ES2139227T5 - Concentrado de fibrinógeno obtenido de plasma sanguíneo, procedimiento e instalación para su preparación. - Google Patents
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Abstract
LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A UN CONCENTRADO DE FIBRINOGENO CARACTERIZADO PORQUE ESTA DESPROVISTO DE CONTAMINANTES VIRALES Y PORQUE SU PUREZA ES SUPERIOR A 95%. LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE TAMBIEN AL PROCEDIMIENTO DE OBTENCION DE DICHO CONCENTRADO DE FIBRINOGENO.
Description
La presente invención se refiere a un procedimiento de preparación de un concentrado de fibrinógeno obtenido del plasma sanguíneo humano o animal.
La presente invención se refiere también a la composición farmacéutica y/o cosmética que comprende dicho concentrado de fibrinógeno.
El fibrinógeno es una proteína plasmática de una importancia capital en el proceso de coagulación, y sus campos de aplicación farmacéutica ó cosmética recubren diferentes campos (cicatrización de heridas, agente de coagulación, constituyente de colas biológicas, fibrinogenemia, inhibición de consecuencias operatorias y postoperatorias).
La puesta a disposición de proteínas de la sangre, tales como el fibrinógeno, necesita para su utilización con fines terapéuticos o no terapéuticos unas técnicas de purificación que permitan obtener productos de alta pureza y totalmente desprovistos de contaminantes virales (HIV, hepatitis, parvovirus,...) o de moléculas biológicas tales como unos anticuerpos o unas proteasas (Consejo Directivo 65/65 EEC, 75/319/EEC & 89/381 EEC).
También, han sido propuestos diferentes procedimientos de tratamiento (filtración, precipitación, cromatografía de afinidad,...) para eliminar o inactivar los contaminantes del plasma y/o de compuestos derivados del plasma (factor VIII, factor de von Willebrand, fibronectina,....).
Los tratamientos de inactivación viral pueden consistir en un tratamiento térmico o químico.
Un tratamiento químico puede por ejemplo consistir en una inactivación viral por solvente-detergente tal como la descrita en la solicitud de patente nº EP-0 131 740.
Sin embargo, estos tratamientos térmicos o químicos de inactivación viral no permiten eliminar completamente ciertos contaminantes virales, en particular ciertos virus no envueltos tales como el parvovirus B19.
La solicitud de patente PCT/FR89/00050 (WO89/12065) describe dicha inactivación viral por solvente-detergente en un procedimiento de separación de proteínas del plasma a partir de una fracción solubilizada de un crioprecipitado de plasma.
Según este procedimiento, se somete la fracción de un crioprecipitado de plasma resolubilizado en agua a un tratamiento de inactivación viral por solvente-detergente, y después a una separación única de cromatografía sobre una resina intercambiadora de iones cuya matriz es un gel capaz, por sus propiedades de porosidad y de hidrofobicidad, de retener el complejo factor VIII -factor de von Willebrand. Se recupera a continuación selectivamente cada una de las proteínas por unos aumentos sucesivos de la fuerza iónica del tampón de elución.
El primer filtrado de la cromatografia contiene principalmente fibrinógeno, pero también albúmina, unas inmunoglobulinas y los agentes de inactivación viral (Tween y TNBP).
A partir de esta solución, el fibrinógeno es a continuación purificado (eliminación de los agentes de inactivación viral) por una nueva etapa de cromatografía sobre columna de resina de heparina-sépharose.
La fracción de fibrinógeno recogida es a continuación concentrada y dializada por un sistema de cassette. El producto concentrado es repartido en frascos y liofilizado.
Sin embargo esta técnica de purificación del fibrinógeno presenta el inconveniente de que necesita una etapa de purificación compleja y costosa por cromatografía.
Además, esta técnica de purificación no permite tratar industrialmente de manera rápida unos volúmenes importantes de fracciones enriquecidas en fibrinógeno de alta pureza. Asimismo, el concentrado de fibrinógeno purificado por una etapa suplementaria de cromatografía estará desprovisto del factor XIII, lo que reduciría su aplicación como cola biológica.
Las patentes y solicitudes de patente DE-30 01 435, EP-0 311 950 y PCT/GB86/00121 WO86/05190) describen unos procedimientos de purificación de compuestos sanguíneos obtenidos de fracciones de plasma
sanguíneo por precipitación a pH ácido y en presencia de un ácido aminado.
Dichos procedimientos pueden ser combinados con un procedimiento químico de inactivación viral.
No obstante, los productos obtenidos por las diferentes técnicas citadas no son suficientemente puros.
En efecto, unos contaminantes tales como unas proteasas no son eliminados por estas técnicas.
Además, el concentrado de fibrinógeno no deslipidado obtenido solo puede ser solubilizado muy lentamente.
La presente invención prevé obtener un procedimiento de obtención de este concentrado de fibrinógeno salido de plasma sanguíneo, que no presente los inconvenientes del estado de la técnica citado, en particular un procedimiento que sea simple, rápido y poco costoso, y que permita obtener de forma industrial volúmenes importantes de fibrinógeno altamente purificado.
El solicitante ha conseguido un procedimiento de obtención del concentrado de fibrinógeno caracterizado porque está desprovisto de contaminantes virales, porque su pureza es superior a 98%, y porque está desprovisto de proteasas. caracterizado porque se somete una fracción solubilizada de plasma que comprende fibrinógeno a un tratamiento químico de inactivación viral mediante la adición de solvente/detergente, a dos o varias etapas de precipitación en una solución que comprende un aminoácido, preferentemente la glicina, y a pH ácido, y a una o varias etapas de filtración del fibrinógeno purificado, preferentemente sobre filtro de carbono activado.
Además, el solicitante ha conseguido un procedimiento de la invención, caracterizado porque el pH de la solución está comprendido entre 4,0 y 7,0, preferentemente entre 5,5 y 6,5, y porque la concentración en aminoácidos en la solución está comprendida entre 0,1 y 3,3 molar, preferentemente entre 0,5 y 1,5 molar.
Además, el solicitante ha conseguido un procedimiento de la invención, caracterizado porque comprende una etapa térmica de inactivación viral, preferentemente mediante calentamiento de la fracción solubilizada de plasma a una temperatura superior o igual a 80ºC durante un tiempo superior o igual a 10 horas, y/o una etapa física de inactivación viral mediante el tratamiento de la fracción solubilizada de plasma con radios ultravioletas C, de la que la mayor parte de la emisión de la radiación se efectúa preferentemente entre 250 y 270 nm, y en la que las dosis de irradiación son preferentemente del orden de 250 Joules/m2.
Además, el solicitante ha conseguido un procedimiento de la invención, caracterizado porque la fracción solubilizada del plasma se selecciona de entre el grupo constituido por la fracción solubilizada de un crioprecipitado de plasma, la fracción FI de Cohn y/o una mezcla de las mismas.
Además, el solicitante ha conseguido un procedimiento de la invención, caracterizado porque previamente se somete a la fracción solubilizada del crioprecipitado de plasma a una etapa única de cromatografía sobre resina intercambiadora de iones, que comprende preferentemente una matriz constituida por un gel capaz, debido a sus propiedades de porosidad y de hidrofobicidad, de retener el complejo factor VIII - factor de von Willebrand.
Asimismo, el solicitante ha conseguido un procedimiento de la invención, caracterizado porque previamente se somete la fracción solubilizada del crioprecipitado de plasma a un tratamiento de prepurificación que comprende un tratamiento con hidróxido de alúmina y/o una precipitación a una temperatura comprendida entre 10 y 20ºC.
Además, el solicitante ha conseguido una composición farmacéutica, cosmética o cola biológica que comprende un concentrado de fibrinógeno caracterizado porque está desprovisto de contaminantes virales, porque su pureza es superior a 98%, y porque está desprovisto de proteasas.
Ventajosamente, el procedimiento de la invención ha conseguido obtener un concentrado de fibrinógeno que está caracterizado por una pureza particularmente elevada, superior a 95%, incluso superior a 98%. La fracción que queda en este concentrado de fibrinógeno está constituida por el factor XIII (pudiendo la proporción del factor XIII en la fracción restante ser superior al 30%) y por inmunoglobulinas.
Además, puede también subsistir en este concentrado de fibrinógeno una concentración muy pequeña de aditivos químicos (solventes/detergentes) utilizados en el procedimiento de inactivación química de este concentrado de fibrinógeno.
Sin embargo, los solventes detergentes detectados en el producto final están sólo presentes en estado de trazas, no tóxicas.
Ventajosamente, el procedimiento de la invención ha conseguido obtener un concentrado de fibrinógeno que está deslipidado, es decir que puede ser rápidamente y fácilmente solubilizado en unos minutos, preferentemente menos de 15 minutos, incluso menos de 10 minutos.
Ventajosamente, el procedimiento de la invención ha conseguido obtener un concentrado de fibrinógeno que no sufre coagulación después de conservación durante más de 12 meses a 4ºC.
Ventajosamente, el procedimiento de la invención ha conseguido obtener un concentrado de fibrinógeno que comprende más e 0,001%, preferentemente más de 0,1%, de factor XIII.
La presente invención se refiere también al procedimiento de obtención del concentrado de fibrinógeno en el cual se somete una fracción solubilizada de plasma que contiene fibrinógeno a un tratamiento químico de inactivación viral, en una o varias etapa(s) de precipitación en una solución a un pH ácido y que comprende un ácido aminado (y eventualmente a uno o varios tratamiento(s) físico(s) (tratamientos por radiación ultravioleta, en particular UVC) o térmico(s) de inactivación viral.
La combinación de estas diferentes etapas permite, de forma inesperada, obtener por un efecto sinérgico el concentrado de fibrinógeno según la invención, cuya pureza es superior a 98% y que está desprovisto de contaminantes virales y desprovisto de proteinasas
Ventajosamente, la etapa de precipitación a pH ácido se efectúa a un pH comprendido entre 4,0 y 7,0, preferentemente entre 5,5 y 6,5.
La concentración de ácido aminado (preferentemente la Glicina) en la solución está comprendida entre 0,1 y 3,3 molar, preferentemente entre 0,5 y 1,5 molar.
Además, el procedimiento de purificación comprende, preferentemente después de cada etapa de precipitación, una o varias etapa(s) de filtración del fibrinógeno purificado. Preferentemente, esta etapa de filtración se efectúa sobre filtro de carbono activado.
Los filtros de carbono AKS-4 o AKS-7, tales como los proporcionados por la sociedad ZEISS, convienen particularmente para el procedimiento de la invención.
Según la invención, el tratamiento químico de inactivación viral consiste en un tratamiento por solvente-detergente tal como el descrito en la solicitud de patente
EP-0 131 740.
La etapa térmica de inactivación viral se efectúa por ejemplo por calentamiento a una temperatura superior a 80ºC, por una duración superior o igual a 10 horas, preferentemente comprendida entre 24 y 72 horas.
La etapa física de inactivación viral se efectúa por tratamiento de la fracción solubilizada de plasma por rayos ultravioletas C, cuya longitud de onda está comprendida entre 250 y 270 nm, preferentemente del orden de 254 nm, y las dosis de irradiación son del orden de 250 Joules/m2.
Según la invención, la fracción solubilizada de plasma se elige entre el grupo constituido por la fracción solubilizada de un crioprecipitado de plasma, la fracción FI de Cohn y/o una mezcla de ellas.
Según una primera forma de realización preferida de la invención, se somete previamente la fracción solubilizada de un crioprecipitado de plasma a una etapa única de cromatografía sobre una resina intercambiadora de iones.
Preferentemente, la resina intercambiadora de iones comprende una matriz constituida por un gel capaz, por sus propiedades de porosidad y de hidrofobicidad, de retener el complejo factor VIII-factor de von Willebrand presente en el plasma.
Además, según esta forma de realización preferida de la invención, el procedimiento comprende también una etapa en la cual se somete previamente la fracción solubilizada del crioprecipitado de plasma a un tratamiento de prepurificación que comprende un tratamiento con hidróxido de alúmina y/o una precipitación a una temperatura comprendida entre 10 y 20ºC.
La presente invención se refiere también a la composición farmacéutica y/o cosmética que comprende un concentrado de fibrinógeno según la invención y/o obtenido por el procedimiento de obtención según la invención,
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estando dicho concentrado caracterizado porque está desprovisto de contaminantes virales, porque su pureza es superior a 98%, y porque está desprovisto de proteasas.
En particular, esta composición farmacéutica y/o cosmética es una cola biológica tal como la descrita en la solicitud de patente EP-0 305 243 y que comprende el concentrado de fibrinógeno según la invención.
La figura 1 representa el análisis densimétrico sobre gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) del fibrinógeno purificado por diferentes métodos.
Las figuras 2 a 5 representan el análisis cimográfico del fibrinógeno purificado por diferentes métodos.
La figura 6 representa de forma esquemática una instalación para la preparación del concentrado de fibrinógenos según la invención.
La presente invención se describirá de manera más detallada con referencia a las figuras anexas en los ejemplos siguientes dados a título de ilustración no limitativa de la invención.
EJEMPLO 1
Se utiliza como material de partida un crioprecipitado de plasma que comprende fibrinógeno puesto de nuevo en suspensión.
Esta suspensión de crioprecipitado se somete a una purificación previa por tratamiento con hidróxido de alúmina y una precipitación en frío.
Esta solución previamente purificada es sometida a continuación a un tratamiento de inactivación viral por solvente-detergente tal como el descrito en la solicitud de patente europea EP-0 131740.
Esta fracción solubilizada es a continuación sometida a una etapa única de cromatografia sobre una resina intercambiadora de iones y se recupera selectivamente la primera fracción obtenida (eluido + volumen de lavado) que es purificada por una primera etapa de precipitación en las condiciones siguientes:
- -
- temperatura = 25ºC
- -
- Na citrato 0,15 M, NaCl 0,15 M, Glicina 1 M
-pH 6,1 (HCl 1 normal)
-Glicina 1 M.
A continuación se lleva la temperatura a +4ºC y se efectúa una centrifugación.
Se disuelve de nuevo el precipitado en las condiciones siguientes:
-pH 7,0
- -
- temperatura = 30ºC
- -
- Na citrato 0,15 M, NaCl 0,15 M, Glicina 1 M
-filtración AKS-4 - AKS-7
-pH 6,1 (HCl 1 normal).
Se lleva a continuación la temperatura a +4ºC y se efectúa una centrifugación.
El precipitado se disuelve de nuevo en las condiciones siguientes:
- -
- temperatura = 30ºC
- -
- Na citrato 0,05 M, monodextrosa 50 g/l
-NaCl 0,05 M
-pH 7.
El precipitado es a continuación filtrado sobre un filtro de carbono del tipo AKS4-EKSP® (SEITZ), y después
concentrado y diafiltrado. El producto concentrado es a continuación filtrado estérilmente y después se añade un
estabilizador (sucrosa), puesto en frascos y liofilizado.
Los rendimientos obtenidos son del orden de 80% y la pureza de los productos alcanza valores del orden de 5 98% ± 2%.
EJEMPLO 2
Se utiliza, como en el ejemplo 1, como material de partida, un crioprecipitado de plasma sometido a un
tratamiento químico de inactivación viral por solvente-detergente, pero sin someter el crioprecipitado a una etapa de
purificación previa por cromatografia como en el ejemplo 1.
10 La purificación del fibrinógeno se obtiene por una sola etapa de precipitación. Los rendimientos obtenidos son del orden de 70 a 80% y la pureza de los productos alcanza unos valores del orden de 75 a 85%.
La tabla 1 siguiente toma de nuevo los datos comparativos de diferentes métodos de purificación del fibrinógeno.
Tabla 1
15
- Rendimiento global%
- Pureza% (e) Tween 80 ppm (f) TNBP ppm (g) Proteasas (h)
- Procedimiento I (a)
- 70-80 > 98 < 10 < 1 -
- Procedimiento II (b)*
- 70-80 75-85 125 < 20 ++
- Procedimiento III (c)*
- > 90 > 90 82 < 10 ±
- Procedimiento IV (d)*
- nd 70-80 nd nd ++
- (a) El fibrinógeno es purificado a partir de la primera fracción obtenida selectivamente a partir de una etapa única de cromatografía, seguida de dos precipitaciones con la Glicina y filtración sobre filtro AKS4-EKSP® (ejemplo 1). (b) El fibrinógeno es purificado a partir de un crioprecipitado de plasma no tratado previamente por cromatografía y purificado por una sola precipitación (ejemplo 2). (c) El procedimiento es idéntico al procedimiento (a) pero no comprende una sola precipitación con la Glicina. (d) El fibrinógeno es purificado según el procedimiento descrito en la solicitud de patente PCT/FR89/00050. (e) Análisis densitométrico del gel de poliacrilamida (SDS-PAGE, ver figura 1). (f) El límite superior aceptable de la concentración de Tween 80 debe ser inferior a 100 ppm. (g) El límite superior aceptable de la concentración de TNBP debe ser inferior a 10 ppm. (h) La presencia de proteasas ha sido puesta en evidencia por análisis cimográfico (ver figura 2). * Ejemplo comparativo
El análisis densitométrico sobre gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) de la figura 1 toma de nuevo diferentes lotes de fibrinógenos obtenidos por diferentes procedimientos según la invención y según el estado de la técnica.
Cantidad de material depositado por pista: 5 μg proteína.
-Pistas 1,8: standards de pesos moleculares BIO-RAD® "High range"
- -
- Pista 2: puesta en solución del crioprecipitado
- -
- Pista 3: fibrinógeno standard de Kordia®
6
- Pista 4: fibrinógeno preparado a partir del crioprecipitado (2 precipitaciones con Glicina).
- -
- Pista 5: fibrinógeno preparado a partir del pico A de una columna intercambiadora de iones (1 precipitación con Glicina)
- -
- Pista 6: fibrinógeno preparado a partir del pico A de una columna intercambiadora de iones (2 precipitaciones con Glicina).
- Pista 7: fibrinógeno preparado a partir de una columna Heparina-Sepharosa (Pharmacia)
Las pistas 2, 3, 4 y 7 presentan una banda suplementaria (MW 300.000) de fibronectina.
El análisis cimográfico presentado en las figuras 2 a 5 toma de nuevo el análisis de diferentes lotes de
fibrinógeno obtenidos por diferentes procedimientos según la invención y según el estado de la técnica (sobre gelatina (figura 2), sobre gelatina + EDTA (figura 3), sobre caseína (figura 4), sobre caseína + EDTA (figura 5)). Cantidad de material depositado por pista: 500 μg proteína.
-Pistas 1,8: standard de pesos moleculares BIO-RAD® "High range"
- -
- Pista 2: puesta en solución del crioprecipitado
- -
- Pista 3: fibrinógeno standard de Kordia®
- Pista 4: fibrinógeno preparado a partir del crioprecipitado (2 precipitaciones con Glicina).
- -
- Pista 5: fibrinógeno preparado a partir del pico A de una columna intercambiadora de iones (1 precipitación con Glicina)
- -
- Pista 6: fibrinógeno preparado a partir del pico A de una columna intercambiadora de iones (2 precipitaciones con Glicina).
- Pista 7: fibrinógeno preparado a partir de una columna Heparina-Sepharosa (Pharmacia).
Las pistas 2 y 7 indican claramente la presencia de proteasas.
EJEMPLO 3: Preparación de concentrado de fibrinógeno a partir de la fracción FI (fraccionado de Cohn (ver tablas 2 y 3)
Obtención de la fracción FI.
50 l de plasma se descongelan a 0 ± 2ºC y se centrifugan para obtener el crioprecipitado. El pH del plasma pobre en crioprecipitado es llevado a pH 7,2 con HCl y se le adiciona etanol (9 ± 1%). La temperatura es mantenida a -2,5ºC. Después de dos horas de incubación, la suspensión es centrifugada y se obtiene (± 800 g) un residuo (Fracción I de Cohn o FI).
La fracción FI es suspendida de nuevo en tampón citrato (citrato Na 0,15 M - NaCl 0,15 M-pH 7,0 ± 0,1) a 15ºC. Se adiciona alhidrogel (2% concentración final), y la incubación se prosigue 20 minutos a 22ºC. Después de eliminación del residuo rico en proteasas, el sobrenadante es filtrado sobre filtro clarificante (1 μm Pall) con un caudal de 1 l/ m. Se lleva a cabo una primera inactivación viral por adición de solvente-detergente (8 horas en presencia de Tween 80 1% y de TNBP 0,3% a 25ºC).
Primera precipitación con Glicina
Después de inactivación, el pH es ajustado a 6,1 ± 0,1 y la concentración de Glicina es llevada a 1 M. Después de como mínimo 2 horas de precipitación a 4ºC, la suspensión es centrifugada o decantada. El residuo es disuelto en 10 veces su volumen de tampón citrato a 30ºC y el pH es llevado a 7,0 ± 0,1.
Eliminación del solvente-detergente por filtración absorbente clarificante
La suspensión es filtrada sobre carbón de tipo AKS-4 o AKS-7 (3 placas) y el filtro de tipo Kieselguhr EKSP (3 placas) (caudal 700 ml/min).
La eliminación del solvente-detergente es más eficaz sobre los filtros de carbón AKS-4 ó AKS-7 tales como los proporcionados por la sociedad ZEISS que sobre los filtros "deslipidado" tales como los proporcionados por la sociedad CUNO.
Segunda precipitación con Glicina
El pH del filtrado es llevado a 6,1 ± 0,1, y se adiciona Glicina (concentración final 1 M). La precipitación a 4ºC dura como mínimo 2,5 horas. El precipitado se obtiene después de centrifugación o decantación. Segunda filtración clarificante
El residuo es disuelto en tampón citrato 3 veces diluido y filtrado, como se ha descrito anteriormente. Concentración y diafiltración
El filtrado de la segunda filtración es concentrado por ultrafiltración (Filtron®, Millipore) ("clotting assay") y diafiltrado contra tampón citrato 3 veces diluido. Adición de los estabilizadores y segunda inactivación viral por rayos ultravioleta
Se adicionan unos estabilizadores al fibrinógeno purificado, el pH es ajustado a 7,0 ± 0,1 y la solución de fibrinógeno puede ser tratada por rayos UVC para poder inactivar en particular los virus no envueltos (parvovirus B19, virus de la hepatitis A y C,...). Filtración esterilizante
La solución es filtrada de forma estéril sobre filtro Millidisk® 0,45 μm y 0,22 μm (Millipore). Liofilización y tratamiento térmico severo
Después de liofilización, el fibrinógeno puede ser calentado a 80ºC por una duración superior o igual a 10 horas, preferentemente durante un tiempo comprendido entre 24 y 72 horas. Resultados
El producto obtenido está caracterizado por las propiedades siguientes:
- rendimiento: 0,4 a 1 g/l de plasma de partida (fracción FI)
- efluente: 0,2 mg/l de plasma
- pureza: superior a 98%
- alta concentración en factor VIII (incluso después de calentamiento a sequedad severa)
- ausencia de proteasas (en particular de proteasas dependientes de la vitamina K) medibles
- -
- producto soluble en menos de 10 minutos
- -
- producto caracterizado por una estabilidad muy grande en solución: no hay coagulación después de conservación durante más de 12 meses a 4ºC
- muy bajo coste de producción
- baja reducción de la actividad del fibrinógeno que haya sufrido tres inactivaciones virales
Tabla 2 Tabla 3
Instalación para la preparación del concentrado de fibrinógeno según la invención
La figura 6 anexa representa de forma esquemática una instalación para la preparación del concentrado del fibrinógeno según la invención.
Esta instalación comprende unos dispositivos (1 y 2) que aseguran la precipitación, la centrifugación/decantación, filtración, concentración y diálisis del concentrado del fibrinógeno según la invención y adaptable por el experto en la materia en función del derivado sanguíneo tratado.
Además, esta instalación comprende un dispositivo (que lleva la referencia 3 en la figura 6 anexa) que asegura por un tratamiento físico una inactivación viral del derivado sanguíneo.
La instalación según la presente invención puede por tanto ser utilizada para un tratamiento físico de inactivación viral de cualquier derivado sanguíneo, en particular la de los factores de coagulación (factor VIII, factor IX,...), de las inmunoglobulinas, de la albúmina, del fibrinógeno...
Este dispositivo comprende un tubo de desinfección UV del cual más del 90% de la emisión se efectúa entre 250 y 270 nm, preferentemente a 254 nm, y que está montado en un recinto reflectante que refleja la radiación hacia un tubo de cuarzo o de material polimerizado y no absorbente en esta zona de longitud de onda. No es posible ningún contacto entre el producto que circula por el tubo 4 y la lámpara UV 5.
Un sistema de turbulencia, como un deflector o una inyección de nitrógeno, permite mantener un flujo homogéneo en el tubo. El sistema de control de la cantidad de UV que irradia el tubo está colocado por el lado opuesto del tubo con respecto a la lámpara. El tiempo de mantenimiento del producto puede ser ajustado para obtener una dosis constante de irradiación. El diámetro del tubo puede ser adaptado al volumen a tratar así como la potencia o a la longitud de la lámpara de desinfección. La temperatura es controlada y registrada tanto en el interior del recinto como en el líquido.
Todo el sistema es de materiales de acuerdo con las prácticas de producción farmacéutica (GMP), como el acero inoxidable 304, Teflon, ... y puede ser tratado de manera sanitaria en el lugar.
La utilización de un sistema de este tipo de radiación UV, en particular de radiación UVC, permite inactivar los virus, en particular los virus no envueltos, en particular los virus monocatenarios tales como el parvovirus murino (5 a 6 log de inactivación viral).
El sistema se coloca corriente abajo del procedimiento de preparación del derivado sanguíneo, por ejemplo antes de la filtración esterilizante o después de la ultrafiltración.
La potencia de la lámpara UV está comprendida entre 18 y 132 Watios. La actividad de las preparaciones (factor VIII, fibrinógeno y IgG) utilizados está poco afectada (5% como mediana de reducción de actividad).
El dispositivo puede ser construido de una sola pieza o en módulos yuxtapuestos colocados en serie. Las dosis de irradiación varían entre 100 y 2000 Joules/m2, pero son preferentemente del orden de 250 Joules/m2.
El dispositivo de desinfección UV utilizado en la instalación según la invención es de tipo s.p.1 (AQUAFINE®, Valencia, CA (USA)).
EJEMPLO 5: Análisis del concentrado del fibrinógeno según la invención
La tabla 4 da un análisis de las características del concentrado de fibrinógeno preparado a partir de una fracción solubilizada de plasma constituida por la fracción solubilizada de un crioprecipitado de plasma sometida a una etapa única de cromatografía sobre una resina intercambiadora de iones (efluente cromato), eventualmente tratada por un calentamiento severo (efluente cromato DH) u obtenida por el tratamiento de la fracción I de Cohn (FI), eventualmente tratada por un calentamiento severo (FI DH).
Este análisis muestra que el producto obtenido presenta una pureza particularmente elevada, superior a 98%, presenta proporciones muy pequeñas de solventes / detergentes, pero conserva una fracción importante de factor XIII que asegura la aplicación del concentrado de fibrinógeno según la invención como cola biológica.
Tabla 4
- Fracción de partida
- Pureza (%) mg FXIII/I ppm Tween 80 ppm TNBP
- Efluente cromato
- > 98 35 13 < 0,5
- Efluente cromato DH
- > 98 0,7 17 < 0,5
- FI
- > 98 360 < 10 < 0,5
- FI DH
- > 98 103 < 10 < 0,5
- DH : dry heart = calentamiento severo
Claims (7)
- REIVINDICACIONES
- 1.
- Procedimiento de obtención del concentrado de fibrinógeno, caracterizado porque está desprovisto de contaminantes virales, porque su pureza es superior a 98%, y porque está desprovisto de proteasas, caracterizado porque se somete una fracción solubilizada de plasma que comprende fibrinógeno a un tratamiento químico de inactivación viral por adición de solvente/detergente, a una o varias etapa(s) de precipitación en una solución que comprende un ácido aminado, preferentemente la Glicina, y a pH ácido, y una o varias etapa(s) de filtración del fibrinógeno purificado, preferentemente sobre filtro de carbono activado.
-
- 2.
- Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque el pH de la solución está comprendido entre 4,0 y 7,0, preferentemente entre 5,5 y 6,5, y porque la concentración de ácido aminado en la solución está comprendida entre 0,1 y 3,3 molar, preferentemente entre 0,5 y 1,5 molar.
-
- 3.
- Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque comprende una etapa térmica de inactivación viral, preferentemente por calentamiento de la fracción solubilizada de plasma a una temperatura superior o igual a 80ºC por una duración superior o igual a 10 horas, y/o una etapa física de inactivación viral por tratamiento de la fracción solubilizada de plasma a los rayos ultravioletas C, de los que la mayoría de la emisión de la radiación se efectúa preferentemente entre 250 y 270 nm, y en la cual las dosis de irradiación son preferentemente del orden de 250 Joules/m2.
-
- 4.
- Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque la fracción solubilizada del plasma se elige entre el grupo constituido por la fracción solubilizada de un crioprecipitado de plasma, la fracción FI de Cohn y/o una mezcla de ellas.
-
- 5.
- Procedimiento según la reivindicación 4, caracterizado porque la fracción solubilizada del crioprecipitado de plasma es previamente sometida a una etapa única de cromatografía sobre una resina intercambiadora de iones, que comprende preferentemente una matriz constituida por un gel capaz, por sus propiedades de porosidad y de hidrofobicidad de retener el complejo factor VIII- factor de von Willebrand.
-
- 6.
- Procedimiento según la reivindicación 5, caracterizado porque se somete previamente la fracción solubilizada del crioprecipitado de plasma a un tratamiento de prepurificación que comprende un tratamiento con hidróxido de alúmina y/o una precipitación a una temperatura comprendida entre 10 y 20ºC.
-
- 7.
- Composición farmacéutica, cosmética o cola biológica que comprende un concentrado de fibrinógeno, caracterizado porque está desprovisto de contaminantes virales, porque su pureza es superior a 98%, y porque está desprovisto de proteasas
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