DE69303941T2

DE69303941T2 - Verfahren zur Herstellung von hochreinem Fibrinogen

Info

Publication number: DE69303941T2
Application number: DE69303941T
Authority: DE
Inventors: Bernard Dazey; Sylvia Enfedaque-Morer; Mohamed Hamsany; Gerard Vezon
Original assignee: AQUITAINE DEV TRANSF SANGUINE
Current assignee: AQUITAINE DEV TRANSF SANGUINE
Priority date: 1992-02-04
Filing date: 1993-02-02
Publication date: 1997-03-27
Anticipated expiration: 2013-02-03
Also published as: EP0555135A1; EP0555135B1; ATE141284T1; FR2686883B1; FR2686883A1; DE69303941D1; GR930300095T1; GR3021419T3; DK0555135T3; ES2049701T3; ES2049701T1; DE555135T1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft im wesentlichen ein Verfahren zur Herstellung von Fibrinogen mit sehr hoher Reinheit, so erhaltenes Fibrinogen mit sehr hoher Reinheit sowie eine dieses enthaltende pharmazeutische Zusammensetzung.
Es ist bekannt, daß Fibrinogen-Indikationen zur Prävention von Blutungen bei Kranken angezeigt sind, welche an einem quantitativen oder qualitativen Fibrinogenmangel, an Leberzellen-Insuffizienz, an Fibrinolyse und an disseminierter intravasaler Koagulopathie (DIC) leiden.
Im Stand der Technik sind bereits verschiedene Verfahren zur Herstellung von Fibrinogen durch Ausfällung mit Glycin, wie in der EP-A-0 383 234 beschrieben, oder durch Leiten über eine Sepharose-Heparinsäule, wie in der EP-A-0 359 593 = WO-A-89 1265 beschrieben, oder aber nach der COHN et al.-Methode (J. Am. Chem. Soc. (1946), 68, Seite 459) bekannt.
Diese Fibrinogenkonzentrate entsprechen insofern den Normen der Europäischen Pharmakopöe, als sie einen Reinheitsgehalt von mindestens 60% aufweisen, was aber einen Nachteil beim neuerlichen in Lösungbringen des lyophilisierten Produkts aufgrund einer relativ langen Rekonstitutionszeit, die bis zu 20 min reichen kann, mit sich bringt.
Weiters hat die Anmelderin im Dokument FR-A-2 644 064 = EP-A-0 383 645 ein Verfahren zur Herstellung von antihämophilem Faktor (Faktor VIIIc) mit einer sehr hohen Reinheit beschrieben, mit welchem es möglich ist, als nicht zurückgehaltenen Nebenbestandteil Fibrinogen zu erhalten, auf das nicht näher eingegangen wird.
Das Dokument EP-A-0 468 181 beschreibt noch ein Verfahren zur Reinigung von Faktor VIII, bei welchem einfach angegeben ist, daß das verbleibende Präzipität, welches von dem nach Zugabe von Aluminiumhydroxid und Polyethylenglykol in Kälte gelösten Kryopräzipitat stammt, als Ausgangssubstanz für die Reinigung von anderen Proteinen, einschließlich Fibrinogen und Fibrinkleber dienen kann (Seite 3, Zeilen 32-33). Dieses Dokument enthält keinerlei Beschreibung oder Vorschlag, wie Fibrinogen mit hoher Reinheit erhalten werden könnte. Übrigens wird bei der nachstehend beschriebenen Erfindung das Präzipitat mit Aluminiumhydroxid nicht rückgewonnen.
Hauptziel der vorliegenden Erfindung ist die Lösung des neuen technischen Problems, welches darin besteht, ein Verfahren zur Herstellung von Fibrinogen mit einer sehr hohen Reinheit und mit einer raschen Rekonstitutionsgeschwindigkeit des Produkts im lyophilisierten Zustand, nämlich vorzugsweise unter 10 min und noch bevorzugter im Bereich von 5 min, zu schaffen.
Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Lösung dieses Problems mittels eines einfachen Herstellungsverfahrens, welches eine hervorragende Reproduzierbarkeit sowie die Bearbeitung bedeutender Mengen in großtechnischem Maßstab bei gleichzeitig sehr geringem Aufwand gestattet. Vorzugsweise soll diese Lösung auch eine Virusinaktivierung ermöglichen.
Die vorliegende Erfindung gestattet die Lösung dieser technischen Probleme gleichzeitig auf eine einfache und kostengünstige Weise, die in großtechnischem Maßstab anwendbar ist und dabei die Bearbeitung großer Mengen ohne Volumenbeschränkung bei geringem Kostenaufwand ermöglicht.
So schafft die vorliegende Erfindung gemäß einem ersten Aspekt ein Verfahren zur Herstellung von Fibrinogen mit einer sehr hohen Reinheit, weiches dadurch gekennzeichnet ist, daß es, ausgehend von einem Kryopräzipitat von Blutplasma tierischen oder menschlichen Ursprungs in wässeriger Lösung, die Behandlung dieser Lösung, um ihr eine Ionenstärke zu verleihen, die gleich jener einer Pufferlösung mit der folgenden Zusammensetzung:
NaCl...120 mM
Tris... 20 mM
pH... 8,8
ist; das Aufbringen dieser Lösung mit geregelter Ionenstärke auf eine Anionenaustauschersäule, die ein Anionenaustauscher-Gel, beispielsweise in Form von Kügelchen, auf Basis vernetzter Agarose mit quaternären Amingruppen, insbesondere am Ende eines kurzen Spacer-Arms, beispielsweise vom C&sub1;-C&sub6;-Alkylen-Typ, verbunden mit den Agarosekügelchen, insbesondere etwa 6 % Agarose, enthält; die Durchführung einer Elution mit einer ersten Elutionslösung derselben Ionenstärke: NaCl 120 mM, Tris 20 mM, pH 8,8, wobei diese Bedingungen eine zumindest selektive Adsorption des Fibrinogens auf der Säule ermöglichen; die anschließende Durchführung einer selektiven Desorption des Fibrinogens durch Behandlung mit einer für Fibrinogen selektiven Elutions-Pufferlösung höherer Ionenstärke mit der folgenden Zusammensetzung:
NaCl...200 mM
Tris... 20 mM
pH... 8,8
und das Sammeln des so erhaltenen Eluats, welches Fibrinogen in hoch gereinigter Form enthält, umfaßt.
Es wird beobachtet, daß dieses Eluat mit hoher Konzentration an Fibrinogen mindestens 90 % Fibrinogen enthält.
Gemäß einer vorteilhaften Ausführungsvariante des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die Ionenstärke des gereinigten, Fibrinogen enthaltenden Eluats durch eine Diafiltration, vorzugsweise mit vorangehender Konzentration, reduziert. Diese Diafiltration kann vorteilhafterweise gegen eine Konservierungs-Pufferlösung, die eine intravenöse Injektion ermöglicht, durchgeführt werden. Diese Lösung kann vorzugsweise die folgende Zusammensetzung aufweisen:
NaCl ...100 mM
Tris ... 20 mM
L-Arginin ... 17mm
L-Lysin-HCl ... 20 mM
pH ... 7
Das so diafiltrierte und konzentrierte Eluat kann danach lyophilisiert werden, wodurch Fibrinogen in lyophilisierter Form mit sehr hoher Reinheit, zumindest gleich 90 %, erhalten wird, welches unverzüglich als Wirkstoff einer pharmazeutischen Zusammensetzung, vorteilhaft bei den zuvor genannten Indikationen, wie der Prävention von Blutungen bei Kranken, die an einem quantitativen oder qualitativen Fibrinogenmangel, an Leberzellen- Insuffizienz, an Fibrinolyse oder an disseminierter intravasaler Koagulopathie (DLC) leiden, einsetzbar ist.
Gemäß einer besonders vorteilhaften Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens verwendet man als Rohfibrinogen-Quelle ein aus Blutplasma tierischen oder menschlichen Ursprungs, vorzugsweise menschlichen Ursprungs, extrahiertes Kryopräzipitat, welches in mit Wasser versetztem Heparin gelöst wird.
Gemäß einer Ausführungsvariante wird die so erhaltene rohe Lösung durch Anwendung des im älteren Dokument der Hinterlegenden FR-A-2 644 064, welches hierin durch Bezugnahme inkorporiert ist, beschriebenen Verfahrens von Faktor VIIIc befreit.
Gemäß einer anderen Ausführungsvariante wird vor der Abtrennung des Faktors VIIIc eine Virusinaktivierung vorgenommen, für welchen Zweck zuerst die rohe Lösung mit Aluminiumhydroxid (4 %ige Lösung) in einem Volumenanteil von 10 bis 15 %, bezogen auf das Gesamtvolumen der zu behandelnden Ausgangslösung, behandelt werden kann. Danach wird eine Zentrifugation zur Abtrennung des Aluminiumhydroxids vorgenommen, welches die Vitamin K-abhängigen Faktoren ausgeschleust hat. Danach kann man die Lösung mit einer Mischung von Inaktivatoren auf Lösungsmittel/Detergens-Basis inaktivieren, wie im Dokument EP-A-0 131 740 oder US-A-4 540 573 beschrieben.
Gemäß einer weiteren vorteilhaften Ausführungsvariante wird vor der Durchführung des Schritts der Abtrennung des Faktors VIIc, vorzugsweise durch Adsorption auf einem Ionenaustauscher-Gel vom anionischen Typ in Form von Kügelchen aus vernetzter Agarose mit quaternären Amingruppen, insbesondere am Ende eines kurzen Spacer-Arms, beispielsweise vom C&sub1;-C&sub6;-Alkylen-Typ, verbunden mit den Agarosekügelchen, wie beispielsweise im Handel unter der Bezeichnung Q-Sepharose Fast Flow bei Pharmacia erhältlich, wie in der FR-A-2 644 064 beschrieben, eine Diafiltration der rohen Lösung durchgeführt, welche mit Hilfe einer mit der zur Fixierung des Faktors VIIIc eingesetzten Pufferlösung identischen Lösung, die insbesondere im Anspruch 11 der FR-A-2 644 064 beschrieben ist, virusinaktiviert wurde.
Diese Elutions-Pufferlösung weist die folgende Zusammensetzung auf:
NaCl...250 mM
Tris... 20 mM
CaCl&sub2;,2H&sub2;O ... 10 mM
pH ... 6,6
So enthält das die nicht-adsorbierte Fraktion enthaltende Eluat, das frei von Faktor VIIIc ist, welcher selektiv am Gel adsorbiert wurde, Fibrinogen, das anschließend mit dem zuvor beschriebenen, erfindungsgemäßen Verfahren behandelt wird.
Gemäß einer vorteilhaften Ausführungsvariante ist das Gel, das zur selektiven Adsorption des Faktors VIIIc oder zur Reinigung von Fibrinogen verwendet wird, das gleiche, mit welchem das großtechnische Verfahren zur Reinigung von Fibrinogen vereinfacht wird.
Gemäß einer anderen Ausführungsvariante, die die Konservierung der Fibrinogenlösung mit sehr hoher Reinheit gestattet, wird eine Sterilfiltration auf einem Sterilfilter mit einer Porengröße von einem Durchmesser von 0,22 µm durchgeführt und dann die sterilisierte Lösung in vorzugsweise für eine Lyophilisierung geeignete Fläschchen gefüllt. Vorteilhafterweise wird ein Volumen an Fibrinogenlösung mit sehr hoher Reinheit derart eingefüllt, daß ein lyophilisertes Produkt mit einem Gewicht von etwa 1,5 bis 2 g pro Fläschchen erhalten wird. Dieses Lyophilisat kann danach für eine intravenöse Injektion in 100 ml PPI-Wasser aufgenommen werden.
Weitere Ziele, Merkmale und Vorteile der Erfindung gehen klar aus der folgenden erläuternden Beschreibung unter Bezugnahme auf ein derzeit bevorzugtes Ausführungsbeispiel hervor, welches einfach zur Illustration angegeben ist und den Schutzumfang der Erfindung in keiner Weise einschränken soll. In diesem Beispiel verstehen sich, wenn nicht anders angegeben, die Prozentangaben als Gewichtsprozent.

Beispiel der Erfindung

9 kg von 900 l menschlichem Blutplasma stammendes Kryopräzipitat werden in einem 3,2fachen Volumen von osmotisiertem Wasser mit 3 IE Heparin pro ml Wasser bei Labortemperatur unter Rühren 2 h lang gelöst.
Nach der Messung des Endvolumens wird zu dieser Lösung 4 %iges Aluminiumhydroxid in wässeriger Lösung in einer Menge von 15 Vol.%, bezogen auf das Gesamtvolumen dieser Lösung, gegeben. Man läßt unter Rühren 5 min stehen, dann wird zur Abtrennung des Aluminiumhydroxids von der Lösung mit 6000 g zentrifugiert.
Danach nimmt man eine Diafiltration der rohen Lösung, welche Faktor VIIIc sowie Fibrinogen enthält, gegen eine Pufferlösung vor, die danach zur Equilibrierung und Eluierung des zur selektiven Adsorption von Faktor VIIIc eingesetzten Q-Sepharose Fast Flow -Gels verwendet wird und folgende Zusammensetzung hat:
NaCl...250 mM
Tris... 20 mM
CaCl&sub2; ... 10 mM
pH ... 6,6
Die zur Diafiltration dienende Membran hat eine Durchlaßschwelle von 100 kD (kilo- Dalton).
Danach erfolgt eine Konzentration der rohen Lösung von Faktor VIIIc und Fibrinogen auf 30 l. Es wird überprüft, daß diese konzentrierte Lösung im wesentlichen dieselbe Ionenstärke wie die zur Adsorption des Faktors VIIIc am Gel dienende Pufferlösung aufweist. Die Gelmenge beträgt beispielsweise 100 l. Nach der Elution des Gels mit der Pufferlösung ist der Faktor VIIIc selektiv adsorbiert, während die nicht zurückgehaltene Proteinfraktion u.a. Fibrinogen in einer Konzentration von 1,5 bis 2 g/l sowie die Inaktivatoren enthält und ein Volumen von 150 bis 200 l aufweist.
Fibrinogen wird mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens folgendermaßen selektiv abgetrennt: man nimmt zuerst eine Konzentration dieser Lösung auf 30 l mit einer Membran mit einer Durchlaßschwelle von 100 kD und dann eine Diafiltration gegen eine Pufferlösung vor, die gekennzeichnet ist durch:
NaCl...120 mM
Tris... 20 mM
pH ... 8,8
30 l Q-Sepharose Fast Flow -Gel (PHARMACIA), welches zuvor mit derselben Pufferlösung equilibriert wurde, dienen nun zur Fixierung u.a. des Fibrinogens, halten aber Albumin und die Inaktivatoren nicht zurück. Wenn die optische Dichte des Filtrats zurück zur Basislinie gefallen ist, wird das Gel mit dem gleichen Puffer eluiert, nachdem seine Ionenstärke durch Zugabe von NaCl auf eine Endkonzentration von 200 mM erhöht worden ist. Dieser für Fibrinogen selektive Elutionspuffer hat also folgende Zusammensetzung:
NaCl...200 mM
Tris... 20 mM
pH ... 8,8
Die Fraktion von Fibrinogen, welches in einer Ausbeute von 60 %, bezogen auf die Menge an injiziertem Fibrinogen, gesammelt wurde, wird danach konzentriert und gegen einen Puffer diafiltriert, welcher die folgende Zusammensetzung aufweist:
NaCl ... 100 mM
Tris ... 20 mM
L-Arginin ... 17 mM
L-Lysin-HCl ... 20 mM
pH ... 7
Die Konzentration an Fibrinogen beträgt nunmehr etwa 30 g/l; zuletzt erfolgt eine Sterilfiltration der Fibrinogenlösung über eine Sterilisationsmembran mit einem Durchmesser von 0,22 µm. Das konzentrierte Produkt wird zu 65 ml in Fläschchen verteilt und dann lyophilisiert.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung von Fibrinogen mit sehr hoher Reinheit, dadurch gekennzeichnet, daß es, ausgehend von einem Kryopräzipitat von Blutplasma tierischen oder menschlichen Ursprungs in wässeriger Lösung und der Behandlung dieser Lösung, um ihr eine Ionenstärke zu verleihen, die gleich jener einer Pufferlösung mit der folgenden Zusammensetzung:

NaCl...120 mM

Tris...20 mM

pH...8,8

ist, das Aufbringen dieser Lösung mit geregelter Ionenstärke auf eine Anionenaustauschersäule, die ein Anionenaustauscher-Gel, beispielsweise in Form von Kügelchen, auf Basis vernetzter Agarose mit quaternären Amingruppen, insbesondere am Ende eines kurzen Zwischenstücks, beispielsweise vom C&sub1;-C&sub6;-Alkylen-Typ, verbunden mit den Agarosekügelchen, insbesondere etwa 6 % Agarose, enthält; das Durchführen einer Elution mit einer ersten Elutionslösung der gleichen Ionenstärke: NaCl 120 mM, Tris 20 mM, pH 8,8; wobei diese Bedingungen eine zumindest selektive Adsorption des Fibrinogens auf der Säule ermöglichen; das anschließende Durchführen der selektiven Desorption des Fibrinogens durch Behandlung mit einer für Fibrinogen selektiven Elutions-Pufferlösung mit höherer Ionenstärke, die die folgende Zusammensetzung aufweist:

NaCl...200 mM

Tris...20 mM

pH...8,8;

und das Sammeln des so erhaltenen Eluats, das Fibrinogen in hoch gereinigter Form enthält, umfaßt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Ionenstärke des gereinigten, Fibrinogen enthaltenden Eluats durch eine Diafiltration, der vorzugsweise eine Konzentration vorausgeht, reduziert wird; wobei diese Diafiltration vorteilhaft gegen eine Konservierungs-Pufferlösung, die eine intravenöse Injektion ermöglicht, durchgeführt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Konservierungs-Pufferlösung die folgende Zusammensetzung aufweist:

NaCl...100 mM

Tris...20 mM

L-Arginin...17 mM

L-Lysin-HCl...20 mM

pH...7.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß das diafiltrierte Eluat konzentriert und gefriergetrocknet wird, wobei so Fibrinogen in gefriergetrockneter Form mit sehr hoher Reinheit, zumindest gleich 90 %, erhalten wird, das unverzüglich als aktiver Bestandteil einer pharmazeutischen Zusammensetzung verwendbar ist.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß als Quelle von rohem Fibrinogen ein aus Blutplasma tierischen oder menschlichen Ursprungs, vorzugsweise menschlichen Ursprungs, extrahiertes Kryopräzipitat verwendet wird, das in Wasser, dem Heparin zugesetzt wurde, gelöst wird.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die wässerige Lösung des Kryopräzipitats einem Schritt viraler Inaktivierung, beispielsweise durch die Verwendung einer Mischung von TnBP/TWEEN, unterworfen wurde, wobei das relative Verhältnis von 0,3 % TnBP zu 1 % TWEEN in bezug auf das Volumen der zu inaktivierenden Lösung eingehalten wird.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß der Faktor VIIIc von der erhaltenen rohen Lösung durch Adsorption auf einem Anionenaustauscher-Gel vom anionischen Typ in Form vernetzter Agarosekügelchen mit quaternären Amingruppen, insbesondere am Ende eines kurzen Zwischenstücks, beispielsweise vom C&sub1;-C&sub6;-Alkylen-Typ, verbunden mit den Agarosekügelchen, entfernt wird.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß als Elutions-Pufferlösung eine Lösung mit der folgenden Zusammensetzung verwendet wird:

NaCl...250 mM

Tris...20 mM

CaCl&sub2;,2H&sub2;O...10 mM

pH...6,6.

9. Verfahren nach Anspruch 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, daß das Eluat, das die nicht-adsorbierte Fraktion enthält, die frei vom Faktor VIIIc ist, der selektiv am Gel adsorbiert wurde, ein Fibrinogen enthält, das anschließend nach einem der vorhergehenden Ansprüche behandelt wird.

10. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das zur selektiven Adsorption des Faktors VIIIc oder zur Reinigung des Fibrinogens verwendete Gel das gleiche ist.