DE69331908T2

DE69331908T2 - Verfahren zur erhöhung der expression und zur verminderung der expressionsvariabilität von fremdgenen in pflanzenzellen

Info

Publication number: DE69331908T2
Application number: DE69331908T
Authority: DE
Inventors: C. Allen; C. Childs; E. Hall; L. Spiker; F. Thomson
Original assignee: North Carolina State University
Current assignee: North Carolina State University
Priority date: 1992-10-05
Filing date: 1993-09-27
Publication date: 2002-12-12
Anticipated expiration: 2013-09-28
Also published as: WO1994007902A1; EP0663921A4; ES2176208T3; DK0663921T3; DE69331908D1; CA2147006A1; ATE217319T1; EP0663921A1; CA2147006C; AU673859B2; AU5165593A; EP0663921B1; PT663921E; US5773689A

Description

GEBIET DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zum Verringern der Variabilität der Expression von Fremdgenen in Pflanzenzellen zusammen mit DNA-Konstrukten zur Ausführung derartiger Verfahren sowie die Pflanzenzellen und so erzeugten Pflanzen.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Die landwirtschaftliche Biotechnologie und speziell die Pflanzen-Biotechnologie hat als eines der Hauptanwendungsgebiete der Methoden der Biotechnologie Anerkennung gefunden. Es existieren Systeme zum Transformieren von Pflanzenzellen und Regenerieren vollständiger Pflanzen aus den transformierten Zellen; Strukturgene und Gen-Regulationsregionen werden weiterhin identifiziert; und die Nachfrage nach Pflanzen mit genetisch veränderten Merkmalen, wie beispielsweise Widerstandsfähigkeit gegenüber Insekten und Dürre, bleiben stark.
Ein Problem bei der Expression von Fremgenen in Pflanzen ist die klonale Variation in der Expression des gleichen Gens in unabhängigen Transformanten: ein Problem, das als "Positioneffekt"- Variation bezeichnet wird. Bisher sind keine vollständig zufriedenstellende Methoden zur Vermeidung dieses Problems entwickelt worden, so dass dementsprechend weiterhin eine Notwendigkeit für Lösungen dieses Problems besteht.
Es sind Zellkern-Gerüstanheftungsregionen (SAR) in Tabakpflanzen untersucht worden (Molecular Biology of the Cell, Sept. 1992, Bd. 3, Abstract 776; Abstract of the Intl. Society for Plant Molecular Biology, 1991, Abstract 407). Von diesen SAR hat sich gezeigt, dass sie im Gegensatz zu den NON-SAR-Konstrukten die Expressionsniveaus von Transgenen beim Abspalten der Transgene erhöhen.
Meyer et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 85, S. 8568-8572, November 1988) beschreiben die Verwendung eines aus der Petunie isolierten Genfragmentes, das die Wirkungen der Hybridisation verstärkt. Ein Fragment wurde als "Transformationsboostersequenz" identifiziert, und es gibt keine Offenbarung über die Verwendung einer solchen Boostersequenz sowohl in 5' als auch in 3' zu einem Transgen in dieser Veröffentlichung.
Die WO 92/14822 beschreibt ein Nucleinsäure-Fragment, das beim Überexprimieren eines starken Methionin-Samen-Speicherproteins in Pflanzen verwendbar ist. Obgleich die Verwendung geeigneter regulatorischer Sequenzen, die wirksam mit dieser Samen-Speicherprotein-DNA verbunden sind, beschrieben wurde, wurde die Verwendung von Gerüstanheftungsregionen weder diskutiert noch vorgeschlagen.
Hoffman et al. (EMBO Journal Bd. 6, Nr. 11, S. 3213-3221, 1987) beschreiben die Synthese eines Maissamen-Speicherproteins ("Zein") in transgenem Tabaksamen. Das "Zein"-Gen wurde unter die Regulierung von Bohnen-5' und -3'-flankierenden Regionen gesetzt. Es wird jedoch nicht die Verwendung von SAR's entweder in 5' oder 3' zu dem Strukturgen gelehrt. Darüber hinaus wurde eine Transformation unter Verwendung von Agro-bacterium ausgeführt.
Die WO 93/19190 beschreibt eine Nucleinsäure-Fragment kodierende Aspartokinase, ein Enzym, das die Ansammlung bestimmter Aminosäuren in den Keimen von Pflanzen fördert. Die Verwendung von SAR's in Verbindung mit diesem Strukturgen ist nicht beschrieben worden.
Die US-P-5122466 beschreibt ein Verfahren zum Transformieren von Coniferen mit einem DNA- Konstrukt, das eine Expressionskassette aufweist. Die Verwendung von Gerüstanheftungsregionen wurde in dieser Veröffentlichung weder offenbart noch vorgeschlagen.
Breyn et al. (Plant Cell, Bd. 4, S. 463-471, April, 1992) isolierten und charakterisierten das Zellkerngerüst von Tabak, das spezifische Pflanzen-DNA-Fragmente in vitro bindet. Im Verlaufe der Untersuchung wurden Gerüstanheftungsregionen in Verbindung mit T-DNA-Vektoren zur Untersuchung ihrer funktionellen Bedeutung bei der Genexpression in vivo verwendet.
Die WO 91/13993 bezieht sich auf Samen-spezifische Expressionskassetten zur Regulierung und Expression von Proteinen, die für pharmakologische und technische Erfordernisse in Pflanzen von Bedeutung sind.
Damit sind Expressionskassetten, die Gerüstanheftungsregionen enthalten, lediglich in Pflanzenzellen unter Verwendung von Agrobacterium-Vektor transfiziert worden.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Im Zusammenhang mit der vorstehenden Ausführung ist ein erster Aspekt der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zum Herstellen von rekombinanten Pflanzenzellen mit verringerter Variabilität der Expression und erhöhten Expressionsniveaus von Fremdgenen darin. Das Verfahren umfasst: (a) Zur Verfügung stellen einer Pflanzenzelle, fähig zur Regenerierung; (b) Transformieren der Pflanzenzelle mit einem DNA-Konstrukt, das eine Expressionskassette aufweist, wobei das Konstrukt in der 5'- bis 3'- Richtung eine Transkriptionsinitiationsregion, ein Strukturgen der Transkriptionsinitiationsregion nachgeschaltet und wirksam mit dieser verbunden und eine Gerüstanheftungsregion aufweist, angeordnet entweder in 5' zu der Transkriptionsinitiationsregion oder in 3' zu dem Strukturgen, wobei die Expressionskassette unter dem Vorbehalt steht, dass T-DNA-Grenzen davon ausgeschlossen sind; und wobei die Expression des Strukturgens erhöht ist im Vergleich zu derjenigen, die in der Abwesenheit der Gerüstanheftungsregionen auftreten würde. Bevorzugt wird der Transformationsschritt durch Beschuss der Pflanzenzelle mit Mikropartikeln ausgeführt, die die Expressionskassette tragen. Dem Schritt des Transformierens folgt vorzugsweise ein Regenerieren von Sprösslingen, Wurzeln oder sowohl Sprösslingen als auch Wurzeln (d. h. eine intakte Pflanze) von den transformierten Zellen. Bevorzugt weist das DNA- Konstrukt in der 5'- bis 3 '-Richtung eine erste Gerüstanheftungsregion auf, eine Transkriptionsinitiationsregion, ein Strukturgen, das der Transkriptionsinitiationsregion nachgeschaltet und mit dieser wirksam verbunden ist, eine Terminationsregion und eine zweite Gerüstanheftungsregion.
Ein zweiter Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein DNA-Konstrukt, das eine Expressionskassette aufweist, wobei das Konstrukt in der 5'- bis 3 'Richtung eine Transkriptionsinitiationsregion aufweist, ein Strukturgen, das der Transkriptionsinitiationsregion nachgeschaltet und mit dieser wirksam verbunden ist sowie eine Gerüstanheftungsregion, die entweder in 5' zu der Transkriptionsinitiationsregion oder in 3' zu dem Strukturgen angeordnet ist, wobei die Expressionskassette unter dem Vorbehalt steht, dass die T-DNA-Grenzen davon ausgeschlossen sind.
Ein dritter Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein DNA-Konstrukt, wie es vorstehend ausgeführt wurde, das von einem Pflanzentransformationsvektor getragen wird, wobei der Pflanzentransformationsvektor kein Agrobacterium tumefaciens ist.
Ein vierter Aspekt der vorliegenden Erfindung ist eine Pflanzenzelle, die ein DNA-Konstrukt enthält, wie es vorstehend ausgeführt wurde.
Ein fünfter Aspekt der vorliegenden Erfindung ist eine rekombinante Pflanze, die transformierte Pflanzenzellen aufweist, wobei die transformierten Pflanzenzellen ein heterologes DNA-Konstrukt enthalten, das eine Expressionskassette aufweist, wobei das Konstrukt in der 5'- bis 3'-Richtung eine Transkriptionsinitiationsregion aufweist, ein Strukturgen, das der Transkriptionsinitiationsregion nachgeschaltet und mit dieser wirksam verbunden ist; sowie eine Gerüstanheftungsregion, die entweder in der Position 5' zu der Transkriptionsinitiationsregion angeordnet ist oder in 3' zu dem Strukturgen, wobei die Expressionskassette unter dem Vorbehalt steht, dass T-DNA-Grenzen davon ausgeschlossen sind.
Das vorstehend Ausgeführte und andere Aufgaben und Aspekte der vorliegenden Erfindung werden im Detail in der nachstehend ausgeführten Beschreibung erläutert.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Fig. 1 veranschaulicht schematisch Plasmide, die zum Testen der Wirkung von flankierenden Gerüstanheftungsregionen auf die Genexpression verwendet werden. Abkürzungen: CaMV35S, Blumenkohl-Mosaikvirus 35S-Promotor; β-Glucuronidase, codierende Region des Escherichia coli-β- Glucuronidase-Gens; NOS TERM, Terminator von dem Nopalinsynthase-Gen; SAR, Gerüstanheftungsregion von dem Hefe-ARS-1-Element; OCS TERM, Terminator von dem Octapinsynthase-Gen.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung kann an einer Vielzahl von Pflanzen (d. h. Kormophyten) und deren Zellen zur Verringerung der Expressionsvariabilität darin ausgeführt werden, einschließlich sowohl Gymnospermen als auch Angiospermen (d. h. Monokotyle, Dikotyle). Gegenwärtig bevorzugt sind die Angiospermen.
Der hierin verwendete Begriff "wirksam verbunden" bezieht sich auf DNA-Sequenzen an einem einzigen DNA-Molekül, die derart miteinander verbunden sind, dass die Funktion des einen durch die andere beeinflusst wird. Damit ist eine Transkriptionsinitiationsregion wirksam mit einem Strukturgen verbunden, wenn sie in der Lage ist, die Expression dieses Strukturgens zu beeinflussen (d. h. das Strukturgen steht unter der Transkriptionskontrolle der Transkriptionsinitiationsregion). Von der Transkriptionsinitiationsregion wird gesagt, dass sie dem Strukturgen "vorgeschaltet" ist, was wiederum besagt, dass es der Transkriptionsinitiationsregion "nachgeschaltet" ("stromabwärts") ist.
In die DNA-Konstrukte oder "Expressionskassetten" der vorliegenden Erfindung bevorzugt einbezogen sind in 5' bis 3'-Richtung der Transkription eine erste Gerüstanheftungsregion, eine Transkriptionsinitiationsregion, ein mit der Transkriptionsinitiationsregion wirksam verbundenes Strukturgen, eine Terminationssequenz unter Einbeziehung eines Stopsignals für RNA-Polymerase und ein Polyadenylierungssignal für Polyadenylierung (z. B. den NOS-Terminator) sowie eine zweite Gerüstanheftungsregion unter der Voraussetzung, dass T-DNA-Grenzen von dem DNA-Konstrukt ausgeschlossen sind. Alle diese Regionen sollten in der Lage sein, in den Zellen des Gewebes, die transformiert werden sollen, wirksam zu sein. Die Terminationsregion kann von dem gleichen Gen wie die Transkriptionsinitiationsregion oder Promotorregion deriviert werden oder kann von einem anderen Gen deriviert werden.
Gerüstanheftungsregionen (oder "SAR", scaffold attachment regions)) die auch als Matrixanheftungsregionen (oder "MAR", matrix attachment regions) bezeichnet werden und die zur Ausführung der vorliegenden Erfindung verwendet werden, können von jeder beliebigen geeigneten Herkunft sein. Im Allgemeinen kann die SAR eines beliebigen eukaryotischen Organismus (einschließend Pflanzen, Tieren und Hefe) eingesetzt werden, da die SAR unter den Eukaryoten in hohem Maße konserviert sind. Siehe hierzu z. B. M. Eva Luderus et al., Cell 70, 949-959, (1992); G. Hall et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 9320-9324, (1991). Beispielsweise wurde in P. Breyne, The Plant Cell 4, 463-471, (1992) gezeigt, dass Tier-SAR in Pflanzen wirksam sind, während nachfolgend gezeigt wird, dass Hefe-SAR in Pflanzen wirksam sind. Pflanzen-SAR können von jeder beliebigen geeigneten Pflanze genommen werden, einschließlich solcher Pflanzen, die vorstehend und nachfolgend angegeben sind; Tier- SAR können von jedem beliebigen geeigneten Tier einschließlich Säugetiere genommen werden (z. B. Hund, Katze), Vögel (z. B. Huhn, Truthahn), usw.; und es können SAR von anderen Eukaryoten genommen werden, wie beispielsweise Fungi (z. B. Saccharomyces cereviseae). Sofern zwei Gerüstanheftungsregionen zum Einsatz gelangen, können diese gleich oder verschieden sein. Die Länge der SAR ist so lange nicht entscheidend, wie sie ihre Wirksamkeit als eine SAR bewahrt, wobei Längen von 400 bis 1.000 Basenpaaren typisch sind.
Die Transkriptionsinitiationsregion, in der bevorzugt die RNA-Polymerase-Bindungsstelle (Promotor) einbezogen ist, kann natürlicher Herkunft in Bezug auf die zu transformierende Gastpflanze sein oder kann von einer anderen Quelle deriviert sein, wo die Region in dem Gast funktionsfähig ist. Andere Quellen schließen die T-DNA-Gene von Agro-bacterium (Transformation wird nicht unter Verwendung von Agro-bacterium ausgeführt) ein, wie beispielsweise die Transkriptionsinitiationsregionen für die Biosynthese von Nopalin, Octapin, Mannopin, oder andere Opin-Transkriptionsinitiationsregionen, Transkriptionsinitiationsregionen von Pflanzen- oder Holz-bildenden Spezies außer der Gastspezies, Transkriptionsinitiationsregionen von Viren (einschließend gastspezifische Viren) oder teilsynthetische oder vollsynthetische Transkriptionsinitiationsregionen. Transkriptionsinitiationsregionen und Terminationsregionen sind gut bekannt. Siehe hierzu beispielsweise dGreve, J. Mol. Appl. Genet. 1, 499-511, (1983); Salomon et al., Embo J. 3, 141-146, (1984); Garfinkel et al., Cell 27, 143-153, (1983); und Barker et al., Plant Mol. Biol. 2, 235-350, (1983).
In die Transkriptionsinitiationsregion kann nicht nur die RNA-Polymerase-Bindungsstelle einbezogen sein, sondern können auch Regionen einbezogen sein, die die Transkription regulieren, wo die Regulierung beispielsweise eine chemische oder physikalische Repression oder Induktion umfasst (z. B. Regulation auf der Grundlage von Metaboliten oder Licht), oder Regulation auf der Grundlage von Zelldifferentiation, wie beispielsweise in Verbindung mit Blättern, Wurzeln, Samen oder dergleichen. Somit wird die Transkriptionsinitiationsregion oder der regulatorische Abschnitt einer solchen Region von einem entsprechenden Gen erhalten, das reguliert wird, beispielsweise von dem 1,5-Ribulose- Biphosphatcarboxylase-Gen, das lichtinduziert ist und zur Transkriptionsinitiation verwendet wird, von stressinduzierten Genen, von Wärmeschock-Genen, die temperaturreguliert sind, wundinduzierte Gene, pathogeninduzierte Gene, meristemspezifische Gene, Gene von Viren, die auf eine Funktion in Pflanzenzellen spezialisiert sind, usw.,
Strukturgene sind solche Abschnitte von Genen, die ein DNA-Segment aufweisen, das für ein Protein, Polypeptid oder ein Abschnitt davon codierend ist, möglicherweise unter Einbeziehung einer Ribosom-bindenden Stelle und/oder eines Translationsstartcodons, denen jedoch eine Transkriptionsinitiationsregion fehlt. Der Begriff kann sich auch auf Kopien eines Strukturgens beziehen, das auf natürliche Weise im Inneren einer Zelle angetroffen wird, das jedoch künstlich eingeführt worden ist. Das Strukturgen kann ein Protein codieren, das normalerweise in der Pflanzenzelle nicht angetroffen wird, in die das Gen eingeführt wird, oder in Kombination mit der Transkriptionsinitiationsregion, mit der es wirksam verbunden ist, in welchem Fall es als ein heterologes Strukturgen bezeichnet wird. Gene, die wirksam mit einer Transkriptionsinitiationsregion der vorliegenden Erfindung zur Expression in einer Pflanzenspezies verbunden sind, können von einem Chromosomen-Gen, einer cDNA, einem synthetischen Gen oder Kombinationen davon deriviert werden. Es kann jedes beliebige Strukturgen eingesetzt werden. Das Strukturgen kann ein Enzym codieren, um ein angestrebtes Merkmal in die Pflanze einzuführen, wie beispielsweise Glyphosphat-Resistenz; das Strukturgen kann ein Protein codieren, wie beispielsweise ein Bacillus thuringiensis-Protein (oder ein Fragment davon), um der Pflanze eine Widerstandsfähigkeit gegenüber Insekten zu verleihen; das Strukturgen kann ein Pflanzenvirusprotein oder ein Fragment davon codieren, um der Pflanze eine Widerstandsfähigkeit gegenüber eine Virus zu verleihen.
Die Expressionskassette kann in einem DNA-Konstrukt bereitgestellt werden, das auch über mindestens ein Replikationssystem verfügt. Einfacherweise ist es üblich, wenn man über ein in Escherichia coli funktionsfähiges Replikationssystem verfügt, wie beispielsweise Co1E1, pSC101, pACYC184 oder dergleichen. Auf diese Weise kann auf jeder Stufe nach der jeweiligen Manipulation das resultierende Konstrukt geklont werden, sequenziert werden und die Richtigkeit des Eingriffes ermittelt werden. Zusätzlich zum E. coli-Replikationssystem oder anstelle dessen kann ein breites Wirts-Replikationssystem eingesetzt werden, wie beispielsweise die Replikationssysteme der P-1-Inkompatibilitätsplasmide, z. B. pRK290. Zusätzlich zu dem Replikationssystem gibt es häufig mindestens einen vorhandenen Marker, der in einem oder mehreren Wirte nützlich sein kann, oder verschiedene Marker für die einzelnen Wirte. Das bedeutet, dass ein Marker für die Selektion eines prokaryotischen Wirts eingesetzt werden kann, während ein anderer Marker für die Selektion in einem eukaryotischen Wirt eingesetzt werden kann, speziell dem Pflanzenwirt. Die Marker können einen Schutz gegen ein Biozid sein, wie beispielsweise Antibiotika, Toxine, Schwermetalle oder dergleichen; eine Komplementierung vermitteln, indem einen auxotrophen Wirt Prototrophie vermittelt wird; oder durch die Erzeugung einer neuartigen Verbindung in der Pflanze ein sichtbarer Phänotyp verlieren wird. Beispielhafte Gene, die eingesetzt werden können, schließen Neomycin-Phosphotransferase (NPTII) ein, Hygromycin-Phosphotransferase (HPT), Chloramphenicolacetyltransferase (CAT), Nitrilase und das Gentamicin-Resistenzgen. Bei der Pflanzenwirtsselektion sind nicht einschränkende Beispiele für geeignete Marker: β-Glucuronidase, die die Indigoerzeugung gewährt; Luciferase, die die Erzeugung von sichtbarem Licht gewährt; NPTII, die die Kanamycin-Resistenz oder G418-Resistenz gewährt; HPT, die die Hygromycin-Resistenz gewährt; und das mutierte aroA-Gen, das die Glyphosat-Resistenz gewährt.
Die verschiedenen Fragmente, die die verschiedenen Konstrukte, Expressionskassetten, Marker und dergleichen aufweisen, können nacheinander durch Restriktionsenzymspaltung eines entsprechenden Replikationssystems eingeführt werden und durch Insertion des speziellen Konstruktes oder Fragmentes in die verfügbare Stelle. Nach Ligation und Klonen kann das DNA-Konstrukt zur weiteren Verarbeitung isoliert werden. Alle diese Methoden sind in der Literatur umfangreich exemplifiziert worden und finden eine spezielle Exemplifizierung bei Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (2. Ausg., 1989) (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY).
Vektoren, die zum Transformieren von Pflanzengewebe mit DNA-Konstrukten der vorliegenden Erfindung verwendet werden sind Non-Agro-bacterium-Vektoren, insbesondere ballistische Vektoren sowie Vektoren, die für DNA-vermittelte Transformation geeignet sind.
Mikropartikel, die ein DNA-Konstrukt der vorliegenden Erfindung tragen, wobei die Mikropartikel für die ballistische Transformation einer Pflanzenzelle geeignet sind, sind ebenfalls zum Herstellen von transformierten Pflanzen der vorliegenden Erfindung verwendbar. Das Mikropartikel wird in eine Pflanzenzelle getrieben, um eine transformierte Pflanzenzelle zu erzeugen, und es wird aus der transformierten Pflanzenzelle eine Pflanze regeneriert. Bei der Ausführung der vorliegenden Erfindung kann jede geeignete Methode und Apparat zur ballistischen Zelltransformation verwendet werden. Ein beispielhafter Apparat und Prozeduren dafür wurden von Stomp et al. in der US-P-5122466 und von Sandord und Wolf in der US-P-4945050 offenbart. Bei Anwendung der Prozeduren der ballistischen Transformation kann die Expressionskassette in ein Plasmid eingebaut werden, das in der Lage ist, sich in der zu transformierenden Zelle zu replizieren. Beispiele von Mikropartikeln, die zur Verwendung in derartigen Systemen geeignet sind, schließen 1 bis 5 Mikrometer Goldkugeln ein. Das DNA-Konstrukt kann auf dem Mikropartikel mit Hilfe jeder beliebigen geeigneten Methode abgeschieden werden, wie beispielsweise durch Ausfällung.
Pflanzenspezies können mit dem DNA-Konstrukt der vorliegenden Erfindung mit Hilfe der durch DNA-vermittelten Transformation von Pflanzenzellen-Protoplasten und nachfolgender Regeneration der Pflanze aus den transformierten Protoplasten nach den auf dem Gebiet gut bekannten Prozeduren transformiert werden.
Es kann jedes beliebige Pflanzengewebe, das für eine nachfolgende klonale Vermehrung geeignet ist, ob durch Organogenese oder durch Embryogenese, mit einem Vektor der vorliegenden Erfindung transformiert werden. Der hierin verwendete Begriff "Organogenese" bedeutet ein Verfahren, mit Hilfe dessen Sprösslinge und Wurzeln sequentiell von Meristemzentren entwickelt werden; der hierin verwendete Begriff "Embryogenese" bedeutet ein Verfahren, mit Hilfe dessen Sprösslinge und Wurzeln gemeinsam in einer konzertierten Form (nicht sequentiell) ob aus somatischen Zellen oder Gameten entwickelt werden. Das spezielle Gewebe, das gewählt wird, wird in Abhängigkeit von den klonalen Verbreitungssystemen variieren, die für die spezielle Spezies, die transformiert werden soll, verfügbar und am besten geeignet sind. Beispielhafte Gewebetargets schließen Laubblättchen, Pollen, Embryos, Kotyledone, Hypokotyle, Megagametophyten, Kallusgewebe, vorhandenes Meristemgewebe (z. B. Apikahneristeme, Axillarknospen und Wurzelmeristeme) ein sowie induziertes Meristemgewebe (z. B. kotyledones Meristem und hypokotyles Meristem).
Pflanzen der vorliegenden Erfindung können eine Vielzahl von Formen annehmen. Die Pflanzen können chimären von transformierten Zellen und nicht transformierten Zellen sein; die Pflanzen können klonale Transformanten sein (z. B. alle Zellen die transformiert sind und die Expressionskassette enthalten); die Pflanzen können Pfropfungen von transformierten und nicht transformierten Geweben aufweisen (z. B. transformiertes Wurzelmaterial, das auf einem nicht transformierten Pfropfreis in Citrus-Spezies aufgepfropft ist). Die transformierten Pflanzen können mit Hilfe einer Vielzahl von Methoden verbreitet werden, wie beispielsweise klonale Verbreitung oder klassische Aufzuchtmethoden. So kann beispielsweise die erste Generation (oder T1) von transformierten Pflanzen durch Inzucht verbreitet werden, um eine homozygote zweite Generation (oder T2) von transformierten Pflanzen zu ergeben, und die T2-Pflanzen durch klassische Aufzuchtmethoden weiterverbreitet werden. Ein dominanter wählbarer Marker (wie beispielsweise npt II) kann mit der Expressionskassette zur Unterstützung der Aufzucht verbunden werden.
Pflanzen die bei der Ausführung der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden können, schließen ein (ohne jedoch auf diese beschränkt zu sein): Tabak (Nicotiana tabacum), Kartoffel (Solanum tuberosum), Sojabohne (glycine max), Erdnüsse (Arachis hypogaea), Baumwolle (Gossypium hirsutum), Süßkartoffel (Ipomoea batatus), Manniok (Manihot esculenta), Kaffee (Cofea spp.), Kokosnuss (Cocos nucifera), Ananas (Ananas comosus), Citrusbäume (Citrus spp.), Kakao (Theobroma cacao), Tee (Camellia sinensis), Banane (Musa spp.), Avocado (Persea americana), Feige (Ficus casica), Guyave (Psidium guajava), Mango (Mangifera indicn), Olive (Olea europaea), Papaya (Carica papaya), Cashew (Anacardium occidentale), Macadamnuss (Macadamia integrifolia), Mandelbaum (Prunus amygdalus), Zuckerrüben (Beta vulgaris), Mais (Zea mays), Weizen, Gerste, Roggen, Hafer, Reis, Gemüse, Zierpflanzen und Coniferen. In Gemüse sind einbezogen: Tomaten (Lycopersicon esculentum), Salat (z. B. Lactuea sativa), grüne Bohnen (Phaseolus vulgaris), Limabohnen (Phaseolus limensis), Erbsen (Pisum spp.) und Vertreter der Gattung Cucumis, wie beispielsweise die Gurke (C. sativus), Melone (C. cantalupensis) und Zuckermelone (C. melo). In die Zierpflanzen einbezogen sind Azaleen (Rhododendron spp.), Hortensie (Macrophylla hydrangea), Hibiscus (Hibiscus rosasanensis), Rosen (Rosa spp.), Tulpen (Tulipa spp.), Narzissen (Narcissus spp.), Petunien (Petzznia hybrida), Gartennelke (dianthus caryophyllus), Weihnachtsstern (Euphorbia pulcherima) und Chrysantheme. Die Gymnospermen, die zur Ausführung der vorliegenden Erfindung zum Einsatz gelangen können, schließen ein: Coniferen, einschließlich Kiefern, Weihrauchkiefer (Pinus taeda), karibische Kiefer (Pinzzs elliotii), Gelbkiefer (Pinus ponderosa), Drehkiefer (Pinus contorta) und Montereykiefer (Pinus radiata); Douglastanne (Pseudotsuga menziesii); Hemlocktanne (Tsuga canadensis); Sitkalichte (Picea glauca); Mammut (Sequoia sempervirens); echte Tannen, wie beispielsweise Purpurtanne (Abies amabilis) und Balsamtanne (Abies balsamea); sowie Zedern, zum Beispiel Riesenlebensbaum (Thuja plicata) und Nutka-Scheinzypresse (Chamaecyparis nootkatensis).
Die folgenden Beispiele sollen die vorliegende Erfindung veranschaulichen und sind nicht zu ihrer Beschränkung auszulegen.

BEISPIEL 1

ZELL-HALTUNG FÜR DEN BESCHUSS

Es wurden Suspensionskulturen von Nicotinia Tabacum L, Linie NT-1, aus G. An, Washington State University, erhalten. Die Zellen wurden in einem Kultutrmedium aufgezogen, das "Murashige"- und "Skoog"-Salze (GIBCO Laboratories, Grand Island, NY), 100 mg/l Inositol, 1 mg/l Thiamin-HCL, 180 mg/l KH&sub2;PO&sub4;, 30 g/l Saccharose und 2 mg/l 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure enthielt. Der pH-Wert des Kulturmediums wurde vor dem Autoklavieren auf 5,7 eingestellt. Die Zellen wurden einmal pro Woche durch Zusatz von 3 ml Impfmaterial zu 100 ml frischem Kulturmedium in 500 ml-Erlenmeyer-Kolben in Subkultur genommen. Die Kolben wurden in einen Kreiselschüttler bei 125 U/min in eine auf 27ºC eingestellten Wachstumskammer mit konstantem Licht gegeben. Für den Beschuss wurden 4 Tage alte Zellen in der Anfangs-log-Phase verwendet.
Die Zellen wurden für den Beschuss vorbereitet, indem 50 ml zentrifugiert und die Pellets zu einer Konzentration von 1 g/ml erneut suspendiert wurden, die danach auf 0,1 g/ml mit NT-1-Kulturbrühe verdünnt wurden. Die verdünnten Zellen (0,5 ml) wurden auf einer Monoschicht auf José-Papier auf NT-1- Agarträger (2% Agar) in 60 ml · 15 mm Petrischalen ausgestrichen. Diese wurden vor dem Beschuss für 3 Stunden bei Raumtemperatur gehalten.

BEISPIEL 2

PLASMID-DNA UND MIKROPROJEKTIL-BESCHICHTUNG

Das β-Glucuronidase (GUS)-Gen wurde für die Messung der Expression und das Neomycinphosphat-Transferase-Gen (nptII), wurde für die Selektion für eine stabile Transformation verwendet. Die in diesen Transformationsversuchen verwendeten Plasmide sind in der nachfolgenden Tabelle I zusammengestellt. Alle Plasmide wurden in den Bakterienstamm Escherichia coli DH5 alpha amplifiziert und mit Hilfe des Qiagen-Plasmidsatzes MAXIPREPTM isoliert. Bei jeder der Co- Transformations-Plasmidmischungen betrug das Molverhältnis von GUS-Gene zu nptII-Gen 4 : 1. Die DNA- Mischungen wurden mit 1,0 um Gold-Mikroprojektilen unter Verwendung einer CaCl&sub2;/Spermidin- Ausfällung zusammengebracht.

TABELLE 1: PLASMID-ÜBERSICHT

PLASMID BESCHREIBUNG

pGA-1 Das EcoR1-Fragment, das die TRP/ARS-1-Gerüstanheftungsregion von yRP7 enthält (B. Amati und 5. Gasser, Cell 54: 967-978 (1988)) wurde in die einzige EcoR1-Stelle in den pJKK mf (1) (J. Kirschman und J. Cramer, Gene 68: 163-165 (1988)) als Vektor- Polylinker geklont.
pGCA-3 Das HindIII-Fragment von pGA-1, welches das ARS-1 enthält, wurde in die einzige HindIII-Stelle in dem von Stratagene erworbenen Bluescribt pBSM13 (-)-Vektor geklont.
pGCA8 Identisch mit pGCA3 mit der Ausnahme, dass die EcoR1-Stellen mit Mung-Bean- Nuclease zerstört und erneut ligiert worden sind.
pGCA6 EcoR1-Fragment von WPF144 (von W. Fitzmaurice), das den CaMV 35S Promotor enthält, treibt das Dihydrofoliat-Reduktase (dhfr)-Gen mit einem NOS-Terminator geklont in die einzige EcoR1-Stelle von pBI221.
pGCA12 Pst1/Kpn1-Fragment von pGCA6, welches den CaMV 35S Promotor enthält, treibt das GUS-Gen mit einem Nopalin-Synthase-Terminator und CaMV35S Promotor treibt das dhfr-Gen mit einem geklonten NOS-Terminator in die Pst1/Kpn1-Stelle des Bluescript II KS-Vektor-Polylinker. Bluescript II wurde von Stratagene erworben. Die BSSH2-Stelle in dem NOS-Terminator des GUS-Gens wurde ebenfalls mit Mung-Bean-Nuclease zerstört.
pGCA776 Xbal-Fragment von pGCA8, welches ARS-1 enthält, wurde in die einzige Spe-Stelle von pGCA12 geklont. Dieses führte in ARS-1 zu einer korrekten Orientierung an dem 5'- Ende des Fragmentes, das den CaMV355 Promotor enthält, welches das GUS-Gen mit einem NOS-Terminator antreibt, und einen CaMV35S Promotor enthält, der das dhfr-Gen mit einem NOS-Terminator antreibt.
pGCA887 HindIII/Sal 1-Fragment von pGCA8, welches das ARS-1 enthält, geklont in die HindIII/Sal 1-Stelle in dem Polylinker von Bluescript pBC KS(+)-Vektor, erworben von Stratagene. Das resultierende Plasmid verfügt über das ARS-1 flankierende einzigartige, multiple Klon-Restriktionsstellen.
pBI221 Das HindIII/EcoR1-Fragment von pBII21 (R. Jefferson et al., EMBO J. 6: 3901-3907 (1987)), das den CaMV35S Promotor enthält, welcher das GUS-Gen mit einem NOS- Terminator antreibt, wurde in pUC19 geklont. Dieser Vektor wurde von Clontech erworben. Dieses Expressionsplasmid ist schematisch in Fig. 1A dargestellt.
pGCA905 NOT I/EcoR1-Fragment von pGCA776, das den CaMV35S Promotor enthält, der das GUS-Gen mit einem NOS-Terminator treibt, und den CaMV35S Promotor enthält, der das dhfr-Gen mit einem NOS-Terminator treibt, geklont in die NOT I/EcoR1-Stelle in dem pBC KS(+)-Vektor, erworben von Stratagene. Das resultierende Plasmid verfügt über ARS-1 in korrekter Orientierung 5' des GUS-Indikatorgens. Dieses Expressionsplasmid ist schematisch in Fig. 1B dargestellt.
pGCA1055 EcoR1/SacII-Fragment von pGCA12, das den CaMV35S Promotor enthält, der das GUS- Gen mit einem NOS-Terminator treibt, geklont in das einzige EcoR1/SacII von pGCA887. Das resultierende Plasmid verfügt über ARS-1 in korrekter Orientierung 3' des GUS-Indikatorgens. Dieses Expressionsplasmid ist schematisch in Fig. 1 dargestellt.
pGCA984 EcoR1/SacII-Fragment von pGCA776, das den ARS-1 in 5' des CaMV35S Promotors enthält, der das GUS-Gen mit einem NOS-Terminator treibt, geklont in die einzige EcoR1/SacII-Stelle von pGCA887. Das resultierende Plasmid verfügt über ARS-1 in korrekter Orientierung, welches das GUS-Indikatorgen flankiert. Dieses Expressionsplasmid ist schematisch in Fig. 1D dargestellt.
pUCNK1 Dieses Plasmid (L. Herrera-Estrella et al., in Plant Molecular Biology Manual B1: 1-22 (S. Gelvin und R. Schilperoot, Herausg. 1988)) enthält einen Nopalin-Synthasepromotor (NOS), der die Neomycin-Phosphotransferase (nptII) mit einem Octapin- Synthaseterminator treibt. Die Expression dieses Plasmids vermittelt eine Kanamycin- Resistenz in Pflanzenzellen. Dieses Selektionsplasmid ist schematisch in Fig. 1E dargestellt.

BEISPIEL 3

TEILCHENBESCHLEUNIGER

In allen Mikroprojektil-Beschussversuchen wurde eine "biolistische" Vorrichtung DuPont PDS- 1000 entsprechend der Beschreibung des Herstellers verwendet. Kurz zusammengefasst wurden die Targetzellen unterhalb der Mikroprojektile angeordnet und die Kammer evakuiert. Die Hochdruckkammer wurde bis 1 · 10&sup7; Pa (1.500 psi) mit Heliumgas unter Druck gesetzt, bei dem ein Plättchen berstet. Die resultierende Stosswelle drückt ein mit den Mikroprojektilen beschichtetes Kapton-Plättchen auf ein Stahlsieb. Die zuvor mit der DNA entsprechend der Beschreibung in dem vorstehenden Beispiel 2 beschichteten Gold-Mikroprojektile setzten ihren Weg fort, um die NT-1-Zellen zu durchdringen.

BEISPIEL 4

GEWINNUNG UND HISTOCHEMISCHES SCREENING VON STABILEN TRANSFORMANTEN

Nach dem Beschuss wurden die Petriplatten mit Parafilm versiegelt und für 24 Stunden bei 27ºC unter konstanter Beleuchtung inkubiert. Das José-Papier wurde sodann vorsichtig entfernt und auf frische NT-1-Agarplatten übertragen, die 300 ug pro ml Kanamycin enthielten. Innerhalb von näherungsweise 3 Wochen begannen sich Kanamycin-resistente Mikrokalli zu zeigen. Die isolierten Mikrokalli wurden sodann in frisches NT-1-Agar übertragen, das 300 ug pro ml Kanamycin enthielt. Es wurden Bruchstücke der Mikrokalli entfernt und in sterile Mikrozentrifugenröhrchen gegeben. Danach wurden die Mikrokalli einem histochemischen Screening unterzogen, indem 200 ul 5-Brom-3-chlor-3-indolyl-β-D-glucuronsäure (X-gluc) zugesetzt wurden und für 24 Stunden bei 37ºC inkubiert wurde. Die Ergebnisse (Daten nicht gezeigt) zeigten, dass das in Fig. 1D dargestellte Doppel-SAR-Konstrukt im Vergleich zu den anderen Konstrukten höhere Werte der Genexpression liefert und den prozentualen Anteil oder die Fraktion von Transformanten mit detektierbarer Expression des GUS-Indikatorgens erhöht. Beide einzelne SAR- Konstrukte (Fig. 1B; Fig. 1C) erzeugten mittlere GUS-Expressionswerte, während, wenn kein SAR vorhanden war, die Expressionswerte extrem gering waren.
Die vorstehend ausgeführten Beispiele dienen zur Veranschaulichung der vorliegenden Erfindung und sind nicht zu ihrer Beschränkung auszulegen.

Claims

1. Verfahren zum Herstellen von rekombinanten Pflanzenzellen mit erhöhter Expression von Fremdgenen darin, wobei das Verfahren umfaßt:

zur Verfügung stellen einer Pflanzenzelle, fähig zur Regenerierung,

Transformieren der Pflanzenzelle mit einer DNA Konstrukt, umfassend in der 5' bis 3' Richtung eine Transcriptionsinitiationsregion, funktionell in Pflanzenzellen, ein Strukturgen, angeordnet stromabwärts von der Transcriptionsinitiationsregion und wirksam damit verbunden und eine Gerüstanheftungsregion, angeordnet entweder 5' zu der Transcriptionsinitiationsregion oder 3' zu dem Strukturgen, wobei das DNA Konstrukt unter dem Vorbehalt ist, daß T-DNA Grenzen davon ausgeschlossen sind,

wobei Expression des Strukturgens erhöht ist im Vergleich zu derjenigen, die in der Abwesenheit der Gerüstanheftungsregionen auftreten würde.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Konstrukt umfaßt in der 5' bis 3' Richtung eine erste Gerüstanheftungsregion, eine Transcriptionsinitiationsregion, ein Strukturgen, angeordnet stromabwärts von der Transcriptionsinitiationsregion und wirksam damit verbunden, und eine zweite Gerüstanheftungsregion.

3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Transformationsstufe durchgeführt wird durch Bombardieren der Pflanzenzelle mit Mikroteilchen, die die Expressionskassette tragen.

4. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Pflanzenzelle auf einem Pflanzengewebe, wirksam zur Regenerierung, beruht.

5. Verfahren nach Anspruch 1, ferner umfassend die Stufe von Regenerieren von Sprößlingen aus den transformierten Pflanzenzellen.

6. Verfahren nach Anspruch 1, ferner umfassend die Stufe von Regenerieren von Wurzeln aus den transformierten Pflanzenzellen.

7. Verfahren nach Anspruch 1, ferner umfassend die Stufe von Regenerieren einer Pflanze aus den transformierten Pflanzenzellen.

8. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Pflanzenzellen Einkeimblattzellen sind.

9. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Pflanzenzellen Zweikeimblattzellen sind.

10. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Pflanzenzellen Gymnospermepflanzenzellen sind.

11. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die ersten und zweiten Gerüstanheftungsregionen Hefegerüstanheftungsregionen sind.

12. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die ersten und zweiten Gerüstanheftungsregionen Pflanzengerüstanheftungsregionen sind.

13. DNA Konstrukt, umfassend eine Expressionskassette, wobei das Konstrukt umfaßt in der 5' bis 3' Richtung eine Transcriptionsinitiationsregion, ein Strukturgen, angeordnet stromabwärts von der Transcriptionsinitiationsregion und wirksam damit verbunden, und eine Gerüstanheftungsregion, angeordnet entweder 5' zu der Transcriptionsinitiationsregion oder 3' zu dem Strukturgen, wobei die Expressionskassette voraussetzt, daß T-DNA Grenzen davon ausgeschlossen sind.

14. DNA Konstrukt nach Anspruch 13, wobei das Konstrukt umfaßt in der 5' bis 3' Richtung eine erste Gerüstanheftungsregion, eine Transcriptionsinitiationsregion, ein Strukturgen, angeordnet stromabwärts von der Transcriptionsinitiationsregion und wirksam damit verbunden, und eine zweite Gerüstanheftungsregion.

15. DNA Konstrukt nach Anspruch 13, getragen von einem Pflanzentransformationsvektor.

16. DNA Konstrukt nach Anspruch 14, wobei die ersten und zweiten Gerüstanheftungsregionen Hefegerüstanheftungsregionen sind.

17. DNA Konstrukt nach Anspruch 14, wobei die ersten und zweiten Gerüstanheftungsregionen Pflanzengerüstanheflungsregionen sind.

18. Pflanzenzelle, enthaltend ein DNA Konstrukt nach Anspruch 13.

19. Zweikeimblättrige Pflanzenzelle, enthaltend ein DNA Konstrukt nach Anspruch 13.

20. Einkeimblättrige Pflanzenzelle, enthaltend ein DNA Konstrukt nach Anspruch 13.

21. Gymnospermenpflanzenzelle, enthaltend ein DNA Konstrukt nach Anspruch 13.

22. Rekombinante Pflanze, umfassend transformierte Pflanzenzellen, wobei die transformierten Pflanzenzellen ein heterologes DNA Konstrukt, umfassend eine Expressionskassette, enthalten, wobei das Konstrukt umfaßt in der 5' bis 3' Richtung eine Transcriptionsinitiationsregion, ein Strukturgen, angeordnet stromabwärts von der Transcriptionsinitiationsregion und wirksam damit verbunden, und eine Gerüstanheftungsregion, angeordnet entweder 5' zu der Transcriptionsinitiationsregion oder 3' zu dem Strukturgen, wobei die Expressionskassette voraussetzt, daß T-DNA Grenzen davon ausgeschlossen sind.

23. Rekombinante Pflanze nach Anspruch 22, wobei das Konstrukt umfaßt in der 5' bis 3' Richtung eine erste Gerüstanheftungsregion, eine Transcriptionsinitiationsregion, ein Strukturgen, angeordnet stromabwärts von der Transcriptionsinitiationsregion und wirksam damit verbunden, und eine zweite Gerüstanheftungsregion.

24. Rekombinante Pflanze nach Anspruch 23, wobei die ersten und zweiten Gerüstanheftungsregionen Hefegerüstanheftungsregionen sind.

25. Rekombinante Pflanze nach Anspruch 23, wobei die ersten und zweiten Gerüstanheftungsregionen Pflanzengerüstanheftungsregionen sind.

26. Rekombinante Pflanze nach Anspruch 23, ferner umfassend eine Terminationssequenz, angeordnet stromabwärts von dem Strukturgen und wirksam damit verbunden, wobei die Terminationssequenz 5' zu der zweiten Gerüstanheftungsregion angeordnet ist.

27. Rekombinante Pflanze nach Anspruch 22, wobei die Pflanze ein Einkeimblatt ist.

28. Rekombinante Pflanze nach Anspruch 22, wobei die Pflanze ein Zweikeimblatt ist.

29. Rekombinante Pflanze nach Anspruch 22, wobei die Pflanze ein Zweikeimblatt, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Tabak, Kartoffel, Sojabohne, Erdnüssen, Baumwolle und Pflanzenernten ist.

30. Rekombinante Pflanze nach Anspruch 22, wobei die Pflanze eine Gymnosperme ist.