DE69007775T2

DE69007775T2 - 5'-alkylphosphonylnukleoside als antivirale verbindungen.

Info

Publication number: DE69007775T2
Application number: DE69007775T
Authority: DE
Inventors: Carlo Battistini; Giovanni Franceschi; Domenico Ungheri; Maria Verini; Sergio Vioglio
Original assignee: Carlo Erba SpA
Current assignee: Pfizer Italia SRL
Priority date: 1989-09-22
Filing date: 1990-09-20
Publication date: 1994-07-07
Anticipated expiration: 2010-09-21
Also published as: AU645762B2; EP0445258B1; WO1991004261A1; GB8921469D0; EP0445258A1; JPH04501867A; AU6424490A; DE69007775D1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von Verbindungen der Formel T als antivirale Mittel:
worin B ein Purin- oder Pyrimidinheterozyklus ist; X Sauerstoff oder Schwefel ist; R¹ eine Hydroxylgruppe oder ein Wasserstoffatom ist; R² eine lineare, verzweigte oder zyklische Alkylgruppe mit bis zu 20 Kohlenstoffatomen ist; R³ eine Gruppe, die wie R² oben definiert ist, oder ein Wasserstoffatom, ein Kation oder ein Radikal eines mehrwertigen Alkohols ist.
Die Heterozyklen, die B darstellen kann, schließen Adenin, Guanin, Cytosin, Thymin und Uracil oder deren Derivate wie beispielsweise 5-Methyluracil oder 5-Methylcytosin ein; B stellt vorzugsweise Adenin dar.
R² ist typischerweise eine lineare oder verzweigte Alkylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, gewöhnlich mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen. Vorzugsweise ist R² eine Methyl-, Ethyl-, Propyl, Isopropyl- oder n-Butylgruppe. Die Kationen, die R³ darstellen kann, schließen Alkalimetallkationen, z.B. Natrium oder Kalium, und Kationen wie z.B. Ammonium- und Alkylammoniumkationen ein, in denen die Alkylgruppe linear, verzweigt oder zyklisch sein kann und vorzugsweise 1 bis 6 Kohlenstoffatome, besonders bevorzugt 1 bis 4 Kohlenstoffatomen umfaßt; der Ausdruck mehrwertiger Alkohol [Polyhydroxygruppe] in der Definition von R³ umfaßt einen Glyceryl- oder Kohlehydratrest, wie beispielsweise ein Mono- oder Disaccharid, oder ein Ketoderivat.
Einige der Verbindungen der Formel I sind bereits bekannt, wie beispielsweise ein 5'-Methylphosphonyladenosin, das zuvor bezüglich seiner hypotensiven Wirksamkeit synthetisiert und getestet wurde (US 3 560 478) oder als Substrat für ein Enzym verwendet wurde; siehe D.V. Santi et al., J. Med. Chem. 16, 273 (1973). Nichtsdestoweniger wurde für keine der Verbindungen jemals eine antivirale Verwendung beschrieben oder beansprucht. Die vorliegenden Verbindungen sind Breitspektrum antivirale Mittel, die biologisch gegen verschiedene Virustypen wirksam sind, insbesondere RNA-Viren.
Verbindungen der Formel I können direkt aus einem ungeschützten Deoxyribonukleosid oder Ribonukleosid wie Adenosin durch Phosphonylierung mit dem geeigneten Alkylphosphonyldichlorid bei niedriger Temperatur, vorzugsweise 0ºC, unter Verwendung von Trialkylphosphat (im allgeineinen Trimethyl- oder Triethylphosphat) als Lösungsmittel hergestellt werden. Nach Rühren der Mischung bei niedriger Temperatur während 1 bis 10 Stunden, vorzugsweise etwa 6 Stunden, wird die Reaktion durch Zugabe einer wäßrigen Lösung von Triethylammoniumbicarbonat, z.B. 0,1 M, abgebrochen. In diesem Fall wird die Isolierung des Reaktionsprodukts besser durch Durchleitung der Lösung durch ein geeignetes Anionenaustauscherharz wie IRA-93 ausgeführt; nach einer geeigneten Wäsche mit Wasser kann das Produkt mit einer wäßrigen basischen oder Salzlösung eluiert werden, wird aber vorteilhafter mit 0,1 M wäßrigem Triethylammoniumbicarbonat (TEAB) eluiert.
Die Lösung wird zur Trockne eingedampft, der Rückstand in Wasser gelöst und durch eine Säule geleitet, die die Natriumform eines Kationenaustauscherharzes enthält, vorzugsweise Dowex 50W-X8,Na&spplus;Form. Die resultierende wäßrige Lösung wird unter Vakuum eingedampft oder gefriergetrocknet, was das Natriumsalz des 5'-Alkylphosphonats des behandelten Nukleosids ergibt.
Ein ungeschütztes Nukleosid kann auch durch Verwendung des frisch hergestellten Alkylphosphonylditriazolids phosphonyliert werden. Dieses aktive Phosphonylierungsmittel wird durch ein bekanntes Verfahren aus dem entsprechenden Dichlorid hergestellt und in der Form der Lösung verwendet, in der es erhalten wird.
In diesem Fall weichen Lösungsmittel und Reaktionsbedingungen von denen im zuvor beschriebenen Verfahren ab. In einem typischen Verfahren wird eine Lösung des trockenen Nukleosids in einem geeigneten trockenen Lösungsmittel, vorzugsweise Pyridin, zu der trockenen Lösung des Alkylphosphonylditriazolids in Acetonitril zugegeben. Die Reaktionsmischung wird bei Raumtemperatur eine unterschiedliche Zeit lang in Abhängigkeit vom Nukleosidtyp gerührt, im allgemeinen von 1/2 bis 5 Stunden. Die Reaktionsmischung kann vorteilhaft mit einer wäßrigen Triethylammoniumbicarbonat-Lösung oder alternativ mit Triethylamin in Wasser-Pyridin, gefolgt von Behandlung mit einer wäßrigen Natriumbicarbonatlösung, abgebrochen werden. Falls keine Entfernung der Schutzgruppen erforderlich ist und das Reaktionsprodukt bereits die Endverbindung darstellt, wird die wäßrige Lösung konzentriert und das Produkt durch Reversphasen-Säulenchromatrographie, vorzugsweise unter Verwendung von LiChroprep RP-8, gereinigt. Kationenaustausch mit Natriumionen, wie bereits beschrieben, liefert die Endverbindung.
Dasselbe Phosphonylierungsverfahren kann für geeignet geschützte Deoxyribonukleoside oder Ribonukleoside verwendet werden, wobei der Schutz an der Base und an den sekundären Hydroxylgrupen oder nur an den letzteren vorgesehen wird. Ausgehend von einem Ribonukleosid wie Adenosin liefert eine Behandlung mit Carbonyldiimidazol in trockenem DMF während einigen Stunden bei Raumtemperatur, gefolgt von einer gewöhnlichen wäßrigen Phase-organischen Lösungsmittel-Aufarbeitung, das 2',3'-zyklische Carbonatnukleosid, das aus Diethylether kristallisiert werden kann. Dieselbe Verbindung kann alternativ durch Reaktion des Ribonukleosids mit Dephenylcarbonat in trockenem DMF in Gegenwart einer katalytischen Menge Phenol und Erhitzen der Mischung auf hohe Temperatur während der erforderlichen Zeitdauer, vorzugsweise bei 150ºC während 1 Stunde, erhalten werden.
Die Verdünnung der Mischung mit Diethylether bewirkt Ausfällung des Produkts.
Das an den 2'- und 3'-Positionen als zyklisches Carbonat geschützte Nukleosid kann der Phosphonylierungsreaktion mit dem oben beschriebenen Ditriazolidderivat unterzogen werden, und nach der Reaktion ist die 2',3'-Schutzgruppe unter den Aufarbeitungsbedingungen labil. Somit erfordert das Verfahren keine weiteren Schritte der Entfernung von Schutzgruppen, sondern nur die Endreinigung für das ungeschützte Nukleosid, wie oben beschrieben.
Andere Schutzgruppentypen können für die Hydroxylgruppen an den 2'- und 3'-Positionen der Ribonukleoside oder in der 3'-Position eines Deoxyribonukleosids verwendet werden.
Beispielsweise kann das oben beschriebene Phosphonylierungsverfahren auf ein 2',3'-O,O-bis(tertButyldimethylsilyl)ribonukleosid oder bei einem 3'-O-tert-Butyldimethylsilyldeoxyribonukleosid angewandt werden, welche beide leicht aus den entsprechenden ungeschützten Nukleosiden nach bekannten Methoden erhältlich sind. In diesen Fällen ist eine Reaktion zur Entfernung der Schutzgruppen, vorzugsweise unter Verwendung von Tetrabutylammoniumfluorid in Tetrahydrofuran, nach dem Phosphonylierungsschritt erforderlich. Danach kann die Reinigung des Endprodukts wie oben beschrieben durchgeführt werden.
Die oben beschriebene Phosphonylierungsreaktion kann auch bei einem Ribonukleosid oder Deoxyribonukleosid, das an den sekundären Hydroxylgruppen und ggf. an der exozyklischen Aminogruppe der Base mit Acylgruppen, wie beispielsweise Benzoylgruppen, geschützt ist, angewandt werden. Ein Beispiel dieses Falls wird für 2',3'-O,O-6-N,N-Tetrabenzoyladenosin, das durch Standardverfahren hergestellt wird, beschrieben. Schutz der geeigneten funktionellen Gruppen kann ebenfalls in einem gemischten Modus durch Acyl- und Silylgruppen wie in 6-N-Benzoyl-2',3'-O-(tetraisopropyldisiloxan-1,3-diyl)- adenosin erzielt werden. In beiden Fällen ist, nachdem der Alkylphosphonylierungsschritt wie oben beschrieben ausgeführt wurde, eine Behandlung mit 30 %igem Ammoniak in Dioxan bei Raumtemperatur während einiger Stunden zur vollständigen Entfernung der Schutzgruppen ausreichend, um das Endprodukt zu ergeben.
Für Produkte, die am Phosphoratom weiter verestert sind, kann die zweite esterbildende Gruppe, im allgemeinen eine einfache Alkylgruppe, anschließend an die Alkylphosphonylierungsreaktion entweder durch Zugabe des geeigneten Alkohols zur immer noch aktiven Form des 5'-phosphonylierten Nukleosids vor Quenchen der Reaktionsmischung oder durch Reaktivierung des Phosphonylierten Nukleosids mit einem geeigneten Mittel, beispielsweise DCC oder Carbonyldiimidazol, eingeführt werden.
Etwas bessere Ergebnisse werden erhalten, indem man ein bifunktionelles Phosphonylierungsmittel wie Alkylphosphonyl-dichlorid oder Alkylphosphonylditriazolid zunächst mit einer äquimolaren Menge des einfacheren Alkohols reagieren läßt und dann das resultierende Zwischenprodukt direkt mit dem geeigneten Nukleosid in derselben Reaktionsmischung umsetzt. Ein Beispiel wird für 5'-O-(P-isopropyloxy-P-methyl-phosphonyl)adenosin beschrieben.
Die Verbindungen der Formel I der vorliegenden Erfindung haben ein breites antivirales Wirkungsspektrum insbesondere gegen RNA-Viren.
Die antivirale Wirksamkeit wurde in Standardverfahren demonstriert, die ausführlicher nachstehend beschrieben werden. Die Verbindungen wurden in einem geeigneten Verdünnungsmittel gelöst, das eine gepufferte Kochsalzlösung oder ein Minimal Essential Medium oder eine Tryptanphosphatbrühe oder ein äquivalentes Medium sein kann.
Die Wirksamkeit der Verbindungen wurde sowohl in in vitro wie auch in in vivo Tests bestimmt.
In vitro Tests wurden mit Monoschichten von menschlichen Hep # 2 Zellen ausgeführt, die mit respiratorischen Syncytial-, Semliki Forest-, Coxsackie- und Vacciniaviren infiziert waren, und von Hamster BHK-Zellen, die mit Columbia SK-Virus infiziert waren, ausgeführt. Der Aktivitätsindex (A.I.) wurde als das Verhältnis: Zytotoxizität, ausgedrückt als die Konzentration des Arzneimittels, das eine 50 %ige Abnahme des zellulären Wachstums ergab (Gewebekulturinhibierungsdosis 50 % - T.C.I.D. 50) bestimmt und die Wirkung auf die Produktion infektiöser Viren als die Konzentration bestimmt, die den Virentiter in Zellkryolysaten um 50 % verringert. Die Ergebnisse für 5'-Methylphosphonatadenosin, das als FCE 25148A kodiert ist, werden in Tabelle 1 gezeigt.
Die Verbindungen der Formel I sind auch in in vivo Tests wirksam: beispielsweise bei Pulmonitis, die von Influenzaviren verursacht wird, und bei dem experimentellen Mausmodell für Enzephalitis, die mit Semliki-Forestviren infiziert wurden.
Es ist bekannt, daß der intranasal injizierte Influenzavirus in Mäusen eine Pneumonie induziert, deren Schwere von der Inoculumgröße abhängt hohe Dosen verursachen Tod, niedrige Dosen verursachen Lungenverletzungen, deren Ausmaß durch Narben bestimmt werden kann. Wenn Mäuse mit einer subletalen Dosis von Influenzaviren infiziert und auf demselben Weg behandelt werden, können die Lungenläsionen am 9. Tag ausgewertet werden, nachdem die Mäuse durch Enthauptung getötet wurden. Die statistische Signifikanz der Unterschiede von den Kontrollen wird durch den Wilcoxon-Test (1952) ausgewertet. Ergebnisse eines typischen Experiments werden in Tabelle 2 wiedergegeben.
Die Wirksamkeit der erfindungsgemäßen Verbindungen bei einem Enzephalitismodell kann durch Inokulierung von Mäusen, z.B. mit einem Semliki-Forestvirus, bestimmt werden. Beispielsweise wurden die Verbindungen i.c. in einem Volumen von 30 ul eines geeigneten Verdünnungsmittels gegeben. Die Ergebnisse für FCE 25148A, die in Tabelle 3 wiedergegeben werden, sind als % Mortalitätsschutz im Vergleich zu infizierten Kontrollen 10 Tage nach Infektion ausgedrückt.
Darüber hinaus zeigte die Verbindung FCE 25148A eine antivirale Wirksamkeit gegen Influenza und Semliki-Forest, die viel besser war als die von Ribavirin, das als Referenzverbindung verwendet wurde. Die erfindungsgemäßen Verbindungen können zur Heilung von Infektionen vom oben erwähnten Virus verwendet werden und können auch gegen andere virale Infektionen insbesondere durch RNA-Viren verwendet werden; spezielle Indikationen sind die Therapien von Toga, Bunja, Arena und anderen exotischen Viren. Außer gegen menschliche Viren können die Verbindungen auch gegen tierische ebenso wie gegen pflanzliche Viren verwendet werden.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind bei Verfahren zur Behandlung des menschlichen oder tierischen Körpers durch Therapie verwendbar. Sie haben eine antivirale Wirksamkeit und können gegen RNA-Viren in Menschen und anderen Säugetieren verwendet werden. Zu diesem Zweck können sie zu oralen Dosierungsformen wie Tabletten, Kapseln und dergleichen formuliert werden.
Die vorliegende Erfindung stellt eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Verfügung, die als Wirkstoff eine Verbindung der Formel I oder eines ihrer pharmazeutisch annehmbaren Baseadditionssalze, zusammen mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger oder Verdünnungsmittel umfaßt.
Die Verbindungen können allein oder in Kombination mit einem herkömmlichen Träger oder Verdünnungsmittel, wie beispielsweise Magnesiumkarbonat, Magnesiumstearat, Talk, Zucker, Lactose, Pectin, Dextrin, Stärke, Gelatine, Tragacanth, Methylzellulose, Natriumcarboxymethylzellulose, ein niedrig schmelzenden Wachs, Kakaobutter und dergleichen verabreicht werden.
Aromastoffe, Löslichkeitsvermittler, Gleitmittel, Suspendiermittel, Bindemittel, Tablettensprengmittel und dergleichen können eingesetzt werden. Die Verbindungen können mit oder ohne andere Träger verkapselt werden. In allen Fällen wird der Anteil der Wirkstoffe in diesen Zusammensetzungen sowohl fester wie flüssiger Art mindestens ausreichend sein, um ihnen eine antivirale Wirksamkeit bei oraler Verabreichung zu verleihen. Die Verbindungen können auch parenteral injiziert werden, wobei sie dann in Form einer sterilen Lösung, die andere gelöste Stoffe, beispielsweise hinreichend Kochsalz oder Glucose, um die Lösung isotonisch zu machen, enthält, verwendet werden. Typischerweise kann eine Tagesdosis von 20-2000 mg einer erfindungsgemäßen Verbindung an einen unter Behandlung stehenden Menschen verabreicht werden.
Die Verbindungen können als Aerosol mit Partikeln verabreicht werden, die klein genug sind, um den unteren Atemraum zu erreichen (massengemittelter Aerosoldurchmesser - 1-2 u) und können durch eine Sauerstoffmaske oder -zelt zur Behandlung von ernsten Infektionen des unteren Atemtrakts aufgrund von respiratorischem Syncytialvirus oder anderen Paramyxo- oder Myxoviren verabreicht werden.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung, ohne sie zu beschränken.

BEISPIEL 1

Adenosin-5'-methylphosphonatnatriumsalz (FCE 25148A)

Präparat A

Triethylamin (1,27 ml, 9,15 mMol) wurde zu einer gerührten Lösung, die 1,2,4-Triazol (820 mg, 11,8 mMol) und Methylphosphonyldichlorid (600 mg, 4,5 mMol) in trockenem Acetonitril (90 ml) enthielt, zugetropft. Die Mischung wurde 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt. Dann wurde wasserfreies Adenosin (1 g, 1,9 inMol), gelöst in trockenem Pyridin (10 ml), zugegeben. Nach 4 Stunden Rühren bei Raumternperatur wurde eine Lösung von Triethylamin (1,7 ml), Wasser (0,6 ml) und Pyridin (4 ml) zugetropft. Nachdem die Unterbrechung durch 5 %iges wäßriges NaHCO&sub3; vervollständigt war, wurde die Mischung unter Vakuum auf ein kleines Volumen eingedampft. Das Produkt in der konzentrierten wäßrigen Lösung wurde durch Reversphasenchromatographie unter Verwendung einer LiChroprep RP8 Säule und Eluierung mit Wasser gereinigt. Fraktionen, die das Produkt enthielten, wurden gesammelt und durch eine Dowex 50W-X8R,Na&spplus;Form-Säule geleitet. Abdampfen des Wassers ergab 350 mg Titelverbindung. Titel-HPLC: 99,0 % (254 nm)
¹H-NMR (200 MHz, DMSO): δ =8,41, 8,16 (2s, 2H, Adenin); 7,11 (bs, 2H, NH&sub2;); 6,10 (bs, 1H, OH); 5,89 (d, J=5,4Hz, 1H, H1'); 5,80 (bs, 1H, OH); 4,56 (dd, J=3,8, 5,4Hz, 1H, H2'); 4,25 (dd, J=3,3, 3,8Hz, IH, H3'); 3,99 (m, 1H, H4'); 3,79 (m, 2H CH&sub2; 5'); 0,94 (d, J=15,9Mz, 3H, P-CH-&sub3;)

Präparat B

Methylphosphonyldichlorid (530 mg, 4 mMol) in 5 ml Triethylphosphat wurde zu einer Suspension von Adenosin (540 mg, 2 mMol) in Triethylphosphat (5 ml), die bei 0ºC gehalten wurde, zugetropft. Die Reaktionsmischung wurde 6 Stunden bei 0ºC gerührt. Die Mischung wurde durch Zugabe von 100 ml einer 0,1 M wäßrigen Triethylammoniumbicarbonatlösung (TEAB) bei 0ºC abgebrochen. Die resultierende Lösung ließ man durch eine IRA 93 Säule (30 × 5 cm) durchlaufen. Die Säule, die das Produkt enthielt, wurde mit Wasser gewaschen und dann das Produkt mit 0,1 M wäßrigem TEAB eluiert. Die Lösung wurde unter Vakuum zur Trockne eingedampft, der Rückstand in Wasser gelöst, durch Reversphasenchromatographie (RPS) gereinigt und durch eine Dowex 50W-X8,Na&spplus;Form-Säule geleitet. Abdampfen des Wassers ergab 200 mg der Titelverbindung, die dieselben analytischen Daten wie Präparat A zeigte.

Präparat C

Carbonyldiimidazol (3,34 g, 20 mMol) wurde zu einer Lösung von Adenosin (2,67 g, 10 mMol) in trockenem DMF (20 ml) gegeben. Die Lösung wurde 4 Stunden gerührt, dann mit gesättiger wäßriger NaCl-Lösung verdünntund mehrmals mit Ethylacetat extrahiert. Die organische Phase wurde getrocknet (Na&sub2;SO&sub4;) und unter Vakuum eingedampft und der Rückstand aus Diethylether umkristallisiert, was festes Adenosin-2',3'-zyklisches Carbonat ergab. Triethylamin (6,8 ml, 49 mMol) wurde zu einer Lösung von Methylphosphonyldichlorid (3,25 g, 24,4 mMol) und 1,2,4-Triazol (4,4 g, 63,6 mMol) in trockenem Acetonitril (50 ml) zugetropft. Nach 15minütigem Rührem wurde die gesamte erhaltene Menge Adenosin-2',3'-zyklisches Carbonat, die in trockenem Pyridin (50 mg) gelöst wurde, zu dieser Lösung zugetropft und die Mischung 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt.
Danach wurde eine Mischung von Triethylamin (9 mg), Wasser (3 ml) und Pyridin (20 ml) zugegeben und die Reaktionsmischung mit 5 %igem wäßrigen Natriumhydrogencarbonat verdünnt. Die wäßrige Lösung wurde unter Vakuum konzentriert und durch eine LiChroprep RP-8-Säule unter Eluierung mit Wasser chromatographiert. Die Fraktionen, die das Produkt enthielten, wurden gesammelt und durch eine Säule mit Dowex 50W-X8,Na&spplus;Form geschickt.
Die wäßrige Lösung wurde eingedampft, wodurch man 1,8 g der Titelverbindung erhielt, die dieselben analytischen Daten wie Präparat A zeigte.

Präparat D

Diphenylcarbonat (17 g, 79,4 mMol) wurde zu einer Lösung von Adenosin (10 g, 37,4 mMol) und Phenol (3,4 g, 3,64 mMol) in Dimethylformamid (50 ml) gegeben. Die Suspension wurde 1 Stunde auf 150ºC erhitzt. Die Mischung wurde mit Diethylether (2 Liter) verdünnt, und der Niederschlag (Adenosin-2',3'-zyklisches Carbonat) abfiltriert.
Triethylamin (35,8 mg, 248 mMol) wurde zu einer Lösung von Methylphosphonyldichlorid (15,26 g, 114,7 mMol) und 1,2,4-Triazol (16,33 g, 236,7 mMol) in Acetonitril (200 ml) zugetropft. Die Lösung wurde 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt. Das erhaltene Adenosin-2',3'-zyklische Carbonat wurde in trockenem Pyridin (200 ml) gelöst und zur Lösung zugetropft. Die Reaktionsmischung wurde 4 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und dann eine Mischung von Triethylamin (45 ml), Wasser (24 ml) und Pyridin (50 ml) zugetropft. Alle organischen Lösungsmittel, die in der Mischung enthalten waren, wurden im Vakuum abgezogen und der Rückstand auf einer LiChroprep RP-8 Säule unter Eluierung mit Wasser chromatographiert. Die Fraktionen, die das Produkt enthielten, wurden gesammelt, durch eine Dowex 50W-X8,Na&spplus;Form-Säule geleitet, und Abdampfen des Wassers unter Vakuum ergab 7,5 g der Titelverbindung, die dieselben analytischen Daten wie Präparat A zeigte.

Präparat E

Triethylamin (1,36 g, 9,8 mMol) wurde zu einer Lösung von Methylphosphonyldichlorid (650 mg, 4,88 mMol) und 1,2,4-Triazol (880 mg, 12,72 mMol) in trockenem Acetonitril (10 ml) getropft und die Lösung 15 Minuten gerührt. 2',3,-O,O-bis(tertButyldimethylsilyl)adenosin (erhalten durch Standardverfahren, 990 mg, 2 mMol) wurden in trockenem Pyridin (10 ml) gelöst und zur Lösung zugetropft, die dann 45 Minuten bei Raumtemperatur gerührt wurde. Die Reaktionsmischung wurde durch Zugabe einer Mischung von Triethylamin (1,8 ml), Wasser (0,6 ml) und Pyridin (4 ml) abgelöscht und dann mit einer 5 %igen wäßrigen Natriumhydrogencarbonatlösung verdünnt. Die wäßrige Phase wurde mehrmals mit Chloroform extrahiert. Die organischen Extrakte wurden eingedampft und der Rückstand in Tetrahydrofuran (10 ml) gelöst.
Tetrabutylammoniumfluorid (1,2 g, 3,8 mMol) wurde zu der letzteren Lösung gegeben, die dann 30 Minuten bei Raumtemperatur gerührt wurde. Die Reaktionsmischung wurde mit 0,1 M wäßrigem Triethylammoniumbicarbonat gequencht und mit Methylenchlorid gewaschen. Die wäßrige Phase wurde unter Vakuum konzentriert und dann auf einer Reversphase (Lichroprep RP-8) unter Eluierung mit Wasser chromatographiert. Die Fraktionen, die das Produkt enthielten, wurden gesammelt und durch eine Dowex 50W-X8,Na&spplus;Form-Säule geschickt. Die wäßrige Lösung wurde unter Vakuum eingedampft, wodurch man 600 mg Titelverbindung erhielt, die dieselben analytischen Daten wie Präparat A zeigte.

Präparat F

Triethylamin (5 ml, 33,5 mMol) wurde zu einer Lösung von Methylphosphonyldichlorid (2,15 g, 15,8 mMol) und 1,2,4-Triazol (2,3 g, 33,3 mMol) in trockenem Acetonitril (30 ml) zugetropft. Nach 1stündigem Rühren bei Raumtemperatur wurde 6-N,N-2',3'-O,O-Tetrabenzoyladenosin (erhalten durch bekannte Verfahren, 3,6 g, 5,27 mMol), gelöst in trockenem Pyridin (10 ml), zugetropft und die Mischung 4 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Eine 0,1 M wäßrige Triethylammoniumbicarbonatlösung (250 ml) wurde zugegeben und die Mischung mit Methylenchlorid (3 × 100 ml) extrahiert. Die organische Phase wurde unter reduziertem Druck eingedampft, der Rückstand in Dioxan (50 ml) gelöst und mit 30 %igem wäßrigen NH&sub4;OH (450 ml) 12 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die wäßrige Lösung wurde unter Vakuum zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wurde mit Diethylether gewaschen und durch Reversphasenchromatographie auf einer LiChroprep RP-8-Säule und Eluierung mit Wasser gereinigt. Fraktionen, die das Produkt enthielten, wurden gesammelt und durch eine Dowex 50W-X8,Na&spplus;Form-Säule geleitet. Eindampfen der wäßrigen Lösung unter Vakuum ergab 1,3 g der Titelverbindung, die dieselben analytischen Daten wie Präparat A hatte.

BEISPIEL 2

5'-O-(P-isopropyloxy-P-methylphosphonyl)adenosin (FCE 26395)

Trockenes Isopropanol (160 ul, 2 mMol), gelöst in trockenem Pyridin (20 ml), wurde zu einer Lösung von Methylphosphonyldichlorid (250 ml, 2 mMol) in trockenem Pyridin (20 ml) zugetropft und die Mischung 4 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Dann wurde eine Suspension von Adenosin (500 mg, 1,8 mMol) in trockenem Pyridin (20 ml) zur Mischung zugegeben, die dann unter Vakuum auf 10 ml konzentriert und 12 Stunden bei Raumtemperatur gerührt wurde. Die Reaktion wurde mit 5 %igem wäßrigen Natriumhydrogencarbonat (100 ml) gequencht. Die Mischung wurde unter Vakuum eingedampft und der Rückstand auf einer LiChroprep RP-8-Säule unter Eluierung mit MeOH-H&sub2;O 2:8 cbromatographiert, wodurch 140 mg 5'-O-(P-isopropyloxy-P-methylphosphonyl)adenosin als Mischung der Diastereomere am P im Verhältnis 1:1 erhalten wurden. Titel-HPLC: 96 % (254 nm)
¹H-NMR (200 MHz, DMSO): δ =8,34, 8,16 (2s, 2H, Adenin); 7,45 (bs, 2H, NH&sub2;); 5,91 (d, J=5,1Hz, 1H, H1'); 5,2-5,7 (bs, 2 OH); 4,63 (m, 1H, H2'); 4,50 (m, 1H CH&sub3;-CH-CH&sub3;); 4,23 (m, 2H, H-3'H-4'); 4,0-4,2 (m,2H,CH&sub2;-5'); 1,40,1,38 (2d,J=17,3Hz, 3H, CH&sub3;-P, 2 Diastereomere); 1,20 (m, 6H CH(CH&sub3;)&sub2;)

BEISPIEL 3

Adenosin-5'-n-butylphosphonatnatriumsalz (FCE 26231A)

n-Butylphosphonyldichlorid (230 ml, 1,63 mMol) wurde zu einer Lösung von
6-N-benzoyl-2'-3'-O-(tetraisopropyldisiloxan-1,3-diyl)adenosin (erhalten durch bekannte Verfahren, 1 g, 1,63 mMol) in trockenem Pyridin (15 ml), das bei 0ºC gehalten wurde, zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde 2 Stunden gerührt, wobei man die Temperatur auf Raumtemperatur kommen ließ.
Eine 0,1 M wäßrige Triethylammoniumbicarbonatlösung (25 ml) wurde zugegeben und nach Verdünnung mit Wasser (50 ml) die Mischung mit Methylenchlorid (3 × 50 ml) extrahiert. Das Lösungsmittel der organischen Phase wurde unter Vakuum abgezogen. Der Rückstand wurde in Dioxan (25 ml) gelöst und mit wäßrigem 30 %igem NH&sub4;OH (75 ml) 1 Nacht bei Raumtemperatur behandelt. Die wäßrige Lösung wurde mit Diethylether (3 × 50 ml) gewaschen und Wasser unter Vakuum abgezogen. Der Rückstand wurde durch Reversphasenchromatographie auf einer LiChroprep RP-8-Säule unter Eluierung mit Wasser und dann mit einem Gradienten von Methanol von 0 bis 10 % gereinigt. Abziehen des Lösungsmittels aus den geeigneten Fraktionen ergab eine konzentrierte wäßrige Lösung, die durch eine Dowex 50W-X8,Na&spplus;Form-Säule geleitet wurde. Wasser wurde unter Vakuum abgezogen, so daß man 240 mg der Titelverbindung erhielt. Titel-HPLC: 95,7 % (254 nm)
¹H-NMR (200 MHz, DMSO): δ =8,41, 8,12 (2s, 2H, Adenin); 7,07 (bs, 2H, NH&sub2;); 5,88 (d, J=5,4Hz, 1H, H1'); 4,55 (dd, J=5,3, 5,4Hz, 1H, H2'); 4,22 (dd, J=3,7, 5,3Hz, 1H, H3'); 4,00 (m, 1H, H4'); 3,82 (m, 2H CH&sub2;-5'); 1,4-1,1 (m, 6H, CH&sub3;(CH&sub2;)&sub3;P); 0,77 (t, J=7,0Hz, 3H, CH&sub3;(CH&sub2;)&sub3;P). Tabelle 1 FCE 25148: in vitro Aktivität Virus Zelle Zytotoxizität T.C. ID&sub5;&sub0; (mg/ml) antivirale Wirksamkeit A.I. (TCID&sub5;&sub0;/IVID&sub5;&sub0;) Influenza respiratorischer Syncytialvirus Semliki Forest Coxsackie Col. SK Vaccinia Tabelle 2 in vivo Aktivität von FCE 25148A bei mit Influenzaviren infizierten Mäusen Verbindung Dosis mg/kg MCG/Maus Verabreichungsweg % Schutz (Lungenläsionen) Test Ribavirin (Wilcoxon-Test) Tabelle 3 in vivo Aktivität von FCE 25148A bei Mäusen mit Enzephalitis, induziert durch Semliki Forest-Virus Verbindung I.C. Behandlung Dosis (mg/kg) Konzentration (MCG/ml) % Schutz (Todesfälle) Bereich Ribavirin

Claims

1. Verwendung einer Verbindung der Formel (I):

worin B ein Purin- oder Pyrimidinheterozyklus ist; X Sauerstoff oder Schwefel ist; R eine Hydroxylgruppe oder ein Wasserstoffatom ist; R² eine lineare, verzweigte oder zyklische Alkylgruppe mit bis zu 20 Kohlenstoffatomen ist; R³ eine wie für R² oben definierte Gruppe oder ein Wasserstoffatom, ein Kation oder ein Radikal eines mehrwertigen Alkohols ist, bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer durch ein Virus verursachten Krankheit.

2. Verwendung gemäß Anspruch 1, worin B Adenin, Guanin, Cytosin, Thymin oder Uracil ist.

3. Verwendung gemäß Anspruch 1 oder 2, worin R² Methyl, Ethyl, Propyl, Isopropyl oder n-Butyl ist.

4. Verwendung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, worin R³ Methyl, Ethyl, Propyl, Isopropyl, n-Butyl, Natrium, Kalium, Ammonium oder ein Glyceryl- oder Kohlehydratrest ist.

5. Verwendung gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Verbindung der Formel (I) 5'-Methylphosphonatadenosin oder dessen Natriumsalz, 5'-O-(P-isopropyloxy-P-methylphosphonyl)adenosin oder Adenosin-5'-n-butylphosphonat oder das Natriumsalz davon ist.

6. Verbindung der Formel (I) gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5 mit Ausnahme von 5'-Methylphosphonyladenosin, 5'-Ethylphosphonyladenosin und 5'-Propylphosphonyladenosin.

7. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung gemäß Anspruch 6, umfassend die Phosphonylierung eines Deoxyribonukleosids oder Ribonukleosids mit einem geeigneten Alkylphosphonyldichlorid oder Alkylphosphonylditriazolid.

8. Verfahren gemäß Anspruch 7, umfassend die Ausführung der Phosphonylierung bei einem Deoxyribonukleosid oder Ribonukleosid, das an der Base und/oder an den sekundären Hydroxylgruppen geschützt ist und, falls erforderlich, Entfernung der Schutzgruppen vom Produkt nach der Phosphonylierung.

9. Verfahren gemäß Anspruch 7 oder 8, umfasssend die Umsetzung des Deoxyribonukleosids oder Ribonukleosids mit dem Alkylphosphonyldichlorid oder Alkylphosphonylditriazolid und mit einer Verbindung der Formel R³-OH, worin R³ wie in Anspruch 1 definiert ist, jedoch nicht Wasserstoff ist, wodurch eine Verbindung der Formel (I) erhalten wird, in der R³ nicht Wasserstoff ist.

10. Zur Behandlung einer durch einen Virus verursachten Krankheit geeignete Zusammensetzung, umfassend eine Verbindung der Formel (I) gemäß Anspruch 6 und ein pharmazeutisch annehmbares Verdünnungsmittel oder Träger.