樹脂ｍｌ当たり０．１ｍｇ糖誘導体ないし樹脂ｍｌ当たり１０００ｍｇの糖誘導体、より好ましくは、樹脂ｍｌ当たり０．５ｍｇの糖誘導体および樹脂ｍｌ当たり５００ｍｇの糖誘導体の間、より好ましくは、樹脂ｍｌ当たり２ｍｇの糖誘導体ないし樹脂ｍｌ当たり１００ｍｇの糖誘導体である。

本発明の意味においては、固体支持体についての標準は、実施例に記載するごとく、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＭＨＳ）で修飾された架橋Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ樹脂である。好ましくは、固形樹脂ｍｌ当たり１５ないし２５マイクロモルのリガンドアームが用いられる。そのような固体支持体は、固形樹脂ｍｌ当たり５マイクロモルのジペプチド、または固形樹脂ｍｌ当たり１ないし２マイクロモルのアルファ−キモトリプシノーゲンに結合することができるように具体化される。

この標準化された固体支持体から、種々のレクチンから望まれるレクチンを得るために、樹脂にカップリングさせる糖誘導体の所定の濃度についての間隔が与えられる。

ダイマーレクチンについての分子量を超えるようにここでは定義される高分子量レクチンの単離は、固形樹脂ｍｌ当たり２０マイクロモルないし固形樹脂ｍｌ当たり８０マイクロモル固形樹脂ｍｌ当たり３０マイクロモルないし固形樹脂ｍｌ当たり７０マイクロモル、固形樹脂ｍｌ当たり４０マイクロモルないし固形樹脂ｍｌ当たり６０マイクロモルのごとき固形樹脂ｍｌ当たり１０マイクロモルないし固形樹脂ｍｌ当たり１００マイクロモルの所定の濃度にて、それにカップリングした糖誘導体を有する標準カラムを用いて得られる。単糖について、該濃度は、固形樹脂ｍｌ当たり４ｍｇないし固形樹脂ｍｌ当たり１６ｍｇ、固形樹脂ｍｌ当たり６ｍｇ、ないし固形樹脂ｍｌ当たり１４ｍｇ、固形樹脂ｍｌ当たり８ｍｇないし固形樹脂ｍｌ当たり１２ｍｇのごとき、固形樹脂ｍｌ当たり２ｍｇないし固形樹脂ｍｌ当たり２０ｍｇに対応する。

トリマーレクチンについても分子量を超えるように本明細書中では定義される高分子量レクチンの単離は、固形樹脂ｍｌ当たり２０マイクロモルないし固形樹脂ｍｌ当たり７０マイクロモル、固形樹脂ｍｌ当たり３０マイクロモルないし固形樹脂ｍｌ当たり７０マイクロモル、固形樹脂ｍｌ当たり４０マイクロモルないし固形樹脂ｍｌ当たり６０マイクロモルのごとき、固形樹脂ｍｌ当たり１０マイクロモルないし固形樹脂ｍｌ当たり８０マイクロモルの所定の濃度にて、それにカップリングした糖誘導体を有する標準カラムを用いて得られる。

テトラマーレクチンについての分子量を超えるように本明細書中では定義される高分子レクチンの単離は、固形樹脂ｍｌ当たり２０マイクロモルないし固形樹脂ｍｌ当たり６０マイクロモル、固形樹脂ｍｌ当たり３０マイクロモル、ないし固形樹脂ｍｌ当たり５０マイクロモルのごとき固形樹脂ｍｌ当たり１０マイクロモルないし固形樹脂ｍｌ当たり６０マイクロモルの所定の濃度にて、それにカップリングした糖誘導体を有する標準カラムを用いて得られる。

ダイマーレクチンのごとき、低分子量レクチンにも結合することができる高リガンド固体支持体は、固形樹脂ｍｌ当たり３００マイクロモルを超える固形樹脂ｍｌ当たり４００マイクロモルを超える、固形樹脂ｍｌ当たり５００マイクロモルを超えるごとき、固形樹脂ｍｌ当たり２００マイクロモルを超える所定の濃度にてそれにカップリングした糖誘導体を有する標準を用いて製造される。

洗浄液
本発明による洗浄液は、当業者に知られたいずれの適当な洗浄液であってもよい。特に、緩衝液は、レクチンおよびアミノ糖のごとき糖誘導体の間の会合に干渉することができる１以上の成分を含むことができる。

本発明の１つの具体例においては、レクチンに結合することができる糖、レクチンに結合することができる糖誘導体および二価金属イオンキレート剤よりなる群から選択される１以上の成分を含む。

レクチンに結合することができる糖／糖誘導体は、例えば、レクチンに結合することができるいずれの単糖および／または単糖誘導体であってもよい。例えば、本発明により支持体にカップリングさせるのに適したいずれの糖誘導体（後記参照）、または対応する誘導体化されていない糖、またはさらに修飾することができる対応する糖も洗浄液に含めることができる。そのような単糖は、例えば、マンノース、Ｎ−アセチルマンノサミン、グルコース、Ｎ−アセチメルグルコサミン、フルコース、Ｎ−アセチルフルコサミン、ガラクトースおよびアセチルガラクトアミンよりなる群から選択することができる。特に、単糖はＤ−グルコース、Ｄ−マンノース、Ｌ−フコースおよびＬ−ガラクトースよりなる群から選択される。

また、レクチンに結合することができる糖および／または糖誘導体は、糖の少なくとも一部がレクチンに結合することができるいずれの二糖、二糖誘導体、三糖、三糖誘導体、オリゴ糖、オリゴ糖誘導体、多糖または多糖誘導体であってもよい。有用なオリゴ糖の例は、限定されるものではないが、サッカロースおよびマルトースを含む。

二価金属イオンキレート剤は二価金属イオンにキレート化することができるいずれの剤でもある。二価金属イオンは例えばＣａ２＋であり得る。二価金属イオンキレート剤の例は、限定されるものではないが、ＥＤＴＡおよびシトレートを含む。

さらに、洗浄液は、当業者に知られたレクチンの溶出に適するいずれの他の方法で調製することもできる。例えば、洗浄液が高塩濃度または酸性ｐＨを含むものであってもよい。

レクチン
本発明により単離されたレクチンはいずれのレクチンであってもよい。例えば、レクチンは、例えば、ＭＢＬ（マンノース−結合レクチン）、ＳＰ−Ａ（肺界面活性剤プロテインＡ）、ＳＰ−Ｄ（肺界面活性剤プロテインＤ）、ＢＫ（またはＢＣ、ウシコングルチニン）およびＣＬ−４３（コレクチン−４３）のごときコレクチンであってよい。コレクチンは、全て、以下の人工物を呈する：それらは鎖間ジスルフィド結合を形成するように見えるＮ−末端システインリッチの領域、続いてのコラーゲン−様領域、α−ラセンコイルド−コイル領域、および最後に、パターン−認識領域であって、炭水化物認識ドメイン（ＣＲＤ）というＣ−型レクチンドメインを有する。名称コレクチンはコラーゲンおよびレクチンドメイン双方の存在に由来する。α−ラセンコイルド−コイル領域は個々のポリペプチドのトリマー化を開始して、コラーゲン三重コイルを形成し、それにより、各々が３つの個々のポリペプチドよりなるコレクチンサブユニットを生成し、他方、Ｎ−末端領域はサブユニットのオリゴマーの形成を媒介する。異なるコレクチンは区別される高次の構造、典型的には、サブユニットのテトラマーまたはサブユニットのヘキサマーを呈する。

本発明の好ましい具体例において、レクチンはＭＢＬまたはフィコリンであり；より好ましい具体例においては、レクチンはＭＢＬである。

用語レクチンは、天然に生じるレクチンならびに突然変異体のごときその変種であってよく、該変種は糖に結合できるものとする。

特に、本発明はＭＢＬを単離するのに適し、これは、本発明の実施例として以下により徹底的に記載するが、本発明を限定するものではない。

本発明によるレクチンは１以上のサブユニットを含むことができる。特に、ＭＢＬのごときコレクチンは１以上のサブユニットを含むことができ、コレクチンの各サブユニットは、通常、３つの個々のポリペプチドよりなる。例えば、ＭＢＬのごときコレクチンは、サブユニットのモノマー、ダイマー、トリマー、テトラマー、ペンタマー、ヘキサマー、ヘプタマー、オクタマー、ノナマー、デカタマー、１１−量体、１２−量体であってよく、あるいはＭＢＬのごときコレクチンは１２を超えるサブユニットを含んでもよい。

組成物
本明細書中に記載する比率Ｒはいずれかの適当な方法を用いて計算することができる。好ましい具体例においては、試料中のＲ値の定量的見積もりは以下のごとき行う：
ＳＤＳ−ＰＡＧＥイミュノブロットをＴＩＦＦファイル、またはもう１つの非圧縮ビットマップファイルにスキャンする。試料バンドに沿った画素密度を、Windows4.0（登録商標）についてのＳｃｉｏｎイメージ（Scion Corporation, www.scioncorp.comでのフリーウエアーデータバージョン）のごときピクチャー評価プログラムで測定され、（Excelのような）データ評価プログラムに送る。

所定の分子量に対応する移動はマーカーの移動から決定する。好ましい具体例においては、所定の分子量はダイマーレクチンの分子量であり（ＭＢＬについては約２００ｋＤａ）、従って、ダイマーレクチンに対応する移動はマーカーの移動から決定することができる（例えば、Precision Protein Standards, BioRad）。Ｒ値は、参照移動点を超える合計画素信号（ダイマーＭＢＬについては、２００ｋＤａ）を、参照移動点（ダイマーＭＢＬについては、２００ｋＤａ）のすぐ下の合計画素信号で割ったものとして計算される。Ｒ_０は出発物質における比率と定義され、他方、Ｒ_１は、本発明の方法の実行後に回収されたレクチン試料中の対応する評価ラインに沿った比率である。

比率Ｒの増加の程度は、比率Ｒ_０を有する出発物質に依存し、出発物質はレクチン調製物、例えば、ＭＢＬ調製物である。組成物の高分子量レクチンの少なくとも５０％がダイマーレクチンについての分子量を超える、好ましくはトリマーレクチンについての分子量を超える分子量を有するのが好ましい。レクチンがＭＢＬである場合、かくして、組成物の高分子量ＭＢＬの少なくとも５０％が、２２５ｋＤａを超える、２５０ｋＤａを超える、約３００ｋＤａを超えるごとき約２００ｋＤａを超える分子量を有するのが好ましい。

本発明に従ってＭＢＬ組成物を製造することによって、ＭＢＬ組成物は、好ましくは、天然宿主生物で生産した場合にＭＢＬに天然では会合したいずれの不純物、例えば、ＭＢＬを血漿ＭＢＬから精製した場合のＭＢＬに会合した不純物も実質的に含まない。

該方法は、いずれかの哺乳動物組換えＭＢＬのごときいずれかのＭＢＬ源から、あるいは血漿から高質量ＭＢＬ組成物を製造するのに用いることができる。しかしながら、ＭＢＬ源は、好ましくは、組換えＭＢＬであり、より好ましくは組成物のＭＢＬは、ＭＢＬサブユニットがＰＣＴ出願ＷＯ ００／７００４３において配列番号：１に示された配列またはその機能的同等体を含む３つのペプチド配列から組立てられたＭＢＬのごとくヒトである。

組換え製造
該方法はＭＢＬのごとき低および高質量レクチン双方を有するいずれのレクチン出発物質に適用することもできるが、組換えにより製造された調製物からのＭＢＬのごとき、高質量レクチンを製造するのに特に適している。

かくして、ＭＢＬ調製物は、好ましくは組換え調製物であり、ここに、該ＭＢＬ調製物は、
−ヒトＭＢＬペプチドをコードする遺伝子発現構築体またはその機能的同等体を調製し、
−宿主細胞培養を該構築体で形質転換し、
−培養基中で宿主細胞培養を培養し、それにより、ポリペプチドの発現およびポリペプチドの培養基への分泌を得、
−種々のＭＢＬ分子を含む調製物を得る；
ことによって得られる。

本発明によると、ＭＢＬ遺伝子からの配列はヒトＭＢＬ遺伝子からの、または他の動物種のＭＢＬ遺伝子からのものであってよく、ここに、この点で免疫系はヒト免疫系のように作用している。本発明による組換えＭＢＬの調製物の好ましい具体例の例は、引用して本明細書の一部とみなすＰＣＴ出願ＷＯ ００／７００４３の実施例１に記載されている。該実施例において、組換えＭＢＬはヒトＭＢＬ遺伝子からの配列を含む発現ベクターの使用によって調製される。

本発明はヒトＭＢＬ遺伝子の配列の機能的誘導体である配列を含む発現ベクターの使用にも関する。該機能的誘導体とは、発現ベクターの機能的差をもたらさない、または実質的にもたらさない塩基対改変を含む配列を意味し、このようにして調製したＭＢＬは、ヒトＭＢＬ遺伝子からの改変されていない配列を含む発現ベクターの使用によって調製されたＭＢＬに匹敵する機能を有する。

精製方法に加えて、遺伝子発現構築体および宿主細胞がより高次のオリゴマーの生産にも好都合であるのは好ましい。従って、遺伝子発現構築体は、好ましくは、ヒトＭＢＬ遺伝子からの少なくとも１つのイントロン配列またはその機能的同等体を含む。さらに、遺伝子発現構築体はヒトＭＢＬ遺伝子からの少なくとも２つのエクソン配列またはその機能的同等体を含むことができる。より好ましくは、遺伝子発現構築体はヒトＭＢＬ遺伝子からの少なくとも３つのエクソン配列またはその機能的同等体を含む。１を超えるエクソンを含む場合、該エクソン配列は好ましくはヒトＭＢＬ遺伝子におけるごとく整列させる。

該配列はイントロン配列を含むのが好ましいが、ある適用においては、発現構築体がＭＢＬサブユニットをコードするｃＤＮＡ配列またはその機能的同等体を含むのが便利であろう。

本発明は、非天然および天然ヒトＭＢＬに実質的に類似する変性条件下で構造特性を持つ組換えＭＢＬを得るための、哺乳動物細胞系またはトランスジェニック動物におけるｒＭＢＬの発現のためにＭＢＬ ｃＤＮＡ構築体よりはむしろＭＢＬ遺伝子発現構築体の使用をその要旨とする。「組換えヒトＭＢＬ」とは、作成された核酸から発現されるヒトＭＢＬを意味し、「ＭＢＬ遺伝子発現構築体」とは、哺乳動物細胞系での発現に適し、ヒトＭＢＬ遺伝子からの、または、限定されるものではないが、チンパンジーおよびアカゲザルのごとき他の動物種のＭＢＬ遺伝子からのエクソン配列および少なくとも１つのイントロン配列を含む発現ベクターを意味する。

好ましくは、ＤＮＡ配列は特許出願ＷＯ ００／７００４３の配列番号：１に示されたポリペプチド配列または機能的同等体をコードし、それにより、機能的同等体は前記したごとく定義される。配列番号：１は、データベース受入番号：Ｐ１１２２６を有するＭＢＬ配列に対応する。同等体は、本発明で言及した配列としての対応する特性を保有する配列のごとき、配列番号：１に示されたペプチド配列の修飾によって得られるが、ここに、１以上のアミノ酸は他のもので置き換えられているものとする。好ましくは、機能的同等体は保存的置換を含み、すなわち、ここに、１以上のアミノ酸は、蛋白質化学の分野の当業者が変化させるべき蛋白質の二次構造および三次構造を予測するように同様の特性を有するアミノ酸によって置換されている。保存的置換に適したアミノ酸は機能的に同様な側鎖を有するものを含む。例えば、疎水性残基、例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシンおよびメチオニンはもう１つのそのような残基を置き換えることができる。同様に、保存的置換は親水性残基：（例えば：アルギニンおよびリシン、グルタミンおよびアスパラギン、スレオニンおよびセリン）、塩基性残基（例えば、リシン、アルギニンおよびヒスチジン）、および／または酸性残基（例えば、アスパラギン酸およびグルタミン酸）を相互交換することを含むことができる。ポリペプチドの機能が保存される限り、機能的同等体は、例えば、アミノ酸の欠失または付加、またはアミノ酸の化学的修飾によって修飾することができる。

そのいずれの機能的同等体も含めた単離されたＭＢＬペプチドは、１つの具体例において、少なくとも１００のアミノ酸残基、少なくとも１５０のアミノ酸残基、少なくとも２００のアミノ酸残基、例えば、少なくとも２２０のアミノ酸残基、少なくとも２５０のアミノ酸残基のごとき少なくとも８０のアミノ酸残基を含む。

好ましい具体例において発現ベクターは、ヒトＭＢＬ遺伝子から、または限定されるものではないがチンパンジーおよびアカゲザルのごとき他の動物種のＭＢＬ遺伝子からのエクソン配列および少なくとも１つのイントロン配列を含む哺乳動物細胞系またはトランスジェニック動物における発現に適している。１つの具体例において宿主細胞培養はトランスジェニック動物で培養する。トランスジェニック動物とは、この意味においては、ヒトＭＢＬ遺伝子またはその断片またはミミックを含有し、それを発現するように遺伝子的に修飾されている動物を意味する。

好ましい具体例において、少なくとも本発明の遺伝子発現構築体はＤＮＡベースのベクター、ＲＮＡベースのベクターまたはキメラウイルスベースのベクターのごときウイルスベースのベクターを含む。ＤＮＡウイルスの例はサイトメガロウイルス、単純疱疹ウイルス、エプスタイン−バールウイルス、シミアンウイルス４０、ウシパピローマウイルス、アデノ関連ウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルスおよびバキュロウイルスである。哺乳動物宿主細胞において、多数のウイルスベースの発現系を用いることができる。アデノウイルスを発現ベクターとして用いる場合、本発明の核酸分子をアデノウイルス転写／翻訳制御複合体、例えば、後期プロモーターおよび三部リーダー配列に連結することができる。次いで、イン・ビトロまたはイン・ビボ組換えによって、このキメラ遺伝子をアデノウイルスゲノムに挿入することができる。ウイルスゲノムの非必須領域（例えば領域Ｅ−３の挿入の結果）、活力があり、かつ感染した宿主においてＭＡＳＰ−３遺伝子産物を発現することができる組み換えウイルスがもたらされる（例えば、LoganおよびShenk， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 3655-3659, 1984)。また、特異的開始シグナルは、挿入された核酸分子の効果的な翻訳に必要であろう。これらのシグナルはＡＴＧ開始コドンおよび隣接配列を含む。それ自身の開始コドンおよび隣接配列を含めた全遺伝子またはｃＤＮＡを適当な発現ベクターに挿入する場合、さらなる翻訳制御シグナルは必要でないであろう。しかしながら、コーディング配列の一部のみを挿入する場合、おそらくはＡＴＧ開始コドンを含めた外因性翻訳制御シグナルを供しなければならない。さらに、開始コドンは所望の暗号配列コーディング配列のリーディングフレームに対してイン・フェイスであって、全インサートの翻訳を確実としなければならない。これらの外因性翻訳制御シグナルおよび開始コドンは、天然および合成の種々の起源のものとすることができる。発現の効率は、適当な転写エンハンサーエレメント転写ターミネーターなどを含めることによって増強することができる（Bittnerら, Methods in Enzymol. 153: 516-544,1987）。

ＲＮＡウイルスの例は、セミリキフェレストウイルス、シンドビスウイルス、ポコウイルス、狂犬病ウイルス、インフルエンザウイルス、ＳＶ５、呼吸器系シンシチウムウイルス、ベネズエラウマウイルス、クンジンウイルス、センダイウイルス、水泡性口内炎ウイルス、およびレトロウイルスである。

キメラウイルスの例は、アデノウイルス、シンドビスウイルスおよびアデノウイルスーアデノ関連ウイルスである。特異的ベクターについては、ここに引用して本明細書の一部とみなすMakrides, S. C. ,"Components of vectors for Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells"を参照されたい。特に、エプスタン−バールウイルス複製起点またはＰｒｅｐ９ベクターを含めたこの機能的誘導体またはミミックを用いる。

１つの態様において、本発明はこの機能的誘導体を含めた、ヒトＭＢＬ遺伝子からの１以上のイントロン配列を含めることを特徴とするＭＢＬをコードする発現構築体を提供する。加えて、それは哺乳動物および昆虫を含めたウイルスまたは真核生物の遺伝子から選択されるプロモーター領域を含む。

プロモーター領域は、好ましくはヒトＭＢＬプロモーターとは異なるように選択し、好ましくはＭＢＬの収率およびＭＢＬオリゴマーのサイズ分布を最適化するためには、プロモーター領域は、問題とするベクターおよび宿主細胞に最も機能的に作用するよう選択する。

好ましい具体例においては、プロモーター領域はラウス肉腫ウイルスのロングターミナルリピートプロモーターおよびサイトメガロウイルス即時型プロモーター、延長因子−１アルファプロモーターよりなる群から選択される。

もう１つの具体例においてプロモーター領域は、他のウイルスおよび酵母細菌のごとき微生物から選択される。

組換えＭＢＬのより大きな収率を得るためには、プロモーター領域はマウス血管内皮成長因子の５’末端非翻訳領域のＱＢ１ ＳＰ１６３エレメントのごときエンハンサーエレメントを含めることができる。該構築体は、ＭＢＬを発現することができる宿主細胞培養を得るように宿主細胞を形質転換するのに用いる。宿主細胞培養は好ましくは真核生物宿主細胞培養である。真核生物細胞培養の形質転換とは、この意味において、細胞への組換えＤＮＡの導入を意味する。該プロセスで用いる発現構築体は、ヒト遺伝子およびチンパンジーからの遺伝子のごときこれとかなり似ている遺伝子を含めた哺乳動物遺伝子から選択されるＭＢＬコーディング配列を有することによって特徴付けられる。用いる発現構築体は、さらに、プロモーター領域が哺乳動物細胞および昆虫からの細胞を含めた、ウイルスまたは真核生物の遺伝子から選択されることを特徴とする。

本発明の組換えＭＢＬの製法は、宿主細胞培養が好ましくは真核生物、例えば、哺乳動物細胞培養であることを特徴とする。好ましい宿主細胞培養は、ヒト腎臓細胞の培養であり、より好ましい形態では、宿主細胞培養はヒト胚性腎臓細胞（ＨＥＫ細胞）である。本発明は、組換えヒトＭＢＬの生産のためのＨＥＫ２９３細胞系の使用をその要旨とする。「ＨＥＫ２９３細胞系」とは、限定されるものではないが、受託番号ＣＲＬ−１５７３およびＣＲＬ−１０８５２にてAmerican Type Culture Collectionに寄託された細胞系のごときヒト胚性腎臓組織に由来するいずれの細胞系も意味する。

他の細胞はニワトリ胚線維芽細胞、ハムスター卵巣細胞、ベビーハムスター腎臓細胞、ヒト頚部癌腫細胞、ヒトメラノーマ細胞、ヒト腎臓細胞、ヒト臍帯血管内皮細胞、ヒト脳内皮細胞、ヒト口腔腫瘍細胞、サル腎臓細胞、マウス線維芽細胞、マウス腎臓細胞、マウス結合組織細胞、マウス稀突起神経膠細胞、マウスマクロファージ、マウス線維芽細胞、マウス神経芽腫細胞、マウスプレ−Ｂ細胞、マウスＢリンパ腫細胞、マウスプラズマ細胞腫細胞、マウステトラカルシノーマ細胞、ラット神経膠星状細胞腫細胞、ラット乳房上皮細胞、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＤＨＫ、２９３、ＶＥＲＯ、ＨｅＬａ、ＭＤＣＫ、ＷＩ３８およびＭＩＨ３Ｔ３細胞とすることができる。

加えて、挿入された配列の発現を変調するか、あるいは所望の特異的な方法で遺伝子産物を修飾し、それをプロセッシングする宿主細胞株を選択することができる。蛋白質産物のその様な修飾（例えば、グリコシル化）およびプロセッシング（例えば、切断）は蛋白質の機能で重要であり得る。異なる宿主細胞は、翻訳後プロセッシングおよび蛋白質および遺伝子産物の修飾について特徴的かつ特異的なメカニズムを有する。適当な細胞系または宿主系は、発現させる外来性蛋白質の正しい修飾およびプロセッシングを確保するように選択することができる。この目的では、遺伝子産物の一次転写体の適切なプロセッシング、グリコシル化およびリン酸化のための細胞マシーンを有する真核生物宿主細胞を用いることができる。前記リストの哺乳動物細胞型は、適当な宿主細胞として働き得るものである。

宿主細胞培養はいずれかの適当な培養基で培養することができる。培養基の例は、例えば、インスリン、トランスフェリン、セレンおよびウシ胎児血清を補足したＲＰＭＩ−１６４０またはＤＭＥＭである。

精製
前記したごとく、本発明はＭＢＬの速い生産を可能とする。ＭＢＬの生産は以下の工程によって行うことができる。

発酵−ＭＢＬ発現細胞の培養
単離−本発明の適用
従って、レクチン組成物は、さらに、本発明の方法を適用する単離に先立って、または本発明の方法による単離に引き続いて、いずれかの適切な手段によって精製することができる。

例えば、レクチン組成物は、限定されるものではないが、濾過方法、沈殿方法、電荷に基づくイオン交換、サイズに基づくゲル浸透、疎水性に基づく疎水性相互作用、アフィニティークロマトグラフィーのごときによってさらに精製することができる。クロマトグラフィーを含むいずれかの物理−化学的単離方法によってさらに精製することができる。

加えて、１つの単離手法内で、本発明による方法を１を超える回数だけ適用することができる。特に、本発明による２以上の異なる方法を単離手法で適用することができ、ここに、該方法は固体支持体の選択、糖誘導体の選択および／または固体支持体にカップリングした所定濃度の糖誘導体の選択だけ異なり得る。

例えば、まず、それにカップリングした第一の所定濃度の糖誘導体を有する固体支持体を用いてレクチンの単離を行い、次いで、それにカップリングした第二の所定濃度の糖誘導体を有する固体支持体を用いてレクチンの単離を行うことができ、ここに、該第一の所定濃度は該第二の所定濃度よりも高くてもまたは低くてもよい。

特に、中程度分子量レクチンを単離する場合、２つの異なる濃度の糖誘導体と共に少なくとも２つの異なる固体支持体を用いる２−工程単離プロセスを用いることができる。２−工程単離プロセスの１つの例において、汚染画分、すなわち、第一の工程において所定分子量未満の分子量を有する未結合画分において、所望のレクチン、例えば、ヘプタマー未満のいずれかのレクチンが得られる。第二の工程において、未結合画分を、所定の分子量に関してもう１つのカットオフ点を有する、例えば、ダイマー分子量を超えるいずれかのレクチンに結合する異なる固体支持体に適用する。それにより、第二の固体支持体に結合したレクチンを溶出させた場合に、トリマー、テトラマー、ペンタマーおよびヘキサマーの所望の中程度分子量組成物が得られる。当業者には、２工程を逆の順序で行って、同一組成物を得ることができるのは明らかである。

機能
本発明により得られた組換えＭＢＬ組成物の機能は、好ましくは、血漿または血清ＭＢＬの機能と似ている。この意味において、ＭＢＬの機能は、機能的同等体に関し前記した補体系を活性化することができることを意味する。該機能は、ＭＢＬの１ｎｇ当たりのＭＢＬ活性の単位のごときＭＢＬの特異的活性として表すことができる。特異的活性として表した組換えＭＢＬの機能は、少なくとも、血清から精製されたＭＢＬの特異的活性の少なくとも５０％、より好ましくは血清から精製されたＭＢＬの特異的活性の少なくとも７５％のごとき、血清から精製されたＭＢＬの特異的活性の少なくとも２５％である。

ＭＢＬの機能は、補体系の活性化に導くＭＢＬ／ＭＡＳＰ複合体を形成するその能力によって見積もることができる。Ｃ４がＭＢＬ／ＭＡＳＰによって切断される場合、活性なチオールエステルは露出され、Ｃ４は親水性基近くに共有結合するようになる。かくして、Ｃ４ｂの実質的部分はコーティングされたプラスチックウエルに結合するようになり、抗−Ｃ４抗体によって検出することができる。

ＭＢＬ機能的活性についての定量的ＴＲＩＦＭＡは、１）１００ｍｌの緩衝液中の１ｍｇのマンナンでマイクロタイターウエルをコーティングし；２）Ｔｗｅｅｎ−２０でブロックし；３）テスト試料、例えば、希釈されたＭＢＬ調製物を適用し、４）ＭＢＬ結合血清を適用し（これは、ＭＢＬ／ＭＡＳＰ複合体の形成に導く）；別法として、ＭＢＬおよびＭＢＬ結合血清をマイクロタイターウエルへの適用に先立って混合することができる；５）精製された補体因子Ｃ４を５ｍｇ／ｍｌにて適用し；３７℃にて１時間インキュベートし；７）Ｅｕ−標識抗−Ｃ４抗体を適用し；８）増強溶液を適用し；次いで９）時間分解フルオロメトリーによってＥｕを読み取ることによって構築した。各工程の間に、工程８および工程９の間を除き、プレートを室温でインキュベートし、洗浄した。
ＥＬＩＳＡによる評価は、同様に、例えば、工程７においてビオチン−標識抗−Ｃ４を適用し；８）アルカリ性ホスファターゼ−標識アビジンを適用し；９）基質を適用し；次いで１０）色強度を読み取ることによって行うことができる。キャリブレーション曲線は、１つの選択された正常な血漿の希釈を用いて構築することができる。本発明に関しては、以下の血清が有用な血清の例である：血漿プールＬＪ ６．５７ ２８／０４／９７。機能は、ＭＢＬの１ｎｇ当たりのＭＢＬ活性の単位のごときＭＢＬの特異的活性として表すことができる。

ＭＢＬの機能的同等体を測定するためのもう１つのアッセイは、細胞上の受容体／複数受容体に結合する能力を測定することである。

ＭＢＬと細胞上の受容体／複数受容体との相互作用はサイトフルオロメトリーによって分析することができる。１）５０μｇ／ｍｌの濃度のＭＢＬを２×１０^５細胞と共にインキュベートする。結合は、１％ＦＣＳ、０．１％アジ化ナトリウムを含有するリン酸緩衝化塩溶液（ＰＢＳ）中で行う。２）細胞−結合ＭＢＬの検出には、ビオチニル化抗−ＭＢＬ抗体を適用し；３）続いて、ストレプトアビジン−ＦＩＴＣの添加、および４）フルオリメトリーによる混合物の分析を行う。

本発明の化合物での治療を必要とする該病気、障害および／または疾患は、例えば、ＭＢＬの欠乏の状態の治療、癌治療中の疾患と関連してあるいは臓器の埋込みおよび／または移植においてみられる特にそれらの感染を含めた免疫抑制化学療法と関連する癌および感染の治療を含む。また、本発明は、再発性流産と関連する疾患の治療を含む。

かくして、特に、医薬組成物は、感染、ＭＢＬ欠乏、癌、感染のごとき化学療法に伴う障害、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に関連する病気、先天性または後天性免疫不全に関連する病気から選択される臨床的疾患の治療および／または予防に用いることができる。より詳しくは、慢性炎症性脱髄性多発神経障害 （ＣＩＤＰ、多病巣性（Multifocal）運動神経障害、多発性硬化症、重症筋無力症、イートン・ランバート症候群、視神経炎、癲癇；原発性抗リン脂質症候群；慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、全身性強皮症、脈管炎、ウェーグナー肉芽腫症、シェーグレン症候群、若年性慢性関節リウマチ；自己免疫性好中球減少症、自己免疫性溶血性貧血、好中球減少症；クローン病、潰瘍性大腸炎、セリアック病；喘息、敗血症性ショック症候群、慢性疲労症候群、乾癬、トキシックショック症候群、糖尿病、静脈洞炎、拡張型心筋症、心内膜炎、アテローム性動脈硬化症、分類不能型免疫不全、ウィスコット・アルドリッチ症候群および重症複合型免疫不全（ＳＣＩＤ）を含む二次的低／無ガンマグロブリン血症、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）および多発性骨髄腫の患者における二次的低／無ガンマグロブリン血症、急性および慢性特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、同種骨髄移植（ＢＴＭ）、川崎病、およびグリアン・バール症候群。

投与経路は、静脈内、筋肉内、皮下または皮内のごときいずれかの適当な経路とすることができる。また、肺または局所投与も本発明では考えられる。

特に、ＭＢＬ組成物を投与して、先天性または後天性ＭＢＬ欠乏に関連する臨床的兆候を有する、またはそのような兆候を生じる危険性のある患者において感染を予防および／または治療することができる。広く種々の疾患が、化学療法または他の治療的細胞障害性処置、癌、ＡＩＴＳ、遺伝的素因、慢性感染、および好中球減少症のごときＭＢＬ−結合個体における感染に対して増大した罹患率に至り得る。

化学療法によって治療された癌患者は、しばしば、この疾患の治療におけるＭＢＬ療法の使用のバックグラウンドとなる、免疫系の細胞に対する薬物養生の悪影響のため感染に罹り易い。ＭＢＬの観察された低い血漿濃度（５００ｍｇ／ｍｌ未満）は、臨床的に重要な感染に対する増大した罹患率の指標であり、これらの患者の免疫防御は組換えまたは天然血漿−由来ＭＢＬの投与によって補強することができる。

かくして、医薬組成物は、化学療法の投与の開始に先立って、および化学療法の少なくとも一部の間に一定期間投与することができる。

ＭＢＬ組成物は一般的な「ブースター」として化学療法前に投与することができるか、あるいはそれはＭＢＬ欠乏が発生する危険性もあるヒトのみに投与することができる。危険性のある患者の群は、治療前にＭＢＬレベルを測定し、そのＭＢＬレベルが所定のレベル未満である治療に付すことによって決定することができる。低いＭＢＬレベルを測定するための制限は、ほとんどの群について５００ｍｇ／ｍｌ未満であると見積もられる。ＭＢＬレベルは、実施例９に記載された時間分解免疫蛍光アッセイ、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡまたはネフロメトリーによって測定することができる。

ＭＢＬを投与するためのもう1つの適応症は、ＭＢＬレベルが３００ｍｇ／ｍｌ未満、または２００ｍｇ／ｍｌ未満のごとく正常なレベルの５０％未満である場合である。

ＭＢＬ組成物は適当な投与量にて投与され、特にそれは通常適当な間隔で、例えば、化学療法の間に一週間に一回または二回投与される。

通常、投与当たり２ないし１０ｍｇ、ほとんどの場合５ないし１０ｍｇのごとき１ないし１００ｍｇが投与当たり投与される。ほとんどの場合、約０．１ｍｇ／ｋｇが投与される。

かくして、1つの態様において、本発明は、癌および病気の状態および、例えば、免疫系の障害および生殖系の障害の治療で用いるためのｒＭＢＬ、この断片またはミミックを含めたＭＢＬに関し、該治療は補体系のオプソニンおよび／または殺菌活性の創製、復元、増強および／または刺激、すなわち微生物病原体を認識し殺す免疫系の能力の増強よりなる。

さらに、本発明のある態様は、さらにもう１つの医薬を含むキット−オブ−パーツにおける本発明の組換え組成物の使用である。特に、他の医薬は抗生物質のごとき抗−微生物医薬であり得る。

流産に関しては、ＭＢＬの低い血漿レベルの頻度は、これらの場合組換えＭＢＬの投与によるＭＢＬレベルの復元による流産に対する罹患性の低下のためのバックグラウンドである、説明されていない再発流産を持つ患者で増加すると報告されている。

本発明の化合物の性質に関しては、その広い態様においては、本発明は、化合物およびマクロファージの間の直接的相互作用を介して、または標的表面の補体沈積を媒介することを介して、マクロファージによる摂取を増強することができるオプソニンとして作用することができる化合物に関する。その具体的な例はＭＢＬ、この断片またはミミックである。本発明は、過去に活性化されたよりも天然のヒトＭＢＬの構造により近く見える組換えヒトＭＢＬの合成の開示に基づく。

今回、本発明を種々の態様において、かつ適度に詳細に説明してきたが、さらに、本発明を好ましい具体例の非限定的な例によって以下に説明する。

実施例
実施例１：
固定化されたアミノ糖を用いるＭＢＬの精製
ＨｙＱベースの培地（ＨｙＣｌｏｎｅ）中で、ＷＯ ００／７００４３に記載されたＭＢＬをコードする発現構築体を含むＨＥＫ２９３ベースの細胞系に似たヒト細胞系によってＭＢＬを組換えにより生産し、引き続いて、固定化されたアミノ糖を用いることによってアフィニティークロマトグラフィーによってＭＢＬを精製した。

１．０ｇのＤ−マンノサミン（ＩＣＮ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ、 カタログ番号１０２２５２）を１３．５ｍＬの懸濁させたＮＨＳ−活性化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， カタログ番号１７−０９０６−０２）にカップリングさせることによって、Ｄ−マンノサミンカラムを調製した。

カップリング条件はＮＨＳ−活性化ゲルについての販売業者の指令書に正確に記載されたものであった：まず、樹脂を氷冷１ｍＭ塩酸で洗浄した。引き続いて、樹脂をアミノ糖（１００ｍｇ／ｍＬのＤ−マンノサミン、１０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ＝７．０）と共に４℃で一晩インキュベートした。翌日、樹脂をエタノールアミン緩衝液（１００ｍＮ、 ｐＨ７．０）でブロックし、ＨＲ１０／１０カラムに充填した。最後に、カラムを弱いトリス緩衝液（ｐＨ７．０）および弱い酢酸緩衝液（ｐＨ＝３．１）で三回平衡化した。

１リットルの細胞培養ブロスをカラムに添加し、ＥＤＴＡ含有緩衝液を用いて溶出させた。

対応する適量のＭＢＬ特異的イムノアッセイ、順送り、および溶出する主なピークにより、ＭＢＬは溶出する主なピーク中でほとんど全部が見出されることが明らかとなる（図１）。ＭＢＬ含有率は、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ６（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｉｅｎｃｅｓからの予備充填ＨＲ１０／３０）でのサイズ排除クロマトグラフィーのごときクロマトグラフィー技術、または還元後のＭＡＬＢＩ−ＭＳ調査によって容易に確認される。

実施例２
固定化されたアミノ糖を用いるＭＢＬの選択されたサイズ−画分の精製
レクチンオリゴマーの選択された画分は、アミノ糖リガンド濃度を調整することによって得ることができる。

比較的低いリガンド濃度を持つ樹脂は、０．１ｇのＤ−マンノサミン（Ｓｉｇｍａ，カタログ番号Ｍ４６７０）を１２．５ｍＬの懸濁させたＮＨＳ−活性化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ(Amersham Biosciences カタログ番号１７−０９０６−０２）にカップリングさせることによって作成した。

比較的高いリガンド濃度を持つ同様な樹脂は、１．０ｇのＤ−マンノサミン（Ｓｉｇｍａ， カタログ番号Ｍ４６７０）を１２．５ｍＬの懸濁させたＮＨＳ−活性化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ （Amersham Biosciences カタログ番号１７−０９０６−０２）にカップリングさせることによって作成した。

リガンドを含まない「ダミー」カラムは、１２．５ｍＬの懸濁させたＮＨＳ−活性化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ（Amersham Biosciences カタログ番号１７−０９０６−０２）へのカップリングの間にアミノ糖を含まないカップリング緩衝液を用いることによって作成した。

全ての場合において、カップリング条件は、正確にＮＨＳ−活性化ゲルについての販売業者の指令書に記載した通りであった。（実施例１に記載したごとく作成された）１リットルの細胞培養ブロスを各カラムに添加し、ＥＤＴＡ含有緩衝液を用いて溶出させた。対応する適用のＭＢＬ特異的イムノアッセイ、順送り、および溶出する主なピークにより、ＭＢＬは、高リガンド濃度でのカラム（「高−ｓｕｂ」カラム）から溶出する主なピーク中にほとんど全部見出されることが明らかになる。

ＭＢＬの選択された高質量画分は、低いリガンド濃度でのカラム（「低−ｓｕｂ」カラム）からの溶出する主なピーク中に見出され、残りのＭＢＬはラン−スルー画分に見られる。全てのＭＢＬは「ダミー」カラムの順送り画分に見出され、これは、ＭＢＬ親和性がリガンド特異的であることを示す（図２）。

実施例３
固定化されたアミノ糖での一連のカラムを用いるＭＢＬの選択されたサイズ−画分の精製

レクチンオリゴマーの特異的画分は、異なるリガンド濃度で一連のカラムに適用することによって得られる。

（実施例１に記載されたごとく作成された）１リットルの細胞培養ブロスを直列の二つのカラムに添加する：第一のカラムは低いアミノ糖リガンド濃度を持つカラム（実施例２に記載された低−ｓｕｂカラム）で、他方、第二のものは高いアミノ糖リガンド濃度を持つカラム（実施例２に記載された「高ｓｕｂ」カラム）である。

「低−ｓｕｂ」カラムからのＭＢＬの順送り画分は「高−ｓｕｂ」カラムに捕獲される。次いで、各カラムをＥＤＴＡ緩衝液（５０ｍＮ、 ｐＨ７．４）で溶出させる。「低−ｓｕｂ」カラムからの溶出する画分は、元の適用よりも高い平均サイズ分布を持つ高質量サイズＭＢＬを含む。「高−ｓｕｂ」カラムからの溶出する画分は「低−ｓｕｂ」カラム溶出物未満の質量を持つＭＢＬ画分を含むが、モノマーＭＢＬまたはダイマーＭＢＬのような低質量サイズＭＢＬは含まない。

実施例４
固定化されたアミノ糖を用いる血漿由来ＭＢＬの精製

血漿からのレクチンは固定化されたアミノ糖を用いて精製することができる。
Ｄ−マンノサミンカラムは実施例１に記載したごとく調製される。１／２リットルの血漿は血液バンクから入手し、ＣａＣｌ_２の添加後に軽く加熱することによって凝固させる。得られた血清をカラムに添加し、しばらくした後、ＥＤＴＡ含有緩衝液を用いて洗浄蛋白質を溶出させる。対応する適量の特異的イムノアッセイ、順送り、および溶出する主なピークにより、ＭＢＬがカラムからの溶出する主なピークにほとんど全部見出される。

ＭＢＬ含有率は、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ６（Amersham Biosciencesからの予備充填ＨＲ１０／３０）でのサイズ排除クロマトグラフィー、ＭｏｎｏＱ（APBiotech）でのアニオン交換クロマトグラフィーまたはＭＢＬ ＥＬＩＳＡ（Statens Serum Institute, Copenhagen）のごときクロマトグラフィー技術によって容易に確認される。

実施例５
Ｄ−マンノサミン以外の固定化されたアミノ糖を用いるＭＢＬの精製
ＮＨ_２基を介する固定化の後、固定化されたＤ−マンノサミンはレクチンに結合することができるいずれかのアミノ糖と交換することができる。リガンド濃縮の同一効果が見られる。

比較的低いリガンド濃度での樹脂は、０．１ｇのＤ−グルコサミン（Ｓｉｇｍａ，カタログ番号Ｇ４８７５）に１２．５ｍＬの懸濁されたＮＨＳ−活性化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ（Amersham Biosciences，カタログ番号１７−０９０６−０２）にカップリングさせることによって作成した。比較的高いリガンド濃度での同様な樹脂は、１．０ｇのＤ−グルコサミン（Ｓｉｇｍａ，カタログ番号Ｇ４８７５）を１２．５ｍＬの懸濁されたＮＨＳ−活性化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ（Amerhsm Biosciences，カタログ番号１７−０９０６−０２）にカップリングさせることによって作成した。双方の場合において、カップリング条件は、正確に、ＮＨＳ−活性化ゲルについての販売業者の指令書に記載された通りであった。

（実施例１に記載したごとくに作成した）１リットルの細胞培養ブロスを各カラムに添加し、ＥＤＴＡ含有緩衝液を用いて溶出させた。
対応する適用のＭＢＬ特異的イムノアッセイ、順送りおよび溶出する主なピークにより、ＭＢＬは、高いリガンド濃度でのカラム（「高−ｓｕｂ」カラム）から溶出する主なピーク中にほとんど全部が見出される（図３）。

実施例６
固定化されたアミノ糖を用いるレクチンの大規模精製
アフィニティークロマトグラフィーは容易に１０倍までスケールアップされる。
大きなＤ−グルコサミンカラムは、５．０ｇのＤ−グルコサミン（Ｓｉｇｍａ，カタログ番号Ｇ４８７５）を１００ｍＬの懸濁されたＮＨＳ−活性化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ（Amersham Biosciences，カタログ番号１７−０９０６−０２）にカップリングすることによって調製される。カップリング条件は、正確に、ＮＨＳ−活性化ゲルについての販売業者の指令書に記載されている通りであった。１０リットルの組換えにより生産されたＭＢＬを含む細胞培養ブロスをカラムに添加し、ＥＤＴＡ含有緩衝液を用いて溶出させる。

対応する適用のＭＢＬ特異的イムノアッセイ、順送りおよび溶出する主なピークにより、ＭＢＬは、溶出する主なピークにほとんど全部が見出されることが明らかとなる。ＭＢＬ含有量は、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ６（Amerhsm Biosciencesからの予備充填ＨＲ１０／３０）でのサイズ排除クロマトグラフィー、ＭｏｎｏＱ（Amerhsm Biosciences）でのアニオン交換クロマトグラフィー、Ｈｙｂ１３１−０１（Statens Serum Institute）を用いるウエスタンでのＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＭＢＬ特異的ＥＬＩＳＡ（Statens Serum Institute）、アミノ酸組成分析、および還元後のＭＡＬＤＩ−ＭＳ調査のごときクロマトグラフィーによって容易に確認される。

実施例７
固定化されたアミノ糖を用いるレクチンの検出
アミノ糖はマイクロタイターウエルに固定化し、レクチンの検出で適用することができる。

マイクロタイターウエル（Life Technologiesからの塩化シアヌル酸活性化ＣｖａＬｉｎｋ ＮＨ_２）をウエル当たり１．０μｇアミノ糖と共に販売業者によって記載されているごとくインキュベートすることによって、Ｄ−グルコサミンを該ウェルにカップリングさせる。ＭＢＬ含有試料の希釈をウエルに添加し、室温にて３時間インキュベートする。引き続いて、Ｈｙｂ１３１−０１（Statens Serum Institute）のような検出抗体を室温にて３時間適用し、続いて、ＨＲＰ−またはＡＰ−標識二次抗体（抗−ＩｇＧ，Ｄａｋｏ）と共に１時間インキュベートする。酵素基質の添加の後、ＭＢＬの量をＥＬＩＳＡリーダーで見積もる。

図1は、実施例１に記載された固定化されたＤ−マンノサミンを含むカラムに適用し、それから溶出された組換え生産したＭＢＬの溶出プロフィールを示す。その図は、血漿由来のＭＢＬに対して産生されたモノクローナル抗体を用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥウェスタンブロットを示す。ＭＷ＝マーカー（ＫＤａ）、Ａ＝適用（本発明の使用前の組換え由来ＭＢＬ）、Ｒ＝適用の間に得られたラン・スルー画分；Ｅ＝ＥＤＴＡで洗浄後の溶出画分（本発明の使用前の組換え由来ＭＢＬ） 図２は、実施例２に記載された固定化されたＤ−マンノサミンを含むカラムに適用し、それから溶出された組換え生産したＭＢＬの溶出プロフィールを示す。その図は、血漿由来のＭＢＬに対して産生されたモノクローナル抗体を用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥウェスタンブロットを示す。「ダミー」：アミノ糖なくしてカップリングされたカラム；「低―ｓｕｂ」＝少量のアミノ糖でカップリングさせたカラム、「高―ｓｕｂ」＝多量のアミノ糖でカップリングさせたカラム、「高―ｓｕｂ Ｒ」＝ＮａＯＨで再生後に多量のアミノ糖でカップリングさせたカラム、ＭＷ＝マーカー（ＫＤａ）、Ａ＝適用、Ｒ＝適用の間に得られたラン−スルー画分；Ｅ＝ＥＤＴＡで洗浄後の溶出画分、ＰＩ＝血漿由来ＭＢＬ（対照） 図３は、実施例５に記載された２つの濃度での固定化されたＤ−マンノサミンを含むカラムに適用し、それから溶出された組換え生産したＭＢＬの溶出プロフィールを示す。その図は、血漿由来のＭＢＬに対して産生されたモノクローナル抗体を用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥウェスタンブロットを示す。Ａ＝適用（本発明の使用前の組換え由来ＭＢＬ）、Ｒ＝適用の間に得られたラン・スルー画分；Ｅ＝ＥＤＴＡで洗浄後の溶出画分（本発明の使用前の組換え由来ＭＢＬ）、ＰＩ＝血漿由来ＭＢＬ（対照）

Claims (28)

1. −アミノ糖分子の一部分に反応部分として位置する第一級アミノ基および該分子の他の部分にマンノース結合レクチン（ＭＢＬ）結合部位を有する少なくとも１つのアミノ糖で誘導体化した固体支持体を確立し、ここに該アミノ糖はアミノ基を介して該固体支持体にカップリングしており、
   −種々のレクチン分子を含む調製物を該固体支持体に適用し、
   −該固体支持体にカップリングしたアミノ糖にレクチンを結合させ、
   −洗浄液で固体支持体を洗浄して、結合しなかった汚染物を除去し、次いで、
   −所望により、固体支持体から該レクチン(類)を回収する
   ことを含む該調製物から少なくとも１つのＭＢＬを単離する方法。
2. 該アミノ糖がマンノサミン、グルコサミン、ガラクトースアミン、フルクトサミン、Ｄ−マンノースアミン、Ｄ−グルコサミン、Ｌ−ガラクトースアミンおよびＬ−フコサミンよりなる群から選択される単糖である請求項１記載の方法。
3. 該アミノ糖がＤ−マンノサミンおよびＤ−グルコサミンよりなる群から選択される請求項１記載の方法。
4. 該固体支持体がクロマトグラフィーカラム樹脂であって、０ . １ｍｇないし１０００ｍｇアミノ糖／ｍｌ樹脂の所定の濃度を該固体支持体にカップリングする請求項１記載の方法。
5. ＭＢＬが該固体支持体から回収される請求項１ないし４のいずれか１項に記載の方法。
6. ＭＢＬが純粋な形態で回収される請求項５記載の方法。
7. 該固体支持体がクロマトグラフィーカラム、クロマトグラフィー樹脂、フィルター、プラスチック表面、ガラス表面および磁性粒子から選択される請求項１ないし６のいずれか１項に記載の方法。
8. 該カラムがＮ−ヒドロキシスクシンイミド活性化樹脂、臭化シアン活性化樹脂およびエポキシ活性化樹脂から選択される請求項７記載の方法。
9. 該プラスチック表面が活性化されたマイクロタイタープレートである請求項７記載の方法。
10. 該洗浄液が、二価金属イオンキレート剤およびＭＢＬに結合することができる糖よりなる群から選択される１またはそれを超える成分を含み、該糖がマンノース、Ｎ−アセチルマンノサミン、グルコース、Ｎ−アセチルグルコサミン、フルクトース、Ｎ−アセチルフルクトサミン、ガラクトースおよびＮ−アセチルガラクトサミン、サッカロースおよびマルトースよりなる群から選択される請求項１ないし９のいずれか１項に記載の方法。
11. 種々のＭＢＬ分子を含む組成物の比率Ｒを増加させる方法であって、ここにＲは所定の分子量未満またはそれと等しい低分子量を有するＭＢＬ分子の濃度に対する所定の分子量を超える高分子量を有するＭＢＬ分子の濃度の比率であり、
    低分子量ＭＢＬおよび高分子量ＭＢＬを含むＭＢＬ調製物を得、ここに該調製物は比率Ｒ＝Ｒ _０ を有し、
    該調製物を請求項１ないし９のいずれか１項に記載の単離する方法に適用し、ついで
    回収したＭＢＬ分子を含む組成物を得る
    ことを含む該方法。
12. 種々のＭＢＬ分子を含む組成物の製法であって、ここに、該ＭＢＬ分子の全てはダイマーＭＢＬについての所定の分子量を超える分子量を有し、
    所定の分子量を超える高分子量を有するＭＢＬ分子および所定の分子量未満またはそれと等しい低分子量を有するＭＢＬ分子を含むＭＢＬ調製物を得、ここに該調製物は比率Ｒ＝Ｒ _０ を有し、Ｒは所定の分子量未満またはそれと等しい低分子量を有するレクチン分子の濃度に対する所定の分子量を超える高分子量を有するレクチン分子の濃度の比率であり、
    請求項１ないし９のいずれか１項に記載の単離する方法に該調製物を適用し、
    回収したレクチン分子を含む組成物を得る
    ことを含む該製法。
13. 所定の分子量を超える高分子量を有するＭＢＬ分子およびダイマーレクチンについての分子量未満またはそれと等しい低分子量を有するＭＢＬ分子を含むＭＢＬ調製物から、種々のＭＢＬ分子を含む組成物を分離する方法であって、ここに、該ＭＢＬ分子の全ては所定の分子量を超える高分子量を有し、ここに該調製物は比率Ｒ＝Ｒ _０ を有し、Ｒは所定の分子量未満またはそれと等しい低分子量を有するＭＢＬ分子の濃度に対する所定の分子量を超える高分子量を有するＭＢＬ分子の濃度の比率であり、
    該ＭＢＬ調製物を得、
    請求項１ないし９のいずれか１項に記載の単離方法に該調製物を適用し、ついで
    回収したＭＢＬ分子を含む組成物を得る
    ことを含む該方法。
14. 種々のＭＢＬ分子を含む組成物の製法であって、ここに、該ＭＢＬ分子の全ては所定の分子量未満またはそれと等しい低分子量を有し、
    所定の分子量を超える高分子量を有するレクチン分子および所定の分子量未満またはそれと等しい低分子量を有するレクチン分子を含むＭＢＬ調製物を得、ここに、該調製物は比率Ｒ＝Ｒ _０ を有し、Ｒは所定の分子量未満またはそれと等しい低分子量を有するレクチン分子の濃度に対する所定の分子量を超える高分子量を有するレクチン分子の濃度の比率であり、
    請求項１ないし９のいずれか１項に記載の単離方法に該調製物を適用し、ついで
    洗浄液の結合しなかったＭＢＬ分子を含む組成物を得る
    ことを含む該製法。
15. 種々のＭＢＬ分子を含む調製物の比率Ｒを増加させる方法であって、ここにＲは高分子量および低分子量を有するＭＢＬ分子の濃度に対する中間的分子量を有するレクチンの濃度の比率であり、
    ここに、該中間的分子量は第１の所定の分子量未満であって第２の所定の分子量を超える分子量であり、高分子量は第１の所定の分子量を超えるかまたはそれと等しい分子量であって、低分子量は第２の所定の分子量未満またはそれと等しい分子量であり；
    ａ）低分子量ＭＢＬ、中間的分子量ＭＢＬおよび高分子量ＭＢＬを含むＭＢＬ調製物を得、該調製物は比率Ｒ＝Ｒ _０ を有し；ついで
    ｂ）請求項１ないし９のいずれか１項に記載の単離方法に該調製物に適用し；
    ｃ）回収したＭＢＬ分子を含む組成物を得、ついで
    ｄ）所望により、異なる濃度のアミノ糖を有する固体支持体を用いて工程ｂ）を繰り返す
    工程を含む該方法。
16. 組成物の高分子量ＭＢＬの少なくとも５０％が、２２５ｋＤａを超えるような、２５０ｋＤａを超えるような、３００ｋＤａを超えるような、２００ｋＤａを超える分子量を有する請求項１５記載の方法。
17. 低分子量ＭＢＬが２００ｋＤａ未満の分子量を有するＭＢＬを含む請求項１５記載の方法。
18. ＭＢＬ調製物が組換えＭＢＬ調製物である請求項１ないし１７のいずれか１項に記載の方法。
19. ＭＢＬ調製物を
    −ヒトＭＢＬペプチドをコードする遺伝子発現コンストラクトを調製し、
    −該コンストラクトで宿主細胞培養物を形質転換し、
    −該宿主細胞培養物を培地で培養し、それによって培地へのポリペプチドの発現および分泌を得、ついで
    −種々のＭＢＬ分子を含む調製物を得る
    ことによって得る請求項１８記載の方法。
20. 遺伝子発現コンストラクトがヒトＭＢＬ遺伝子からの少なくとも１つの イントロン配列を含む請求項１９記載の方法。
21. 遺伝子発現コンストラクトがヒトＭＢＬ遺伝子からの少なくとも２つのエクソン配列を含む請求項２０記載の方法。
22. 遺伝子発現コンストラクトがＭＢＬサブユニットをコードするｃＤＮＡ配列を含む請求項１９記載の方法。
23. 宿主細胞培養物をイン・ビトロ (in vitro) で培養する請求項１９記載の方法。
24. 宿主細胞培養物が真核生物宿主細胞培養物である請求項１９記載の方法。
25. 宿主細胞培養物が哺乳動物宿主細胞培養物である請求項１９記載の方法。
26. クロマトグラフィーカラム樹脂である固体支持体であって、当該固体支持体は、マンノサミン、グルコサミン、ガラクトサミン、フルクトサミン、Ｄ−マンノサミン、Ｄ−グルコサミン、Ｌ−ガラクトサミンおよびＬ−フコサミンよりなる群から選択される０ . １ｍｇないし１０００ｍｇアミノ糖／ｍｌ樹脂の所定の濃度の、第一級アミノ基を有する少なくとも１つのアミノ糖が当該固体支持体に共有的にカップリングしており、該アミノ糖はアミノ基を介して当該固体支持体にカップリングしている該固体支持体。
27. アミノ糖がＤ−マンノサミンおよびＤ−グルコサミンよりなる群から選択される請求項２６記載の固体支持体。
28. 該カラムがＮ−ヒドロキシスクシンイミド活性化樹脂、臭化シアン活性化樹脂およびエポキシ活性化樹脂から選択される請求項２６記載の固体支持体。

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