DE69222013T2

DE69222013T2 - Endoplasmatisches Retikulum-ständige rekombinante dibasische Endoprotease und deren Verwendungen

Info

Publication number: DE69222013T2
Application number: DE69222013T
Authority: DE
Inventors: Bhabatosh Dr Chaudhuri; Howard Prof Dr Riezman; Peter Dr Seeboth; Christine Stephan
Original assignee: Ciba Geigy AG
Current assignee: Novartis AG
Priority date: 1991-12-16
Filing date: 1992-12-08
Publication date: 1998-01-29
Anticipated expiration: 2012-12-09
Also published as: NZ245469A; IL104075A; KR930013115A; FI925678A0; JP3305781B2; NO308619B1; AU3007192A; MX9207291A; CA2085308A1; DK0548012T3; US5501975A; DE69222013D1; EP0548012A1; ZA929711B; ES2107520T3; FI105482B; AU667852B2; CA2085308C; JPH06197787A; EP0548012B1

Description

Die Erfindung betrifft neue DNA-Moleküle, die eine modifizierte, im endoplasmatischen Retikulum lokalisierte, dibasische Prozessierungs-Endoprotease codieren und die Verwendung der im endoplasmatischen Retikulum lokalisierten, dibasischen Prozessierungs-Endoprotease für das korrekte Prozessieren von heterologen Polypeptiden in transformierten Wirten.

Hintergrund der Erfindung

Die Produktion von pharmazeutisch anwendbaren oder enzymatisch aktiven Proteinen ist ein Schlüsselgebiet in der der sich rasch entwickelnden biotechnologischen Industrie. Seit Beginn der Ära der rekombinanten DNA-Technik wurde eine große Anzahl wertvoller heterologer Proteine in eukaryotischen Wirtszellen, die mit geeigneten Expressionsvektoren, die diese Proteine codierende DNA-Sequenzen enthalten, transformiert wurden, produziert und daraus sezerniert. Eines der Hauptprobleme mit der Produktion von sezernierten Proteinen in eukaryotischen Expressionssystemen ist die Vermeidung eines falsch geformten, biologisch inaktiven Produkts.
Es wird nun allgemein angenommen, daß Proteine, die für die Sekretion aus eukaryotischen Zellen bestimmt sind, in das endoplasmatische Retikulum (ER) infolge der Anwesenheit einer Signalsequenz, die durch das Enzym Signalpeptidase, das in der rauhen ER-Membran lokalisiert ist, abgespalten wird, transloziert werden. Das Protein wird dann aus dem ER in den Golgi-Apparat und über von dem Golgi-Apparat abgeleitete sekretorische Vesikel an die Zelloberfläche transportiert (S. Pfeffer und J. Rothman, Ann. Rev. Biochem. 56:829-52, 1987). Eine weitere Hauptstufe bei der Produktion von korrekt prozessierten und korrekt gefalteten Proteinen ist die Umwandlung der Proproteine in die reifen Formen in dem Golgi-Apparat und den sekretorischen Vesikeln. Die Spaltung der Proproteine findet an sog. dibasischen Stellen statt, d.h. an einer Einheit, die aus mindestens zwei basischen Aminosäuren besteht. Die Prozessierung wird durch im Golgi-Apparat lokalisierte Enzyme, die sog. dibasischen Prozessierungs-Endoproteasen, katalysiert.
Verschiedene dibasische Prozessierungs-Endoproteasen sind bekannt, die an der Prozessierung von Proteinvorläufern beteiligt sind, beispielsweise die Säugerproteasen Furin, PC2, PC1 und PC3, und das Produkt des Hefe-YAP3-Gens und der Hefe-yscF (auch als KEX2-Gen-Produkt bezeichnet; nachstehend als KEX2p bezeichnet).
KEX2p ist an der Reifung des Hefepaarungs-Pheromons α- Faktor beteiligt (J. Kurjan und I. Hershkowitz, Cell 30:933- 943, 1982). Der α-Faktor wird als ein 165 Aminosäuren langer Vorläufer produziert, der während des Transports an die Zelloberfläche prozessiert wird. In der ersten Stufe wird die 19 Aminosäuren lange Signalsequenz (Vorsequenz) durch die Signalpeptidase abgespalten. Dann wird der Vorläufer glycosyliert und wandert in den Golgi-Apparat, worin eine 66 Aminosäuren lange Prosequenz durch KEX2p abgespalten wird. Die α-Faktor-Preprosequenz ist auch als α-Faktor-Leader-Sequenz bekannt. Eine zweite Protease in dem Golgi-Apparat, d.h. das KEX1-Gen-Produkt, ist für die abschließende Reifung des Proteins verantwortlich.
KEX2p wird von dem KEX2-Gen codiert und besteht aus einer N-terminalen katalytischen Domäne, einer Ser/Thrreichen Domäne, einer Transmembrandomäne und einem C- terminalen Schwanz, der für die Golgi-Lokalisierung verantwortlich ist. Ein mutiertes KEX2p-Enzym, dem die 200 C-terminalen Aminosäuren einschließlich der Ser/Thrreichen Domäne, der Transmembrandomäne und des C-terminalen Schwanzes fehlen, besitzt immer noch eine KEX2p-Proteasefunktion, d.h. Spaltung an der C-terminalen Seite eines Paares basischer Aminosäuren, wie Lys-Arg oder Arg-Arg [Fuller et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. 86, 1434-1438; Fuller et al., 1989, Science 246, 482-485].
Leader-Sequenzen, wie die Hefe-α-Faktor-Leader-Sequenz, werden vielfach zur Produktion von sezernierten heterologen Proteinen in eukaryotischen Zellen verwendet. In vielen Fällen trifft man jedoch auf große Schwierigkeiten, weil beträchtliche Mengen biologisch inaktiver Proteine infolge einer falschen Faltung und Aggregation der Proteine, insbesondere im Falle von Proteinen mit niedrigem Molekulargewicht, produziert werden.

Aufgabe der Erfindung

Überraschenderweise wurde gefunden, daß ein höheres Verhältnis an biologisch aktivem, korrekt gefaltetem, heterologem Protein zu inaktivem, falsch gefaltetem Protein in der Wirtszelle produziert wird, wenn die Wirtszelle eine dibasische Prozessierungs-Endoproteaseaktivität in dem endoplasmatischen Retikulum (ER) besitzt.
So liegt der vorliegenden Erfindung die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Herstellung eines heterologen Proteins in einer eukaryotischen Zelle bereitzustellen, wobei man die Wirtszelle mit einer Nucleinsäure transformiert, die eine Proform des Proteins, die eine Prosequenz umfaßt, und eine dibasische Prozessierungs-Endoprotease, die die Prosequenz entfernen kann, codiert, fusioniert an ein Retentionssignal des endoplasmatischen Retikulums, und die Wirtszelle züchtet, um das heterologe Protein zu produzieren. Weitere Aufgaben sind die Bereitstellung einer Wirtszelle mit einer Variante einer dibasischen Prozessierungs-Endoprotease, die in dem ER lokalisiert ist, als Folge der Transformation mit einem Gen, das die Variante der dibasischen Prozessierungs-Endoprotease codiert, und die Bereitstellung eines DNA-Moleküls, das ein solches Gen umfaßt.

Ausführliche Beschreibung der Erfindung

Verfahren zur Herstellung des heterologen Proteins

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines heterologen biologisch aktiven Proteins, das in der Wirtszelle aus einem Proprotein freigesetzt wird, wobei das Verfahren die Verwendung einer Wirtszelle mit einer dibasischen Prozessierungs-Endoproteaseaktivität in dem ER umfaßt.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist eine dibasische Prozessierungs-Endoproteaseaktivität die Aktivität einer Endoprotease, die für ein Motiv mit zwei basischen Aminosäuren, z.B. Arg-Arg, Arg-Lys, Lys-Arg oder Lys-Lys, spezifisch ist, wobei die Endoprotease natürlicherweise in dem Golgi-Apparat lokalisiert ist und natürlicherweise an der Prozessierung von Proproteinen oder Polyproteinen beteiligt ist.
Der Ausdruck dibasische Prozessierungs-Endoprotease umfaßt eukaryotische Enzyme, wie beispielsweise mit Säugerursprung, z.B. Furin, PC2, PC1, PC3 (Barr, Cell 66:1-3, 1991) und bevorzugt von Hefe abgeleitete Enzyme, wie die YAP3-Endoprotease [Egel-Mitani et al., Yeast 6:127-137 (1990)] und am bevorzugtesten die S. cerevisiae- Endoprotease-KEX2p.
Die biologisch aktiven Varianten der erfindungsgemäßen dibasischen Prozessierungs-Endoprotease sind nicht auf den Golgi-Apparat beschränkt, sondern sind infolge der Anwesenheit eines ER-Retentionssignals, d.h. einer Struktur, die zur Retention einer dibasischen Prozessierungs-Endoprotease in dem ER geeignet ist, im ER lokalisiert. Die natürlich vorkommenden dibasischen Prozessierungs-Endoproteasen sind an die Membran des Golgi-Apparats oder der sekretorischen Vesikel infolge eines Membranankers, d.h. einer hydrophoben Transmembransequenz, gebunden. Die ER-Retentionssignale werden mit dem C-Terminus des Proteins, d.h. der dibasischen Prozessierungs-Endoprotease verknüpft, um die Protease in dem ER zu lokalisieren. Ein solches Fusionsprotein besteht aus einer Protease und einem ER-Retentionssignal und wird nachstehend als ER-ständige dibasische Prozessierungs- Endoprotease bezeichnet.
In einer bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform ist das ER-Retentionssignal an den C-Terminus einer löslichen Form einer dibasischen Prozessierungs-Endoprotease, d.h. einer Variante einer dibasischen Prozessierungs-Endoprotease, die nicht an eine Zellmembran gebunden ist, gebunden. Einer solchen löslichen Form fehlt die hydrophobe Transmembransequenz, aber sie besitzt immer noch die typische enzymatische dibasische Prozessierungsfunktion.
Ein bevorzugtes Beispiel einer löslichen dibasischen Prozessierungs-Endoprotease, die erfindungsgemäß nützlich ist, ist ein lösliches S. cerevisiae KEX2p, d.h. eine KEX2p- Variante, der die hydrophobe Transmembransequenz, die in der Region Tyr&sup6;&sup7;&sup9; bis Met&sup6;&sup9;&sup9; lokalisiert ist, fehlt [die Aminosäuresequenz der 814 Reste langen S. cerevisiae KEX2p ist aus K. Mizuno et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 156, 246-254 (1988) bekannt]. Insbesondere wurde in einer erfindungsgemäßen löslichen KEX2p-Endoprotease die Membranbindungsstelle selektiv entfernt. Daher ist der C-Terminus, der beispielsweise mit der Aminosäure 700 (Lys) beginnt, immer noch vorhanden, oder der ganze C-Terminus einschließlich der Membranbindungsstelle, d.h. 136 bis etwa Aminosäuren vom C-Terminus, wurde entfernt. Solche löslichen KEX2p-Proteine sind beispielsweise in der EP 327 377 oder in R.S. Fuller et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 1434-1438 (1989) beschrieben. Die am meisten bevorzugte erfindungsgemäße dibasische Prozessierungs-Endoprotease ist das lösliche KEX2p mit der in dem Sequenzprotokoll unter SEQ ID NO. 1 dargestellten Sequenz; sie wird nachstehend als KEX2ps bezeichnet.
Ein ER-Retentionssignal ist eine Struktur, die die Lokalisierung eines Polypeptids in dem ER bestimmt. Die Lokalisierung in dem ER kann auf einer spezifischen Bindung an die ER-Membran oder bevorzugt auf der Verhinderung des Transports eines löslichen Proteins in den Golgi-Apparat durch Rücktransport des Polypeptids aus einem Kompartiment zwischen dem Golgi-Apparat und dem ER in das ER-Lumen beruhen. ER-Retentionssignale, die erfindungsgemäß bevorzugt verwendet werden, sind vom zuletzt genannten Typ, d.h. derart, daß sie den Transport eines löslichen Proteins in den Golgi-Apparat verhindern.
Ein bevorzugtes Beispiel eines solchen ER-Retentionssignals ist die sog. KDEL-Sequenz (SEQ ID NO. 3), die in Säugerzellen funktionell ist. Bevorzugter ist die DDEL-Sequenz (SEQ ID NO. 4), die in der Hefe Kluyveromyces lactis funktionell ist und am meisten bevorzugt ist die HDEL-Sequenz (SEQ ID NO. 2), die in S. cerevisiae und in K. lactis funktionell ist.
Bevorzugte Formen der ER-ständigen dibasischen Prozessierungs-Endoprotease umfassen die ER-Retentionssignalsequenz KDEL, gebunden an eine dibasische Prozessierungs- Endoprotease einer Säugerzelle, wie beispielsweise Furin, PC1, PC2 oder PC3 (P.J. Barr, a.a.O.), oder bevorzugt gebunden an eine lösliche Variante davon oder auch an ein S. cerevisiae-KEX2p, von dem bekannt ist, daß es in Säugerzellen funktionell ist oder bevorzugt gebunden an eine lösliche Variante davon. Wenn eine solche ER-ständige dibasische Prozessierungs-Endoprotease, z . B. Furin-KDEL-, PC1-KDEL-, PC2-KDEL-, PC3-KDEL- oder KEX2p-KDEL-Enzyme in einer Saugerwirtszelle produziert werden, die mit einem Gen für die Expression eines heterologen Proteins transformiert ist, wird ein höherer Anteil eines korrekt gefalteten, sezernierten, heterologen Proteins produziert.
Bevorzugter ist das DDEL-Retentionssignal an ein K.lactis-KEX2p-Analogon oder bevorzugt an eine lösliche Variante davon oder an ein S. cerevisiae-KEX2p oder bevorzugt an eine lösliche Variante davon, insbesondere an KEX2ps fusioniert. S. cerevisiae-KEX2p ist auch in K.lactis funktionell. Eine solche KEX2pDDEL, produziert in einer K.lactis- Wirtszelle, erlaubt die Expression eines höheren Anteils eines korrekt gefalteten, sezernierten, heterologen Proteins.
Am meisten bevorzugt ist das HDEL-Retentionssignal an eine S. cerevisiae-KEX2p oder bevorzugt an eine eine lösliche Variante davon, insbesondere an KEX2ps, fusioniert. Ein solches in einer K.lactis- oder bevorzugter in einer S. cerevisiae-Wirtszelle produziertes KEX2pHDEL-Protein erlaubt die Expression eines höheren Anteils eines korrekt gefalteten, sezernierten, heterologen Proteins.
Um eine Wirtszelle zu produzieren, in der eine ER- ständige dibasische Prozessierungs-Endoprotease produziert wird, muß die Wirtszelle mit einer Expressionskassette transformiert werden, die eine ER-ständige dibasische Prozessierungs-Endoprotease codiert. Die Wirtszelle, die transformiert wird, kann noch ein intaktes endogenes Gen für die endogene dibasische Prozessierungs-Endoprotease auf dem Chromosom enthalten, d.h. im Falle des S. cerevisiae-Systems kann die mit KEX2pHDEL zu transformierende Wirtszelle eine KEX²&spplus;-Zelle sein, z.B. der Stamm AB110. Jedoch kann das Gen, das die entsprechende endogene dibasische Prozessierungs- Endoprotease codiert, auch zerstört sein, z.B. kann im Falle des S. cerevisiae-Systems die Wirtszelle eine kex2&supmin;-Zelle sein, z.B. der Stamm AB110 kex&supmin;.
Zur Transformation einer Wirtszelle werden Hybridvektoren verwendet, die die Replikation und Expression einer Expressionskassette, die die ER-ständige dibasische Prozessierungs-Endoprotease codiert, bereitstellen. Diese Hybridvektoren können extrachromosomal beibehaltene Vektoren oder auch Vektoren, die in das Wirtsgenom integriert sind, so daß eine Zelle produziert wird, die stabil mit der Expressionskassette transformiert ist, sein. Geeignete extrachromosomal gehaltene Vektoren und auch Vektoren, die in das Wirtsgenom integrieren, die Transformation von Säugerzellen oder von Hefezellen sind auf dem Fachgebiet gut bekannt.
Die Hybridvektoren können von jedem Vektor, der auf dem Gebiet der Gentechnik nützlich ist, abgeleitet sein, wie beispielsweise von Viren, Plasmiden oder chromosomaler DNA, wie der Derivate von SV40, Herpes-Viren, Papilloma-Viren, Retroviren, Baculoviren oder Derivaten von Hefeplasmiden, z.B. das Hefe-2µ-Plasmid.
Mehrere mögliche Vektorsysteme sind zur Integration und Expression der erfindungsgemäßen donierten DNA verfügbar. Im Prinzip sind alle Vektoren, die ein gewünschte Polypeptidgen, das in einer erfindungsgemäßen Expressionskassette in dem gewählten Wirt enthalten ist, replizieren und/oder exprimieren, geeignet. Der Vektor wird in Abhängigkeit von den Wirtszellen, die für die Transformation in Betracht gezogen werden, ausgewählt. Solche Wirtszellen sind bevorzugt Säugerzellen (wenn eine dibasische Prozessierungs- Endoprotease, die in Säugerzellen funktionell ist, verwendet wird) oder bevorzugter Hefezellen (wenn eine dibasische Prozessierungs-Endoprotease, die in Hefezellen funktionell ist, verwendet wird). Im Prinzip umfassen die extrachromosomal gehaltenen erfindungsgemäßen Hybridvektoren die Expressionskassette für die Expression einer ER-ständigen dibasischen Prozessierungs-Endoprotease und einen Replikationsorigin oder eine autonom replizierende Sequenz.
Ein Replikationsorigin oder eine autonom replizierende Sequenz (ein DNA-Element, das extrachromosomalen Elementen autonom replizierende Fähigkeiten verleiht) wird entweder durch Konstruktion des Vektors, so daß er einen exogenen Origin umfaßt, der, wie im Falle des Säugervektors, von dem Simian-Virus (SV 40) oder einer anderen viralen Quelle abgeleitet ist, oder durch chromosomale Mechanismen der Wirtszelle bereitgestellt.
Ein erfindungsgemäßer Hybridvektor kann selektive Marker in Abhängigkeit von dem zu transformierenden, zu selektionierenden und donierenden Wirt enthalten. Jedes Markergen kann verwendet werden, das die Selektion der Transformanten infolge der phänotypischen Expression des Markers erleichtert. Geeignete Marker sind insbesondere solche, die eine Antibiotikaresistenz exprimieren, z.B. gegen Tetracyclin oder Ampicillin, oder Gene, die Wirtsläsionen komplementieren. Es ist auch möglich, Strukturgene als Marker zu verwenden, die mit einem autonom replizierenden Segment assoziiert sind, vorausgesetzt, der zu transformierende Wirt ist für das von dem Marker exprimierte Produkt auxotroph.
Bevorzugt Vektoren, die für die Herstellung der erfindungsgemäßen Hybridvektoren geeignet sind, d.h. die eine Expressionskassette für die Herstellung einer ER-ständigen dibasischen Prozessierungs-Endoprotease enthalten, sind solche, die für die Replikation und Expression in S. cerevisiae geeignet sind, und einen Hefereplikationsorigin und einen selektiven genetischen Marker für Hefe enthalten. Hybridvektoren, die einen Hefereplikationsorigin enthalten, beispielsweise das chromosomale autonom replizierende Segment (ARS), werden extrachromosomal in der Hefezelle nach der Transformation beibehalten und werden während der Mitose autönom repliziert. Auch Hybridvektoren, die Sequenzen enthalten, die der Hefe-2µ-Plasmid-DNA homolog sind, oder die ARS und eine Sequenz eines chromosomalen Centromers, beispielsweise CEN4, enthalten, können verwendet werden. Bevorzugt sind Plasmide auf 2µ-Basis, die die vollständige oder teilweise S. cerevisiae-2µ-Plasmidsequenz enthalten. Geeignete Markergene für Hefe sind insbesondere diejenigen, die dem Wirt eine Antibiotikaresistenz verleihen, oder im Falle von auxotrophen Hefemutanten Gene, die Wirtsläsionen komplementieren. Entsprechende Gene verleihen beispielsweise Resistenz gegenüber dem Antibiotikum Cycloheximid oder ergeben Prototrophie in einer auxotrophen Hefemutante, beispielsweise des URA3, LEU2, HIS3 oder TRP1-Gens.
Bevorzugt enthalten die Hybridvektoren weiter einen Replikations-Origin und ein Markergen für einen bakteriellen Wirt, insbesondere E. coli, so daß die Konstruktion und die Clonierung der Hybridvektoren und ihre Vorläufer in E. coli durchgeführt werden kann.
In einer am meisten bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird ein kex&supmin;-Stamm von S. cerevisiae entweder mit einem extrachromosomal gehaltenen Plasmid oder mit einem Integrationsplasmid, umfassend eine Expressionskassette für die Expression eines löslichen KEX2pHDEL, transformiert.
Eine Expressionskassette für die Expression einer ER- ständigen dibasischen Prozessierungs-Endoprotease bedeutet eine DNA-Sequenz, die ein solches Polypeptid exprimieren kann und umfaßt einen Promotor und ein Strukturgen und ggf. einen Transkriptionsterminator und ggf. einen Transkriptionsverstärker, eine Ribosomenbindungsstelle und/oder weitere regulatorische Sequenzen.
Eine solche Expressionskassette kann entweder die Regulatorelemente in natürlicher Verknüpfung mit dem entsprechenden Gen für die dibasische Prozessierungs-Endoprotease, heterologe Regulatorelemente oder ein Gemisch aus beiden, d.h. beispielsweise einen homologen Promotor und eine heterologe Terminatorregion enthalten.
Eine breite Vielzahl von Promotorsequenzen kann in Abhängigkeit von der Natur der Wirtszelle verwendet werden. Sequenzen zur Translationsinitiation sind beispielsweise Shine-Dalgarno-Sequenzen. Sequenzen, die für die Initiation und Termination der Transkription und für die Stabilisierung der mRNA notwendig sind, sind allgemein aus den nichtcodierenden 5'-Regionen bzw. den 3'-Regionen von viralen oder eukaryotischen CDNAS, z.B. aus dem Expressionswirt, verfügbar.
Beispiele für Promotoren sind wie vorstehend, d.h. der Hefe-TRP1-, ADHI-, ADHII-, CYC1-, GAL1/10-, CUP1-, PHO3- oder PHO5-Promotor oder Promotoren aus Hitzeschockproteinen oder glycolytische Promotoren, wie der Glycerinaldehyd-3- phosphatdehydrogenase-Promotor (GAP) (einschließlich des 5'- verkürzten GAP) oder ein Promotor der Enolase-, 3-Phosphoglyceratkinase- (PGK), Hexokinase-, Pyruvatdecarboxylase-, Phosphofructokinase-, Glucose-6-phosphatisomerase-, 3-Phosphoglyceratmutase-, Pyruvatkinase-, Triosephosphatisomerase-, Phosphoglucoseisomerase- und Glucokinase-Gene, ferner ein α-Faktorpromotor und Hybridpromotoren, wie die hybriden PHO5-GAP- oder ADH2-GAP-Promotoren oder hybride Promotoren unter Verwendung von Hitzeschockelementen.
Promotoren, die für die Expression in Säugerzellen geeignet sind, leiten sich beispielsweise von Viren ab, z.B. SV40-, Rous-Sarcom-Virus-, Adenovirus 2-, Rinderpapilloma- Virus-, Papovavirus-, Cytomegalievirus-abgeleitete Promotoren oder sind von Säugerzellen abgeleitete Promotoren, z.B. des Actin-, Collagen-, Myosin- oder β-Globingens. Die Hefepromotoren können mit Enhancer-Sequenzen, wie mit den stromaufwärtigen Aktivierungssequenzen der Hefe (UAS) kombiniert werden. und in Säugerzellen aktive Promotoren können mit viralen oder zellulären Enhancern kombiniert werden, wie beispielsweise Cytomegalievirus-IE-Enhancern, SV40-Enhancer, Immunglobulingen-Enhancer oder anderen.
Enhancer sind transkriptionsstimulierende DNA-Sequenzen, z.B. abgeleitet von Viren, wie dem Simian-Virus, Polyoma-Virus, Rinderpapilloma-Virus oder Moloney-Sarcom- Virus, oder genomischen Ursprungs. Eine Enhancer-Sequenz kann auch von der extrachromosomalen ribosomalen DNA von Physarum polycephalum abgeleitet sein, oder sie kann die stromaufwärtige Aktivierungsstelle des sauren Hefephosphatase-PHO5-Gens oder das Hefe-PHO5-, TRP-, PHO5- GAPDH-Hybrid oder ein ähnlicher Promotor sein.
Eine erfindungsgemäße Wirtszelle mit einer dibasischen Prozessierungs-Endoproteaseaktivität in dem ER ist zur Herstellung von korrekt prozessierten heterologen Proteinen nützlich. Dazu muß natürlich eine Expressionskassette zur Expression eines Gens, das das gewunschte heterologe Protein codiert, in die Wirtszelle eingeschleust werden. Eine solche Expressionskassette wird nachstehend als Produktionsgen bezeichnet.
Ein solches Produktionsgen umfaßt eine Promotorregion, eine DNA-Sequenz, die ein Signalpeptid codiert, das von einer Signalpeptidase abgespalten werden kann, eine DNA-Sequenz, die eine Prosequenz codiert, die von dem gewünschten heterologen Genprodukt durch eine dibasische Prozessierungs- Endoprotease abgespalten werden kann, eine DNA-Sequenz, die ein gewünschtes heterologes Genprodukt codiert und/oder eine Transkriptionsterminationsregion und ggf. einen Transkriptions-Enhancer, eine Ribosomenbindungsstelle und/oder weitere Regulatorsequenzen. Die codierenden Regionen für das Signalpeptid, die Prosequenz und das heterologe Protein werden im Leseraster gebunden, d.h. das Signalpeptid ist nach der Translations des Strukturgens kovalent an den N-Terminus der Prosequenz gebunden, und das zuletzt genannte ist nach der Transiation des Gens kovalent an den N-Terminus des heterologen Proteins gebunden.
Die Prosequenz kann jede beliebige Sequenz aus einer genomischen Zufallsbank von Fragmenten sein, die als molekulares Einfangmolekül dienen können, d.h. ein Polypeptid, das in cis oder in trans die Bildung einer geeigneten Konformation beeinflussen kann. Bevorzugt ist sie eine Zufallssequenz, die eine Membrantranslokation erlaubt. Besonders bevorzugt ist die α-Faktorprosequenz.
In der vorstehend für die Expression einer dibasischen Prozessierungs-Endoprotease beschriebenen Expressionskassette können eine breite Vielzahl von Regulatorsequenzen in Abhängigkeit von der Natur der Wirtszelle verwendet werden. Beispielsweise sind Promotoren, die stark und gleichzeitig gut reguliert sind, am meisten nützlich. Sequenzen zur mitiation der Translation sind beispielsweise Shine-Dalgorno- Sequenzen. Sequenzen, die für die Initiation und Termination der Transkription und zur Stabilisierung der mRNA notwendig sind, sind weithin aus den nichtcodierenden 5'-Regionen bzw. den 3'-Regionen aus viralen oder eukaryotischen cDNAs, beispielsweise aus dem Expressionswirt, verfügbar.
Signalpeptide im Rahmen der vorliegenden Erfindung sind Präsquenzen, die die Translokation des gewünschen Polypeptids in das ER steuern, beispielsweise die α-Faktorsignalsequenz. Weitere Signalsequenzen sind aus der Literatur bekannt, z.B. diejenigen, die in von Heijne, G., Nucleic Acids Res. 14, 4683 (1986) zusammengestellt sind.
Beispiele für geeignete Promotoren sind wie vorstehend, d.h. der Hefe-TRP1-, ADHI-, ADHII-, CYC1-, GAL1/10-, CUP1-, PHO3- oder PHO5-Promotor oder Promotoren aus den Hitzeschockproteinen oder glycolytische Promotoren, wie der Glycerinaldehyd-3-phosphatdehydrogenase-Promotor (GAP) (einschließlich des 5'-verkürzten GAP-Promotors) oder ein Promotor der Enolase-, 3-Phosphoglyceratkinase-(PGK)-, Hexokinase-, Pyruvatdecarboxylase-, Phosphofructokinase-, Glucose-6-phosphatsiomerase-, 3-Phosphoglyceratmutase-, Pyruvatkinase-, Triosephosphatisomerase-, Phosphoglucoseisomerase- und Glucokinase-Gene, ferner der α-Faktorpromotor und Hybridpromotoren, wie die hybriden PHO5-GAP- oder ADH2-GAP- Promotoren oder hybride Promotoren unter Verwendung der Hitzeschockelemente oder von eukaryotischen Viren abgeleitete Promotoren, z.B. SV40-, Rous-Sarcom-Virus-, Adenovirus 2-, Rinderpapillomavirus-, Papovavirus-, Cytomegalievirus-abgeleitete Promotoren, oder von Säugerzellen abgeleitete Promotoren, z.B. des Actin-, Collagen-, Myosin- oder β- Globingens. Die eukaryotischen Promotoren können mit Enhancer-Sequenzen kombiniert werden, wie den stromaufwärtigen Aktivierungssequenzen der Hefe (UAS) oder viralen oder zellulären Enhancern, wie den Cytomegalievirus IE-Enhancern, SV40-Enhancer, Immunglobulingen-Enhancer oder anderen.
Die Expressionskassette, die die ER-ständige dibasische Prozessierungs-Endoprotease und das Produktionsgen codiert, kann Promotoren des gleichen oder eines anderen Typs umfassen. Beispielsweise können sie beide durch einen induzierbaren Promotor reguliert werden, der die konzertierte Expression des Vorläufers des heterologen Proteins und der es prozessierenden ER-ständigen dibasischen Prozessierungs-Endoprotease erlaubt.
In einer erfindungsgemäßen bevorzugten Ausführungsform enthält ein Produktionsgen, das für die Expression in einer S. cerevisiae-Zelle geeignet ist, die eine ER-ständige dibasische Prozessierungs-Endoprotease, bevorzugt YAP3pHDEL, bevorzugter KEX2pHDEL oder am meisten bevorzugt KEX2psHDEL, enthält, ein strukturelles Fusionsgen, bestehend aus einer DNA-Sequenz, die eine Hef eprosequenz codiert, die von dem Vorläufer durch eine dibasische Hefe-Prozessierungs-Endoprotease abgespalten werden kann, bevorzugt die S. cerevisiae-α-Faktor-Leader-Sequenz, und stromabwärts eine DNA-Sequenz, die ein gewünschtes heterologes Protein codiert, wobei das Fusionsgen unter der Kontrolle der Expressionskontrollsequenzen, die die Transkription und Translation in Hefe regulieren, steht.
Das heterologe Protein kann jedes Protein von biologischem Interesse sein und aus einem Prokaryonten oder insbesondere einem Eukaryonten, insbesondere einem höheren Eukaryonten, wie einem Säuger (einschließlich Tier und Mensch) stammen und ist beispielsweise ein Enzym, das beispielsweise zur Produktion von Nährstoffen und zur Durchführung von enzymatischen Reaktionen in der Chemie oder Molekularbiologie verwendet werden kann, oder ein Protein sein, das zur Behandlung von menschlichen und tierischen Erkrankungen nützlich und wertvoll ist oder zu deren Prävention dient, beispielsweise ein Hormon, ein Polypeptid mit immunmodulatorischen, antiviralen und Antitumoreigenschaften, ein Antikörper, ein virales Antigen, ein Blutgerinnungsfaktor, ein fibrinolytisches Mittel, ein Wachstumsregulator, ferner ein Lebensmittel und dgl.
Beispiele für solche Proteine sind beispielsweise Hormone, wie Secretin, Thymosin, Relaxin, Calcitonin, lutenisierendes Hormon, Parathyroidhormon, Adrenocorticotropin, Melanocyten-stimulierendes Hormon, β-Lipotrop in, Urogastron, Insulin, Wachstumsfaktoren, wie der epidermale Wachstumsfaktor (EGF), der insulinähnliche Wachstumsfaktor (IGF), z.B. IGF-1 und IGF-2, der Mastzellenwachstumsfaktor, der Nervenwachstumsfaktor, der Glia-abgeleitete Nervenzellenwachstums faktor, der Plättchen-abgeleitete Wachstums faktor (PDGF) oder der transformierende Wachstumsfaktor (TGF), wie -TGFβ, Wachstumshormone, wie menschliche oder Rinderwachstumshormone, Interleukin, wie Interleukin-1 oder -2, der menschliche Makrophagenmigrations-Hemmfaktor (MIF), Interferone, wie menschliches α-Interferon, beispielsweise Interferon-αA, αB, αD oder αF,β-Interferon, γ-Interferon oder ein Hybridinterferon, beispielsweise ein αA-αD- oder ein αB-αD-Hybridinterferon, insbesondere das Hybridinterferon BDBB, Proteinaseinhibitoren, wie α&sub1;-Antitrypsin, SLPI und dgl., Hepatitisvirusantigene, wie das Hepatitis B- Virus-Oberflächen- oder -core-Antigen oder das Hepatitis A- Virus-Antigen, oder das Hepatitis-Non-A-Non-B-Antigen, Plasminogenaktivatoren wie der gewebsplasminogenaktivator oder Urokinase, hybride Plasminogenaktivatoren, wie K&sub2;tuPA, antikoagulierendes Zeckenpeptid (TAP), Tumornekrosefaktor, Somatostatin, Renin, Immunglobuline, wie die leichten und/oder schweren Ketten von Immunglobulin D, E oder G, oder Mensch-Maus-Hybridimmunglobuline, Immunglobulinbindungsfaktoren, wie Immunglobulin E-Bindungsfaktor, menschliches Calcitonin-verwandtes Peptid, Blutgerinnungsfaktoren, wie Faktor IX oder VIIIc, Plättchenfaktor 4, Erythropoietin, Eglin, wie Eglin C, Desulfatohirudin, wie die Desulfatohirudinvariante HV1, HV2 oder PA, Corticostatin, Echistatin, Cystatine, menschliche Superoxiddismutase, virale Thymidinkinase, β-Lactamase oder Glucoseisomerase. Bevorzugt sind menschliches α-Interferon, z.B. Interferon αB oder Hybridinterferon, insbesondere Hybridinterferon BDBB (vgl. EP 205 404), menschlicher Gewebsplasminogenaktivator (t-PA), einkettiger menschlicher Urokinasetyp-Plasminogenaktivator (scu-PA), hybrider Plasminogenaktivator K&sub2;tuPA (vgl. EP 277 313), menschliches Calcitonin, Desulfatohirudin, z.B. die Variante HV1, noch bevorzugter insulin-verwandte Proteine, wie Insulin, Relaxin und noch weiter bevorzugt der insulin-ähnliche Wachstumsfaktor II und insbesondere der insulin-ähnliche Wachstumsfaktor I. Proteine, die ein Paar von basischen Aminosäuren enthalten, wie Arg-Arg, Lys-Arg, Lys-Lys und Arg-Lys, die auf der Proteinoberfläche exponiert sind und daher einer proteolytischen Spaltung zugänglich sind, eignen sich für das erfindungsgemäße Verfahren nicht und müssen so mutiert werden, daß eine der aufeinanderfolgenden basischen Aminosäuren durch eine andere nichtbasische Aminosäure ersetzt ist, ohne daß die biologische Aktivität beeinträchtigt ist.
Ein Produktionsgen muß nicht notwendigerweise auf dem gleichen Vektormolekül wie das Gen, das die ER-ständige dibasische Prozessierungs-Endoprotease codiert, lokalisiert sein. Falls das zuletzt genannte auf einem Vektor lokalisiert ist, der extrachromosomal gehalten wird, kann es vorteilhaft sein, wenn das Produktionsgen auf dem gleichen Vektormolekül lokalisiert ist.
Expressionsvektoren, die für die Expression eines Produktionsgens geeignet sind, sind beispielsweise auch diejenigen, die vorstehend als geeignet für die Expression einer ER-ständigen dibasischen Prozessierungs-Endoprotease beschrieben wurden, d.h. Vektoren, die von jedem auf dem Fachgebiet der Gentechnik nützlichen Vektor abgeleitet wurden, wie beispielsweise von Viren, Plasmiden oder chromosomaler DNA, wie Derivate von SV40, Herpes-Viren, Papilloma-Viren, Retroviren, Baculoviren oder Derivate von Hefeplasmiden, z.B. Hefe-2µ-Plasmid. Bevorzugt sind Vektoren zur Replikation und Expression in S. cerevisiae.
Bevorzugt enthalten die erfindungsgemäßen Hybridvektoren auch einen Replikationsorigin und ein Markergen für einen bakteriellen Wirt, insbesondere E. coli, so daß die Konstruktion und die Clonierung der Hybridvektoren und ihrer Vorläufer in E. coli durchgeführt werden kann.
Ein Verfahren zur Herstellung des heterologen biologisch aktiven Proteins, umfassend die Verwendung einer Wirtszelle mit einer dibasischen Prozessierungs-Endoproteaseaktivität in dem ER gemäß der Erfindung, umfaßt (a) die Transformation einer geeigneten Wirtszelle mit einem Hybridvektor, umfassend eine Expressionskassette, die eine ER- ständige dibasische Prozessierungs-Endoprotease codiert und mit einem Hybridvektor, der ein Produktionsgen codiert oder (b) Transformation einer geeigneten Wirtszelle mit einem Hybridvektor, umfassend sowohl eine Expressionskassette, die eine ER-ständige dibasische Prozessierungs-Endoprotease und ein Produktionsgen codiert oder (c) Transformation einer geeigneten Wirtszelle, die mit einem Gen, das eine ER-ständige dibasische Prozessierungs-Endoprotease codiert, stabil transformiert wurde, mit einem ein Produktionsgen codierenden Hybridvektor, Züchten der transformierten Wirtszellen unter Bedingungen, unter denen das die ER- ständige dibasische Prozessierungs-Endoprotease codierende Gen und das Produktionsgen exprimiert werden, und Isolieren des gewünschten heterologen Polypeptids aus dem Kulturmedium nach herkömmlichen Methoden.
Die Erfindung betrifft bevorzugt ein Verfahren, bei dem ein Hefestamm, bevorzugter ein Saccharomyces cerevisiae Stamm, z.B. AB110 oder AB110-kex2&supmin;, eine ER-ständige dibasiche Prozessierungs-Endoprotease aus Hefe, z.B. YAP3DDEL oder bevorzugt YAP3HDEL, oder noch bevorzugter KEX2pHDEL, am meisten bevorzugt KEX2psHDEL, zur Herstellung eines insulinähnlichen Proteins, bevorzugt IGF-2 und bevorzugter IFG-1, verwendet wird, das als ein Vorläufer, der die α-Faktor- Leader-Sequenz enthält, produziert wird.
Die Transformation wird nach auf dem Fachgebiet bekannten Verfahren durchgeführt, beispielsweise gemäß dem von Hinnen et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75, 1919 (1978)] beschriebenen Verfahren. Dieses Verfahren kann in drei Stufen aufgeteilt werden:
(1) Entfernung der Hefezellwände oder von Teilen davn.
(2) Behandlung der nackten Hefezellen (Sphäroplasten) mit dem Expressionvektor in Anwesenheit von PEG (Polyethylenglycol) und Ca²&spplus;-Ionen.
(3) Regeneration der Zellwand und Selektion der transformierten Zellen in einer festen Agarschicht.
Die transformierten Wirtszellen werden nach auf dem Fachgebiet bekannten Verfahren in einem Flüssigmedium, das assimilierbare Quellen für Kohlenstoff, Stickstoff und anorganische Salze enthält, gezüchtet. Verschiedene Quellen für Kohlenstoff können zur Züchtung der transformierten Hefezellen gemäß der Erfindung verwendet werden.
Beispiele für bevorzugte Kohlenstoffquellen sind assimilierbare Kohlenhydrate, wie Glucose, Maltose, Mannit oder Lactose, oder ein Acetat, das entweder als solches oder in geeigneten Gemischen verwendet werden kann. Beispiele für geeignete Stickstoffquellen sind Aminosäuren, wie Casaminosäuren, Peptide und Proteine und ihre Abbauprodukte, wie Trypton, Pepton oder Fleischextrakte, Hefeextrakte, Malzextrakt und auch Ammoniumsalze, beispielsweise Ammoniumchlorid, -sulfat oder -nitrat, die entweder als solche oder in geeigeten Gemischen verwendet werden können. Anorganische Salze, die auch verwendet werden können, sind beispielsweise Sulfate, Chloride, Phosphate und Carbonate von Natrium, Kalium, Magnesium und Calcium. Das Medium enthält weiterhin beispielsweise wachstumsfördernde Substanzen, wie Spurenelemente, beispielsweise Eisen, Zink, Mangan und dgl. und bevorzugt Substanzen, die einen Selektionsdruck ausüben und das Wachstum von Zellen, die das Expressionplasmid verloren haben, verhindern. So enthält beispielsweise, wenn ein Hefestamm, der beispielsweise bezüglich einer essentiellen Aminosäure auxotroph ist, als der Wirtsmikroorganismus verwendet wird, das Plasmid bevorzugt ein Gen, das ein Enzym codiert, das den Wirtsdefekt komplementiert. Die Züchtung des Hefestamms wird in einem minimalen Medium, dem die Aminosäure fehlt, durchgeführt.
Die Züchtung wird durch Verfahren, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, durchgeführt. Die Züchtungsbedingungen, wie Temperatur, pH-Wert des Mediums und Fermentationszeit, werden so gewählt, daß ein maximaler Titer der erfindungsgemäß hergestellten heterologen Proteine erhalten wird. So wird der Hefestamm bevorzugt unter aeroben Bedingungen in einer Submerskultur unter Schütteln oder Rühren bei einer Temperatur von etwa 20 bis 40ºC, bevorzugt etwa 30ºC, und einem pH-Wert von 5 bis 8, bevorzugt etwa pH 7, für etwa 4 bis etwa 96 h, bevorzugt bis maximale Ausbeuten der erfindungsgemäßen Proteine erhalten werden, gezüchtet. Das Kulturmedium wird so gewählt, daß ein Selektionsdruck ausgeübt wird und nur diejenigen Zellen überleben, die immer noch die Hybridvektor-DNA einschließlich des genetischen Markers enthalten. So wird beispielsweise ein Antibiotikum dem Medium zugesetzt, wenn der Hybridvektor das entsprechende Antibiotikum-Resistenzgen enthält.
Wenn die Zelldichte einen ausreichenden Wert erreicht hat, wird die Züchtung unterbrochen, und das das Produkt enthaltende Medium wird von den Zellen abgetrennt, die mit frischem Medium versorgt werden können und für die kontinuierliche Produktion verwendet werden können. Das Protein kann sich auch innerhalb der Zellen anreichern, beispielsweise im periplasmatischen Raum. In dem zuletzt genannten Fall besteht die erste Stufe zur Isolierung des gewünschten Proteins in der Freisetzung des Proteins aus dem Zellinneren. Die Zellwand wird zuerst durch enzymatische Spaltung mit Glucosidasen entfernt oder alternativ wird die Zellwand durch Behandlung mit chemischen Mitteln, d.h. Thiolreagentien oder EDTA, entfernt, die zu Zellwandschäden führen, die die Freisetzung des produzierten Proteins erlauben. Das so erhaltene Gemisch wird an heterologen Protein nach herkömmlichen Methoden angereichert, wie beispielsweise die Entfernung des Hauptteils des nichtproteinartigen Materials durch Behandlung mit Polyethylenimin, Fällung der Proteine unter Verwendung von Ammoniumsulfat, Gelelektrophorese, Dialyse, Chromatographie, beispielsweise Ionenaustauschchromatographie (besonders bevorzugt, wenn das heterologe Protein eine große Anzahl von sauren oder basischen Aminosäuren umfaßt), Größenausschlußchromatographie, HPLC oder Umkehrphasen-HPLC, Molekulargrößenverteilung auf einer geeigneten Sephadex -Säule oder dgl. Die Endreinigung des zuvor gereinigten Produkts wird beispielsweise mittels Affinitätschromatographie, beispielsweise Antikörper-Affinitätschromatographie, insbesondere monodonale Antikörper- Affinitätschromatographie, unter Verwendung von an eine unlösliche Matrix nach auf dem Fachgebiet bekannten Verfahren gebundenen Antikörpern durchgeführt.

Rekombinante DNA-Moleküle

Die Erfindung betrifft auch ein rekombinantes DNA-Molekül, das eine Expressionskassette für eine, wie vorstehend definierte, ER-ständige, dibasische Prozessierungs-Endoprotease codiert. Die Erfindung betrifft ferner Hybridvektoren, umfassend ein solches rekombinantes DNA-Molekül.
Die vorliegende Erfindung betrifft bevorzugt ein rekombinantes DNA-Molekül oder einen Hybridvektor, umfassend die codierende Region für KEX2p, bevorzugt für eine lösliche KEX2p-Variante, am meisten bevorzugt für KEX2ps, wie in dem Sequenzprotokoll unter SEQ ID NO. 1 gezeigt, und für ein ER- Retentionssignal, bevorzugt für die in dem Sequenzprotokoll unter SEQ ID NO. 2 gezeigte HDEL-Sequenz. Die codierende Sequenz für das ER-Retentionssignal ist bevorzugt in stromabwärtiger Richtung der KEX2p-codierenden Region lokalisiert. Ein KEX2p mit an den C-Terminus gebundenem HDEL wird hier als KEX2pHDEL bezeichnet, das entsprechende Strukturgen ist KEX2HDEL.
Wie vorstehend genannt, sind einige lösliche KEX2p-Varianten aus der Literatur bekannt. Weitere erfindungsgemäße Deletionsmutanten können unter Verwendung von auf dem Fachgebiet bekannten Verfahren hergestellt werden, beispielsweise durch Herstellung einer entsprechenden DNA, die die Mutante codiert, ihre Insertion in eine geeignete Vektor-DNA unter der Kontrolle einer Expressionskontrollsequenz, Transformation geeigneter Wirtsmikroorganismen mit dem gebildeten Expressionsvektor, Züchten des transformierten Wirtsmikroorganismus in einem geeigneten Kulturmedium und Isolieren der produzierten Mutante. Die für eine beliebige der Mutanten codierende DNA kann beispielsweise durch Nehmen eines Plasmids, das die KEX2p-codierende DNA enthält und (1) seine Spaltung mit einem Restriktionsenzym, das innerhalb oder 3' der DNA-Region, die die Membranbindunqsstelle codiert, spaltet (beispielsweise EcoRI, BstXI oder NarI), Spalten der gespaltenen DNA mit einer geeigneten Endonuclease, beispielsweise Bal31, so daß die DNA-Region entfernt wird und Rezirkularisierung des linearisierten Plasmids durch glattendige Ligierung oder dgl., oder (2) Wählen oder Erzeugen (beispielsweise durch ortsspezifische Mutagenese) einer Restriktionsstelle 5' der und einer Restriktionsstelle 3' der DNA-Region, die die Membranbindungsstelle codiert (beispielsweise PvuII und NarI oder EcoRI; die 3'-Restriktionsstelle kann auch innerhalb der Plasmid-DNA neben dem Translationsstoppsignal des KEX2-Gens liegen), Spalten des Plasmids mit zwei Restriktionsenzymen, die die Restriktionsspaltstellen erkennen und Rezirkularisation des linearisierten Plasmids durch glattendige Ligierung oder dgl. oder (3) Deletieren der DNA-Region, die die Membranbindungsstelle codiert, unter Verwendung der Loop-out-Mutagenese, oder (4) vollständige Deletion des C-Terminus durch Spalten mit PvuII im Falle von KEX2 und Rezirkularisierung des linearisierten Plasmids durch glattendige Ligierung oder dgl., produziert werden. Da die DNA-Sequenzen von KEX2 bekannt sind (K. Mizumo et al., a.a.O.) kann ein geeignetes Mutageneseoligonucleotid leicht entwickelt werden und zur Deletion der DNA-Region verwendet werden, wobei das M13-Clonierungssystem angewendet wird. Es muß aufgepaßt werden, daß die mutierten KEX2-Gene mit einer DNA-Sequenz, die ein Hefe- ER-Retentionssignal codiert, verknüpft werden. Eine solche DNA-Sequenz kann an der gewünschten Stelle über eine synthetische Linker-DNA eingeschleust werden, oder sie kann durch die benachbarte Vektor-DNA bereitgestellt werden. Bevorzugt umfassen die mutierten KEX2-Gene an ihren 3'-Enden Codons, die für die vorstehend definierte HDEL-Sequenz codieren. Bei all diesen Verfahren werden herkömmliche Techniken verwendet.
Unter den Umfang der vorliegenden Erfindung fallen auch rekombinante DNA-Moleküle, umfassend DNA-Sequenzen, die innerhalb der Bedeutung des genetischen Codes auf die DNA-Sequenzen mit SEQ ID NO. 1 und 2 degeneriert sind, d.h. DNA- Sequenzen, die die gleiche Aminosäuresequenzen codieren, obwohl die Nucleotide ausgetauscht sind. Solche degenerierte DNA-Sequenzen können beispielsweise neue Restriktionsenzymspaltstellen enthalten.

Wirtsstämme

Ein weiterer Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung betrifft Wirtszellen, bevorzugt Säugerzellen, bevorzugter Hefezellen, noch bevorzugter K.lactis- und am meisten bevorzugt S. cerevisiae-Zellen, die mit einem erfindungsgemäßen Hybridvektor transformiert sind, umfassend eine Expressionskassette, die eine ER-ständige dibasische Prozessierungs-Endoprotease codiert. Die Erfindung betrifft auch Wirtszellen, die mit einer Expressionskassette, die eine ER- ständige dibasische Prozessierungs-Endoprotease codiert, stabil transformiert sind, d.h. die eine solche rekombinante Expressionskassette, integriert in ein Chromosom, umfassen.
Geeignete Wirte für die Integration einer Expressionskassette, die KEX2HDEL codiert, sind beispielsweise kex2&supmin;- Mutanten von Hefe, bevorzugt S. cerevisiae. Das Verfahren zur Herstellung der transformierten Wirtszellen umfaßt die Transformation der Wirtszellen mit einem Integrationsvektor, bestehend aus einer KEX2pHDEL-Expressionskassette, die unter der Kontrolle irgendeines konstitutiven oder induzierbaren Promotors, bevorzugt der vorstehend definierten Promotoren, oder des Promotors des KEX2-Gens, steht, und Selektion stabil transformierter Zellen. Eine stabile integrative Transformation gehört zum Stand der Technik und kann beispielsweise nach dem für Säugerzellen in P.L. Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 84:7413-7417 (1987) oder in FL. Graham et al., Virology 52:456-467 81973) und für S. cerevisiae-Zellen in R. Rothstein, Methods Enzymol. 194:281- 302 (1991) beschriebenen Verfahren durchgeführt werden.
Die Erfindung betrifft insbesondere das rekombinante DNA-Molekül, die Hbybridvektoren, die transformierten Wirte, die Proteine und die Verfahren zur Herstellung davon und das Verfahren zur Herstellung eines biologisch aktiven Proteins, wie in den Beispielen beschrieben.
Die folgenden Beispiele dienen der Erläuterung der Erfindung, aber sie sollen nicht als Beschränkung davon aufgefaßt werden.

Beispiel 1: Konstruktion eines verkürzten KEX2-Gens, codierend eine lösliche KEX2p-Variante

Um eine lösliche KEX2p-Proteaseaktivität zu erhalten, wird ein mutiertes KEX2-Gen, dem 600 bp fehlen, das die C- terminalen 200 Aminosäuren codiert, konstruiert. Das verkürzte Gen steht unter der Kontrolle des KEX2-Promotors, der sich von -1 bis -502 erstreckt. Die Translation wird am Stoppcodon (TAA), das aus dem Polylinker von pUC18 stammt, beendet.
Äusführlich, das Plasmid pUC19 [Boehringer Mannheim GmbH, BRD] wird vollständig mit HindIII gespalten, und das 2686 bp große Fragment wird isoliert. Die Enden werden aufgefüllt, und das Fragment wird religiert. Ein Aliquot des Ligierungsgemisches wird calciumbehandelten transformationskompetenten E. coli JM101-Zellen [Invitrogen, San Diego, USA] zugesetzt. 12 transformierte ampicillinresistente E. coli-Transformanten werden in Gegenwart von 100 µg/ml Ampicillin gezüchtet. Die Plasmid-DNA wird hergestellt und durch Spaltung mit HindIII sowie mit BamHI analysiert. Das Plasmid, dem die HindIII-Spaltstelle fehlt, wird als pUC19woH bezeichnet.
Ein 3207 bp großes BalI-AhaIII-KEX2-Fragment (erhältlich aus gesamter genomischer Hefe-DNA) wird an beiden Enden mit BamHI-Linkern versehen und anschließend vollständig mit BamHI gespalten. Das Plasmid pUC19woH wird vollständig mit BamHI gespalten, das lineare 2690 bp große Fragment wird isoliert und an das vorstehend beschriebene BamHI-KEX2-Fragment ligiert. Ein Aliquot des Ligierungsgemisches wird in E. coli JM101-Zellen transformiert. 12 transformierte ampicillinresistente Kolonien werden in ampicillinhaltigem LB- Medium (100 µg/ml) gezüchtet, die Plasmid-DNA wird extrahiert und durch BamHI-Spaltungen analysiert. Ein Clon mit den erwarteten Restriktionsfragmenten wird ausgewählt und als pKS301b bezeichnet (hinterlegt als DSM 6028).
Der 2 µm-Hefevektor pAB24, der im wesentlichen dem Plasmid pDP34 (hinterlegt als DSM 4473) entspricht, wird vollständig mit BamHI gespalten und das lineare pAB24-Fragment wird isoliert. Das Plasmid pKS301b wird mit BamHI gespalten und das Fragment, das das vollständige KEX2-Gen enthält, wird isoliert und an den linearisierten Hefevektor pAB24 ligiert. Ein Aliquot des Ligierungsgemisches wird in E. coli JM101 transformiert, und die Plasmid-DNA von 12 positiven Clonen wird durch BamHI-Spaltung untersucht. Ein Clon mit den erwarteten Restriktionsfragmenten wird als pAB226 bezeichnet.
Das Plasmid pKS301b wird vollständig mit SphI, PvuII und ScaI gespalten. Das 2,37 kb große SphI-PvuII-Fragment, das KEX2-Sequenzen von -502 bis +1843 und einen Teil des pUC19-Polylinkers enthält, wird isoliert. Das Plasmid pUC18 [Boehringer Mannheim, BRD] wird vollständig mit SphI und SmaI gespalten. Das 2660 bp große SphI-SmaI-pUC18-Fragment wird an das 2,37 kb große SphI-PvuII-KEX2-Fragment durch Sphi/Sphi und PvuII/SmaI-Ligierung ligiert. Die PvuII/SmaI- Ligierung führt zur Fusion des KEX2-ORF, der 614 Aminosäuren codiert, an einen ORF in den pUC18-Sequenzen, der sieben weitere C-terminale Aminosäuren (-G-V-P-S-S-N-S) codiert, und auf den ein Stoppcodon (TAA) folgt. Ein Aliquot des Ligierungsgemisches wird in E. coli JM101 transformiert. Die Plasmid-DNA wird aus ampicillinresistenten E. coli- Transformanten isoliert und durch Spaltung mit SphI und EcoRI sowie mit HindIII analysiert. Ein Clon mit dem erwarteten Restriktionsmuster wird als p18kexp bezeichnet. In dem Sequenzprotokoll ist unter SEQ ID NO. 1 das ORF, das das lösliche KEX2ps codiert, mit der KEX2-abgeleiteten DNA gezeigt.
Das Plasmid p18kexp wird vollständig mit PvuII, SalI und ScaI gespalten. Das 2552 bp große SalI-PvuII-Fragment, das die KEX2-Seguenzen von -502 bis +1843 sowie 206 bp von pUC18-Sequenzen enthält, wird isoliert. Das Plasmid pDP34 wird mit BamHI gespalten, und die Enden des linearisierten Plasmids werden aufgefüllt. Nach Inaktivierung der T4-Polymerase wird das linearisierte aufgefüllte Plasmid mit SalI gespalten, und das 11,78 kb große Fragment wird isoliert.
Das pDP34-BamHI*-SalI-Fragment (BamHI*: aufgefülltes BamHI) wird an das 2552 bp große SalI-PvuII-Fragment durch SalI/SalI- und BamHI*/PvuII-Ligierung ligiert. Ein Aliquot des Ligierungsgemisches wird in transformationskompetente E. coli JM101-Zellen transformiert. Die Plasmid-DNA wird aus ampicillinresistenten Zellen extrahiert und durch Restriktionsanalyse mit SalI, NcoI, SmaI, XbaI, EcoRI analysiert. Ein Clon mit den erwarteten Restriktionsfragmenten wird als pDPkexp bezeichnet.

Beispiel 2: Konstruktion von pDPkexpHDEL

Das Plasmid p18kexp (siehe Beispiel 1) besteht aus dem verkürzten KEX2-Gen, das lösliches KEX2p (KEX2ps), insertiert in die Polylinkerregion von pUC18, codiert. Auf die DNA-Sequenz, die das C-terminale Ende von KEX2ps in p18lexp codiert, folgt eine Asp718- und eine EcoRI- Spaltstelle (siehe SEQ ID NO. 1). Das Plasmid wird mit Asp718 und EcoRI gespalten und mit den hybridisierten Oligonudeotiden mit SEQ ID NO. 11 und 12, die die HDEL-Sequenz und zwei Stoppcodons codieren, ligiert, wodurch das Ligierungsprodukt p18kexpHDEL erhalten wird. Die Plasmide p18kexp und p18kexpHDEL können durch SacI- oder SfuI- Spaltung unterschieden werden. Die Polylinkerinsertionsregion wurde in p18kexpHDEL sequenziert.
Das Plasmid p18kexpHDEL wurde mit SalI, PvuI und ScaI gespalten, und das 2572 bp große SalI-PvuII-Fragment wurde isoliert.
Das Plasmid pDP34 wurde mit BamHI gespalten, und die klebrigen Enden wurden mit Klenow-Polymerase aufgefüllt. Nach dem Auffüllen wurde die Polymerase durch Phenol/Chloroform- und Chloroformextraktion, gefolgt von einer Ethanolfällung, zerstört. Das BamHI-gespaltene aufgefüllte pDP34- Fragment wurde dann mit SalI gespalten, und das 11780 bp große SalI-BamHI*-Fragment (BamHI*: aufgefüllte BamHI-Spaltstelle) wurde isoliert.
Das 2572 bp große SalI-PvuII-Fragment, isoliert aus p18kexpHDEL, wurde mit dem 11780 bp großen SalI-BamHI*- pDP34-Fragment ligiert. Die Ligierung von SalI/SalI und PvuI/BamHI* führte zu dem Plasmid pDPkexpHDEL.

Beispiel 3: Konstruktion eines Hefevektors, der die IGF-1-Expressionskassette enthält

Das Plasmid pDP34 ist ein E. coli-S. cerevisiae-Schaukelvektor, der die vollständige 2µ-Sequenz, die genomischen URA3- und dLEU2-Hefesequenzen als selektierbare Marker für Hefe und die pBR322-Sequenzen zur Selektion und Propagation in E. coli [A. Hinnen, B. Meyhack und J. Heim in Yeast, genetic engineering (P.J. Barr, A.J. Brake & P. Valenzuela, Hrg., S. 193-213 (1989), Butterworth Publishers, Stoneham)] enthalten. Ein 276 bp großes SalI-BamHI-Fragment von pBR322 [Boehringer Mannheim, GmbH, BRD] wird an den isolierten linearen Vektor nach Spaltung mit SalI und BamHI ligiert. Ein Aliquot des Ligierungsgemisches wird calciumbehandelten transformationskompetenten E. coli HB101-Zellen [Invitrogen, San Diegeo, USA] zugesetzt. Vier transformierte amplicillinresistente E. coli-Transformanten werden in Gegenwart von 100 µg/ml Ampicillin gezüchtet. Die Plasmid- DNA wird hergestellt und durch Spaltung mit SalI-BamHI analysiert. Ein Plasmid mit den erwarteten Restriktionsfragmenten wird als pDP34A bezeichnet. Eine Expressionskassette für das menschliche insulinähnliche Wachstumsfaktor-1-(IGF-1)-Gen, beispielsweise in Hefe, wird in die BamHI-Spaltstelle von pDP34A ligiert. Die DNA-Sequenz der Expressionskassette ist unter SEQ ID NO. 5 gezeigt. Sie besteht aus einem BamHI- spaltbaren Linker, gefolgt von einem etwa 400 bp langen Fragment des S. cerevisiae-Glycerinaldehyd-3-phosphatdehydrogenase-(GAPDH)-Promotors, dann der S. cerevisiae-α- Faktor-Leader-Sequenz, die die ersten 85 Aminosäuren des α- Faktorvorläufers codiert (J. Kurjan et al., Cell 30:933-943, 1982), direkt gefolgt von einem chemisch synthetisierten IGF-1-Gen [G.T. Mullenbach, A.L. Choo, M.S. Urdea, P.J. Barr, J.P. Merryweather, A.J. Brake und P. Valenzuela, Fed. Proc. 42, 434 (Abstr.) (1983)], dem etwa 275 bp großen S. cerevisiae-α-Faktor-Terminator (αFT; Kurian et al., Cell 30:933-943, 1982) und einem zweiten BamHI-spaltbaren Linker. Ein Aliquot des Ligierungsgemisches wird in E. coli HB101 transformiert. Die Plasmid-DNA aus 6 unabhängigen Transformanten wird mit SalI sowie mit BamHI analysiert. Ein Clon mit dem Promotor der Expressionskassette, orientiert 3' zu dem SalI-BamHI-Fragment, wird als pDP34A/GAPDH-αFL-IGF1-αFT bezeichnet.

Beispiel 4: Konstruktion von zwei mutierten α-Faktor- Leader-Sequenzen

Ein 1146 bp großes BamHI-Fragment, bestehend aus dem 400 bp großen GAPDH-Promotor, der 255 bp großen αFL-Sequenz, dem 216 bp großen chemisch synthetisierten IGF-1-Gen (IGF-1-Gen und 2 Stoppcodons) und dem 275 bp großen αFT, freigesetzt aus pDP34A/GAPDH-αFL-IGF1-αFT (vgl. Beispiel 3), wird an eine BamHI-gespaltene mit bakterieller alkalischer Phosphatase (Gibco-BRL, Basel Schweiz) behandelte replikative Form (RF) des Phagenvektors M13mp18 (Boehringer Mannheim GmbH, BRD) ligiert. Ein Aliquot des Ligierungsgemisches wird in E. coli JM 101 transformiert. Die Plasmid- DNA aus 6 Plaques wird mit EcoRI, BamHI und BamHI-SalI analysiert. Ein RF-Clon mit den geeigneten Restriktionsfragmenten und mit dem Promotor direkt neben der EcoRI-Spaltstelle des Vektors wird ausgewählt und als mp18/BamHI/GAPDH- αFL-IGF1-αFT bezeichnet. Die ortsspezifische Mutagenese unter Verwendung des Zwei-Primerprotokolls [M.J. Zoller und M. Smith, Meth. in Enzymol. 154, 329-350 (1987)] unter Verwendung des mutagenen Oligodesoxyribonucleotid-Primers mit SEQ ID NO. 6 ergibt eine neue Sequenz des αFL, wobei die Aminosäuren Ala²&sup0; in Asp²&sup0; und Pro²¹ in Leu²¹ ausgetauscht sind. Einzelsträngige DNA, erhalten von einem positiven Clon nach der Hybridisierung, mit dem radioaktiv markierten mutagenen Primer, wird sequenziert [F. Sanger, S. Nicklen und A.R. Coulsen, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463-5467 (1977)], um die gewünschten Mutationen zu bestätigen. Die mutierte αFL-Sequenz wird als αFLMut2 bezeichnet und der so erhaltene Phage wird als mp18/BamHI/GAPDH-αFLMut2-IGF1-αFL bezeichnet.
Die ortsspezifische Mutagenese unter Verwendung der vier mutagenen Oligodesoxyribonucleotid-Primer mit SEQ ID NO. 7, 8, 9 und 10 ergibt eine αFL-Sequenz, in der die folgenden Aminosäuren ausgetauscht sind:
Ala¹³ in Asn¹³, Gln³² in Asn³², Pro³&sup4; in Thr³&sup4;, Gly&sup4;&sup0; in Asn&sup4;&sup0;, Lys&sup7;&sup6; in Asn&sup7;&sup6;, und Glu&sup7;&sup8; in Thr&sup7;&sup8;.
Die DNA-Sequenzierung an eine einzelsträngige DNA- Matrize bestätigt alle Mutationen.
Die mutierte αFL-Sequenz wird als αFLG1G2G3G5 bezeichnet, und der Phage wird als mp18/BamHI/GAPDH-αFLG1G2G3G5-IGF1-αFT bezeichnet.

Beispiel 5: Konstruktion von Hefevektoren, die GAPDH-α FL-IGF1-αFT, GAPDH-αFLMut2-IGF1-αFT und GAPDH-α FLG1G2G3G5-IGF1-αFT enthalten

Um eine einzigartige BglII-Spaltstelle in dem Vektor pDP34A (siehe Beispiel 3) zu erzeugen, wird Plasmid-DNA vollständig mit SacI verdaut, und das 3'-überstehende Ende wird mit T4-DNA-Polymerase beseitigt (New England BioLabs, Beverly, MA, USA). Der linearisierte glattendige Vektor pDP34A wird an BglII-Liner (Boehringer Mannheim GmbH, BRD) ligiert. Nach der Linkerligierung wird die Vektor-DNA mit BglII gespalten und dann religiert. Die Plasmid-DNA von 6 ampicillinresistenten Transformanten, erhalten nach der Transformation eines Aliquots des religierten Gemisches in E. coli HB101, wird mit den Restriktionsenzymen BglII-SalI und BglII-ScaI analysiert. Ein Clon mit den erwarteten Restriktionsfragmenten, was die Schaffung einer BglII-Stelle anstelle der SacI-Stelle bestätigt, wird als pDP34B bezeichnet.
pDP34B wird vollständig mit BamHI gespalten und dann mit bakerieller alkalischer Phosphatase behandelt. Diese linearisierte Vektor-DNA wird zur Subclonierung der 1146 bp großen BamHI-Fragmente, die von pDP34A/GAPDH-αFL-IGF1-αFT (siehe Beispiel 3), mp18/BamHI/GAPDH-αFLMut2-IGF1-αFT (siehe Beispiel 4) und mp18/BamHI/GAPDH-αFLG1G2G3G5-IGF1-αFT (siehe Beispiel 4) erhalten wurden, verwendet. Nach der Ligierung wird ein Aliquot jedes der drei Ligierungsgemische in E. coli HB101 transformiert. Die Plasmid-DNA von vier einzelnen Transformanten aus jeder der drei Ligierungen wird mit SalI analysiert, um die Orientierung der BamHI-Fragmente bezüglich des SalI-BamHI-pBR322-Fragments zu bestimmen. Plasmide, die ein 1147 bp großes Fragment ergeben, wobei die PBR322DNA am 5'-Ende des Promotors liegt, werden ausgewählt und als pDP34B/BamHI/GAPDH-αFL-IGF1-αFT, pDP34B/BamHI/GAPDH- αFLMut2-IGF1-αFT und pDP23B(BamHI/GAPDH-αFLG1G2G3G5-IGF1-αFT bezeichnet.

Beispiel 6: Konstruktion von Hefevektoren, die auf dem gleichen Plasmid Expressionskassetten für KEX2p und für IGF-1 mit dem Wildtyp-α-Faktor-Leader-Sekretionssignal enthalten

Der Hefevektor pDP34B (Beispiel 5) wird vollständig mit BglII gespalten und mit bakterieller alkalischer Phosphatase behandelt. Das Plasmid pKS301b (Beispiel 1) wird mit BamHI gespalten und das etwa 3210 bp große Fragment, das das vollständige KEX2-Gen enthält, wird isoliert und an den linearisierten Vektor pDP34B ligiert. Ein Aliquot des Ligierungsgemisches wird in E. coli HB101 transformiert, und die Plasmid-DNA von vier Transformanten wird durch Restriktionsanalyse mit BamHI und BglII untersucht. Ein Clon mit den erwarteten Restriktionsfragmenten ist als pDP34B/KEX2 bekannt.
pDP34B/KEX2 wird vollständig mit BamHI gespalten und mit bakterieller alkalischer Phosphatase behandelt.
Ein 1146 bp großes BamHI-Fragment, das die IGF-1-Expressionskassette, isoliert aus pDP34A/GAPDH-αFL-IGF1-αFT (Beispiel 3), enthält, wird an den linearisierten Vektor pDP34B/KEX2 ligiert. Nach der Transformation wird die Plasmid-DNA von vier Clonen mit SalI und BamHI-BglII analysiert. Ein Clon mit dem Promotor in der IGF-1-Expressionskassette 3' des pBR322-SalI-BamHI-Fragments und dem KEX2-Gen in der entgegengesetzten Orientierung zu der IGF-1-Kassette wird ausgewählt und als pDP34B/KEX2/GAPDH-αFL-IGF1-αFT bezeichnet.

Beispiel 7: Konstruktion von Hefevektoren, die auf dem gleichen Plasmid Expressionskassetten für KEX2ps und für IGF-1 mit dem Wildtyp-α-Faktor-Leader-Sekretionssignal enthalten

Nach der Spaltung des Plasmids pDPkexp (Beispiel 1) mit SmaI werden BamHI-Linker [Boehringer Mannheim GmbH, BRD] angefügt und anschließend wird mit BamHI und ScaI gespalten, wodurch die Isolierung eines etwa 2560 bp großen BamHI-Fragments möglich wird. Dieses wird an linearisiertes pDP34B ligiert Die Analyse der Plasmid-DNA von Transformanten mit BamHI und BamHI-BglII ergibt einen Clon mit den erwarteten Restriktionsfragmenten, der als pDP34B/kexp bezeichnet wird.
Die IGF-1-Expressionskassette wird in die BamHI-Spaltstelle von pDP34B/kexp wie in Beispiel 6 subcloniert. Die Restriktionsanalyse mit SalI und BamHI-BglII ergibt verschiedene Clone mit dem Promotor der IGF-1-Expressionskassette 3' zu dem pBR322-SalI-BamHI-Fragment und dem löslichen KEX2 in der entgegengesetzten Orientierung zu der IGF-1- Kassette. Ein derartiger Clon wird ausgewählt und als pDP34B/kexp/GAPDH-αFL-IGF1-αFT bezeichnet.

Beispiel 8: Konstruktion von Hefevektoren. die auf dem gleichen Plasmid Expressionskassetten für KEX2psHDEL und für IGF-1 mit dem Wildtyp α-Faktor-Sekretionssignal enthalten

pDPkexpHDEL (siehe Beispiel 2) wird mit BamHI gespalten, und nach der Isolierung des etwa 2580 bp langen Fragments wird es an linearisiertes pDP34B ligiert. Die Plasmid-DNA von E. coli HB101-Transformanten wird mit BamHI- BglII analysiert. Ein Clon mit den erwarteten Restriktionsfragmenten wird als pDP34B/kexpHDEL bezeichnet.
Die IGF-1-Expressionskassette wird in die BamHI-Spaltstelle von pDP34B/kexpHDEL wie in Beispiel 6 subcloniert. Die Plasmid-DNA von ampicillinresistenten E. coli HB101- Transformanten wird mit SalI und BamHI-BglII analysiert. Ein Clon mit dem Promotor der IGF-1-Expressionskassette 3' des pBR322-SalI-BamHI-Fragments und dem löslichen KEX2HDEL in der entgegengesetzten Orientierung zu der IGF-1-Kassette wird als pDP34B/kex2pHDEL/GAPDH-αFL-IGF1-αFT bezeichnet.

Beispiel 9: Konstruktion der Plasmide pDP34B/KEX2/GAPDH-αFLMut2-IGF1-αFT, pDP34B/kexp/GAPDH-αFLMut2-IGF1-αFT, pDP34B/kexpHDEL/GAPDH-αFLMut2-IGF1-αFT, pDP34B/KEX2/GAPDH-αFLG1G2G3G5-IGF1-αFT, pDP34B/kexp/GAPDH-αFLG1G2G3G5-IGF1-αFT und pDP34B/kexpHDEL/GAPDH-αFLG1G2G3G5-IGF1-αFT

Diese Plasmide werden ähnlich den in den Beispielen 6, 7 und 8 ausführlich beschriebenen Verfahren konstruiert. Die Expressionskassetten, BamHI-Fragmente von GAPDH-αFLMut2- IGF1-αFT und GAPDH-αFLG1G2G3G5, werden aus pDP34B/BamHI/GAPDH-αFLMut2-IGF1-αFT (siehe Beispiel 5 und pDP34B/BamHI/GAPDH-αFLG1G2G3G5-IGF1-αFT (siehe Beispiel 5) isoliert und in Hefevektoren, die bereits KEX2- oder lösliche KEX2HDEL-Gene enthalten, subcloniert.

Beispiel 10: Konstruktion einer kex2&supmin;-Mutante des Hefestamms AB110

pKS301b (Beispiel 1) wird an der einzigen BglII-Spaltstelle in dem KEX2-Gen gespalten. Ein etwa 2930 bp großes BglII-Fragment aus dem Plasmid YEp13 [J. Broach et al., Gene 8, 121-122 (1979)] wird an den linearisierten Vektor pKS301b ligiert. Ein Aliquot des Ligierungsgemisches wird in E. coli HB101 transformiert. Plasmid-DNA aus 12 ampicillinresistenten Transformanten wird mit HindIII-EcoRI analysiert. Ein Clon mit den erwarteten Fragmenten wird als pUC19/kex2::LEU2 bezeichnet. Dieses Plasmid besitzt die codierende Sequenz des KEX2-Gens, unterbrochen durch das funktionelle LEU2-Gen.
pUC19/kex2::LEU2 wird mit BamHI unter Freisetzung des linearen kex2::LEU2-Fragments gespalten. Der Hef estamm AB110 wird zur Transformation (Beispiel 11) mit der linearisierten DNA verwendet. Die Transformanten werden auf Leucinprototrophie selektioniert. Genomische DNA von vier LEU²&spplus;-Transformanten wird durch EcoRI-HindIII gespalten. Um zu bestätigen, daß die genomische Kopie von KEX2 in der Tat durch das LEU2-Gen unterbrochen ist, wird eine Southern-Blot-Analyse durchgeführt. Ein Hefetransformant mit den erwarteten Restriktionsfragmenten wird als Ab110kex2&supmin; bezeichnet.

Beispiel 11: Transformation der S. cerevisiae-Stämme AB110 und AB110 kex2&supmin;.

Die Hefetransformation wird wie von Klebe et al. [Gene 25, 333-341 (1983)] beschrieben, durchgeführt.
S. cerevisiae AB110 wird mit den nachstehend zusammengestellten Plasmiden transformiert (siehe Beispiel 12) und die Transformanten werden, wie angegeben, bezeichnet:
Drei Kolonien jedes der Transformanten werden ausgewählt und mit einer zusätzlichen Nummer bezeichnet (d.h. yIG 1-1, yIG 1-2, yIG 1-3).
S. cerevisiae AB110 kex2&supmin; (siehe Beispiel 10) wird mit den nachstehend zusammengestellten Plasmiden transformiert, und die Transformanten werden, wie angegeben, bezeichnet:
Drei Kolonien jedes der Transformanten werden ausgewählt und mit einer zusätzlichen Nummer bezeichnet (d.h. yIG 6-1, yIG 6-2, yIG 6-3).

Beispiel 12: Wachstum von Hefetransformanten in Schüttelkolbenkulturen und quantitative/qualitative Bestimmung des IGF-1-Proteins durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) und Western Blots

S. cerevisiae AB110 (Matα, his 4-580, leu2, ura 3-52, pcp 4-3, [cirº]) ist an anderer Stelle beschrieben [P.J. Barr et al., J. Biol. Chem. 263, 16471-16478 (1988)]. Ein reiches Medium, das 6,5 g/l Hefeextrakt, 4,5 g/l Casaminosäuren und 30 g/l Glucose enthält, wird als nichtselektives Vorkulturmedium verwendet. IGF-1 wird in der Hauptkultur, die ein uracilselektives Medium mit 1,7 g/l Hefestickstoffbase, supplementiert mit 30 g/l Glucose, 8,5 g/l Casaminosäuren und den benötigten Aminosäuren, ist, exprimiert. Die Hefetransformanten (siehe Beispiel 11) werden bei 30ºC auf einem rotierenden Schüttler mit 180 UpM 24 h lang in einem 20 ml Volumen des Vorkulturmediums und für 72 h in einem 80 ml Volumen der Hauptkultur gezüchtet.
Ein Aliquot der Zellen wird geerntet, und das sezernierte aktive monomere IGF-1-Molekül in dem Kulturmedium wird mittels HPLC und ELISA gemessen [K. Steube et al., Eur. J. Biochem. 198, 651-657 (1981)].
Aliquote der gewachsenen Kulturen werden 2 min lang bei 13.000 x g zentrifugiert. Die Zellen werden in 3 x Laemmli-Puffer [6 % SDS, 0,15 M Tris pH 6,8, 6 mM EDTA, 30 % Glycerin, 0,05 % Bromphenol-Blau] resuspendiert und durch heftiges Schütteln mit Glaskügelchen lysiert, und anschließend werden die Proben 3 min lang in einem siedenden Wasserbad inkubiert. Die Proteine aus dem Zellysat werden mittels SDS- PAGE unter Verwendung eines 15%igen Polyacrylamidgels [U.K. Laemmli, Nature 227, 680-685 (1970)] getrennt. Die Proteine werden auf Nitrocellulosefiltern mit Hilfe eines halbtrockenen Blotters [Sartorius GmbH, BRD] elektrisch geblottet. Die überführten Proteine werden mit Anti-IGF-1- Antikörpern mit dem dem Bio-Rad-Immun-Assay-Kit beigefügten Verfahren detektiert [Bio-Rad, Richmond, CA, USA].

Beispiel 13: Vergleich des/der sezernierten und intrazellulären IGF-1-Proteins/Proteine mittels HPLC und Western Blot aus den Transformanten yIG1, y196 und yIG7

Sezernierter IGF-1 aus Transformanten des Plasmids pDP34B/GAPDH-αFL-IGF1-αFT (siehe Beispiel 5) in den Hefestämmen AB110 (Transformanten yIG1-1, yIG6-2 und yIG6-3) und AB101kex2&supmin; (Transformanten yIG6-1, yIG6-2 und yIG6-3) werden mittels HPLC verglichen, und die Ergebnisse sind in Tabelle 1 dargestellt. Tabelle 1
Die Western-Blot-Analyse des intrazellulären Proteins aus den Transformanten yIG6-1, yIG6-2 und yIG6-3 zeigt IGF-1, wenn das Processing des αFL nicht eingetreten war.
Die Ergebnisse implizieren, daß kein reifer IGF-1 in die Medien aus den Hefestämmen, denen eine funktionelle Kopie von KEX2 auf dem Chromosom fehlt, sezerniert wird. Wenn eine funktionelle Kopie von KEX2 auf einem Plasmid, z.B. pDP34/KEX2/GAPDH-αFL-IGF1-αFT (siehe Beispiel 6), in den Hefestamm AB110kex2&supmin; (Transformanten yIG7-1, yIG7-2 und yIG7-3) erneut eingeführt wird, wird erneut sezernierter IGF-1 beobachtet.

Beispiel 14: Vergleich des sezernierter IGF-1-Proteins mit HPLC und ELISA aus den Transformanten yIG1, yIG2 und yIG3

Mit HPLC wird die Menge an aktivem monomerem IGF-1 im Überstand gemessen. Der ELISA bestimmt die Gesamtmenge an IGF-1-artigen Teilchen in dem Überstand. Neben den Monomeren bestimmt der ELISA die Mengen an intramolekular über Disulfidbrücken verknüpften Dimeren und Multimeren, falsch gefaltetem IGF-1, oxidiertem IGF-1 und anderen Molekülen. Die Tabelle 3 zeigt einen Vergleich der HPLC-Titer und der ELISA-Werte von sezerniertem IGF-1 aus Transformanten, die gleichzeitig IGF-1 und KEX2p (yIG1 und yIG2) exprimieren und Transformanten, die gleichzeitig IGF-1 und löslichen KEX2HDELp (yIG3) exprimieren. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 dargestellt. Tabelle 2
Diese Ergebnisse sind die Durchschnittswerte, die aus 3 individuellen Stämmen aus jeder der drei Transformationen erhalten wurden. Die begleitende Expression von löslichem KEX2HDEL zeigt, daß die Bildung von Molekülen neben den Monomeren drastisch reduziert wurde.

Beispiel 15: Vergleich von sezerniertem IGF-1-Protein aus den Transformanten yIG1, yIG4, yIG8, yIG9 und yIG10 mittels HPLC-Analyse

Die mutierte Leader-Sequenz αFLMut2 erlaubt keine Sekretion von IGF-1 in dem Stamm AB110. Glycosylierte, nichtprozessierte αFL-IGF-1-Moleküle häufen sich im Inneren der Zelle an. Aus der Natur der Glycosylierung (nur Kernglycosylierung beobachtet) ist offensichtlich, daß diese Moleküle nicht in das endoplasmatische Retikulum infolge von Mutationen in der αFL-Sequenz vorgedrungen sind. Die gleichzeitige Expression von IGF-1 unter Verwendung des αFLMut2- Sekretionssignals zusammen mit den drei verschiedenen Formen des KEX2-Enzyms, KEX2, lösliches KEX2 und lösliches KEX2HDEL, in A8110-kex2&supmin; zeigt, daß das lösliche KEX2HDEL- Protein sich von den anderen der beiden unterscheidet.
Die Western-Blot-Analyse von intrazellulären IGF-1- artigen Proteinen aus den Transformanten yIG1, yIG4, yIG8, yIG9 und yIG10 zeigt, daß nur lösliches KEX2HDEL-Protein reifen IGF-1 aus dem intrazellulären Pool freisetzt.

Beispiel 16: Analvse von sezerniertem IGF-1-Protein aus den Transformanten yIG1, yIG5, yIG11, yIG12 und yIG13 mittels HPLC-Analyse

Die mutierte Leader-Sequenz αFLG1G2G3G5 erlaubt eine schlechte Sekretion von IGF-1 in dem Stamm AB110. Nichtglycosylierte, nichtprozessierte αFL-IGF-1-Moleküle häufen sich im Inneren der Zelle an. Es scheint, daß diesen Moleküle die Signalsequenz von αFL fehlt, was bezeichnet, daß die Translokation in das ER eingetreten war. Jedoch verursachte der Eintritt in das ER keine Glycosylierung dieser drei möglichen Sequenzabschnitte (Asn-X-Ser/Thr) in der Proregion von αFL. Die gleichzeitige Expression von IGF-1 mit drei verschiedenen Formen des KEX2-Enzyms (KEX2, lösliches KEX2 und lösliches KEX2HDEL) in AB110-kex2&supmin; zeigt, daß das lösliche KEX2HDEL-Protein, das in yIG13 exprimiert wird, dahingehend einzigartig ist, daß es die Freisetzung von mehr reifem IGF-1 aus dem intrazellulären Pool erlaubt.

Beispiel 17: Zeitverlaufsexperiment zur Untersuchung der Sekretionskinetik von monomerem IGF-1 aus den Hefetransformanten yIG1, yIG5 und yIG13

Die Freisetzung der Proregion von αFL aus IGF-1 in dem ER statt im Golgi-Apparat kann die Gesamtmenge von monomerem IGF-1, der zu verschiedenen Zeitpunkten sezerniert wurde, beeinflussen. Es ist wahrscheinlich, daß die Proregion eine Rolle bei der Erleichterung des Exports des nichtprozessierten IGF-1-Proteins aus dem ER in den Golgi- Apparat besitzt. Um diese Möglichkeit anzusprechen, wurden drei individuelle Stämme aus yIG1, yIG5 und yIG13 in Schüttelkolben gezüchtet, und die Sekretion von monomerem IGF-1 wurde mittels HPLC unter Entnahme von Aliquoten von Überständen aus den Hefekulturen nach 40 h, 48 h, 60 h und 72 h gemessen. Die Durchschnittswerte, die aus den drei individuellen Stämmen (z.B. yIG1-1, yIG1-2, yIG1-3 und yIG5-1, yIG5-2, yIG5-3 und yIG13-1, yIG13-2, yIG13-3), die zu jeder der drei Transformationen yIG1, yIG5 und yIG13 gehören, erhalten wurden, sind in Tabelle 3 gezeigt. Tabelle 3

Beispiel 18: Analyse von sezerniertem IGF-1 mittels Western-Blots zeigt eine deutliche Abnahme der dimeren Formen unter Verwendung des löslichen KEX2HDEL-Proteins

Überstände aus yIG1 und yIG13 (Beispiel 17) wurde mit Western-Blots unter nichtreduzierenden und reduzierenden Bedingungen analysiert.
Zu den Zeitpunkten 40 h, 48 h und 60 h wird die Bildung von intermolekular disulfidverknüpften IGF-1-Molekülen bei Verwendung von löslichem KEX2HDEL-Protein nicht beobachtet. Nur bei 72 h sieht man eine vernachlässigbare Menge (auf dem Blot kaum sichtbar) des dimeren IGF-1. Jedoch zeigen die KEX2p-exprimierenden Stämme Dimere zu jedem Zeitpunkt. Diese Dimere kunnen durch Dithiotreit (DTT) reduziert werden, was bedeutet, daß die Dimere in der Tat disulfidverknüpft sind.

Hinterlegte Mikroorganismen

Die folgenden Mikroorganismenstämme wurden gemäß dem Budapester Vertrag bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen (DSM), Mascheroder Weg 1b, D-3300 Braunschweig hinterlegt (die Hinterlegungsdaten und die Hinterlegungsnummern sind angegeben):
Escherichia coli JM109/pDP34: 14. März 1988, DSM 4473.
Escherichia coli JM101/pKS301b: 25. Juni 1990, DSM 6028.

Claims

1. Verfahren zur Produktion eines heterologen Proteins in einer eukaryotischen Wirtszelle, umfassend die Transformation der Wirtszelle mit einer Nucleinsäure, die sowohl eine Proform des Proteins, die eine Prosequenz umfaßt, als auch eine dibasische Prozessierungs-Endoprotease mit der Fähigkeit zur Entfernung der Prosequenz codiert, und an ein endoplasmatisches Retikulum-Retentionssignal fusioniert ist; und Züchtung der Wirtszelle unter Produktion des heterologen Proteins.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das heterologe Protein und die dibasische Prozessierungs-Endoprotease von separaten Nucleinsäuren codiert werden.

3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei eine Wirtszelle permanent mit einer Nucleinsäure, die die dibasische Prozessierungs-Endoprotease codiert, transformiert ist und anschließend weiter mit einer Nucleinsäurel die das heterologe Protein codiert, transformiert wird.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Wirtszelle eine Hefezelle ist, und die dibasische Prozessierungs-Endoprotease aus der Gruppe, bestehend aus KEX2 und YAP3, ausgewählt ist.

5. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Prosequenz die Hefe-α-Faktor-Prosequenz ist.

6. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei das heterologe Protein ein biologisch aktives Protein ist.

7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei das biologische aktive Protein ein insulinverwandtes Protein ist.

8. Rekombinantes DNA-Molekül, umfassend eine Expressionskassette, die eine dibasische Prozessierungs-Endoprotease in Fusion an ein endoplasmatisches Retikulum-Retentionssignal codiert.

9. Rekombinantes DNA-Molekül nach Anspruch 8, wobei das dibasische Protein Endoprotease löslich ist.

10. Rekombinantes DNA-Molekül nach Anspruch 8, wobei die dibasische Prozessierungs-Endoprotease aus der Gruppe, bestehend aus KEX2 mit der C-terminalen Extension HDEL, löslicher KEX2 mit der in SEQ ID NO. 1 gezeigten Aminosäuresequenz und der C-terminalen Extension HDEL und YAP3 mit der C-terminalen Extension HDEL, ausgewählt ist.

11. Hybridvektor, umfassend ein rekombinantes DNA-Molekül nach einem der Ansprüche 8 bis 10.

12. Wirtszelle, transformiert mit einem Vektor nach Anspruch 11.

13. Wirtszelle nach Anspruch 12, die stabil transformiert ist.