JPH0768142B2 - 動物を核酸前駆物質生合成系を欠く微生物に起因する病気から予防するための組成物 - Google Patents
動物を核酸前駆物質生合成系を欠く微生物に起因する病気から予防するための組成物Info
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 この発明は微生物に起因する病気の予防するための組成
物に関する。より詳しくは、この発明は特別なマイコプ
ラズマ生物における核酸前駆物質の生合成系を欠く微生
物に起因する病気、最も詳しくはエム・ヒオニューモニ
エー（M.hyopneumoniae）に起因する豚のマイコプラズ
マ性肺炎を予防するための組成物に関する。
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ラズマ生物における核酸前駆物質の生合成系を欠く微生
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エー（M.hyopneumoniae）に起因する豚のマイコプラズ
マ性肺炎を予防するための組成物に関する。
種々な微生物、例えばマイコプラズマ生物に起因する病
気が存在する。マイコプラズマ・ヒオニューモニエー
（Mycoplasma hyopneumoniae）に起因する病気（特に豚
における）は世界中で発生し、豚の損失を伴う病気であ
る。一般にこの病気は無能、矮小、病弱な動物を生じ、
又治癒した豚はしばしば日和見菌による二次感染を受け
易い。
気が存在する。マイコプラズマ・ヒオニューモニエー
（Mycoplasma hyopneumoniae）に起因する病気（特に豚
における）は世界中で発生し、豚の損失を伴う病気であ
る。一般にこの病気は無能、矮小、病弱な動物を生じ、
又治癒した豚はしばしば日和見菌による二次感染を受け
易い。
豚をマイコプラズマ性肺炎から予防するためのワクチン
を作り出す数多くの試みがなされたが、そのようなワク
チンの生産は成功しなかった。
を作り出す数多くの試みがなされたが、そのようなワク
チンの生産は成功しなかった。
クリステンセン（Kristensen）ら（アメリカン・ジャー
ナル・オブ・ベテリナリー・リサーチ（Am.J.Vet.Re
s.）（1981年）、42巻、784ページ）はマイコプラズマ
・ヒオニューモニエーの熱不活化細胞を注射後、豚をマ
イコプラズマ性肺炎から予防する効果を認めなかった。
ナル・オブ・ベテリナリー・リサーチ（Am.J.Vet.Re
s.）（1981年）、42巻、784ページ）はマイコプラズマ
・ヒオニューモニエーの熱不活化細胞を注射後、豚をマ
イコプラズマ性肺炎から予防する効果を認めなかった。
エセライド（Etheride）ら（リサーチ・オブ・ベンテリ
ナリー・サイエンス（Res.Vet.Sci.）（1982年）、33
巻、188ページ）はマイコプラズマの生ワクチンを静脈
内、皮下又は腹腔内に投与後、マイコプラズマによる肺
臓のコロニー形成に対して不完全な予防しか認めなかっ
た。
ナリー・サイエンス（Res.Vet.Sci.）（1982年）、33
巻、188ページ）はマイコプラズマの生ワクチンを静脈
内、皮下又は腹腔内に投与後、マイコプラズマによる肺
臓のコロニー形成に対して不完全な予防しか認めなかっ
た。
ロス（Ross）らはアメリカン・ジャーナル・オブ・ベテ
リナリー・リサーチ（1984年）、45巻、1899ページにお
いて凍結融解法により調製したマイコプラズマ・ヒオニ
ューモニエー抽出液の使用は変動する予防効果のみを示
し、ある場合には障害の発達を増加させることを報告し
ている。又、ロスらはそのような作用物を豚に注射する
ことにより、VPP−11株の15代ないし20代継代培養の24
時間培養の1mlと合併したVPP−11株を含む肺炎罹患肺の
10％懸濁液からの上清の4mlの気管内投与による挑戦に
対してある程度予防すると主張している。
リナリー・リサーチ（1984年）、45巻、1899ページにお
いて凍結融解法により調製したマイコプラズマ・ヒオニ
ューモニエー抽出液の使用は変動する予防効果のみを示
し、ある場合には障害の発達を増加させることを報告し
ている。又、ロスらはそのような作用物を豚に注射する
ことにより、VPP−11株の15代ないし20代継代培養の24
時間培養の1mlと合併したVPP−11株を含む肺炎罹患肺の
10％懸濁液からの上清の4mlの気管内投与による挑戦に
対してある程度予防すると主張している。
これらの結果として、今日に至るまで、マイコプラズマ
性肺炎から豚を保護する有効なワクチンは開発されてい
ない。
性肺炎から豚を保護する有効なワクチンは開発されてい
ない。
この発明の一つの態様により、微生物に起因する病気の
予防するための組成物が提供される。
予防するための組成物が提供される。
この発明の一つの態様により、予防すべき微生物の外部
表面により分泌され、及び／又は前記外部表面上で露出
されるヌクレアーゼ（核酸分解酵素）（そのような細胞
の外部表面により分泌され、及び／又は前記外部表面上
で露出されるヌクレアーゼを、ここでは「（１つ又は複
数の）外因性ヌクレアーゼ」と称する。）を認識するパ
ラトープを持つ抗体を生産するヌクレアーゼ（核酸分解
酵素）及び／又はその断片及び／又は誘導体を使用する
ことにより、核酸前駆物質（プリン及び／又はピリミジ
ン）の生合成系を欠く微生物に起因する病気を予防する
ための組成物が提供される。
表面により分泌され、及び／又は前記外部表面上で露出
されるヌクレアーゼ（核酸分解酵素）（そのような細胞
の外部表面により分泌され、及び／又は前記外部表面上
で露出されるヌクレアーゼを、ここでは「（１つ又は複
数の）外因性ヌクレアーゼ」と称する。）を認識するパ
ラトープを持つ抗体を生産するヌクレアーゼ（核酸分解
酵素）及び／又はその断片及び／又は誘導体を使用する
ことにより、核酸前駆物質（プリン及び／又はピリミジ
ン）の生合成系を欠く微生物に起因する病気を予防する
ための組成物が提供される。
ヌクレアーゼはデオキシリボヌクレアーゼ（DNA分解酵
素又はDNase）及び／又はリボヌクレアーゼ（RNA分解酵
素又はRNase）及び／又はその断片及び／又はその誘導
体であることができ、前記ヌクレアーゼは、RNase又は
その断片を使用した場合、予防すべき微生物の表面によ
り分泌され、及び／又は前記表面上で露出されるRNase
（外因性RNase）を認識する抗体を生産するか、又は前
記ヌクレアーゼは、DNase及び／又はDNase断片及び／又
は誘導体を投与した場合、予防すべき微生物の表面によ
り分泌され、及び／又は前記表面上で露出されるDNase
を認識する抗体を生産する。
素又はDNase）及び／又はリボヌクレアーゼ（RNA分解酵
素又はRNase）及び／又はその断片及び／又はその誘導
体であることができ、前記ヌクレアーゼは、RNase又は
その断片を使用した場合、予防すべき微生物の表面によ
り分泌され、及び／又は前記表面上で露出されるRNase
（外因性RNase）を認識する抗体を生産するか、又は前
記ヌクレアーゼは、DNase及び／又はDNase断片及び／又
は誘導体を投与した場合、予防すべき微生物の表面によ
り分泌され、及び／又は前記表面上で露出されるDNase
を認識する抗体を生産する。
使用するRNase又はDaseの断片及び／又は誘導体は、そ
れがここに記述するような抗体を生産することができる
間、酵素活性を持っても持たなくてもよい。
れがここに記述するような抗体を生産することができる
間、酵素活性を持っても持たなくてもよい。
この発明は何等かの説明によって限定されるべきではな
いが、核酸前駆物質を合成する能力のないある種の生物
は増殖と感染に必要なプリンとピリミジンを得るために
核酸の存在を必要とし、細胞表面により分泌され、及び
／又は前記表面上で露出されるヌクレアーゼは宿主細胞
によって供給される核酸からプリンとピリミジンを生産
するよう機能すると信じられている、外来性ヌクレアー
ゼを認識するパラトープを持つ抗体の生産を誘導する適
当なヌクレアーゼ（１つ又は複数）及び／又は断片（１
つ又は複数）及び／又は誘導体の投与により外来性ヌク
レアーゼに特異的に結合又はこれを除去し、それによっ
て微生物の増殖と感染から予防する。かくして、予防す
べき微生物の外因性RNase及び／又は外来性DNaseを認識
する抗体の生産を動物に誘導することにより、その微生
物の増殖又はそれによる感染は除去されるか又は遅延さ
せることができる。
いが、核酸前駆物質を合成する能力のないある種の生物
は増殖と感染に必要なプリンとピリミジンを得るために
核酸の存在を必要とし、細胞表面により分泌され、及び
／又は前記表面上で露出されるヌクレアーゼは宿主細胞
によって供給される核酸からプリンとピリミジンを生産
するよう機能すると信じられている、外来性ヌクレアー
ゼを認識するパラトープを持つ抗体の生産を誘導する適
当なヌクレアーゼ（１つ又は複数）及び／又は断片（１
つ又は複数）及び／又は誘導体の投与により外来性ヌク
レアーゼに特異的に結合又はこれを除去し、それによっ
て微生物の増殖と感染から予防する。かくして、予防す
べき微生物の外因性RNase及び／又は外来性DNaseを認識
する抗体の生産を動物に誘導することにより、その微生
物の増殖又はそれによる感染は除去されるか又は遅延さ
せることができる。
ある場合においては、DNase又はその断片及び／又はそ
の誘導体もしくはRNase又はその断片及び／又はその誘
導体を使用することにより予防をすることができる。他
の場合においては、RNase（又はその断片及び／又はそ
の誘導体）を使用するのみ、又はDNase（又はその断片
及び／又はその誘導体）を使用するのみで予防すること
ができる。ある場合においては、RNaseとDNaseの両方
（又は適当な断片及び／又は誘導体）を投与することが
必要なことがある。自明のことであるが、そのような使
用の型は微生物が増殖と感染に必要なプリンとピリミジ
ンを生産するためにRNase又はDNase又は両方を必要とす
るか否かに依存する。好ましいDNaes又はその断片及び
／又はその誘導体はDNAエンドヌクレアーゼである。
の誘導体もしくはRNase又はその断片及び／又はその誘
導体を使用することにより予防をすることができる。他
の場合においては、RNase（又はその断片及び／又はそ
の誘導体）を使用するのみ、又はDNase（又はその断片
及び／又はその誘導体）を使用するのみで予防すること
ができる。ある場合においては、RNaseとDNaseの両方
（又は適当な断片及び／又は誘導体）を投与することが
必要なことがある。自明のことであるが、そのような使
用の型は微生物が増殖と感染に必要なプリンとピリミジ
ンを生産するためにRNase又はDNase又は両方を必要とす
るか否かに依存する。好ましいDNaes又はその断片及び
／又はその誘導体はDNAエンドヌクレアーゼである。
この発明により予防すべき微生物の代表的な例として、
マイコプラズマ、アコレプラズマ（acholeplasma）、ウ
レアプラズマ（ureaplasma）、スピロプラズマ（spilop
lasma）、及びアネアロプラズマ（aneroplasma）を挙げ
ることができる。
マイコプラズマ、アコレプラズマ（acholeplasma）、ウ
レアプラズマ（ureaplasma）、スピロプラズマ（spilop
lasma）、及びアネアロプラズマ（aneroplasma）を挙げ
ることができる。
予防を実現するために使用するヌクレアーゼは、予防を
検討している微生物から外因性ヌクレアーゼを回収する
ことにより得ることができる。更に別な方法として、予
防を検討する微生物の１つ又は複数の抗原決定基（エピ
トープ）のアミノ酸配列をコードする組換えDNA分子
を、遺伝子工学技術によりヌクレアーゼ又はその断片及
び／又はその誘導体を生産するために使用することがで
きる。遺伝子工学技術により生産されるそのようなヌク
レアーゼ又はその断片及び／又はその誘導体は、予防す
なわち免疫応答を検討している微生物の外因性ヌクレア
ーゼを認識する抗体を生産する。
検討している微生物から外因性ヌクレアーゼを回収する
ことにより得ることができる。更に別な方法として、予
防を検討する微生物の１つ又は複数の抗原決定基（エピ
トープ）のアミノ酸配列をコードする組換えDNA分子
を、遺伝子工学技術によりヌクレアーゼ又はその断片及
び／又はその誘導体を生産するために使用することがで
きる。遺伝子工学技術により生産されるそのようなヌク
レアーゼ又はその断片及び／又はその誘導体は、予防す
なわち免疫応答を検討している微生物の外因性ヌクレア
ーゼを認識する抗体を生産する。
好ましい具体化により、この発明はマイコンプラズマ微
生物に起因する病気の予防を意図する。好ましい具体化
により、そのような予防はDNase又はその断片及び／又
はその誘導体により実現され、好ましいDNaseはDNAエン
ドヌクレアーゼである。
生物に起因する病気の予防を意図する。好ましい具体化
により、そのような予防はDNase又はその断片及び／又
はその誘導体により実現され、好ましいDNaseはDNAエン
ドヌクレアーゼである。
この発明は更に、マイコプラズマに起因する病気をDNas
e又はその断片又はその誘導体を使用することにより予
防することに関して記述されているが、しかしながらこ
のような方法は上に述べた他の種類の微生物に対する予
防及び／又はRNaseの使用に対しても等しく適用するこ
とが可能である。
e又はその断片又はその誘導体を使用することにより予
防することに関して記述されているが、しかしながらこ
のような方法は上に述べた他の種類の微生物に対する予
防及び／又はRNaseの使用に対しても等しく適用するこ
とが可能である。
ワクチンに使用するDNaseはマイコプラズマ生物から得
ることができ、すなわち、DNaseはDNaseを可溶化する非
イオン性界面活性剤のようなおだやかな界面活性剤を使
用してマイコプラズマ生物の膜から取り出すことができ
る。
ることができ、すなわち、DNaseはDNaseを可溶化する非
イオン性界面活性剤のようなおだやかな界面活性剤を使
用してマイコプラズマ生物の膜から取り出すことができ
る。
非イオン性界面活性剤はDNaseを可溶化するのに十分な
量を使用する。一般に、非イオン性界面活性剤は処理さ
れるマイコプラズマ生物に対する重量比は0.05:1から約
10.0:1であり、好ましくは約0.5:1から5.0:1である。一
般に処理は40℃を超えない温度で行い、最も一般的には
１℃〜37℃の程度である。
量を使用する。一般に、非イオン性界面活性剤は処理さ
れるマイコプラズマ生物に対する重量比は0.05:1から約
10.0:1であり、好ましくは約0.5:1から5.0:1である。一
般に処理は40℃を超えない温度で行い、最も一般的には
１℃〜37℃の程度である。
処理はDNaseの可溶化が生ずるのに十分な時間行い、一
般にそのような時間は0.5〜18時間の程度であるが、場
合によっては、より長い時間又はより短い時間を用いる
こともできる。
般にそのような時間は0.5〜18時間の程度であるが、場
合によっては、より長い時間又はより短い時間を用いる
こともできる。
一般に、DNAを可溶化するのに使用する溶液は0.05〜1.0
Mの塩のイオン強度を持つ。好ましい可溶化剤は0.2Mの
ナトリウムイオンを含む。
Mの塩のイオン強度を持つ。好ましい可溶化剤は0.2Mの
ナトリウムイオンを含む。
上に示したように、一般にマイコプラズマ生物の膜はそ
のような処理を受ける。そのような膜は一般に凍結融解
の反復、超音波処理などのような当該技術分野で公知の
方法により微生物を破壊して得ることができる。又、DN
aseは全生物から得ることもできる。適当な方法の選択
は、ここに記述したことにより当業者が到達し得る範囲
にあると考えられる。
のような処理を受ける。そのような膜は一般に凍結融解
の反復、超音波処理などのような当該技術分野で公知の
方法により微生物を破壊して得ることができる。又、DN
aseは全生物から得ることもできる。適当な方法の選択
は、ここに記述したことにより当業者が到達し得る範囲
にあると考えられる。
DNaseはマイコプラズマ細胞培養の上清から取り出すこ
とも可能であり、たとえば、DNaseを細胞上清から硫酸
アンモニウムで沈殿させることができる。
とも可能であり、たとえば、DNaseを細胞上清から硫酸
アンモニウムで沈殿させることができる。
更に別な方法としては、DNase又はその断片又はその誘
導体を遺伝子工学技術により得ることができ、たとえば
予防を検討している微生物の外因性ヌクレアーゼを認識
するパラトープを持つ抗体を生産するヌクレアーゼ又は
その断片又はその誘導体（特にDNase又はその断片又は
その誘導体）をコードする組換えDNA分子を使用するこ
とにより得ることができる。
導体を遺伝子工学技術により得ることができ、たとえば
予防を検討している微生物の外因性ヌクレアーゼを認識
するパラトープを持つ抗体を生産するヌクレアーゼ又は
その断片又はその誘導体（特にDNase又はその断片又は
その誘導体）をコードする組換えDNA分子を使用するこ
とにより得ることができる。
この発明は動物を予防するためのワクチン、特に予防を
検討している生物に見出される外因性ヌクレアーゼを認
識する抗体を生産するヌクレアーゼ（又はその断片又は
誘導体）を使用することにより、上述の種類の微生物特
にマイコプラズマ生物に起因する病気から人間以外の動
物を予防するためのワクチンを提供する。かくして、マ
イコプラズマ生物から豚を予防するために使用するヌク
レアーゼ（又はその断片又はその誘導体）は１つ又は複
数の豚マイコプラズマに存在する外因性DNaseのエピト
ープを持つ。DNaseは微生物から直接得るか、又は遺伝
子工学により作ることができる。
検討している生物に見出される外因性ヌクレアーゼを認
識する抗体を生産するヌクレアーゼ（又はその断片又は
誘導体）を使用することにより、上述の種類の微生物特
にマイコプラズマ生物に起因する病気から人間以外の動
物を予防するためのワクチンを提供する。かくして、マ
イコプラズマ生物から豚を予防するために使用するヌク
レアーゼ（又はその断片又はその誘導体）は１つ又は複
数の豚マイコプラズマに存在する外因性DNaseのエピト
ープを持つ。DNaseは微生物から直接得るか、又は遺伝
子工学により作ることができる。
この発明の思想と範囲内において、この発明のワクチン
の生産にヌクレアーゼの断片又は誘導体をたとえそれら
が酵素活性を持たなくても使用することが可能である。
ここで使用する用語のヌクレアーゼ（RNase又はDNase）
の断片又は誘導体は、ワクチンが予防する生物の外因性
ヌクレアーゼ（外因性RNase又はDNase）を認識する抗体
を生産するエピトープを含むヌクレアーゼ（RNase又はD
Nase）の断片又は誘導体である。
の生産にヌクレアーゼの断片又は誘導体をたとえそれら
が酵素活性を持たなくても使用することが可能である。
ここで使用する用語のヌクレアーゼ（RNase又はDNase）
の断片又は誘導体は、ワクチンが予防する生物の外因性
ヌクレアーゼ（外因性RNase又はDNase）を認識する抗体
を生産するエピトープを含むヌクレアーゼ（RNase又はD
Nase）の断片又は誘導体である。
上述の種類の生物たとえばマイコプラズマ性肺炎のよう
なマイコプラズマ生物に起因する病気の予防、特にマイ
コプラズマ性肺炎から豚を予防するためのワクチンは、
適当な生理的な受容可能な賦形剤たとえば担体及び／又
はアジュバントと組み合わせた上述のDNaseのようなヌ
クレアーゼ及び／又はその断片又はその誘導体である。
そのようなヌクレアーゼ及び／又は断片又は誘導体は、
微生物たとえばマイコプラズマ生物に起因する病気、特
にエム・ヒオニューモニエーに起因するマイコプラズマ
性肺炎を予防するために有効な量をワクチンに使用す
る。
なマイコプラズマ生物に起因する病気の予防、特にマイ
コプラズマ性肺炎から豚を予防するためのワクチンは、
適当な生理的な受容可能な賦形剤たとえば担体及び／又
はアジュバントと組み合わせた上述のDNaseのようなヌ
クレアーゼ及び／又はその断片又はその誘導体である。
そのようなヌクレアーゼ及び／又は断片又は誘導体は、
微生物たとえばマイコプラズマ生物に起因する病気、特
にエム・ヒオニューモニエーに起因するマイコプラズマ
性肺炎を予防するために有効な量をワクチンに使用す
る。
一般に、ワクチンはDNase及び／又は断片又は誘導体の
ようなヌクレアーゼを少なくとも１投与当り５マイクロ
グラム、好ましくは少なくとも１投与当り100マイクロ
グラムを含む。大部分の場合、20ミリグラム以上のヌク
レアーゼ、及び／又は断片又は誘導体を含むことはな
い。
ようなヌクレアーゼを少なくとも１投与当り５マイクロ
グラム、好ましくは少なくとも１投与当り100マイクロ
グラムを含む。大部分の場合、20ミリグラム以上のヌク
レアーゼ、及び／又は断片又は誘導体を含むことはな
い。
一般に多投与を用いる場合、ワクチンは８週間に３投与
を超える量を投与しない。
を超える量を投与しない。
ここに記述するワクチン又は方法と関連して使用する用
語「予防」又は「予防する」は、ワクチンが生物に起因
する病気特にエム・ヒオニューモニエーに起因するマイ
コプラズマ性肺炎を予防し、及び／又は生物に起因する
病気特にエム・ヒオニューモニエーに起因するマイコプ
ラズマ性肺炎の重篤度を軽減することを意味する。
語「予防」又は「予防する」は、ワクチンが生物に起因
する病気特にエム・ヒオニューモニエーに起因するマイ
コプラズマ性肺炎を予防し、及び／又は生物に起因する
病気特にエム・ヒオニューモニエーに起因するマイコプ
ラズマ性肺炎の重篤度を軽減することを意味する。
ヌクレアーゼ及び／又は断片又は誘導体と組み合わせて
使用する賦形剤は広範囲の賦形剤の任意の１つとするこ
とができる。適当な賦形剤の代表例としては鉱物油、明
礬、合成ポリマーなどを挙げることができる。ワクチン
用賦形剤は当該技術分野で公知であり、適当な賦形剤の
選択はここに記述の内容により当業者が到達し得る範囲
内にある。適当な賦形剤の選択はワクチンを投与する方
法にも依存する。ワクチンは注射可能な投与形態とする
ことができ、又筋肉内、静脈内、気管内、腹腔内、鼻内
たとえば吸入剤として、又は眼内、又は皮下投与により
投与することができる。又、ワクチンは錠剤形態などを
作り、活性成分を飼料又は水と混合して経口的に投与す
ることもできる。
使用する賦形剤は広範囲の賦形剤の任意の１つとするこ
とができる。適当な賦形剤の代表例としては鉱物油、明
礬、合成ポリマーなどを挙げることができる。ワクチン
用賦形剤は当該技術分野で公知であり、適当な賦形剤の
選択はここに記述の内容により当業者が到達し得る範囲
内にある。適当な賦形剤の選択はワクチンを投与する方
法にも依存する。ワクチンは注射可能な投与形態とする
ことができ、又筋肉内、静脈内、気管内、腹腔内、鼻内
たとえば吸入剤として、又は眼内、又は皮下投与により
投与することができる。又、ワクチンは錠剤形態などを
作り、活性成分を飼料又は水と混合して経口的に投与す
ることもできる。
ワクチンを投与する他の手段はここに記述の内容により
当業者には明白であり、従って、この発明の範囲を特定
の供給形態に限定するものではない。
当業者には明白であり、従って、この発明の範囲を特定
の供給形態に限定するものではない。
又、ワクチンはここに記述のヌクレアーゼ又は断片又は
誘導体の外に活性成分又はアジュバントを含むこともで
きると理解すべきである。
誘導体の外に活性成分又はアジュバントを含むこともで
きると理解すべきである。
又、ワクチンは活性成分の組合せ、たとえば適当なヌク
レアーゼ断片の混合物又はヌクレアーゼとヌクレアーゼ
断片の混合物などを含むことができると理解すべきであ
る。
レアーゼ断片の混合物又はヌクレアーゼとヌクレアーゼ
断片の混合物などを含むことができると理解すべきであ
る。
一般にワクチンはマイコプラズマ生物に起因する病気特
にエム・ヒオニューモニエーに起因するマイコプラズマ
性肺炎に罹患し得る人間以外の動物、特に豚及び牛に使
用する。
にエム・ヒオニューモニエーに起因するマイコプラズマ
性肺炎に罹患し得る人間以外の動物、特に豚及び牛に使
用する。
この発明の他の態様により、予防すべき微生物の外因性
ヌクレアーゼにより認識されるパラトープを持つ抗体又
は抗体断片又は誘導体を使用することによる、上述の種
類の微生物に起因する病気から動物を予防するための組
成物と方法が提供される。
ヌクレアーゼにより認識されるパラトープを持つ抗体又
は抗体断片又は誘導体を使用することによる、上述の種
類の微生物に起因する病気から動物を予防するための組
成物と方法が提供される。
抗体は当該技術分野で公知の方法により、上述の性質を
持つヌクレアーゼ（RNase又はDNase）から生産すること
ができ、そのような抗体はモノクローナル又はポリクロ
ーナル抗体であることができる。抗体又はその適当な部
分又は誘導体は予防のために使用することができる。
持つヌクレアーゼ（RNase又はDNase）から生産すること
ができ、そのような抗体はモノクローナル又はポリクロ
ーナル抗体であることができる。抗体又はその適当な部
分又は誘導体は予防のために使用することができる。
抗体は組成物として使用し、ヌクレアーゼ及び／又はヌ
クレアーゼ断片又は組成物の使用と関連して上述のよう
に投与することができる。抗体又は抗体断片又は誘導体
を使用する場合、ワクチンは一般に少なくとも１投与当
り５マイクログラム、好ましくは少なくとも１投与当り
50マイクログラムのような抗体又は断片又は誘導体を含
む。大部分の場合、単位投与量は20ミリグラムを超えな
い。
クレアーゼ断片又は組成物の使用と関連して上述のよう
に投与することができる。抗体又は抗体断片又は誘導体
を使用する場合、ワクチンは一般に少なくとも１投与当
り５マイクログラム、好ましくは少なくとも１投与当り
50マイクログラムのような抗体又は断片又は誘導体を含
む。大部分の場合、単位投与量は20ミリグラムを超えな
い。
かくして、この発明のこの態様により、動物を予防すべ
き微生物の外因性ヌクレアーゼを認識する抗体は動物の
外部で生産され、そのような抗体又はその断片又は誘導
体は動物を予防するため動物に投与される。
き微生物の外因性ヌクレアーゼを認識する抗体は動物の
外部で生産され、そのような抗体又はその断片又は誘導
体は動物を予防するため動物に投与される。
この発明の別の態様により、エム・ヒオニューモニエー
の外因性DNaseを認識する抗体を生産するDNase又はその
断片又は誘導体が実質的に純粋な形で提供される。その
ようなDNane又はDNase断片はエム・ヒオニューモニエー
の外因性DNaseに存在する１つ又は複数のエピトープを
含む。
の外因性DNaseを認識する抗体を生産するDNase又はその
断片又は誘導体が実質的に純粋な形で提供される。その
ようなDNane又はDNase断片はエム・ヒオニューモニエー
の外因性DNaseに存在する１つ又は複数のエピトープを
含む。
そのようなDNaseは上述のようにエム・ヒオニューモニ
エー生物から直接取り出し、精製して実質的に純粋なDN
aseを得ることができる。
エー生物から直接取り出し、精製して実質的に純粋なDN
aseを得ることができる。
又、この発明の思想と範囲内で遺伝子工学原理によりそ
のようなDNaseを生産することができ、この場合、この
発明のエム・ヒオニューモニエーDNase又はその断片又
は誘導体はエム・ヒオニューモニエー以外の生物によ
り、たとえばエム・ヒオニューモニエーの外来性Daseを
認識する抗体を生産するアミノ酸配列をコードする組換
えDNA分子を使用することにより生産すことができる。
のようなDNaseを生産することができ、この場合、この
発明のエム・ヒオニューモニエーDNase又はその断片又
は誘導体はエム・ヒオニューモニエー以外の生物によ
り、たとえばエム・ヒオニューモニエーの外来性Daseを
認識する抗体を生産するアミノ酸配列をコードする組換
えDNA分子を使用することにより生産すことができる。
外因性エム・ヒオニューモニエーDNaseは、更に次の特
性により特徴付けられる。
性により特徴付けられる。
A.熱不安定性：細胞表面DNaseは56℃、10分間定温保持
することにより不活化される。
することにより不活化される。
B.トリプシン感受性：細胞表面DNase活性は完全細胞を
トリプシンで処理することにより消失する。
トリプシンで処理することにより消失する。
C.見掛けの分子量:SDSポリアクリルアミド・ゲル電気泳
動にかけると、酵素は35〜40キロダルトン（kDa）の見
掛けの分子量を持つ二重線として移動する。
動にかけると、酵素は35〜40キロダルトン（kDa）の見
掛けの分子量を持つ二重線として移動する。
D.イオン交換性:DNaseは0.0175MNaCl中でDEAE−セルロ
ースに結合し、0.0175M〜0.5MのNaClグラジエントによ
り溶離する。DNaseは0.0175MNaCl中でホスホセルロース
に結合し、0.0175M〜1.0MのNaClにより溶離することが
できる。
ースに結合し、0.0175M〜0.5MのNaClグラジエントによ
り溶離する。DNaseは0.0175MNaCl中でホスホセルロース
に結合し、0.0175M〜1.0MのNaClにより溶離することが
できる。
この発明の１つの態様により、（ａ）免疫抑制活性を欠
くマイコプラズマ・ヒオニューモニエー抗原を認識する
抗体を生産する１つ又は複数のタンパク質と、（ｂ）マ
イコプラズマ・ヒオニューモニエーの外来性ヌクレアー
ゼを認識する抗体を生産する少なくとも１つのヌクレア
ーゼ又はその断片又は誘導体とから成るマイコプラズマ
性肺炎を予防するワクチンが提供される。
くマイコプラズマ・ヒオニューモニエー抗原を認識する
抗体を生産する１つ又は複数のタンパク質と、（ｂ）マ
イコプラズマ・ヒオニューモニエーの外来性ヌクレアー
ゼを認識する抗体を生産する少なくとも１つのヌクレア
ーゼ又はその断片又は誘導体とから成るマイコプラズマ
性肺炎を予防するワクチンが提供される。
ワクチンは前記タンパク質と前記ヌクレアーゼ又はその
断片又は誘導体をマイコプラズマ性肺炎を予防するに有
効な量を含む。ワクチンは本質的に免疫抑制活性を持つ
マイコプラズマ・ヒオニューモニエー抗原を含まない。
断片又は誘導体をマイコプラズマ性肺炎を予防するに有
効な量を含む。ワクチンは本質的に免疫抑制活性を持つ
マイコプラズマ・ヒオニューモニエー抗原を含まない。
ワクチンは（ａ）マイコプラズマ・ヒオニューモニエー
抗原を認識する抗体を生産する１つ又は複数のタンパク
質と、（ｂ）ヌクレアーゼ又はその断片又は誘導体と
を、ヌクレアーゼに対するタンパク質の重量比として約
100:1から約1:40、好ましくは約4:1から約1:4の範囲で
含む。
抗原を認識する抗体を生産する１つ又は複数のタンパク
質と、（ｂ）ヌクレアーゼ又はその断片又は誘導体と
を、ヌクレアーゼに対するタンパク質の重量比として約
100:1から約1:40、好ましくは約4:1から約1:4の範囲で
含む。
この発明の他の態様により、ワクチンは（ａ）上述のよ
うな成分から成るか、（ｂ）抗体又はその断片又は誘導
体と組み合わせて成ることができ、前記抗体又はその断
片又は誘導体はエム・ヒオニューモニエーの外因性ヌク
レアーゼにより認識されるエピトープ（１つ又は複数）
を持つ。抗体又はその断片又はその誘導体のエピトープ
（１つ又は複数）を認識する外因性ヌクレアーゼはDNas
e又はRNaseであることができる。抗体のタンパク質に対
する重量比は約1,000:1から約10,000:1の範囲であるこ
とができる。
うな成分から成るか、（ｂ）抗体又はその断片又は誘導
体と組み合わせて成ることができ、前記抗体又はその断
片又は誘導体はエム・ヒオニューモニエーの外因性ヌク
レアーゼにより認識されるエピトープ（１つ又は複数）
を持つ。抗体又はその断片又はその誘導体のエピトープ
（１つ又は複数）を認識する外因性ヌクレアーゼはDNas
e又はRNaseであることができる。抗体のタンパク質に対
する重量比は約1,000:1から約10,000:1の範囲であるこ
とができる。
出願人はマイコプラズマ・ヒオニューモニエー生物は多
数の抗原を含み、それらのあるものは免疫抑制活性を持
ち、またそれらのあるものは免疫抑制活性を欠くことを
見出した。出願人は更に免疫抑制活性を欠くマイコプラ
ズマ・ヒオニューモニエー抗原及び／又はそのような抗
原の断片はマイコプラズマ性肺炎に有効なワクチンに使
用するのに適していることを見出した。
数の抗原を含み、それらのあるものは免疫抑制活性を持
ち、またそれらのあるものは免疫抑制活性を欠くことを
見出した。出願人は更に免疫抑制活性を欠くマイコプラ
ズマ・ヒオニューモニエー抗原及び／又はそのような抗
原の断片はマイコプラズマ性肺炎に有効なワクチンに使
用するのに適していることを見出した。
マイコプラズマ・ヒオニューモニエー抗原を認識する抗
体を引き出すタンパク質は天然起源であり、マイコプラ
ズマ・ヒオニューモニエー生物から得ることができる。
又、タンパク質は組換えDNA起源であることもできる。
体を引き出すタンパク質は天然起源であり、マイコプラ
ズマ・ヒオニューモニエー生物から得ることができる。
又、タンパク質は組換えDNA起源であることもできる。
使用するヌクレアーゼはマイコプラズマ・ヒオニューモ
ニエー生物の表面により分泌され、及び／又は前記表面
上で露出されるDNase及び／又はRNase（外因性DNase又
は外因性RNase）を認識する抗体を引き出すデオキシリ
ボヌクレアーゼ（DNA分解酵素又はDNase）又はその誘導
体及び／又はリボヌクレアーゼ（RNA分解酵素又はRNas
e）又はその誘導体であることができる。
ニエー生物の表面により分泌され、及び／又は前記表面
上で露出されるDNase及び／又はRNase（外因性DNase又
は外因性RNase）を認識する抗体を引き出すデオキシリ
ボヌクレアーゼ（DNA分解酵素又はDNase）又はその誘導
体及び／又はリボヌクレアーゼ（RNA分解酵素又はRNas
e）又はその誘導体であることができる。
DNaseを使用する場合、好ましいDNase又は断片及び／又
はその誘導体はDNAエンドヌクレアーゼである。
はその誘導体はDNAエンドヌクレアーゼである。
ワクチンに使用するマイコプラズマ・ヒオニューモニエ
ー抗原は天然起源であり、マイコプラズマ・ヒオニュー
モニエー生物特にマイコプラズマ・ヒオニューモニエー
生物の膜から得ることができる。上述のように、マイコ
プラズマ・ヒオニューモニエー生物特にマイコプラズマ
・ヒオニューモニエー生物の膜は免疫抑制活性を持つ抗
原と免疫抑制活性を持たない抗原とを含み、従ってワク
チン用抗原を得るには免疫抑制活性を欠くマイコプラズ
マ・ヒオニューモニエー抗原を選択的に取り出すことが
必要である。
ー抗原は天然起源であり、マイコプラズマ・ヒオニュー
モニエー生物特にマイコプラズマ・ヒオニューモニエー
生物の膜から得ることができる。上述のように、マイコ
プラズマ・ヒオニューモニエー生物特にマイコプラズマ
・ヒオニューモニエー生物の膜は免疫抑制活性を持つ抗
原と免疫抑制活性を持たない抗原とを含み、従ってワク
チン用抗原を得るには免疫抑制活性を欠くマイコプラズ
マ・ヒオニューモニエー抗原を選択的に取り出すことが
必要である。
たとえば、免疫抑制活性を持つ化合物又は組成物である
か否かを測定する方法はスター・エム（Suter,M.）、コ
ビッシュ・エム（Kobisch,M.）、ジェー・ニコレット
（J.Nicolet）、インフェクション・アンド・イムニテ
ィー（Infect.and Immun.）（1985年）、49巻、615ペー
ジ「スティムレーション・オブ・イムノグロブリン・コ
ンテイニング・セルス・アンド・アイソタイプ・スペシ
フィック・アンチボディー・レスポンス・イン・エキス
ペリメンタル・マイコプラズマ・ヒオニューモニエー・
インフェクション・イン・スペシフィック・パトゲン−
フリー・ピッグス（（Stimulation of immunoglobulin
containing cells and isotype specific antibody res
ponse in experimental Mycoplasma hyopneumoniae in
fection in specific pathogen−free pigs）」に報告
されている。
か否かを測定する方法はスター・エム（Suter,M.）、コ
ビッシュ・エム（Kobisch,M.）、ジェー・ニコレット
（J.Nicolet）、インフェクション・アンド・イムニテ
ィー（Infect.and Immun.）（1985年）、49巻、615ペー
ジ「スティムレーション・オブ・イムノグロブリン・コ
ンテイニング・セルス・アンド・アイソタイプ・スペシ
フィック・アンチボディー・レスポンス・イン・エキス
ペリメンタル・マイコプラズマ・ヒオニューモニエー・
インフェクション・イン・スペシフィック・パトゲン−
フリー・ピッグス（（Stimulation of immunoglobulin
containing cells and isotype specific antibody res
ponse in experimental Mycoplasma hyopneumoniae in
fection in specific pathogen−free pigs）」に報告
されている。
１つの方法により、マイコプラズマ・ヒオニューモニエ
ーの膜は可溶性及び不溶性画分の両方を作るためにおだ
やかな界面活性剤特に非イオン性界面活性剤で処理する
ことができる。出願人は不溶性画分は免疫抑制活性を欠
くマイコプラズマ・ヒオニューモニエー抗原を含み、一
方おだやかな界面活性剤処理で得られる可溶性画分は免
疫抑制活性を持つ物質の外に免疫抑制活性を欠くマイコ
プラズマ・ヒオニューモニエー抗原を含むことを見出し
た。おだやかな界面活性剤でマイコンプラズマ・ヒオニ
ューモニエー生物からの膜を処理することにより得られ
る不溶性画分は、少なくとも１つのマイコプラズマ・ヒ
オニューモニエーのヌクレアーゼ又はその断片及び／又
はその誘導体と共にマイコプラズマ性肺炎から動物を予
防するためのワクチンを作るために使用することがで
き、又はその代りに可溶性画分を処理して免疫抑制活性
を含む物質を除き、それによってそのような画分を少な
くとも１つのエム・ヒオニューモニエーのヌクレアーゼ
又はその断片及び／又はその誘導体と共にワクチンを作
るために使用することができる。
ーの膜は可溶性及び不溶性画分の両方を作るためにおだ
やかな界面活性剤特に非イオン性界面活性剤で処理する
ことができる。出願人は不溶性画分は免疫抑制活性を欠
くマイコプラズマ・ヒオニューモニエー抗原を含み、一
方おだやかな界面活性剤処理で得られる可溶性画分は免
疫抑制活性を持つ物質の外に免疫抑制活性を欠くマイコ
プラズマ・ヒオニューモニエー抗原を含むことを見出し
た。おだやかな界面活性剤でマイコンプラズマ・ヒオニ
ューモニエー生物からの膜を処理することにより得られ
る不溶性画分は、少なくとも１つのマイコプラズマ・ヒ
オニューモニエーのヌクレアーゼ又はその断片及び／又
はその誘導体と共にマイコプラズマ性肺炎から動物を予
防するためのワクチンを作るために使用することがで
き、又はその代りに可溶性画分を処理して免疫抑制活性
を含む物質を除き、それによってそのような画分を少な
くとも１つのエム・ヒオニューモニエーのヌクレアーゼ
又はその断片及び／又はその誘導体と共にワクチンを作
るために使用することができる。
更に別な方法として、マイコプラズマ・ヒオニューモニ
エー生物から得られる膜を他の薬品で処理して免疫抑制
活性を持つ表面抗原を選択的に可溶化し、それによって
免疫抑制活性を欠くマイコプラズマ・ヒオニューモニエ
ー抗原（１つ又は複数）を含む不溶性画分を作ることが
できる。他の可溶化剤の代表例としてはｎ−オクチルグ
ルコシド、デオキシコール酸ナトリウム、CHAPS（３−
［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］１−
プロパン・スルホネート）などが挙げられる。
エー生物から得られる膜を他の薬品で処理して免疫抑制
活性を持つ表面抗原を選択的に可溶化し、それによって
免疫抑制活性を欠くマイコプラズマ・ヒオニューモニエ
ー抗原（１つ又は複数）を含む不溶性画分を作ることが
できる。他の可溶化剤の代表例としてはｎ−オクチルグ
ルコシド、デオキシコール酸ナトリウム、CHAPS（３−
［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］１−
プロパン・スルホネート）などが挙げられる。
免疫抑制活性を欠くマイコプラズマ・ヒオニューモニエ
ー抗原を得る他の例としては、免疫抑制活性を欠く１つ
又は複数のマイコプラズマ・ヒオニューモニエー抗原を
得るように種々のマイコプラズマ・ヒオニューモニエー
膜抗原と分離するための電気泳動的方法が挙げられる。
ー抗原を得る他の例としては、免疫抑制活性を欠く１つ
又は複数のマイコプラズマ・ヒオニューモニエー抗原を
得るように種々のマイコプラズマ・ヒオニューモニエー
膜抗原と分離するための電気泳動的方法が挙げられる。
上の方法などはここに記述の内容から当業者にとっては
明白なことである。
明白なことである。
免疫抑制活性を欠き、少なくとも１つのヌクレアーゼ又
はその断片及び／又はその誘導体と共にマイコプラズマ
性肺炎を予防するワクチンを作るのに使用するマイコプ
ラズマ・ヒオニューモニエー抗原は、一般に少なくとも
10kDaで一般に350kDaより大きくない分子量を持つ。大
部分の場合、そのような抗原は22kDa〜121kDaの分子量
を持つ。ワクチンは１つ又は複数のそのような抗原又は
その断片を含むことがある。自明のことであるが、断片
はそれが得られる抗原より低い分子量を持つ。１つの具
体化において、ワクチンは22.5kDa、34kDa、36kDa、41k
Da、44kDa、48kDa、52kDa、64kDa、74.5kDa、79kDa、8
8.5kDa、96.5kDa及び121kDaの分子量を持つ１つ又は複
数の抗原を含む。１つ又は複素のそのような抗原をワク
チンを作るのに使用し、及び／又は前記１つ又は複数の
抗原の断片を少なくとも１つのヌクレアーゼ又はその断
片又はその誘導体と共に使用することはこの発明の思想
と範囲内で可能であると理解すべきである。
はその断片及び／又はその誘導体と共にマイコプラズマ
性肺炎を予防するワクチンを作るのに使用するマイコプ
ラズマ・ヒオニューモニエー抗原は、一般に少なくとも
10kDaで一般に350kDaより大きくない分子量を持つ。大
部分の場合、そのような抗原は22kDa〜121kDaの分子量
を持つ。ワクチンは１つ又は複数のそのような抗原又は
その断片を含むことがある。自明のことであるが、断片
はそれが得られる抗原より低い分子量を持つ。１つの具
体化において、ワクチンは22.5kDa、34kDa、36kDa、41k
Da、44kDa、48kDa、52kDa、64kDa、74.5kDa、79kDa、8
8.5kDa、96.5kDa及び121kDaの分子量を持つ１つ又は複
数の抗原を含む。１つ又は複素のそのような抗原をワク
チンを作るのに使用し、及び／又は前記１つ又は複数の
抗原の断片を少なくとも１つのヌクレアーゼ又はその断
片又はその誘導体と共に使用することはこの発明の思想
と範囲内で可能であると理解すべきである。
抗原（１つ又は複数）を特徴付ける分子量はレームリ
（Laemmli）、ネーチャー（Nature）（ロンドン、1970
年）、227巻、680〜685ページに記述のSDS緩衝液系を使
用する不連続ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動によ
り、アクリルアミド濃度を12％とし、ビス−アクリルア
ミドのアクリルアミドに対する比率を0.8:30とすること
により得ることができる。
（Laemmli）、ネーチャー（Nature）（ロンドン、1970
年）、227巻、680〜685ページに記述のSDS緩衝液系を使
用する不連続ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動によ
り、アクリルアミド濃度を12％とし、ビス−アクリルア
ミドのアクリルアミドに対する比率を0.8:30とすること
により得ることができる。
非イオン性界面活性剤は免疫抑制活性を持つマイコプラ
ズマ・ヒオニューモニエー抗原を可溶化するのに十分な
量を使用する。一般に、非イオン性界面活性剤の処理さ
れるマイコプラズマ・ヒオニューモニエー生物部分に対
する重量比は10:1から約0.05:1であり、好ましくは約5.
0:1から0.5:1である。処理は一般に40℃を超えない温度
で行い、最も一般的には０℃〜37℃の程度で行う。
ズマ・ヒオニューモニエー抗原を可溶化するのに十分な
量を使用する。一般に、非イオン性界面活性剤の処理さ
れるマイコプラズマ・ヒオニューモニエー生物部分に対
する重量比は10:1から約0.05:1であり、好ましくは約5.
0:1から0.5:1である。処理は一般に40℃を超えない温度
で行い、最も一般的には０℃〜37℃の程度で行う。
処理は免疫抑制活性を持つマイコプラズマ・ヒオニュー
モニエー抗原を可溶化するのに十分な時間行い、一般に
その時間は0.5〜12時間の程度であるが、場合によって
はより長く又はより短くすることができる。
モニエー抗原を可溶化するのに十分な時間行い、一般に
その時間は0.5〜12時間の程度であるが、場合によって
はより長く又はより短くすることができる。
抗原（１つ又は複数）を可溶化するのに使用する溶液は
一般に0.05〜1.0Mのイオン強度を持つ。好ましい可溶化
剤は0.2Mのナトリウム・イオンを含む。
一般に0.05〜1.0Mのイオン強度を持つ。好ましい可溶化
剤は0.2Mのナトリウム・イオンを含む。
一般に、マイコプラズマ・ヒオニューモニエー生物の膜
は上述のような処理を受ける。そのような膜は凍結融解
の反復、超音波処理などのような一般に当該技術分野で
公知の方法により生物を破壊して得ることができる。又
は、抗原（１つ又は複数）は全生物から得ることもでき
る。適当な方法の選択はここに記述の内容から当業者が
到達し得る範囲内にあると考えられる。
は上述のような処理を受ける。そのような膜は凍結融解
の反復、超音波処理などのような一般に当該技術分野で
公知の方法により生物を破壊して得ることができる。又
は、抗原（１つ又は複数）は全生物から得ることもでき
る。適当な方法の選択はここに記述の内容から当業者が
到達し得る範囲内にあると考えられる。
マイコプラズマ・ヒオニューモニエー生物を処理してマ
イコプラズマ・ヒオニューモニエー抗原及び／又はその
断片を得る外に、抗原及び／又はその断片は起源が組換
え体であり、種々な遺伝子工学的方法で得ることもでき
ると理解すべきである。
イコプラズマ・ヒオニューモニエー抗原及び／又はその
断片を得る外に、抗原及び／又はその断片は起源が組換
え体であり、種々な遺伝子工学的方法で得ることもでき
ると理解すべきである。
マイコプラズマ性肺炎予防用ワクチン、特に豚をマイコ
プラズマ性肺炎から予防するためのそれは、１つ又は複
数の免疫抑制活性を欠くエム・ヒオニューモニエー抗原
又はその断片又はその誘導体と、少なくとも１つの上述
のようなマイコプラズマ・ヒオニューモニエーのヌクレ
アーゼ（又はその断片又はその誘導体）とから成り、担
体又はアジュバントのような適当な生理的に受容可能な
賦形剤が配合される。マイコプラズマ・ヒオニューモニ
エー抗原（１つ又は複数）及び／又はその断片（１つ又
は複数）並びに少なくとも１つの前記ヌクレアーゼ及び
その断片（１つ又は複数）及び／又はその誘導体（１つ
又は複数）は、マイコプラズマ性肺炎を予防する有効量
をワクチンに使用する。
プラズマ性肺炎から予防するためのそれは、１つ又は複
数の免疫抑制活性を欠くエム・ヒオニューモニエー抗原
又はその断片又はその誘導体と、少なくとも１つの上述
のようなマイコプラズマ・ヒオニューモニエーのヌクレ
アーゼ（又はその断片又はその誘導体）とから成り、担
体又はアジュバントのような適当な生理的に受容可能な
賦形剤が配合される。マイコプラズマ・ヒオニューモニ
エー抗原（１つ又は複数）及び／又はその断片（１つ又
は複数）並びに少なくとも１つの前記ヌクレアーゼ及び
その断片（１つ又は複数）及び／又はその誘導体（１つ
又は複数）は、マイコプラズマ性肺炎を予防する有効量
をワクチンに使用する。
ワクチンはマイコプラズマ・ヒオニューモニエー抗原と
ヌクレアーゼを抗原のヌクレアーゼに対する重量比とし
て約100:1から約1:40、好ましくは約4:1から約1:4の間
で含むことができる。ワクチンの各投与はエム・ヒオニ
ューモニエー抗原の約10μｇ〜約200μｇとDNaseの約0.
5μｇ〜約1,000μｇ、好ましくは抗原の約25μｇ〜約10
0μｇとDNaseの約10μｇ〜約200μｇを含むことができ
る。多投与を行う場合、投与数は一般に８週間に３投与
を超えないのが望ましい。この発明に次の実施例との関
連で更に説明するが、この発明の範囲はそれによって限
定されるものではない。
ヌクレアーゼを抗原のヌクレアーゼに対する重量比とし
て約100:1から約1:40、好ましくは約4:1から約1:4の間
で含むことができる。ワクチンの各投与はエム・ヒオニ
ューモニエー抗原の約10μｇ〜約200μｇとDNaseの約0.
5μｇ〜約1,000μｇ、好ましくは抗原の約25μｇ〜約10
0μｇとDNaseの約10μｇ〜約200μｇを含むことができ
る。多投与を行う場合、投与数は一般に８週間に３投与
を超えないのが望ましい。この発明に次の実施例との関
連で更に説明するが、この発明の範囲はそれによって限
定されるものではない。
実施例１ マイコプラズマ・ヒオニューモニエーVPP−11株、Ｊ株
又はＰ−57223株を3.5Lのフリース（Friis）培地中で約
109〜1010変色単位/mlの密度となるまで増殖させ、遠心
分離し、リン酸緩衝液添加食塩水（PBS）中で４回洗浄
し、10mM Tris（pH8.0）と10mMEDTA中で凍結融解を反復
することにより溶菌する。破片を12,000gで10分間遠心
分離して除く。105,000gで45分間遠心分離して膜を回収
し、PBS中で１回洗浄し、PBS中1.0％TritonX−100で41
℃で18時間かけて可溶化する。可溶化した物質をセファ
ロース（Sepharose）Ｓ−200を用いるゲル濾過により分
画し、活性のピークを合併する。酵素活性を25mM Tris
（pH8.0）添加30mM塩化ナトリウム、1mMEDTA、1mMジチ
オスレイトール、0.3％TritonX−100及び3mMナトリウム
・アジドで平衡させたDNA−セルロース上のアフィニテ
ィー・クロマトグラフにより精製し、同一緩衝液で広く
洗浄し、同一緩衝液中1.0M塩化ナトリウムで溶離する。
SDSポリアクリルアミド・ゲル電気泳動により、酵素は3
7/39kDaの二重線を示す。
又はＰ−57223株を3.5Lのフリース（Friis）培地中で約
109〜1010変色単位/mlの密度となるまで増殖させ、遠心
分離し、リン酸緩衝液添加食塩水（PBS）中で４回洗浄
し、10mM Tris（pH8.0）と10mMEDTA中で凍結融解を反復
することにより溶菌する。破片を12,000gで10分間遠心
分離して除く。105,000gで45分間遠心分離して膜を回収
し、PBS中で１回洗浄し、PBS中1.0％TritonX−100で41
℃で18時間かけて可溶化する。可溶化した物質をセファ
ロース（Sepharose）Ｓ−200を用いるゲル濾過により分
画し、活性のピークを合併する。酵素活性を25mM Tris
（pH8.0）添加30mM塩化ナトリウム、1mMEDTA、1mMジチ
オスレイトール、0.3％TritonX−100及び3mMナトリウム
・アジドで平衡させたDNA−セルロース上のアフィニテ
ィー・クロマトグラフにより精製し、同一緩衝液で広く
洗浄し、同一緩衝液中1.0M塩化ナトリウムで溶離する。
SDSポリアクリルアミド・ゲル電気泳動により、酵素は3
7/39kDaの二重線を示す。
実施例２ マイコプラズマ・ヒオニューモニエーVPP−11株、Ｊ株
又はＰ−57223株を1.0Lのフリース培地中で約109〜1010
変色単位/mlの密度となるまで増殖させた。細胞を遠心
分離により除き、231gの固体硫酸アンモニウムを氷上の
上清に添加して40％飽和とする。タンパク質沈殿を遠心
分離により回収し、17.5mMリン酸カリウム（pH7.0）と3
mMナトリウム・アジドに再懸濁し、広く同一緩衝液に対
して透析した。活性画分は結合しないDEAE−セルロース
上のイオン交換クロマトグラフにより、更に活性を精製
する。酵素活性を25mM Tris（pH8.0）、30mM塩化ナトリ
ウム、1mM EDTA、1mMジチオスレイトール、0.3％Triton
X−100及び3mMナトリウム・アジドで平衡させたDNA−セ
ルロース上のアフィニティー・クロマトグラフにより精
製し、同一緩衝液で広く洗浄し、同一緩衝液中1.0M塩化
ナトリウムで溶離する。これはDNA−セルロース画分で
ある。SDSポリアクリルアミド・ゲル電気泳動により、
酵素は37/39kDaの二重線を示す。
又はＰ−57223株を1.0Lのフリース培地中で約109〜1010
変色単位/mlの密度となるまで増殖させた。細胞を遠心
分離により除き、231gの固体硫酸アンモニウムを氷上の
上清に添加して40％飽和とする。タンパク質沈殿を遠心
分離により回収し、17.5mMリン酸カリウム（pH7.0）と3
mMナトリウム・アジドに再懸濁し、広く同一緩衝液に対
して透析した。活性画分は結合しないDEAE−セルロース
上のイオン交換クロマトグラフにより、更に活性を精製
する。酵素活性を25mM Tris（pH8.0）、30mM塩化ナトリ
ウム、1mM EDTA、1mMジチオスレイトール、0.3％Triton
X−100及び3mMナトリウム・アジドで平衡させたDNA−セ
ルロース上のアフィニティー・クロマトグラフにより精
製し、同一緩衝液で広く洗浄し、同一緩衝液中1.0M塩化
ナトリウムで溶離する。これはDNA−セルロース画分で
ある。SDSポリアクリルアミド・ゲル電気泳動により、
酵素は37/39kDaの二重線を示す。
実施例３ 実施例２からのDNA−セルロース画分の6mlアリコート
（全量12ml）を等量のフロイント（Freund）の不完全ア
ジュバントとこれを滴下添加しながら配合し、生成する
ホモジェネートを超音波により絶えず混合した。
（全量12ml）を等量のフロイント（Freund）の不完全ア
ジュバントとこれを滴下添加しながら配合し、生成する
ホモジェネートを超音波により絶えず混合した。
ワクチン接種： ７日令の小型豚にアジュバント添加ワクチンの2.0mlア
リコートを臀部に皮下投与し、始発注射２週間後にブー
スター注射を行って免疫した。
リコートを臀部に皮下投与し、始発注射２週間後にブー
スター注射を行って免疫した。
チャレンジ： 同一令の豚の他群を実験動物として、３日令でエム・ヒ
オニューモニエーＰ−57223株を気管内に接種し、以後
の豚マイコプラズマ性肺炎（MPS）のチャレンジの「シ
ーダー・ピッグス（Seeder pigs）」として使用した。
最初のワクチン接種から３週間後、上述の実験動物に接
触露出によりエム・ヒオニューモニエーの伝達を開示す
るためシーダー・ピッグスと混合飼育した。動物はMPS
チャレンジ開始の６週間後死体解剖するまで一緒にとど
めた。
オニューモニエーＰ−57223株を気管内に接種し、以後
の豚マイコプラズマ性肺炎（MPS）のチャレンジの「シ
ーダー・ピッグス（Seeder pigs）」として使用した。
最初のワクチン接種から３週間後、上述の実験動物に接
触露出によりエム・ヒオニューモニエーの伝達を開示す
るためシーダー・ピッグスと混合飼育した。動物はMPS
チャレンジ開始の６週間後死体解剖するまで一緒にとど
めた。
ワクチン無接種豚６匹の内、２匹はMPS障害があり４匹
は障害がなかった。ワクチン接種豚６匹の内、MPS障害
のある豚はなく６匹全部障害はなかった。
は障害がなかった。ワクチン接種豚６匹の内、MPS障害
のある豚はなく６匹全部障害はなかった。
実施例４ 抗体の調製 エム・ヒオニューモニエーＰ−57223株を1Lのフリース
培地中で109〜1010変色単位/mlの密度となるまで増殖さ
せた。細胞を遠心分離して除き、固体硫酸アンモニウム
を０℃で40％飽和が達成されるまで増殖培養の上清に添
加した。タンパク質沈殿を遠心分離により回収し、17.5
mMリン酸カリウム（pH7.0）と3mMナトリウム・アジドに
再懸濁し、広く同一緩衝液に対して透析した。活性は更
に上述のように、DEAE−セルロース上のイオン交換クロ
マトグラフとDNAセルロース上のアフィニティ・クロマ
トグラフにより精製した。
培地中で109〜1010変色単位/mlの密度となるまで増殖さ
せた。細胞を遠心分離して除き、固体硫酸アンモニウム
を０℃で40％飽和が達成されるまで増殖培養の上清に添
加した。タンパク質沈殿を遠心分離により回収し、17.5
mMリン酸カリウム（pH7.0）と3mMナトリウム・アジドに
再懸濁し、広く同一緩衝液に対して透析した。活性は更
に上述のように、DEAE−セルロース上のイオン交換クロ
マトグラフとDNAセルロース上のアフィニティ・クロマ
トグラフにより精製した。
小型豚をフロイントの不完全アジュバント中DNAセルロ
ース画分の200マイクログラムで免疫した。始発注射２
週間後ブースター注射を行い、豚をその後２週間飼育し
た。全エム・ヒオニューモニエ〜タンパク質のウエスタ
ン・ブロット（Westeern blot）分析により、抗血清は2
6kDaと97kDaの間にある見掛け上の分子量を持つ少なく
とも６つのタンパク室と1:50希釈で反応することが示さ
れた。
ース画分の200マイクログラムで免疫した。始発注射２
週間後ブースター注射を行い、豚をその後２週間飼育し
た。全エム・ヒオニューモニエ〜タンパク質のウエスタ
ン・ブロット（Westeern blot）分析により、抗血清は2
6kDaと97kDaの間にある見掛け上の分子量を持つ少なく
とも６つのタンパク室と1:50希釈で反応することが示さ
れた。
このような抗血清は上述のワクチンを作るのに使用する
ことができる。
ことができる。
実施例５ DNaseの調製 マイコプラズマ・ヒオニューモニエーＰ−57223株を25L
のフリース培地中で1010変色単位/mlと同等又はそれ以
上まで増殖させた。細胞は遠心分離により回収し、廃棄
した。培養上清を４℃で25mM Tris（pH8.0）、1mM MgCl
2、1mM CaCl2及び1mMジチオスレイトールに透析し、同
一緩衝液中でワットマン（Whatman）DE52・DEAEセルロ
ース上を通過させた。結合しない画分を集め、50mM Tri
s（pH8.0）、5mM MGCl2、5mM CaCl2及び5mMジチオスレ
イトールに調節した。固体硫酸アンモニウムを０℃で55
％飽和が達成されるまで添加した。不溶性物質を遠心分
離により回収し、廃棄した。固体硫酸アンモニウムを０
℃で90％飽和が達成されるまで遠心分離上清に添加し
た。不溶性タンパク質を遠心分離により回収し、冷たい
50mM Tris（pH8.0）、5mM MgCl2、5mMジチオスレイトー
ル及び0.1％CHAPS（w/v）に再懸濁し、４℃で同一緩衝
液に透析し、ワットマンP11ホスホセルロース上を通過
させた。ホスホセルロース・カラムを４℃で50mM Tris
（pH8.0）、5mM MgCl2、5mM CaCl2、5mMジチオスレイト
ール、0.1％CHAPS（w/v）及び0.5MKClで溶離した。溶離
した物質を50mM酢酸ナトリウム（pH4.0）、0.1％CHAPS
（w/v）に透析し、４℃でDNA−セファロース（160mg・
E.coliDNA/ml.ファルマシア（Pharmacia）・セファロー
ス6B樹脂）上を通過させた。DNA−セファロース・カラ
ムを４℃で最初に50mM酢酸ナトリウム（pH4.0）、0.1％
CHAPS及び0.2％M NaCl、次いで50mM酢酸ナトリウム（pH
4.0）、0.1％CHAPS（w/v）及び1.0M MgCl2で溶離した。
最終溶離からの物質を生成物として合併した。
のフリース培地中で1010変色単位/mlと同等又はそれ以
上まで増殖させた。細胞は遠心分離により回収し、廃棄
した。培養上清を４℃で25mM Tris（pH8.0）、1mM MgCl
2、1mM CaCl2及び1mMジチオスレイトールに透析し、同
一緩衝液中でワットマン（Whatman）DE52・DEAEセルロ
ース上を通過させた。結合しない画分を集め、50mM Tri
s（pH8.0）、5mM MGCl2、5mM CaCl2及び5mMジチオスレ
イトールに調節した。固体硫酸アンモニウムを０℃で55
％飽和が達成されるまで添加した。不溶性物質を遠心分
離により回収し、廃棄した。固体硫酸アンモニウムを０
℃で90％飽和が達成されるまで遠心分離上清に添加し
た。不溶性タンパク質を遠心分離により回収し、冷たい
50mM Tris（pH8.0）、5mM MgCl2、5mMジチオスレイトー
ル及び0.1％CHAPS（w/v）に再懸濁し、４℃で同一緩衝
液に透析し、ワットマンP11ホスホセルロース上を通過
させた。ホスホセルロース・カラムを４℃で50mM Tris
（pH8.0）、5mM MgCl2、5mM CaCl2、5mMジチオスレイト
ール、0.1％CHAPS（w/v）及び0.5MKClで溶離した。溶離
した物質を50mM酢酸ナトリウム（pH4.0）、0.1％CHAPS
（w/v）に透析し、４℃でDNA−セファロース（160mg・
E.coliDNA/ml.ファルマシア（Pharmacia）・セファロー
ス6B樹脂）上を通過させた。DNA−セファロース・カラ
ムを４℃で最初に50mM酢酸ナトリウム（pH4.0）、0.1％
CHAPS及び0.2％M NaCl、次いで50mM酢酸ナトリウム（pH
4.0）、0.1％CHAPS（w/v）及び1.0M MgCl2で溶離した。
最終溶離からの物質を生成物として合併した。
実施例３に記述の内容から明らかなように、この発明の
ワクチンを豚に予め接種した場合、マイコプラズマ・ヒ
オニューモニエーの感染を予防する明瞭な効果が認めら
れた。
ワクチンを豚に予め接種した場合、マイコプラズマ・ヒ
オニューモニエーの感染を予防する明瞭な効果が認めら
れた。
Claims (8)
- 【請求項１】核酸前駆物質生合成系を欠く微生物の外因
性ヌクレアーゼを認識するパラトープを持つ抗体の生産
を誘導するヌクレアーゼ、前記ヌクレアーゼの断片、前
記ヌクレアーゼの誘導体及びそれらの混合物と、 前記微生物の外因性ヌクレアーゼを認識するパラトープ
を持つ抗体、抗体の断片、抗体の誘導体及びそれらの混
合物とから成る群より選ばれる物質、並びに生理的に受
容可能な担体から成ることを特徴とする動物を核酸前駆
物質生合成系を欠く微生物に起因する病気から予防する
ための組成物。 - 【請求項２】物質は微生物に起因する病気を予防するた
めの有効量で存在する請求項１記載の動物を核酸前駆物
質生合成系を欠く微生物に起因する病気から予防するた
めの組成物。 - 【請求項３】微生物はマイコプラズマである請求項１ま
たは２記載の動物を核酸前駆物質生合成系を欠く微生物
に起因する病気から予防するための組成物。 - 【請求項４】微生物はマイコプラズマ・ヒオニューモニ
エーである請求項１ないし３までのいづれか１項記載の
動物を核酸前駆物質生合成系を欠く微生物に起因する病
気から予防するための組成物。 - 【請求項５】マイコプラズマ・ヒオニューモニエーに起
因する病気から予防するための組成物と、免疫抑制活性
を欠くマイコプラズマ・ヒオニューモニエー抗原を認識
する抗体を誘発する能力のある１種または複数種のタン
パク質とから成る組成物。 - 【請求項６】ヌクレアーゼはデオキシリボヌクレアーゼ
（DNase）である請求項１ないし５までのいずれか１項
記載の動物を核酸前駆物質生合成系を欠く微生物に起因
する病気から予防するための組成物。 - 【請求項７】ヌクレアーゼはDNAエンドヌクレアーゼで
ある請求項１ないし６までのいずれか１項記載の動物を
核酸前駆物質生合成系を欠く微生物に起因する病気から
予防するための組成物。 - 【請求項８】35〜40kDaの分子量を持つ外因性マイコプ
ラズマ・ヒオニューモニエー・デオキシリボヌクレアー
ゼ（DNase）であり、前記DNaseがマイコプラズマ・ヒオ
ニューモニエー細胞から本質的に遊離しているDNaseで
あって動物を核酸前駆物質生合成系を欠く微生物に起因
する病気から予防するための組成物。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US07/146,256 US4985243A (en) | 1988-01-20 | 1988-01-20 | Composition and method for protecting against diseases caused by microorganisms |
| US146,256 | 1988-01-20 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02711A JPH02711A (ja) | 1990-01-05 |
| JPH0768142B2 true JPH0768142B2 (ja) | 1995-07-26 |
Family
ID=22516535
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1007865A Expired - Lifetime JPH0768142B2 (ja) | 1988-01-20 | 1989-01-18 | 動物を核酸前駆物質生合成系を欠く微生物に起因する病気から予防するための組成物 |
Country Status (11)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4985243A (ja) |
| EP (1) | EP0325191B1 (ja) |
| JP (1) | JPH0768142B2 (ja) |
| AT (1) | ATE127693T1 (ja) |
| DE (1) | DE68924183T2 (ja) |
| DK (1) | DK22389A (ja) |
| ES (1) | ES2078900T3 (ja) |
| GR (1) | GR3017427T3 (ja) |
| IE (1) | IE890141L (ja) |
| PT (1) | PT89488A (ja) |
| ZA (1) | ZA89447B (ja) |
Families Citing this family (24)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5240706A (en) * | 1989-04-07 | 1993-08-31 | Ml Technology Ventures, L.P. | Intranasal administration of Mycoplasma hyopneumoniae antigen |
| CA2082155C (en) * | 1990-05-29 | 2008-04-15 | Krishnaswamy I. Dayalu | Swine pneumonia vaccine and method of preparation |
| US6113916A (en) * | 1990-05-29 | 2000-09-05 | American Cyanamid Company | Method of enhancing cell mediated immune responses |
| US5565205A (en) * | 1990-08-16 | 1996-10-15 | Solvay Animal Health, Inc. | Inactivated Mycoplasma hypopneumoniae bacterin and method of use thereof |
| US5338543A (en) * | 1992-02-27 | 1994-08-16 | Ambico, Inc. | Thimerosal inactivated mycoplasma hyopneumoniae vaccine |
| USRE39494E1 (en) * | 1992-02-27 | 2007-02-27 | Intervet Inc. | Inactivated mycoplasma hyopneumoniae and uses therefor |
| DE69333588T2 (de) * | 1992-09-28 | 2005-08-04 | Wyeth Holdings Corp. | Verfahren zur verstärkung zellularer immunantworten |
| US5498527A (en) * | 1994-02-18 | 1996-03-12 | Ube Industries, Ltd. | Phosphorylcholine-containing glyceroglycolipid |
| US9248166B2 (en) | 2003-07-14 | 2016-02-02 | Cls Therapeutics Limited | Method for treating oncological diseases |
| US8431123B2 (en) | 2003-07-14 | 2013-04-30 | Cls Therapeutics Limited | Method for treating systemic bacterial, fungal and protozoan infection |
| US8710012B2 (en) | 2003-07-14 | 2014-04-29 | Cls Therapeutics Limited | Method for treating oncological diseases |
| WO2006130034A1 (fr) | 2005-04-25 | 2006-12-07 | Dmitry Dmitrievich Genkin | Procede pour prolonger la duree de vie d'animaux ou de l'humain |
| US8388951B2 (en) | 2003-07-14 | 2013-03-05 | Cls Therapeutics Limited | Method for treating systemic DNA mutation disease |
| AU2003298972A1 (en) * | 2003-07-14 | 2005-02-04 | Dmitry Dmitrievich Genkin | Method for treating oncological, virulent and somatic diseases, method for controlling treatment efficiency, pharmaceutical agents and composition for carrying out said treatment |
| CA2621666A1 (en) * | 2005-09-09 | 2007-03-15 | Universitaet Zuerich | Antigens for vaccination against and detection of mycoplasma suis |
| US8871200B2 (en) | 2006-11-28 | 2014-10-28 | Cls Therapeutics Limited | Method for treating human diseases associated with an increased deoxyribonucleic acid content in extracellular spaces of tissues and a medicinal preparation for carrying out said method |
| UA114504C2 (uk) | 2012-04-04 | 2017-06-26 | Зоетіс Сервісіз Ллс | Комбінована вакцина pcv, mycoplasma hyopneumoniae та prrs |
| US9120859B2 (en) | 2012-04-04 | 2015-09-01 | Zoetis Services Llc | Mycoplasma hyopneumoniae vaccine |
| UA114503C2 (uk) | 2012-04-04 | 2017-06-26 | Зоетіс Сервісіз Ллс | Комбінована вакцина pcv та mycoplasma hyopneumoniae |
| US10617743B2 (en) | 2014-06-19 | 2020-04-14 | Cls Therapeutics Limited | Method to improve safety and efficacy of anti-cancer therapy |
| CN104784465B (zh) * | 2015-04-14 | 2017-11-03 | 中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所 | 一种用于防治猪气喘病的中药组合物及其制备方法和应用 |
| ES2799515T3 (es) | 2015-05-22 | 2020-12-18 | Dmitry Dmitrievich Genkin | ADN extracelular como una diana terapéutica en la neurodegeneración |
| AU2019209770B2 (en) | 2018-01-16 | 2025-07-31 | Cls Therapeutics Limited | Treatment of diseases by liver expression of an enzyme which has a deoxyribonuclease (DNase) activity |
| CN109234253B (zh) * | 2018-09-19 | 2021-02-19 | 中国农业大学 | Mhp非特异性核酸酶及其编码基因与应用 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3485721A (en) * | 1968-04-24 | 1969-12-23 | Merck & Co Inc | Process for growing mycoplasma pneumonial organisms |
| US4123427A (en) * | 1976-07-27 | 1978-10-31 | Daniel Thomas M | Method for the purification of mycobacterial protein antigens and resulting product |
| FR2565825B1 (fr) * | 1984-06-15 | 1990-07-13 | Centre Nat Rech Scient | Vaccin contre les maladies dues a des microorganismes tels que des mycoplasmes, sa preparation et membranes de microorganismes en tant que principe actif |
| US4666851A (en) * | 1985-04-25 | 1987-05-19 | Lee Sin H | Specific mycoplasma membrane antigen and antibody and their clinical applications |
-
1988
- 1988-01-20 US US07/146,256 patent/US4985243A/en not_active Expired - Fee Related
-
1989
- 1989-01-17 ES ES89100675T patent/ES2078900T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1989-01-17 DE DE68924183T patent/DE68924183T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1989-01-17 AT AT89100675T patent/ATE127693T1/de active
- 1989-01-17 EP EP89100675A patent/EP0325191B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1989-01-18 IE IE890141A patent/IE890141L/xx unknown
- 1989-01-18 JP JP1007865A patent/JPH0768142B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1989-01-19 DK DK022389A patent/DK22389A/da not_active Application Discontinuation
- 1989-01-19 ZA ZA89447A patent/ZA89447B/xx unknown
- 1989-01-20 PT PT89488A patent/PT89488A/pt unknown
-
1995
- 1995-09-18 GR GR950402550T patent/GR3017427T3/el unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ES2078900T3 (es) | 1996-01-01 |
| ATE127693T1 (de) | 1995-09-15 |
| DE68924183T2 (de) | 1996-03-21 |
| DK22389D0 (da) | 1989-01-19 |
| PT89488A (pt) | 1989-10-04 |
| EP0325191B1 (en) | 1995-09-13 |
| DE68924183D1 (de) | 1995-10-19 |
| DK22389A (da) | 1989-07-21 |
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