DE69329403T2

DE69329403T2 - Verfahren und Vorrichtung für die Analyse von Haemoglobinen und Lösung zum Unterdrücken der Verschlechterung der Kolonne zum Gebrauch darin

Info

Publication number: DE69329403T2
Application number: DE69329403T
Authority: DE
Inventors: Junkichi Miura; Sadabumi Ohnuma; Yoshinori Takata; Harumi Tsuruta; Kenji Yasuda
Original assignee: Hitachi Ltd
Current assignee: Hitachi Ltd
Priority date: 1992-04-01
Filing date: 1993-03-29
Publication date: 2001-04-19
Anticipated expiration: 2013-03-30
Also published as: US5358639A; EP0563865B1; EP0563865A2; US5468379A; JP2669255B2; JPH05281222A; DE69329403D1; EP0563865A3

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

1) Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Analyse von Hämoglobinen und eine Lösung zum Unterdrücken des Verschlechterns der dabei verwendeten Trennsäule und insbesondere Techniken, die zum Analysieren von Hämoglobinen in Blutproben durch Flüssigchromatographie geeignet sind.

2) Stand der Technik

Es ist herkömmliche Praxis, Glycohämoglobine in Blutproben zur Diagnose von Diabetes durch Flüssigchromatographie zu analysieren.
In der japanischen Patentanmeldung Kokai (offengelegt) 63-75558 ist eine herkömmliche Praxis offenbart, bei der Glycohämoglobine in Blutproben durch Zuführen einer Kaliumphosphatpufferlösung als Eluierlösung zu einer Trennsäule, die mit Carboxylgruppen als Ionenaustauschgruppen versehen ist, analysiert werden.
Bei der chromatographischen Trennung von Blutproben durch eine Pufferlösung auf Phosphatbasis in einer mit Carboxylgruppen oder Carboxyalkylgruppen als Ionenaustauschgruppen versehenen Trennsäule, wie es bei der oben erwähnten herkömmlichen Anwendung der Fall ist, tritt das folgende Problem auf. Wenn Operationen zum Trennen von Glycohämoglobinen in derselben Flüssigchromatographie-Analysiervorrichtung wiederholt werden, um Analysierbehandlungen einer großen Anzahl von Blutproben auszuführen, wird der Druck in der Durchflußleitung der Analysiervorrichtung allmählich erhöht, wodurch die Fähigkeit zum Trennen der Probenbestandteile verringert wird. Ein solches Erhöhen des Drucks und Verringern der Trennfähigkeit sind auf das Verschlechtern der Trennsäule zurückzuführen.
Wenn demgemäß die Flüssigchromatographie-Analysiervorrichtung zum Analysieren von Glycohämoglobinen für einen längeren Zeitraum verwendet wird, muß die verschlechterte Trennsäule durch eine frische ausgetauscht werden. Bisher war die Häufigkeit des Austauschens dieser verschlechterten Trennsäulen so hoch, daß auf den Bediener zahlreiche mühsame Arbeiten für das Austauschen bei erhöhtem Verbrauch an Trennsäulen zukamen.
In EP-A-368 092 ist ein Verfahren zur chromatographischen Analyse mit einer Trennsäule offenbart, wobei Verunreinigungen durch Verdrängermoleküle von der Säule entfernt werden, die Ladungen mit dem gleichen Vorzeichen wie das Ionenaustauschmaterial der Säule aufweisen. Beispiele von Verdrängermolekülen zur Verwendung mit einer Kationenaustauschsäule sind Carboxymethylzellulose, geladene Polysaccharide, synthetische geladene Polymere, wie Polyacrylat und vorzugsweise Carboxymethyl-Dextrans. Das Verfahren wird vorzugsweise zum Trennen monoklonaler Antikörper und von Immunoglobulin von asciten Fluiden oder Serum verwendet. Die Analyse von Hämoglobinen ist nicht offenbart.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Eine Aufgabe der Erfindung besteht darin, das Verschlechtern einer zum Analysieren von Hämoglobin in Blutproben verwendeten Trennsäule zu unterdrücken.
Das dieser Aufgabe zugrundeliegende Problem wird durch das Analysierverfahren und die Analysiervorrichtung aus den Ansprüchen 1 und 9, durch das Verfahren zum Regenerieren einer Trennsäule nach Anspruch 4 und durch Bereitstellen einer Lösung zum Unterdrücken des Verschlechterns einer Trennsäule gemäß Anspruch 5 gelöst. Die Unteransprüche sind auf bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung gerichtet.
Bei einer Ausgestaltung der Erfindung wird eine Pufferlösung auf Phosphatbasis, die höchstens 100 mM S-(Carboxyalkyl)-L-cystein aufweist, einer Trennsäule zugeführt, wenn Hämoglobine in Blutproben durch Zuführen einer Pufferlösung auf Phosphatbasis als Eluierlösung zur Trennsäule analysiert werden. Die Lösung kann als eine Eluierlösung zum Trennen von Blutprobenbestandteilen oder nach der Trennung der Bestandteile als eine Waschlösung (Regenerationslösung) für eine Trennsäule verwendet werden.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG BEVORZUGTER AUSGESTALTUNGEN DER ERFINDUNG

Es ist bekannt, daß Blut Hämoglobine, Glycohämoglobine, Hämoglobin F usw. als Hämoglobin-verwandte Substanzen enthält. Der Begriff "Hämoglobine" wird nachfolgend zur Bezeichnung dieser Hämoglobin-verwandten Substanzen verwendet.
Eine Trennsäule für die Flüssigchromatographie, die bei der Analyse von Hämoglobinen zu verwenden ist, ist mit granulierten Füllstoffen mit speziellen an ein Grundmaterial gebundenen Austauschgruppen gefüllt. Als Grundmaterial werden Polymere in der Art von Polyvinylalkohol, Polymethacrylat oder Siliciumdioxid verwendet. Als Ionenaustauschgruppen werden Carboxylgruppen und Carboxymethylgruppen verwendet.
Beim Eluieren von Hämoglobinen aus einer Trennsäule wird ein in mehreren Stufen ablaufendes Eluieren (gewöhnlich ein in drei Stufen ablaufendes Eluieren) verwendet, bei dem mehrere Eluierlösungen schrittweise zugeführt werden, oder es wird ein Gradienteneluieren, bei dem der pH-Wert einer Eluierlösung allmählich geändert wird, verwendet, um die Behandlungszeit zu verkürzen. Als eine Eluierlösung wird ein System, bei dem mehrere Lösungen verwendet werden, die ein Kaliumphosphat-Puffermittel (eine Mischung aus Kaliumdihydrogenphosphat und Dikaliumhydrogenphosphat) enthalten, ein System, bei dem mehrere Lösungen verwendet werden, die ein Natriumphosphat-Puffermittel (eine Mischung aus Natriumdihydrogenphosphat und Dinatriumhydrogenphosphat) enthalten, oder ein System, bei dem eine ausgewählte Kombination dieser zwei früheren Systeme verwendet wird, verwendet. In jedem Fall werden Pufferlösungen auf Phosphatbasis als Eluierlösungen verwendet.
Jede der Eluierlösungen wird so hergestellt, daß sie einen pH-Wert von vorzugsweise 5,5 bis 6,5 aufweist, es können jedoch, wenn erwünscht, auch mehrere Eluierlösungen, die so hergestellt sind, daß sie einen pH-Wert von 5,5 bis 7,5 aufweisen, verwendet werden. Beim in mehreren Stufen ablaufenden Eluieren wird die Eluierlösung der letzten Stufe so hergestellt, daß sie 1 bis 10 mM S-(Carboxyalkyl)-L-cystein enthält. Bei der Gradientenlösung wird der Trennsäule in der letzten Halbperiode des ganzen Eluierablaufs eine Eluierlösung zugeführt, die wenigstens 1 mM S-(Carboxyalkyl)-L-cystein enthält. In beiden Fällen wird der Trennsäule eine Lösung zugeführt, die wenigstens 1 mM S- (Carboxyalkyl)-L-cystein enthält, nachdem der A1(eins)c-Bestandteil der Hämoglobine aus der Trennsäule eluiert worden ist.
Die S-(Carboxyalkyl)-L-cystein enthaltende Lösung kann nicht nur als eine Eluierlösung sondern auch als eine Säulenwaschlösung verwendet werden. In diesem Fall ist die Säulenwaschlösung eine Pufferlösung auf Phosphatbasis, die auf einen pH-Wert von 5,0 bis 6,5 eingestellt ist, und sie enthält ein Puffermittel auf Phosphatbasis als Hauptbestandteil und 5 bis 100 mM S-(Carboxyalkyl)-L-cystein.
Es ist praktisch, S-(Carboxymethyl)-L-cystein (das nachfolgend als "S-CMC" bezeichnet wird) als ein S-(Carboxyalkyl)-L-cystein zu verwenden. S-(Carboxyethyl)-L-cystein kann auch verwendet werden, um eine ähnliche Wirkung zu erzielen. Zur einfacheren Erklärung wird die folgende Beschreibung nur in bezug auf S-CMC als typisches Beispiel von S-(Carboxyalkyl)-L-cystein gegeben. Selbst dann, wenn S-CMC allein einer Eluierlösung oder einer Säulenwaschlösung hinzugefügt wird, kann eine Wirkung des Unterdrückens des Verschlechterns einer Trennsäule erhalten werden, wenngleich dies von der Art der Verunreinigung der Trennsäule abhängt. Die Wirkung des Unterdrückens des Verschlechterns einer Trennsäule kann viel stärker erhöht werden, indem S-CMC zusammen mit einer oberflächenaktiven Substanz zu einer Eluierlösung oder einer Säulenwaschlösung hinzugefügt wird.
Als eine oberflächenaktive Substanz, die einer Eluierlösung oder einer Waschlösung zusammen mit S-CMC hinzuzufügen ist, wird eine oberflächenaktive Substanz verwendet, die sich leicht mit einem Protein oder einem Lipid verbinden kann. Beispielsweise hat Polyoxyethylen-(10)-Octylether als eine der nichtionischen oberflächenaktiven Substanzen eine starke Neigung zur Verbindung hauptsächlich mit einem Protein. Eine solche oberflächenaktive Substanz ist im Handel als Triton X-100 (Warenzeichen) von Rohm & Haas Co., USA erhältlich. Dodecyl-N-betain als eine der amphoterischen oberflächenaktiven Substanzen hat eine starke Neigung, sich hauptsächlich mit einem Lipid zu verbinden. Eine solche oberflächenaktive Substanz ist im Handel von Kao K.K., Japan als Amphitol 24B (Warenzeichen) erhältlich.
Wenn Blutproben in eine Flüssigchromatographie-Analysiervorrichtung eingeführt und nicht auf der Grundlage der vorliegenden Erfindung wiederholten Eluiervorgängen ausgesetzt werden, werden in den Blutproben enthaltene Verunreinigungen, wie Proteine, Lipide, Polysaccharide oder Polynucleotide, an die Oberflächen von Füllstoffen in der Trennsäule adsorbiert, und sie sammeln sich daran bei zunehmender Anzahl der eingeleiteten Proben an. Demgemäß verschlechtert sich die Funktion von Ionenaustauschgruppen auf der Füllstoffe allmählich und steigt der Druck auf der Einlaßseite der Trennsäule auch allmählich an. Die Fähigkeit der Trennsäule, Bestandteile zu trennen, verringert sich mit fortschreitender Verschlechterung der Trennsäule, und die Trennsäule muß schließlich durch eine frische ausgetauscht werden.
Wenn die vorliegende Erfindung auf die Flüssigchromatographie von Blutproben angewendet wird, indem eine S-CMC und oberflächenaktive Substanzen enthaltende Lösung als eine Eluierlösung der letzten Stufe beispielsweise eines in drei Stufen ablaufenden Eluierens einer Trennsäule zugeführt wird, werden Verunreinigungen, wie Proteine oder Lipide, selbst dann, wenn die Eluiervorgänge wiederholt werden, bei einer sehr geringen Verringerung des Drucks in der Durchflußleitung kaum an die Oberflächen der Füllstoffe in der Trennsäule adsorbiert, und die Fähigkeit zum Trennen der Bestandteile kann für eine längere Zeit auf einem hohen Niveau gehalten werden. Dies bedeutet, daß S-CMC als ein Mittel zum Unterdrücken des Verschlechterns einer Trennsäule wirkt.
Weiterhin setzt eine sowohl S-CMC als auch oberflächenaktive Substanzen enthaltende Lösung Verunreinigungen frei, die sich einmal mit den Oberflächen von Füllstoffen verbunden haben und entfernt sie von diesen, was bedeutet, daß sie die einmal verschlechterte Trennsäule in einen Zustand zurückführt, in dem sie wiederverwendet werden kann. Eine oberflächenaktive Substanzen und nicht S-CMC enthaltende Lösung beseitigt kaum die Verunreinigungen, die sich einmal mit den Oberflächen der Füllstoffe verbunden haben. Demgemäß kann eine Lösung, die sowohl S-CMC als auch oberflächenaktive Substanzen enthält, als eine Behandlungslösung zum Regenerieren der verschlechterten Trennsäule verwendet werden.
Bei einer mindestens 1 mM S-CMC enthaltenden Lösung besteht die Tendenz, daß sich das Trennen der Glycohämoglobinbestandteile verschlechtert, eine weniger als 1 mM S-CMC enthaltende Lösung hat jedoch eine geringere Wirkung des Unterdrückens des Verschlechterns einer Trennsäule. Demgemäß wird eine mindestens 1 mM S-CMC enthaltende Lösung der Trennsäule zugeführt, nachdem Glycohämoglobinbestandteile, wie A1(eins)a, A1(eins)b, A1(eins)c aus der Trennsäule eluiert worden sind. Eine weniger als 1 mM S-CMC enthaltende Lösung hat im wesentlichen keine nachteilige Wirkung auf das Trennen von Glycohämoglobinbestandteilen, und S-CMC kann demgemäß bei einer solch niedrigen Konzentration allen Eluierlösungen hinzugefügt werden.
Eine mehr als 10 mM S-CMC enthaltende Lösung hat eine nachteilige Wirkung auf die Trennung von Hämoglobinbestandteilen (A0-Bestandteil). Demgemäß muß eine Eluierlösung hergestellt werden, die höchstens 10 mM S-CMC enthält. Wenn S-CMC zu einer Säulenwaschlösung hinzugefügt wird, kann die Konzentration andererseits auf etwa 100 mM erhöht werden. In diesem Fall besteht keine Gefahr einer direkten Beeinflussung der Trennung der Bestandteile, es ist jedoch erforderlich, die Säulenwaschlösung mit einer Eluierlösung einer ersten Stufe, die kein S-CMC enthält, von der gewaschenen Trennsäule abzuwaschen, bevor die nächste Blutprobe in die Trennsäule eingeführt wird. Je höher die Konzentration an S-CMC ist, desto stärker ist die Wirkung des Desorbierens der Verunreinigungen von den Oberflächen des Füllstoffs und desto kürzer ist die Zeit der Behandlung mit der Säulenwaschlösung.

KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNG

Fig. 1 ist ein schematisches Flußdiagramm, in dem der Aufbau einer Flüssigchromatographie-Analysiervorrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung skizzenhaft angegeben ist.
Fig. 2 ist ein Diagramm, in dem ein Beispiel des Zuführens einer Eluierlösung zur Analyse von Hämoglobinen dargestellt ist.
Die Fig. 3A und 3B sind Chromatogramme gemäß der vorliegenden Erfindung.

BEVORZUGTE AUSFÜHRUNGSFORMEN DER ERFINDUNG

Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden weiter unten erklärt.
Der Aufbau einer Flüssigchromatographie-Analysiervorrichtung zum Analysieren von Hämoglobinen in Blut ist in Fig. 1 skizzenhaft angegeben, wobei das Eluieren in drei Stufen ausgeführt wird.
In Fig. 1 wird eine Eluierlösung, die bei einer vorgegebenen Strömungsrate von 0,5 bis 10 ml/min durch eine Zuführpumpe 1 gepumpt wird, durch ein Probeentnahmeventil 2 mit einem Röhrchen 27 konstanten Volumens und ein Durchflußfilter 3 einer Trennsäule 4 zugeführt. Eine über das Probeentnahmeventil 2 eingeleitete Blutprobe wird in der Trennsäule 4 in Bestandteile zerlegt, und die eluierten Bestandteile werden durch einen Detektor 5 nachgewiesen, der ein Absorptionsphotometer für ultraviolettes und sichtbares Licht aufweist. Das so erhaltene Chromatogramm wird auf einer Anzeigeeinheit 7 dargestellt. Die Spitzenwerte der durch den Detektor 5 nachgewiesenen einzelnen Bestandteile werden einer Berechnung in einem Steuerabschnitt 6 unterzogen, und die Ergebnisse der Berechnung werden mit den Namen der Bestandteile, der Retentionszeit jedes Spitzenwerts, der Bestandteilskonzentration bei jedem Spitzenwert und dergleichen auf der Anzeigeeinheit 7 dargestellt.
Ein Eluierlösungsbehälter 11 enthält eine Eluierlösung einer ersten Stufe, ein Eluierlösungsbehälter 12 enthält eine Eluierlösung einer zweiten Stufe, und ein Eluierlösungsbehälter 13 enthält eine Eluierlösung einer letzten Stufe. Ein Waschlösungsbehälter 14 enthält eine Waschlösung und wird verwendet, wenn es erforderlich ist. Bei den gewöhnlichen Analysiervorgängen werden die Eluierschritte für jede Probe bei Verwendung nur der Eluierlösungsbehälter 11 bis 13 wiederholt. Die einzelnen Behälter 11 bis 14 sind mit jeweiligen Ventilen 16 bis 19 versehen, und die Öffnungs- und Schließbewegungen dieser Ventile werden bei einer Zeitsteuerung ausgeführt, die einem vom Steuerabschnitt 6 vorgegebenen Programm entspricht. Das Aktivieren der Zuführungspumpe 1, des Probeentnahmeventils 2, des Detektors 5, der automatischen Probendosiereinrichtung 21 usw. wird auch entsprechend einem vorgegebenen Programm vom Steuerabschnitt 6 gesteuert.
Eine automatische Probendosiereinrichtung 21 weist einen abnehmbaren Probenrahmen 22 auf, an dem maximal 100 Probenbehälter angeordnet werden können. Als Probenbehälter können übliche Vakuum-Blutprobenröhrchen verwendet werden. Die automatische Probendosiereinrichtung weist eine Probeneinspritzöffnung 23, eine Entnahmeöffnung 24, ein Verdünnungsgefäß 25 und eine Waschöffnung 26 auf. Die Einspritzöffnung 23 und die Entnahmeöffnung 24 sind über Durchflußleitungen 28 bzw. 29 mit dem Probeentnahmeventil 2 verbunden. Die automatische Probendosiereinrichtung 21 weist weiterhin einen Beförderungsmechanismus auf, der eine Pipettendüse in X- und Y-Richtung bewe gen kann, wobei sich die Pipettendüse über die automatische Probendosiereinrichtung 21 in horizontaler Richtung frei bewegen kann und sich durch den Beförderungs- und Spritzenmechanismus, der in Verbindung mit der Pipettendüse steht, vertikal zu einer gewünschten Position bewegen kann.
Blutproben werden vor dem Einleiten in das Probeentnahmeventil 2 in der automatischen Probendosiereinrichtung vorbehandelt. Zuerst wird eine vorgegebene Menge einer ganzen Blutprobe in einem Probenbehälter in die Pipettendüse eingegeben und in das Verdünnungsgefäß 25 abgegeben. Die Düse wird danach durch die Waschöffnung 26 gewaschen, und eine Verdünnungslösung wird von der Düse in das Verdünnungsgefäß 25 abgegeben, um das Blut bis auf das 160fache des ursprünglichen Volumens zu verdünnen und das Blut darin gleichmäßig zu verteilen. Ein Teil der im Verdünnungsgefäß 25 verdünnten Blutprobe wird durch die Düse entnommen und über die Probeneinspritzöffnung 23 in das Röhrchen 27 konstanten Volumens des Probeentnahmeventils 2 eingeführt. Wenn das Röhrchen 27 konstanten Volumens mit der Blutprobe gefüllt ist, wird das Probeentnahmeventil 2 umgeschaltet, um das konstante Volumen der Probe durch den Überleitstrom der Eluierlösung in die Trennsäule 4 zu befördern.
Die Trennsäule 4 ist mit granulierten Füllstoffen mit Carboxylgruppen oder Carboxyalkylgruppen, die als Ionenaustauschgruppen mit dem Grundmaterial verbunden sind, beladen. Die Trennsäule 4 weist einen Innendurchmesser von etwa 4 bis 6 mm und eine Länge von etwa 30 bis 80 mm auf. Eine Flußzelle im Detektor 5 besteht aus Quarzglas und hat eine Lichtweglänge von 3 bis 10 mm. Wenn ein Photometer für ultraviolettes und sichtbares Licht als Detektor 5 verwendet wird, wird Licht mit einer Wellenlänge von 410 nm als Probenlicht nachgewiesen und Licht mit einer Wellenlänge von 530 nm als Bezugslicht nachgewiesen.
Wenn die Zeit der Probeneinspritzung als Anfangszeit festgelegt wird, werden bei einem in drei Stufen ablaufenden Eluieren ohne Verwendung einer Waschlösung Eluierlösungen zugeführt, wie in Fig. 2 dargestellt ist. Das heißt, daß eine Eluierlösung B dem Eluierlösungsbehälter 11 der ersten Stufe zugeführt wird, daß eine Eluierlösung C vom Eluierlösungsbehälter 12 der zweiten Stufe zugeführt wird und daß eine Eluierlösung D vom Eluierlösungsbehälter 11 der dritten Stufe zugeführt wird. Zur Anfangszeit wird die Eluierlösung B in die Trennsäule 4 eingebracht, und 0,6 Minuten nach der Anfangszeit wird dieser die Eluierlösung C zugeführt. 1,6 Minuten nach der Anfangszeit wird die Eluierlösung D zugeführt, und 2,0 Minuten nach der Anfangszeit wird die Eluierlösung B zugeführt, um die Trennsäule für das Einführen der nächsten Probe vorzubereiten. Bei diesem Beispiel beträgt die für eine Probe erforderliche Zeit 3, 3 Minuten, und diese Operationen zum Zu führen der Eluierlösung werden entsprechend dem Probeneinführungs-Zeitsteuerungsprogramm wiederholt.
Beim Beispiel aus Fig. 2 enthält die Eluierlösung D der letzten Stufe S-CMC und eine oberflächenaktive Substanz, und die Füllstoffe in der Trennsäule 4 werden in jedem Probeneinführungszyklus durch das Reagens gereinigt, um das Verschlechtern der Trennsäule 4 zu unterdrücken, wobei dieses in der Eluierlösung D enthalten ist. Der Zeitpunkt für das Einleiten der Eluierlösung D der letzten Stufe liegt direkt nach dem Zeitpunkt, zu dem die Spitze des A1(eins)c-Bestandteils aus der Trennsäule eluiert worden ist. Selbst dann, wenn mit dem Zuführen der Eluierlösung D durch Öffnen des Ventils 18 nach Anweisungen vom Steuerabschnitt 6 1,6 Minuten nach der Anfangszeit begonnen wird, beginnt die Eluierlösung D etwa 2 Minuten nach der Anfangszeit aus der Trennsäule 4 zu fließen, wie in Fig. 2 durch eine gepunktete Linie dargestellt ist.
Glycohämoglobinbestandteile, wie die Spitzenwerte A1(eins)a, A1(eins)b, A1(eins)c, instabiles A1(eins)c (in der Zeichnung nicht dargestellt) und der Bestandteil Hämoglobin F als Spitzenwert F wurden aus der Trennsäule 4 eluiert, bevor die S-CMC enthaltende Eluierlösung D der Trennsäule zugeführt wird. Ein Hämoglobinbestandteil (die Spitze A0) wird jedoch durch die Eluierlösung D eluiert.
Es werden weiter unten Beispiele des Analysierverfahrens angegeben.

Beispiel 1

Hämoglobine in Blutproben wurden durch die Analysiervorrichtung aus Fig. 1 analysiert. Die Trennsäule 4 war mit Füllstoffen beladen, die Carboxymethylgruppen als Ionenaustauschgruppen aufweisen. Die Teilchengröße der Füllstoffe betrug 5 um. Die Zuführrate der Zuführpumpe 1 war auf 1,4 ml/min gelegt. Es wurden drei in der folgenden Tabelle dargestellte Arten von Eluierlösungen verwendet, und die Zufuhr der Eluierlösung wurde nach dem in Fig. 2 dargestellten Programm ohne Verwendung einer Waschlösung schrittweise umgeschaltet. Tabelle
Es wurden ein nicht auf der vorliegenden Erfindung beruhender Fall und ein auf der vorliegenden Erfindung beruhender Fall verglichen. In dem nicht auf der vorliegenden Erfindung beruhenden Fall wurden die gleiche Eluierlösung der ersten Stufe und die Lösung der zweiten Stufe verwendet, wie in der vorhergehenden Tabelle dargestellt ist, während die in der vorhergehenden Tabelle dargestellte gleiche Eluierlösung der dritten Stufe, wobei darin jedoch kein S-CMC enthalten war, als Eluierlösung verwendet wurde.
Eluiervorgänge wurden kontinuierlich mit beiden Gruppen der Eluierlösungen ausgeführt, wobei jede für 1000 Blutproben diente. In dem nicht auf der vorliegenden Erfindung beruhenden Fall wurde ein Chromatogramm in der Art des in Fig. 3A dargestellten erhalten, während in dem auf der vorliegenden Erfindung beruhenden Fall ein Chromatogramm in der Art des in Fig. 3B dargestellten erhalten wurde.
Wenn 1000 Proben nicht auf der Grundlage der vorliegenden Erfindung kontinuierlich behandelt wurden, wurde der Druck auf der Eingangsseite der Trennsäule 4 von den ursprünglichen 50 Bar auf 70 Bar erhöht. Wie anhand von Fig. 3A offensichtlich ist, war die Trennung um die A1(eins)b-Spitze schlecht, und die A1(eins)a-Spitze, die richtig vorhanden sein mußte, wurde nicht identifiziert. Weiterhin war die Trennung um die A1(eins)c-Spitze schlecht, und die Spitze des instabilen A1(eins)c (L-A1(eins)c) wurde nicht identifiziert. Das heißt, daß nur 4 Bestandteile identifiziert werden konnten. Weiter hin bestand die Tendenz, daß die Retentionszeit zum Erhalten der Chromatogramme bei den späteren Durchläufen etwas kürzer wurde als bei den früheren Durchläufen.
Bei dem auf der vorliegenden Erfindung beruhenden Fall waren die selbst nach der kontinuierlichen Behandlung von 1000 Proben erhaltenen Chromatogramme gegenüber den bei den früheren Durchläufen erhaltenen nicht erheblich geändert. Der Druck auf der Einlaßseite der Trennsäule war nur etwas gegenüber den anfänglichen 50 Bar erhöht. Wie bei Betrachtung von Fig. 3B offensichtlich ist, wurden die A1(eins)b-Spitze und die A1(eins)a-Spitze voneinander getrennt und wurden die A1(eins)c-Spitze und die labile A1(eins)c-Spitze voneinander getrennt. Dies bedeutet, daß die 6 Bestandteile identifiziert werden konnten, was zeigt, daß die Verschlechterung der Trennsäule sehr gering war. Die Retentionszeit zum Erhalten der Chromatogramme bei den späteren Abläufen war gegenüber derjenigen bei den früheren Abläufen nicht erheblich geändert. Es wurde herausgefunden, daß bei der vorliegenden Erfindung kontinuierliche Behandlungen von sogar 10000 Proben ausgeführt werden konnten, während eine hohe Trennfähigkeit aufrechterhalten wurde.

Beispiel 2

Zum Analysieren von Hämoglobinen in Blutproben bei der Analysiervorrichtung aus Fig. 1 wurden Füllstoffe mit Carboxylgruppen als Ionenaustauschgruppen mit Teilchengrößen von 5 um in die Trennsäule eingebracht. Die Eluierlösungen der ersten bis dritten Stufe waren Pufferlösungen, die jeweils Dinatriumhydrogenphosphat und Natriumdihydrogenphosphat enthielten und für die erste Stufe einen pH-Wert von 5,94, für die zweite Stufe einen pH-Wert von 5,82 und für die dritte Stufe einen pH-Wert von 5,71 aufwiesen. Bei diesem Beispiel wurde neben den Eluierlösungen eine Säulenwaschlösung verwendet.
Die in den Waschlösungsbehälter 14 aus Fig. 1 gegebene Waschlösung war eine Pufferlösung auf Phosphatbasis, die die gleichen Hauptbestandteile wie die Eluierlösungen enthält und die weiter 20 mM S-CMC und 0,5 Gew.-% Triton X-100 (oberflächenaktive Substanz) auf der Basis der Lösung, eingestellt auf einen pH-Wert von 5,65, enthält.
Die S-CMC enthaltende Säulenwaschlösung wurde der Trennsäule 4 nach der Eluierlösung der dritten Stufe zugeführt, und eine vorgegebene Zeit danach wurde die Zufuhr der Säulenwaschlösung zur Eluierlösung der ersten Stufe umgeschaltet, um für die nächste Probe ein Säulengleichgewicht zu erhalten. Wenn die Säulenwaschlösung neben den Eluierlösungen verwendet wurde, konnte das Verschlechtern der Trennsäule durch Hinzufügen von S-CMC und der oberflächenaktiven Substanz in einer Säulenwaschlösung unterdrückt werden, wodurch ein Erhöhen des Drucks in der einer wiederholten Verwendung für eine ausgedehnte Zeit unterzogenen Trennsäule unterdrückt werden konnte und eine hohe Trennfähigkeit aufrechterhalten werden konnte, was zu einer verbesserten Reproduzierbarkeit der exakten Analyse von Hämoglobinen führt.

Beispiel 3

Eine mit Füllstoffen beladene Trennsäule mit Carboxymethylgruppen als Ionenaustauschgruppen, die eine Teilchengröße von 7 um aufweisen, wurde verwendet, und es wurde ein Reagens zum Unterdrücken des Verschlechterns der Trennsäulen zu einer Eluierlösung der dritten Stufe als Eluierlösung der letzten Stufe hinzugefügt, und es wurde keine Säulenwaschlösung verwendet. Die Eluierlösung der ersten Stufe war eine Pufferlösung auf Natriumphosphatbasis mit einem pH-Wert von 5,92, die Eluierlösung der zweiten Stufe war eine Pufferlösung auf Kaliumphosphatbasis mit einem pH-Wert von 7,25 und die Pufferlösung der dritten Stufe war eine Pufferlösung auf Natriumphosphatbasis mit einem pH-Wert von 5,95, die auf der Grundlage der Lösung 5 mM S-CMC und 0,2 Gew.-% Triton X-100 enthält. Bei diesem Beispiel konnte eine Erhöhung des Drucks der Trennsäule bei der Analyse von Hämoglobinen unterdrückt werden.

Beispiel 4

Es wurde die Funktion zum Regenerieren der Trennfähigkeit der verschlechterten Trennsäule durch ein Reagens zum Unterdrücken der Verschlechterung einer Trennsäule geprüft. Bei der Trennsäule, bei der 1000 Blutproben nicht auf der Grundlage der vorliegenden Erfindung behandelt wurden, war die Fähigkeit zum Trennen von Bestandteilen verschlechtert, wie in Fig. 3A dargestellt ist. Bei der so verschlechterten Trennsäule wurden Hämoglobine in Blutproben durch wiederholtes Zuführen der in der vorhergehenden Tabelle dargestellten Eluierlösungen zur Trennsäule analysiert. Etwa beim 15. Zyklus nach Zuführen der in der vorhergehenden Tabelle dargestellten Eluierlösungen konnte eine Verbesserung der Fähigkeit zum Trennen der Bestandteile in den Chromatogrammen beobachtet werden. Etwa beim 30. Zyklus konnten 6 Bestandteile identifiziert werden, und etwa beim 100. Zyklus konnte im wesentlichen die gleiche Trennbarkeit wie beim Original erhalten werden. Das heißt, daß die gleichen Chromatogramme erhalten werden konnten, wie sie in Fig. 3B dargestellt sind.
Bei der vorliegenden Erfindung können Hämoglobine für einen längeren Zeitraum analysiert werden, während ein Erhöhen des Drucks in der Durchflußleitung unterdrückt wird, und das Unterdrücken des Verschlechterns einer Trennsäule kann bei verbesserter Reproduzierbarkeit der analytischen Ergebnisse erhalten werden.

Claims

1. Verfahren zur Analyse von Hemoglobinen in Blutproben, aufweisend: Liefern einer Pufferlösung auf Phosphatbasis als Eluierlösung an eine Trennsäule (4), die mit Karboxylgruppen oder Karboxyalkylgruppen als Ionenaustauschgruppen versehen ist, wobei die Lösung bis zu 10 ml S-(Karboxyalkyl)-L-Cystein und ein Puffermittel auf Phosphatbasis enthält.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die S-(Karboxyalkyl)-L-Cystein enthaltende Lösung ein oberflächenaktives Mittel enthält, auf einen pH-Wert von 5,5 bis 7,5 eingestellt ist, und als eine von mehreren Eluierlösungen verwendet wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die S-(Karboxyalkyl)-L-Cystein enthaltende Lösung der Trennsäule (4) zugeführt wird, nachdem Glykohemoglobinkomponenten aus ihr eluiert worden sind.

4. Verfahren zur Regeneration der Komponententrennfähigkeit einer Trennsäule (4), die mit Karboxylgruppen oder Karboxyalkylgruppen als Ionenaustauschgruppen versehen ist, aufweisend: Zuführen einer Lösung, die bis zu 100 mM S-(Karboxyalkyl)-L-Cystein und ein oberflächenaktives Mittel enthält, zu der Trennsäule, deren Säulenfüllung sich aufgrund von Verunreinigungen verschlechtert hat, wodurch die verschlechterte Trennsäule regeneriert wird.

5. Lösung zur Unterdrückung einer Verschlechterung einer Trennsäule zur Analyse von Hemoglobinen, die 1 bis 100 mM S-(Karboxyalkyl)-L-Cystein als Reagenz zur Unterdrückung einer Verschlechterung und 0,01 bis 1,0 Gew.-% eines oberflächenaktiven Mittels, das von Blutproben herrührende Verunreinigungen löslich machen kann, enthält.

6. Lösung nach Anspruch 5, die ein Puffermittel aus Phosphatbasis als Hauptkomponente enthält.

7. Lösung nach Anspruch 5, die 1 bis 10 mM S-(Karboxyalkyl)-L-Cystein enthält und als Eluierlösung mit einem pH von 5,5 bis 7,5 zubereitet ist.

8. Lösung nach Anspruch 6, die 5 bis 100 mM S-(Karboxyalkyl)-L-Cystein enthält und als Säulenwaschlösung mit einem pH von 5,0 bis 6,5 zubereitet ist.

9. Vorrichtung zur Analyse von Hemoglobinen mit einem ersten und einem zweiten Eluierlösungstank (11, 12), die jeweils eigene Pufferlösungen auf Phosphatbasis enthalten, einem dritten Eluierlösungstank (13), der eine Pufferlösung auf Phosphatbasis mit S- (Karboxyalkyl)-L-Cystein und einem oberflächenaktiven Mittel enthält, einer Trennsäule (4) mit Karboxylgruppen oder Karboxyalkylgruppen als Ionenaustauschgruppen, Zuführeinrichtungen (1, 16-18) zur Lieferung der ersten, der zweiten und der dritten Eluierlösung, einem Detektor (5) zur optischen Erfassung von Eluaten aus der Trennsäule und einer Eluierlösungs-Auswahleinrichtung (6) zur Lieferung der Eluierlösung aus dem dritten Eluierlösungstank an die Trennsäule, nachdem Glykohemoglobinkomponenten aus der Trennsäule eluiert worden sind.