DE68907045T2

DE68907045T2 - Synthetische Peptide und deren Verwendung als allgemeine Träger für die Herstellung von immunogenischen Konjugaten, die für die Entwicklung von synthetischen Impfstoffen geeignet sind.

Info

Publication number: DE68907045T2
Application number: DE89203318T
Authority: DE
Inventors: Elisabetta Bianchi; Giampietro Corradin; Antonello Pessi; Antonio Silvio Verdini
Original assignee: Eniricerche SpA
Current assignee: Eni Tecnologie SpA
Priority date: 1989-01-17
Filing date: 1989-12-27
Publication date: 1993-12-02
Anticipated expiration: 2009-12-28
Also published as: EP0378881A1; ES2055785T3; JPH02221295A; EP0378881B1; DE68907045D1; CA2006700A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft synthetische Peptide, deren Verwendung als universelle Träger für die Herstellung immunogener Konjugate und die Verwendung dieser Konjugate bei der Entwicklung von synthetischen Vakzinen, die zum Induzieren einer protektiven Immunität gegenüber verschiedenen Krankheitserregern befähigt sind, und welche Konjugate nicht oder nur geringfügig genetisch beschränkt sind.
Der Ausdruck "Hapten" bezeichnet ein (antigenes) Molekül, welches befähigt ist, sich an spezifische Antikörper zu binden, welches aber nicht befähigt ist, die Bildung solcher Antikörper zu induzieren, oder welches befähigt ist, die Bildung solcher Antikörper nur bis zu einer geringen (nicht immunogenen) Antikörperzahl zu induzieren. Spezifisch umfassen Haptene Peptid- oder Polysaccharidmoleküle (Thymus-unabhängige Antigene), welche aus Krankheitserregern isoliert und rein dargestellt worden sind, oder kurze Peptide mit einer Sequenz, welche jener von einem oder mehreren B-Epitopen eines natürlichen Antigens entspricht, und welche durch chemische Synthese oder über rekombinante DNA erhalten worden ist.
Der Ausdruck "Antigen" bezeichnet ein (antigenes) Molekül, welches befähigt ist, die Bildung von spezifischen (immunogenen) Antikörpern zu induzieren und mit denselben zu reagieren.
Antigene umfassen natürliche Mikroorganismen, Zellen und deren lösliche Produkte.
Die Immunisierung gegen eine durch Krankheitserreger (Viren, Parasiten und Bakterien) verursachte Infektion wird generell dadurch erzielt, daß man ein Individuum mit einer ein natürliches Antigen (i) oder Antigene (abgeschwächte oder abgetötete Mikroorganismen oder deren in geeigneter Weise behandelte Produkte) enthaltenden Vakzine impft, welche die Produktion von Anikörpern stimuliert, welche Antikörper befähigt sind, das Antigen als solches zu neutralisieren. Die Verwendung solcher herkömmlicher Vakzinen hat jedoch zahlreiche Nachteile, welche sich sowohl aus der begrenzten Verfügbarkeit des natürlichen antigenen Materials als auch aus der Gefahr einer möglichen Infektion während der Handhabung des pathogenen Materials ableiten.
Außerdem erfordern diese Vakzinen Herstellungs- und Lagerungsbedingungen (bei neidrigen Temperaturen), welche ein enormes Problem, insbesondere in unterentwickelten Ländern, darstellen könne.
Aus allen diesen Gründen besteht gegenwärtig ein zunehmendes Interesse an der Entwicklung von synthetischen Vakzinen, welche nicht das ganze Pathogen oder dessen Produkte enthalten, sondern welche statt dessen kurze Peptidfragmente enthalten, welche Abschnitte des natürlichen Antigens reproduzieren, welche als Epitope oder Determinanten oder antigene Stellen bekannt sind.
Die Herstellung einer solchen Vakzine erfordert daher die Identifizierung und die Auswahl der zu verwendenden Peptide. Es ist bekannt, daß eine Immunantwort gegenüber einem Erreger bzw. einer Fremdsubstanz durch einen Organismus durch die Zusammenarbeit von verschiedenen Typen von Zellen zustandekommt, nämlich durch die das Antigen darbietenden Zellen (APC), durch die B-Lymphozyten (Antikörper-Pruduzenten, welche befähigt sind, als APC zu fungieren), durch T-Helferzellen (oder Th)-Lymphozyten und durch T-zytotoxische Lymphozyten, welche für das direkte Abtöten der mit dem Pathogen infizierten Zellen verantwortlich sind.
Die Immunität kann eine humorale (durch die von den B-Zellen produzierten Antikörper vermittelte) oder eine zellvermittelte sein.
Was die humorale Immunität anbelangt, so besteht das Mindesterfordernis für das Auslösen einer wirksamen Immunantwort darin, daß die in dem Organismus zirkulierenden B-Lymphozyten einer antigenen Determinante die Fremdsubstanz (das B-Epitop) erkennen, und daß die Th-Zellen einer Determinante, welche generell von B verschieden ist, die Substanz (das T-Epitop) erkennen.
Demzufolge müssen in der synthetischen Vakzine zwei Peptidsequenzen als Mindesterfordernis für deren Wirksamkeit vorhanden sein, nämlich das B-Epitop und das T-Epitop.
Während die Identifizierung des B-Epitops oder der B-Epitopen, welche in einem natürlichen Antigen enthalten sind, durch die Möglichkeit der Verwendung natürlicher, anti-pathogener Antikörper als Reaktionskomponenten erleichtert wird, bereitet das Lokalisieren der T-Epitope sehr komplizierte Probleme.
Diesbezüglich bedeutet der erste Fall eine direkte Wechselwirkung zwischen dem anti-pathogenen Antikörper und dein Antigen, wohingegen im zweiten Fall die Aktivierung des für ein Epitop des Antigens spezifischen T-Zellklons nur dann stattfindet, nachdem dieses Antigen von einer APC in deren Inneres aufgenommen, durch Proteolyse oder Denaturierung, oder durch beide dieser Vorgänge, zu kurzen Peptidfragmenten verarbeitet und dann wieder nach außen, auf die Oberfläche der APC, gebracht worden ist, und zwar assoziiert mit einem Membranmolekül der Zelle der Klasse II (für die T-Helferzellen), welches Membranmolekül durch ein Gen des Histokompatibilitäts-Hauptkomplexes ("major histocompatibility complex", MHC) codiert wird. Der Th-Lymphozyten-Rezeptor erkennt daher nicht das freie Antigen, sondern den Komplex, der zwischen einem Fragment des Antigens und einem Teil des Klasse-II-MHC-Moleküls gebildet worden ist.
Diese Moleküle werden in drei Familien, DR, DP und DQ, für den Menschen (HLA), und IA und IE für die Maus, eingeteilt, und sie sind äußerst polymorph.
Der Polymorphismus ist auf eine große Anzahl von Allelen für jedes der für dieses Molekül codierenden Gene zurückzuführen.
Diese Verschiedenheit ermöglicht eine große Anzahl von Kombinationen in eine Chromosom (vom Haplotypus).
Es ist daher sehr schwierig, Individuen - welche nicht durch familiäre Beziehungen miteinander verbunden sind -, zu finden, welche einen identischen MHC aufweisen.
Die Tatsache, daß nur einige wenige der aus dem Antigenabbau stammenden Peptide befähigt sind, sich mit einem Wirts-Histokompatibilitätsantigen zu assoziieren, bedeutet, daß der Gen-Satz des Wirtes, welcher für diese Antigene codiert, die Anzahl von Peptiden einschränkt, welche befähigt sind, mit diesen Wirts-Histokompatibilitätsantigenen einen Komplex zu bilden, was jedoch eine wesentliche Bedingung für die Aktivierung der Th-Lymphozyten ist.
Der Ausdruck "genetische Beschränkung" der T-Epitope ist daher in dem Sinne zu verstehen, daß diese Peptidfragmente in ihrer Wechselwirkung mit dem T-Lymphozyten-Rezeptor durch die Proteine, mit welchen sie assoziiert sind, beschränkt sind.
Darauf beruht die Schwierigkeit, innerhalb eines natürlichen Antigens jenes T-Epitop oder jene T-Epitopen mit fehlender oder nur minimaler genetischer Beschränkung zu identifizieren, welche(s) für die Entwicklung synthetischer, azellulärer Vakzinen mit breit gestreuter Wirksamkeit geeignet ist bzw. sind, nämlich welche(s) T-Epitop bzw. T-Epitopen befähigt ist bzw. sind, eine protektive Immunisierung gegen den interessierenden Krankheitserreger in Individuen mit unterschiedlichen MHC-Gen- Sätzen zu induzieren.
Bisher hat man diese Schwierigkeit sehr häufig dadurch überwunden, daß man als Quelle für die T-Epitopen ein auch als Träger bekanntes Makromolekül verwendet hat, an welches ein natürliches oder synthetisches Peptid- oder Polysaccharid-Hapten kovalent gebunden ist, welches aus einem interessierenden Krankheitserreger stammt. Beispiele von für diesen Zweck geeigneten Trägern sind das Tetanus-Toxoid (TT), das Diphtherie-Toxoid (CRM), Serumalbumin und Lampreten-Hämocyanin (KLH), weil sie dem so entstandenen Konjugat nur eine minimale genetische Beschränkung verleihen. Konjugate, welche diese auch als universelle Träger bekannten Träger enthalten, sind befähigt, als T-Zellklonen-Aktivatoren in Individuen zu fungieren, welche sehr unterschiedliche Gen-Sätze aufweisen.
Diesbezüglich sind die meisten Tiere, welche für in-vivo-Tests eingesetzt werden, und welche unterschiedliche Gen-Sätze aufweisen, befähigt, eine Antikörper-Antwort gegen das Konjugat-Antigen zu aktivieren, was bedeutet, daß sie darauf Ansprechende sind. Obwohl sich dieser Weg der versuchten Problemlösung als wirksam erwiesen hat, so hat dennoch die Verwendung von ein Hapten und einen makromolekularen Träger enthaltenden Konjugaten in einem Verfahren der Immunisierung gegen einen Krankheitserreger noch immer zahlreiche Nachteile, und zwar aufgrund der Schwierigkeit, welche darin gelegen ist, die verschiedenen Stufen der Herstellung dieser Konjugate zu standardisieren, sowie wegen der möglichen Änderung der antigenen Eigenschaften des Haptens infolge der Konjugatbildungsreaktion [J.P. Briand et al., J.Immunol.Methods, 78 (1985), 59-69], und schließlich wegen des Phänomens, welches als "durch den Träger induzierte Unterdrückung des Epitops" bekannt ist, und welches Phänomen die Unterdrückung einer Anti-Hapten-Antikörperproduktion in einem Individuum bewirkt, welches bereits nur mit dem Träger immunisiert worden ist [H. Etlinger et al., J.Immunol. 140, (1988), 6261]. Dieses Phänomen wird in jenen Fällen beobachtet, in welchen der verwendete Träger ein Protein ist, demgegenüber der Wirtsorganismus bereits exponiert gewesen ist, wie z.B. gegenüber dem Tetanus-Toxoid, welches für Anti-Tetanus-Impfungen verwendet wird.
Außerdem hat die Verwendung von kurzen Peptidsequenzen als Immunogenen, selbst wenn dieselben sowohl ein B-Epitop als auch ein T-Epitop des natürlichen Antigens enthalten, generell zu einer Immunantwort geführt, welche genetisch viel beschränkter ist, nämlich zu einer Verringerung der Anzahl der darauf ansprechenden Tiere und/oder Individuen [siehe z.B. A.R.Togna et al., J.Immunol., 137 (1986), 2956-2960; G. Del Giudice et al., J.Immunol. 137 (1986), 2952-2965; G. Del Giudice et al., Immunology 63 (1988), 187-191].
Kürzlich haben Fairweather N.F. et al. in der am 21. Jänner 1987 veröffentlichten EP 209281 über das Klonieren des Tetanus- Toxin-Gens und dessen Kennzeichnung aufgrund der Nukleotid- und Aminosäurensequenz der B- und C-Fragmente dieses Proteins berichtet. In dieser europäischen Patentanmeldung ist jedoch die T-Epitop-Sequenz dieses Proteins weder beschrieben noch nahegelegt.
U. Eisel et al. [EMBO J. 5 (1986), 2495-2502] beschreiben die vollständige Sequenz des Tetanus-Toxins und berichten über die Lokalisierung des Promotors des Gens für dieses Toxin.
Die Sequenz der in diesem Protein enthaltenen T-Epitope wird jedoch von Eisel et al. weder beschrieben noch nahegelegt. Fairweather et al. [Infect.Imm., 55 (1987), 2541-2545] wiederum beschreiben die Herstellung - mit rekombinanter DNA - von Fragmenten des Tetanus-Toxins mit einem hohen Molekulargewicht und deren Verwendung bei der Immunisierung von Mäusen gegen Tetanus. In dieser Arbeit wird jedoch über die Lokalisierung der T-Epitopen oder deren Sequenz nichts berichtet.
Das Ziel der vorliegenden Erfindung liegt in der Schaffung universeller Peptidträger für die Verwendung bei der Herstellung immunogener Peptid-Hapten-Konjugate, welche für die Entwicklung synthetischer Vakzinen mit einer sehr umfassenden Wirksamkeit, welche gegen verschiedene Krankheitserreger protektiv sind, geeignet sind. Dieses Ziel wird gemäß der vorliegenden Erfindung dadurch erreicht, daß man innerhalb des Tetanus-Toxins jene T-Epitopen lokalisiert, welche geeignet sind, von zahlreichen Human-T-Zellklonen im Zusammenhang mit einem weiten Bereich von Allelen des Human-Histokompatibilitäts-Hauptkomplexes erkannt zu werden, und welche T-Epitopen durch Synthetisieren von Peptiden hergestellt werden, welche die diesen T-Epitopen bzw. deren Analoga entsprechende Aminosäurensequenz aufweisen. Somit werden durch die vorliegende Erfindung erstens einmal synthetische Peptide zur Verfügung gestellt, welche eine Aminosäurensequenz aufweisen, welche derjenigen von solchen Tetanus-Toxin-T-Epitopen bzw. deren Analoga entspricht, und welche Peptide befähigt sind, von zahlreichen Human-Th-Zellklonen im Zusammenhang mit einem weiten Bereich von Allelen des Human-Histokompatibilitäts-Hauptkomplexes erkannt zu werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch noch die Verwendung dieser synthetischen Peptide als Universalträger bei der Herstellung immunogener Konjugate.
Durch die vorliegende Erfindung werden weiterhin immunogene Konjugate zur Verfügung gestellt, welche aus diesen synthetischen Peptiden bestehen, welche an ein natürliches oder synthetisches Peptid- oder Polysaccharid-Hapten, welches aus einem interessierenden Krankheitserreger stammt, kovalent gebunden sind.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Verwendung dieser immunogenen Konjugate bei der Herstellung synthetischer Vakzinen mit einer umfassenden Wirksamkeit, welche gegen interessierende Krankheitserreger protektiv sind.
Durch die vorliegende Erfindung werden auch synthetische Vakzinen zur Verfügung gestellt, welche zum Immunisieren von Individuen mit unterschiedlichen MHC-Gen-Sätzen gegen durch einen Krankheitserreger verursachte Infektionen dienen, und welche eine immunologisch wirksame Menge der immunogenen Konjugate enthalten.
Weitere Ziele der vorliegenden Erfindung ergeben sich bei der Lektüre der vorliegenden Beschreibung und aus den nachstehenden Beispielen.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wurden die antigenen T-Stellen des Tetanus-Toxoids (TT) unter Verwendung von für TT spezifischen T-Zellklonen lokalisiert, welche aus dem peripheren Blut eines Spenders mit einem DR-3,5-Gen-Satz isoliert worden waren, welcher Spender mit Tetanus-Toxoid immunisiert worden war, wie dies von Lanzavecchia, A., Nature 314, 537 (1985), beschrieben worden ist.
Die Klone wurden durch periodische Restimulation unter Verwendung von bestrahlten mononukleären Zellen aus dem peripheren Blut ("peripheral blood mononucleate cells" (PBMC)), welche Zellen autolog, d.h. aus demselben Spender stammend, waren, plus 1 % Phytohämagglutinin unter Kultur gehalten.
Nach 5 Tagen wurden die T-Blastenzellen gewaschen und in RPMI-c Kulturmedium (RPMI 1640, GIBCO Laboratories, Paisley, Schottland) kultiviert, welches mit 10% inaktiviertem fetalem Kälberserum, 2mM L-Glutamin, 1 mM Natriumpyruvat, 5x10&supmin;&sup5; M 2-Mercaptoethanol und 1% eines 100-fach konzentrierten Gemisches von nicht-essentiellen Aminosäuren (GIBCO), zu welchem 40 Einheiten/ml von rekombinantem Human-Interleukin 2 (Hoffmann- LaRoche) zugesetzt worden waren, ergänzt war. Die Spezifität dieser T-Klone wurde dann durch in-vitro-Proliferationstests untersucht, bei denen als Antigene das Tetanus-Toxin, dessen B-Fragment (B.fr) und C-Fragment (C.fr.), die von der Firma Calbiochem, La Jolla, Ca, USA, erhalten worden waren, und das reduzierte, carboxymethylierte C-Fragment (RCM-C.fr.) verwendet wurden.
Typischerweise wurden die Proliferationstests durchgeführt, indem man die T-Zellklone in den Vertiefungen einer flachbödigen Platte in RPMI-c-Kulturmedium suspendierte, welches verschiedene Konzentrationen dieser Antigene enthielt, und zwar in Gegenwart von immortalisierten oder fixierten, autologen B-Zellen (siehe die oben zitierte Schrift von Lanzavecchia et al.), die den Zweck hatten, die Antigene darzubieten.
Die B-Zellen wurden nach bekannten Verfahren mit dem Epstein Barr Virus (EBV) dadurch immortalisiert, daß man die PBMC-Zellen in RPMI-c-Kulturmedium suspendierte, welches 30% von dem Überstand der das EBV produzierenden B95.8-Zell-Linie enthielt.
Die Zellen wurden nach dein von Shimonkevitz R. et al., J.Immunol. 133, 2067 (1984), beschriebenen Verfahren dadurch fixiert, daß man sie in HankKulturmedium (GIBCO, Paisley, Schottland) suspendierte und während einer halben Minute mit 0,05% Glutaraldehyd fixierte. Die Reaktion wurde durch Zugabe von RPMI blockiert, und die Zellen wurden durch Zentrifugieren rückgewonnen und wiederholt gewaschen.
Die Proliferationsreaktion wurde bei 37ºc während 48 h in 5%igem CO&sub2; durchgeführt, und die Kulturen wurden mit 1 uCi (³H)-Thymidin versetzt. Nach Beendigung der Reaktion wurde die Anzahl der Zellen, welche Radioaktivität enthielten, mit einem Szintillationszähler bestimmt. Die Ergebnisse, welche als Mittelwert für die Zählimpulse je min (cpm) einer Doppelkultur ausgedrückt wurden, zeigten, daß einige Klone dem TT-C-Fragment zugeordnet waren, während andere Klone dem B-Fragment zugeordnet waren.
Gemäß der vorliegenden Erfindung, und um diejenigen T-Epitope in dem TT genauer zu lokalisieren, welche von diesen Klonen erkannt worden waren, wurden in-vitro-Proliferationstests durchgeführt, bei welchen als Antigene verschiedene Fragmente des RCM-C.fr. verwendet wurden, welche durch chemische Modifikation oder proteolytische Verdauung mit Trypsin und Chemotrypsin erzeugt worden waren, wobei die B-Zellen, als APC, mit Glutaraldehyd fixiert waren.
Ebenfalls als Antigene verwendet wurden Peptidfragmente, welche nach bekannten Verfahren, mit Hilfe von rekombinanter DNA, durch Kultivieren von E.coli-Zellen erhalten worden waren, welche Zellen mit einem Hybridplasmid transformiert worden waren, welches die für diese Fragmente codierende Nukleotidsequenz enthielt.
Spezifisch wurden die folgenden rekombinanten Peptide hergestellt:
Tet 6 (TT-Fragment 406-743), Tet 15 (TT-Fragment 604-1315), Tet 3 (TT-Fragment 744-1315), Tet 5 (TT-Fragment 1-405) und Tet 97 (TT-Fragment 1-535).
Die dabei erhaltenen Ergebnisse ermöglichten die Identifizierung der von den Human-T-Zellklonen erkannten Sequenzen (T-Epitope) in den TT-Segmenten 830-843, 830-844 und 1273-1284 von C.fr.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wurde dann das von den Klonen verwendete Beschränkungselement der Klasse II des MHC durch Proliferationstests, unter Verwendung einer HAR-Homozygoten-D3-Zell-Linie als APC,bestimmt. Die dabei erhaltenen Ergebnisse zeigten, daß beide Klone, wenn sie sich in Gegenwart von TT befanden, gut proliferierten, was sie auch in Gegenwart der B KK35-Zell-Linie als APC taten.
Um weiterhin zu bestimmen, welches von den drei Molekülen DR, DP oder DQ der Klasse II des MHC von den obgenannten Klonen als Beschränkungselement verwendet worden war, wurden Proliferationstests durchgeführt, wobei monoklonale Anti-DR-, -DP- oder -DQ-Antikörper (Mabs) zu den Kulturen hinzugefügt wurden.
Auf diese Art uind Weise wurde gefunden, daß nur die Anti-DR-Mabs die Proliferation dieser Klone stark hemmten. Dies zeigte an, daß diese Klone das DR-Antigen der Klasse II des MHC als Beschränkungselement verwendet hatten. Gemäß der vorliegenden Erfindung wurden dann Peptide synthetisiert, welche eine Aminosäurensequenz aufwiesen, welche jener der wie oben beschrieben identifizierten T-Epitope entsprach.
Spezifisch wurden Peptide synthetisiert, welche den TT-Segmenten 1273-1284 bzw. 830-843 bzw. 830-844 mit der folgenden Aminosäurensequenz entsprachen:
Gly-Gln-Ile-Gly-Asn-Asp-Pro-Asn-Arg-Asp-ILe-Leu
(nachstehend als TT=1 bezeichnet)
Gln-Tyr-Ile-Lys-Ala-Asn-Ser-Lys-Phe-Ile-Gly-ILe-Thr-Glu
(nachstehend als TT=2 bezeichnet)
Gln-Tyr-Ile-Lys-Ala-Asn-Ser-Lys-Phe-Ile-Gly-ILe-Thr-Glu-Leu und Analoga des TT=2 waren durch Deletionen entweder des N-terminalen Teiles oder des C-terminalen Teiles, oder durch Austausch von Aminosäureresten gekennzeichnet, und sie wiesen die folgenden Sequenzen auf:
Diese Peptide können in fester Phase oder in homogener Phase synthetisiert werden, wobei man nach einem der wohlbekannten, allgemeinen Verfahren vorgeht.
Vorzugsweise wurden diese Peptide in fester Phase unter Verwendung eines handelsüblichen Polyacrylamidharzes, sowie von 4-Hydroxymethylphenoxy-essigsäure als umkehrbarem Verbindungsteil zwischen dem Peptid und dem Harz, und von der Fluorenyl-methoxycarbonylgruppe (Fmoc) als Schutzgruppe des endständigen Stickstoffatoms für die Aminosäurereste, gemäß der in den Beispielen 2 und 3 angeführten Verfahrensweise, synthetisiert. Die reaktiven funktionellen Gruppen in der Seitenkette der Aminosäurereste wurden unter Verwendung von Schutzgruppen geschützt, welche aus den in der Peptidsynthese generell verwendeten ausgewählt worden waren.
Vorzugsweise wurden die Trifluoracetylgruppe (TFA) für Lysin (Lys), tert.Butylether (But) für Serin (Ser), Threonin (Thr) und Tyrosin (Tyr), tert.Butylester (OBut) für Glutaminsäure (Glu) und die 4-Methoxy-2,3,6-trimethylbenzolsulfonylgruppe (Mtr) für Arginin (Arg) verwendet. Die in geeigneter Weise geschützten Aminosäuren wurden einzeln mit symmetrischen Anhydriden oder Estern von Pentafluorphenol und/oder p-Nitrophenol kondensiert.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wurde das Peptid von dem Harz unter Verwendung einer wäßrigen Lösung von Trifluoressigsäure bei Umgebungstemperatur (20 bis 25ºC) und während der zum gleichzeitigen Entfernen der Schutzgruppen vom t-Butyl-Typus, aber nicht der TFA oder Mtr, erforderlichen Zeitspanne entfernt.
Diese Verfahrensweise ermoglicht die Gewinnung von Peptiden, in welchen die einzige freie Aminogruppe, welche für ihr späteres Konjugieren mit einem Hapten zur Verfügung steht, die N-terminale Gruppe ist.
Dann wurden die auf diese Art und Weise synthetisierten Peptide durch Gelfiltrationschromatographie und anschließende präparative HPLC in der üblichen Weise gereinigt.
Dann wurde die Fähigkeit der Peptide gemäß der vorliegenden Erfindung, in Gegenwart von APC die Proliferation von Human-T- Zellklonen zu stimulieren, welche einen unterschiedlichen Satz von HLA-Molekülen der Klasse II aufweisen, gemessen.
Die Ergebnisse zeigten, daß diese Peptide von den verschiedenen Human-T-Zellklonen im Zusammenhang mit den zahlreichen Allelen des Human-Histokompatibilitäts-Hauptkomplexes erkannt wurden. Demzufolge waren diese Peptide als Universalträger für die Herstellung immunogener Peptid-Hapten-Konjugate besonders gut geeignet.
Diesbezüglich vereinigen sie in sich die Vorteile, welche auf das Vorliegen der gesamten Sequenz des Tetanus-Toxoids zurückzuführen sind, nämlich die Fähigkeit, die Bildung von Anti-Hapten- Antikörpern bei den meisten geimpften Individuen zu induzieren, mit den Vorteilen, die sich auf ihre kleine Größe beziehen (keine Unterdrückung von Epitopen, und eine wirksamere Regelung der Konjugatbildungsreaktionen mit dem Hapten).
Beispiele von Haptenen, welche an diese Peptidträger gebunden werden können, um immunogene Konjugate gemäß der vorliegenden Erfindung zu erzeugen, sind: Peptide oder Polysaccharide, welche aus verschiedenen Krankheitserregern stammen, wie z.B. Meningokokken, Pneumokokken, Haemophilus influenzae, B-hämolytischen Streptokokken und Escherichia coli.
Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung geeignete Haptene sind auch jene synthetischen Peptide, welche die Sequenz aufweisen, die jener von einem oder von mehreren der B-Epitopen eines natürlichen Antigens entspricht.
Die Konjugatbildung zwischen einem Peptidträger gemäß der vorliegenden Erfindung und einem Hapten kann nach einem der herkömmlichen Verfahren durchgeführt werden, welche generell auf diesem speziellen Fachgebiet angewendet werden.
Spezifisch kann die Konjugatbildung unter Verwendung von Glutaraldehyd als Bindungsmittel durchgeführt werden, wie dies z.B. von Avremas und Ternyck (Immunochemistry 6, 53, 1969) beschrieben worden ist. Gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wurden die Peptide TT Nr. 1 und TT Nr. 2 als Universalträger dazu verwendet, die Immunogenität synthetischer Peptide zu verbessern, welche eine Aminosäurensequenz aufweisen, welche jener des immundominanten B-Epitops des Circumsporozoitenproteins (CSP) von Plasmodium falciparum entspricht, welches letztgenannte der Erreger der schwersten Form der Malaria (der bösartigen Malaria tertiana) bei Menschen ist.
Diese synthetischen Peptide, welche die Aminosäurensequenz H-(Asn-Ala-Asn-Pro)n aufweisen, worin n eine Zahl zwischen 3 und 40 ist, waren tatsächlich nicht befähigt, eine Anti-CSP-Antikörperantwort in CBA/ca- und DBA/2-Mäusen (nicht ansprechenden Mäusen) zu induzieren [G. Del Giudice et al., J.Immunol., 137, 2952-2965 (1986)].
Diesbezüglich ist gezeigt worden, daß das (NANP)n in seiner Sequenz ein oder mehrere T-Epitopen enthält, welche alle durch das nur in C57-BL/6-Mäusen vorhandene I-Ab-Allel des H-2-Mäuse-Histokompatibilitätskomplexes genetisch beschränkt sind.
Diese Peptide wurden durch Polymerisieren des aktivierten Monomers HCl.H-Asn-Ala-Asn-Pro-OPCP in Gegenwart von Triethylamin als basischem Initiator hergestellt, wie dies in der Italienischen Patentanmeldung 21718 A/85 beschrieben ist.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wurden die Peptidträger-(NANP)n-Konjugate durch Umsetzen der Aldehydgruppen des Glutaraldehydes mit der endständigen Aminogruppe des Asparagins (Asn) von (NANP)n und mit der endständigen Aminogruppe des Trägers hergestellt. Die Konjugatbildungsreaktion wurde in zwei Stufen durchgeführt. In der ersten Stufe wurde das (NANP)n in einem Phosphatpuffer (vom pH 7,4) mit einem Überschuß von Glutaraldehyd (OHCCH&sub2;CH&sub2;CH&sub2;CHO) unter Neutralitätsbedingungen reagieren gelassen, um die Bildung des Polymers - durch Aldol- Autokondensation - mit Aldehydfunktionen zu veranlassen:
welches das wirksame Konjugatbildungsmittel zu sein scheint.
Nach Beendigung der Konjugatbildungsreaktion wurde das so entstandene Produkt, (NANP)n-Glutaraldehyd, von dem nicht-umgesetzten Glutaraldehyd durch Gelfiltration in reinem Zustand abgetrennt.
In der zweiten Stufe wurde das (NANP)n-Glutaraldehyd-Konjugat in einem Phosphatpuffer (vom pH 7,4) oder in Dimethylsulfoxid (DMSO) mit einem molaren Überschuß des Peptidträgers (zwischen 2,5- und 25-fach), bezogen auf das (NANP)n-Glutaraldehyd-Konjugat, umgesetzt, wobei das Vorliegen der noch freien Aldehydgruppen an dem mit dem (NANP)n konjugierten Glutaraldehyd zum Angreifen der endständigen Aminogruppe des Trägers benützt wurde.
Die Reaktion wurde bei Umgebungstemperatur (20 bis 25ºC) unter Rühren während 3 Tagen durchgeführt, wobei eine gelbliche Lösung erhalten wurde. Dieser Lösung kann eine reduzierende Substanz, wie z.B. NaBH&sub4;, zugesetzt werden, welche durch Reduzieren der Bindungen (Schiff'schen Basen) zwischen der Aminogruppe der Peptide und den Aldehydgruppen des Glutaraldehyds die in dem Konjugat vorliegenden Bindungen stabilisiert. Vorzugsweise wurde das NaBH&sub4; gemäß der vorliegenden Erfindung dazu verwendet, eine weitere Sicherheitsspanne für die Stabilität der Bindung zwischen den zwei Peptiden zu schaffen.
Die Reduktionsreaktion wurde bei Umgebungstemperatur während etwa 2 h durchgeführt, und nach ihrer Beendigung wurde der gebildete Niederschlag dadurch löslich gemacht, daß man den pH-Wert auf einen sauren Wert einstellte. Die so erhaltene Lösung wurde durch Gelfiltration gereinigt, wobei mit 0,1 M Essigsäure eluiert wurde, um das gebildete Konjugat von dem überschüssigen Peptidträger abzutrennen.
Dann wurde zum Freisetzen der Schutzgruppen aus den Aminfunktionen in den Seitenketten der Aminosäurereste des Peptidträgers eines der herkömmlichen Verfahren angewendet.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wurde die Schutzgruppe 4-Methoxy-2,3,6-trimethylbenzolsulfonyl des Arginins des TT Nr. 1-Peptides durch Behandeln des Konjugates mit einer Trifluoressigsäure/Phenol-(95/5 Vol./Gew.)-Lösung entfernt, während die Trifluoracetylgruppe des Lysins des Peptides TT Nr. 2 durch Behandlung mit einer basischen wäßrigen Lösung freigesetzt wurde. Die Konjugate wurden dann durch Lyophilisierung und Chromatographie gereinigt.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wurde die Immunogenität dieser Konjugate dadurch verifiziert, daß dieselben die in-vitro-Proliferation von Human-T-Lymphozyten, welche jeweils für den Peptidträger spezifisch waren, in Gegenwart autologer B-Zell-Linien als APC stimulierten.
Zusätzlich wurde auch die Fähigkeit dieser Konjugate bestimmt, die Produktion von Anti-(NANP)n-Antikörpern in Mäusen, welche auf (NANP)n nicht ansprechen, zu induzieren.
Die dabei erhaltenen Proliferations-Ergebnisse zeigten, daß dies lange (NANP)n-Sequenz die Fähigkeit des Peptidträgers, als T-Epitop zu fungieren, nicht beeinflußt hatte, und daß die Konjugatbildungsreaktion die Struktur dieses T-Epitops nicht verändert hatte.
In-vitro-Immunisierungsdaten (von Mäusen) zeigten auch das Fehlen einer genetischen Beschränkung und einer Unterdrückung der Epitopen des Trägers. Tatsächlich waren die Mäuse, welche auf das (NANP)n nicht ansprachen, in der Lage, eine hohe Konzentration von Anti-(NANP)n-Antikörpern auszubilden.
Wie oben bereits erwähnt worden ist, werden diese Peptidträger im Zusammenhang mit dem sehr weitverbreiteten Human-Beschränkungselement DR erkannt, und da ein beträchtliches Ausmaß von Übereinstimmung zwischen den Beschränkungselementen des Human- Histokompatibilitätskomplexes (HLA) und jenen des Mäuse-Histokompatibilitätskomplexes (H-2) besteht, können die an der Maus durchgeführten Versuche als für den Menschen gültig angesehen werden, und die Ergebnisse können auf den Menschen extrapoliert werden. Zusammenfassend läßt sich sagen, daß die synthetischen Peptide gemäß der vorliegenden Erfindung als Universalträger für die Herstellung immunogener Peptidträger-Hapten-Konjugate geeignet sind, welche letztgenannten befähigt sind, eine genetisch nicht beschränkte, oder doch nur geringfügig genetisch beschränkte, protektive Immunität gegen verschiedene Krankheitserreger zu induzieren.
Besonders bevorzugt als Universalträger sind die synthetischen Peptide, welche den Regionen 830-843 (TT=2) und 830-844 des TT und den analogen Regionen des TT=2-Peptides entsprechen.
Immunogene Konjugate gemäß der vorliegenden Erfindung können an den Menschen in einer Einzeldosis oder in aufeinanderfolgenden Dosen in der Form von pharmazeutischen Zusammensetzungen (Vakzinen) verabreicht werden, welche diese Konjugate in einer Form und in einer Menge enthalten, welche für das Induzieren einer protektiven Immunantwort geeignet sind.
Die bevorzugten Formen sind pharmazeutische Zusammensetzungen, welche als das Konjugat enthaltende Suspensionen oder Lösungen hergestellt werden, und welche leicht durch Injektion verabreicht werden können.
Gewünschtenfalls kann zu diesen Zusammensetzungen ein Adjuvans hinzugefügt werden, um die Immunantwort zu verstärken.
Die Erfindung wird durch die nachstehenden, Versuche betreffenden Beispiele veranschaulicht, aber nicht eingeschränkt.

BEISPIEL 1

Identifizierung der T-Epitopen des Tetanus-Toxins.

Es wurden T-Zellklone (KT1, KT2, KT4, KT30, KT40 und KT42) verwendet, welche aus dem peripheren Blut eines Spenders (KK) gewonnen worden waren, welcher Spender einen DR 3,5-Gen-Satz aufwies und mit dem Tetanus-Toxoid immunisiert worden war. Diese Klone wurden nach bekannten Verfahren [Lanzavecchia A., Nature 314 (1985), 357-36 ] stabilisiert, und sie wurden durch periodische Restimulation mit bestrahlten, mononukleären Blutzellen aus peripherem Blut (PBMC) mit 1% Phytohämagglutinen (Gibco, Paisley, Schottland) unter Kultur gehalten. 5 Tage später wurden die T-Blastenzellen gewaschen und in RPMI-c-Kulturmedium (bestehend aus dem Gibco-RPMI-Wachstumsmedium, welches mit durch Erhitzen inaktiviertem (10%igem), fetalem Kälberserum, 2 mM L-Glutamin, 1 mM Natriumpyruvat, 5x10&supmin;&sup5; M 2-Mercaptoethanol und einem Gemisch aus nicht-essentiellen Aminosäuren (1%ig) von Gibco, welches mit 40 Einheiten/ml von rekombinantem Human-Interleukin 2 (Hoffmann La Roche) ergänzt war, versetzt war) kultiviert.
Dann wurde die Spezifität dieser Klone nach dem in-vitro-Proliferationstest untersucht, wobei als Antigene das Tetanus-Toxin, dessen B-Fragment (B.fr.) und C-Fragment (C.fr.) von Calbiochem, La Jolla, Ca, USA, und das reduzierte, carboxylierte C-Fragment (RCM-C.fr.) verwendet wurden. Praktisch wurde die Reduktion des C-Fragmentes (C.fr.) in einem Sole enthaltenden Phosphatpuffer (PES) vom pH 7,0 und in 8 M Harnstoff durchgeführt, wobei während 30 min mit 20 mM Dithiothreit von 37ºC behandelt wurde.
Das reduzierte Fragment wurde dann mit 80 mM Iodacetamid während 60 min bei 4ºC im Dunkeln carboxymethyliert und wurde dann umfassend gegen Wasser dialysiert.
Der Proliferationstest wurde dann durchgeführt, indem jede Vertiefung einer Platte mit 96 flachbödigen Vertiefungen (Cluster Cambridge MA), welche 100 ul RPMI-c-Kulturmedium mit einem Gehalt an den obgenannten Antigenen aufwies, mit 2x10&sup4;-T-Zellklonen in 0,1 ml RPMI-c-Kulturmedium in Gegenwart dieser Antigene und von 2x10&sup4; EBV-B-Zellen (autologen B-Lymphozyten, welche mit dem mit Mitomycin C behandelten Epstein-Barr-Virus transformiert worden waren), als APC, beimpft wurde.
Die Proliferationsreaktion wurde bei 37ºC während 48 h in 5% CO&sub2; durchgeführt, und die Zellen wurden durch Zugabe von 1 uCi Methyl-(³H)-Thymidin (185 GBq/mMol, Amersham International, Amersham, GB) mit radioaktivem Material versetzt. Nach etwa 20 h wurde die Anzahl der Zellen bestimmt, welche Radioaktivität einverleibt enthielten.
Die Ergebnisse, welche als der Mittelwert für die Zählimpulse je min (cpm) einer Doppelkultur ausgedrückt wurden, zeigten, daß zwei T-Zellklonen (KT4 und KT30) dem TT C-Fragment zugeordnet waren, wohingegen der KT2-Klon dem B-Fragment zugeordnet war.
Eine Verfahrensweise wurde dann angewendet, um jene T-Epitopen in dem TT genauer zu lokalisieren, welche von diesen Klonen erkannt worden waren. Dann wurden Proliferationstests durchgeführt, wobei wie oben angegeben vorgegangen wurde, und wobei als Antigene Fragmente des RCM-C.fr. von unterschiedlicher Länge verwendet wurden, welche durch enzymatische Verdauung mit Trypsin und Chemotrypsin (Sigma, St. Louis, MO) oder durch chemische Modifikation erzeugt worden waren.
In der Praxis wurde die enzvmatische Reaktion durchgeführt, indem man das Fragment in PBS (vom pH 7,0) mit einem Gehalt an Ca²&spplus;-Ionen und an dem Enzym während 20 h bei 37ºC und unter Anwendung eines Enzym-Substrat-Verhältnisses zwischen 1:1 und 20:1 suspendierte und die erhaltenen Fragmente abtrennte.
Die chemische Behandlung wurde wie von Corradin G. und Harbury H.A. (1970), Biochem.Biophys.Acta, 221, 489, beschrieben durchgeführt. Es wurden auch Peptidfragmente verwendet, welche mit Hilfe von rekombinanter DNA nach bekannten Verfahren erhalten worden waren, nämlich durch Kultivieren von E.coli-Zellen, welche nach bekannten Verfahren gentechnologisch behandelt worden waren.
Spezifisch wurden die folgenden rekombinanten Peptide hergestellt und verwendet:
Tet 6 (TT-Fragment 406-743), Tet 15 (TT-Fragment 604-1315), Tet 3 (TT-Fragment 744-1315), Tet 5 (TT-Fragment 1-405) und Tet 97 (TT-Fragment 1-535).
Die dabei erhaltenen Ergebnisse haben es ermöglicht, in dem C-Fragment des TT, die Regionen 1273-1284, 830-843 und 830-844, entsprechend den T-Epitopen mit den folgenden Aminosäuren- Sequenzen:
Gly-Gln-Ile-Gly-Asn-Asp-Pro-Asn-Arg-Asp-ILe-Leu
(nachstehend als TT=1 bezeichnet)
Gln-Tyr-Ile-Lys-Ala-Asn-Ser-Lys-Phe-Ile-Gly-ILe-Thr-Glu
(nachstehend als TT=2 bezeichnet)
Gln-Tyr-Ile-Lys-Ala-Asn-Ser-Lys-Phe-Ile-Gly-ILe-Thr-Glu-Leu, zu identifizieren.

BEISPIEL 2

Synthese des Peptides TT Nr. 1.

Das Peptid TT Nr. 1 wurde in fester Phase mit einer automatischen Synthesevorrichtung vom Typus T-Beckman 99 B Automatic Synthesizer" synthetisiert, und zwar unter Verwendung eines handelsüblichen Polyacrylamidharzes (PepSyn, Cambridge Research Biochemicals), welches mit Norleucin als interner Bezugsaminosäure und mit 4-Hydroxymethylphenoxyessigsäure als reversiblem Peptid-Harz-Verbindungsteil funktionalisiert worden war.
1 g dieses Harzes mit einer Funktionalisierung von 1,1 Milliäquivalenten/g wurde über Nacht bei Umgebungstemperatur (20 bis 25ºC) in 32 ml N,N-Dimethylformamid (DMF) aufquellen gelassen und wurde dann mit 1 ml DMF 1 mal (jeweils 1 min( gewaschen.
Der erste Aminosäurerest (Leu), der an der alpha-Aminogruppe durch die Schutzgruppe Fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc) geschützt war, wurde an dem Harz durch die Reaktion mit dem symmetrischen Anhydrid der Aminosäure verestert.
In der Praxis wurden 1,238 g (1,8 mMol) (Fmoc Leu)&sub2;O mit dem Harz in 16 ml DMF in Gegenwart von 0,022 g (0,18 mMol) 4-Dimethylaminopyridin (DMAP) und 0,198 ml (1,8 mMol) N-Methylmorpholin (NMM) bei Umgebungstemperatur während 3 min umgesetzt.
Nach Beendigung der Veresterungsreaktion wurde das Harz 5-mal (jeweils 1 min) mit DMF, zweimal mit einer Piperidin/DMF-Lösung (2/8 Vol./Vol.) während 3 bzw. 7 min gewaschen, um die Fmoc-Schutzgruppe zu entfernen, und schließlich wurde das Harz zehnmal mit DMF (jeweils 1 min) gewaschen.
Die anderen Aminosäuren wurden dann an den freien -NH&sub2;-Gruppen der wachsenden Peptidkette durch Acylierung der Aminosäure eingeführt, welche an der Carboxylgruppe aktiviert war, und welche an der alpha-Aminogruppe mit Fmoc geschützt war.
Die Seitenkettenfunktionen der Aminosäuren waren mit dem t-Butylester (OBut) für die Asparaginsäure bzw. mit 4-Methoxy-2,3,6-trimethylbenzolsulfonyl (Mtr) für das Arginin geschützt. Die angegebenen Arbeitsgänge des Waschens und des Entfernens der Fmoc-Gruppe wurden jeweils zwischen einer Acylierungsreaktion und der nächsten durchgeführt.
Die Acylierungsreaktion wurde bei Umgebungstemperatur während 60 min durchgeführt.
Alle Aminosäurereste mit Ausnahme des Glutamins (Gln) und des Asparagins (Asn) wurden unter Verwendung der entsprechenden symmetrischen Anhydride als aktiver Form (1,8 mMol in 16 ml DMF) eingeführt.
Für Gln bzw. Asn wurden der p-Nitrophenolester (1,8 mMol) bzw. der Pentafluorphenolester (1,8 mMol) der Aminosäure in Gegenwart von 0,244 g (1,8 mMol) 1-Hydroxybenzotriazol (HOBt) verwendet.
Das symmetrische Anhydrid der in geeigneter Weise geschützten Aminosäuren wurde unmittelbar vor der Acylierungsreaktion, durch Umsetzen von 3,6 mMol Fmoc-Aininosäure mit 0,371 g (1,8 mMol) Dicyclohexylcarbodiimid (DCCI) in 2 ml Methylenchlorid bei Umgebungstemperatur während 10 min hergestellt.
Nach Beendigung der Reaktion wurde der Dicyclohexylharnstoff, der sich gebildet hatte, durch Filtration abgetrennt, das Lösungsmittel wurde eingedampft, und das erhaltene symmetrische Anhydrid wurde rückgewonnen.
Für jede Acylierungsreaktion wurde die Beendigung der Reaktion mit dem Ninhydrin-Test [E. Kaiser et al., Anal.Biochem., 34 (198 ), 595] und mit dem Trinitrobenzosulfonsäurerest [W.S. Hancock et al., Anal.Biochem., 71 (1976), 261] geprüft. Die nach 3-minütiger Umsetzung entnommenen Proben ergaben positive Ergebnisse.
Bei der Aminosäurenanalyse ergab das Harz-Peptid die folgenden Ergebnisse:
Die theoretischen Werte sind in Klammern angeführt.
Ein Teil des Peptides TT Nr. 1 wurde für die Zwecke einer moglichen Synthese von an das TT Nr. 1 gebundenen Peptiden auf dem Harz zurückgehalten, während der Rest hievon durch eine zweistündige Behandlung, bei Umgebungstemperatur, mit der Trifluoressigsäurelösung (TFA/H&sub2;O = 90/1, Vol./Gew.) freigesetzt wurde. Diese Lösung entfernt die t-Butylester-Schutzgruppe, aber nicht die 4-Methoxy-2,3,6-trimethylbenzolsulfonylgruppe. Durch diese Vorgangsweise wurde es ermöglicht, ein Peptid herzustellen, in welchem die einzige für die Konjugation mit einem Hapten brauchbare Aminogruppe die endständige Glycingruppe ist.
Diese chromatographischen Bedingungen wurden als für die präparative HPLC geeignet angesehen.
In der Praxis wurde eine Säule mit den Abmessungen 24x0,2 cm, welche mit RP-18-Silica (25-4 um) (ICN BIOMEDICALS, BRD) gefüllt war, unter Verwendung einer wäßrigen 0,1%igen TFA-Lösung mit einem Gehalt von 29% an Acetonitril als Eluierungsmittel verwendet.
Es wurden verschiedene Chromatographie-Durchläufe durchgeführt, bei denen sowohl die Menge des aufgegebenen Peptides als auch der Prozentsatz des Acetonitrils in dem Eluierungsmittel, als Versuche in Richtung einer Optimierung der Ausbeute an dem reinen Produkt, variiert wurden. In der nachstehenden Tabelle I sind die erhaltenen Ausbeuten als Funktion der verschiedenen Parameter angeführt. TABELLE I Präparation Nr. % Acetonitril Beschickung (mg) Gereinigtes Produkt, mg Ausbeute %

BEISPIEL 3

Synthese des Peptides TT Nr. 2

Die Peptidsynthese wurde gemäß der im Beispiel 2 beschriebenen Vorgangsweise mit dem Fmoc-Polyamid und unter Anwendung der Durchflußvariante des gleichen verfahrens [E. Atherton et al., Tetrahedron 44 (1968), 843-887; A. Bryland und R.C. Sheppard, ibid. 859-876] durchgeführt. Die Veresterung des ersten Aminosäurerestes (Glu) an dem Polymerträger wurde unter Verwendung des asymmetrischen Anhydrides der geschützten Aminosäure [Fmoc-Glu (OBut)]&sub2;O in Gegenwart der Katalysatoren 4-N,N'-Dimethylaminopyridin (0,1 mMol, 0,012 g) und N-Methylmorpholin (1 mMol, 110 ul) durchgeführt. Dieses Anhydrid wurde durch Umsetzen von Fmoc-Glu (OBut)OH (2 mMol, 0,851 g) mit DCCI (1 mMol, 0,206 g) gewonnen. Die Umsetzung wurde mit 3 g des handelsüblichen, in 3 ml DMF aufgelösten Harzes ULTROSYN (Pharmacia-LKB, Schweden) bei Umgebungstemperatur während 0,5 h durchgeführt.
Die Funktionalisierung betrug 80 %.
Das Harz wurde dann mit DMF gewaschen und in zwei "Omnifit"-Säulen (10x1,0 cm) (1,5 g Harz pro Säule) gepackt, welche einen Teil einer Durchfluß-Synthesevorrichtung vom Typus "PHARMACIA-LKB Flow Synthesizer Model 4170" bilden.
Die Vorgangsweise bei der Synthese war die in den zitierten Schriften angeführte. Die für die Aminosäureseitenkettenfunktionen verwendeten Schutzgruppen waren Trifluoracetysl (TFA) für Lysin (Lys), tert.Butylether (But) für Ser, Thr und Tyr, und tert.Butylester (OBut) für Glu. Der umkehrbare Verbindungsteil war 4-Hydroxymethylphenoxyacetat.
Das Peptid wurde durch Behandlung mit Trifluoressigsäure/H&sub2;O (95/5, Vol./Vol.) während 1,5 h bei Umgebungstemperatur aus dem Harz freigesetzt. Ausbeute 93 %.
Durch diese Behandlung werden alle Schutzgruppen vom tert.Butyl- Typus entfernt, die TFA-Schutzgruppe an den Lysinresten wird aber intakt belassen. Somit besitzt das so entstandene Peptid eine einzige verfügbare Aminofunktion an dem endständigen Aminosäurerest.
Das Peptid wurde dann durch Gelfiltration unter Verwendung von Dimethylsulfoxid (DMSO) als Eluierungsmittel, und einer mit Sephadex G-10-Harz gepackten Säule von 80x2,6 cm, wobei mit einer Durchsatzmenge von 36 ml/h eluiert wurde, gereinigt.
Diejenigen Fraktionen, welche dem an dem Säulenkopf eluierten Material entsprachen, wurden gesammelt, mit Wasser verdünnt und lyophilisiert.
Die Aminosäurenanalyse des gereinigten Peptides ergab das folgende Ergebnis (wobei die theoretischen Werte in Klammern angeführt sind):

BEISPIEL 4

Synthese des 830-844-Peptides

Die Synthese des Peptides wurde durchgeführt, indem man die Vorgangsweise des vorhergehenden Beispieles 3 anwendete, wobei die Veresterung des ersten Aminosäurerestes (Leu) an dem Polymersubstrat durch Verwendung des symmetrischen Anhydrides der geschützten Aminosäure (Fmoc-Leu)&sub2;O durchgeführt wurde.
Die Aminosäurenanalyse des gereinigten Peptides ergab das folgende Ergebnis (wobei die theoretischen Werte in Klammern angeführt sind):

BEISPIEL 5

Isolierung von T-Zellklonen, welche spezifisch für das TT=2-Peptid sind.

Mononukleäre Zellen aus peripherem Blut (PBMC), welche aus verschiedenen (als HLA typisierten) Spendern isoliert worden waren, welche Spender mit dem Tetanus-Toxoid immunisiert worden waren, wurden in einer Konzentration von 7x10&sup5; in 200 ul RPMI-HS-Kulturmedium (RPMI=RPMI 1640, welches durch 2 mM Glutamin, 1% an nicht-essentiellen Aminosäuren, 1% Natriumpyruvat, 50 ug/ml Kanamicin (Flow, Irvine, Schottland); HS=Humanserum (Schweizer Rotes Kreuz) ergänzt worden war) in Gegenwart (10 uM) oder in Abwesenheit des TT=2-Peptides in Mikroplatten kultiviert, welche 96 ebenbödige Vertiefungen aufweisen. Nach 6 Tagen wurden zu jeder Vertiefung 30 Einheiten/ml von Interleukin 2 (IL-2) (Hoffmann La Roche, Nutley, N.J.) hinzugefügt, und nach 4 weiteren Tagen wurden die Kulturen untersucht, um eine mögliche Zellproliferation nachzuweisen. Die positiven Kulturen wurden dann in dem gleichen Kulturmedium, welches durch IL-2 ergänzt worden war, weitergezüchtet, und sie wurden auf ihre Fähigkeit zum Erkennen des TT=2-Peptides geprüft. Ein Teil dieser T-Zellen wurde in die Vertiefungen von Mikroplatten mit 96 flachbödigen Vertiefungen übertragen, dreimal gewaschen, und erneut in 200 ul RPMI-Kulturmedium aufgeschlämmt, welches durch 10% Fetalkälberserum (FCS) (Gibco, Paisley, Schottland) ergänzt worden war, und zwar in Gegenwart (20 uM) oder in Abwesenheit des TT=2-Peptides Da die aktivierten Human-T-Zellen Moleküle der Klasse II exprimieren, sind sie befähigt, die Peptide einander darzubieten, mit dem Ergebnis einer sichtbaren Agglutination nach 6 h bei 37ºC. Die positiven Kulturen wurden durch beschränkende Verdünnung kloniert, und die für das TT=2-Peptid spezifischen Klone wurden isoliert, und sie wurden durch periodische Restimulation mit bestrahlten, allogenen PBMC und Phytohämagglutinin (1%) (Gibco), wie von Lanzavecchia et al. (1988), Nature, 334, 530, beschrieben, in Kultur gehalten.
Für jede positive Kultur wurde nur ein einziger, spezifischer Klon gelagert. Aus der Tabelle II ist zu ersehen, daß die für TT=2 spezifischen Klone leicht aus allen Spendern, unabhängig von deren DR-Typus, isoliert werden konnten. Die annähernde Häufigkeit des Vorkommens der für das TT=2 spezifischen Zellen lag zwischen 1 in 3x10&sup4; und 1 in 3x10&sup5;, und sie stellten nur 5%, oder weniger, von allen T-Zellen dar, welche für das Tetanus Toxoid (TT) spezifisch waren. TABELLE II T-Zellenantwort auf TT=2 Spender Isolierte Klone Beschränkung (b)
worin:
(a) = PBMC aus verschiedenen als DR typisierten Spendern;
(b) = gibt sämtliche Allele der Klasse II der Klasse MHC an, welche das Peptid wenigstens einem T-Zellklon darbieten könnten.
Alle isolierten Klone sprechen proliferierend sowohl auf das TT=2-Peptid als auch auf das ganze Molekül des Tetanus Toxoids an, welches von autologen APC-Zellen dargeboten wird, wodurch ihre Spezifität hinsichtlich des TT bewiesen ist.
Diese Ergebnisse zeigen, daß das TT=2 nach einer Immunisierung mit dem TT universell erkannt wird, und daß es befähigt ist, sich mit verschiedenen Molekülen der Klasse II zu assoziieren.

BEISPIEL 6

Kennzeichnung der T-Zellklone, welche spezifisch für das TT=2 sind.

A) Bestimmung des Beschränkungsmusters der T-Zellen.

Um den Isotypus der Moleküle der Klasse II zu bestimmen, welche von jedem T-Zellklon erkannt worden sind, wurden unter Verwendung von monoklonalen Anti-DR-Antikörpern, welche aus dem ATCC L243-Hybridom erhalten worden sind, welches letztgenannte von dem American Type Culture Center erhältlich ist, sowie unter Verwendung von monoklonalen Anti-DP-Antikörpern, und von monoklonalen Anti-DQ-Antikörpern, Proliferationstests durchgeführt.
In der tatsächlichen Praxis wurden die T-Zellen mit autologen EBV-B-Zellen in Gegenwart von beschränkenden Konzentrationen von sowohl TT=2 als auch von monoklonalen Anti-DR-Antikörpern (L243, 1:4 des Kulturüberstandes), Anti-DP-Antikörpern und Anti-DQ-Antikörpern, beide als 1:1000-Aszites, kultiviert.
Die Ergebnisse zeigen, daß die für TT=2 spezifischen Klone beschränkte DRs sind, weil nur die Anti-DR-Antikörper die Zellproliferation hemmen. Um die DR-Beschränkungs-Allelen zu identifizieren, wurde jeder Klon auf seine Fähigkeit geprüft, als Antwort auf eine Gruppe allogener (als APC verwendeter) EPBV-B-HLA-Homozygotenzellen zu proliferieren, welche Zellen mit dem TT=2-Peptid während 2 h bei 37ºC versetzt worden sind, oder auch nicht, und welche Zellen viermal gewaschen und bestrahlt worden sind.
Die Ergebnisse zeigen, daß eine große Anzahl von DR-Allelen als Beschränkungsmoleküle verwendet werden können. Diese letztgenannten umfassen DR1-9, 4x4, 5JVM und DRw52b (Tabelle III). TABELLE III Proliferationsantwort von T-Zellklonen (cpm x 10&supmin;³) (a) p2-markiert
(a) Verschiedene Klone wurden auf ihre Fähigkeit geprüft, in Gegenwart von das TT=2-Antigen darbietenden APC zu proliferieren. Die Antwort war nur durch Anti-DR-Antikörper gehemmt.
(b) Gibt die DR-Typisierung der APC an.
(c) Gibt die DR-Typisierung der Spender an, aus welchen die Klone isoliert worden sind.
(d) Gibt die Konzentration des Peptides, in uMol, an, welche befähigt ist, 30% der maximalen Antwort zu induzieren.
Die für jeden Klon durchgeführte Auftragung der Dosis gegen die Antwort zeigt, daß alle Klone in dem Bereich sehr niedriger Konzentrationen des Peptides (0,1-2 uM) reagieren (Tabelle III). Diese Tatsache ist ein Beweis dafür, daß alle Klone die gleiche hohe Affinität besitzen, und daß alle DR-Allelen befähigt sind, das Peptid mit der gleichen Wirksamkeit darzubieten.
Durchaus überraschend ist festgestellt worden, daß einige wenige (als monogam definierte) Klone das TT=2 in Verbindung mit einem einzigen DR-Allel erkennen, während andere Klone das TT=2 in Verbindung mit zwei oder mehreren Allelen erkennen. Beispiele sind der Klon GM2.11, welcher das TT=2 in Verbindung mit DRI, 2, 4w4 und 7 erkennt, und der Klon AL4.1, welcher das TT=2 in Verbindung mit DR5JVM und 6 erkennt.

B) Identifizierung der von den T-Zellen erkannten, antigenen Mindestsequenz.

Um eine antigene Mindestsequenz innerhalb des TT=2-Peptides zu identifizieren, wurden Proliferationstests durchgeführt, wobei eine Reihe von TT=2-Deletionsfragmenten benützt wurde, denen die N-Terminusregion oder die C-Terminusregion fehlten.
Darüber hinaus wurden TT=2-Analoga synthetisiert, welche dadurch gekennzeichnet sind, daß ein Aminosäurerest ausgetauscht worden ist. Die Proliferationsergebnisse, welche unter Benützung von verschiedenen T-Zellklonen als APC erhalten worden sind, zeigen, daß das TT=2 ein einziges 831-842-Epitop enthält, welches im Zusammenhang mit jedem der untersuchten Moleküle (von DR1 bis 9, 52a und 52b) erkannt wird, und daß die TT=2-Deletionspeptide und jene Peptide, welche den ausgetauschten Aminosäurerest enthalten, eine ähnliche Wirkung auf die Erkennung durch verschiedene T-Zellklonen haben (Tabelle IV). TABELLE IV Peptidkonzentration (uM), welche zum Induzieren von 30% der maximalen Antwort erforderlich ist (a) T-Zellklon (a) monogame und bunt durcheinander aktive Klone wurden auf ihre Fähigkeit geprüft, mit APC zu proliferieren, welche mit verschiedenen Konzentrationen von Peptiden oder Ersatz-Peptiden versetzt worden waren. (b) die Beschränkungsliste des untersuchten Klons ist in Klammern angeführt.

BEISPIEL 7

Synthese von (NANP)n-TT Nr. 1-Konjugaten

Das Peptid TT Nr. 1, welches an der Arginin-Guanidinogruppe mit der Mtr-Gruppe geschützt und wie im Beispiel 2 beschrieben erhalten worden war, wurde für die Synthese der folgenden Konjugate verwendet:
1) (Asn-Ala-Asn-Pro)&sub4;&sub0;-TT Nr. 1 oder (NANP)&sub4;&sub0;-TT Nr. 1
2) (Asn-Ala-Asn-Pro)&sub2;&sub0;-TT Nr. 1 oder (NANP)&sub2;&sub0;-TT Nr. 1
Die Polymere (NANP)&sub4;&sub0; und (NANP)&sub2;&sub0; wurden durch Polymerisieren des aktivierten Monomers HCl.H-AsnAlaAsnPro-OCPP in Gegenwart von Triethylamin als basischem Initiator, wie dies in der italienischen Patentanmeldung 21718 A/85 beschrieben ist, erhalten.

a) Synthese von (NANP)&sub4;&sub0;-TT Nr. 1

40 mg (NANP)&sub4;&sub0; , welches in 2,5 ml einer Phosphatpufferlösung vom pH 7,44 gelöst war, wurden in einen Reaktor mit einem Volumen von 3 ml übertragen, welcher 52 ul (260 mÄquiv.) einer waßrigen 5%igen Glutaraldehydlösung (FluKa) enthielt, was einem 100-fachen Überschuß über das (NANP)&sub4;&sub0; entsprach.
Das Reaktionsgemisch wurde unter leichtem Rühren über Nacht bei Umgebungstemperatur gehalten.
Dann wurde die Lösung in einer 85x2,5 cm-Säule mit einer Sephadex G-25-Packung chromatographiert, wobei mit 0,1 M Essigsäure eluiert wurde. Dann wurden diejenigen Fraktionen gesammelt und lyophilisiert, welche dem Peak entsprachen, welcher mit dem Leervolumen der Säule eluiert wird, und welcher dem an den Glutaraldehyd gebundenen (NANP)&sub4;&sub0; entsprach.
2,5 ml eines den (NANP)&sub4;&sub0;-Glutaraldehyd enthaltenden Phosphatpuffers (vom pH 7,4) wurden in einen 3 ml-Reaktor eingebracht, welcher 9,67 mg (6,32 mMol) TT Nr. 1 enthielt. Der molare Überschuß des TT Nr. 1 gegenüber dem (NANP)&sub4;&sub0;-Glutaraldehyd betrug etwa das 2,5-fache.
Die so erhaltene, gelbe Lösung wurde unter Rühren während 3 Tagen belassen. Nach Beendigung der Umsetzung wurden 25 ug NaBH&sub4; als Reduktionsmittel zugegeben. Die so entstandene Lösung wurde während weiterer 2 h gerührt, um einen suspendierten Niederschlag zu erhalten.
Dieser Niederschlag wurde aufgelöst, indem man den pH-Wert durch Zugabe von 1 M Essigsäure auf etwa 4,0 einstellte.
Die Lösung wurde dann durch Gelfiltration auf Sephadex G-25 gereinigt, wobei mit 0,1 M Essigsäure eluiert wurde, um das gebildete Konjugat von dem überschüssigen TT Nr. 1 abzutrennen.
Die Ausbeute der Konjugatbildungsreaktion, berechnet aufgrund der Aminosäurenanalyse, betrug 17%.
Dann wurde die 4-Methoxy-2,3,6-trimethylbenzolsulfonyl-Schutzgruppe für das Arginin des TT Nr. 1-Peptides durch Behandeln des Konjugates mit 5 ml TFA/Phenol (95/5, Vol./Gew.) während 5 h entfernt. Die Lösung wurde unter Vakuum bis zur Trockne eingedampft, und der so erhaltene Rückstand wurde in 5 ml H&sub2;O aufgelöst, auf einen 25 ml-Scheidetrichter übertragen und zweimal mit Ethylether extrahiert. Die Etherphase wurde erneut mit Wasser extrahiert, und die rückgewonnenen wäßrigen Phasen wurden vereinigt und lyophilisiert.

b) Synthese von (NANP)&sub2;&sub0;-TT Nr. 1

Die Vorgangsweise zur Herstellung diesese Konjugates war zu jener unter Punkt a) analog, doch wurde in der zweiten Stufe der Umsetzung ein 25-facher Überschuß des TT Nr. 1 gegenüber dem (NANP)&sub2;&sub0;-Glutaraldehyd angewendet, um die Ausbeute der Konjugatbildungsreaktion zu erhöhen.
Die Aminosäurenanalyse zeigte, daß diese Ausbeute 32% betrug.

BEISPIEL 8

Synthese des Konjugates (NANP)&sub2;&sub0;-TT Nr. 2

Die Verfahrensweise war die gleiche wie die für das Konjugat (NANP)&sub2;&sub0;-TT Nr. 1 angewendete, wobei aber statt des Phosphatpuffers 5 ml Dimethylsulfoxid (DMSO) als Konjugatreaktionslösungsmittel, zusammen mit 100 mg TT Nr. 2 und 52 mg (NANP)&sub2;&sub0;-Glutaraldehyd, verwendet wurden. Auch wurden 50 mg NaBH&sub4; verwendet.
Nach Beendigung der Konjugatbildungsreaktion wurde das entstandene Gemisch in einer Säule (80x2,6 cm) von Sephadex G-25 chromatographiert, wobei mit 0,1 M Essigsäure eluiert wurde.
Diejenigen Fraktionen, welche dem am Kopf des Lösungsmittels eluierten Material entsprachen, wurden gesammelt und lyophilisiert.
Das Lyophilat wurde dann während 2 h bei Umgebungstemperatur mit 25 ml einer 1 M wäßrigen Piperidinlösung behandelt. Die erhaltene Lösung wurde dann mit verdünnter Essigsäure bis auf einen pH-Wert von 4 neutralisiert, wonach die Lösung erneut auf die Sephadex-G-25-Säule aufgegeben und mit 0,1 M Essigsäure eluiert wurde.
Die dem am Kopf eluierten Material entsprechenden Fraktionen wurden gesammelt und lyophilisiert.
Die Aminosäurenanalyse des (NANP)&sub2;&sub0;-TT Nr. 2-Konjugates zeigte für die Konjugatbildung eine Ausbeute von 75 % an.

BEISPIEL 9

Verwendung des Konjugates (NANP)&sub2;&sub0;-TT Nr. 2 für die in-vivo-Produktion von Anti-NANP-Antikörpern

Der Versuch wurde unter Verwendung von 3 Stämmen von Mäusen durchgeführt:
- C57/8L/6-Mäuse, welche von Natur aus auf das (NANP)&sub4;&sub0; ansprechen;
- CBA/ca- und DBA/2-Mäuse, welche auf das (NANP)&sub4;&sub0; nicht ansprechen.
Das Ziel des Versuches besteht darin, aufzuzeigen, daß das TT=2-Peptid dann, wenn es kovalent an das (NANP)&sub2;&sub0; gebunden ist, befähigt ist, die Anzahl von Mäusestämmen zu erhöhen, welche ihrerseits befähigt sind, auf das Antigen NANP anzusprechen.
50 ug des (NANP)&sub2;&sub0;-TT Nr. 2-Konjugates, welches in einem endgültigen Volumen von 50 ul von komplettem Freunds-Adjuvans (CFA) aufgelöst war, wurden an der Basis des Schwanzes der betreffenden Mäuse injiziert.
Nach 3 Wochen wurden den Mäusen in der obigen Weise 25 ug des Konjugates injiziert, welches in 25 ul von unvollständigem Freunds-Adjuvans (ICFA) emulgiert war (Booster-Dosis). 10 Tage nach der Booster-Injektion wurde aus jeder Maus durch Anstechen des retro-orbitalen Venenplexus Blut abgezogen. Die Seren wurden dann wie von G. Del Giudice et al., J.Clin. Microbiol., 25 (1987), 91-96, beschrieben, in einem Enzym-Immun-ELISA-Assay unter Verwendung von (NANP)&sub4;&sub0; als Antigen geprüft.
Die Fig. 1, in welcher die vertikale Achse die optische Dichte darstellt, und die horizontale Achse die Serumverdünnungen darstellt, zeigt, daß sowohl die C57/8L/6-Mäuse als auch die CBA/ca-Mäuse hohe Zahlen von Anti-NANP-Antikörpern produzierten, während die DBA/2-Mäuse nach wie vor auf das Konjugat nicht ansprachen.

BEISPIEL 10

In-vitro-Proliferation von Human-T-Lymphozyten unter Verwendung der Konjugate (NANP)&sub2;&sub0;-TT Nr. 1 und (NANP)&sub4;&sub0;-TT Nr. 1

Für den Proliferationstest wurde eine Polystyrolplatte mit 96 flachbödigen Vertiefungen (Cluster, Cambridge) verwendet.
Jede Vertiefung wurde mit 2x10&sup4; für TT Nr. 1 spezifischen Human-T-Lymphozyten in 0,1 ml RPMI-c-Kulturmedium beimpft, welches aus RPMI-Wachstumsmedium (Gibco, Paisley, Schottland) bestand, welches mit Fetalkälberserum (10%), welches durch Erhitzen inaktiviert worden war, 2 mM L-Glutamin, 1 mM Natriumpyruvat, 5x10&supmin;&sup5; M 2-Mercaptoethanol und einem Gemisch nicht-essentieller Aminosäuren (1%) von Gibco ergänzt war.
Die T-Zellen wurden während 3 Tagen in einer 5% CO&sub2; enthaltenden Atmosphäre bei 37ºC in Gegenwart von verschiedenen Konzentrationen der zwei Konjugate (Fig. 2), und von 2x10&sup4; EBV-Zellen (autologen B-Lymphozyten, welche mit dem mit Mitomycin C behandelten Epstein-Barr-Virus transformiert worden waren), welche wie von Lanzavecchia (1985) (l.c.) beschrieben hergestellt worden waren, inkubiert.
Der Zweck der EBV-B-Zellen besteht darin, die Antigene darzubieten, und die Proliferation der für diese Antigene spezifischen T-Klone zu stimulieren. Am zweiten Tag wurden alle Kulturen während 16 bis 18 h mit 1 uCi (³H)-Thymidin radioaktiv markiert.
Nach Ablauf dieser Zeitspanne wurden die Zellen mit Hilfe eines Zellkollektors (Skatron, Lier, Norwegen) auf Glasfaserfiltern gesammelt.
Dann wurde die von den Zellen einverleibte Radioaktivität mit einem Scintillationszähler aufgrund der Anzahl der Zellen, welche Radioaktivität zeigten, bestimmt.
Die Ergebnisse des Proliferationstests sind als die Mittelwerte für die Zählimpulse je min (cpm) einer Doppelkultur plus Standardabweichung angegeben (Fig. 2).
Die einverleibte Radioaktivität, welche als das Verhältnis:
cpm der Kulturen mit Antigen/cpm der gleichen Kulturen ohne Antigen
ausgedrückt wird, nimmt spezifisch in dem Maße zu, wie die Antigenkonzentration zunimmt. Indem in dieser Weise vorgegangen wurde, wurde gefunden, daß alle geprüften T-Lymphozyten in Gegenwart der (NANP)&sub4;&sub0;-TT Nr. 1- und (NANP)&sub2;&sub0;-TT Nr. 1-Konjugate proliferierten, wodurch nachgewiesen wird, daß die Konjugatbildung mit dem B-Epitop des CSP-Proteins (NANP)n die Fähigkeit des TT Nr. 1-Peptides, als T-Epitop zu fungieren, nicht aufgehoben hatte.

Claims

1. Synthetische, zum Induzieren der Proliferation von Human-Th- Lymphozyten in Assoziation mit verschiedenen Molekülen des humanen Histokompatibilitäts-Hauptkomplexes befähigte Peptide, mit der nachstehenden Aminosäuresequenz:

2. Immunogenes Konjugat, bestehend aus einem synthetischen Peptidträger, der covalent an ein natürliches oder synthetisches Peptid- oder Polysaccharidhapten gebunden ist, das von einem interessierenden pathogenen Mittel abgeleitet ist, worin dieser Peptidträger die nachstehende Aminosäuresequenz aufweist:

3. Immunogenes Konjugat nach Anspruch 2, worin das Hapten von Viren oder Bakterien abgeleitet ist.

4. Immunogenes Konjugat nach Anspruch 3, worin das Hapten ein von Pneumococcen, Meningococcen, Haemophilus influenzae, Escherichia coli und hämolytischen Streptococcen abgeleitetes Polysaccharid ist.

5. Immunogenes Konjugat nach Anspruch 2, worin das Hapten ein synthetisches Peptid mit der Sequenz:

H-(Asn-Ala-Asn-Pro)n-OH

ist, worin n einen Wert von 3 bis 40 aufweist.

6. Immunogenes Konjugat nach Anspruch 2, das sich zur Herstellung von synthetischen Vaccinen eignet, die zum Induzieren einer protektiven Antikörperantwort gegenüber einem interessierenden pathogenen Mittel befähigt sind, welches Konjugat nicht oder nur geringfügig genetisch beschränkt ist.

7. Immunogenes Konjugat nach Anspruch 5, das sich zur Herstellung einer Antimalariavaccine eignet, die zum Induzieren einer protektiven Antikörperantwort gegenüber durch Plasmodium falciparum verursachten Infektionen befähigt ist, welches Konjugat nicht oder nur geringfügig genetisch beschränkt ist.

8. Synthetische, zum Induzieren einer protektiven Antikörperantwort beim Menschen gegenüber einem pathogenen Mittel befähigte Vaccine, welche nicht oder nur geringfügig genetisch beschränkt ist, umfassend (a) eine immunologisch wirksame Menge des in Anspruch 2 beanspruchten Konjugats und (b) ein physiologisch annehmbares Medium, sowie gegebenenfalls (c) ein Hilfsmittel.

9. Synthetische, zum Induzieren einer protektiven Antikörperantwort beim Menschen gegenüber Plasmodium falciparum befähigten Antimalariavaccine, die nicht oder nur geringfügig genetisch beschränkt ist, umfassend eine immunologisch wirksame Menge des in Anspruch 5 beanspruchten Konjugats.