DE69220940T2

DE69220940T2 - Verkürzte Formen den Hepatozyten Wachstumsfaktor (HGF) Rezeptors

Info

Publication number: DE69220940T2
Application number: DE69220940T
Authority: DE
Inventors: Paolo I-10100 Torino Comoglio; Tiziana I-10100 Torino Crepaldi; Maria I-10100 Torino Prat
Original assignee: Pharmacia and Upjohn SpA
Current assignee: Pfizer Italia SRL
Priority date: 1991-05-10
Filing date: 1992-04-30
Publication date: 1998-01-15
Anticipated expiration: 2012-05-01
Also published as: MX9202129A; NZ242645A; JPH06508508A; FI934934A0; JP3293823B2; ES2104914T3; US5571509A; EP0584125A1; FI934934A7; EP0584125B1; HUT67009A; IE921485A1; CA2102595A1; CA2102595C; DE69220940D1; DK0584125T3; WO1992020792A1; HU9303182D0; MY108614A; IL101809A0

Description

Diese Erfindung betrifft verkürzte Formen des Hepatocytenwachstumsfaktor (HGF)-Rezeptors, deren Herstellung und pharmazeutische Zusammensetzungen, die diese enthalten.
Das MET-Protooncogen (Cooper et al, Nature 311, 29-33, 1984; Dean et al, Nature 318, 385-388, 1985; Part et al, PNAS USA 84, 6379-6383, 1987) kodiert ein Transmembranglycoprotein (p190MET oder Met-Rezeptor) mit einheitlichen Merkmalen, das ein Heterodimer ist, das sich aus zwei Disulfidverbundenen Ketten mit 50 Kda (p50α) und 145 Kda (p145β) (Giordane et al, Mol. Cell. Biol. 8, 3510-3517, 1988; Giordano et al, Nature 339, 155-156, 1989) zusammensetzt. Beide Ketten sind an der Zelloberfläche exponiert. Die β-Kette erstreckt sich über die Plasmamembran mit einer hydrophoben Aminosäuredehnung und besitzt eine intracelluläre Tyrosinkinasedomäne (Dean et al, 1985; Gonzatti-Haces et al, PNAS USA 85, 21-25, 1988; Tempest et al, FEBS Lett. 209, 357-361, 1986). Der Rezeptor wird als ein 170 kDa- Vorläufer, der glycosiert und enzymatisch gespalten ist, synthetisiert, unter Erhalt des reifen Heterodimers (Giordano et al. Oncogene, 4, 1383-1388, 1989; Tempest et al., Br. J. Cancer 58, 3-7, 1988).
Vor kurzem wurde der Hepatocytenwachstumsfaktor (HGF) als Ligand für den Met Rezeptor vorgeschlagen (Bottaro et al., Science 251, 803-804, 1991; Naldini et al, Oncogene 6, 501-504, 1991; Naldini et al, 1991, EMBO J., 10, 2867-2878). HGF, ebenfalls bekannt als Hepatopoietin-A (Miyazawa et al., Biochem. Biphys. Res. Commun. 163 967-973 (1989) ; Nakamura et al., Nature 342, 440-443, 1989; Zarnegar et al. Cancer Res. 49, 3314, 1989) wurde als stärkstes Mitogen für Ratten- und Menschen Hepatocyten in Primärkulturen als hepatotropher Faktor, der in vivo bei der Leberregenerierung involviert ist, sowohl bei Menschen als auch Nagetieren beschrieben (für einen Überblick vergleiche Michalopoulos, FASEB J. 4, 176-187, 1990). In Ratten und Kaninchen wurde HGF ebenfalls in dem Pancreas, der Speicheldrüse, Duodenum, Schilddrüse und ausgewählten Flächen des zentralen Nervensystems ermittelt (Tashiro et al., Proc. Natl. Acad-Sci. USA 87, 3200-3204, 1990; Zarnegar et al., Proc. Natl. Acad-Sci, USA 87, 1252-1256, 1990).
Das MET-Oncogen wurde ursprünglich durch Transfection identifiziert, wobei DNA von einer menschlichen Zellinie verwendet wurde, die mit einem chemischen Carcinogen behandelt war (Cooper et al., Nature 311, 29-33, 1984). In dieser Zellinie war das MET-Gen durch eine chromosomale Umlagerung aktiviert (Park et al., Cell 45, 895 (1986)). Es wurde ebenfalls festgestellt, daß MET in einer menschlichen, Magencarcinom-Zellinie (Giordano et al., Mol. Cell Biol. 8, 3510, 1988) und in spontan transformierten Mausfibroblasten (cooper et al., EMBO J., 5, 2623, 1986) verstärkt und aktiviert wurde.
Wir haben nun monoklonale Antikörper entwickelt, die für die extracelluläre Domäne spezifisch sind, und haben diese zum Screenen von mehreren menschlichen Zellinien verwendet. Neben dem bekannten p190MET erkannten diese Antikörper konsistent zwei andere MET-Heterodimere: einen 140 kDa- Komplex, der an der Zelloberfläche lokalisiert ist, und einen 130 kDa- Komplex, der in das Kulturmedium freigesetezt ist. Beide Komplexe bestehen aus einer α-Kette, die von p50α nicht unterscheidbar ist, und aus einer C- Terminus-abgekürzten β-Kette (p85β bzw. p75β), bei denen die zytoplasmische Kinasedomäne fehlt. Diese verkürzten Met-Formen werden in vivo durch Posttranslationale proteolytische Verarbeitung erzeugt. Die Proteinkinase C- Aktivierung verstärkt die p130MET-Freisetzung in dem Kulturmedium.
Verkürzte Formen von Wachstumsfaktorrezeptoren wurden in mehreren Zellen, Gewebekulturüberständen und biologischen Fluiden beschrieben (Beguin et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 85, 637-640; DiStefano et al 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85, 270-274; Johnson et al., 1990, Mol. Cell. Biol., 10, 4728-4736; Mosley et al., 1989, Cell, 591 335-348; Zabrescky et al., 1991, J. Biol. Chem., 266, 1716-1720). Vor kurzem wurde berichtet, daß lösliche Formen von C-Terminus-verkürzten Formen mit dem intakten Rezeptor für die Ligandenbindung kompetitieren können und mit der Liganden-induzierten Stimulierung der Tyrosinkinaseaktivität durch Bildung von inaktiven Heterodimeren wechselwirken können (Basu et al., 1989, Mol. Cell. Biol., 9, 671-677; Kashles et al., 1991, Mol. Cell. Biol., 11, 1454- 1463; Ueno et al., 1991, Science, 252, 844-848).
Demgemäß stellt die vorliegende Erfindung ein Protein zur Verfügung, das sich aus zwei Disulfid-verbundenen Ketten mit 50 kDa und 75 bzw. 85 kDa zusammensetzt, wobei die 50 kDa-Kette die α-Kette der Tyrosinkinase ist, die durch das MET-Protooncogen kondiert ist, und die 75 oder 85 kDa-Kette eine C-Terminus-verkürzte Form der β-Kette der Tyrosinkinase ist.
Die beiden C-Terminus-verkürzten Met-Proteine entsprechend dieser Erfindung sind eine 140 kDa-Transmembranform (p140MET) und ein 130 kDa lösliches Protein, das in dem Kulturmedium (p130MET) freigesetzt wird. Diese verkürzten Formen sind in der GTL-16 menschlichen Magenkarzinomzellinie, wo das MET-Gen verstärkt und überexprimiert wird (Giordano et al, 1988) ebenso wie in anderen Carcinomazellinien mit normalen Gehalten der MET-Expression ermittelbar.
Die verkürzten MET-Proteine haben die gleiche heterodimere Struktur des intakten p190MET, das aus zwei Disulfid-gebundenen Ketten besteht. Die α-Ketten der verkürzten Formen sind von der α-Kette von p190MET nicht unterscheidbar, während deren β-Ketten ein niedrigeres Molekulargewicht haben. Die β-Kette von p140MET ist etwa 85 kDa (p85 β), wobei die β-Kette von p130MET etwa 75 kDa (p75β) ist.
Sowohl p85β als auch p75β sind an ihren C-Termini verkürzt. Sie werden nicht durch Antikörper erkannt, die gegen ein C-Terminus-Nonadecapeptid gerichtet sind, das von der MET-Sequenz vorbestimmt ist. Ihnen fehlt die zytoplasmische Tyrosinkinasedomäne, die Tyr¹²³&sup5; enthält, die hauptsächliche in vitro Phosphorylierungsstelle, wie durch die Tatsache gezeigt wird, daß sie nicht an Tyrosin in vivo oder in vitro phosphoryliert werden. P85 β und P75 β teilen sich die N-Terminusdomäne mit p145β, da sie alle durch monoklonale Antikörper erkannt werden, die vier verschiedene Epitope definieren, und sie haben die gleichen extrazellulären tryptischen Peptide.
Es wird angekommen, daß die p85β-Kette ein Transmembranglycoprotein ist, das den hauptsächlichen Teil seiner cytoplasmischen Domäne verloren hat. Basierend auf der vorgesagten Aminosäuresequenz würde eine Spaltung der letzten 435 C-Terminus-Aminosäuren die molekulare Masse um etwa 50 kDa reduzieren. Dieser Wert ist mit dem beobachteten Unterschied der elektrophoretischen Migration der intakten gegenüber den verkürzten β-Ketten konsistent. p75β fehlt die zytoplastische Domäne und das Transtnembransegment, da es in dem Kulturüberstand freigesetzt wird und nicht mit der Zellmembran assoziiert. Darüber hinaus zeigt eins es 10 kDa-Reduktion im Vergleich zu der Membran-überspannenden p85β-Kette. Diese Größenreduktion ist mit dem Verlust eines Segmentes, einschließlich der Transmembrandomäne kompatibel.
Die Proteine dieser Erfindung können von Kulturen von Zellinien erhalten werden, in denen das MET-Gen exprimiert ist. Typischerweise sind die Zellinien Carcinomzellinien. Demgemäß stellt diese Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Proteins der Erfindung zur Verfügung, worin die C- Terminus-verkürzte Form der β-Kette die 75 kDa-Kette ist, wobei das Verfahren umfaßt:
(i) Kultivieren von Zellen, die das MET-Gen exprimieren, in einem Medium dafür;
(ii) Kontaktieren des resultierenden konditionierten Mediums mit einem Antikörper, der für die extracelluläre Domäne der β-Kette der Tyrosinkinase spezifisch ist, die durch das MET-Gen kodiert ist; und
(iii) Freisetzen des Proteins von dem resultierenden Immunkomplex.
Die Zellen, die das MET-Gen exprimieren, können Zellen von irgendeiner angemessenen Zellinie sein. Geeignete Zellen sind Zellen von Magenkarzinom, Lungenadenocarcinom-, oralen Carcinom- und Coloncarcinom-Zellinien. Bevorzugt werden Zellen verwendet, die das MET-Gen überexprimieren. Das Kulturmedium kann irgendein Medium sein, das eine assimilierbare Quelle von Kohlenstoff, eine assimilierbare Quelle von Stickstoff und je nach Wunsch Mineralsalze enthält. RPMI 1640-Medium, wahlweise ergänzt mit fetalem Kälberserum, ist ein nützliches Medium.
Ein Antikörper, der für die extrazelluläre Domäne der β-Kette der Tyrosin-Kinase, die durch das MET-Gen kodiert ist, spezifisch ist, kann auf konventionelle Weise gebildet werden. Der Antikörper ist typischerweise ein monoklonaler Antikörper (Kohler and Milstein, Nature 256, 495-497, 1975). Hybridomzellen, die einen monoklonalen Antikörper erzeugen, können durch Schmelzen von Milzzellen von einem immunisierten Tier mit einer Tumorzelle hergestellt werden. Der Säuger, der immunisiert ist, kann eine Ratte oder Maus sein. Der Säuger kann mit gesamten Zellen oder Extrakten von Zellen, die das MET-Gen exprimieren, immunisiert sein. Bevorzugt überexprimieren die Zellen das MET-Gen. Antikörper, die durch die Hybridome erzeugt sind, werden durch Beurteilung ihrer Fähigkeit für die Immunpräzipitation des MET-Proteins untersucht, das von einer Met-Protein-produzierenden Zellinie extrahiert ist. Die Hybridome können in Kultur gewachsen sein oder intraperitoneal für die Bildung von Ascitesfluid oder in den Blutstrom eines albgenen Wirts oder eines immunokomprimittierten Wirts injiziert werden.
Ein Immunopräzipitat bildet sich zwischen dem Antikörper und p130MET, das in dem konditionierten Medium vorhanden ist. Das Immunopräzipitat wird gesammelt, zum Beispiel auf einer Säule, wie Protein-A-Sepharose (Warenname)-Säule, an die spezifische anti-Met-Antikörper gebunden und vernetzt sind. p&sub1;&sub3;&sub0;MET wird von dem Immunkomplex durch Behandlung mit niedrigem pH oder hohem Salz freigelassen.
Ein Protein entsprechend dieser Erfindung, worin die C-Terminusverkürzte Form der β-Kette die 85 kDa-Form ist, wird entsprechend der Erfindung durch ein Verfahren hergestellt, umfassend:
(i) Extrahieren von Zellen, die das MET-Gen exprimieren, unter Verwendung eines Detergenz;
(ii) Kontaktieren des Extraktes mit einem Antikörper, der für die extrazelluläre Domäne der β-Kette der Tyrosinkinase, die durch das MET-Gen kodiert ist, spezifisch ist; und
(iii) Freisetzen des Proteins von dem resultierenden Immunokomplex.
Die Zellen, die das MET-Gen exprimieren, und das Kulturmedium, in dem sie gewachsen sind, sind wie oben beschrieben. Die Zellen werden mit einem Detergens extrahiert, typischerweise einem nicht-ionischen Detergens wie Triton X100 oder CHAPS (3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio-1- propansulfonat)). CHAPS ist von Fluka kommerziell erhältlich und wird als eine 1%-ige Lösung in HEPS-Puffer verwendet, wie in Naldini et al., Molecular and Cellular Biology, (Bd. 11, Nr. 4 (April 1991), Seiten 1793-1803) beschrieben. Typischerweise werden die Zellen in einem Puffer extrahiert. Proteaseinhibitoren können zusätzlich vorhanden sein, wie Pepstatin-, Leupeptin-, Aprotinin- und Trypsin-Inhibitor. Der resultierende Extrakt wird mit einem Antikörper kontaktiert, der für die β-Kette der Tyrosinkinase sezifisch ist, die durch das MET-Gen kodiert ist, und p140MET wird von dem resultierenden Immunopräzipitat wie oben beschrieben freigesetzt.
Ein Protein entsprechend dieser Erfindung kann isoliert und gereinigt werden. Es kann im wesentlichen frei von der vollständigen Tyrosin-Kinase, die durch das MET-Gen kodiert ist, und tatsächlich im wesentlichen frei von anderen Komponenten von Zellen, die das MET-Gen exprimieren, geschaffen werden. Das Protein kann als ein Antagonist von HGF verwendet werden. Das Protein behält die Fähigkeit, an HGF zu binden, ihm fehlt aber die Tyrosinkinase-Domäne, und es ist nicht in der Lage, das intrazelluläre nitogenesignal zu transduzieren. Das Protein kann daher bei der Behandlung von neoplastischen Erkrankungen, einschließlich Tumoren des gastromtestinalen Traktes, der Leber, der Schilddrüse und des Gehirns verwendet werden. Zusätzlich exprimiert ein hoher Prozentsatz dieser Tumoren den HGF-Rezeptor und erfordert ein Wachstum von HGF. Es kann ebenfalls als Mittel zum Unterdrücken der hepatitischen Regenerierung für die Behandlung von Leberhyperplasie oder Adenomatose verwendet werden.
Das erfindungsgemäße Protein kann einem Patienten durch eine angemessene parenterale Route verabreicht werden. Die Wahl, ob eine subkutane, intravenöse oder intramuskuläre Verabreichung angewandt wird; der Dosis und der Häufigkeit der Verabreichung, hängen von einer Vielzahl von Faktoren ab. Diese Faktoren umfassen den Zweck der Verabreichung, das Alter und Gewicht des Patienten, der behandelt wird, und den Zustand des Patienten. Eine therapeutisch effektive Mengen wird gegeben. Tyischerweise wird jedoch das Protein in einer Menge von 10 bis 1000 µg pro Dosis, mehr bevorzuzgt von 50 bis 500 µg Dosis für jede Verabreichungsroute verabreicht.
Das Protein kann zu einer pharmazeutischen Zusammesnetzung formuliert werden. Die pharmazeutische Zusammensetzung umfaßt ebenfalls einen pharmazeutisch akzeptablen Träger oder Verdünnungsmittel. Irgendein angemessener Träger oder Verdünnungsmittel kann in Abhängigkeit von der Verabreichungsroute verwendet werden.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung. In den beigefügten Zeichnungen zeigt:
Fig. 1, daß eine verkürzte Form des Met-Proteins durch monoklonale Antikörper gegen die extracelluläre Domäne identifiziert wird. Listen A und B: GTL-16 Zellen, deren Oberfläche mit ¹²&sup5;I in der Gegenwart von Lactoperoxidase markiert ist. Celluläre Proteine wurden mit Triton X-100 löslich gemacht, mit den verschiedenen Mabs, die entweder gegen das C-Terminus- Peptid (DR-6, Spur 1) oder die extracelluläre Domäne (DO-24, DN-30, DN-31, Spuren 2, 3, 4) des Met-Proteins gerichtet sind, immunausgefällt. Immunausgefällte Proteine wurden durch Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) unter nicht-reduzierenden Bedingungen (Liste A) oder nach Reduktionsbehandlung mit 2β-Mercaptoethanol (Liste B) getrennt. Liste C: die p140MET (Spur 1)- und die P190MET-Komplexe (Spur 2), erhalten nach Immunausfällung mit DO-24 Mabs wurden von der SDS-PAGE herausgeschnitten, in Laemmli-Puffer eluiert, durch 2β-Mercaptoethanol reduziert und in SDS-PAGE unter reduzierenden Bedingungen analysiert. Die Gele wurden getrocknet und der Autoradiographie für 3 Tage ausgesetzt.
Fig. 2 zeigt zweidimensionale tryptische Peptidkarten der extrazellulären Domänen der β-Ketten, die von intakten oder verkürzten Met-Rezeptoren isoliert sind. P145 β (Teil A), p85β (Teil B) und p75β (Teil C) wurden in SDS-PAGE getrennt, mit anschließender Immunausfällung mit Mabs-antiextrazellulärer Domäne entweder von oberflächenradiojodierten GTL-16-Zellen oder dem Überstand von radiojodierten GTL-16-Zellen. Proteine wurden elektrophoretisch zu der Immobilon-P-Membran übertragen und einer erschöpfenden tryptischen Verdauung unterworfen. Etwa 3000 cpm eines jeden digerierten Stoffes wurden in der rechten unteren Ecke, die der Anode entspricht, getröpfelt und einer Electrophorese bei pH 1,9 und einer aszendierenden Chromatographie in Pyridin-Essigsäure-Butanol-Wasser unterworfen. Ein hauptsächliches tryptisches Peptid (Pfeil), erhalten von der α-Kette des Met- Proteins, ist zum Vergleich gezeigt (Teil D). Die Karten wurden zwei Wochen bei -70ºC verstärkenden Screens exponiert. Der Ursprung ist mit einem Kreis gekennzeichnet.
Fig. 3 zeigt, daß p140MET nicht in vitro phosphoryliert ist. Proteine, die von GTL-16-Zellen in nicht-ionischem Detergens löslich gemacht sind, wurden mit MAbs antiextracellulärer Domäne des Met-Proteins (DL-21, DO-24, DN-30, DN-31, Spuren 1, 2, 3, 4) oder mit MAbs gegen ein nicht verwandtes Protein (Spur 5) immunausgefällt. Gewaschene Immunkomplexe wurden in der Gegenwart von (γ-³²P]ATP phosphoryliert, und markierte Proteine wurden durch SDS-PAGE unter nicht-reduzierenden Bedingungen (Teil A) oder reduzierenden Bedingungen (in der Gegenwart von 2 β-Mercaptoethanol, Teil B) getrennt. Gele wurden getrocknet und 2 Tage einer Autoradiographie ausgesetzt. Nur die intakte P190MET oder die intakte p145β-Kette und der Pr170- Met-Vorläufer sind markiert.
Figur 4 zeigt, daß Mausfibroblasten, die mit der menschlicher MET cDNA transfiziert sind, intakte p190MET ebenso wie verkürzte Formen exprimieren. Proteine, die in siedendem Laemmli-Puffer von NIH 3T3-Zellen löslich gemacht sind, die mit der Vollängen-MET-cDNA, die sich von der Haupt 9kb mRNA (Spuren 1, 2) oder von deren konditionierten Medien (Spur 3 und 4) ableitete, transfiziert waren, wurden durch Western-Blot unter reduzierenden Bedingungen analysiert. Spuren: 1 und 4, Mabs gegen das C-Terminus-Peptid des Met-Proteins; 2 und 3, MAb (DO-24), gegen die Met-extrazelluläre Domäne gerichtet. Eine spezifische Bindung wurde durch das verbesserte Chemilumineszenz-System (ECLTM, Amersham) ermittelt. Banden A bis D haben Größen, die mit dem 170kDa Met-Vorläufer (A), dem intakten p145 β (B), dem verkürzten p85 β (C) und dem löslichen p75β (D) konsistent sind.
Fig. 5 zeigt die unebene celluläre Lokalisierung von p190MET und p140MET. GTL-16-Zellen wurden mit [³H]Glucosamin für 18 h markiert. Lebende Zellen wurden für 2 h auf Eis mit MAbs inkubiert, bevor sie mit Detergens lysiert wurden (Spuren 1, 3, 5). Alternativ wurden Zellen zunächst lysiert und dann mit Mabs inkubiert (Spuren 2, 4, 6). In beiden Fällen wurden Immunkomplexe mit Protein-A-Sepharose wiedergewonnen und radiomarkierte Proteine in SDS-PAGE unter reduzierenden Bedingungen analysiert. Die folgenden Antikörper wurden verwendet: Mabs, gerichtet gegen die extracelluläre Domäne (DO-24, Spuren 1, 2) oder gegen das C-Terminus-Peptid des Met-Proteins (DR-6, Spuren 5,6) und Mabs gegen die extrazelluläre Domäne des Rezeptors für EGF (Spuren 3,4). Die Gele wurden getrocknet und für 4 Tage der Autoradiographie ausgesetzt.
Fig. 6 zeigt die Expression von p140MET in verschiedenen menschlichen Zellinien unter physiologischen Bedingungen (Western Blot). Zelluläre Proteine wurden in siedendem Laemmli-Puffer löslich gemacht, auf SDS-PAGE unter nicht-reduzierenden Bedingungen getrennt, auf ein Nitrocellulose-Blatt übertragen und nacheinander mit DL-21 Mabs und [¹²&sup5;I]-Schaf-α-Maus-Ig dekoriert. In jede Spur wurden 300 µg zelluläre Proteine geladen; in der GTL- 16-Spur wurden 100 µg geladen. Zellinien sind wie folgt; Spur 1: A549; Lungencarcinom, Spur 2: GTL-16, Magencarcinom; Spur 3: SK-BR3, Brustkarcinom; Spur 4: HT-29, Coloncarcinom; Spur 5: KB, Oralcarcinom.
Figur 7 zeigt, daß eine lösliche, verkürzte Form des MET-Proteins durch monoklonale Antikörper gegen die extrazelluläre Domäne identifiziert wird. GTL-16 (Teile A, C) oder A549-Zellen (Teil B) wurden über Nacht mit [³&sup5;S]Methionin (100 µCi/ml) markiert, gewaschen und mit nicht-ionischem Detergens extrahiert. Geklärte Zellextrakte (Spuren 1) und konditionierte Medien (Spuren 2, 3) wurden mit Mabs, gerichtet gegen die extracelluläre Domäne (DO-24, Spuren 1, 3) oder gegen das C-Terminuspeptid (DR-6, Spuren 2) des Met-Proteins ausgefällt. Immunausgefällte Proteine wurden auf SDS-PAGE unter nicht-reduzierenden Bedingungen (Teile A, B) oder nach Reduktionsbehandlung mit 2 β-Mercaptoethanol (Teil C) getrennt. Gele wurden fluorographiert, getrocknet und 3 Tagene der Autoradiographie ausgesetzt.
Fig. 8 zeigt, daß das löslichte p130MET durch Proteolyse von Met- Proteinen erzeugt wird, die an der Zelloberfläche exponiert sind. GTL-16- Zellen wurden mit ¹²&sup5;I in der Gegenwart von Lactoperoxidas oberflächenmarkiert. Nach Inkubation für 4 h wurden markierte Proteine entweder von Kulturüberständen (Spuren 1, 2) oder von Zellextrakten (Spuren 3, 4) isoliert und mit Mabs, gerichtet gegen die extracelluläre Domäne (DO-24, Spuren 2, 3) oder gegen das C-Terminuspeptid (DR-6, Spuren 1,4) des Met-Proteins, immunausgefällt. Immunausgefällte Proteine wurden auf SDS-PAGE unter reduzierenden Bedingungen getrennt. Die Gele wurden getrocknet und für 18 h einer Autoradiographie ausgesetzt.
Figur 9 zeigt die Aufregulierung der p130MET-Freisetzung von der Zelloberfläche durch Proteinkinase-C-Aktivierung. Die GTL-16-Zellen wurden mit [³&sup5;S]Methionin (100 µCi/ml) über Nacht markiert, für 2 h mit 160 nM TPA, aufgelöst in Dimethylsulfoxid, (Spuren T) oder mit Dimethylsulfoxid alleine (Spuren C) behandelt, gewaschen und mit nicht-ionischem Detergens extrahiert. Konditionierte Medien (A) und geklärte Zellextrakte (B) wurden mit MAbs, gerichtet gegen die Met-extrazelluläre Domäne (DO-24) ausgefällt. Immunkomplexe, auf Protein-A-Sepharose gesammelt, wurden in SDS-PAGE unter reduzierenden Bedingungen analysiert. Die Gele wurden fluorographiert, getrocknet und für 6 h der Autoradiographie ausgesetzt. Teil C: GTL-16-Zellen wurden mit TPA (Spur T) oder Dimethylsulfoxid (Spur C) wie oben beschrieben behandelt, mit ¹²&sup5;I durch Lactoperoxidase markiert, gewaschen und mit nicht-ionischem Detergens extrahiert. Geklärte Zellextrakte wurden zur Immunausfällung mit MAbs DO-24 verarbeitet, und Immunkomplexe wurden wie oben analyisert.
Figur 10 zeigt die Bindung von ¹²&sup5;I-HGF durch lösliches p130MET MAb DN-30, gerichtet gegen die extracelluläre Domäne von Met-Protein, wurde auf PVC-Microtiter-Wells geschichtet und als Einfänger für verschiedene Konzentrationen von p130MET oder konditioniertem Medium, das kein p130MET (-) aufwies, verwendet. ¹²&sup5;I-HGF wurde dann wie in Beispiel 2 unter Materialien und Verfahren beschrieben zugegeben. Platten wurden bei 4ºC über Nacht inkubiert, dreimal gewaschen, und die gebundene Radioaktivität wurde mit 1% SDS eluiert und in einem γ-Zähler gemessen.
Figur 11 zeigt die Inhibition der in vivo-Tyrosin-Phosphorylierung des HGF-Rezeptors (p145b-Subeinheit) durch lösliches p130MET. GTL-16-Zellen wurden mit p130MET, das teilwesie durch Affinitätschromatographie auf Lentil-Lectin gereinigt war, wie in Beispiel 2 unter Materialien und Verfahren beschrieben inkubiert. Die relative Menge an Phosphotyrosin, das in P145 β vorhanden ist, wurde durch Messen der optischen Dichte der entsprechenden Bande abgeschätzt, die in Radiogrammen von Western blots, die mit P-Tyr- Antikörpern sondiert waren, beobachtet wurde. Die gezeigten Werte sind von einem repräsentativen Experiment. A: Zellen, die mit konditioniertem Medium inkubiert waren, das kein p130MET aufwies; B: Zellen, die mit Lentil Lectin gereinigtem p130MET inkubiert waren.
Fig. 12 zeigt die Inhibition der in vitro Tyrosinkinaseaktivität des Met/HGF-Rezeptors (p145β-Subeinheit) durch lösliches p130MET. Der Rezeptor wurde mit polyklonalem anti-Met-Serum ausgefällt und für 5 Minuten bei Raumtemperatur mit 60 µl an verschiedenen Verdünnungen von konditioniertem Medium, das frei war von p130MET (A), oder von teilweise gereinigtem p130MET (B) inkubiert. Die Kinasereaktion wurde auf Eis für 2 Minuten in der Gegenwart von 100 µM [γ-³²P]ATP und 5 mM MgCl&sub2; durchgeführt. Nach SDS- PAGE und Autoradiographie wurde die Kinaseaktivität durch Messen der optischen Dichte der ³²P-markierten Pande mit einem Laserdensitometer quantifiziert. Die gezeigten Werte sind von einem repräsentativen Experiment.
Fig. 13 erläutert die radioimmunometrische Ermittlung von löslichem p130 Met, das von GTL-16-Zellen in Gewebekulturmedium freigesetzt ist. Offene Kreise: GTL-16-Überstand; geschlossene Kreise: RPMA-Medium (negative Kontrolle).

Beispiel 1

Materialien und Verfahren

Zellen

Alle verwendeten Linien sind humanen Ursprungs. GTL-16-Zellen sind eine donale Linie, die sich von einem schlecht differenzierten Magenkarzinom ableiten (Giordano et al, Mo. Cel. Biol. 8, 3510-3517, 1988). A549- Lungenadenocarzinomzellen, KB Oralcarcinomzellen, HT-29 Coloncarcinomzellen und SK-BR-3 Brustcarcinomzellen wurden von der American Type Culture Collection gekauft. Die Zellen wurden in RPMI 1640-Medium, das mit 10% fetalem Kälberserum (Flow Laboratories, Inc. Mclean, Va) in einer 5% CO&sub2;-Wasser gesättigten Atmosphäre ergäntzt war, wachsen gelassen.

Antikörper

MAbS gegen die extracelluläre Domäne des Met-Proteins wurden nach Immunisierung mit gesamten lebenden GTL-16-Zellen, die das Met-Protein überexprimieren, entsprechend der Vorgehensweise von Kohler und Milstein erhalten (Nature 256, 495-497, 1975). Immunmilzzellen wurden mit Ag8.653- Myelomzellen verschmolzen, und Hybridüberstände wurden in einem immunoenzymatischen Assay (Prat et al, Cancer Detection and Prevention, 10, 293- 301, 1987) für deren Differentialbindung an GTL-17-Zellen gescreent. Die Hybridüberstände wurden bezüglich ihrer Fähigkeit, selektiv an Zellen, die das Met-Protein überexprimieren, in einem immunoenzymatischen Assay in festem Zustand gescreent (Prat et al, 1985). Für die Immunausfällungsversuche wurden Zellen für 18 h mit ³&sup5;S-Methionin markiert, intenstiv gewaschen und mit dem nicht-ionischen Detergens Triton X100 wie zuvor beschrieben lysiert (Prat et al, Cancer Research, 45, 5799-5807, 1985). Die Proben wurden auf 8% SDS-PAGE analysiert und bei 7000 unter Verwendung von Amersham Hyperfilm für 1 Tag autoradiographiert.
Vier verschiedene MAbs (DL-21, DN-30, DN-31, DO-24) wurden für diese Studien ausgewählt. Die MAbs reagieren mit verschiedenen Epitopen der β- Kette, basierend auf einer reziprokalen Kreuzkompetition. Da identische Ergebnisse mit verschiedenen MAbs erhalten wurden, beziehen wir uns der Einfachheit halber auf diesen Teil als MAbs antiextracellulärer Domäne. Ein monoklonaler Antikörper (DR-6) wurde ebenfalls gegen ein Peptid gebildet, das 19 C-Terminus-Aminosäuren (von Ser¹³&sup7;² bis Ser¹³&sup9;&sup0;) der MET-Sequenz (EMBL Datenbankreferenz Nr. X54559) entspricht. Monoklonale Antikörper gegen die extracelluläre Domäne des epidermalen Wachstumsfaktorrezeptors sind solche, die durch Honegger et al, EMBO J. 7(10), 3053-3060, 1988 beschrieben sind. Nicht bezogene MAbs wurden als negative Kontrolle verwendet.
Zelloberflächeniodierung, metabolisches Markieren und Immunausfällung
Lactoperoxidase-H&sub2;O&sub2;-katalysierte Zelloberfächenradiojodierung wurde, wie zuvor beschrieben durchgeführt (Giordano et al, 1988). Für Puls- Matrizenexperimente wurden Zellen mit methioninfreiem Medium für 30 Minuten vorbehandelt, mit 400 µCi/ml [³&sup5;S]-Methionin für 15 Minuten gepulst, zweimal mit komplettem Medium gewaschen und dann für unterschiedliche Zeitperioden verfolgt. Zellen wurden mit 100 µCl/ml [³H]-Glucosamin oder [³&sup5;S]- Methionin für 18 h markiert. Alle radioaktiven Isotope wurden von Amersham (Amersham Corp., Arlington Heights, I11) gekauft. Nach dem Markieren wurden die Zellen mit eiskaltem Puffer, umfassend 10 mM Pipes, pH 7,6, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl&sub2;, 300 mM Sucrose, 5 mM EGTA (DIM-Puffer), 1% Triton X-100 und Inhibitoren von Proteasen (Pepstatin, 50 µg/ml; Leupeptin, 500 µg/ml; Aprotinin, 1 µg/ml, 2 mM PMSF, Sigma; Sojabohnentrypsininhibitor, 500µg/ml, Boehringer) extrahiert. Ultrazentrifugierte Gewebekulturüberstände oder Zellextrakte wurden auf Protein-A-Sepharose vorgereinigt und mit den verschiedenen Antikörpern immunausgefällt. Die Immunausfällung von Molekülen, die an der Zelloberfläche exponiet waren, erfolgte durch Inkubieren von intakten GTL-16-Zellen mit MAbs vor der Lysis mit Detergens. Immunkomplexe wurden auf Protein-A-Sepharose gesammelt, zuvor reagiert mit affinitätsgereinigten Ziegen-Anti-Maus-Ig-Antikörpern (GαMlg), gewaschen und eluiert in Laemmli (Nature 230, 680-685, 1970)-Puffer mit oder ohne 2 β- Mercaptoethanol. Tetradecanoylphorbolacetat (TPA)-Behandlung wurde bei GTL- 16-Zellen, die mit [³&sup5;S]Methionin für 18 h markiert waren, durchgeführt. Die Zellen wurden mit frischem RPMI-Medium gewaschen und weiter mit Dimethylsulfoxiid für 2 h inkubiert, das 160 nM TPA (Sigma) enthielt oder nicht (Kontrolle). Um die Wirkung von TPA auf Met-Proteine, die an der Zelloberfläche exponiert waren, zu analysieren, wurden GTL-16-Zellen mit TPA, wie oben beschrieben, behandelt und dann mit ¹²&sup5;I durch Lactoperoxidase markiert. In beiden Fällen wurden Zeliproteine, die mit Detergens oder Überständen löslich gemacht waren, wie oben beschrieben ausgefällt. Die Proteine wurden dann einer SDS-PAGE unterworfen, fixiert, fluorographiert, falls erforderlich, getrocknet und Amersham-Hyperfilm für die Autoradiographie ausgesetzt.

Immunokomploex- Kinase-Assay

Proteine wurden von GTL-16-Zellen in DIM-Puffer, 1% Triton X-100 extrahiert und wie oben beschrieben ausgefällt. Auf Protein-A-Sepharose-GαMlg gesammelte Immunokomplexe wurden in 20 µl des gleichen Puffers in Gegenwart von 2,5 µCi [γ-³²P]ATP (spezifische Aktivität 7000 Ci/Mm; Amersham) bei 30ºC für 5 min phosphoryliert. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 1 ml eiskalter phosphatgepufferter Salzlösung, pH 7,2, umfassend 5 mM EDTA, gestoppt. Proben wurden zentrifugiert und durch siedenen Laemmli-Puffer mit oder ohne 2 β-Mercaptoethanol eluiert. Nach SDS-PAGE wurden die Gele getrocknet und Amersham Hyperfum für die Autoradiographie mit verstärkenden Screens exponiert.

Peptidmapping

Met-β-Ketten, die von Oberflächeradiojodierten GTL-16-Zellen abstammten, wurden durch SDS-PAGE fraktioniert und elektrophoretisch auf Immobilon-P-Membranen (Millipore Towbin et al, PNAS USA 76, 4350-4353, 1979) übertragen. Membranfragmente, die radioaktive β-Ketten enthielten, wurden in 0,5% Polyvinylpyrrolidon in 100 mM Essigsäure bei 37ºC für 30 Minuten getrennt, kurz mit Wasser und dann mit frisch hergestelltem 0,05 M NH&sub4;H&sub2;CO&sub3; gewaschen. Die tryptische Digestion der immobilisierten Proteine wurde mit 10 µg TPCK-behandeltem Trypsin (Worthington) für 16 h bei 37ºC und dann für wewitere 2 h bei 3700 mit zusätzlichen 10 µg frischem Enzym (Hunter et al, PNAS USA 77, 1311-1315, 1980) durchgeführt. Die verdauten Stoffe wurden auf Cellulose-Dünnschichtplatten (13255 Cellulose, Kodak) in der Ecke, die der Anode entspricht, geladen und einer Elektrophorese bei pH 1,9 (2,5% Ameisensäure, 7% Eisessig) für 1200 Voltstunden unterworfen. Die Platten wurden dann einer aszendierenen chromatographie (n-Butanol: Pyridin: Essigsäure: Wasser; 20:30:6:24 VIV) unterworfen. Peptide wurden durch Autoradiographie auf Amersham Hyperfilm mit intensivierenden Screens sichtbar gemacht.

Western Blotting

Zellen wurden in dem siedenen Puffer durch Laemmli mit oder ohne dem Reduktionsmittel 2 β-Mercaptoethanol löslich gemacht. Gleiche Mengen an Protein (300 µg) wurden in jede Spur gegeben. Proben wurden durch Western Blotting analysiert, wie von Towbin et al, 1979 beschrieben. Die Blots wurden mit Hybridomaüberstand, der DL-21 MAb enthielt, und dann mit ¹²&sup5;I- markiertem Schaf-α-Mlg (Amersham) sondiert. Autoradiogramme wurden mit intensivierenden Screens für 2 bis 3 Tage exponiert. Die Größe der Proteine wurde unter Verwendung von Myosin (200 kDa), Phosphorylase b (92,5 kDa), Rinderserumalbumin (69 kDa), Eialbumin (43 kDa) und Kohlensäureanhydrase (30 kDa), die durch [¹&sup4;C]Methylierung als Marker (Amersham) vormarkiert waren, abgeschätzt.

Transfektion von MET cDNA in NIH 3T3-Zellen

Der Expressionsvektor, der für diese Studien verwendet wurde, basierte auf Plasmid pMT2, das den hauptsächlichen Nachadenovirus-Promotor enthält. Das Expressionsplasmid wurde mit einer 4,3-kb cDNA konstruiert, die die gesamte MET-Kodiersequenz umfaßte (Giordano et al, 1989, Nature 339 155-156). Da dieses Plasmid nicht irgendeinen selektierbaren Marker enthält, wurden Zellen mit pSV2neo kotransfiziert, das das Neomydin-resistente Gen trägt. Das Plasmid wurde in NIH 3T3-Zellen durch die Lipofektionsvorgehensweise kotransfiziert. Zwei Tage nach der Transfektion wurde das Neomycinanalog G418 zu dem Kulturmedium gegeben, um resistente Klone aufzustellen. Stabile Transfizierungen exprimierende Met-Rezeptoren wurden durch Untersuchung der Fähigkeit, Met-Rezeptoren zu synthetisieren, durch Western Blot Analyse identifiziert.

Ergebnisse

Ein verkürztes p140MET koexistiert mit p190MET an der Zelloberfläche
Proteine, die an der Oberfläche von GTL-16-Zellen exponiert waren, wurden mit ¹²&sup5;I durch Lactoperoxidase markiert. Zellen wurden mit 1% Triton extrahiert und löslich gemachte Moleküle mit einem MAb gegen das C- Terminus-Peptid des Met-Proteins oder mit MAbs, die verschiedene Epitope der extracellulären Domäne erkennen, ausgefällt. Immunopräzipitate wurden in SDS-PAGE unter nicht-reduzierenden oder reduzierenden Bedingungen analysiert. Der Antikörper gegen das C-Terminus-Peptid fällte das p190MET- Heterodimer aus (Fig. 1A, Spur 1), das in p50α und p145 β-Ketten unter reduzierenden Bedingungen aufgelöst wurde (Fig. 1B, Spur 1). MAbs, die gegen die extrazelluläre Domäne produziert wurden, fällten mit p190MET ein anderes Molekül aus, das bei dem scheinbaren Molekulargewicht von 140 kDa migrierte (p140MET; Fig. 1A, Spuren 2, 3, 4). Diese Immunopräzipitate unter reduzierenden Bedingungen wurden in drei Ketten von 145, 85 bzw. 50 kDa aufgelöst (Fig. 1B, Spuren 2, 3, 4), was vermuten ließ, daß p140MET ein Heterodimer von p85 und p50 ist. Das in Fig. 1C gezeigte Experiment bestätigt formal diese Interpretation der heterodimeren Struktur von p140MET. Die 140 kDa-Bande, die vom Teil A exzisiert wurde, lief erneut unter reduzierenden Bedingungen und ging aus p85 und p50 hervor (Fig. 1C, Spur 1). Das zuletzt genannte comigrierte mit p50α, dissoziert von dem p190MET-αβ-Komplex (Fig. 1C, Spur 2). Das Verhältnis von p190MET zu p140MET variierte zwischen 1:1 bis 2:1. Identische Ergebnisse wurden erhalten, wenn oberflächenjodierte Proteine von anderen Zellinien untersucht wurden.
Bidimensionale tryptische Karten von oberflächenjodierten p145 β Ketten zeigen, daß die extrazellulären Domänen der intakten und verkürzten Ketten des Met-Proteins identische Peptide enthalten (Fig. 2A, 28) . Folglich ist p140MET ein Heterodimer von p50α und einer 85 kDa-β Kette (p80β), die von einer C-Terminus-Verkürzung von p145 β abstammen.
Das verkürzte p140MET ist nicht auf Tyrosinphosphoryliert.
Es wurde zuvor unter Verwendung von Antikörpern, die für das C- Terminus-Peptid von p190MET spezifisch sind, gezeigt, daß dieses Protein in vitro an seiner β-Subeinheit phosphoryliert werden kann (Giordano et al, Mol. Cell. Biol. 8, 3510-3517, 1988). Die Inkubation von Immunopräzipitaten, die mit den vier MAbs erhalten sind, die gegen Met-Extrazelluläre Domäne gerichtet sind, in der Gegenwart von [γ-³²P]ATP, führt zur Markierung von p190MET, aber nicht von p140MET (Fig. 3A). Unter reduzierenden Bedingungen war nur p145β markiert (Fig. 3B) . Darüber hinaus war p140MET niemals durch anti-Phosphotyrosin-Antikörper in Western Blots von GTL-16 Proteinen dekoriert, während p&sub1;&sub9;&sub0;MET konsistent sichtbar gemacht wurde (Giordano et al, 1988). Diese Daten legen nahe, daß die verkürzte Form des Met-Proteins die Tyrosin-Reste nicht aufweist, die in vitro oder in vivo phosphoryliert werden können.

Das verkürzte p140MET und p130MET resultieren von der Verarbeitung von p190MET

p140MET könnte entweder von einer Translation einer alternativ gespalteten mRNA, die nur die extracelluläre und Transmembran-Domäne des Met- Proteins kodiert, stammen, oder könnte von der Posttranslationsverarbeitung des intakten Moleküls resultieren. Tatsächlich werden vier verschiedene Met-Transcripte in GTL-16-Zellen ermittelt (Giordano et al, Nature 239, 155-156, 1989; Park et al, Cell 45, 895-904, 1986), aber keinem von diesen fehlt der Bereich, der die Cytoplasmadomäne kodiert.
Um den Ursprung des C-Terminus-verkürzten Met-Proteins zu untersuchen, wurden NIH 3T3-Zellen mit menschlicher MET-cDNA mit voller Länge und pSV2neo cotransferriert. Stabile Transformanten wurden mit G418 ausgewählt und für die Met-Exprimierung analysiert. Northern (RNA)-Blot-Analyse von positiven Zellen ermittelten eine einzelne mRNA mit der erwarteten Größe (ungefähr 4,3 kb). Zellen wurden in siedendem Laemmli-Puffer löslich gemacht, und Proteine wurden unter reduzierenden Bedingungen durch Western- Blot untersucht. Die Antikörper gegen das Met-C-Terminus-Peptid ermittelten den 170-kDa-Met-Vorläufer und die p145β-Kette (Fig. 1, Spur 1). Zusätzlich ermittelten die Antikörper, die gegen die Met-extrazelluläre Domäne gerichtet waren, ein Molekül mit antigenen Eigenschaften und einem Molekulargewicht, das mit dem des verkürzten p85 β konsistent war (Fig. 4, Spur 2). Darüber hinaus entwickelten in den Überständen der transfizierten Zellen diese Antikörper ein Molekül, das dem löslichen p75 β vergleichbar ist (Fig. 4, Spur 3). In transfizierten NIH 3T3-Zellen war das Verhältnis der verkürzten Met-β-Ketten zu den intakten höher als bei menschlichen Zellen. Diese Daten zeigen, daß die Met-verkürzten Formen von dem Voll-Längen- Transkript abstammen.
Ungleichmäßige cellulare Verteilung von p190MET und p140MET Um die relativen Mengen von p190MET und p140MET in der gesamten Zelle und bei der Zelloberfläche zu quantifizieren, wurden GTL-16-Zellen mit [³H)-Glucosamin markiert. Unter Verwendung dieses Isotops sollten die beiden Molekularspecies mit ähnlicher Effizienz markiert werden, da die Glycosylierung nur die gemeinsame extracelluläre Domäne involviert. Die selektive Immunpräzipitation von Molekülen, die an der Zelloberfläche exponiert waren, wurde durchgeführt (siehe Verfahren). Die Menge an wiedergewonnenen Proteinen wurde mit der von dem ganzen Zellextrakt immunausgefällten Menge verglichen. Fig. 5 zeigt, daß an der Zelloberfläche das Verhältnis von p145 β gegenüber p85 β ungefähr 2:1 war (Fig. 5, Spur 1). Umgekehrt war in dem gesamten Zellextrakt p85 β nicht mehr als 1/10 von p145 β (Fig. 5, Spur 2). Anti-C-Terminus-MAbs fällten p145 β nur von Zellextrakten aus (Fig. 5, Spuren 5, 6). Es kann somit gefolgert werden, daß die verkürzte Met-Form bvorzugt an der Zelloberfläche lokalisiert ist.
Da der gleiche Lysenvorgang zur Ausfällung von Met-Proteinen von der Oberfläche oder von den gesamten Zellextrakten angewandt wurde, zeigt dieses Experiment weiter an, daß die potentielle proteolytische Aktivität, die durch das Detergens induziert wurde, bei der Erzeugung von p85 β keine signifikante Rolle spielt.

p&sub1;&sub4;&sub0;MET ist nicht das Ergebnis von experimentell induzierter Proteolyse

Die proteolytische Spaltung von p&sub1;&sub9;&sub0;MET konnte durch Aktivierung von endogene(n) Protease(n) während der Zellextraktion induziert werden. Als interne Kontrolle für die postlytische Proteolyse verwendeten wir Antikörper,d ie für die extracelluläre Domäne spezifisch waren, um den epidermen Wachstumsfaktor-Rezeptor immunauszufällen. Dieser Rezeptor wird in GTL-16- Zellen exprimiert (Giordano et al, 1988), und es ist bekannt, daß er für Proteolyse anfällig ist (Basu et al, Nature 311, 477-480, 1984). Fig. 5 zeigt, daß unter den Bedingungen, bei denen das verkürzte p140MET beobachtet wurde, nur das intakte 175 kDa-EGF-Rezeptormolekül ausgefällt wurde, sowohl von der Oberfläche als auch vom gesamten Zellysat.
Um weiter auszuschließen, daß die verkürzte Form des MET-Proteins das Ergebnis des protolytischen Abbaus war, der während der Extraktions- oder Immunausfällungsvorgänge eingeführt wurde, wurde deren Vorhandensein direkt in Western Blots von verschiedenen menschlichen Zellinien analysiert. Bei diesen Experimenten wurden lebende Zellen mit siedendem Laemmli-Puffer zum Blockieren der Protease-Aktivität löslich gemacht. Die gesamten Proteine wurden in SDS-PAGE unter nicht reduzierenden Bedingungen getrennt und mit MAbs dekoriert, die gegen die extracelluläre Domäne gerichtet waren. Beide p190MET und P140MET-Formen wurden in vier Karcinomzellinien beobachtet&sub1; die das MET-Gen exprimieren (Fig. 6). Diese Daten legen nahe, daß die verkürzte Form des MET-Proteins in physiologischen Bedingungen in lebenden Zellen vorhanden ist.
Ein verkürztes, lösliches p130MET wird in dem Kulturmedium freigesetzt.
GTL-16-Zellen wurden mit ³&sup5;S-Methionin metabolisch markiert und das konditionierte Medium, geklärt durch Ultrazentrifugation, wurde mit MAbsantiextrazellulärer Domäne ausgefällt und in SDS-PAGE analysiert. Unter nicht-reduzierenden Bedingungen wurde ein Molekül mit dem scheinbaren Molekulargewicht von 130 kDa (p130MET) beobachtet (Fig. 7A, Spur 3). Aufgrund der Reduktion wurde dieses Molekül in zwei Subeinheiten mit 50 kDa (p50 α) bzw. 75 kDa (p75 β) aufgelöst (Fig. 70, Spur 3). Von dem gleichen Medium wurden durch MAbs gegen das Met-C-Terminuspeptid keine Proteine ausgefällt (Fig. 7A und 7C, Spur 2). Ähnliche Ergebnisse wurden mit einem Überstand erhalten, der von der Lungencarcinomzellinie A549 erhalten wurde (Fig. 7B, Spur 3).
Tryptische Peptidkarten wurden ebenfalls mit der p75 β-Kette durchgeführt. Als Ausgangsmaterial für diese Experimente wurden Immunopräzipitate von p130MET verwendet, die von oberflächenradiojodierten Zellen in das Kulturmedium freigesetzt wurden. P75 b wurde von SDS-PAGE-Gelen, die unter reduzierenden Bedingungen gelaufen sind, eluiert. Fig. 30 zeigt, daß die markierten tryptischen Peptide von jenen nicht unterscheidbar waren, die von p145 β und p85 β erhalten wurden.
Das lösliche p130MET weist keine Kinaseaktivität auf, wie es durch den Immunokomplex-Kinaseassay in vitro sichergestellt wurde. Diese Daten zeigen, daß die Met-Form, die in das Kulturmedium freigesetzt wurde, ein αβ- Komplex ist, der keine cytoplastischen und Transmembran-Domänen von p145 β aufweist, und daß die Erzeugung dieses Moleküls nicht auf GTL-16-Zellen beschränkt ist.
P130MET wird durch ein protolytisches Verfahren erzeugt.
Zur Bestätigung, daß das lösliche p130MET von den Membran-verbundenen Met-Proteinen abstammt, wurde das folgende Experiment durchgeführt. GTL-16- Zellen, die an Gewebekulturpiatten haften, wurden mit ¹²&sup5;-I durch das Lactoperoxidaseverfahren oberflächenmarkiert und für weitere 4 h kultiviert. Das Kulturmedium wurde geerntet und mit MAbs antiextracellulärer Domäne immunausgefällt. Das Immunpräzipitat, analysiert in SDS-PAGE unter reduzierenden Bedingungen, ergab p75β und p50β, die erwarteten Subeinheiten des löslichen p130MET (Fig. 8, Spur 2). Die entsprechenden Zellextrakte, die mit dem gleichen MAbs behandelt wurden, ergaben p145 β, p85 β, und p50 α (Fig. 8, spur 3). MAbs, die gegen das Met-C-Terminus-Peptid gerichtet waren, wurden als Kontrolle verwendet. Diese Antikörper fällten kein Protein von dem Kulturmedium aus (Fig. 8, Spur 1) und fällten nur die intakten p145β- und p50 α-Kette von Zellextrakten aus (Fig. 8, Spur 4). Diese Ergebnisse demonstrieren, daß das lösliche Met-Protein in das Kulturmedium durch proteolytische Spaltung der membrangebundenen Met-Proteine freigesetzt wird.
p130MET-Freisetzung wird durch TPA-Behandlung verstärkt Für die Ermittlung, ob die Freisetzung von P130MET in lebenden Zellen moduliert werden kann, wurde Proteinkinase C durch TPA-Behandlung aktiviert. GTL-16-Zellen, metabolisch mit (³&sup5;S]-Methionin markiert, wurden durch 160 nM TPA für 2 h stimuliert. Die Zellextrakte und Überstände wurden dann geerntet, ultrazentrifugiert und mit MAbs gegen Met-extracelluläre Domäne ausgefällt. Immunopräzipitate wurden durch SDS-PAGE unter reduzierenden Bedingungen analysiert. Nach der TPA-Behandlung war die Menge an p75β, die in dem Gewebekultur-Überstand ermittelt wurde, im Vergleich zu Kontrollgehalten signifikant erhöht (Fig. 9A). Die Menge an gesamtem cellulärem p145β und p85β war scheinbar nicht beeinträchtigt (Fig. 9B). Um die Wirkung von TPA auf MET-Proteine zu analysieren, die an der Zelloberfläche exponiert waren, wurden GTL-16-Zellen mit TPA behandelt und dann mit ¹²&sup5;I durch Lactoperoxidase vor der Immunausfällung markiert. Wenn nur die oberflächenmarkierten Met-Proteine berücksichtigt wurden, war die Menge an p85β nach der TPA-Behandlung signifikant vermindert. P145β war weniger beeinflußt als p85 β (Fig. 90). Es wird somit gefolgert, daß die Proteinkinase-C-Aktivierung die Freisetzung von extracellulärem p130MET durch Stimulieren der proteolytischen Verarbeitung der membrangebundenen p140MET- und p190MET-Formen verstärkt.

Beispiel 2

Materialien und Verfahren

Reagentien

[γ-³²P)ATP (spezifische Aktivität: 7000Ci mmol&supmin;¹) und (¹²&sup5;I]-Protein A wurden von Amersham erhalten ¹²&sup5;I-HGF wurden wie von Naldini et al. beschrieben (1991, EMBO J., 10, 2867-2878) hergestellt. Kurz gesagt wurde reines HGF (1 µg) mit trägerfreiem Na¹²&sup5;I (2 mCi) und Jodogen (Pierce) radiomarkiert. 200 µl Jodogen bei 100 µg/ml in Chloroform wurden in einer Polypropylenampullestickstoffluß getrocknet. HGF und ¹²&sup5;I wurden dann in 0,25 M Phosphatpuffer pH = 7,4, gegeben. Die Reaktion konnte bei 4CC 15 Minuten ablaufen, dann wurde die Miscung in eine andere Ampulle gegeben und für 10 Minuten auf Eis gelassen. Träger-BSA wurde zu einer Endkonzentration von 0,1% in 0,4 NaCl, 0,1% CHAPS, 20 mM PO&sub4;, gepuffert auf pH = 7,4, gegeben, und der markierte Ligand wurde von dem freien Na¹²&sup5;1 durch Affinitätschromatographie auf einer 1 ml Heparin-Sepharosesäule (Pierce), die mit dem gleichen Puffer präequilibriert war, fraktioniert. Nach extensivem Waschen wurde die Säule mit 1,2 M NaCl in dem gleichen Puffer eluiert, und 0,5 ml Fraktionen wurden gesammelt. Fraktionen, die TCA-ausfällbare Radioaktivität enthielten, wurden gesammelt, mit einer Centrisart (Sartorius)- Diafiltrationsanalge mit einem Membran-Cut-Off von 20 kd konzentriert und bei 4ºC gelagert. Die spezifische Aktivität des Tracers war ungefähr 8 x 10&sup7; CPM/µg (5700 Ci/mmol), entsprechend einem I/HGF-molaren Verhältnis von ungefähr 3/1. Somit enthielt das Präparat keine signifikante Menge an nicht markierten Molekülen.
Lentil-Lectin-Sepharose und Sepharose-Protein-A waren von Pharmacia. Tritonx-100 war von Fluka.

Zellen.

Die verwendete Zellinie war die GTL-16-Zellinie, wie in Beispiel 1 beschrieben. Zellen wurden in RPMI 1640-Medium (Flow), das 10% fetales Rinderserum (Flow) enthielt, kultiviert und bei 37ºC in einer feuchten Amtosphäre mit 5% CO&sub2; gehalten.

Antikörper

Phosphotyrosinantikörper wurden gegen p-Aminobenzolphosphonat gebildet und wie zuvor beschrieben affinitätsgereinigt (Comoglio et al., 1984, EMBO J., 3, 483-489). Polyclonales anti-Met-Serum wurde in Kaninchen gebildet, die gegen das synthetische Peptid VDTRPASFWETS immunisiert waren, das der Aminosäuresequenz an dem C-Terminusende des vorgesagten MET-Genproduktes entspricht. Die monoklonalen Antikörper DN-30, DN-31 und DO-24 gegen die extracelluläre Domäne des Met-Proteins wurden nach der Immunisierung mit gesamten lebenden GTL-16-Zellen in Mäusen erhalten.
Die monoklonalen Antikörper wurden von Ascites durch Ammoniumsulfatausfällung und Affinitätschromatographie auf Protein-A-Sepharose 48 (Pharmacia, Uppsala, Schweden) gereinigt. Der gereinigte DO-24 MAb wurde mit ¹²&sup5;I durch die Chloramin-T-Vorgehensweise bei einer spezifischen Aktivität von 2-4 mCi/mg Protein markiert.

Teilweise Reinigung von p130MET

Serumfreies, konditioniertes Medium wurde von GTL-16 zusammenfließenden Kulturen geerntet, bei 50000 x g ultrazentrifugiert, auf Amicon-Filtern (100 K), 10-fach (Grundlösung) konzentriert. Die Reinigung wurde durch Affinitätschromatographie auf einer Lentil-Lectin-Sepharosesäule durchgeführt. Nach 2 h bei 4ºC wurde die Säule mehrere MAbs mit RPMI-Medium gewaschen und Glycoprotenine mit RPMI, das 0,2 M α-Methyl-D-mannosid (Fluka) enthielt, eluiert. Nach einer über-Nacht-Dialyse gegen RPMI wurde ein Teil des durch Affinitätschromatographie gereinigten Materials von p130MET durch erschöpfende Adsoprtion an MAb DN-31, auf Sepharose-Protein A unlöslich gmeacht, befreit. Dieses Material wurde als negative Kontrolle verwendet. Die Lösung des teilweise gereinigten p130MET wurde bei einer Proteinkonzentration, die 0,4 O.D. Einheiten (280 nm) enthält, standardisiert. Das Glycoprotein wurde bei -20ºC gelagert.

Doppelt-Determinanten-Immunoassay (DDIA)

96-Well-ELISA-Platten (Titertek Immuno-Assay-Plate, Flow Laboratories, Netherlands), beschichtet mit dem DN-30 MAb und gesättigt mit BSA, wurden über Nacht bei 4ºC bei verschiedenen Konzentrationen von teilweise gereinigtem p130MET und radiomarkiertem HGF inkubiert. In dem zur Auswertung der Menge an p130MET entwickelten DDIA wurden 2 MAbs verwendet, die gegen verschiedene Epitope der extracellulären Domäne von Met-Proteinen gerichtet waren. Gereinigte DN-30 MAbs wurden auf 96-Well ELISA Platten adsorbiert. Die Platten wurden dann gesättigt, und verschiedene Konzentrationen von rohem Überstand, geerntet von GTL-16 Zellkulturen, wurden zugegeben. Die Bindung wurde durch radiomarkierten DO-24 MAb, der als Tracer verwendet wurden, ermittelt. Die Platten wurden dann extensiv gewaschen, und die gebundene Radioaktivität mit 1% siedendem SDS eluiert und in einem γ-Zähler (Autogamma, Packard) gezählt.

Immunopräzipitation und in vitro-Autophosphorylierungs-Assay

GTL-16-Zellen wurden zweimal mit eiskaltem PBS gewaschen und in DIM- Puffer (10 mM Pipes, pH 6,8, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl&sub2;, 300 mM Sucrose, 5 mM EGTA) plus 1% Triton X-100 und einer Mischung aus Proteaseinhibitoren lysiert. Die Zellysate wurden bei 10000 Upm bei 400 für 30 Minuten zentrifugiert und mit anti-MET-Serum inkubiert, das an Sepharose-Protein A gekuppelt war. Gebundene Proteine wurden mehre Male in DIM-Puffer gewaschen und bei Raumtemperatur für 5 Minuten mit 60 µl unterschiedlicher Verdünnungen von Lentil-Lectin-Eluat von GTL-16-überstand, das frei war von p130MET oder nicht, inkubiert. Die Kinasereaktion wurde auf Eis für 2 Minuten durchgeführt. 10 µCi an [γ³²P]ATP pro Probe wurden mit 100 µM Endkonzentration an nicht markiertem ATP verdünnt. Die Kinasereaktion wurde mit 1 ml Trisgepufferter Salzlösung mit 10 mM EDTA und 100 mM Na&sub3;VO&sub4; gestoppt. Nach kurzer Zentrifugation wurden Proteine in siedendem Laemmli-Puffer eluiert und einer 8%-igen SDS-PAGE unterworfen, mit anschließender Autoradiographie für 12 h bei -80ºC mit verstärkenden Screens. Die relative Menge an Phosphat, das in p145MET-β-Subeinheit eingefügt war, wurde durch Messen der optischen Dichte der entsprechenden Autoradiographiebande mit einem Laserdensitometer (Pharmacia LKB 2202 Ultroscan) abgeschätzt.

Western blotting

Eine celluläre Monoschicht aus GTL-16-Zellen wurde zweimal mit eiskalter, phosphatgepufferter Salzlösung und Zellen gewaschen, die in siedendem Laemmli-Puffer löslich gemacht waren (Laemmli, U.K., 1970, Nature 230, 680- 685). Die Proben wurden auf eine Proteinkonzentration von 300 µg/Well eingestellt, in 8% SDS-PAGE laufengelassen und auf Nitrocelluloseblätter übertragen. Blots wurden mit 10 µg ml&supmin;¹ an gereinigtem P-Tyr-Antikörpern sondiert, und dann mit [¹²&sup5;I] markiertem Protein A, wie detailliert anderswo beschrieben ist (Di Renzo et al.,, 1986, Eur. J. Biochem., 158, 383-391). Filter wurden für 24 h bei -70ºC einer Autoradiographie unter Verwendung von verstärkenden Screens unterworfen. Die relative Menge an Phospho- Tyrosin, das in p145MET-β-Subeinheit eingefügt war, wurde durch Messen der optischen Dichte der entsprechenden Autoradiographie-Bande mit einem Laserdensitometer abgeschätzt.

Ergebnisse:

HGF bindet p130MET

Fig. 10 zeigt, daß erhöhende Mengen an löslichem, verkürztem p130MET, auf Mircotiterwells, die mit spezifischen Antikörpern beschichtet sind, unlöslich gemacht, radiomarkiertes HGF bindet. Diese Bindung ist zu sättigen und dosisabhängig.

Inhibition der in vivo Tyrosinphosphorylierung des MET/HGF-Rezeptors durch p130MET

GTL-16-Zellen exprimieren eine hohe Menge des HGF-Rezeptors, dessen β- Subeinheit (P145) konstitutiv auf Tyrosin in vivo phosphoryliert ist. Dies kann durch Western Blot von gesamten cellulären Proteinen, die mit ionischem Detergens loslich gemacht sind, untersucht werden, in STS-PAGE analysiert und mit P-Tyr-Antikörpern sondiert werden (Fig. 11,A). Die Behandlung dieser Zellen für 10 Minuten mit Lentil-Lectin-gereinigtem p130MET induzierte eine 30%-ige Verminderung bei der Tyrosin-Phosphorylierung des HGF/SF-Rezeptors (Fig. 11B)

In vitro Inhibition der Tyrosinkinaseaktivität des Met/HGF-Rezeptors durch p130MET

Der HGF-Rezeptor wurde von GTL-16-Zellen mit einem Antiserum, das gegen ein synthetisches Peptid gerichtet war, das sich von der C-terminalen Sequenz des Proteins ableitet, immunausgefällt. Das p130MET, inkubiert mit den Immunkomplexen oder dem Kinaseassay, inhibierte auf dosisabhängige Weise die Autophosphorylierung der intakten Rezeptor-β-Subeinheit (p145MET; Fig. 12, B). Nur eine leichte Inhibitionswirkung wurde mit den gleichen Konzentrationen an Lentil-Lectin-Eluaten gemessen, die kein p130MET aufwiesen (Fig. 12A)

Quantifizierung an löslichem p130MET durch DDIA

p130MET kann quantitativ durch ein Festphasendoppeldeterminanten- Immunoassay unter Verwendung eines Tandems von MAbs, die verschiedene Epitopen erkennen, ausgewertet werden. Fig. 13 zeigt eine typische Bindungskurve, die mit p130MET erhalten ist, das von GTL-16-Zellen in dem Gewebekulturmedium freigeseetzt ist. Die Bindung ist sättigbar, dosisabhängig und spezifisch.

Claims

1. Protein, das sich aus zwei mit Disulphid verbundenen Ketten mit 50 kDa und 75 bzw. 85 kDa zusammensetzt, wobei die 50 kDa Kette die α-Kette des Hepatocyten-Wachstumsfaktor (HGF)-Rezeptors ist, kodiert durch das MET- Protooncogen, und die 75 oder 85 kDa-Kette eine C-Terminus verkürzte Form der β-Kette des HGF-Rezeptors ist, bei dem die cytoplasmische Tyrosinkinase-Domäne fehlt.

2. Verfahren zur Herstellung eines Proteins, wie in Anspruch 1 definiert, worin die C-Terminus verkürzte Form der β-Kette die 75 kDa-Kette ist, umfassend:

(i) Kultivieren von Zellen, die das MET-Gen exprimieren, in einem Medium dafür;

(ii) Kontaktieren des resultierenden konditionierten Mediums mit einem Antikörper, der für die extrazelluläre Domäne der β-Kette des HGF-Rezeptors spezifisch ist; und

(iii) Freisetzen des Proteins von dem resultierenden Immunokomplex.

3. Verfahren zur Herstelung eines Proteins wie in Anspruch 1 beansprucht, worin die C-Terminus-verkürzte Form der β-Kette die 85 kDa-Kette ist, umfassend:

(i) Extrahieren von Zellen, die das MET-Gen exprimieren, unter Verwendung eines Detergens;

(ii) Kontaktieren des Extraktes mit einem Antikörper, der für die extracelluläre Domäne der β-Kette des HGF-Rezeptors spezifisch ist; und

(iii) Freisetzen des Proteins von dem resultierenden Immunokomplex.

4. Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend einen pharmazeutisch akzeptablen Träger oder Verdünnungsmittel und als aktiven Bestandteil ein Protein wie in Anspruch 1 beansprucht.