DE68924183T2

DE68924183T2 - Zusammensetzung und Verfahren zum Schutz gegen durch Mikroorganismen verursachte Krankheiten.

Info

Publication number: DE68924183T2
Application number: DE68924183T
Authority: DE
Inventors: Daryl Faulds; Mimi Vishoot
Original assignee: ML Technology Ventures LP
Current assignee: ML Technology Ventures LP
Priority date: 1988-01-20
Filing date: 1989-01-17
Publication date: 1996-03-21
Anticipated expiration: 2009-01-18
Also published as: ATE127693T1; US4985243A; EP0325191A3; DK22389A; JPH02711A; GR3017427T3; EP0325191B1; EP0325191A2; ES2078900T3; DE68924183D1; JPH0768142B2; ZA89447B; DK22389D0; PT89488A; IE890141L

Description

Diese Erfindung betrifft eine Zubereitung und ein Verfahren zum Schutz gegen durch Mikroorganismen hervorgerufene Krankheiten. Insbesondere betrifft die Erfindung eine Zubereitung und ein Verfahren zum Schutz gegen Krankheiten, die durch Mikroorganismen, denen es an Biosynthesewegen für Nucleinsäurevorläufer in speziellen Mycoplasma-Organismen mangelt, hervorgerufene Krankheiten und insbesondere gegen durch M. hypopneumoniae hervorgerufene Mycoplasma-Pneumonie bzw. -Lungenentzündung bei Schweinen.
Es gibt Krankheiten, die durch die verschiedensten Mikroorganismen, z.B. Mycoplasma-Organismen, hervorgerufen werden. Die durch Mycoplasma-hypopneumoniae (insbesondere bei Schweinen) verursachte Krankheit kommt weltweit vor und führt zum Verlust der Schweine. Die Krankeit hat im allgemeinen unbrauchbare, verkümmerte und kränkliche Tiere zur Folge und führt dazu, daß die Schweine oftmals für eine Sekundärinfektion durch opportunistische Mikroorganismen anfällig werden.
Es gibt bereits zahlreiche Versuche zur Bereitstellung eines Impfstoffs zum Schutz von Schweinen gegen Mycoplasma-Pneumonie, die betreffenden Impfstoffe waren jedoch bislang nicht erfolgreich.
Kristensen und Mitarbeiter fanden nach einer Impfung mit hitzeinaktivierten Zellen von Mycoplasina-hypopneumoniae keinen Schutz von Schweinen gegen Mycoplasma-Pneumonie "Am. J. Vet. Res." 42, 784 (1981)).
Etheride und Mitarbeiter fanden nach intravenöser, subkutaner und interperitonialer Gabe eines Lebendimpfstoffs nur einen unvollständigen Schutz gegen eine Lungenbesiedelung durch Mycoplasma ("Res. Vet. Sci." 33, 188 (1982)).
Ross und Mitarbeiter ("Am. J. Vet. Res." 45, 1899 (1984)) beschrieben, daß der Einsatz von nach einem Gefrier- Auftau-Verfahren hergestellten Mycoplasma-hypopneumoniae-Extrakten lediglich einen variablen Schutz bot und in einigen Fällen zu einer stärkeren Läsionsentwicklung führte. Ross und Mitarbeiter behaupteten auch, daß eine Injektion eines solchen Mittels bei Schweinen einen gewissen Schutz gegen eine intratracheale Provokation von 4 ml Überstand aus einer 10%igen Suspension einer pneumonischen Lunge mit dem Stamm VPP-11 in Kombination mit 1 ml einer 24 h Kultur von bis Passagen desselben Stammes bot.
Bartholeyns und Mitarbeiter ("Europ. J. Cancer" 15(4), 85-91 (1979)) beschreiben, daß ein Dimeres von Rinderpankreas-RNase A die Proliferation von Tumorzellen blockiert.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine Zubereitung zum Schutz eines Tieres gegen eine durch einen Mikroorganismus, dem es an Biosynthesewegen für Nucleinsäurevorläufer ermangelt und bei dem es sich um ein Mycoplasma, Acholeplasma, Spiroplasma, Ureaplasma oder Anaeroplasma handelt, hervorgerufene Krankheit, umfassend:
(a) eine Komponente, ausgewählt aus (i) Nucleasen, die Antikörper mit eine äußere Nuclease des Mikroorganismus erkennenden Paratopen produzieren, und (ii) Antikörpern mit eine äußere Nuclease des Mikroorganismus erkennenden Paratopen und
(b) einen physiologisch akzeptablen Träger.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung werden die Nucleasen/Antikörper zur Herstellung eines Medikaments zum Schutz eines Tieres gegen eine solche Krankheit benutzt.
Bei der äußeren Nuclease handelt es sich um eine beliebige Nuclease, die durch bzw. an eine(r) äußere(n) Oberfläche des Mikroorganismus, gegen den Schutz gewährleistet werden soll, ausgeschieden wird und/oder freiliegt. Bei der Nuclease kann es sich um eine Desoxyribonuclease (DNA-abbauendes Enzym bzw. DNase und/oder eine Ribonuclease RNA-abbauendes Enzym bzw. RNase), die äußere RNase bzw. DNase erkennende Antikörper produziert, handeln. Die verwendete RNase oder DNase kann eine bzw. braucht keine enzymatische Aktivität auf(zu)weisen, solange sie nur die Fähigkeit zur Produktion von Antikörpern des beschriebenen Typs besitzt.
Obwohl die vorliegende Erfindung nicht durch irgendeine Erklärung beschränkt werden soll, erfordern vermutlich bestimmte Organismen ohne die Fähigkeit zur Synthese von Nucleinsäurevorläufern die Anwesenheit von Nuclease zur Herstellung von für das Wachstum und die Infektion erforderlichen Purinen und Pyrimidinen, wobei vermutlich die durch die bzw. auf der Oberfläche der Zelle ausgeschiedene bzw. freiliegende Nuclease dahingehend wirkt, daß aus den durch die Wirtzellen gelieferten Nucleinsäuren Purine und Pyrimidine entstehen. Die Verabreichung einer geeigneten Nuclease, die spezifisch die äußere Nuclease bindet oder entfernt, bietet hierbei Schutz gegen das Wachstum von den und die Infektion durch die Mikroorganismen. Somit kann durch die Einleitung der Produktion von äußere RNase und/oder äußere DNase des Mikroorganismus, gegen den Schutz gesucht wird, erkennenden Antikörpern das Wachstum von solchen und die Infektion durch solche Mikroorganismen ausgeschaltet oder gehemmt werden.
In manchen Fällen läßt sich der Schutz unter Verwendung von lediglich RNase oder lediglich DNase erreichen. In anderen Fällen kann es erforderlich sein, sowohl RNase als auch DNase zu verabreichen. Es dürfte selbstverständlich sein, daß der betreffende Einsatz davon abhängt, ob der Mikroorganismus zur Produktion der für das Wachstum und die Infektion erforderlichen Purine und Pyrimidine RNase und/oder DNase benötigt.
Die zu Schutzzwecken verwendete Nuclease läßt sich aus dem Mikroorganismus, gegen den Schutz angestrebt wird, durch Gewinnen äußerer Nuclease aus dem Organismus erhalten. Als weitere Alternative kann man ein rekombinantes DNA-Molekül mit Kodierung für eine Aminosäuresequenz mit einer oder mehderen Antigenendeterminante(n) (Epitope) der äußeren Nuclease zur Herstellung der Nuclease auf gentechnischem Wege einsetzen. Die auf gentechnischem Wege hergestellte Nuclease sollte Antikörper liefern, die die äußere Nuclease erkennen, d.h. eine Immunantwort liefern.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung den Schutz gegen durch Mycoplasma-Organismen hervorgerufene Krankheiten. Die Nuclease besteht vorzugsweise aus einer DNase, die DNase besteht vorzugsweise aus einer DNA-Endonuclease.
Zur Verwendung im Rahmen der Erfindung kann man einen Impfstoff zum Schutz von Tieren, insbesondere nicht-menschlichen (Säuge)Tieren, gegen durch Mikroorganismen des beschriebenen Typs hervorgerufene Krankheiten bereitstellen. Insbesondere zum Schutz von Schweinen gegen Mycoplasma-Organismen wird eine Nuclease verwendet, die ein oder mehrere Epitop(e) der in Schweine-Mycoplasma vorhandenen äußeren DNase aufweist. Zum Schutz von Schweinen gegen Mycoplasma-Lungenentzündung enthält der betreffende Impfstoff insbesondere eine Nuclease, z.B. DNase, in Kombination mit einem geeigneten physiologisch akzeptablen Vehikel, beispielsweise einem Träger und/oder Hilfsstoff.
Die vorliegende Erfindung wird - lediglich zur Veranschaulichung - im Hinblick auf den Schutz gegen durch Mycoplasma hervorgerufene Krankheiten anhand der Verwendung von DNase in einem Impfstoff näher erläutert. Die DNase kann von dem Mycoplasma-Organismus herrühren, d.h. die DNase kann aus der Membran des Mycoplasma-Organismus mit Hilfe eines milden Detergens, z.B. eines nicht-ionischen Detergens, zum Löslichmachen der DNase gewonnen werden.
Das nicht-ionische Deterqens wird in zum Löslichmachen der DNase ausreichenden Mengen eingesetzt. Das Gewichtsverhältnis nicht-ionisches Detergens/zu behandelnder Teil des Mycoplasma-Organismus beträgt im allgemeinen 0,05/1 bis 10,0/1, vorzugsweise 0,5/1 bis 5,0/1. Die Behandlung erfolgt im allgemeinen bei einer Temperatur, die 40º nicht übersteigt. Speziell arbeitet man bei einer Temperatur in der Größenordnung von 1ºC bis 37ºC.
Die Behandlungsdauer sollte ausreichen, um die DNase löslich zu machen. Im allgemeinen dauert dies - obwohl in einigen Fällen auch längere oder kürzere Behandlungszeiten eingehalten werden können - 0,5 bis 18 h.
Die zum Löslichmachen der DNase verwendete Lösung besitzt im allgemeinen eine Ionenstärke von 0,05 bis 1,0 M Salz. Ein bevorzugtes löslichmachendes Mittels enthält 0,2 M Natriumionen.
Wie bereits angedeutet, wird im allgemeinen die Membran des Mycoplasma-Organismus einer derartigen Behandlung unterworfen. Eine solche Membran läßt sich durch Aufbrechen des Organismus nach auf dem einschlägigen Gebiet allgemein bekannten Maßnahmen, z.B. durch einen Gefrier-Auftau-Zyklus, durch Beschallen und dgl., gewinnen. Andererseits kann die DNase aüch vom Vollorganismus herrühren. Die Wahl einer geeigneten Maßnahme dürfte unter Beachtung der hierin gegebenen Anleitungen innerhalb des Fachwissens des Fachmanns liegen.
DNase läßt sich auch aus dem Überstand einer Mycoplasma- Zellkultur, d.h. durch Ausfällen von DNase aus dem Zellüberstand mit Ammoniumsulfat gewinnen.
Als weitere Alternative kann die DNase oder ein Fragment oder Derivat derselben auch auf gentechnischem Wege hergestellt werden, z.B. durch Verwendung eines rekombinanten DNA- Moleküls mit Kodierung für eine Nuclease oder ein Fragment oder Derivat derselben (insbesondere einer DNase oder eines Fragments oder Derivats derselben, welche(s) Antikörper mit eine äußere Nuclease des Mikroorganismus, gegen den Schutz gesucht wird, erkennenden Paratopen produziert).
Eine solche Nuclease wird in dem Impfstoff in einer zum Schutz gegen eine durch die Mikroorganismen, beispielsweise einen Mycoplasma-Organismus, hervorgerufene Krankheit, insbesondere durch M. hypopneumoniae hervorgerufene Mycoplasma- Lungenentzündung bzw. Pneumonie bietenden Menge verwendet.
Im allgemeinen enthält der Impfstoff mindestens 5, vorzusgweise mindestens 100 Mikrogramm einer solchen Nuclease, z.B. DNase und/oder eines Fragments oder Derivats pro Dosis. in den meisten Fällen enthält der Impfstoff die Nuclease und/oder das Fragment oder das Derivat nicht in einer Menge über mg.
Bei Einsatz von Mehrfachdosen sollte im allgemeinen der Impfstoff nicht in einer drei Dosen über 8 Wochen übersteigenden Menge verabreicht werden.
Der Ausdruck "Schutz" oder "schützend" bedeutet im Zusammenhang mit dem hierin beschriebenen Impfstoff bzw. mit den hierin beschriebenen Verfahren, daß der Impfstoff eine durch den Organismus hervorgerufene Krankheit, insbesondere durch M. hypopneumoniae hervorgerufene Mycoplasma-Lungenentzündung, verhindert und/oder die Schwere der durch den Organismus hervorgerufenen Krankheit, insbesondere der durch M. hypopneumoniae hervorgerufenen Mycoplasma-Lungenentzündung bzw. -Pneumonie, lindert.
Das im Zusammenhang mit der Nuclease eingesetzte Vehikel kann aus irgendeinem der verschiedensten Vehikel bestehen. Als repräsentative Beispiele für geeignete Vehikel seien genannt: Mineralöl, Alaun, synthetische Polymere und dgl.. Vehikel für Impfstoffe sind auf dem einschlägigen Fachgebiet bekannt. Die Auswahl eines geeigneten Vehikels dürfte unter Beachtung der hierin gegebenen Lehren innerhalb des Fachwissens des Fachmanns liegen. Die Auswahl eines geeigneten Vehikels hängt auch von der Art und Weise der Verabreichung des Impfstoffs ab. Der Impfstoff kann in Form einer injizierbaren Dosis vorliegen und intramuskulär, intravenös, intratracheal, intraperitoneal, intranasal, d.h. als Inhalationsmittel, oder intraokular oder durch subkutane Verabreichung verabreicht werden. Es ist auch möglich, den Impfstoff oral durch Vermischen der aktiven Komponenten mit Futter oder Wasser, in Tablettenform und dgl. zu verabreichen.
Andere Verabreichungsformen des Impfstoffs sollten sich für den Fachmann aus den hierin gegebenen Lehren eröffnen. Folglich ist die vorliegende Erfindung nicht auf irgendeine spezielle Abgabeform beschränkt.
Selbstverständlich kann der Impfstoff neben der Nuclease oder Fragmenten oder Derivaten der beschriebenen Art auch noch (andere) aktive Komponenten oder Hilfstoffe enthalten.
Selbstverständlich kann der Impfstoff ferner eine Kombination von aktiven Komponenten, beispielsweise ein Gemisch aus geeigneten Nucleasefragmenten oder ein Gemisch aus Nuclease und einem Nucleasefragment und dgl. umfassen.
Der Impfstoff wird im allgemeinen bei nicht-menschlichen (Säuge) Tieren, die für durch Mycoplasma-Organismen hervorgerufene Krankheiten, insbesondere durch M. hypopneumoniae hervorgerufene Mycoplasma-Lungenentzündung oder -Pneumonie, anfällig sind, insbesondere bei Schweinen und Rindern, eingesetzt.
Der Antikörper kann aus einer Nuclease (RNase oder DNase) mit den zuvor beschriebenen Kennwerten nach auf dem einschlägigen Fachgebiet bekannten Maßnahmen hergestellt werden. Bei dem Antikörper kann es sich entweder um einen monoklonalen oder polyklonalen Antikörper handeln. Um Schutz zu bieten, kann der Antikörper oder eine geeignete Fraktion oder ein geeignetes Derivat desselben benutzt werden.
Der Antikörper kann in einer Zubereitung verwendet und in der zuvor im Zusammenhang mit dem Einsatz einer Nuclease beschriebenen Weise verabreicht werden. Bei Verwendung eines Antikörpers enthält der Impfstoff mindestens 5, vorzugsweise mindestens 50 ug des betreffenden Antikörpers pro Dosis. In den meisten Fällen überschreitet die Einheitsdosis mg nicht.
Somit werden gemäß dieser Ausführungsform der vorliegenden Erfindung Antikörper, die äußere Nuclease des Mikroorganismus, gegen den das Tier zu schützen ist, außerhalb des Tiers produzieren, bereitgestellt. Die betreffenden Antikörper oder Fragmente oder Derivate derselben werden dann zum Schutz des Tieres an dieses verabreicht.
DNase zur Verwendung im Rahmen der vorliegenden Erfindung läßt sich - wie beschrieben - direkt aus dem M. hypopneumoniae-Organismus gewinnen und zum Erhalt praktisch reiner DNase reinigen.
Man kann auch eine solche DNase auf gentechnischem Wege herstellen. In diesem Falle könnte die M. hypopneumoniae- DNase in einem von M. hypopneumoniae verschiedenen Organismus, beispielsweise mit Hilfe eines rekombinanten DNA-Moleküls mit Kodierung für eine Aminosäuresequenz, die äußere DNase von M. hypopneumoniae erkennende Antikörper produziert, hergestellt werden.
Die äußere M. hypopneumoniae-DNase ist weiterhin gekennzeichnet durch:
A. Wärmelabilität. Die Zelloberflächen-DNase wird durch 10-minütiges Inkubieren bei 56ºC inaktiviert.
B. Trypsinempfindlichkeit. Die Zelloberflächen-DNase- Aktivität wird durch Behandlung intakter Zellen mit Trypsin aufgehoben.
C. scheinbares Molekulargewicht. Bei Durchführung einer SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese läuft das Enzym als Dublette mit einem scheinbaren Molekulargewicht von bis 40 kDa.
D. Ionenaustaucheigenschaften. Die DNase geht eine Bindung an DEAE-Cellulose in 0,0175 M NaCl ein und kann mit einem NaCl-Gradienten von 0,0175 M bis 0,5 M eluiert werden. Die DNase geht eine Bindung mit Phosphocellulose in 0,0175 M NaCl ein und kann mit einem NaCl-Gradienten von 0,175 M bis 1,0 M eluiert werden.
Eine erfindungsgemäße Zubereitung kann neben der Nuclease ein oder mehrere Protein(e) mit der Fähigkeit zur Produktion (Herauslockung) eines Antikörpers, der ein M. hypopneumoniae-Antigen ohne immunsuppressive Aktivität erkennt, enthalten. Ein im wesentlichen von M. hypopneumoniae-Antigenen mit immunsuppressiver Aktivität freier Impfstoff dieses Typs kann zum Schutz gegen Mycoplasma-Pneumonie oder -Lungenentzündung verwendet werden. Das Gewichtsverhältnis Protein/Nuclease kann 100/1 bis 1/40, vorzugsweise 4/1 bis 1/4 betragen.
Ein Impfstoff gemäß der Erfindung kann ferner das (die) betreffende(n) eine oder mehrere Protein(e) und Antikörper zur Verwendung im Rahmen der Erfindung enthalten. Das Gewichtsverhältnis Antikörper/Protein kann von 1000/1 bis 10000/1 reichen.
Es hat sich gezeigt, daß Mycoplasma hypopneumoniae-Organismen eine Menge Antigene beinhalten. Einige derselben zeigen immunsuppressive Aktivität, anderen fehlt eine immunsuppressive Aktivität. Es hat sich ferner gezeigt, daß die Mycoplasma hypopneumoniae-Antigene ohne immunsuppressive Aktivität zur Verwendung in einem Impfstoff gegen Mycoplasma-Lungenentzündung verwendet werden können.
Die Proteine, die einen ein Mycoplasma hypopneumoniae- Antigen erkennende Antikörper heraus locken können, können rekombinanten oder natürlichen Ursprungs sein. Wenn sie natürlichen Ursprungs sind, lassen sie sich aus Mycoplasma hypopneumoniae-Organismen unter selektiver Gewinnung der Mycoplasma hypopneumoniae-Antigene ohne immunsuppressive Aktivität herstellen.
Ein Verfahren zur Bestimmung, ob eine Verbindung oder Zubereitung immunsuppressive Aktivität besitzt oder nicht, wird von Suter und Mitarbeitern in "Infect. and Immun." 49, 6(1985) beschrieben.
Im Rahmen eines (bestimmten) Verfahrens wird die Membran des Mycoplasma hypopneumoniae-Organismus mit einem milden Detergens, insbesondere einem nicht-ionischen Detergens, behandelt, um sowohl eine lösliche als auch eine unlösliche Fraktion herzustellen. Der Anmelder hat gefunden, daß die unlösliche Fraktion Mycoplasma hypopneumoniae-Antigene ohne immunsuppressive Aktivität, die durch Behandlung mit einem milden Detergens erhaltene lösliche Fraktion Mycoplasma hypopneumoniae-Antigene ohne immunsuppressive Aktivität sowie Substanzen mit immunsuppressiver Aktivität enthalten. Die durch Behandeln der Membran eines Mycoplasma hypopneumoniae- Organismus mit einem milden Detergens erhaltene unlösliche Fraktion kann in Verbindung mit mindestens einer Nuclease von Mycoplasma hypopneumoniae zur Bereitstellung eines Impfstoffs zum Schutz von Tieren gegen Mycoplasma-Lungenentzündung oder -Pneumonie verwendet werden. Andererseits kann die lösliche Fraktion zur Entfernung von Materialien mit immunsuppressiver Aktivität behandelt werden. Die hierbei erhaltene Fraktion kann dann in Verbindung mit mindestens einer Nuclease von M. hyo zur Bereitstellung eines Impfstoffs eingesetzt werden.
Als weitere Alternative kann die von dem Mycoplasma hypopneumoniae-Organismus herrührende Membran mit anderen Mitteln zum selektiven Löslichmachen der Oberflächenantigene mit immunsuppressiver Aktivität zur Bereitstellung einer unlöslichen Fraktion mit Mycoplasma hypopneumoniae-Antigen(en) ohne immunsuppressive Aktivität behandelt werden. Beispiele für sonstige löslichmachende Mittel sind n-Octylglucosid, Natriumdesoxycholat, CHAPS, d.h. 3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propansulfonat.
Als weiteres Beispiel für Verfahren zur Gewinnung von Mycoplasma hypopneumoniae-Antigenen ohne immunsuppressive Aktivität seien elektrophoretische Maßnahmen zur Auftrennung der verschiedenen Mycoplasma hypopneumoniae-Membranantigene mit dem Ziel der Gewinnung eines oder mehrerer Mycoplasma hypopneumoniae-Antigens (Antigene) ohne immunsuppressive Aktivität genannt.
Die geschilderten Maßnahmen und auch sonstige Maßnahmen sollten sich für den Fachmann aus den hierin gegebenen Lehren eröffnen.
Die Mycoplasma hypopneumoniae-Antigene ohne immunsuppressive Aktivität, die in Verbindung mit mindestens einer Nuclease oder einem Fragment und/oder Derivat derselben zur Zubereitung eines Impfstoffs zum Schutz gegen Mycoplasma-Lungenentzündung eingesetzt werden, besitzen im allgemeinen ein Molekulargewicht von mindestens 10 kDa und im allgemeinen von nicht mehr als 350 kda. In den meisten Fällen besitzen solche Antigene ein Molekulargewicht von 22 kDa bis 121 kDa. Der Impfstoff kann ein oder mehrere derartige(s) Antigen(e) oder Fragment(e) derselben enthalten. Selbstverständlich dürfte ein Fragment ein geringeres Molekulargewicht aufweisen als das Antigen, von dem es herrührt. Gemäß einer Ausführungsform enthält der Impfstoff ein oder mehrere der Antigene mit folgenden Molekulargewichten: 22,5 kDa, 34 kDa, 36 kDa, 41 kDa, 44 kDa, 48 kDa, 52 kDa, 64 kDa, 74,5 kDa, 79 kDa, 88,5 kDa, 96,5 kDa und 121 kDa.
Die Molekulargewichte zur Kennzeichnung des (der) Antigens (Antigene) lassen sich durch diskontinuierliche Polyacrylamidgel-Elektrophorese unter Verwendung des von Laemmli in "Nature" 227, 680-85 (London 1970) beschriebenen SDS-Puffersystems bei einer Acrylamidkonzentration von 12% und einem Verhältnis Bis-Acrylamid/Acrylamid von 0,8/bestimmen.
Das nicht-ionische Detergens wird in zum Löslichmachen der Mycoplasma hypopneumoniae-Antigene mit immunsuppressiver Aktivität ausreichenden Mengen eingesetzt. Im allgemeinen beträgt das Gewichtsverhältnis nicht-ionisches Detergens/zu behandelnder Teil des Mycoplasma hypopneumoniae-Organismus 10/1 bis etwa 0,05/1, vorzugsweise etwa 5,0/1 bis 0,5/1. Die Behandlung erfolgt im allgemeinen bei einer Temperatur nicht über 40ºC. In den meisten Fällen liegt die Temperatur in der Größenordnung von 0ºC bis 37ºC.
Die Behandlung erfolgt während einer zum Inlösungbringen der Mycoplasma hypopneumoniae-Antigene mit immunsuppressiver Aktivität ausreichenden Zeit. Im allgemeinen liegt diese Zeit in der Größenordnung von 0,5 bis 12 h. In einigen Fällen können jedoch auch längere oder kürzere Behandlungszeiten eingehalten werden.
Die zum Löslichmachen des (der) Antigens (Antigene) verwendete Lösung besitzt im allgemeinen eine Ionenstärke von 0,05 bis 1,0 M. Ein bevorzugtes löslichmachendes Mittel enthält 0,2 M Natriumionen.
Wie bereits erwähnt, ist im allgemeinen die Membran des Mycoplasma hypopneumoniae-Organismus Gegenstand einer solchen Behandlung. Eine solche Membran erhält man durch Aufbrechen des Organismus nach allgemein bekannten Maßnahmen, z.B. im Rahmen eines Gefrier-Auftau-Zyklus, durch Beschallen und dgl.. Andererseits kann (können) das (die) Antigen(e) auch vom Gesamtorganismus herrühren. Die Wahl geeigneter Maßnahmen dürfte unter Beachtung der hierin gegebenen Anweisungen im Rahmen des Fachwissens des Fachmanns liegen.
Neben der Gewinnung von Mycoplasma hypopneumoniae-Antigenen und/oder Fragmenten derselben durch Behandeln von Mycoplasma hypopneumoniae-Organismen können selbstverständlich die Antige und/oder Fragmente derselben auch rekombinanten Ursprungs sein und nach den verschiedensten gentechnischen Maßnahmen hergestellt werden.
Ein Impfstoff zum Schutz gegen Mycoplasma-Lungenentzündung und insbesondere zum Schutz von Schweinen gegen Mycoplasma-Lungenentzündung, umfaßt eines oder mehrere der M. hypopneumoniae-Antigene ohne immunsuppressive Aktivität oder von Fragmenten oder Derivaten derselben sowie mindestens eine zuvor beschriebene Nuclease (oder ein Fragment oder Derivat derselben) von Mycoplasma hypopneumoniae in Kombination mit einem geeigneten physiologisch akzeptablen Vehikel, z.B. einem Träger oder Hilfsstoff. Das (die) Mycoplasma hypopneumoniae-Antigen(e) und/oder Fragment(e) hiervon und die mindestens eine Nuclease sowie (ein) Fragment(e) und/oder Derivat(e) hiervon werden in dem Impfstoff zum Schutz gegen Mycoplasma-Lungenentzündung ausreichenden Mengen eingesetzt.
Der Impfstoff kann das Mycoplasma hypopneumoniae-Antigen und eine Nuclease in einem Verhältnis Antigen/Nuclease von etwa 100/1 bis etwa 1/40, vorzugsweise von etwa 4/1 bis etwa 1/4 enthalten. Jede Dosis des Impfstoffs kann etwa ug bis etwa 200 ug M. hyo-Antigen und etwa 0,5 ug bis etwa 1000 ug DNase, vorzugsweise etwa ug bis etwa 100 ug Antigen und etwa ug bis etwa 200 ug DNase enthalten. Wird mehrfach dosiert, überschreitet im allgemeinen die Anzahl der Dosierung drei Dosen über 8 Wochen hinweg nicht.
Die vorliegende Erfindung wird anhand der folgenden nicht beschränkenden Beispiele näher erläutert.

Beispiel 1

Mycoplasma hypopneumoniae Stamm VPP-11, Stamm J oder P- 57223 wird in 3,5 l Friis-Medium bis zu einer Dichte von etwa 10º bis zum Zentrifugieren wachsengelassen, viermal in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen und in mM Tris eines pH-Werts von 8,0, mM EDTA in wiederholten Gefrier-Auftau-Zyklen lysiert. Trümmer werden durch 10-minütiges Zentrifugieren bei 12000 g entfernt. Die Membranen werden durch 45-minütiges Zentrifugieren bei 105000 g geerntet, einmal in PBS gewaschen und mittels 1,0% Triton X-100 in PBS 18 h bei 4ºC in Lösung gebracht. Das löslich gemachte Material wird durch Gelfiltration unter Verwendung von Sepharose S-200 fraktioniert. Der aktive Peak wird gesammelt. Die enzymatische Aktivität wird durch Affinitätschromatographie auf DNA- Cellulose, die mit mM Tris eines pH-Werts von 8,0 mM Natriumchlorid, 1 mM EDTA, 1 mM Dithiothreit, 0,3% Triton X- 100, 3 mM Natriumazid ins Gleichgewicht gesetzt wurde, gereinigt, gründlich mit demselben Puffer gewaschen und mit 1,0 M Natriumchlorid in demselben Puffer eluiert. Aufgrund einer SDS Polyacrylamid-Gelelektrophorese besteht das Enzym aus einer Dublette von 37/39 kDa.

Beispiel 2

Der Mycoplasma hypopneumoniae-Stamm VPP-11, der Stamm J oder P-57223 wird in 1,0 l Friis-Medium bis zu einer Dichte von etwa 10&sup9;-10¹&sup0; Farbänderungseinheiten pro ml wachsengelassen. Nach Entfernen der Zellen durch Zentrifugieren wird der Überstand auf Eis mit 231 g festen Ammoniumsulfats versetzt, um eine 40%ige Sättigung zu erreichen. Der Proteinniederschlag wird nach dem Zentrifugieren geerntet, in 17,5 mM Kaliumphosphat eines pH-Werts von 7,0, 3 mM Natriumazid resuspendiert und gründlich gegen denselben Puffer dialysiert. Die Aktivität wird weiter durch Ionenaustauschchromatographie auf DEAE-Cellulose, mit der die aktive Fraktion keine Bindung eingeht, gereinigt. Die enzymatische Aktivität wird durch Affinitätschromatographie auf DNA-Cellulose, die mit 25 mM Tris eines pH-Werts von 8,0, 30 mM Natriumchlorid, 1 mM EDTA, 1 mM Dithiothreit, 0,3% Triton X-100, 3 mM Natriumazid, ins Gleichgewicht gesetzt worden war, gereinigt, gründlich mit demselben Puffer gewaschen und mit 1,0 M Natriumchlorid in demselben Puffer eluiert. Dies ist die DNA-Cellulose-Fraktion. Aufgrund einer SDS Polyacrylamid-Gelelektrophorese handelt es sich bei dem Enzym um eine Dublette von 37 /39 kDa.

Beispiel 3

Ein aliquoter Teil von 6 ml (Gesamtvolumen: 12 ml) der DNA-Cellulose-Fraktion von Beispiel 2 wurde mit einem gleichen Volumen Freud'schem unvollständigem Hilfsmittel durch tropfenweise Zugabe des Hilfsmittels unter konstantem Durchmischen des erhaltenen Homogenisats durch Beschallen vereinigt.
Impfungen
Zwergschweine wurden mit 2,0 ml aliquoten Teilen des Impfstoffs plus Hilfsmittel im Alter von 7 Tagen subkutan in die Hüfte geimpft. Zwei Wochen nach der ersten Injektion wurde eine Zusatzinjektion verabreicht.
Provokation bzw. Herausforderung
Eine weitere Gruppe von Schweinen desselben Alters wie die Versuchstiere wurden im Alter von drei Tagen intratrachial mit P-57223 M. hypopneumoniae im Alter von drei Tagen beimpft und dienten als "Ansteckungsmaterial" für die folgende Schweine-Mycoplasma-Lungenentzündung (MPS)-Provokation. Drei Wochen nach der Erstimpfung wurden die beschriebenen Versuchstiere mit dem "Ansteckungsmaterial" zusammengebracht, um die Übertragung von M. hypopneumoniae durch Kontakt einzuleiten. Die Tiere blieben bis zur Autopsie sechs Wochen nach Beginn der MPS-Provokation zusammen.
Bei den 6 Nicht-Impflingen gab es zwei Schweine mit MPS- Läsionen und 4 Schweine ohne Läsionen. Unter den 6 Impflingen gab es keine Schweine mit MPS-Läsionen, vielmehr 6 Schweine ohne Läsionen.

Beispiel 4 (Herstellung eines Antikörpers)

Der M. hypopneumoniae Stamm P-57223 wurde in 1 l Friis-Medium bis zu einer Dichte von etwa bis 10~ 10*~ Farbänderungseinheiten pro ml wachsengelassen. Nach Abtrennen der Zellen durch Zentrifugieren wurde der Wachstumskulturüberstand bis zum Erreichen einer 40%igen Sättigung bei 0ºC mit festem Ammoniumsulfat versetzt. Der Proteinniederschlag wurde durch Zentrifugieren geerntet, in 17,5 mM Kaliumphosphat eines pH-Werts von 7,0, 3 mM Natriumazid resuspendiert und gründlich gegen denselben Puffer dialysiert. Die Aktivität wurde in der zuvor beschriebenen Weise durch Ionenaustauschchromatographie auf DEAE-Cellulose und durch Affinitätschromatographie auf DNA-Cellulose weiter gereinigt.
Zwergschweine wurden mit 200 ug DNA-Cellulosefraktion in unvollständigem Freud'schem Hilfsstoff geimpft. Zwei Wochen nach der Erstimpfung wurde eine Zusatzinjektion gegeben. Zwei Wochen später wurde den Schweinen Blut entnommen. Durch Western blot-Analyse der gesamten M. hypopneumoniae-Proteine wurde ermittelt, daß die Antiseren in 1/50-Verdünnung mit mindestens 6 Proteinen mit scheinbaren Molekulargewichten von 26 und 97 kDa reagierten.
Solche Antiseren können bei der Zubereitung eines Impfstoffs der beschriebenen Art verwendet werden.

Beispiel 5 Zubereitung von DNase

Der Mycoplasma hypopneumoniae Stamm P-57223 wurde in 25 l Friis-Medium auf ≥ 10¹&sup0; Farbänderungseinheiten pro ml wachsengelassen. Die Zellen wurden nach dem Zentrifugieren geerntet und verworfen. Der Kulturüberstand wurde bei 4ºC gegen 25 mM Tris eines pH-Werts von 8,0, 1 mM Mgcl&sub2;, 1 mM CaCl&sub2;, 1 mM Dithiothreit dialysiert und über Whatman DE 52 DEAE-Cellulose im selben Puffer laufengelassen. Die ungebundene Fraktion wurde gesammelt und auf 50 mM Tris eines pH-Werts von 8,0, 5 mM Mgcl&sub2;, 5 mM CaCl&sub2;, 5 mM Dithiothreit eingestellt. Nach Zugabe von festem Ammoniumsulfat bei 0ºC bis zum Erreichen einer 55%igen Sättigung wurde unlösliches Material durch Zentrifugieren geerntet und verworfen. Der Zentrifugierüberstand wurde mit Ammoniumsulfat bei 0ºC versetzt, um eine 90%ige Sättigung zu erreichen. Unlösliches Protein wurde durch Zentrifugieren geerntet, in kaltem 50 mM Tris eines pH-Werts von 8,0, 5 mM MgCl&sub2;, 5 mM Dithiothreit, 0,1% CHAPS (g/v) resuspendiert, bei 4ºC gegen denselben Puffer dialysiert und über Whatman P 11 Phosphocellulose bei 4ºC laufengelassen. Die Phosphocellulosesäule wurde mit 50 mM Tris eines pH-Werts von 8,0, 5 mM MgCl&sub2;, 5 mM CaCl&sub2;, 5 mM Dithiothreit, 0,1% CHAPS (g/v), 0,5 M KCl bei 4ºC eluiert. Das eluierte Material wurde gegen 50 mM Natriumacetat eines pH-Werts von 4,0, 0,1% CHAPS (g/v) dialysiert und bei 4ºC über DNA-Sepharose (160 mg E. coli DNA pro ml Pharmacia Sepharose 6B Harz) laufengelassen. Die DNA-Sepharosesäule wurde bei 4ºC zunächst mit 50 mM Natriumacetat eines pH-Werts von 4,0, 0,1% CHAPS, 0,2 M NaCl, und danach mit 50 mM Natriumacetat eines pH-Werts von 4,0, 0,1% CHAPS (g/v), 1,0 M MgCl&sub2; eluiert. Das zuletzt eluierte Material wurde als Produkt gesammelt.

Claims

1. Zubereitung zum Schutz eines Tieres gegen eine durch einen Mikroorganismus, dem es an Biosynthesewegen für Nucleinsäurevorläufer ermangelt und bei dem es sich um ein Mycoplasma, Acholeplasma, Spiroplasma, Ureoplasma oder Anaeroplasma handelt, hervorgerufene Krankheit, umfassend:

(a) eine Komponente, ausgewählt aus (i) Nucleasen, die Antikörper mit eine äußere Nuclease des Mikroorganismus erkennenden Paratopen produzieren, und (ii) Antikörpern mit eine äußere Nuclease des Mikroorganismus erkennenden Paratopen und

(b) einen physiologisch akzeptablen Träger.

2. Zubereitung nach Anspruch 1, wobei die Nuclease aus ei- ner DNase besteht.

3. Zubereitung nach Anspruch 2, wobei die DNase aus einer DNA-Endonuclease besteht.

4. Zubereitung nach Anspruch 2 oder 3 in Einheitsdosisform, jeweils enthaltend mindestens 5 ug der DNase.

5. Zubereitung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Mikroorganismus aus einem Mycoplasma besteht.

6. Zubereitung nach Anspruch 5, wobei der Mikroorganismus aus M. hypopneumoniae besteht.

7. Zubereitung nach Anspruch 6, mit der Komponente (i) und zusätzlich einem oder mehreren Protein(en) mit der Fähigkeit zum Herauslocken eines Antikörpers, der ein M. hypopneumoniae-Antigen ohne immunsuppressive Aktivität erkennt.

8. Zubereitung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Tier ein Schwein ist.

9. Verwendung eines Materials zur Herstellung eines Medikaments zum Schutz eines Tieres gegen eine durch einen Mikroorganismus ohne Biosynthesewege für Nucleinsäurevorläufer hervorgerufene Krankheit, wobei das Material aus einer Komponente, ausgewählt aus (i) Nucleasen, die Antikörper mit eine äußere Nuclease des Mikroorganismus erkennenden Paratopen produzieren und (ii) Antikörpern mit eine äußere Nuclease des Mikroorganismus erkennenden Paratopen besteht.

10. Verwendung nach Anspruch 9, wobei die Nuclease entsprechend Anspruch 2 oder 3 definiert ist.

11. Verwendung nach Anspruch 9 oder 10, wobei der Mikroorganismus nach einem der Ansprüche 1, 5 und 6 definiert ist.

12. Verwendung nach Anspruch 11, wobei der Mikroorganismus aus M. hypopneumoniae besteht, die Verwendung in Kombination mit einem oder mehreren Protein(en) gemäß der Definition von Anspruch 7 erfolgt und die Krankheit durch M. hypopneumoniae, dem es an Biosynthesewegen für Nucleinsäurevorläufer ermangelt, hervorgerufen ist.

13. Verwendung nach einem der Ansprüche 9 bis 12, wobei das Tier ein Schwein ist.