DE69005352T2 - Antikörper enthaltende Verabreichungssysteme für biologische verhaltensändernde Stoffe. - Google Patents

Antikörper enthaltende Verabreichungssysteme für biologische verhaltensändernde Stoffe.

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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein das Gebiet der Immunkonjugate und genauer die Verwendung von Immunkonjugaten, um Modifikatoren des biologischen Ansprechvermögens Zielgeweben zuzuführen. Die Erfindung betrifft auch die Behandlung von Krebs mit Konjugaten aus monoklonalen Antikörpern (MoAb) und Modifikatoren des biologischen Ansprechvermögens bzw. Modifikatoren biologischer Reaktionen wie dem Tumor-Nekrose-Faktor (TNF).
  • Modifikatoren des biologischen Ansprechvermögens zeigen eine Vielzahl von Wirkungen auf eine Anzahl von Zellarten. Säugetierzellen erzeugen eine Konstellation von Lymphokinen und Cytokinen, um die Homöostase auf dem Zellpegel zu halten. Außerdem können als Reaktion auf eine Vielzahl von Stimuli Säugetierzellen eine Menge von Proteinprodukten erzeugen und ausscheiden. In physiologischen oder pharmakologischen Konzentrationen können Modifikatoren des biologischen Ansprechvermögens, wie z.B. IFN-α, IFN-β, IFN-gamma, IL-1 bis IL-7, TNF-α und TNF-β alle starke cytotoxische Wirkungen haben. Der Tumor-Nekrose-Faktor (TNF) ist einer von einer Anzahl von Modifikatoren des biologischen Ansprechvermögens, der eine pleiotrope Wirkung hat. Der Ausdruck TNF stammt aus der ursprünglichen Beobachtung, daß TNF eine Nekrose von Meth-A-Mäusesarkomen verursachte. Die Antitumor-Wirkung von TNF wurde am besten gezeigt an einer Anzahl von tierischen und menschlichen Tumorzellen in vitro und in vivo. Es wurde gezeigt, daß der rekombinante Human-TNF eine Tumornekrose bei Sarkomen, Adenokarzinomen und Melanomen verursacht. TNF hat divergente Wirkungen auf das Zellwachstum, wobei es bei einigen Zellinien eine Wachstumshemmung verursacht, bei anderen Zellinien keine Wirkung hat (d. h. weniger als 5% Cytostase oder Cytotoxizität) und bei anderen Zellen das Wachstum verbessert. TNF kann auch die Knochenresorption erhöhen und die prokoagulierende Aktivität von Endothel-Zellen verbessern. Der Mechanismus/die Mechanismen dieser pleiotropen Effekte wird nicht vollständig verstanden. Während IL-1, ein anderer Modifikator des biologischen Ansprechvermögens, einige biologische Eigenschaften mit TNF teilt, hat IL-1 viele Eigenschaften, die sich von denen von TNF unterscheiden.
  • Jedoch muß der Modifikator für das biologische Ansprechvermögen, um eine Wirkung auf eine Zelle auszuüben, die Zielzelle in einer Konzentration erreichen, die ausreicht, um die gewünschte Wirkung zu erzeugen.
  • Bei der kürzlichen Entdeckung der Modifikatoren des biologischen Ansprechvermögens und der Aufklärung der Fülle von Wirkungen, die durch sie verursacht werden, wurden große Erwartungen dahingehend erzeugt, daß eine Heilung für schwer zu behandelnde Krankheiten, wie z.B. Krebs, bevorstand. Dies konnte jedoch nicht gezeigt werden. Ein Hinderungsgrund kann die Unfähigkeit sein, eine ausreichende Menge des Modifikators des biologischen Ansprechvermögens dem Zielgewebe oder der Zielzelle zuzuführen, um die Wirkung zu verursachen. Wenn Arzneimittel oder andere cytoaktive Mittel an einen Patienten verabreicht werden, werden viele, wenn nicht alle, in dem Wirtskörper verdünnt und bis zu einem gewissen Grad durch das Wirtsgewebe metabolisiert. So müssen in vielen Fällen diese cytoaktiven Mittel in viel höheren Mengen verabreicht werden als es notwendig ist, um die gewünschten Wirkungen zu erreichen, um der Verdünnung, der Absorption und dem Metabolismus durch Nicht-Zielgewebe Rechnung zu tragen.
  • Krebs ist eine der führenden Ursachen von Krankheiten und Sterblichkeit in der westlichen Welt. Es gibt viele verschiedene Arten von Krebs, die jeweils ihre eigenen Kennzeichen haben. Jedoch teilen die Krebsarten zumindestens einige Eigenschaften, sie betreffen Schäden in dem Verfahren der Steuerung des Zellwachstums. Brustkrebs und Gebärmutterhalskrebs sind zwei der Hauptursachen des Todes durch Malignität bei Frauen in der westlichen Welt. Melanome sind eine sehr stark metastatische Erkrankung, die beide Geschlechter betrifft und fast einheitlich innerhalb von 5 Jahren nach der Diagnose tödlich ist. Die chirurgische Entfernung lokalisierter bösartiger Tumoren hat sich nur dann als wirksam erwiesen, wenn die Krankheit nicht von der Primärläsion ausgebreitet worden war. Wenn die Krankheit sich einmal verbreitet hat, müssen die chirurgischer Verfahren ergänzt werden durch andere allgemeinere Verfahren, um erkrankte oder maligne Zellen auszulöschen. Die meisten der üblicherweise verwendeten alternativen therapeutischen Ansätze, wie Bestrahlung oder Chemotherapie, begrenzen ihre Wirkungen nicht nur auf die Tumorzellen und beeinflussen oft normale Zellen in einem gewissen Ausmaß, obwohl sie eine proportional größere destruktive Wirkung auf maligne Zellen haben.
  • Viele Tumoren oder Krebszellen exprimieren membrangebundene oder cytoplasmatische Antigene oder Antigen-Determinanten, die von normalen Zellen entweder sehr schwach oder überhaupt nicht exprimiert werden. Einige Tumorzellen exprimieren Antigene, die sich auch in oder an Zellarten von Embryos befinden, nicht aber von normalen Zellen einem reifen Tieres exprimiert werden. Diese abnormal exprimierten Antigene sind bekannt als tumorspezifische oder tumorassoziierte Antigene (TAA). Die TAA sind spezifisch, da sie gewöhnlich von allen oder den meisten Zellen des jeweiligen Tumors, der sie exprimiert, exprimiert werden, während ein spezielles Antigen von mehr als einem Tumor exprimiert werden kann. Eine Tumorzelle kann ein oder mehrere TAA exprimieren. Diese tumorassoziierten Antigene können an der Oberfläche der Zelle (Zelloberflächen-Antigene) exprimiert werden, können von der Tumorzelle ausgeschieden werden (ausgeschiedene Antigene) oder können innerhalb der Zelle bleiben (intrazelluläre Antigene). Zwar wird angenommen, daß membrangebundene oder Zelloberflächen-Antigene eine Hauptrolle bei der Wechselwirkung zwischen Tumorzellen und dem Immunsystem des Wirts spielen, jedoch sind cytoplasmatische Antigene auch nützlich, um die Tumorbildung zu überwachen, da diese Antigene oft in großen Mengen von den Tumorzellen ausgeschüttet werden.
  • Die Gegenwart dieser tumorassoziierten Antigene wurde verwendet, um Tumoren bei Tieren und Menschen nachzuweisen, zu diagnostizieren und zu lokalisieren. In einigen Fällen ließ die Gegenwart von tumorassoziierten Antigenen das gezielte Zuführen spezifischer Arzneimittel und Behandlungsmittel zu den Tumorzellen zu.
  • Antikörper sind Proteine, die normalerweise vom Immunsystem eines Tieres als Reaktion auf Fremd-Antigene oder Antigendeterminanten erzeugt werden. Antikörper binden ein spezifisches Antigen, gegen das sie gerichtet sind. Monoklonale Antikörper (MoAb), die gegen spezifische Antigene oder Antigendeterminanten gerichtet sind, können in großer Mengen hergestellt werden. Monoklonale Antikörper für tumorassoziierte Antigene lokalisieren sich in Tumoren nach einer systemischen Verabreichung an Patienten mit Krebs. Diese wichtige Eigenschaft wurde erfolgreich verwendet, um Arzneimittel, Toxine oder radioaktive Isotope direkt zu den Tumoren zu bringen.
  • Ein Verfahren, um chemotherapeutische Mittel gezielt zu Tumorzellen zu bringen und deren Wirkung auf normale Zellen zu vermindern, wurde möglich mit der Entwicklung von Antikörpern und bevorzugter MoAb's, die gegen Antigene auf Tumorzellen gerichtet sind, die nicht auf normalen Zellen auftreten.
  • Antikörper, gekuppelt an Arzneimittel, wurden verwendet als Zuführsystem, mit dem das Arzneimittel gezielt einer spezifischen Tumorzellart, gegen die der Antikörper gerichtet ist, zugeführt werden kann. Antikörper können auch an Toxine gekuppelt werden und somit als Zuführsystem für das gezielte Zuführen von Toxinen direkt zu spezifischen Tumorzellen dienen. Ein spezieller Vorteil der Verwendung eines Antikörpers, der an ein Arzneimittel oder ein Toxin gekuppelt ist, als Zuführsystem, um das Arzneimittel oder Toxin dem spezifischen Tumor gezielt zuzuführen, ist die Fähigkeit, das Arzneimittel oder die Verbindung an der gewünschten Stelle zu konzentrieren. Ohne ein spezifisches gezieltes Zuführsystem wird die an einen Patienten verabreichte Verbindung in dem gesamten Wirtskörper verteilt und daher wird die Konzentration, die die gewünschte Zielstelle erreicht, stark verdünnt. Die Verwendung eines Antikörper- Zielsystems verursacht, daß die verabreichte Verbindung, die an den Antikörper gebunden oder konjugiert ist, an Zellen der Zielstelle gebunden wird oder in große Nähe dazu kommt. Da der mit der verabreichten Verbindung konjugierte Antikörper an die Zielzellen in einer höheren Rate bindet als an andere (d. h. normale Zellen), wird die Verbindung an der Zielstelle konzentriert.
  • Die Verbindung von cytotoxischen Mitteln mit Antikörpern zur Herstellung von "Immunotoxinen" wurde berichtet. Von speziellem Interesse waren Immunotoxine monoklonaler Antikörper konjugiert mit enzymatisch aktiven Teilen (A-Ketten) von Toxinen bakteriellen oder pflanzlichen Ursprungs, wie z.B. Ricin oder Abrin. Nevelle und York, Immunol. Rev. (1982) 62: 75-91; Ross et al., European J. Biochem. 1980) 104; Vitteta et al., Immunol. Rev. (1982) 62: 158-183; Ross et al., Cancer Res. (1982) 42: 457-464; Trowbridge and Domingo Nature (Cond.) (1981) 294: 171-173. Immunotoxine wurden hergestellt, indem MoAb's mit Toxinen oder Fragmenten von Toxinen, die sich von Pflanzen ableiten, konjugiert wurden. Gelonin und Ricin sind die aktivsten von Pflanzen abgeleiteten Toxine zur Hemmung der Proteinsynthese.
  • Die Konjugation von Gelonin an Antikörper wurde beschrieben in EP-A-0350230 und die Verwendung von mit Gelonin konjugierten Immunotoxinen wurde berichtet für die Behandlung verschiedener Arten von Krebs.
  • WO 8500974 offenbart Komplexe von α-Interferon mit einem monoklonalen Antikörper, der die Serum-Halbwertszeit von Interferon, das als Komplex verabreicht wird, gegenüber Interferon, das allein verabreicht wird, erhöht.
  • J. E. Zuckerman et al., Proceedings of AACR, Band 28, 1987 (1522) offenbart das Kuppeln von Interferon an den monoklonalen Antikörper ZME-018 unter Verwendung von SPDP.
  • EP-A-0305967 offenbart verschiedene Methoden zur Konjugation von Cytokinen mit Antikörpern.
  • Obwohl Antikörper als Zuführsysteme für toxische Anteile von pflanzlichen Toxinen oder anderen cytotoxischen Arzneimitteln verwendet wurden, war die Konjugation von Antikörpern mit Modifikatoren des biologischen Ansprechvermögens, wie z.B. dem Tumor-Nekrose-Faktor und die Verwendung solcher Konjugate als spezifische Zuführsysteme zu Zielgeweben oder Zielzellen bisher nicht möglich.
  • Die vorliegende Erfindung ist gerichtet auf ein neues Antikörper-Zuführsystem für Modifikatoren des biologischen Ansprechvermögens. Die vorliegende Erfindung liefert eine Zusammensetzung, die ein Konjugat eines Antikörpers, der gegen das 15A8-Brustkarzinom-Antigen oder das ZME-018-Melanom-Antigen gerichtet ist, mit einem Anteil eines modifizierten, cytotoxischen Modifikators für biologisches Ansprechvermögen, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus TNF-α, TNF-β und IL-1, umfaßt, wobei der Anteil mit dem Antikörper konjugiert ist mit Hilfe eines bifunktionellen Protein-Kupplungsmittels. Vorzugsweise ist der Antikörper kovalent an den Modifikator des biologischen Ansprechvermögens gebunden. In einer Ausführungsform umfaßt das Tmmunkonjugat einen Antikörper, vorzugsweise den monoklonalen 15A8- oder ZME-018-Antikörper und TNF-α, TNF-β oder IL-1, die kovalent gekuppelt sind. Alternativ kann das Immunkonjugat ein Fusionsprotein sein, das durch gentechnische Methoden hergestellt wurde, die dem Fachmann bekannt sind. Ein solches Fusionsprotein würde die Antigen-Erkennungsstelle eines Antikörpermoleküls und den cytotoxischen Anteil des Modifikators des biologischen Ansprechvermögens enthalten.
  • Da normale ebenso wie Tumorzellen Oberflächenrezeptoren für Modifikatoren des biologischen Ansprechvermögens, wie z.B. TNF aufweisen, verbessert ein Zuführsystem für TNF zu spezifischen Ziel-Tumorzellen die Wirksamkeit der Behandlung mit TNF. Zusätzlich wird ein Zuführsystem, das selektiv Modifikatoren für das biologische Ansprechvermögen Zellen zuführt, bei denen sie eine nicht cytotoxische Wirkung haben, zur Verfügung gestellt.
  • Als Konsequenz der Konzentration der Verbindung an der Zielstelle kann die Dosis der mit Antikörper konjugierten Verbindung, die verabreicht werden muß, um eine biologische Reaktion bzw. ein biologisches Ansprechen zu erhalten z.B. eine Zelltötung, eine Verbesserung des Wachstums oder eine Enzyminduktion, um Größenordnungen geringer sein, als die, die erforderlich ist, wenn die unkonjugierte Verbindung verabreicht wird.
  • Ein weiterer Vorteil bei Verwendung eines mit Antikörper konjugierten Antikörper-Zuführsystemes für chemische oder biologische Verbindungen ist die verlängerte Aufenthaltszeit der Verbindung in dem Wirtssystem aufgrund des verminderten Metabolismus und/oder einer langsameren Elininierungsrate der konjugierten Verbindung durch den Wirt. Da der Kontakt des Wirtes mit einer cytoaktiven Verbindung verlängert wird wegen der verminderten Metabolismusund/oder Eliminierungrate, können geringere Dosen der cytoaktiven Verbindung verabreicht werden, wobei die biologischen Wirkungen in der gleichen Größenordnung erreicht werden, die vorher nur mit höheren Dosen erreicht wurden. Der Mechanismus des Metabolismus und der Eliminierung bioaktiver Verbindungen ist allgemein verbindungsspezifisch und kaum ganz verstanden. Die Rate an Metabolismus und/oder Eliminierung fast aller, wenn nicht aller bioaktiven Verbindungen ist langsamer, wenn die bioaktive Verbindung an einen Antikörper gekuppelt ist.
  • In einer Ausführungsform liefert die Erfindung eine cytotoxische Zusammensetzung, die selektiv an Tumorzellen bindet und diese tötet. Diese Ziel-Tumorzellen können von irgendeinem Tumor sein, der einen antigenen Marker hat oder erzeugt in Mengen, die größer sind als die, die sich in oder an normalen Zellen finden. Obwohl bevorzugt der antigene Marker oder die TAA ein Zelloberflächen-Antigen ist, ist die vorliegende Erfindung auch genauso anwendbar für Tumorzellen, die ein intrazelluläres Antigen erzeugen in Mengen, die größer sind als die normalerweise von normalen Zellen produzierten. Es ist bekannt, daß viele Tumoren intrazelluläre Antigene produzieren und entweder ausscheiden oder diese Antigene freisetzen, wenn der Tumor nekrotisch wird. Das Immunkonjugat der vorliegenden Erfindung lokalisiert auch die Tumorstellen, an denen diese intrazellulären Antigene in höherer Konzentration als in normalem Gewebe auftreten.
  • In einer weiteren Ausführungsform liefert die Erfindung cytotoxische Zusammensetzungen, die selektiv an Human- Brustkrebs-Zellen, Gebärmutterhals-Karzinom-Zellen und Melanomzellen binden und für sie cytotoxisch oder cytostatisch sind.
  • Die Anwendungen der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen schließen die Verwendung in einem Verfahren zur Abtötung von menschlichen Brustkrebszellen, Gebärmutterhals-Karzinom-Zellen, Melanomzellen oder anderen Tumorzellen die tumorassoziierte Antigene exprimieren, ein, indem die Zellen mit einer zellschädigend wirksamen Menge der Immunotoxin-Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung in Kontakt gebracht werden.
  • Das Immunkonjugat der vorliegenden Erfindung kann verwendet werden, um ein cytotoxisches Immunkonjugat den Brust-Tumorzellen zuzuführen, die das 15A8-Antigen exprimieren (das Antigen, das von den monoklonalen Antikörpern, die in US-A- 5 032 521 offenbart und beansprucht sind, erkannt wird).
  • In einer weiteren Ausführungsform liefert die vorliegende Erfindung ein Immunkonjugat, das an Melanom-Tumorzellen bindet und für diese cytotoxisch oder cytostatisch ist. Melanom-Zellen exprimieren auch verschiedene TAA. Wilson et al., 1981 Int. J. Cancer 28: 293 haben zwei solche Melanom- Antigene beschrieben und monoklonale Antikörper dagegen hergestellt. Einer dieser Antikörper (225.28S), der von Wilson diskutiert wird, erkennt ein Melanom-Membran-Antigen. Dieses Antigen wird hier mit ZME-018 bezeichnet.
  • In einer weiteren Ausführungsform liefert die vorliegende Erfindung ein Immunkonjugat, das an Zellen bindet, die das ZME-018-Antigen oder ein funktionelles Äquivalent davon exprimieren, und ist cytotoxisch oder cytostatisch dafür.
  • Das Immunkonjugat der vorliegenden Erfindung kann auch einen Antikörper umfassen, der ein cytoplasmatisches Antigen erkennt, einschließlich dem 465.12-Antikörper von Wilson, der mit einem cytoplasmatischen Melanom-Antigen reagiert, ist aber nicht darauf beschränkt.
  • Es ist eine Aufgabe der Erfindung, Konjugate von Antikörpern mit Modifikatoren des biologischen Ansprechvermögens zur Verfügung zu stellen.
  • Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine Zusammensetzung zur Verfügung zu stellen, die ein Konjugat eines Antikörpers, der gegen ein tumorassoziiertes Antigen gerichtet ist, mit einem Anteil eines Modifikators des biologischen Ansprechvermögens umfaßt.
  • Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine Zusammensetzung bereitzustellen, die eine rekombinant erzeugte Verbindung umfaßt, die einen Antikörper-Anteil und einen Modifikator für das biologische Ansprechvermögen umfaßt, wobei der Modifikator für das biologische Ansprechvermögen ein cytotoxischer Anteil des Modifikators des biologischen Ansprechvermögens ist.
  • Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Immunkonjugat eines gegen das 15A8-Brustkarzinom-Antigen oder das ZME-018-Melanom-Antigen gerichteten Antikörpers mit einem Anteil des Modifikators des biologischen Ansprechvermögens bereitzustellen, wobei dieser Anteil ausgewählt ist aus dem cytoaktiven Bereich von TNF-α, TNF-β und IL-1.
  • Eine weitere Aufgabe ist es, Zusammensetzungen bereitzustellen, die für ein Verfahren zur Behandlung proliferativer Zellerkrankungen, wie z.B. Krebs verwendet werden können, das umfaßt, daß man eine zellschädigend wirksame Dosis eines Immunkonjugats, das einen Antikörper oder einen Antikörperteil, der gegen TAA der Zielzelle gerichtet ist, konjugiert mit dem Modifikator des biologischen Ansprechvermögens oder einem cytoaktiven Anteil davon, an einen Patienten, der eine derartige Behandlung benötigt, verabreicht.
  • Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, Zusammensetzungen bereitzustellen, die in einem Verfahren zur Verhütung des Wiederauftretens von Tumoren verwendet werden können, das die Verabreichung von mit TNF konjugierten monoklonalen TAA-Antikörpern an einen Patienten, der eine derartige Behandlung benötigt, umfaßt.
  • Es ist eine weitere Aufgabe, ein Immunkonjugat bereitzustellen, das ein Genfusionsprodukt ist, das rekombinant durch Fusion eines Gens, das die antigene Erkennungsstelle eines monoklonalen Antikörpers kodiert, mit einem Ger, das einen Modifikator des biologischen Ansprechvermögens oder den cytoaktiven Anteil davon kodiert, wie z.B. TNF-α, TNF-β und IL-1 kodiert, hergestellt wurde.
  • Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein selektives Zuführsystem für Modifikatoren des biologischen Ansprechvermögens für spezifische Zielstellen bereitzustellen.
  • Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, das Wiederauftreten von tumorassoziierte Antigene tragenden Tumoren zu verhindern durch Verabreichung von zellschädigend wirkenden Immunkonjugaten, die einen Modifikator des biologischen Ansprechvermögens und einen Antikörper umfassen, an einen Patienten, der eine solche Behandlung benötigt. Vorzugsweise ist der Antikörper ein monoklonaler Antikörper und der Modifikator des biologischen Ansprechvermögens ist TNF.
  • Eine der Aufgaben der vorliegenden Erfindung ist es eine cytotoxische Zusammensetzung bereitzustellen, die spezifisch an Tumorzellen bindet und diese tötet.
  • Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine Zusammensetzung bereitzustellen, die für Tumorzellen toxisch ist, aber bei normalem Gewebe nur minimale Schäden verursacht.
  • Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine Zusammensetzung bereitzustellen, die einen Antikörper, der gegen ein tumorassoziiertes Antigen, wie z.B. ein tumorassoziiertes Antigen eines Brusttumors oder eines Melanoms konjugiert mit einem Modifikator des biologischen Ansprechvermögens, ausgewählt aus TNF-α, TNF-β und IL-1 umfaßt.
  • Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine pharmazeutische Zusammensetzung bereitzustellen, die ein Immunkonjugat eines Modifikators des biologischen Ansprechvermögens, ausgewählt aus TNF-α, TNF-β und IL-1 in einem pharmazeutisch annehmbaren Träger umfaßt.
  • Figur 1 zeigt eine S-300-Gelpermeations-Chromatographie der ZME-TNF-Reaktionsmischung.
  • Figur 2 zeigt das chromatographische Profil der gesammelten Fraktionen der S-300-Chromatographie nach einer Affinitäts-Chromatographie.
  • Figur 3 zeigt den Vergleich der Bindung des ZME-018-TNF- Konjugats und von freiem TNF an antigenpositive A-375-Zielzellen und antigennegative T-24-Zellen.
  • Figur 4 zeigt die Cytotoxizität des ZME-TNF-Immunkonjugats und von TNF alleine bei antigenpositiven humanen Melanomzellen (AAB-527).
  • Figur 5 zeigt die Hemmung des Wachstums bei antigenpositiven A-375-Zellen durch TME-TNF-Immunkonjugat.
  • Figur 6 zeigt die Hemmung des Wachstums bei antigenpositiven ME-180-Zellen durch MoAb15A8-TNF-Immunkonjugat.
  • Die immunochemischen Derivate der Erfindung umfassen Konjugate eines Antikörpers, der gegen ein tumorassoziiertes Antigen gerichtet ist und eines Modifikators des biologischen Ansprechvermögens.
  • Modifikatoren des biologischen Ansprechvermögens, die mit dem gegen ein tumorassoziiertes Antigen gerichteten Antikörper gekuppelt werden können und erfindungsgemäß verwendet werden können, schließen TNF-α, TNF-β und IL-1 ein. Diese Modifikatoren des biologischen Ansprechvermögens haben eine Vielzahl von Wirkungen auf Tumorzellen. Zu diesen Wirkungen gehören eine erhöhte Tumorzell-Tötung durch direkte Wirkung ebenso wie eine erhöhte Tumorzell-Tötung durch eine Erhöhung der durch Wirtsabwehr vermittelten Prozesse. Die Konjugation des gegen ein tumorassoziiertes Antigen gerichteten Antikörpers mit diesen Modifikatoren des biologischen Ansprechvermögens erlaubt die selektive Lokalisierung innerhalb von Tumoren und damit verbesserte antiproliferative Wirkungen, während nicht spezifische Wirkungen, die zu einer Toxizität für Nicht-Zielzellen führen, unterdrückt werden.
  • Die spezifische Antikörper-Zuführung von Cytotoxinen zu Tumoren liefert einen Schutz der empfindlichen Stellen, wie z.B. der Leber, der Niere und des Knochenmarks vor der schädlichen Wirkung der natürlich auftretenden toxischen Mittel. Die Verwendung von mit Antikörpern konjugierten Modifikatoren des biologischen Ansprechvermögens als Zuführsystem läßt eine niedrigere Dosierung des Arzneimittels selbst zu, da alle toxischen Anteile mit Antikörpern konjugiert sind, die sich innerhalb des Tumors oder an anderen Zielstellen ansammeln.
  • Konjugate des monoklonalen Antikörpers können hergestellt werden unter Verwendung einer Vielzahl von bifunktionellen Protein-Kupplungsmitteln. Beispiele für diese Reagenzien sind SPDP, IT, bifunktionelle Derivate von Imidoestern, z.B. Dimethyladipidat.HCl, aktive Ester, z.B. Disuccinimidylsuberat, Aldehyde, z.B. Glutaraldehyd, Bisazido-Verbindungen, z.B. Bis(p-azidobenzoyl)hexandiamin, Bis-diazonium-Derivate, z.B. Bis-(p-diazoniumbenzoyl)ethylendiamin, Diisocyanate, z.B. Tolylen-2,6-diisocyanat und bis- aktive Fluorverbindungen, z.B. 1,5-Difluor-2,4-dinitrobenzol.
  • Die für die Immunkonjugate verwendeten Antikörper sind vorzugsweise monoklonale Antikörper und am meisten bevorzugt monoklonale Antikörper, die gegen einen spezifischen pathologischen Zustand gerichtet sind, einschließlich Krebs, z.B. Brustkrebs und Melanome. Die Immunkonjugate der vorliegenden Erfindung liefern, wenn sie aus nicht Wirts-Antigenen zusammengesetzt sind, ein selektives Zuführmittel für die Zuführung von cytotoxischen oder cytostatischen Modifikatoren des biologischen Ansprechvermögens zu pathogen infizierten Wirtszellen.
  • Der Ausdruck "monoklonaler Antikörper", wie er hier verwendet wird, bedeutet eine Antikörper-Zusammensetzung mit einer homogenen Antikörper-Population. Er soll nicht beschränkt sein im Hinblick auf die Quelle des Antikörpers oder die Art, wie er gemacht wird.
  • Zum Beispiel exprimieren Brustkarzinom-Zellen ein 22/kD- Antigen auf ihrer Zelloberfläche. Antikörper gegen dieses Antigen wurden erzeugt. Hybridomas, die spezifische monoklonale Antikörper der IgG1-, IgG2a- und IgG2b-Isotypen ausscheiden, die ein Epitop auf diesem 22/kD-Antigen erkennen, wurden erzeugt. Alle Isotypen erkennen dasselbe Epitop auf dem Antigen. Für die Zwecke weiterer Beispiele bei der Beschreibung dieser Erfindung wird dieses Epitop als das 15A8-Epitop bezeichnet. Somit sind alle diese Antikörper funktionell äquivalent. Außerdem sind bei Durchführung der Erfindung Antikörper, die an verschiedene antigene Determinanten an dem gleichen Antigen binden, d. h. verschiedene Epitope erkennen, auch funktionell äquivalent.
  • Monoklonale Antikörper können hergestellt werden mit Methoden, die dem Fachmann auf diesem Gebiet bekannt sind. Das Verfahren zur Herstellung von Hybridoma-Zellkulturen, die z.B. 15A8-MoAb produzieren, ist im Detail beschrieben in US-A-5 032 521, die eine Continuation in part Anmeldung von EP-A-0184-369 (veröffentlicht am 11. Juni 1986) ist. Kurz gesagt wurden Brustdrüsen-Tumorzellen in BALB/c Mäuse intraperitoneal drei Wochen lang injiziert bei insgesamt 3 bis 4 Injektionen. Die Milz wurde jeweils drei Tage nach der letzten Injektion geerntet und eine Milz-Zellsuspension wurde hergestellt und mit 107 PAI-Mezelom-Zellen fusioniert. Die Hybridzellen wurden auf Hypoxanthin-Aminopterin- Thymidin-(HAT)-Medium selektiert. Weitere Details zur Herstellung der Hybridoma und die Kennzeichnung dieser monoklonalen Antikörper ist in den Beispielen unten angegeben. Jedoch können monoklonale Antikörper, die gegen irgendein TAA hergestellt werden, mit irgendeinem bekannten Verfahren für die Immunkonjugate der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
  • Der Ausdruck "tumorassoziiertes Antigen" soll jedes Antigen umfassen, das in bedeutend höherer Konzentration in oder an Tumorzellen als an normalen Zellen gefunden wird.
  • Modifikatoren des biologischen Ansprechvermögens, wie z.B. TNF, können aus Seren von intakten Tieren, Kulturüberständen von Lymphzellen oder Zellinien erhalten werden, nachdem Tiere oder Zellen mit einer Substanz behandelt wurden, von der bekannt ist, daß sie die Proliferation von Immunzellen stimuliert (ein Induktor) oder durch rekombinante Technologie. Der Modifikator des biologischen Ansprechvermögens kann aus irgendeiner Säugetierquelle erhalten werden z.B. von Mäusen, Kaninchen, Ratten, Primaten, Schweinen und Menschen. Vorzugsweise werden solche Proteine aus einer menschlichen Quelle erhalten und bevorzugter sind rekombinante menschliche Proteine. Danach wird das Serum, der Überstand oder der Zellbrei geerntet und auf eine biologische Aktivität gegenüber einer Ziel-Tumorzellinie getestet.
  • Der Ausdruck "rekombinantes Protein" bezieht sich auf ein Protein mit einer mit dem nativen Protein vergleichbaren biologischen Aktivität, das durch rekombinante DNA-Technik hergestellt wurde, wie es im Stand der Technik bekannt ist.
  • Rekombinante DNA-Techniken sind auf diesem Gebiet bekannt. Allgemein wird das Gen, das ein spezifisches Protein kodiert, z.B. Interferon oder TNF, aus dem nativen Plasmid herausgeschnitten und in einen Klonierungsvektor, um kloniert zu werden, und dann in einen Expressionsvektor insertiert, der verwendet wird, um einen Wirtsorganismus zu transformieren, vorzugsweise einen Mikroorganismus und am meisten bevorzugt E. coli. Der Wirtsorganismus exprimiert das Fremdprotein-Gen unter bestimmten Bedingungen unter Erzeugung des spezifischen Proteins, z.B. TNF oder Interferon. Zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung müssen die rekombinant erzeugten Modifikatoren des biologischen Ansprechvermögens nicht identisch in der Struktur sein, noch müssen sie den identischen Bereich an biologischen Aktivitäten des nativen Proteins exprimieren, solange sie die Aktivität behalten, die der Zielstelle zugeführt werden soll.
  • Die biologische Aktivität des Modifikators des biologischen Ansprechvermögens und des Immunkonjugierten Modifikators des biologischen Ansprechvermögens können gemessen werden mit Methoden, die im Stand der Technik beschrieben sind. Zum Beispiel kann die cytotoxische Aktivität von TNF gemessen werden unter Verwendung eines L-929-Fibroblasten-Zelltestsystems, wie in Beispiel 2 unten beschrieben.
  • Antikörper, wie z.B. 15A8G2 oder ZME-018 wurden mit SPDP modifiziert, wie in Beispiel 5 unten beschrieben und dann mit einem mit Iminothiolan modifizierten TNF konjugiert, wie in den Beispielen 3 und 6 unten beschrieben. Der mit TNF konjugierte Antikörper wurde mit Säulenchromatographie auf einer Sephadex S-300 Säule gereinigt, wie in Beispiel 7 unten beschrieben.
  • Die Toxizität des mit TNF konjugierten Antikörpers wurde bestimmt mit dem L-929-Fibroblasten-Test und die antiproliferative Aktivität wurde mit in vitro Tests bestimmt.
  • Die Immunochemikalien der vorliegenden Erfindung können verwendet werden, um Tumorzellen in vitro ebenso wie in vivo abzutöten. Zum Beispiel kann das Knochenmark in klinischen Situationen, wenn Metastasen im Knochenmark aufgetreten sind, von Tumorzellen extrakorporal gereinigt werden. Dies ist oft notwendig, wenn ein Tumor strahlenempfindlich ist und eine Gesamtkörperbestrahlung eine erforderliche Behandlung ist. Wenn das Knochenmark des Patienten selbst von allen Tumorzellen befreit werden kann, dann kann es aus dem Patienten vor der Bestrahlung entfernt werden, extrakorporal von Tumorzellen befreit werden und dem Patienten zurückgeführt werden, um durch die Bestrahlung zerstörte Knochenmarkzellen zu ersetzen. Wenn die Konjugate verwendet werden, um z.B. menschliche Brustkrebszellen in vitro abzutöten, werden sie typischerweise dem Zellkulturmedium in einer Konzentration von mindestens etwa 10 nm zugegeben. Die Formulierung und die Art der Verabreichung für die in vitro-Verwendung sind nicht kritisch. Wäßrige Formulierungen, die mit dem Kultur- oder Perfusionsmedium kompatibel sind, werden normalerweise verwendet. Die Cytotoxizität kann mit konventionellen Techniken abgelesen werden, um die Gegenwart oder den Grad der verbleibenden Brustkrebszellen zu bestimmen.
  • Die Verabreichung der Immunkonjugate der vorliegenden Erfindung an einen Patienten, bei dem ein Tumor mit einer spezifischen antigenen Determinante diagnostiziert wurde, läßt es zu, das cytotoxische Mittel gezielt an die Stelle, wo es gebraucht wird, um die Tumorzellen abzutöten, zu bringen und zu konzentrieren. Indem die cytotoxischen Mittel so gezielt hingebracht werden, wird eine nicht spezifische Toxizität gegenüber anderen Organen, Geweben und Zellen eliminiert oder vermindert.
  • Wenn die Immunotoxine für eine in vivo Therapie verwendet werden, werden sie dem Patienten in therapeutisch wirksamen Mengen verabreicht (d. h. Mengen, die den Tumor des Patienten entfernen oder vermindern). Sie werden normalerweise parenteral verabreicht, entweder intravenös oder intraperitoneal. Die Dosis und der Dosierungsplan hängen ab von der Art des Krebses (primär oder Metastasen) und seiner Population, den Eigenschaften des jeweiligen Immunkonjugats, z.B. seiner therapeutischen Breite, dem Patienten und der Krankengeschichte. Die Menge an verabreichtem Immunotoxin liegt typischerweise im Bereich von etwa 0,1 bis etwa 10 mg/kg Patientengewicht. Für die parenterale Verabreichung werden die Immunkonjugate in einer injizierbaren Einheitsdosierungsform (Lösung, Suspension, Emulsion) zusammen mit einem pharmazeutisch annehmbaren parenteralen Träger formuliert. Solche Träger sind inhärent nicht toxisch und nicht therapeutisch. Beispiele für solche Träger sind Wasser, Kochsalzlösung, Ringer-Lösung, Dextroselösung und 5 % Humanserumalbumin. Nicht wäßrige Träger, wie feste Öle und Ethyloleat können auch verwendet werden. Liposomen können auch als Träger verwendet werden. Der Träger kann geringere Mengen an Additiven enthalten, z.B. Substanzen, die die Isotonizität und chemische Stabilität verbessern, z.B. Puffer und Konservierungsmittel. Das Immunkonjugat wird typischerweise in solchen Trägern in Konzentrationen von etwa 0,1 mg/ml bis 10 mg/ml formuliert.
  • Das Immunkonjugat der vorliegenden Erfindung wird dann in einem nicht toxischen, inerten, pharmazeutisch annehmbaren Trägermedium formuliert, vorzugsweise mit einem pH von etwa 3 bis 8, bevorzugter 6 bis 8.
  • Der Dosierungsgrad des Immunkonjugats hängt ab von den Daten für die in vivo-Wirksamkeit, die nach einem vorklinischen Test erhalten wurden und hängt hauptsächlich ab von dem jeweiligen verwendeten Modifikator des biologischen Ansprechvermögens und davon, ob er allein oder in Kombination mit anderen Arzneimitteln oder Modifikatoren des biologischen Ansprechvermögens verwendet wird.
  • Das pharmazeutische Präparat, wie oben beschrieben, ist geeignet für die parenterale Verabreichung an Menschen oder andere Säugetiere in therapeutisch wirksamen Mengen (d. h. Mengen, die den pathologischen Zustand des Patienten eliminieren oder vermindern), um eine Therapie zu liefern, wobei die Art der Therapie abhängig ist von dem spezifischen Modifikator des biologischen Ansprechvermögens, der mit dem Antikörper-Zuführsystem konjugiert ist.
  • Mit Antikörper konjugierte Modifikatoren des biologischen Ansprechvermögens, z.B. TNF, können in Kombination mit Interferon, vorzugsweise Human-β-interferon (IFN-β) verabreicht werden. IFN-β bezieht sich auf Immuninterferon mit einer dem nativen Interferon vergleichbaren biologischen Aktivität. Bevorzugt wird das Interferon durch rekombinante Technik hergestellt.
  • Die folgenden Beispiele liefern eine detaillierte Beschreibung der Herstellung, Kennzeichnung und Verwendung der erfindungsgemäßen Immunkonjugate.
    • Beispiel 1 Reinigung von TNF
  • TNF kann mit auf diesem Gebiet bekannten Techniken gereinigt werden. Zum Beispiel beschreiben Aggarwal et al. die Reinigung von TNF aus verschiedenen Quellen einschließlich verschiedener Zellinien monocytischen Ursprungs. Aggarwal (1986) Methods of Enzymology 116: 448.
  • Dieses Verfahren kann auch verwendet werden, um TNF aus anderen Quellen zu reinigen.
  • TNF wird vorzugsweise durch rekombinante Technik erhalten, die dem Fachmann auf diesem Gebiet bekannt ist. Eine solche Herstellung wird z.B. im Detail im US-Patent Nr. 4,677,063 und der Europäischen Patentschrift EP 186,214 beschrieben. Das TNF-Präparat, das verwendet wurde, um die folgenden Daten zu erhalten, die in den folgenden Beispielen dargestellt sind, wurde von Genentech Corp., South San Francisco, California erhalten.
  • Das von humaner rekombinanter DNA stammende Material wurde bis zur Homogenität aus Extrakten von E. coli gereinigt.
  • TNF wanderte als einzelne Bande mit einem ungefähren Molekulargewicht von 18.000 Dalton.
    • Beispiel 2 Test der cytotoxischen Aktivität von TNF
  • Die cytotoxische Aktivität von TNF wurde kontrolliert unter Verwendung des folgenden Tests an L-929-Zellen. 40.000 Maus-L-929-Fibroblasten in MEM-Medium, das 10 % FCS enthielt, wurden in jeden Napf einer 96-Napfplatte gegeben und 24 Stunden bei 37ºC (5 % CO&sub2;) inkubiert. Die Zellen wurden dann mit verschiedenen Mengen entweder TNF oder TNF-Antikörper-Konjugat in einem Medium, das 0,5 g/ml Actinomycin-D enthielt, 24 Stunden lang bei 37ºC (5 % CO&sub2;) behandelt. Die Zellen wurden mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (pH 7,2) (PBS) gewaschen und lebensfähige Zellen wurden mit Kristallviolett angefärbt. Die Platten wurden bei 590 nm abgelesen, um die lebensfähige Zellzahl zu bestimmen.
  • TNF mit einer spezifischen Aktivität von nicht weniger als 1 x 10&sup7; U/mg wurde verwendet zur Konjugation mit den Antikörpern. Eine Einheit TNF-Aktivität ist die Menge an TNF- Protein, die 50 % Hemmung des Zellwachstums von L-929 verursacht.
    • Beispiel 3 Modifikation von TNF mit Iminothiolan
  • TNF in phosphatgepufferter Kochsalzlösung wurde auf ungefähr 2 mg/ml in einem Centricon 10 Mikrokonzentrator konzentriert. Triethanolaminhydrochlorid (TEA/HCl), pH 8,0 und EDTA wurden bis auf eine Endkonzentration von 60 mm TEA/HCl und 1 mm EDTA, pH 8,0 zugegeben. 2-Iminothiolan-Stammlösung (20 mm) wurde auf eine Endkonzentration von 1 mm zugegeben und die Probe wurde 90 Minuten bei 4ºC unter einem Stickstoffstrom inkubiert.
  • Überschüssiges Iminothiolan (IT) wurde durch Gelfiltration auf einer Sephadex G-25-Säule (1 x 24 cm), die mit 5 mm Bis-Tris/Acetatpuffer, pH 5,8, der 50 mm NaCl und 1 mm EDTA enthielt, voräquilibriert war, entfernt. Die Fraktionen wurden auf den Proteingehalt in Mikrotiterplatten unter Verwendung des Bradford-Farbstoff-Bindungstestes analysiert. Kurz gesagt wurden 40 ul Probe, 100 ul phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) und 40 ul Farbkonzentrat in jeden Napf gegeben. Die Absorption bei 600 nm wurde an einem Dynatech Mikroelisa-Autoreader abgelesen. TNF eluiert mit dem Leervolumen (etwa Fraktionen 14 bis 20). Diese Fraktionen werden gesammelt und eingeengt unter Verwendung eines Centricon -10-Mikrokonzentrators.
    • Beispiel 4 Herstellung und Charakterisierung von monoklonalen Antikörpern gegen 15A8-Brustkrebs-Antigen und Melanom-Antigen ZME-018
  • Diese monoklonalen Antikörper können mit dem Fachmann bekannten Methoden hergestellt werden. Das Verfahren zur Herstellung der Hybridoma-Zellkulturen, die die 15A8-Antikörper erzeugen, ist im Detail beschrieben in US-A-5,032,521, die eine Continuation-in-part-Anmeldung von EP-A-184-369 (veröffentlicht am 11. Juni 1986) ist. Kurz gesagt wurden Brustdrüsen-Krebszellen (Soule et al., JNCI, 51: 1409-1413 (1973) ATCC Hinterlegungs-Nr. TB-22) in Balb/c Mäuse alle 3 Wochen intraperitoneal injiziert bei insgesamt drei bis vier Injektionen. Die Milz wurde jeweils drei Tage nach der letzten Injektion geerntet und eine Milz-Zellsuspension wurde hergestellt und mit zwei Zentrifugationen (800 x g) in Dulbecco's modifiziertem Eagles-Medium gewaschen. 108 immunisierte Mäuse-Milzzellen und 107 PAI-Myelomzellen, die von Dr. Theo Staehlin, Basel, Schweiz, J. Stocker, Research Disclosure, 21713, 155-157 (1982) erhalten wurden, wurden zur Fusion in einer 45%igen Lösung (V/V) von Polyethylenglykol 1500 resuspendiert. Die Hybridzellen wurden selektiert auf Hypoxanthin-Amenopterin-Thymidin (HAT)-Medium.
  • Klone der Hybridoma wurden in vitro gezüchtet mit bekannten Gewebekultur-Techniken, wie z.B. der von Cotten et al., Eur. J. Immunol. 3:136 (1973) beschriebenen. Hybridoma, die Antikörper produzierten, die mit MCF-7- und/oder MDA-157- Zellen reagierten, nicht aber mit menschlichen Vorhaut- Fibroblasten-Zellen, wurden weiter charakterisiert. Die Antikörper, die von der 15A8-Zellinie erzeugt wurden und Hybridomas, die funktionell äquivalente Antikörper produzierten, reagierten mit dem 15A8-Antigen auf MCF-7-Zellen. Sie reagierten auch statistisch mit 28/31 menschlichen Brustdrüsen-Karzinom-Zellen, die getestet wurden, und zeigten eine schwächere Reaktion mit normalen Human-Epithel-Zellen der Brust, des Tubulus renalis proximalis, der Blasenhaut, des Ösophagus und der Speicheldrüse, aber mit Zellen von praktisch keinem anderen normalen Gewebe und reagierte nicht mit 14 von 18 anderen malignen Geweben, die getestet wurden. Der 15A8-Antikörper reagierte auch mit allen fibrocystischen Erkrankungen, normalem Brustdrüsen- Epithel, einer Anzahl von Adenokarzinomen. Er reagierte nicht mit Mesotheliomen. Der 15A8-Antikörper kreuzreagierte mit Gebärmutterhals-, Darm- und Prostatakarzinomen.
  • Beispielhafte Hybridoma-Kulturen, deren Zellen Antikörper des gleichen Idiotyps ausscheiden, d. h. die alle das 15A8- Epitop erkennen, wurden bei der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852 ("ATCC") hinterlegt und erhielten die Hinterlegungsnummern HB-8655 (für 15A8), HB-9344 (für 15A8 G2a) und HB-9345 (für 15A8 G2b).
  • Der Ausdruck "funktionell äquivalent", wie er hier im Hinblick auf beispielhafte monoklonale Anti-Human-Brustkrebs- Antikörper der Maus verwendet wird, bedeutet einen monoklonalen Antikörper der: (1) einen beispielhaften monoklonalen Antikörper kreuzblockiert; (b) selektiv an Zellen bindet, die das 15A8-Antigen exprimieren, z.B. Human-Brustkrebs- Zellen; (c) vom G- oder M-Isotyp ist; (d) an das 15A8-Antigen bindet, bestimmt durch Immunofällung oder Sandwich- Immuno-Assay und (e), wenn er an TNF konjugiert ist, eine Hemmdosis für die Gewebekultur (TCID) von mindestens 50 % aufweist bei mindestens einer der Zellinien MCF-7, ME-180, BT-20 oder A431, wenn er in einer Dosis von 50 bis 100 Einheiten pro ml verwendet wird.
  • Monoklonale Antikörper, die an Melanomzellen binden, wurden auf ähnliche Weise hergestellt. Die Details zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern, die gegen die Zelloberfläche und das Cytoplasma von Melanom-Antigenen gerichtet sind, ist im Detail bei Wilson et al., Int. J. Cancer (1981) 28: 293 beschrieben, der hier durch Bezugnahme aufgenommen wird.
    • Beispiel 5 Modifikation von monoklonalen 15A8-Antikörpern oder monoklonalen ZME-018-Antikörpern mit SPDP
  • N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)-(propionat) (SPDP) in Dimethylformamid wurde hergestellt als Vorratslösung mit 3 mg/ml in trockenem Dimethylformamid. Da das kristalline SPDP einer Hydrolyse unterliegen kann, wurde die aktuelle Konzentration des chemisch reaktiven Vernetzers durch spektrophotometrische Methoden bestimmt, indem die Absorption bei 260 nm in einem Doppelstrahl-Spektrophotometer analysiert wurde. Die Konzentration der SPDP-Stammlösung wird berechnet aus der folgenden Gleichung:
  • 1 mg monoklonaler Antikörper, z.B. MoAb 15A8 oder MoAb ZME- 018 in 0,5 ml PBS wurde in ein Glasröhrchen gegeben. SPDP- Stammlösung wurde langsam zu dem Röhrchen mit fünffachem molaren Überschuß zugegeben, wobei ständig gemischt wurde. Die Mischung wurde 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert, wobei alle fünf Minuten während des Inkubations-Zeitraumes gemischt wurde.
  • Überschüssiges, nicht umgesetztes SPDP wurde durch Gelfiltrations-Chromatographie auf einer Sephadex G-25-Säule (1 x 24 cm), die mit PBS voräquilibriert war, entfernt. Die Fraktionen (0,5 ml) wurden gesammelt, während der PBS-Elution und wurden auf ihren Proteingehalt analysiert mit dem Bradford-Farbstoff-Verfahren. Antikörper wurden eluiert im Leervolumen (ungefähr Fraktionen 14 bis 20). Diese Fraktionen wurden gesammelt und das Protein in einem Centricon-30- Mikrokonzentrator konzentriert. Das Centricon-Retentat wurde mit 100 mm Natriumphosphat-Puffer, pH 7,0, der EDTA enthielt (0,5 mm) gewaschen. Der Antikörper wurde auf ein Endvolumen von ungefähr 0,5 bis 0,75 ml eingeengt.
    • Beispiel 6 Konjugation von mit SPDP modifiziertem monoklonalem Antikörper mit mit Iminothiolan modifiziertem TNF
  • 15A8-Antikörper und ZME-018-Antikörper wurden konjugiert mit TNF unter Verwendung von N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)-propionat (SPDP) und/oder Iminothiolan (IT) als Kupplungsmittel. Die Konjugate wurden gegenüber ME-180 und AAB-527-Zellen in einem 72stündigen Gewebekultur-Test getestet. Die Antikörper-Konjugate zeigten eine annehmbare antiproliferative Aktivität (TCID 50 % bei weniger als 10 Einheiten pro ml) gegenüber beiden Zellinien.
  • Monoklonale 15A8-Antikörper oder ZNE-018-Antikörper, modifiziert wie in Beispiel 4 beschrieben, wurde mit einem gleichen Gewicht an TNF, das wie in Beispiel 3 modifiziert war, gemischt. Dieser Anteil entsprach einem fünffachen molaren Überschuß von TNF verglichen mit dem Antikörper. Der pH der Mischung wurde auf 7,0 eingestellt durch Zugabe von 0,05 m/TEA/HCl-Puffer, pH 8,0, und die Mischung wurde 20 Stunden bei 4ºC unter Stickstoff inkubiert. Iodacetamid (0,1 m) wurde bis auf eine Endkonzentration von 2 mm zugegeben, um jegliche verbleibenden freien Sulfhydryl-Gruppen zu blockieren und die Inkubation wurde eine weitere Stunde bei etwa 25ºC fortgesetzt. Die Reaktionsmischung wurde bei 4ºC aufbewahrt bis zur Reinigung mit Gelfiltration.
    • Beispiel 7 Reinigung der Komplexe aus TNF und monoklonalen Antikörpern
  • Nicht konjugiertes TNF wurde aus den Reaktionsmischungen von Beispiel 6 entfernt durch Gelfiltration auf einer Sephedex S-300-Säule (2,5 x 50 cm), die mit PBS voräquilibriert war.
  • Die Reaktionsmischungen von Beispiel 6, die TNF konjugiert mit MoAb ZME enthielten, wurden auf ungefähr 1 ml eingeengt mit einem Centricon-30-Mikrokonzentrator, bevor sie auf die Sephadex-Säule geladen wurden. Die Säule wurde mit PBS gewaschen. 1 ml Fraktionen wurden gesammelt und 50 ul Aliquots wurden auf Protein analysiert mit dem Bradford-Farbstoff-Bindungstest. M. Bradford, Anal. Biochem 72: 248 (1976).
  • Freier und TNF-konjugierter Antikörper eluierte etwa mit den Fraktionen 17 bis 40, während unkonjugiertes TNF etwa mit den Fraktionen 46 bis 50 eluierte. Figur 1 zeigt das Elutionsprofil der S-300-Säule. Die Elution des freien TNF- Standards (in Fraktionen 46 bis 48) ist durch Pfeil gezeigt. Die Elution von unkonjugiertem ZME-Antikörper tritt ungefähr bei Fraktion 28 auf. Nach der Chromatographie der Reaktionsmischung wurden die Fraktionen 20 bis 40 gesammelt. Eine PAGE-Analyse zeigte, daß diese Fraktioner kein freies TNF enthielten. Dieses Elutionsmuster wurde durch Elektrophorese von 50 ul Aliquots auf nicht reduzierendem SDS-Polyacrylamid-Gel mit 5 bis 20 % Gradienten bestätigt. Diese Analyse bestätigte, daß das konjugierte Material 1 bis 3 Moleküle gekuppeltes TNF pro Molekül Antikörper und kein freies TNF enthielt.
  • Nicht konjugierter Antikörper wurde von dem TNF konjugierten Antikörper durch Affinitäts-Chromatographie entfernt unter Verwendung von CNBr-Sepharose, an die ein Maus-Anti- TNF-Antikörper gekuppelt war. Das Harz wurde in eine kleine Säule (1 x 4 cm) gegossen und mit 10 mm Phosphatpuffer, pH 7,2, der 0,1 m NaCl enthielt, voräquilibriert. Nach dem Beladen der mit S-300 gesammelten Probe wurde die Säule mit 30 ml des gleichen Puffers gewaschen, um nicht konjugierten Antikörper vollständig zu eluieren. Mit TNF konjugierter Antikörper band an die Säule.
  • Der Antikörper-TNF-Komplex eluierte von der Säule, wie in Figur 2 gezeigt, die das Elutionsprofil der TNF-Affinitäts- Säule darstellt. Der Durchflußpeak enthält nur freien Antikörper, während die Fraktionen 58 bis 70 Antikörper-TNF- Konjugat frei von unkonjugiertem TNF oder unkonjugiertem Antikörper enthalten. Die gesammelten Fraktionen der S-300- Chromatographie wurden auf einen Träger für Affinitäts- Chromatographie aufgetragen, an den ein Anti-TNF-Maus-Antikörper gebunden war. Die Säule wurde intensiv mit PBS gewaschen, damit freier ZME-Antikörper (Peak Fraktion 20) von dem Harz eluieren konnte. Die Elution des ZME-TNF-Konjugats wurde durchgeführt, indem die Säule mit 0,1 m Na-Acetatpuffer (pH 4,5), der 0,15 m NaCl-Puffer enthielt, gewaschen wurde. Wie in Figur 2 gezeigt, wurde das gereinigte Konjugat als einziger Proteinpeak eluiert. Die PAGE-Analyse eines nicht reduzierenden Acrylamidgels mit 5 bis 20 9 kontinuierlichem Gradienten zeigte, daß das Konjugat ZME gebunden an 1, 2 und 3 TNF-Moleküle enthielt. Es gab kein nachweisbares freies TNF oder freien ZME-018 im Endprodukt.
  • Der Proteingehalt der eluierten Fraktionen wurde bestimmt mit dem Bradford-Farbstoff-Bindungstest. Die Protein enthaltenden Fraktionen wurden gesammelt und das Elutionsmuster bestätigt durch Elektrophorese auf einem nicht reduzierenden Polyacrylamidgel mit 5 bis 20 % Gradient.
  • Der L-929-Test, der in Beispiel 2 beschrieben ist, wurde verwendet, um die TNF-Aktivität des im wesentlichen reinen TNF-Antikörper-Komplexes abzuschätzen. Sowohl das im wesentlichen reine 15A8-TNF als auch das ZME-TNF-Antikörper- Konjugat waren in dem L-929-Test aktiv. Eine Verdünnung von 1:1000 der Originalprobe verursachte ungefähr 50 % Hemmung des L-929-Zellwachstums. Somit war die Aktivität des Originalpräparates 1000 U/ml.
    • Beispiel 8 Vergleich der Bindung von TNF-konjugiertem und unkonjugiertem ZME-018-Antikörper an Zielzellen
  • Um zu bestimmen, ob Änderungen bei den Bindungseigenschaften von ZME an A-375-Zielzellen (antigenpositiv) oder T-24- Zellen (antigennegativ) auftraten durch die Modifikation mit TNF, wurden Zellen mit 50.000 Zellen pro Napf auf einer 96-Napf-Kunststoffplatte plattiert und bei Raumtemperatur lufttrocknen gelassen. Verschiedene Konzentrationen von ZME oder ZME-TNF wurden zugegeben, 3 Stunden bei Raumtemperatur binden gelassen. Ein Standard-ELISA-Test wurde durchgeführt zum Nachweis von Maus-Antikörper.
  • Die Fähigkeit von mit TNF konjugiertem und unkonjugiertem ZME-018-Antikörper, an Zielzellen zu binden, wurde beurteilt. 50.000 Zielzellen (A-325) oder Nicht-Zielzellen von Human-Blasenkarzinom (T-24-Zellen) wurden in jeden Napf der Mikrotiterplatte gegeben. Die Zellen wurden auf den Platten über Nacht bei 37ºC getrocknet. Die Zellen wurden dann mit 3 Chargen kaltem PBS gewaschen und über Nacht luftgetrocknet. Die antigenen Determinanten an der Zelloberfläche blieben nach dieser Behandlung antigen aktiv.
  • Nach Bindung der Zellen wurden die Platten mit Waschpuffer (9,68 Tris, 64,8 Natriumchlorid, 16 ml Tween 20, 800 mg Thimerasol in 8 l doppelt destilliertem Wasser) gewaschen. Antikörperproben wurden in Waschpuffer, der 1 % Rinderserumalbumin (G/V) (Verdünnungspuffer) enthielt, verdünnt. 50 ul verschiedener Konzentrationen im Bereich von 0,002 bis 100 ug/ml von konjugiertem oder unkonjugiertem ZME-018- Antikörper wurden in die Näpfe gegeben. Nach einstündiger Inkubation bei 4ºC wurden die Überstände entfernt und die Näpfe zweimal mit Waschpuffer gewaschen.
  • 50 ul pro Napf konjugierter alkalischer Phosphatase-Ziege- Anti-Maus-IgG, der von Bio-Rad erhalten wurde, und 1:1000 (V/V) (APGAM) in Verdünnungspuffer verdünnt wurde, wurde jedem Napf zugegeben. Die Platten wurden eine Stunde bei 4ºC inkubiert und die Näpfe zweimal mit Waschpuffer gewaschen. Nach der Inkubation der Platten mit 50 ul Substrat-Lösung (80 mm Citrat-Phosphat (pH 5,0), 1 mm ABTS- Substitut und 4 ul 30 % Wasserstoffperoxid) 30 Minuten im Dunkeln bei Raumtemperatur, wurden 25 ul 4 n Schwefelsäure zu jedem Napf zugegeben. Die Absorption bei 492 nm wurde an einem ELISA-Plate-Reader bestimmt.
  • Die Ergebnisse sind in Figur 3 gezeigt. Der ZME-TNF-Komplex band an A-375-Zielzellen im gleichen Ausmaß wie der native ZME-Antikörper. Da es keinen Unterschied in der Bindung des ZME-TNF oder des unkonjugierten ZME-Antikörpers an A-135- Antigen enthaltende Zielzellen gab, veränderte das chemische Konjugations-Verfahren die Affinität des Antikörpers für sein Zielantigen nicht. Es gab keine nachweisbare Bindung von ZME oder ZME-TNF-Komplex an Nicht-Zielzellen des T-24-Blasenkarzinoms.
    • Beispiel 9 Antiproliferative Wirkungen von TNF und TNF-15A8- oder ZME- TNF-Antikörper-Komplex
  • Die antiproliferativen Wirkungen von TNF und 15A8-TNF- oder ZME-TNF-Konjugat wurden beurteilt, indem ungefähr 5000 Zellen in der Logphase/pro Napf in 96 Napf-Mikrotiter-Platten plattiert wurden in 200 ml geeignetem Gewebekultur-Medium. Die Zellen wurden 24 Stunden bei 37ºC in einer Atmosphäre von 5 % CO&sub2; in Luft anhaften gelassen. Antigennegative Nicht-Zielzellen des T-24-Human-Blasenkarzinoms, für 15A8 antigenpositive Me-180-Zellen und für ZME-018 antigenpositive A-375-Human-Melanomzellen in der Logphase wurden mit verschiedenen Konzentrationen entweder von Medium allein (Kontrolle), von TNF, von 15A8-TNF-Konjugat oder von ZME- TNF-Konjugat behandelt und 72 Stunden bei 37ºC in einer Atmosphäre von 5 % CO&sub2; in Luft inkubiert. Die Platten wurden dreimal mit kaltem PBS gewaschen. 50 ml Methanol wurden zu jedem Napf zugegeben und die Zellen lysiert durch wiederholte Zyklen von Einfrieren und Auftauen. Die Protein-Konzentrationen wurden dann mit dem Bradford-Farbstoff-Test bestimmt. Alternativ wurde die Zellzahlen in jedem Napf unter Verwendung einer Kristallviolett-Färbung bestimmt. Die Absorption jedes Napfes wurde an einem ELISA-Reader bestimmt und mit Kontrollnäpfen (keine Behandlung) verglichen. Wie in Figur 4 gezeigt, hatte TNF alleine keine cytotoxische oder cytostatische Wirkung bei der verwendeten TNF-Konzentration (50.000 Einheiten pro Napf). Jedoch wurde mit dem ZME-TNF-Konjugat eine 50%ige Hemmung mit nur 10 Einheiten pro ml erhalten.
  • Die Hemmung des Zellwachstums wurde auch untersucht durch Verminderung der Protein-Konzentrationen oder Zellzahl der behandelten Zellen, verglichen mit mit Kochsalzlösung behandelten Kontrollen. Es gab keine Hemmung des Zellwachstums durch 15A8-TNF-Konjugat oder ZME-TNF-T24-Karzinom bei den Nicht-Zielzellen des T24-Karzinoms.
  • Es gab keine Wirkung von 15A8-TNF gegenüber der T24-Nicht- Zielzellinie.
  • Da nur Zellen, die das 15A8-Antigen auf ihrer Oberfläche enthielten, mit dem TNF-15A8-Immunotoxin getötet wurden, ist dieses Immunotoxin eine wirksame Methode, um das tumorassoziierte Antigen 15A8 enthaltende Zellen gezielt anzusteuern und zu töten, während eine Schädigung normaler nicht das tumorassoziierte Antigen tragender Zellen minimiert oder verhindert wird.
  • Das ZME-TNF-Konjugat war aktiver als freies TNF, als es an antigenpositiven Human-Melanom-Zellen (entweder AAB-27 oder A-375) in Kultur getestet wurde (Figuren 4 und 5). Wie in Figur 4 gezeigt, hat TNF alleine keine Wirkung auf das Wachstum von AAB-27-Zellen bei Dosierungen von bis zu 50.000 U/ml. Jedoch wurde eine 50%ige Hemmung erhalten mit ungefähr 6 U/ml der ZME-TNF-Konjugate, wie in Figur 5 gezeigt. A-375-Human-Melanom-Zellen als Ziel wurden gehemmt durch TNF alleine bei Dosierungen von ungefähr 100 U/ml, während das ZME-TNF-Konjugat Zellen mit einer Konzentration von ungefähr 0,8 U/ml hemmte. Me-180-Zielzellen waren um das 10fache empfindlicher gegenüber dem 15A8-TNF-Immunotoxin als gegenüber TNF allein (Figur 6).
  • Figur 6 zeigt, daß bei ungefähr 15 U/ml mit TNF konjugierter 15A8-Antikörper 50 % der Me-180-Zellen hemmte, während eine Konzentration von 200 U/ml des unkonjugierten TNF erforderlich war, um dieselbe Wirkung zu erzielen. Es gab keine Wirkung weder von TNF noch von ZME-TNF-Konjugat auf antigennegative T-24-Zellen.
  • Somit können Immunkonjugate von ZME und 15A8 mit TNF die Cytotoxizität von TNF gegenüber antigenpositiven Zellen dramatisch erhöhen, während antigennegative Zellen unbeeinflußt bleiben. Außerdem kann bei einer Zellinie, die vollständig resistent ist gegenüber den das Wachstum hemmenden Wirkungen von TNF alleine (Figur 4) die zelluläre Resistenz überwunden werden durch gezielte Antikörper.
  • Der Fachmann erkennt leicht, daß die vorliegende Erfindung gut dazu geeignet ist, die Aufgaben zu lösen und die erwähnten Vorteile ebenso wie die inhärent vorliegenden Vorteile zu erreichen. Die Verbindungen, Verfahren, Methoden und Techniken, die hier beschrieben wurden, sind beispielhaft für bevorzugte Ausführungsformen und sollen als Beispiele dienen. Änderungen und andere Verwendungen der Erfindung sind durch den Umfang der beigefügten Ansprüche definiert.

Claims (6)

1. Zusammensetzung, umfassend ein Konjugat eines gegen das 15A8-Brustkarzinom-Antigen oder das ZME-018-Melanom-Antigen gerichteten Antikörpers und eines Anteils eines modifizierten cytotoxischen Modifikators des biologischen Ansprechvermögens, ausgewählt aus TNF-α, TNF-β und IL-1, wobei der Anteil mit dem Antikörper konjugiert ist mit Hilfe eines bifunktionellen Protein-Kupplungsmittels.
2. Zusammensetzung nach Anspruch 1, worin die Zusammensetzung eine rekombinant erzeugte Verbindung ist.
3. Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, worin der Antikörper ein 15A8-Antikörper ist.
4. Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, worin der Antikörper ein ZME-018-Antikörper ist.
5. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 2 bis 4, worin das Konjugat ein Gen-Fusions-Produkt ist, das rekombinant erzeugt wurde durch Fusion eines Gens, das eine Antigen-Erkennungsstelle eines monoklonalen Antikörpers kodiert, mit einem Gen, das einen Modifikator des biologischen Ansprechvermögens kodiert.
6. Zusammensetzung, umfassend Human-Interferon und ein Konjugat eines gegen das 15A8-Brustkarzinom-Antigen oder ZME-018-Melanom-Antigen gerichteten Antikörpers und eines Anteils eines Modifikators des biologischen Ansprechvermögens, ausgewählt aus TNF-α, TNF-β und IL-1, wobei der Anteil mit dem Antikörper konjugiert ist mit Hilfe eines bifunktionellen Protein- Kupplungsmittels.
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