DE68928251T2

DE68928251T2 - Cs-Peptide von P. Falciparum als allgemeines t-Zellen-Epitop

Info

Publication number: DE68928251T2
Application number: DE68928251T
Authority: DE
Inventors: Francesco Dr Sinigaglia
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 1988-05-24
Filing date: 1989-05-12
Publication date: 1998-03-12
Anticipated expiration: 2009-05-13
Also published as: EP0343460A3; US5114713A; EP0343460A2; EP0343460B1; DE68928251D1; ATE156841T1; DK250589A; CA1340472C; AU3504689A; JP2761402B2; NZ229146A; GB8812214D0; ZA893702B; AU627459B2; DK250589D0; JPH0242099A

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Verwendung eines Peptides aus dem Circumsporozoit Protein von Plasmodium falciparum (P. falciparum) und davon abgeleitete Derivate als universell erkennbares T-Zell Epitop, dass heisst als ein Epitop, das in Assoziation mit vielen verschiedenen humanen und murinen Haupthistocompatiblitätskomplex (MHC) Haplotypen, z B. in Zusammenhang mit den humanen MHC Klasse II Molekülen wie DR1, DR2, DR4, DR5, DRw6, DR7 oder DR9 erkannt wird. Weiterhin bezieht sich die vorliegende Erfindung auf die obengenannten Peptide per se und auf immunogene Zusammensetzungen, die solche Peptide oder Derivate davon umfassen. Diese immunogenen Zusammensetzungen können als Impfstoffe benutzt werden, die eine lang andauernde Immunantwort gegen ein pathogenes Agens in Menschen und Tieren unabhängig vom MHC Haplotyp des Wirts auslösen.
Sinigaglia et al. [Eur. J. Immunol. 18, 633-636 (1988)] beschreiben drei Peptide des Circumsporozoit Proteins des Malaria Parasiten Plasmodium falciparum. Diese Peptide entsprechen nicht-repetitiven Sequenzen, die T Zell Erkennungsbereiche darstellen sollen.
Es ist bekannt, dass chemisch synthetisierte Peptide, die ausgewählte Regionen antigener Strukturen (B-Zell Epitope) darstellen, Antikörper induzieren können, die an die nativen Moleküle binden können (Arnon et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 68, 1450-1455 [1971]). Solche Peptide können in einen Wirt injiziert werden, wobei eine schützende Immunantwort induziert wird (zur Uebersicht siehe Shinnick et al., Ann. Rev. Microbiol. 37, 425- 446 [1983]).
Jedoch limitiert die strikte genetische Kontrolle der Fähigkeit zur Immunantwort auf individuelle Epitope durch die polymorphe Klasse II MHC Gene die Nützlichkeit von Einzelepitop-Impfstoffen.
Ein Beispiel eines Epitops das nicht immer eine Immunantwort in einem Wirt auslöst ist die Repeat-Sequenz Asn-Ala-Asn-Pro (NANP) in dem CS Protein des Malaria Parasiten P. falciparurm (Enea et al., Science, 225. 628-630 [1984]; Dame et al., Science 225,593-599 [1984]). Es wurde gefunden, dass das repetitive Peptid eine Parasit spezifische Immunantwort nur in solchen Mäusen auslöst, die einen H-2b Haplotyp ausweisen. (Good et al., J. Exp. Med. 164 655-660 [1986]; del Guidice et al., J. Immunol. 137, 2952-2955 [1986]).
Kürzlich wurde gezeigt, dass das nicht-immunogene B-Zell Epitop des CS Proteins (NANP)n durch Konjugation mit einem T-Zell Epitop, das die Aminosäurebereiche 326 bis 343 des CS Proteins umfasst, stark immunogen gemacht werden kann (Good et al., Science, 235, 1059-1062 [1987]). Ein Peptid, dass eine Aminosäuresequenz umfasst, die diesem T-Zell Epitop entspricht, wurde kovalent mit einem Peptid verbunden, das die Repeat- Sequenz (NANP)&sub5; aufweist. Die kombinierten Peptide riefen hohe Titer an Antikörpern in B10BR und B10.A(4R) Mäusen hervor. Aehnliches berichteten Francis et al. in Nature 330, 168-170 [1987]: die Nichtantwort auf ein Maul- und Klauenseuche Virus Peptid kann durch Kombination eines Maul- und Klauenseuche Virus B-Zell Epitopes mit einem fremden Helfer T- Zell Epitop Determinante, z. B. aus Ovalbumin oder Pottwal Myoglobin, vermieden werden. Die Antworten auf T-Zell Determinanten, die von Good et al. ([1987], supra) und Franeis et al. (supra) beschrieben wurden, waren unter der Kontrolle von Ir Genen (immune response genes). Das bedeutet, dass nur bestimmte Inzucht Maus Stämme, die die "richtigen" MHC Haplotypen aufweisen, durch die verwendeten T-Zell Epitope erkannt werden konnten.
Da ein idealer Impfstoff eine Immunantwort gegen ein pathogenes Agens in allen Individuen hervorrufen muss, muss er T-Zell Epitope aufweisen, die von allen MHC Haplotypen erkannt werden.
Es wurde nun gefimden, dass das GS.T3 Peptid, das die Aminosäuresequenz
H-Asp-Ile-Glu-Lys-Lys-Ile-Ala-Lys-Met-Glu-Lys-Ala- Ser-Ser-Val-Phe-Asn-Val-Val-Asn-Ser-OH
aufweist, als universell erkennbares T-Zell Epitop eingesetzt werden kann. Dies bedeutet, dass es in Verbindung mit vielen verschiedenen humanen und murinen MHC Haplotypen erkannt wird, z. B. im Kontext der humanen MHC Moleküle DR1, DR2, DR4, DR5, DRw6, DR7 oder DR9. Die CS.T3 Peptide entsprechen den Positionen 378 bis 398 des CS Proteins von P. falciparum (Dame et al., supra), enthalten jedoch zwei Alanin Bausteine anstelle der nativen Protein Cysteine an Position 384 und 389. Die CS.T3 Peptide können deshalb auch als [Ala³&sup8;&sup4;,³&sup8;&sup9;] - P. falciparum CS(378-398) bezeichnet werden.
Weiterhin wurde gefünden, dass Derivate der CS.T3 Peptide mit kleineren Modifikationen in der Aminosäuresequenz des CS.T3 Peptides immer noch als universell erkennbare T-Zell Epitope eingesetzt werden können. So können zum Beispiel ein oder zwei Aminosäuren an jedem Ende des CS.T3 Peptides deletiert werden ohne seine Verwendung als universell erkennbares T-Zell Epitop zu beeinträchtigen. Wenn mehr als zwei Aminosäuren an jedem Ende des CS.T3 Peptides deletiert werden, können die Peptide immer noch von den meisten aller MHC Haplotypen erkannt werden, obwom beobachtet wurde, dass je mehr Aminosäuren deletiert werden, das Peptid desto mehr die Fähigkeit verliert, von verschiedenen MHC Haplotypen erkannt zu werden. Wenn mehr als acht Aminosäuren an jedem Ende deletiert werden, wird das Peptid nicht länger als T-Zell Epitop von MHC Haplotypen erkannt (siehe unten).
Andere Modifikationen in der Aminosäuresequenz des CS.T3 Peptides, die keinen Effekt auf die Verwendung als universell erkennbares T-Zell Epitop haben sollten, sind Aminosäuresubstitutionen und -additionen am Terminus und/oder am N-Terminus. So können die besagten CS.T3 Peptide oder Derivate davon Teil eines grösseren Polypeptides sein, z. B. ein natürliches CS Protein oder Fragmente davon oder ein Fusionsprotein enthaltend fremde Peptidsequenzen, bevorzugt Peptidsequenzen von anderen Polypeptiden von Malariaparasiten. Weiterhin kann der C-Terminus des CS.T3 Peptides oder Derivate davon amidiert sein.
Neben Modifikationen am N- oder C-Terminus der Peptide, sind auch Modifikationen innerhalb der Aminosäuresequenz der CS.T3 Peptide oder seiner Derivate möglich, wobei die Modifikationen immer noch die Verwendung als universell erkennbare T-Zell Epitope erlauben. Diese Modifikationen können Deletionen, Insertionen und/oder Aminosäuresubstitutionen sein. Beispiele solcher Derivate sind Peptide, die die Positionen 378 bis 398 des CS-Proteins umfassen, die Cystein Bausteine an Position 384 und 389 wie in dem nativen CS-Protein aufweisen. Die allgemeinen Merkmale der Modifikationen sind, dass sie die Sekundär- und Tertiärstruktur der Peptide praktisch nicht verändern (Doolittle, R.F., in "The Proteins", Vol. IV, Neurath, H. und Hill R.L., Hrsg., Academic Press, New York, S. 1-119, [1979]). Die obengenannten Derivate müssen an die MHC Klasse II Moleküle wenigstens genauso gut oder bevorzugterweise besser als die CS.T3 Peptide binden. Es wurde beobachtet, dass Derivate, in denen ile an Position 383 durch Leu und/oder Glu an Position 387 aus getauscht wurden, um ungefähr 10 bis 100 Mal besser als die ursprüngliche CS.T3 Sequenz an sowohl DR5 als auch an DRw6 binden, wenn die Bindung in einem kompetitiven Bindungsassay (Kilgus et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 86, 1629-1633 [1989]) gemessen wird.
Folglich bezieht sich die vorliegende Erfindung auf die Verwendung eines Polypeptides umfassend die Aminosäuresequenz
R¹-Glu-Lys-Lys-Ile-Ala-Lys-Met-Glu-Lys-Ala-Ser-Ser- Val-Phe-Asn-Val-R²
a) wobei R¹ H-Asp-Ile-, H-Ile- oder H- und R² -Val-Asn-Ser-OH, -Val- Asn-OH, -Val-OH oder -OH ist
oder seine Derivate als universell erkennbare T-Zell Epitope, auf die Polypeptide per se und auf ein Verfahren zur Herstellung dieser Polypeptide. Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf immunogene Zusammensetzungen, die ein solches Polypeptid und ein Polypeptid, das eine antigene Struktur aufweist, die ein B-Zell Epitop darstellt, enthalten.
Die Derivate der obengenannten Polypeptide sind Polypeptide mit Modifikationen in der Aminosäuresequenz (I) wie die oben erwähnten wobei die Modifikationen nicht die Sekundär- oder Tertiärstruktur der Polypeptide verändern, so dass die Polypeptide immer noch an mehrere MHC Klasse II Moleküle binden und so noch als universell erkennbare T-Zell Epitope verwendet werden können.
Die bevorzugten Polypeptide, die in der vorliegenden Erfindung als universell einsetzbare T-Zell Epitope benutzt werden sind Polypeptide mit den folgenden Aminosäuresequenzen
H-Asp-Ile-Glu-Lys-Lys-Ile-Ma-Lys-Met-Glu-Lys-Ma-Ser-Ser-Val- Phe-Asn-Val-OH (II),
H-Asp-Ile-Glu-Lys-Lys-Ile-Ala-Lys-Met-Glu-Lys-Ala-Ser-Ser-Val- Phe-Asn-Val-Val-OH (III),
H-Asp-Ile-Glu-Lys-Lys-Ile-Ma-Lys-Met-Glu-Lys-Ma-Ser-Ser-Val- Phe-Asn-Val-Val-Asn-OH (IV),
H-Ile-Glu-Lys-Lys-Ile-Ala-Lys-Met-Glu-Lys-Ala-Ser-Ser-Val-Phe- Asn-Val-OH (V),
H-Ile-Glu-Lys-Lys-Ile-Ala-Lys-Met-Glu-Lys-Ma-Ser-Ser-Val-Phe- Asn-Val-Val-OH (VI),
H-Ile-Glu-Lys-Lys-Ile-Ma-Lys-Met-Glu-Lys-Ma-Ser-Ser-Val-Phe- aAsn-Val-Val-Asn-OH (VII),
H-Ile-Glu-Lys-Lys-Ile-Ala-Lys-Met-Glu-Lys-Ala-Ser-Ser-Val-Phe- Asn-Val-Val-Asn-Ser-OH (VIII),
H-Glu-Lys-Lys-Ile-Ala-Lys-Met-Glu-Lys-Ala-Ser-Ser-Val-Phe- Asn-Val-OH (IX),
H-Glu-Lys-Lys-Ile-Ma-Lys-Met-Glu-Lys-Ma-Ser-Ser-Val-Phe- Asn-Val-Val-OH (X),
H-Glu-Lys-Lys-Ile-Ala-Lys-Met-Glu-Lys-Ala-Ser-Ser-Val-Phe- Asn-Val-Val-Asn-OH (XI),
H-Glu-Lys-Lys-Ile-Ala-Lys-Met-Glu-Lys-Ala-Ser-Ser-Val-Phe Asn-Val-Val-Asn-Ser-OH (XII) oder
H-Asp-Ile-Glu-Lys-Lys-Ile-Ala-Lys-Met-Glu-Lys-Ma-Ser-Ser-Val- Phe-Asn-Val-Val-Asn-Ser-OH (XIII)
oder Derivate der Polypeptide, die die Aminosäuresequenzen (II) bis (XIII) beinhalten.
Das weitaus bevorzugteste Polypeptid, das in der vorliegenden Erfindung als universell erkennbares T-Zell Epitop verwendet wird, ist das Polypeptid mit der Aminosäuresequenz XIII, das identisch mit dem CS.T3 Peptid ist, das oben erwähnt ist.
Wie oben beschrieben ist die Kombination eines T-Zell Epitopes und eines B-Zell Epitopes die funktionelle Einheit, die in der Lage ist, eine T- Helfer Zell-abhängige Immunantwort zu induzieren. Deshalb muss das oben erwähnte T-Zell Epitop mit einem B-Zell Epitop assoziiert sein, um eine Immunantwort in einem Wirt auszulsen. Das B-Zell Epitop kann ein beliebiges Peptid, Hapten oder Karbohydrat sein, das eine ausgewählte Region einer antigenen Struktur repräsentiert. Eine solche antigene Struktur kann Teil eines Polypeptids sein, wobei das Polypeptid glykosiliert oder nichtglykosiliert sein kann. Die besagten Polypeptide können ein Oberflächenprotein eines pathogenen Agens sein, z. B. ein eine Krankheit verursachendes Bakterium, ein Virus, ein Pilz oder ein Parasit. Beispiele solcher pathogenen Agenzien sind in Davis et al., "Microbiology", 3. Auflage, Harper International Edition, beschrieben.
Die Peptide, die als universell erkennbare T-Zell Epitope der vorliegenden Erfindung verwendet werden, können kovalent an jedes ein B- Zell Epitop repräsentierende Peptid, Hapten oder Karbohydrat gekoppelt werden. Die Kupplung kann entweder direkt durch die Bildung einer Peptid- oder Esterbindung zwischen einer freien Carboxyl-, Amino- oder Hydroxylgruppe des Peptides, dass als universell erkennbares T-Zell Epitop genutzt wird, und den korrespondierenden Gruppen des Peptides, Haptens oder Karbohydrates, das ein B-Zell Epitop darstellt oder indirekt mittels einer konventionellen Verknüpfungsgruppe hergestellt werden. Beispiele für konventionelle bifunktionelle Verknüpfüngsreagenzien, die für die Bildung solcher Verknüpfungen verwendet werden, sind Sulfosuccinimidyl-4- (p-maleimidophenyl)butyrat (sulfo-SMPB), Sulfosuccinimidyl-(4- iodoacetyl)aminobenzoat (sulfo-SIAB), N-Succinimidyl (4- iodoacetyl)aminobenzoat (SIAB), 2-Iminothiolan HCl (Trautsches Reagenz), Dimethylpimelimidat 2HCl (DMP), Succinimidyl-4-(p- maleimidophenyl)butyrat (SMPB), N-Succinimidyl-3-(2- pyridyldithio)propionat (SPDP), Bismaleinidohexan (BMH) und m- Maleimidobenzoyl-N-hydroxy-succinimidester (MBS). Diese und andere bifunktionelle Verknüpfungsreagenzien sind kommerziell erhältlich von der Pierce Chemical Company, Rockford, Illinois, U.S.A. Alternativ können C&sub2;&submin;&sub7;-Dialkanale wie Glutardialdehyd (Avrameas, Immunochem. 6, 43-52 [1969]) benutzt werden.
Weiterhin können das B-Zell und das T-Zell Epitop Teil eines multiplen antigenen Peptids (MAP) sein. Solche MAP's können wie von Posnett et al., J. Biol. Chem. 263, 1719-1725 [1988] beschrieben hergestellt werden. Ein Beispiel eines MAPs ist das multiple antigene Peptidsystem (MAPS) B-Zell Epitop [(NANP)&sub3;]&sub8;-Lys&sub7;-Aca-Cys-NH&sub2;, dass aus Multimeren der Repeatsequenz (NANP) besteht, die im CS Protein von Plasmodium falciparum vorliegt (Internationale Patentanmeldung Nr. PCT/US85/01416, Publikationsnummer WO 86100911). Dieses MAPS kann mittels eines Festphasenverfahrens synthetisiert werden. Es wurde in zwei separaten Immunisierungsstudien gefunden, dass dieses MAPS beträchtliche Antikörpertiter hervorruft, wie der, der für das [Ac-Cys(NANP)&sub3;]&sub2;&sub5; B-Zell Epitop konjugiert mit dem Tetanus Toxoid beobachtet wurde (Herrington et al., Nature 328, 257-259 [1987]). Diese Feststellung war besonders wichtig, da das besagte B-Zell Epitop ein gut definiertes homogenes Peptid ist, was eine exakte Dosierung erlaubt und keine Konjugation mit einem Trägerprotein benötigt (z.B. Tetanus Toxoid) um hohe Antikörpertiter hervorzurufen.
Deshalb kann der MAPS B-Zell Epitop-Ansatz Probleme, die mit mit Proteinträgern assoziierten Peptidimpfstoffen verbunden sind, nämlich (a) Mikroheterogenität der Protein-Protein Konjugation und (b) die Antikörperantwort auf das Tetanus Toxoid selbst, die die Immunantwort auf den synthetischen Peptidanteil des Konjugates stören könnte, überwinden helfen (Herrington et al., supra).
Demnach können, als eine weitere Verbesserung in dem Versuch einen idealen Impfstoff mit langandauernder Immunität sowohl auf dem T- Zell als auch auf dem B-Zell Ebene zu entwickeln, die Polypeptide, die die Aminosäuresequenz (I) aufweisen oder Derivate davon mit dem obengenannten MAPS B-Zell Epitop kombiniert werden. Zum Beispiel kann das Polypeptid, das die Aminosäuresequenz XIII aufweist (siehe Beispiel Verbindung 5a) oder das Polypeptid, das die Aminosäuresequenz X aufweist (siehe Beispiel, Verbindung 7a) mit dem B-Zell Epitop [(NANP)&sub3;]&sub8;-Lys&sub7;-Aca- CYS-NH&sub2; kombiniert werden. Eine schematische Darstellung des letzteren Peptides/Peptidimpfstoffes ist in Figur 1 gezeigt. In den oben erwähnten Peptiden/Peptidvakzinen sind die Peptide, die die T-Zell Epitope darstellen, kovalent mit einem Peptid verknüpft, das ein B-Zell Epitop darstellt. Es liegt jedoch keine Notwendigkeit vor, dass das Peptide, das ein T-Zell Epitop darstellt, kovalent mit einem ein B-Zell Epitop darstellenden Peptid verbunden ist, nur müssen die Peptide in einer solchen Weise assoziiert sein, das sie zu einer gemeinsamen Repräsentation gegenüber Zellen des Immunsystems fähig sind.
Die Peptide, die das B-Zell und/oder T-Zell Epitop darstellen, können mittels konventioneller Peptidsynthesemethoden, entweder in Lösung, oder bevorzugterweise mittels der Festphasenmethode von Merrifield (J. Am. Chem. Soc. 85, 2149-2154 [1963]) oder mittels anderer dazu äquivalenter Methoden, die aus dem Stand der Technik bekannt sind hergestellt werden.
Die Festphasensynthese wird vorn C-terminalen Ende des Peptides durch Kupplung einer geschützten Aminosäure an ein geeignetes Harz eingeleitet. Das Ausgangsmaterial kann durch Anbringen einer Aminogeschützten Aminosäure via eine Benzylesterverbindung an ein chlormethyliertes Harz oder an ein hydroxymethyliertes Harz oder via eine Amidbindung an ein Benzhydrylamin (BHA) Harz, ein Methylbenzhydrylamin (MBHA) Harz oder ein Benzyloxybenzalkoholharz hergestellt werden. Diese Harze sind kommerziell erhältlich und ihre Verwendung ist geläufig.
Generelle Methoden für das Schützen und die Entfernung von Schutzgruppen von Aminosäuren, die für diese Erfindung benutzt werden können, sind beschrieben in "The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology", Vol 2, (E. Gross und J. Meienhofer, Eds., Academic Press, New York, p. 1- 284 [1979)) und von Atherton et al., in "The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology", Vol, 9, (S. Udenfried und J. Meienhofer, Hrsg., Academic Press, New York [1987]). Zu den Schutzgruppen gehören z. B. die 9-Fluorenylmethyloxycarbonyl- (FMOC), die tert.-Butyloxycarbonyl (Boc), die Benzyl(Bzl), die t-Butyl- (But), die 2-Chlorobenzyloxycarbonyl- (2Cl-Z), die Dichlorobenzyl- (Dcb) und die 3,4-Dimethylbenzyl (Dmb)-Gruppen.
Nach Entfernung der α-Aminoschutzgruppen von der ersten (C- terminalen) Aminosäure, werden die verbleibenden Aminosäuren schrittweise in der gewunschten Abfolge gekoppelt. Das vollständige Peptid kann auf diese Weise synthetisiert werden. Alternativ können kleinere Peptide konstruiert werden, die später verbunden werden und das endgültige Peptidprodukt ergeben. Geeignete Kopplungsbedingungen sind aus dem Stand der Technik bekannt, wie die Prozedur von Dourtoglou et al (Synthesis 1984, p. 572-574), die 1,3-Dicyclohexylcasrbodiimid/1- Hydroxybenzotriazol (DCC/HOBT) oder O-Benzotriazolyl-N,N,N',N'- Tetramethyluroniumhexafluorophosphat (HBTU) als besonders geeignet erscheinen lässt.
Jede geschützte Aminosäure oder Peptid wird im Ueberschuss in den Festphasenreaktor eingeleitet und die Kopplung kann in einem Medium aus Dimethylformamid (DMF) oder Methylenchlorid (CH&sub2;Cl&sub2;) oder Mischungen davon durchgeführt werden. In Fällen, in denen eine unvollständige Kopplung auftritt, wird die Kopplungsprozedur vor Entfernung der N'-Amino geschützten Gruppe vor der Kopplung der nächsten Aminosäure wiederholt. Der Erfolg der Kopplungsreaktion kann zu jedem Zeitpunkt der Synthese kontrolliert werden. Eine bevorzugte Methode der Reaktionskontrolle ist die Ninhydrin Reaktion. Die Kopplungsreaktionen und Waschschritte können unter Verwendung automatischer Gerätschaften durchgeführt werden.
Die Spaltung der Peptide vom Harz kann mittels bekannter Methoden aus der Peptidchemie erreicht werden. Zum Beispiel kann einer Reaktion mit Fluorwasserstoffsäure (HF) in Gegenwart von p-Kresol und Dimethylsulfid bei 0ºC für eine Stunde eine zweite Reaktion mit Fluorwasserstoffsäure in Gegenwart von p-Kresol für 2 Stunden bei 0ºC oder mit Trifluoressigsäure/Methylenchlorid/Anisol folgen. Die Spaltung der Peptide von chlormethylierten oder p-Benzyloxybenzylalkohol-Harz- Trägern liefert Peptide, die eine Carboxylgruppe am C-Terminus besitzen. Spaltung der Peptide von Benzhydrylamin- oder Methylbenzhydrylamin-Harzen liefert Peptide mit einer C-terminalen Amidgruppe.
Alternativ kann das Peptid, dass als universell erkennbares T-Zell Epitop gebraucht wird oder die kombinierten Peptide, die zusätzlich das Peptid enthalten, dass ein B-Zell Epitop darstellt, durch Methoden der rekombinanten DNA Technologie hergestellt werden. Die Methoden zur Herstellung solcher Peptide mittels rekombinanter RNA Technologie sind aus dem Stand der Technik gut bekannt. Ein DNA Fragment, dass für die besagten Peptide kodiert, kann gemäss den gut bekannten Methoden aus dem Stand der Technik dargestellt werden, z. B. mittels der Phosphotriestermethode (Narang et al., Meth. Enzymol. 68, 90-108 [1979] oder mittels der Phosphodiestermethode (Brown et al., Meth. Enzymol. 68, 109-151 [1979] und in einen Expressionsvektor wie durch Maniatis et al. in "Molecular Cloning - A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory [1982] beschrieben kloniert werden.
Die Peptide, die in der vorliegenden Erfindung benutzt werden, können mittels bekannter Methoden gereinigt werden, wie differentielle Zentrifugation, Fällung mit Ammoniumsulfat, Dialyse zur Salzentfernung (unter normalem und reduziertem Druck), präparative isoelektrische Fokussierung, präparative Gelelektrophorese oder verschiedene chromatographische Methoden, z. B. Gelfiltration, Hochdruckflüssigkeitschromatographie, 'Reverse phase' Chromatographie oder Affinitätschromatographie.
Die immunogenen Zusammensetzungen, die ein Peptid, das ein universelles T-Zell Epitop gemäss der vorliegenden Erfindung darstellt und ein Peptid, dass ein B-Zell Epitop darstellt, umfassen, können zusätzlich ein pharmazeutisch geeignetes Adjuvans einschliessen. Die besagten immunogenen Zusammensetzungen können als Impfstoffe zur Auslösung der Bildung von Antikörpern spezifisch für ein pathogenes Agens, das das oben erwähnte B-Zell Epitop eiprimiert, verwendet werden. Der Ausdruck "pharmazeutisch geeignetes Adjuvans" kann entweder eine Standardzusammensetzung bedeuten, die für die humane Verabreichung geeignet ist, oder typische Adjuvantien und Excipienten (z. B. Serumalbumin oder Plasmapräparationen) hergestellt für Tierimpfstoffe. Geeignete Adjuvantien für die Impfung von Tieren schliessen ein, sind aber nicht beschränkt auf, Freundsches komplettes oder nicht-komplettes Adjuvans (nicht geeignet für den humanen Gebrauch oder den Gebrauch für Tierbestände), Adjuvans 65 (enthält Erdnussöl, Mannitmonooleat und Aluminiummonostearat), mineralische Gele wie Aluminiurmhydroxid, Aluminiumphosphat und Alaun, Grenzflächen-aktive Mittel wie Hexadecylamin, Octadecylamin, Lysolecithin, Dimethyl-dioctyldecylammoniumbromid, N,N- Dioctadecyl-N',N'-bis(2-hydroxyethyl)propandiamin, Methoxyhexydecylglycerol und Pluronic-Polyole, Polyanionen wie Pyran, Dextransulfat, Polyic, Polyacrylsäure und Carbopol, Peptide und Aminosauren wie Muramyldipeptid, Dimethylglycin, Tuftsin und Oelemulsionen. Das Polypeptid der vorliegenden Erfindung kann auch nach Einbau in Liposomen oder andere Mikrocarrier verabreicht werden, oder nach Konjugation an Polysacchariden oder anderer Proteine oder anderer Polymere oder in Kombination mit Quil-A unter Bildung von "Iscoms" (immunstimulierende Komplexe) (Allison et al., J. Immunol. Meth. 95, 157- 168 [1986]; Morein et al. Nature 308,457460 [1984]). Zusätzlich sind genetisch modifizierte Mikroorganismen wie Vaccinia oder Salmonella in der Lage Gene zu exprimieren, die ein Polypeptid kodieren, das ein universelles T- Zell Epitop darstellt, die als Imfstoffabgabe Systeme eingesetzt werden können.
Die immunogenen Zusammensetzungen können durch Kombination eines Pepides, das ein universelles T-Zell Epitop gemäss der vorliegenden Erfindung darstellt, mit einem Peptid, das ein B-Zell Epitop darstellt und falls notwendig mit einem pharmazeutisch geeigneten Adjuvans hergestellt werden. Bevorzugterweise liegt die immunogene Zusammensetzung in Form einer einzigen Dosis vor. Die Menge der als Impfstoff oder als Medikament einmal oder über einen Zeitraum verabreichten aktiven Verbindungen hängt von der zu behandelnden Person, der Art und Form der Verabreichung und der Einschätzung des behandelnden Arztes ab. Eine effektive Dosis kann in dem Bereich von ungefähr 1 ng bis ungefähr 1 mg der Zusammensetzung dieser Erfindung liegen, bevorzugterweise zwischen ungefähr 100 µg bis ungefähr 500 µg; es ist klar, dass auch niedrigere und höhere Dosen nützlich sein können. Die immunogene Zusammensetzung kann in einer Vielzahl von Formen vorliegen. Diese schliessen zum Beispiel feste, halbfeste und flüssige Darreichungsformen ein. Die Darreichungsdosis wird bevorzugterweise in einem 1 ml Gefäss abgepackt, das die immunogene Zusammensetzung in Form einer Suspension in 0,9% (w/v) NaCl-Lösung enthält. Die bevorzugteste immunogene Zusammensetzung enthält 0,4 mg/ml Protein (T- und B-Zell Epitop Peptide) absorbiert an 850 µg Al(OH)&sub3; und 100 µg/ml Merthiolate (Eli Lilly). Das Gefäss wird bevorzugterweise in ein Behältnis zusammen mit einer schriftlichen Gebrauchsanweisung, die über den richtigen Gebrauch der immunogenen Zusammensetzung informiert, verpackt. Die vorliegende Erfindung bezieht sich also auch auf eine solche Darreichungsdosis der immunogenen Zusammensetzung, die in einem Behältnis verpackt ist, am bevorzugtesten zusammen mit einer Gebrauchsanweisung. Weiterhin bezieht sich die vorliegende Erfindung sowohl auf ein Verfahren zur Herstellung der besagten immunogenen Zusammensetzung oder einer Darreichungsform davon als auch auf eine Methode zur Immunisierung eines Menschen oder Tieres unter Verwendung einer solchen immunogenen Zusammensetzung.
Die Art und Weise der Verabreichung der immunogenen Zusammensetzung als auch die Häufigkeit der Injektionen sind alles Faktoren, die unter Verwendung des bekannten Fachwissens optimiert werden können. Typischerweise folgen der ersten Impfung mit einer immunologisch wirksamen Menge des Impfstoffs ein oder zwei Verstärkungsimpfungen, wobei deren Effekt die Herstellung von hohen Antikörpertitern gegen ein spezielles pathogenes Agens ist.
Nach der nun allgemeinen Beschreibung der Erfindung kann sie nun auch leichter durch Bezugnahme auf die folgenden Beispiele in Zusammenhang mit den Abbildungen 1 bis 6 verstanden werden.
FIG 1 Schematische Darstellung des Peptid/Peptid-Impfstoffes umfassend das MAPS B-Zell Epitop [(NANP)&sub3;]&sub8;-Lys&sub7;-Aca-Cys-NH&sub2; und das T- Zell Epitop Ac-Cys-Aca-[Ala³&sup8;&sup4;,³&sup8;&sup9;]-P. falciparum Cs(378-396)-NH&sub2;. N, A, P, K bedeuten Asparagin, Alanin, Prolin bzw. Lysin.
FIG 2A.B Schematische Darstellung der Festphasensynthese (SPPS) des MAPS B-Zell Epitopes [(NANP)&sub3;]&sub8;-Lys&sub7;-Aca-Cys-NH&sub2;
FIG 3 Schematische Darstellung der kovalenten Verknüpfung des MAPS B- Zell Epitopes [(NANP)&sub3;]&sub8;-Lys&sub7;-Aca-Cys-NH&sub2; mit dem universellen T- Zell Epitop Ac-Cys-Aca-[Ala³&sup8;&sup4;,³&sup8;&sup9;]-P. falciparum CS(378-398)-NH&sub2;.
FIG4 Schematische Darstellung der kovalenten Verknüpfling des MAPS B- Zell Epitopes [(NANP)3]8-Lys&sub7;-Aca-Cys-NH&sub2; mit dem universellen T- Zell Epitop Ac-Cys-Aca-[Ala³&sup8;&sup4;,³&sup8;&sup9;]-P. falciparum Cs(380-396)-NH&sub2; via 2,2'-Dipyridyldisulfid.
FIG 5 "Enzyme-linked immunoadsorbent assay" zum Nachweis von anti(NANP)&sub5;&sub0; Antikörper im Plasma von BALB/c Mäusen immunisiert mit (NANP)&sub3;-CS.T3 ( ) oder mit dem universellen T-Zell Epitop Ac-Cys-Aca-[Ala³&sup8;&sup4;,³&sup8;&sup9;]-P. falciparum CS(378-398)-NH&sub2; kovalent verknüpft mit dem MAPS-B-Zell Epitop [(NANP)&sub3;]&sub8;-Lys&sub7;-Aca-Cys- NH&sub2;( ).
FIG 6 Immunofluoreszenz Assay (IFA) zum Nachweis von Anti-(NANP)&sub5;&sub0; Antikörpern im Plasma von BALBI/c Mäusen immunisiert mit (NANP)&sub3;-CS.T3 ( ) oder mit dem universellen T-Zell Epitop Ac- Cys-Aca-[Ala³&sup8;&sup4;,³&sup8;&sup9;]-P. falciparum CS(378-398-NH&sub2; kovalent verknüpft mit dem MAPS-B-Zell Epitop [(NANP)&sub3;]&sub8;-Lys&sub7;-Aca-Cys- NH&sub2;( ).
Es versteht sich, dass die folgenden Beispiele nur illustrativen Zwecken dienen und nicht in irgendeiner Weise als limitierend für die Erfindung auf die spezifischen hier dargestellten Ausführungsformen angesehen werden können. Die hier verwendeten Abkürzungen stehen in Uebereinstimmung mit denen, die generell in der Peptidchemie verwendet werden (siehe "The Peptides", Vol 2, S. Udenfriend und J. Meinenhofer, Hrsg., Academic Press, New York [1987)).

Synthese und Reinigting der CS.T3 Peptide

Das Peptid CS.T3 wurde mittels der Festphasentechnik unter Verwendung von Base-labilen N-Fluorenylmethoxylcarbonyl-Aminosäuren, auf t-Butyl basierenden Seitenketten-Schutzgruppen und einem p- Benzyloxybenzylalkohol Polystyrolharz wie durch Atherton et al. in "The Peptides", Vol 2, S. Udenfriend und J. Meinenhofer, Hrsg., Academic Press, New York [1987]) beschrieben, synthetisiert.
Die Anfangssynthese wurde mit Fmoc-Ser(But)-O-CH&sub2;C&sub6;H&sub4;O- CH&sub2;C&sub6;H&sub4;-Harz in einem manuellen Schüttler gestartet. Das Protokoll für einen typischen Synthesezyklus war folgendermassen:
Das resultierende geschützte Peptidharz H-Asp(OBut)-Ile-Glu(OBut) Lys(Boc)-Lys(Boc)-Ile-Ala-Lys(Boc)-Met-Glu(OBut)-Lys(Boc)-Ala-Ser(But) -Ser(But)-Val-Phe-Asn-Val-Val-Asn-Ser(But)-O-CH&sub2;C&sub6;H&sub4;OCH&sub2;C&sub6;H&sub4;-Harz wurde mit Trifluoressigsäure-Methylenchlorid-Anisol (49:49:2) behandelt, um das freie Peptid zu erhalten. Das Peptid wurde mittels Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPLC) unter Verwendung einer Lichrosorb RP18 (10 µm) Säule (Merck, Darmstadt, FRG) in einem 0,1% Trifluoressigsäure-Ethanol Gradientensystem gereinigt.
Das Triatriakontapeptid (NANP)&sub3;-CS.T3 wurde mittels einer Kombination der klassischen Lösungstechnik und der Festphasenpeptidsynthese synthetisiert. Die geschützten Tetrapeptide Fmoc-Asn-Ala-Asn-Pro-OH wurden gemäss folgendem Schema synthetisiert:
Dreimalige Kopplungen der N'geschützten Tetrapeptide via der HBTU Methode an das oben beschriebene N'ungeschützte Peptidharz ergaben das geschützte Triatriakontapeptidharz. Behandlung mit Trifluoressigsäure (TFA)/Methylenchlorid/Anisol lieferten die freien Peptide. Die Reinigung erfolgte mittels HPLC in dem oben beschriebenen Gradientensystem.
Das Peptid war homogen laut analytischer HPLC und zeigte die erwartete Aminosäurezusammensetzung nach saurer Hydrolyse.

Restriktionsspezifität der CS.T3 spezifischen T-Zell Klone

Periphere mononukleare Blutzellen (PBMC) von 8 Freiwilligen (Europäische Blutspender MG, DP, JK, BR, BH, AH, SD und PE ohne Vorgeschichte einer Malariainfektion) wurden unter Verwendung eines Standard National Institutes of Health (Bethesda, Maryland, U.S.A.) Komplement-vermittelten Mikrotoxizitätsassay HLA-bestimmt (Amos, D.B., "Cytotoxicity testing", in NIHD Manual of Tissue Typing Techniques, NIH Publication 80-545 [1979], U.S. Department of Health, Education and Welfare, Atlanta, Georgia, U.S.A.). Die Zellen wurden mit dem Peptid CS.T3 (10 mg(ml) stimuliert, in einem IL-2 enthaltenden Medium expandiert und wie kürzlich beschrieben kloniert (Sinigaglia et al., Eur. J. Immunol. 17, 187-192 [1987]). Um die Antigen Reaktivität und Restriktionsspezifität der Klone in einem proliferativen Assay zu testen, wurden klonierte T-Zellen (2 x 10&sup4;) in Triplikas mit 10&sup4; bestrahlten autologen, oder DR homozygoten EBV transformierten B-Zellen in 0,2 ml komplettem Medium mit oder ohne CS.T3 Antigen (10 mg/ml) cokultiviert (Sinigaglia et al., EMBO J. 4, 3819-3822 [1985]). 3H-Thymidin Einbau wurde 72 Stunden später vermessen. Die Resultate, ausgedrückt in Mittelwerden der Zerfalle pro Minute (cpm) von repräsentativen Klonen, sind in Tabelle 1 dargestellt. Tabelle 1 Proliferation von T-Zell Klonen, gemessen als 3H-Thymidinaufnahme (cpm), in Gegenwart des Peptids CS.T3 und verschiedener Antigenpräsentierender Zellen (APC)
anti DR: = Monoklonaler Antikörper E.31
Wie in Tabelle 1 gezeigt, reagieren die T-Zell Klone gleichmässig gut auf das CS.T3 Antigen, wenn es auf autologen EBV-B-Zellen oder auf der DR-homozygoten EBV-B-Zelllinie, die eine der Spender DR-Speziftäten trägt, präsentiert wird. So waren wenigstens 7 verschiedene DR Moleküle in der Lage, mit dem CS.T3 Peptid zur Präsentation zu assoziieren. Der anti-DR monoklonale Antikörper E.31 (Trucco et al., Immunol. Rev. 47, 219-242 [1979]) wurde zu den Kulturen als 1/100-Verdünnung der Ascites Flüssigkeit gegeben.
Vom Donor MG (HLA Typ DR2,9) wurden 12 CS.T3-spezifische Klone erhalten, 8 waren beschränkt auf DR2 und 4 auf DR9); von DP (DR1,4) wurden 11 CS.T3-spezifische Klone analysiert, 3 waren DR1-beschränkt und 8 DR4-beschränkt; von JK (DRw11(5),7) wurden 9 CS.T3-spezifische Klone analysiert, die alle auf DR5 beschränkt waren; von BR (DR4,w6) wurden 10 CS.T3-spezifische Klone getestet, die Hälfte von ihnen waren DR4 und die andere Hälfte DRw6-beschränkt; von BH (DR 1,3) wurden 16 Antigenspezifische Klone erhalten, alle waren DR1-beschränkt; von SD (DR5,7) wurden 17 Klone getestet, 4 von ihnen waren auf DR5 beschränkt und 13 auf DR7, und letztlich wurden 13 CS.T3-spezifische Klone von PE (DR5,w6) erhalten, 13 waren DR5-beschränkt und keines war beschränkt auf DRw6. Alle erhaltenen CS.T3-spezifischen Klone waren C4+,CD8-, was bedeutete, dass sie T-Helfer Zellen (TH) waren (Engleman et al., J. Exp. Med. 153 193- 198 [1981]).
Insgesamt wurden 298 Anti-CS.T3 Klone von stimulierten PBMC durch limitierte Verdünnung abgeleitet. Alle 298 T-Zell Klone waren spezifisch für CS.T3 und proliferierten nicht in Gegenwart eines Kontrollpeptides abgeleitet von dem CS Protein aus P. falciparum (Aminosäuren 325-342 des CS Proteins). Das MHC Restriktionsmuster jedes CS.T3-spezifischen T-Zell Klons wurde mittels einer Prüfung des Effekts auf anti-MHC Klasse II monoklonaler Antikörper (mAbs) auf T-Zell Proliferationsantworten untersucht. Die Proliferation von 187 getesteten Klonen wurde durch den monoklonalen Antikörper E.31, der die monomorphe DR Determinante erkennt, inhibiert (Tabelle 1). Weder Anti-DP (Watson et al., Nature 304, 358- 361 [1983] noch Anti-DQ (Ziegler et al., Nature 279, 243-244 [1979] Antikörper waren wirksam. Diese Resultate zeigen, dass die DR Moleküle das Restriktionselement für die CS.T3-spezifischen Klone sind. Das DR Restriktionsmuster eines jeden CS.T3-spezifischen T-Zell Klones wurde durch Vergleich der Antworten auf CS.T3 Peptide in Gegenwart einer Reihe von homozygoter HLA-DR präsentierender Zellen erhalten. Homozygote HLA-DR präsentierende Zellen könnten von der European Collection for Biomedical Research (E.C.B.R.), European Collection of Human Lymphoblastiod Cell Lines, Instituto Nazionale per la Ricerca sul Cancro, Immunogenetics Lab, Viale Benedetto XV, 10, 16132, Genua, Italien, erhalten werden. Die homozygoten HLA-DR präsentierenden Zellen, die verwendet wurden um die Daten der Tabelle 1 zu erhalten, nämlich die homozygote DR1 präsentierenden Zelle EDR, die homozygote DR2 präsentierende Zelle NOL, die DR4 präsentierende Zelle BSM, die DR5 präsentierende Zelle ATH, die homozygote DRw6 präsentierende Zelle APD, die homozygote DR7 präsentierende Zelle EKR und die homozygote DR9 präsentierende Zelle DKB wurden aus dem Department of Immunohaematology, University Hospital, Leiden, Niederlande (Drs. E. Goulmy und J. van Rood) erhalten. Die Zellen wurden in RPMI 160 Medium (Gibco, Paisley, Schottland) unter Zusatz von 2 mM L-Glutamin, 1 mM Natriumpyruvat, 5 x 10&supmin;&sup5; M β- Mercaptoethanol, 1% nichtessentielle Aminosäuren (100% Stammlösung; Gibco), 50 U/ml Streptomycin und 10% fetales Kälberserum gehalten. Die Linien waren Epstein-Barr Virus-transformierte B (EBV-B) Zellinien, die bestrahlt wurden (5000 Rad), bevor sie als Antigen-präsentierende Zellen eingesetzt wurden.
Es soll betont werden, dass die homozygoten DR präsentierenden Zellen nicht essentiell sind, um die Erfindung auszuführen. Sie werden in dem vorliegenden Beispiel nur benutzt um zu zeigen, dass das CS.T3 Polypeptid wirklich ein universell erkennbares T-Zell Epitop ist.

Definition der CS.T3 Determinanten, die von T-Zell Klonen erkannt werden. die auf verschiedene DR Allele beschränkt sind

Da eine grosse Spanne von DR Typen fähig sind, die einzelnen CS.T3 Peptide zu repräsentieren, wurde vermutet, dass die Peptide mehr als ein T- Zell Epitop enthalten könnten. Um zu bestimmen, ob T-Zell Klone, die durch verschiedene DR Moleküle beschränkt sind, verschiedene Determinanten auf der CS.T3 Sequenz erkennen, wurden die Proliferationsreaktionen auf die T-Zell Klone in Gegenwart einer Serie von Peptiden untersucht, die um jeweils einen Baustein entweder vom N- oder C-Terminus verkürzt waren.
Peptide mit der in Tabelle 2 angegebenen Aminosäuresequenz wurden synthetisiert, gespalten und mittels HPLC wie oben beschrieben gereinigt. Diese Peptide sind Abkömmlinge des CS.T3 Peptids mit 1, 2 oder mehr Aminosäuredeletionen am N- oder C-Terminus. T-Zellen (2 x 10&sup4;) der in Tabelle 1 gezeigten Klone wurden mit bestrahlten autologen EBV-B Zellen (10&sup4;) in Gegenwart von verschiedenen Antigenkonzentrationen im Bereich von 0,1 bis 100 µg/ml kultiviert. Alle Peptide, die nicht in der Lage waren, die Proliferation bei 100 µg/ml zu stimulieren wurden als nicht-antigen (-) betrachtet. Peptide, die bis 50 % des Maximalwertes, der mit dem vollständigen Peptid (378-398) erhalten wurde, erreichten, wurden mit (+) bezeichnet, wohingegen Peptide, die Werte vergleichbar mit dem vollständigen CS.T3 Peptide (378-398) ergaben, mit (++) bezeichnet wurden. Jeder Klon ist repräsentativ für eine Gruppe (wenigstens 4) von CS.T3- spezifischen Klonen mit der gleichen DR Beschränkung. Tabelle 2
*) Ein-Buchstabenbezeichnung der Aminosäuren, siehe: Hood, Wilson, Wood, "Molecular Biology of Eucaryotic Cells", S.287, W.A. Benjamin, Inc., Menlo Park, Kalifornien, U.S.A. [1975]
Das Peptid 380-398, das die Aminosäuresequenz XII aufweist, das Peptid 378-395, das die Aminosäuresequenz II aufweist und die grösseren Peptide, die die Aminosäuresequenzen XIII, VIII, IV und III besitzen, waren in allen untersuchten Fällen stimulatorisch aktiv. Die kürzeren Peptide waren in der Lage, verschiedene Erkennungsmuster für CS.T3- spezifische Klone, die auf verschiedene DR Moleküle beschränkt waren, zu unterscheiden. Die beiden Extreme bilden die DR2- und DR5-beschränkten Klone. Deletionen vom C-terminalen Ende bis Val an Position 395 und vom N-terminalen Ende bis Ala&sub3;&sub8;&sub4; waren ohne bemerkenswerte Wirkung auf die DR2-beschränkten Klone. Deletion von Ala&sub3;&sub8;&sub4; setzte die Erkennung auf < 50% für jede getestete Dosierung herab. Die weitergehende Entfernung von Lys&sub3;&sub8;&sub5; vom N-terminalen oder Val&sub3;&sub9;&sub5; vom C-terminalen Ende bewirkte den vollständigen Verlust an Erkennung. Demgegenüber konnten DR5- beschränkte Klone bis zur Deletion von Lys&sub3;&sub8;&sub1; vom N-terminalen Ende und Deletion von Ser&sub3;&sub9;&sub0; vom C-terminalen Ende reagieren. Die minimalen Bereiche, wie sie durch separate N- und C-terminale Verkürzungen definiert wurden, die stimulatorisch in Verbindung mit DR2 und DR5 sind, korrespondieren deshalb mit den Bausteinen Lys&sub3;&sub8;&sub5;-Val&sub3;&sub9;&sub5; bzw. Lys&sub3;&sub8;&sub1;- Ser&sub3;&sub9;&sub0;. Tabelle 2 zeigt auch, dass eine minimale stimulatorische Region für DM zwischen Positionen 383-394 eingeschlossen ist, die Region für sowohl DRw6 und DR7 korrespondiert mit den Positionen 381-393/394, während DR1-beschränkte Klone entweder 382-395 (nicht gezeigt) oder 381-392 erkennen. Die Reaktion von DR9-beschränkten T-Zell Klonen auf die verkürzten Peptide verlangt besondere Erwähnung. Für diese Klone (4 von 4 getesteten) bewirkt die Deletion von Lys 381 den Verlust an Erkennung, ähnlich zu dem Peptid 381-398, das über einen grossen Bereich von Konzentrationen nicht erkannt wurde. Demgegenüber führte die weitere Entfernung von Lys 382 und Ile 383 zur Wiederherstellung der Immunogenität. Letztlich war das Peptid 385-398 völlig nicht stimulatorisch. Zusammengefasst zeigen die in Tabelle 2 dargestellten Daten, dass verschiedene überlappende Determinanten im Kontext verschiedener DR Moleküle auszumachen sind.

Antikörperantwort in Maus, immunisiert mit dem (NANP)&sub3;-CS.T3 Peptid

Die folgenden Resultate zeigen, dass der dominante Bereich für die oben beschriebenen humanen T-Zellen als eine Helfer Determinante für eine anti-(NANP)&sub3; Antwort in verschiedenen Mausstämmen dienen kann. Die repetitive (NANP)&sub3;-Sequenz gekoppelt mit dem CS.T3 Peptid wurde an 7 verschiedene Inzuchtstämme verabreicht und sowohl die anti-NANPn als auch die anti-Sporozoit Antwort bestimmt.
Die Mäuse (2 pro Gruppe) wurden an der Schwanzbasis mit 50 µg (NANP)&sub3;-CS.T3 in inkomplettem Freundschem Adjuvans (IFA) immunisiert. Acht Wochen später wurden sie mit 25 µg des Immunogens in komplettem Freundschen Adjuvans geimpft. Plasma wurde 2 und 6 Wochen später abgenommen und individuell mittels ELISA (Rita Togna et al., J. Immunol. 137 2956-2960 [1986]) auf Anwesenheit von anti-(NANP)&sub5;&sub0; Antikörpern getestet. ELISA-Titer sind geometrische Mittelwerte der letzten Verdünnung des Plasmas mit OD&sub4;&sub5;&sub5; > 0,1 und > 2 mal OD&sub4;&sub5;&sub5; von Plasma aus Mäusen, denen eine Salzlösung gespritzt wurde. Das Antigen mit dem die ELISA Platten abgesättigt wurden war (NANP)&sub5;&sub0;. Tabelle 3
Tabelle 3 zeigt, dass alle verschiedenen getesteten Stämme eine Antikörperantwort gegen sowohl (NANP)&sub5;&sub0; als auch gegen Sporozoiten aufwiesen. Es war bereits bekannt, das C57BL/6 Mäuse einen T-Zell Bereich der die repetitive Region umfasst, erkennt (Good et al., [1986], supra; del Guidice et al., [1986], supra). Alle anderen Stämme, die die repetitive Region nicht erkennen, müssen die CS.T3 Determinante erkannt haben. Die Tatsache, dass alle die getesteten Stämme eine Reaktion zeigten, bedeutet, dass der CS.T3 T-Zellbereich in Assoziation mit vielen verschiedenen Maus Ia Molekülen zusätzlich zu den vielen getesteten humanen MHC Genprodukten erkannt wird und deshalb ein universelles T-Zell Epitop darstellt.

Herstellung eines multipen antigenen Peptidsystem-B-Zell Epitops, dass das CS.T3 Peptid enthält

Alle optisch aktiven Aminosäuren besassen die L-Konfiguration und wurden auf Reinheit mittels Dünnschichtchromatographie, Schmelzpunktbestimmung, NMR-Analyse und durch Bestimmung der optischen Drehung geprüft. Nα-Boc-Aminosäuren wurden in der Synthese verwendet und trifunktionelle Aminosäuren wurden als Nα-Boc-Lys-(2- ClZ), Nα-Boc-Asp(OcHex), Nα-Boc-Ser(Bzl) und Nα-Boc-Glu(OBzl) geschützt. Boc-Asn-Ala-Asn-Pro-OBzl wurde katalytisch hydriert und für das resultierende Boc-Asn-Ala-Asn-Pro-OH wurde mittels Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPLC) gezeigt, dass es homogen war. Lösungsmittel und Reagenzien der höchsten Reinheit wurden verwendet. Kupplungen wurden in situ mittels DCC durchgeführt oder nach Verfahren basierend auf symmetrischen Anhydriden mit der Ausnahme von Asparagin, das als Hydroxybenzotrialzolester gekoppelt wurde. Die Peptide wurden mittels der Merrifield Festphasensynthese hergestellt durch sequentielle Kupplung von Aminosäuren unter Verwendung des Applied Biosystems Peptide Synthesizer Model 430A (Applied Biosystems, Foster City, Kalifornien, U.S.A.) oder durch manuelle Verfahren.

Herstellung von Boc-Cy(Dmb)-Benzhydrylaminharz. 1.

Eine Suspension von Benzhydrylaminharz (24 g, 0,45 meq/g, 12,96 mmol) wurden in ein Reaktionsgefäss gegeben, das auf einen manuellen Schüttler gesteckt war, und nacheinander mit Methylenchlorid (CH&sub2;Cl&sub2;; 4 x 250 ml), 10% Diisopropylethylamin (DIEA; 1 x 250 ml, 10 min) und CH&sub2;Cl&sub2; (1 x 250 ml) gewaschen. Die Prozedur wurde wiederholt und das Harz wurde dann mit Methanol (MeOH; 2 x 250 ml), CH&sub2;Cl&sub2; (1 x 250 ml) und Dimethylformamid (DMF; 4 x 250 ml) gewaschen. Eine Lösung von Boc- Cys(Dmb)-OH (13,27 g, 38,9 mmol) in DMF (200 ml) wurde zugegeben und für 5 min geschüttelt. Zu der Aufschlämmung wurde dann eine Lösung von Benzotriazol-1-yloxytris(dimethylaminos)phosphoniumhexafluorophosphat (BOP; 17,20 g, 38,9 mmol) in DMF (50 ml) gegeben, sofort gefolgt von einer Zugabe von DIEA (20,32 ml, 116,6 mmol) und weiterem Schütteln für 150 Minuten. Ein Aliquot des Harzes wurde entfernt (100 mg) und mit Hilfe des Gisin-Tests analysiert (Anal. Chim. Acta 58, 248-249 [1972]). Die Substitution belief sich auf 0,23 meq/g-Harz. Das gesamte Harz wurde filtriert, mit DMF (2 x 250 ml) und CH&sub2;Cl&sub2; (2 x 250 ml) gewaschen und mit Boc-Cys(Dmb) (13,27 g, 38,9 mmol) und 1,3-Dicyclohexylcarbodiimid (DCC; 8,02 g, 38,2 mmol) in CH&sub2;Cl&sub2; für 24 Stunden wieder gekoppelt. Der Gisin-Test wurde wiederholt mit einem 100 mg Harzaliquot und die Beladung wurde mit 3,36 mmol/g-Harz bestimmt. Das Harz wurde in 150 ml Pyridin und 150 ml Essigsäureanhydrid suspendiert, für 1 Stunde geschüttelt, filtriert und mit CH&sub2;Cl&sub2; (2 x 250 ml), MeOH (2 x 250 ml) und CH&sub2;Cl&sub2; (2 x 250 ml) gewaschen und im Vakuum getrocknet.

Herstellung von Boc-Aca-Cys(Dmb)-benzhydrylaminharz, 2.

Boc-Cys(Dmb)-benzhydrylaminharz, 1. (20 g, 7.2 mmol) wurde mit CH&sub2;Cl&sub2; gewaschen, mit 250 ml 50% TFA-CH&sub2;Cl&sub2; für 1 min von den Schutzgruppen befreit, mit CH&sub2;Cl&sub2; (250 ml) gewaschen und wiederum mit 250 ml 50% TFA-CH&sub2;Cl&sub2; für 20 min von den Schutzgruppen befreit. Das Harz wurde dann mit CH&sub2;Cl&sub2; (3 x 250 ml), MeOH (2 x 250 ml) und CH&sub2;Cl&sub2; (2 x 250 ml) gewaschen. Neutralisation wurde durch Waschen mit 10% DIEA- CH&sub2;Cl&sub2; (2 x 250 ml) für je 5 min, CH&sub2;Cl&sub2; (2 x 250 ml), MeOH (2 x 250 ml) und CH&sub2;Cl&sub2; (4 x 250 ml) erreicht. Eine Lösung von Boc-aminocapronsäure (Boc- Aca-OH) (0,66 g, 2,88 mmol, 0,40 eq) in CH&sub2;Cl&sub2; (250 ml) wurde dann zugegeben und die Reaktionsmischung für 5 Minuten geschüttelt. Dicyclohexylcarbodiimid (0,59 g, 2,88 mmol, 0,40 eq) wurde zugegeben und die Mischung für 2 Stunden geschüttelt. Die Mischung wurde filtriert und mit CH&sub2;Cl&sub2; (2 x 100 ml), MeOH (2 x 100 ml) und CH&sub2;Cl&sub2; (2 x 100 ml) gewaschen. Ein Harzaliquot (50,3 mg) wurde hydrolysiert (6 M Salzsäure/Propionsäure, 110ºC, 24 Stunden) und die Aminosäureanalyse zeigte eine Substitution von 0,08 mmol von Aca pro Gramm-Harz. Das Harz wurde wie Verbindung 1 mit Ac&sub2;0 "gecappt".

Herstellung von (Lys&sub7;-Aca-Cys(Dmb)-benzhydrylaminharz, 3.

Boc-Aca-Cys(Dmb)-benzhydrylaminharz, 2, (20 g, 0,08 meq/g, 1,6 mmol) wurde den Waschungen, der Freisetzung von Schutzgruppen und der Neutralisationsprozedur wie für Verbindung 1 spezifiziert unterworfen. Boc-Lys(Boc)-OH (1,99 g, 5,76 mmol, 3,6 eq) wurde in CH&sub2;Cl&sub2; (250 ml) aufgelöst, zu dem H-Aca-Cys(Dmb)-BHA-Harz, 2 gegeben und einem Zyklus Festphasensynthese (2 Stunden) unter Verwendung von DCC (1,18 g, 5,76 mmol, 3,6 eq) als Kondensationsreagenz unterworfen. Ein Aliquot Boc- Lys(Boc)-Aca-Cys(Dmb)-BHA-Harz, 3 a, (100 mg) wurde hydrolysiert und zeigte eine Substitution von 0,056 meq Lys/g Harz an. Die Festphasenpeptidsynthese wurde unter Verwendung von Boc-Lys(Boc)-OH (3,98 g, 11,52 mmol, 3,6 eq) und DCC (2,36 g, 11,52 mmol, 3,6 eq) mittels der obigen Prozedur fortgesetzt. Die Aminosäureanalyse des Peptidharzes zeigte eine Beladung von 0,15 meq Lys/g (Lys)&sub3;-Aca-Cys(Dmb)-Bha-Harz, 3b an. Die Synthese wurde fortgesetzt unter Verwendung von Boc-Lys(Boc)-OH (7,96 g, 23,04 mmol, 3,6 eq) und DCC (4,75 g, 23,04 mmol, 3,6 eq) gemäss der obigen Prozedur. Ein Aliquot des Peptidharzes wurde hydrolysiert und die Aminosäurezusammensetzung zeigte eine 0,20 meq Lysig Substitution des (Lys)&sub7;-Aca-Cys(Dmb)-BHA-Harzes, 3c, an. Das Peptidharz wurde im Vakuum getrocknet. Endgewicht = 20.1 g.

Herstellung von [(Asn-Ala-Asn-Pro)&sub3;]&sub8;-Lys&sub7;-Aca-Cys-(NH&sub9;), 4.

Ein Teil (5,0 g, 0,20 meq Lys/g, 1,0 meq Lys, 0,143 mmol Peptid) des (Lys)&sub7;-Aca-Cys(Dmb)-BHA-Harzes, 3c, wurde einem Zyklus der Festphasenpeptidsynthese unter Verwendung des geschützten Tetrapeptids Boc-Asn-Ala-Asn-Pro-OH (1,28 g, 2,5 mmol, 2,5 eq) und des BOP Reagenzes (1,1 g, 2,5 mmol, 2,5 eq) in DMF (250 ml enthaltend 0,5% DIEA) unterworfen. Nach 18 Stunden zeigte der Ninhydrintest an, dass die Reaktion vollständig war. Ein Aliquot des Peptidharzes wurde hydrolysiert (6 N HCl, 150ºC, 2 Stunden) und ergab die erwartete Aminosäurezusammensetzung: Asp, 15,90 (16); Pro, 6,99 (8); Ala, 8,50 (8); Lys, 7,00 (7). Das Harz wurde mit TFA von den Schutzgruppen befreit und die obige Prozedur wurde in einem zweiten Zyklus unter Verwendung von Boc-Asn-Ala-Asn-Pro-OH (Einzelkupplung) wiederholt, dann wurde das Harz hydrolysiert und die Aminosäurezusammensetzung zeigte den erwarteten Einbau: Asp, 32,42 (32); Pro, 15,07 (16); Ala 16,92 (16); Lys, 7,26 (7). Nach der Freisetzung der Schutzgruppen mit TFA wurde eine letzte Kupplung wie oben mit Boc-Asn-Ala-Asn-Pro-OH durchgeführt, die 6,3 g [(Boc-Asn-Ala-Asn-Pro)&sub3;]&sub8;-Lys&sub7;-Aca-Cys-BHA-Harz ergab. Die Hydrolyse eines Aliquots (wie oben) ergab: Asp, 48,00 (48); Pro, 20,32 (24); Ala, 24,96 2) (24); Lys, 7,26 (7). Ein Teil dieses Materials (6 g) wurde mit wasserfreier Fluorwasserstoffsäure (HF; 60 ml enthaltend 10% 1-Propanthiol) bei 0ºC für zwei Stunden gespalten. Die HF wurde bei 0ºC abgedampft (grosses Vakuum, CaO-Falle) und das Rohpeptid und die Harzmischung mit EtOAc verrieben, mit wasserfreiem TFA (3 x 50 ml) extrahiert, abgedampft, mit wasserfreiem Ether vermischt und getrocknet, um 1,3 g des Rohpeptids zu ergeben.
Das Rohpeptid (1,3 g) wurde gelöst (40 ml 0,025% TFA/H&sub2;O), filtriert (0,45 µ Millex-HV Filter) und auf eine Nucleosil C-18 Säule (1 x 50 cm) aufgetragen. Die Säule wurde mit einem Lösungssystem bestehend aus A: H&sub2;0 (enthaltend 0,025% TFA) und B: CH&sub3;CN (enthaltend 0,025% TFA) mit einem linearen Gradientenmodus von 10% (B) zu 25% (B) in 2 h eluiert (7 ml/min). Die Fraktionen wurden gesammelt (7 ml) und Aliquots mittels analytischer HPLC analysiert (Säule: Lichrosorb RP-8 (5µ); Elutionsmittel: (A) 0,1 M HClO&sub4; (pH 2.5) (B) CH&sub3;CN; Gradient: 15% B bis 55% B in 20 min; Fliessgeschwindigkeit: 1 ml/min; Retentionszeit: 9,1 min). Das Produkt war in Fraktionen enthalten (10-18), die zusammengegeben, eingedampft und lyophilisiert wurden, um remes [(NANP)&sub3;]&sub8;-K&sub7;-Aca-Cys-NH&sub2;, 4, zu ergeben. Ausbeute: 1,06 g (67,3%). Es wurde mittels analytischer HPLC gezeigt, dass die Verbindung homogen war und die erwartete Aminosäurezusammensetzung nach Säurehydrolyse ergab (6 N HCl; 150ºC; 1 Stunde): Asp, 45,5 (48); Pro, 23,8 (24); Ala, 23,6 (24); Lys, 7,0 (7); Cys, 1,12 (Ellman Test; siehe Ellman, Arch. Biochem. Biophys. 82, 70-77 [1959]). Weitere Bestätigungen für die Struktur lieferten die Mikrosequenzanalyse und die FAB Massenspektroskopie: Berechnet (M+2H)²: 10,644,5; Gefünden 10,642.

Herstellung von [Ala³&sup8;&sup4;,³&sup8;&sup9;]-P.falciparum CS(378-398)-NH&sub2;, 5a.

Boc-Ser(Dmb)-BHA-Harz (3,4 g, 0,35 meq/g-Harz, 1,19 mmol) wurde in ein 100 ml Reaktionsgefäss gegeben, das auf einen manuellen Schüttler gesteckt war und die Peptidsynthese wurde für insgesamt 4 Zyklen durchgeführt, um P. falciparum CS(394-398)-BHA-Harz (3,5 g) zu ergeben. Ein 1,5 g (0,5 mmol) Anteil wurde entfernt und einem zusätzlichen Zyklus einer Festphasensynthese unter Verwendung des Applied Biosystems 430A Synthesizer unterworfen um 2,2 g des geschützten [Ala³&sup8;&sup4;,³&sup8;&sup9;]-P.falciparum CS(378-398)-BHA-Harzes zu ergeben. Eine 0,4 g Portion des geschützten Peptidharzes wurde mit wasserfreier HF gespalten (wie Verbindung 4) und 0,226 g des rohen [Ala³&sup8;&sup4;,³&sup8;&sup9;]-P.falciparum CS(378-398)-NH&sub2; wurden erhalten. Das Rohmaterial wurde in 10 ml H&sub2;0 aufgelöst, gefiltert (0,45 µ Typ HA Millipore Filter) und auf eine Waters C-18 Säule (1,9 x 30 cm) erhältlich von Waters Associates, Milford, Massachusetts, USA, geladen. Die Säule wurde mit einem Lösungsmittelsystem bestehend aus (A) Wasser (enthaltend 0,025% TFA) und (B) CH&sub3;CN (enthaltend 0,025% TFA) mit einem linearen Gradientenmodus von 10% (B) -35% (B) in 120 Minuten eluiert. Die Fraktionen wurden gesammelt Qede Minute) und Aliquots mittels analytischer HPLC analysiert (Säule: Lichrosorb RP-8 (10 µ); Elutionsmittel: (A) 0,1 M HClO&sub4; (pH 2,5) (B) CH&sub3;CN; Gradient: 20% B zu 40% B in 20 min; Fliessgeschwindigkeit: 1,5 ml/min; Retentionszeit: 16 Minuten). Das Produkt zeigte sich in den Fraktionen 68 und 69, die zusammengegeben, eingedampft und lyophilisiert wurden, um 10 mg (3,7% Ausbeute) an reinem [Ala³&sup8;&sup4;,³&sup8;&sup9;]-P. falciparum CS(378-398)-NH&sub2;, 5a, zu ergeben, dass die amidierte Form des CS.T3 Peptides darstellt. Es wurde mittels analytischer HPLC gezeigt, dass die Verbindung homogen war und die erwartete Aminosäurezusammensetzung nach Säurehydrolyse ergab (6 N HCl; 150ºC; 24 Stunden): Asp, 2,83 (3); Ser, 2,79 (3); Met, 0,90 (1); Glu, 1,89 (2); Ala, 2,00 (2); (6 N HCl; 110ºC; 72 Stunden): Val, 2,89(3); Ile, 1,87 (2); Phe, 0,97 (1); Lys, 4,14 (4). Die weitere Bestätigung der Struktur erfolgte mittels FAB Massenspektroskopie. Berechnet (M+H)+: 2337,7, Gefünden 2338,0.

Herstellung von Ac-Cys-Aca[Ala³&sup8;&sup4;,³&sup8;&sup9;]-P. falciparum CS(378-398)-NH&sub2;, 5b.

Ein 0,8 g Anteil (0,182 mmol) des geschützten [Ala³&sup8;&sup4;,³&sup8;&sup9;]-P.falciparum CS(378-398)-BHA-Harzes (siehe oben) wurde 2 Zyklen einer Festphasensynthese unterzogen und acetyliert (50% Ac&sub2;0/Pyridin; 30 ml; 1 Stunde) um das geschützte Ac-Cys-Aca[Ala³&sup8;&sup4;,³&sup8;&sup9;]-P.falciparum CS(378-398)-BHA-Harz (600 mg) zu ergeben. Behandlung mit wasserfreiem HF (wie für Verbindung 4) ergab 360 mg Rohprodukt, das in Wasser aufgelöst, filtriert (wie in Beispiel 5a) und auf eine µ-Bondpak C-18 Säule (1,9 x 30 cm) aufgegeben wurde. Die Säule wurde mit einem Lösungssystem bestehend aus A: H&sub2;0 (enthaltend 0,025% TFA) und B: CH&sub3;CN (enthaltend 0,025% TFA) mit einem linearen Gradientenmodus von 20% (B) zu 40% (B) innerhalb von 90 Minuten eluiert (10 ml/min). Die Fraktionen wurden gesammelt (jede Minute) und die Aliquots mittels analytischer HPLC analysiert (Säule: Lichrosorb RP-8 (5µ); Elutionsmittel: (A) 0,1 M HClO&sub4; (pH 2.5) (B) CH&sub3;CN; Gradient: 30% B bis 55% B in 20 min; Fliessgeschwindigkeit: 1 ml/min; Retentionszeit: 10 min.). Das Produkt zeigte sich in den Fraktionen 33-35, die zusammengegeben, eingedampft und lyophilisiert wurden. Ausbeute: 19 mg (3.4% Ausbeute). Es wurde mittels analytischer HPLC gezeigt, dass das gereinigte Ac-Cys-Aca[Ala³&sup8;&sup4;,³&sup8;&sup9;]-P.falciparum CS(378-398)-NH&sub2;, 5b, homogen war und die erwartete Aminosäurezusammensetzung nach Säurehydrolyse ergab (6 N HCl; 150ºC; 24 Stunden): Asp, 2,87 (3); Ser, 2,77 (3); Glu, 1,98 (2); Ala, 2,00 (2); Val, 2,05 (2); Ile, 1,69 (2); Met, 0,99 (1); Phe, 1,00 (1); Lys, 4,07 (4); Cys, 0,86 (Ellman Test). Die weitere Bestätigung der Struktur erfolgte mittels FAB Massenspektroskopie. Berechnet (M+H)+: 2596,2, Gefünden 2595,8.

Die Synthese von [(NANP)&sub3;]&sub8;K&sub7;Aca-Cys-NH&sub2;Ac-Cys-Aca[Ala³&sup8;&sup4;,³&sup8;&sup9;]- P.falciparum CS(378-398)-NH&sub2;. 6.

Ac-Cys-Aca[Ala³&sup8;&sup4;,³&sup8;&sup9;]-P.falciparum CS(378-398)-NH&sub2;, 5b, (2,5 mg; 0,82 µmol, 2 eq) und [(NANP)&sub3;]&sub8;K&sub7;Aca-Cys-NH&sub2;, 4, (4,74 mg; 0,41 µmol; 1 eq) wurden in 1,8 ml destilliertem Wasser gelöst, gefolgt von der Zugabe von 7,6 ml 0,2 M NH&sub4;HCO&sub3; (pH 7,8). Die Reaktionsmischung wurde bei Raumtemperatur für 24 Stunden stehengelassen und lyophilisiert. Der Rückstand wurde in 2 ml 0,025% TFA/H&sub2;0 aufgelöst, flitriert und auf eine Nucleosil C-18 Säule (0,4 x 25 cm) gegeben. Die Säule wurde mit einem Lösungsmittelsystem bestehend aus (A) Wasser (enthaltend 0,025% TFA) und (B) CH&sub3;CN (enthaltend 0,025% TFA) mit einem linearen Gradientenmodus von 10% (B) zu 40% (B) innerhalb von 120 Minuten eluiert (1,5 Minute). Die Fraktionen wurden gesammelt (jede Minute) und Aliquots wurden mittels HPLC analysiert (Säule: RP-8 (5µ); Elutionsmittel (A) 0,1 M HClO&sub4; (pH 2,5) (B) CH&sub3;CN; Gradient: 10% B zu 55% B in 30 Minuten; Fliessgeschwindigkeit: 1 ml/Minute; Retentionszeit: 21 Minuten). Das Produkt zeigte sich in den Fraktionen 42 - 45, die zusammengegeben, eingedampft und lyophilisiert wurden, um 1,5 mg (25% Ausbeute) an Produkt, 6, zu ergeben. Es wurde mittels analytischer HPLC gezeigt, dass die Verbindung homogen war und die erwartete Aminosäurezusammensetzung nach Säurehydrolyse ergab (6 N HCl; 110ºC; 24 Stunden): Asp, 52,0 (51); Ser, 3,4 (3); Glu, 2,5 (2); Ala, 24,7 (26); Val, 2,5 (3); Met, 1,0 (1); Ile, 2,2 (2); Phe, 1,1 (1); Lys, 11,5 (11).

Herstellung von [Ala³&sup8;&sup4;,³&sup8;&sup9;]-P.falciparum CS(380-396)-NH&sub2;. 7a.

Boc-Val-benzhydrylamin-Harz (1,5 g, 0,2 meq/g; 0,3 mmol) wurden 16 Zyklen einer Festphasenpeptidsynthese unter Verwendung des Applied Biosystems 430A Synthesizer unterworfen, um 2,1 g an geschütztem [Ala³&sup8;&sup4;,³&sup8;&sup9;]-P.falciparum CS(380-396)-BHA-Harz zu ergeben. Ein 0,4 g Anteil des geschützten Peptidharzes wurden mit wasserfreiem HF gespalten (wie Verbindung 4) und 121 mg des rohen [Ala³&sup8;&sup4;,³&sup8;&sup9;]- P.falciparum CS(380-396)-NH&sub2; wurden erhalten. Ein Teil des Rohproduktes (60 mg) wurde in 0,025% TFA/H&sub2;0 gelöst, filtriert und auf eine Nucleosil C- 18 Säule (1,0 x 50 cm) gegeben. Die Säule wurde mit einem Lösungsmittelsystem bestehend aus (A) Wasser (enthaltend 0,025% TFA) und (B) CH&sub3;CN (enthaltend 0,025% TFA) mit einem linearen Gradientenmodus von 15% (B) zu 35% (B) innerhalb von 180 Minuten eluiert (2,5 ml/Minute). Die Fraktionen wurden gesammelt (jede Minute) und Aliquots wurden mittels HPLC analysiert (Säule: Lichrosorb RP-8 (5µ); Elutionsmittel (A) 0,1 M HClO&sub4; (pH 2,5) (B) CH&sub3;CN; Gradient: 30% B zu 55% B in 20 Minuten; Fliessgeschwindigkeit: 1 ml/Minute; Retentionszeit: 8.0 Minuten). Das Produkt zeigte sich in den Fraktionen 34-36, die zusammengegeben, eingedampft und lyophilisiert wurden, um 14 mg (20% Ausbeute) an [Ala³&sup8;&sup4;,³&sup8;&sup9;]-P.falciparum CS(380-396)-NH&sub2;, 7a, zu ergeben. Es wurde mittels analytischer HPLC gezeigt, dass das Produkt homogen war und die erwartete Aminosäurezusammensetzung nach Säurehydrolyse ergab (6 N HCl; 150ºC; 1 Stunden): Asp, 0,95 (1); Ser, 1,88 (2); Glu, 2,00 (2); Ala, 2,00 (2); Met, 0,93 (1); (6 N HCl; 1100; 72 Stunden): Val, 2,91 (3); Ile, 0.97 (1); Phe, 1,17 (1); Lys, 4,10 (4). Die weitere Bestätigung der Struktur erfolgte mittels Mikrosequenzanalyse und FAB Massenspektroskopie. Berechnet (M+H)+: 1908,3, Gefünden 1908,0.

Herstellung von Ac-Cys-Aca-[Ala³&sup8;&sup4;,³&sup8;&sup9;]-P.falciparum CS(380-396)-NH&sub2;, 7b.

Boc-Val-Benzhydrylamin-Harz, hergestellt wie Verbindung 1 (20 g; 0,5 mmol/g; 10 mmol) wurde in einen 1 l Reaktionsgefäss gegeben, auf einen Kraft Schüttler gesteckt und eine Festphasensynthese wurde für insgesamt 19 Zyklen durchgeführt um Ac-Cys-Aca-[Ala³&sup8;&sup4;,³&sup8;&sup9;]-P.falciparum CS(380- 396)-BHA-Harz (44,9 g) zu erhalten. Ein Anteil des geschützten Peptidharzes (5 g; 1,11 mmol) wurde mit wasserfreier HF (wie für Verbindung 4) behandelt und 2,21 g des Rohproduktes wurden erhalten. Ein Anteil (1,1 g) des Rohproduktes wurden in 40 ml 0,025% TFA/H&sub2;0 gelst, filtriert und auf eine Nucleosil C-18 Säule (2,2 x 25 cm) gegeben. Die Säule wurde mit einem Lösungssystem bestehend aus A: H&sub2;0 (enthaltend 0,025% TFA) und B: CH&sub3;CN (enthaltend 0,025% TFA) mit einem linearen Gradientenmodus von 10% (B) zu 35% (B) innerhalb von 120 Minuten eluiert (9 ml/min). Die Fraktionen wurden gesammelt (jede Minute) und die Aliquots mittels analytischer HPLC analysiert (Säule: Lichrosorb RP-8 (5µ); Elutionsmittel: (A) 0,1 M HClO&sub4; (pH 2.5) (B) CH&sub3;CN; Gradient: 30% B bis 55% B in 20 min; Fliessgeschwindigkeit: 1 ml/min; Retentionszeit: 10 min.). Das Produkt zeigte sich in den Fraktionen 65-72, die zusammengegeben, eingedampft und lyophilisiert wurden, um 144 mg (9,9% Ausbeute) an Produkt zu ergeben. Es wurde mittels analytischer HPLC gezeigt, dass das gereinigte Ac-Cys-Aca-[Ala³&sup8;&sup4;,³&sup8;&sup9;]-P.falciparum CS(380-396)-NH&sub2;, 7b, homogen war und die erwartete Aminosäurezusammensetzung nach Säurehydrolyse ergab (6 N HCI; 150ºC; 1 Stunde): Asp, 1,09 (1); Ser, 1,90 (2); Glu, 1,98 (2); Ala, 2,00 (2); Met, 0,93 (1); Phe, 0,95 (1). (6 N HCI; 110ºC; 72 Stunden): Val, 2,76 (3); fle, 1,04 (1); Lys, 4,35 (4); Cys, 1,10 (Elirnan Test). Die weitere Bestätigung der Struktur erfolgte mittels FAB Massenspektroskopie. Berechnet (M+H)+: 2166,6, Gefunden 2167,0.

Herstellung von Ac-Cys(S-Pyridyl)-Aca[Ala³&sup8;&sup4;,³&sup8;&sup9;]-P.falciparum CS(380- 396-NH&sub2;,8.

2,2'-Dipyridyldisulfid (10,8 mg, 49 µmol, 1,64 eq) wurden in Trifluorethanol (14 ml, enthaltend 4% ACOH) gelöst und unter Rühren zu einer Lösung von Ac-Cys-Aca-[Ala³&sup8;&sup4;,³&sup8;&sup9;]-P.falciparum CS(380-396)-NH&sub2;, 7b, (78 mg, 29,8 mmol, 1 eq) in Trifluorethanol (14 ml, enthaltend 4% ACOH) gegeben. Die Lösung wurde für eine Stunde gerührt, eingedampft und der Rückstand mit wasserfreiem Ether aufgerührt und getrocknet. Ausbeute: 73,3 mg (93,9% Ausbeute). Es wurde mittels analytischer HPLC gezeigt, dass das Produkt im wesentlichen homogen war (Säule: Nucleosil C-18 (5µ); Elutionsmittel: (A) H&sub2;0 (enthaltend 0,025% TFA), (B) CH&sub3;CN (enthaltend 0,025% TFA); Gradient: 15% B bis 40% B in 20 Minuten und konstant bei 40% B für 15 Minuten; Fliessgeschwindigkeit: 1.4 ml/minute; Retentionszeit: 23 Minuten). Die Aminosäureanalyse nach Säurehydrolyse (6N HCl; 1100; 72 Stunden) ergab die erwartete Zusammensetzung: Asp, 1,07; Ser, 2,05; Glu, 2,13; Ala, 2,03; Val, 1,87; Met, 0,94; Ile, 0,92; Phe, 0,92; Lys, 3,94; Aca, 0,98. Der Ellman Test zeigte die Abwesenheit von Cysteinylsulfhydrylgruppen. Das ¹H-NMR (DMSO-d&sub6;) war kompatibel mit der Struktur und zeigte die Anwesenheit einer Pyridyleinheit: δ 7,22 (1H, d), 8 7,32 (2H, m) und 8 7,83 (1H, m). U.V. λ max (50% TFE/H&sub2;0) 280 nm (&epsi; 3780).
Die Synthese von [(Asn-Ala-Asn-Pro)&sub3;]&sub8;Lys&sub7;-Aca-C7s-NH&sub2;Ac-Cys- Aca[Ala³&sup8;&sup4;,³&sup8;&sup9;]-P.falciparum CS(378-396)-NH&sub2;,9.
Ac-Cys(S-pyridyl)-Aca[Ala&sub3;&sub8;&sub4;,&sub3;&sub8;&sub9;]-P.falciparum CS(380-396)-NH&sub2;, 8, (53,4 mg, 20.4 µmol, 2,35 eq) wurde in Trifluorethanol (4,8 ml) gelöst und 0,2 M NH&sub4;HCO&sub3; (12 ml, pH 8,7) zugegeben. Unter Rühren wurde [(Asn-Ma- Asn-Pro)&sub3;]&sub8;-Lys&sub7;-Aca-Cys-NH&sub2;, 4 (100,4 mg, 8,69 µmol, 1 eq) in destilliertem H&sub2;0 (7,2 ml) zugegeben und die Reaktionsmischung wurde für 2 Stunden bei 25 º gerührt und lyophilisiert. Der Rückstand wurde in 10 ml 0,025% TFA/H&sub2;0 aufgelöst, filtriert und auf eine Nucleosil C-18 Säule gegeben (2,2 x 25 cm). Die Säule wurde mit einem Lösungssystem bestehend aus A: H&sub2;0 (enthaltend 0,025% TFA) und B: CH&sub3;CN (enthaltend 0,025% TFA) mit einem linearen Gradientenmodus von 10% (B) zu 40% (B) innerhalb von 100 Minuten eluiert (9 ml/min). Die Fraktionen wurden gesammelt (jede Minute) und die Aliquots mittels analytischer HPLC analysiert (Säule: Lichrosorb RP-8 (5µ); Elutionsmittel: (A) 0,1 M HClO&sub4; (pH 2.5) (B) CH&sub3;CN; Gradient: 10% B bis 55% B in 30 min. Fliessgeschwindigkeit: 1 ml/min; Retentionszeit: 19,7 Minuten.). Das Produkt, zeigte sich in den Fraktionen 36-44, die zusammengegeben, eingedampft und lyophilisiert wurden, um 92 mg (74,5% Ausbeute) an Produkt zu ergeben. Es wurde mittels analytischer HPLC gezeigt, dass das Produkt homogen war und die erwartete Aminosäurezusammensetzung nach Säurehydrolyse ergab (6 N HCl; 110ºC; 72 Stunden): Asp, 51,30 (49); Ser, 1,99(2); Glu, 2,07 (2); Pro, 25,13 (24); Ala, 26,00 (26); Val, 2,40 (3); Met, 0,96 (1); Ile, 1,04 (1); Phe, 1,03 (1); Lys, 11,35 (11). Der Ellman-Test bestätigte die Abwesenheit von Cystein-SH-Gruppen. Zusätzlich ergab die Behandlung unter reduzierenden Bedingungen mit Dithiothreitol die Ausgangsverbindungen Ac-Cys-Aca[Ala³&sup8;&sup4;,³&sup8;&sup9;]- P.falciparum CS(380-396)-NH&sub2;, 7b und [(Asn-Ala-Asn-Pro&sub3;]&sub8;-Lys&sub7;-Aca-Cys- NH&sub2;, 4, was durch analytische HPLC bestätigt wurde.

Antikörperantwort in Mäusen. die mit (MAP NANP)-CS.T3 immunisiert waren

BALB/c Mäuse (fünf pro Gruppe) wurden intraperitoneal mit 40 µg (NANP)&sub3;-CS.T3 ( ) oder der Verbindung 6, die die amidierte Form des Polypeptids umfasste, das die Aminosäuresequenz XIII (CS.T3 Peptid) aufweist, und kovalent mit dem MAPS B-Zell Epitop [(NANP)&sub3;]&sub8;-Lys&sub7;-Aca- Cys-NH&sub2; ( ) verknüpft ist, in komplettem Freunschen Adjuvans immunisiert. Eine Verstärkungsinjektion (40 µg des Immunogens in CFA) wurde 4 Wochen später gegeben. Plasma wurde wie in der Abbildung gezeigt abgenommen, mittels des "enzyme-linked immunoadsorbent assay" auf die Anwesenheit von anti-(NANP)&sub5;&sub0; Antikörpern (Fig. 5) und mittels Immunofluoreszenz auf Antikörper gegen Sporozoiten (Fig. 6) mittels Standardmethoden getestet. Die Titer der Antiseren, die durch Verbindung 6 hervorgerufen wurden, waren viermal höher als die, die durch (NANP)&sub3;- CS.T3 hervorgerufen wurden, wie durch Messung der indirekten Immunofluoreszenz an fixierten Sporozoiten festgestellt wurde, was zeigte, dass die Kombination von Polypeptiden, die ein universelles T-Zell Epitop mit dem oben erwähnten MAPS B-Zell Epitop darstellen zu einer stärkeren Immunantwort führte als im Fall eines B-Zell Epitops mit dem linearen Peptid (NANP)&sub3;.

Claims

1. Die Verwendung eines Polypeptides, das die Aminosäuresequenz

R¹-Glu-Lys-Lys-Ile-Ala-Lys-Met-Glu- Lys-Ala-Ser-Ser-Val-Phe-Asn-Val-R²,

wobei R¹ H-Asp-Ile, H-Ile- oder H- und R² -Val-Asn-Ser-OH, -Val-Asn-OH, -Val-OH oder OH ist,

umfasst oder eines davon abgeleiteten Derivates, als universell erkennbares T-Zell-Epitop bei Anwesenheit eines B-Zell-Epitops zur Herstellung einer immunogenen Zusammensetzung zur Auslösung einer dauerhaften immunogenen Antwort in einem Wirtsorganismus.

2. Die Verwendung eines Polypeptides mit der in Anspruch 1 definierten Aminosäuresequenz gemäss Anspruch 1.

3. Die Verwendung eines Polypeptides wie in Anspruch 1 oder 2 definiert, wobei R¹ H-Asp-Ile- und R² -OH ist.

4. Die Verwendung eines Polypeptides wie in Anspruch 1 oder 2 definiert, wobei R¹ H-Asp-Ile- und R² -Val-OH ist.

5. Die Verwendung eines Polypeptides wie in Anspruch 1 oder 2 definiert, wobei R¹ H-Asp-Ile und R² -Val-Asn-OH ist.

6. Die Verwendung eines Polypeptides wie in Anspruch 1 oder 2 definiert, wobei R¹ H-Ile- und R² -OH ist.

7. Die Verwendung eines Polypeptides wie in Anspruch 1 oder 2 definiert, wobei R¹ H-Ile- und R² -Val-OH ist.

8. Die Verwendung eines Polypeptides wie in Anspruch 1 oder 2 definiert, wobei R¹ H-Ile- und R² -Val-Asn-OH ist.

9. Die Verwendung eines Polypeptides wie in Anspruch 1 oder 2 definiert, wobei R¹ H-Ile- und R² -Val-Asn-Ser-OH ist.

10. Die Verwendung eines Polypeptides wie in Anspruch 1 oder 2 definiert, wobei R¹ H- und R² -OH ist.

11. Die Verwendung eines Polypeptides wie in Anspruch 1 oder 2 definiert, wobei R¹ H- und R² -Val-OH ist.

12. Die Verwendung eines Polypeptides wie in Anspruch 1 oder 2 definiert, wobei R¹ H- und R² -Val-Asn-OH ist.

13. Die Verwendung eines Polypeptides wie in Anspruch 1 oder 2 definiert, wobei R¹ H- und R² -Val-Asn-Ser-OH ist.

14. Die Verwendung eines Polypeptides wie in Anspruch 1 oder 2 definiert, wobei R¹ H-Asp-Ile- und R² -Val-Asn-Ser-OH ist.

15. Ein Polypeptid wie in einem der Ansprüche 1 bis 13 definiert, wobei falls R¹ H-Asp-Ile ist, R² nicht -Val-Asn-Ser-OH ist.

16. Ein Polypeptid wie in Andpruch 15 definiert, das mit einer antigenen Struktur assoziiert ist, das ein B-Zell-Epitop darstellt.

17. Ein Polypeptid gemäss Anspruch 16, wobei die antigene Struktur, die ein B-Zell-Epitop darstellt, ein multiples antigenes Peptid ist.

18. Ein Polypeptid gemäss Anspruch 17, wobei das multiple antigene Peptid Multimere der Repeatsequenz NANP umfasst, die in dem CS Protein von Plasmodium falciparum vorliegen.

19. Ein Polypeptid, das

ist.

20. Einpolypeptid gemäß Anspruch 18, das

ist.

21. Ein Polypeptid gemäss einem der Ansprüche 15 bis 20 als universelles T-Zell-Epitop.

22. Ein Verfahren zur Herstellung eines Polypeptides gemäss einem der Ansprüche 15 bis 21, dadurch gekennzeichnet, dass konventionelle Peptidsynthesemethoden verwendet werden.

23. Ein Verfahren wie in Anspruch 22 beansprucht, dadurch gekennzeichnet, dass Festphasenmethoden verwendet werden.

24. Eine immunogene Zusammensetzung, dass ein Polypeptid gemäss einem der Ansprüche 15 bis 20 und ein Polypeptid, dass eine antigene Struktur hat, die ein B-Zell-Epitop darstellt, umfasst.