DE69400807T2

DE69400807T2 - Bausteine mit carbamate luternukleosidverbindungen und oligonukleotide abgeleitet davon

Info

Publication number: DE69400807T2
Application number: DE69400807T
Authority: DE
Inventors: Sudhir Agrawal; Ivan Habus
Original assignee: Hybridon Inc
Current assignee: Aceragen Inc
Priority date: 1993-07-28
Filing date: 1994-07-27
Publication date: 1997-04-03
Anticipated expiration: 2014-07-28
Also published as: US6605708B1; FI960375A0; CN1131951A; CA2167679A1; DK0711302T3; FI960375A7; DE69400807D1; NO960304D0; KR960703938A; GR3021955T3; AU7552894A; FI960375L; ES2096484T3; WO1995004066A1; EP0711302B1; NO960304L; JPH09503494A; EP0711302A1; AU682533B2; ATE144525T1

Description

Die Erfindung bezieht sich auf synthetische Oligonucleotide, insbesondere bezieht sich die Erfindung auf synthetische Oligonucleotide mit modifizierten Internucleosidbindungen, die Resistenz gegenüber nucleolytischem Abbau verleihen.
In den letzten Jahren bestand erhebliches Interesse in der Verwendung von synthetischen Oligonucleotiden als Modulatoren der Genexpression, siehe z.B. Agrawal, Trends in Biotechnology, 1992, 10:152-158. Zumindest ein Teil des Interesses war gerichtet auf die Entwicklung von modifizierten Oligonucleotiden mit größerer Resistenz gegenüber nucleolytischem Abbau, als ihn konventionelle Oligonucleotidphosphodiester aufweisen. Eingeschlossen in solchen Oligonucleotiden sind chimere Oligonucleotide mit verschiedenen Typen von modifizierten Internucleosidbindungen. Zum Beispiel beschreibt Pederson et al. im US-Patent Nr. 5,149,797 chimere Oligonucleotide mit Regionen, die RNase H aktivieren und Regionen, die RNase H nicht aktivieren.
Unter den modifizierten Internucleosidbindungen, die in Oligonucleotide eingebaut worden sind, befinden sich Bindungen auf Phosphat-Basis und Nicht-Phosphat-Basis. Die erste Gruppe schließt unter anderen die bekannten Phosphorothioat-, Phosphorodithioat-, Methylphosphonat- und Phosphoramidatbindungen ein. Die letztgenannte Gruppe schließt Sulfon-, Sulfat- und Carbamatbindungen ein. Solche Bindungen modifizieren Oligonucleotide in einer Art und Weise, die die Oligonucleotide in ihren Fähigkeiten beeinflussen, nucleolytischem Abbau zu widerstehen, normale Wasserstoffbindung und Basen-Stapelung einzugehen, die komplementäre Zielnucleinsäure zu binden und durch Zellen aufgenommen zu werden.
Bestimmte Typen von Carbamat-Internucleosidbindungen sind bekannt. Gait et al., J. Chem. Soc., Perkin, 1974, I:1684-1686 beschreiben als erste ein Dinucleotid, enthaltend eine Carbamat-Internucleosidbindung der Struktur 5'-Nucleosid-3'-OCONH-5'-Nucleosid- 3'. Mungall und Kaiser, J. Org. Chem., 1977, 42:703-706, beschreiben die Synthese von modifizierten Dinucleotiden und Trinucleotiden mit Carbamatbindungen derselben Struktur. Coull et al., Tetrahedron Lett., 1987, 28:745-748 beschreiben, daß ein hexameres Oligonucleotidcarbamat mit der gleichen Internucleosidbindung keine Basenstapelung eingeht, obwohl deren Größe und Form keine sterische Hinderung bilden sollten. Stirchak et al., Nucleic Acids Res., 1989, 17:6129-6142 beschreiben, daß ein hexameres Poly-C-morpholinoligonucleotidcarbamat mit der gleichen Internucleosidbindung und komplementären Poly(dG) eher einen Multistrangkomplex bilden als einen Watson-Crick-Doppelstrang. Wang und Weller, Tetrahedron Lett., 1991, 32:7385-7388 beschreiben die Festphasensynthese von Oligonucleotiden oder Morpholinoligonucleotidcarbamaten mit der gleichen Internucleosidbindung.
Obwohl Carbamatoligonucleotide aufgrund ihrer Stabilität über einen breiten pH-Bereich und ihrer Resistenz gegenüber enzymatischem Abbau für die Verwendung als Modulatoren der Genexpression von Interesse sind, kann die Abwesenheit der Basenstapelung und die Bildung von Multistrangkomplexen durch unbekannte Mechanismen diese Verwendung aus praktischen Gründen hindern. Es besteht daher ein Bedarf für neue Bindungen mit ähnlicher Resistenz gegenüber Abbau, aber ohne eine Behinderung der Fähigkeit der Oligonucleotide zumindest in einigen Konfigurationen Basenpaarstapelungen einzugehen, ohne die Doppelhelix signifikant zu destabilisieren, die zwischen Oligonucleotid und seiner komplementären Zielnucleinsäure gebildet wird.
Die Erfindung stellt neue Bausteine für die Oligonucleotidsynthese, enthaltend eine neue Carbamatbindung, bereit. Die Carbamatbindung in den erfindungsgemäßen Bausteinen und Oligonucleotiden haben die Struktur 5'-Nucleosid-3'-NHCOO-5'-Nucleosid-3'. Dies ist die gegenteilige Struktur der bekannten Carbamatinternucleosidbindungen. Anders als bekannte Carbamat-verbundene Oligonucleotide unterziehen sich überraschenderweise die Oligonucleotide mit dieser neuen Carbamatbindung der Basenstapelung. Außerdem ist die Stabilität der Doppelhelices, umfassend die erfindungsgemäßen Oligonucleotide, nicht signifikant beeinträchtigt, wenn die neuen Carbamatbindungen in bestimmten bevorzugten Positionen innerhalb der Oligonucleotide vorhanden sind.
In einem ersten Aspekt stellt die Erfindung dimere, trimere und tetramere Bausteine bereit, in denen mindestens zwei Nucleoside durch die neue Carbamatbindung 5'-Nucleosid-3'- NHCOO-5'-Nucleosid-3' verknüpft sind. Bevorzugt haben diese Bausteine geeignete Schutzgruppen oder Leaving-Gruppen für die Oligonucleotidsynthese an ihren 5'- und 3'- Enden. Diese Bausteine können leicht durch Arbeiten in Lösung hergestellt werden und können genauso wie die geschützten, gegenwärtig für die Festphasenoligonucleotidsynthese verwendeten Monomere, für die Oligonucleotidsynthese verwendet werden. Die erfindungsgemäßen Bausteine sind nützlich für den Zusammenbau von Oligonucleotiden mit neuen Carbamatinternucleosidbindungen an verschiedenen Positionen innerhalb des Oligonucleotids.
In einem zweiten Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zur Verwendung der erfindungsgemäßen Bausteine zur Synthese von Oligonucleotiden mit neuen Carbamatverbindungen bereit. In diesem Aspekt werden konventionelle Oligonucleotidsyntheseverfahren mit den erfindungsgemäßen Bausteinen ausgenutzt.
In einem dritten Aspekt stellt die Erfindung neue Oligonucleotide mit der Carbamatinternucleosidbindung 5'-Nucleosid-3'-NHCOO-5'-Nucleosid-3', an einer oder mehreren Positionen innerhalb des Oligonucleotids bereit. Diese Oligonucleotide werden leicht synthetisiert unter Verwendung konventioneller Festphasenchemie, aber unter Verwendung dimerer, trimerer oder tetramerer erfindungsgemäßer Bausteine während eines oder mehrerer Zyklen der Synthese. Die Oligonucleotide sind gemäß bestimmter Ausführungsformen der Erfindung nützlich zum Studium des positionsabhängigen Effekts von Carbamatinternucleosidbindungen auf die Destabilisierung einer Doppelhelix. In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Oligonucleotide sind die neuen Carbamatbindungen in Positionen, die nicht zu einer signifikanten Destabilisierung der Doppelhelix-Bildung zwischen dem Oligonucleotid und einer komplementären Zielnucleinsäure führen. Besonders bevorzugt sind diese neuen Carbamatbindungen in Positionen, in denen sie dem Oligonucleotid gesteigerte Resistenz gegenüber nucleolytischem Abbau verleihen. Oligonucleotide gemäß dieser Ausführungsform sind nützlich für die Modulierung der Genexpression, sowohl in in vitro-experimentellen Systemen als auch bei der therapeutischen Verwendung für pflanzliche-, tierische- oder menschliche Krankheiten.
Figur 1 zeigt die allgemeine Struktur eines dimeren erfindungsgemäßen Bausteins. Trimere und tetramere Bausteine haben eine ähnliche Struktur.
Figur 2 zeigt das allgemeine Schema für die Synthese eines Dinucleosidcarbamatbausteins entsprechend der Erfindung.
Figur 3 zeigt die Umwandlung eines Dinucleosidcarbamatbausteins in sein Phosphoramiditderivat.
Figur 4 zeigt Beispiele von Dinucleosid-, Trinucleosid- und Tetranucleosidcarbamatintermediaten und -Bausteinen. Die Zahlen unter jeder Verbindung entsprechen den Zahlen jeder Verbindung in Beispiel 1.
Die Erfindung betrifft synthetische Oligonucleotide mit modifizierten Internucleosidbindungen, die Resistenz gegenüber nucleolytischem Abbau verleihen. Die Erfindung stellt Bausteine, die eine neue Carbamat-Internucleosidbindung enthalten, ein Verfahren zur Verwendung dieser Bausteine zum Zusammenbau von Oligonucleotiden und Oligonucleotide, die die neuen Carbamat-Internucleosidbindungen enthalten, bereit.
In einem ersten Aspekt stellt die Erfindung neue Bausteine zum Zusammenbau von Oligonucleotiden bereit, die eine neue Carbamat-Internucleosidbindung enthalten. Erfindungsgemäße Bausteine haben zwei, drei oder vier Nucleoside, die durch eine neue Carbamat-Internucleosidbindung mit der Struktur 5'-Nucleosid-3'-NHCOO-5'-Nucleosid- 3', der entgegengesetzt zu bekannten Carbamat-Internucleosidbindungen ist, verknüpft sind. Die allgemeine Struktur einer Ausführungsform eines erfindungsgemäßen dimeren Bausteins ist in Figur 1 gezeigt. Zur Vereinfachung der Zahl der zu veranschaulichenden Verbindungen werden in den nachstehenden Beispielen nur Bausteine mit 5'-Thymidinnucleosiden dargestellt. Jedoch kann die Base des 5'- oder 3'-Nucleosids jedes Purin oder Pyrimidin oder jedes Analogon hiervon sein, das fähig zur Basenpaarung in einer Watson- Crick-Doppelhelix oder Hoogsteen-Trippelhelix ist. Die Nucleoside können Ribonucleoside oder Desoxyribonucleoside sein. Wie in Figur 1 gezeigt, ist der Rest R&sub1; oder R&sub2; bevorzugt eine Hydroxylgruppe, eine säurelabile Schutzgruppe wie eine Dimethoxytrithyl, eine basisch-labile Schutzgruppe wie eine Levulinylgruppe oder eine Leaving-Gruppe wie ein Phosphotriester, eine H-Phosphonat- oder eine Phosphoramiditgruppe, besonders bevorzugt eine Betacyanoethylphosphoramiditgruppe. Besonders bevorzugt werden die Kombinationen von den Resten R&sub1; und R&sub2; innerhalb eines bestimmten Bausteins ausgewählt aus den in der nachstehenden Tabelle 1 gezeigten. TABELLE 1 BEVORZUGTE STRUKTUR DER BAUSTEINE
Erfindungsgemäße trimere und tetramere Bausteine haben im wesentlichen die gleiche Struktur wie vorstehend für dimere Bausteine beschrieben.
Die Synthese der erfindungsgemäßen Bausteine wird typischerweise durch Umsetzung von mono-, di- oder trimeren Nucleosid-5'-O-p-nitrophenylcarbonatintermediaten mit 3'- Amino-3'-desoxythymidin (oder 3'-Amino-3'-desoxyuridin) ausgeführt, wobei die Umsetzung regiospezifisch an der 3'-Aminogruppe erfolgt. Die erhaltenen Bausteine werden dann an der 5'-Position mit Dimethoxytrityl (DMT) geschützt. Es folgt die Hydrolyse des 3'- Acetylrestes in Ammoniak unter Bildung eines 3'-Hydroxylrests. Die Bausteine werden dann durch Standardverfahren in die entsprechenden 3'-Phosphoramidite umgewandelt.
In den hier beschriebenen Syntheseverfahren wurden organische Chemikalien in organischer Synthese- und HPLC-Reinheit verwendet. Wasserfreie Lösungsmittel wurden von Aldrich und Fisher Scientific Co. bezogen. 3-H-1,2-Benzodithiol-3-on-1,1-dioxid wurde von R.I. Chemical Inc. erhalten und als eine Lösung von 1 g in 100 ml Acetonitril verwendet. TLC wurde auf Merck's DC-Alufolien mit Kieselgel 60F-254 und Säulenchromatographie an Kieselgel (Silica gel 60, 230-400 mesh ASTM, Merck) durchgeführt. Die detailliertere Veranschaulichung dieser Syntheseverfahren ist in dem nachstehenden Beispiel 1 gezeigt.
In einem zweiten Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zur Verwendung der erfindungsgemäßen Bausteine zum Zusammenbau von Oligonucleotiden, die eine oder mehrere neue Carbamatbindung(en) enthalten, bereitgestellt. In einem Beispiel dieses Verfahrens werden Bausteine direkt kovalent an eine geeignete Festphasenträgermatrix gebunden. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Trägermatrix (CPG). Der Carboxylrest ist direkt mit dem 3'-Hydroxylrest des Bausteins verestert. In dieser Ausführungsform sind eine bis drei neue Carbamatbindungen an der Internucleosidposition in dem synthetisierten Oligonucleotide eingeführt, die dem 3'-Terminus am nächsten ist. Abhängig von der Natur der zu synthetisierenden Oligonucleotide können zusätzliche neue Carbamat-Internucleosidbindungen in Gruppen von einer bis drei anderen Stellen innerhalb des Oligonucleotids unter Verwendung der erfindungsgemäßen Bausteine eingeführt werden. Zusätzliche oder alternative Phosphordiester-, Phosphorothioat-, Phosphorodithioat-, Alkylphosphonat-, Alkylphosphonothioat- und Phosphoamidatbindungen oder andere bekannte Internucleosidbindungen können an jeder anderen Position innerhalb des Moleküls eingeführt werden unter Verwendung bekannter Festphasenverfahren. In alternativen Ausführungsformen können erfindungsgemaße Bausteine zur Einführung neuer Carbamatbindungen in ein Oligonucleotid an verschiedenen Positionen verwendet werden, ohne solche Bindungen an den am nächsten am 3'-Ende gelegenen Internucleosidpositionen einzuführen. Dies wird erreicht, indem die Bausteine nicht direkt an die feste Trägermatrix angeheftet werden, sondern an die wachsende Oligonucleotidkette, die unter Verwendung anderer Typen von Bausteinen wie Nucleosidphosphoramiditmonomere iniziiert worden ist, angebracht werden.
Im allgemeinen wird das Verfahren der Verwendung der erfindungsgemäßen Bausteine zum Zusammenbau von Oligonucleotiden, die neue Carbamat-Internucleosidbindungen enthalten, nach bekannten konventionellen Verfahren ausgeführt, jedoch unter Verwendung der di-, tri- oder tetrameren Bausteine. Die Phosphoramidit-Methode ist besonders bevorzugt und hier exemplarisch dargestellt. Jedoch können andere bekannte Methoden wie die H- Phosphonat-Methode, beschrieben in der US-PS 5,149,798, verwendet werden. Auch die bekannte Phosphotriester-Methode kann mit den erfindungsgemäßen Bausteinen ausgeführt werden. In diesen Fällen werden die erfindungsgemäßen Bausteine derivatisiert, um die entsprechenden Di-, Tri- oder Tetranucleotid-H-phosphonate- oder -phosphotriester zu bilden unter Verwendung der gleichen bekannten Verfahren, die gegenwärtig verwendet werden, um Nucleosidmonomere zu derivatisieren, um die korrespondierenden Nucleosid-H- phosphonate oder -phosphotriester zu bilden. Die Bausteine werden dann verwendet um Oligonucleotide zusammenzubauen in den bekannten H-Phosphonat- oder Phoshotriesterverfahren.
In einem dritten Aspekt stellt die Erfindung synthetische Oligonucleotide bereit, die neue Carbamat-Internucleosidbindungen an einer oder mehreren Internucleosidpositionen innerhalb des Oligonucleotids enthalten. Diese Oligonucleotide haben vorzugsweise eine Länge von etwa 8 bis etwa 100 Nucleotiden. Die Nucleotide können Ribonucleotide oder Desoxyribonucleotide sein. Für jedes gegebene Oligonucleotid kann die maximale Anzahl der neuen Carbamat-Internucleosidbindungen, die anwesend sein können, kalkuliert werden durch die Gleichung n = 3x, wobei n die Anzahl der neuen Carbamatbindungen im Oligonucleotid darstellt und x die Anzahl der Bausteine ist, die zum Zusammenbau des Oligonucleotids verwendet werden. Somit ist die maximale Anzahl von neuen Carbamat-Internucleosidbindungen in einem 100-mer 75, basierend auf dem Zusammenbau unter Verwendung von 25 erfindungsgemäßen tetrameren Bausteinen.
In einer bevorzugten Ausführungsform haben die erfindungsgemäßen Oligonucleotide neue Carbamatbindungen nur an ihrer/ihren Internucleosidposition(en), die am nächsten am 3'- Ende gelegen ist. Besonders bevorzugt sind solche Oligonucleotide, die neue Carbamatbindungen nur an ihrer ersten, zweiten und/oder dritten Internucleosidposition haben, die am nächsten am 3'-Ende gelegen sind. Oligonucleotide gemäß dieser Ausführungsform sind stärker resistent gegenüber nucleolytischem Abbau als konventionelle Oligonucleotide und fähig zur Teilnahme an der Wasserstoffbrückenbindung, Basenstapelung und Doppelhelixbildung. Entsprechend sind die Oligonucleotide gemäß dieser Ausführungsform nützlich als Antisense oder Antigenagenzien, wenn sie eine Nucleotidsequenz haben, die unter physiologischen Bedingungen mit einer Nucleinsäure von einem Virus, einem prokaryontischen oder eukaryontischen pathogenen Organismus oder einem zellulären Gen oder einer die Genexpression kontrollierenden Region hybridisieren. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform enthalten diese Oligonucleotide zusätzliche modifizierte Internucleosidbindungen, die die Nucleaseresistenz des Oligonucleotids weiter erhöhen, ohne ihre Fähigkeit der Doppelstrangbildung zu beeinflussen. Diese Internucleosidbindungen können ausgewählt werden von jeder der bekannten modifizierten Bindungen, vorzugsweise Phosphorothioat-, Phosphorodithioat-, Alkylphosphonat-, Alkylphosphonothioat- oder Phosphoramidatbindungen oder jeder Kombination von diesen und besonders bevorzugt Phosphorothioat-Internucleosidbindungen.
Die folgenden Beispiele beschreiben bestimmte bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung. Sie sind nicht einschränkend aufzufassen.

BEISPIEL 1

Synthese von dimeren, trimeren oder tetrameren Bausteinen enthaltend ausschließlich als Internucleosidbindungen die neuen Carbamatbindungen 5'-Nucleosid-3'-NHCOO-5'-Nucleosid-3'

Synthese von 3'-Amino-3'-desoxythymidin wurde ausgeführt nach dem Standard-Hybridisierungsverfahren unter Verwendung von 3'-Azido-3'-desoxythymidin mit Pd/C-10% Pd als Katalysator und Methanol als Lösungsmittel. p-Nitrophenyl-3'-O-acetyldesoxythymidin- 5'-carbonat wurde nach bekannten Verfahren hergestellt, siehe z.B. Stirchak und Summerton, J. Org. Chem., 1987, 52:4202; Mungell und Kaiser, J. Org. Chem., 1977, 42:703 in einer Umsetzung von 3'-O-Acetyldesoxythymidin mit bis-(p-Nitrophenyl-)-carbonat.
Zuerst wurde 3'-Amino-3'-desoxythymidylyl-(3'-5'-carbamoyl)-3'-O-acetyldesoxythymidin, 1, synthetisiert. Das allgemeine Schema für diese Synthese ist in Figur 2 gezeigt. p- Nitrophenyl-3'-acetyldesoxythymidin-5'-carbonat (324,68 mg; 0,72 mmol) und 3'-Amino- 3'-desoxythymidin (122,87 mg; 0,50 mmol) wurden in 5 ml wasserfreiem Pyridin bei Raumtemperatur aufgelöst. Das Reaktionsgemisch wurde über Nacht unter Stickstoff gerührt. Das Lösungsmittel wurde unter reduziertem Druck entfernt. Der Rückstand wurde der Flash-Säulenchromatographie an Kieselgel unter Verwendung eines Gemisches von Methylenchlorid und Methanol in einem Verhältnis von 23:2 als Elutionsmittel unterzogen. Das Produkt wurde als weißer Feststoff erhalten, 276,6 mg (99%).
IR (KBr): 3500-2800; 1700; 1550; 1500; 1300; 1100; 800 cm&supmin;¹. ¹H-NMR (DMSO; δ in ppm): 1.70 (s, 6H; 2xCH&sub3;); 2.10 (s, 3H; CH&sub3;); 2.10-2.40 (m, 4H; H-2'+H-2"); 3.40-370 (m, 2H; H-4'+H-4"); 3.80 (bs, 1H; OH); 4.00-4.30 (m, 4H; H- 5'+H-5"); 5.10-5.30 (m, 2H; H-3'+H-3"); 6.10-6.30 (m, 2H; H-1'+H-1"); 7.50 und 7.80 (2s, 2H; 2xH-6); 7.90 (bs, H; NH); 11.30 und 11.40 (2s, 2H; 2xNH).
Der nächste Schritt war die Synthese von 5'-O-Dimethoxytrithyl-3'-amino-3'-desoxythymidylyl-(3'-5'-carbamoyl)-3'-O-acetyldesoxythymidin, 3. 3'-Amino-3'-desoxythymidylyl-(3'-5'-carbamoyl)-3'-O-acetyldesoxythymidin (1, 203,5 mg; 0,366 mmol) und 4,4'- Dimethoxytritylchlorid (186,02 mg; 0,55 mmol) wurden in 5 ml wasserfreiem Pyridin bei Raumtemperatur aufgelöst. Das Reaktionsgemisch wurde über Nacht unter Stickstoff gerührt. Die resultierende Suspension wurde dann in Eis enthaltendes Wasser eingegossen. Das Produkt wurde mit Methylenchlorid (3x50 ml) extrahiert. Die vereinigten Extrakte wurden mit 3x50 ml Wasser gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, filtriert und bis zur Trockenheit unter vermindertem Druck eingedampft. Der feste Rückstand wurde einer Flash-Säulenchromatographie an Kieselgel unter Verwendung eines Gemisches von Methylenchlorid, Methanol und Triethylamin in einem Verhältnis von 23:1:1 als Lösungsmittel unterzogen. Das Produkt wurde als ein weißer Feststoff, 309 mg (98%) erhalten.
IR (KBr): 3500-2800; 1700; 1600; 1500; 1300; 1150; 1000; 950; 850; 790; 750; 550 cm&supmin;¹. ¹H-NMR (DMSO; δ in ppm); 1.78 und 1.80 (2s; 6H; 2xCH&sub3;); 2.10 (s, 3H; CH&sub3;); 2.30-2.50 (m, 4H; H-2'+Hc2"); 3.30-3.60 (m, 2H; H-4'+H-4"); 3.75 (s, 6H; 2xOCH&sub3;); 3.90-4.10 (m, 2H; H-5'); 4.30-4.50 (m, 2H; H-5"); 5.40 (m, H; H- 3'); 6.0 (m, H; H-3"); 6.30-6.40 (m, 2H; H-1'+H-1"); 6.80-6.90 (m,Phenyl ); 7.20-7.30 (m, Phenyl ); 7.40 (bs, 2H; H-6); 7.60 (bs; 1H; NH); 10.30 (bs, 2H; 2xNH).
Der am 5'-Ende mit einer Schutzgruppe versehene dimere Baustein 5'-O-Dimethoxytrithyl- 3'-amino-3'-desoxythymidylyl-(3'-5'-carbamoyl)-desoxythymidin 4 wurde wie folgt hergestellt. 5'-O-Dimethoxytrithyl-3'-amino-3'-desoxythymidylyl-(3'-5'-carbamoyl)-3'-O- acetyldesoxythymidin, 3, (309 mg) wurden in 5 ml konzentriertem Ammonium aufgelöst und für 3 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Nach dem Entfernen von Ammonium unter vermindertem Druck wurde der feste Rückstand der Flash-Säulenchromatographie an Kieselgel unterzogen und mit einem Gemisch von Methylenchlorid, Methanol und Triethylamin in einem Verhältnis von 22:2:1 eluiert. 290 mg (98%) Produkt wurden als weißer Feststoff erhalten.
IR (KBr): 3500-2800, 1750; 1500; 1450; 1300; 1200; 1100-1000; 900; 700; 600 cm&supmin;¹. ¹H-NMR (CDCl&sub3;; δ in ppm): 1.35 und 1.80 (2s, 6H; 2xCH&sub3;); 2.0 (s, 2H; H-2'); 2.40 (bs, H; OH); 2.70 (s, 2H; H-2"); 3.25-3.50 (m, 2H; H-4'+H-4"); 3.75 (s, 6H; OCH&sub3;); 4.0-4.30 (m, 2H, H-5'); 4.30-4.50 (m, 2H; H-5"); 5.90-6.0 (m, 2H, H-3'+H-3"); 6.20-6.40 (m, 2H; H-1'+H-1"); 6.70-6.90 (m, Phenyl ); 7:15-7.30 (m,Phenyl ); 7.40 (bs, 2H; H-6); 7.60 (bs, H; NH).
Der dimere Baustein wurde dann entweder umgewandelt zu einem trimeren Baustein oder in der dimeren Form in sein 3'-Phosphoramidit. Zur Trimersynthese wurde das Dimer zuerst an dem 5'-Ende mit bis-p-Nitrophenylcarbonat (vgl. Figur 1) zum Carbonat aktiviert, das weiter umgesetzt wurde mit 3'-Amino-3'-desoxythymidin. Das erhaltene Trimer wurde dann an der 5'-Stellung mit einer Schutzgruppe versehen. Das mit einer Schutzgruppe versehene 5'-ODMT-Trimer wurde erhalten. Dieses wurde nachstehend in Ammonium hydrolysiert, um einen freien 3'-Hydroxylrest zu erzeugen. Produkt 5 wurde als ein weißes Pulver in einer Ausbeute von 78,4% erhalten.
IR (KBr): 3500-2800; 1750; 1500; 1460; 1250; 1180; 1150-1050; 850; 800 cm&supmin;¹. ¹H-NMR (DMSO; δ in ppm): 1.50, 1.70, und 1.80 (3s, 9H; 3xCH&sub3;); 1.75 (bs, H; OH); 2.10-250 (m, 6H; H-2'+H-2"+H-2"'); 3.10-3.40 (m, 3H; H- 4'+H-4"+H-4"'); 3.75 (s, 6H; 2xOCH&sub3;) 3.90-4.40 (m, 6H; H-5'+H-5"+H-5"'); 6.10-6.30 (m, 3H; H-3'+H-3"+H-3"'); 6.80-6.90 (m, Phenyl ); 7.20-7.40 (m, Phenyl , und 3H; H- 1'+H-1"+H-1"'); 7.40-7.60 (m, 3H; H-6); 7.80-8.0 (m, 2H; 2xNH), 11.40 (m, 3H; 3xNH).
Die Umwandlung des Trimers zu einem Tetramer wurde durch Wiederholung dieser Schritte ausgeführt. Produkt 6 wurde als ein weißes Pulver in einer Ausbeute von 83,8% erhalten.
IR (KBr): 3600-2800; 1750; 1500; 1490; 1350; 1200; 1100-1000; 800; 750 cm&supmin;¹. ¹H-NMR (DMSO; δ in ppm): 1.50, 1.70, 1.80, und 1.90 (4s, 12H; 4xCH&sub3;); 1.60 (bs, H; OH); 2.00-2.50 (m, 8H; H-2'+H- 2"+H-2"'+H-2""); 3.0-3.40 (m, 4H; H-4'+H-4"+H-4"'+H-4""); 3.70 (s, 6H; 2xOCH&sub3;); 3.80-4.40 (m, 8H; H-5'+H-5"+H-5"'+H-5""); 6.10-6.30 (m, 4H; H-4'+H-4"+H-4"'+H- 4""); 6.80-7.0 (m, Phenyl ); 7.20-7.40 (m, Phenyl ; und 4H; H-6); 7.80-8.0 (m, 3H; 3xNH); 11.30-14.40 (m, 4H; 4xNH).
Die Dimere wurden in ihre korrespondierenden β-Cyanoethylphosphoramidite durch nachstehendes Verfahren umgewandelt. Das mit einer Schutzgruppe versehene 5'-O-DMT-Dimer 4, Trimer 5 oder Tetramer 6 wurde über P&sub2;O&sub5; für 24 Stunden bei 70ºC unter vermindertem Druck getrocknet und co-evaporiert mit wasserfreiem Benzol und wasserfreiem Methylenchlorid (3x Gemisch von 2 ml Methylenchlorid und 5 ml Benzol), aufgelöst in trockenem Methylenchlorid (2 ml). 1 ml Triethylamin wurde der Lösung hinzugefügt. Danach wurden 173,96 mg (0,735 mMol) (N,N-Diisopropylamino)-(2-cyanoethoxy)-chlorophosphin hinzugefügt. Das Reaktionsgemisch wurde für 60 Minuten unter Stickstoff gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde in eine kalte gesättigte wäßrige Lösung von Natriumbicarbonat gegeben. Das Produkt wurde mit Methylenchlorid (3x20 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte wurden mit 3x10 ml Kochsalzlösung gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, filtriert und dann bis zur Trockenheit unter vermindertem Druck eingedampft. Der feste Rückstand wurde in 2 ml Methylenchlorid aufgelöst und mit 600 ml Hexan, enthaltend N,N-Diisopropylethylamin (2 ml) bei -78ºC gefällt. Das weiße Präzipitat wurde abgefiltert, gesammelt und über P&sub2;O&sub5; unter vermindertem Druck getrocknet. 182 mg (73 %) des dimeren Bausteins wurden als weißer Feststoff erhalten. Dieser wurde direkt für die Synthese von Oligonucleotiden verwendet. ³¹P- NMR (CDCl&sub3;; δ in ppm) 144,65 und 144,20. Es ist möglich, Phosphoramidite von Trimeren und Tetrameren in derselben Weise herzustellen. Aufgrund von sterischen Hinderungen und der Kupplungseffizienz in der automatischen DNA-Synthese werden reduzierte Ausbeuten für diese erwartet. Für jede der vorstehenden Produktanalysen wurden ¹H- und ³¹P- NMR-Spektren mit einem Varian Unity 300 Spektrometer gemessen unter Verwendung von TMS als internen Standard und 85% H&sub3;PO&sub4; als externen Standard. Die IR-Spektren wurden auf einem Nicolet 800 Spektrometer aufgezeichnet unter Verwendung von Proben als KBr-Scheiben.

BEISPIEL 2

Synthese von Oligonucleotiden, enthaltend neue Carbamat-Internucleosidbindungen an verschiedenen Positionen

Zur Synthese von Oligonucleotiden mit 1, 2 oder 3 neuen Carbamat-Internucleosidbindungen an dem am nächsten am 3'-Ende gelegenen Ende wurden die mit Schutzgruppen am 5'-Ende versehenen dimeren 4 trimeren 5 oder tetrameren 6 Bausteine an Trägerglas kontrollierter Porengröße auf Basis einer langkettigen Alkylaminopropancarbonsäure (CPG)) angeheftet, da der Carboxylrest direkt mit dem 3'-Hydroxylrest des Dimers 4, Trimers 5 oder Tetramers 6 in Gegenwart von 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimidhydrochlorid unter Verwendung von Standardverfahren verestert werden kann; vgl. z.B. Damha et al., Nucleic Acids Res., 1990, 18:3813. Die Anfangsladungen waren 37,4, 27,5 und 2,2 µMol/g CPG für den dimeren Baustein 4, den trimeren Baustein 5 und den tetrameren Baustein 6. Zur Verbesserung der Ladungswerte für die trimeren und tetrameren Bausteine wurden diese zuerst an dem 3'-OH-Rest succiniliert und dann über eine Amidbindung an dem vorstehend genannten Trägerglas kontrollierter Porengröße unter Verwendung von Standardverfahren angeheftet; vgl. z.B. Caruthers et al., Methods in Enzymology, 1987, 154:287; Damha et al., Nucleic Acids Res., 1990, 18:3813. Diese Manipulation modifiziert die Ladungswerte zu 25,0 und 14,6 µMol/g CPG für den trimeren Baustein 5 bzw. den tetrameren Baustein 6.
Etwa 10 mg von CPG-gebundenem Dimethoxytrithyl di-, tri- oder tetra-Nucleosidcarbamat wurde in eine Flasche von 10 ml Volumen gegeben und mit 0,2 ml HClO&sub4;-Ethanol (3:2) für 1 Minute zur Freisetzung der Dimethoxytrithylreste behandelt. Danach wurden 9,8 ml Acetonitril hinzugegeben und die Absorption bei 498 nm gemessen, um die Ladungseffizienz gemäß der Gleichung Gewicht CPG (mg)
zu bestimmen.
Für Oligonucleotide mit 1, 2 oder 3 Internucleosidbindungen ausschließlich an der/den am nächsten am 3'-Ende gelegenen Position(en) wurden das CPG-gebundene Dimer, Trimer bzw. Tetramer zur Initiierung der Synthese des Oligonucleotids verwendet. Die Synthese wurde gemäß Standardverfahren unter Verwendung von monomeren Nucleosidcyanoethylphosphoramiditen durchgeführt, mit der Ausnahme, daß in bestimmten Zyklen Monomere ersetzt wurden durch erfindungsgemäße Dinucleosidcarbamatcyanoethylphosphoramidite. Unter Verwendung dieses Verfahrens wurden Oligonucleotide mit neuer Carbamat-Internucleosidbindung an verschiedenen Positionen hergestellt, wie in nachstehender Tabelle II gezeigt. TABELLE II OLIGONUCLEOTIDE, ENTHALTEND NEUE CARBAMATINTERNUCLEOSIDBINDUNGEN AN VERSCHIEDENEN POSITIONEN
PO = Phosphodiester
PS = Phosphorothiot
* = 5'-Nucleosid-3'-NH-CO-O-5'-nucleosid-3'
Die Oligonucleotide wurden bei Raumtemperatur für 1 Stunde und nachfolgend bei 55ºC für 5 Stunden mit konzentriertem Ammoniumhydroxid von CPG abgespalten und die Schutzgruppen entfernt. Die resultierenden 5'-O-DMT-geschützten Oligonucleotide wurden auf einer präparativen C-18-Reversphasensäule durch Elution mit einem linearen Gradienten des Lösungsmittels A (0,1 M wäßrigem Ammoniumacetat) und Lösungsmittel B (20% 0,1 M Ammoniumacetat + 80% Acetonitril) gereinigt. Die Oligonucleotide wurden in 80%iger wäßriger Essigsäure für 30 Minuten bei Raumtemperatur detrityliert. Danach wurden sie wiederum gereinigt durch Wiederholung des C-18-Chromatographie-Schritts.

BEISPIEL 3

Bestimmung der Nucleaseresistenz von Oligonucleotiden mit neuen Carbamat-Internucleosidbindungen an verschiedenen Positionen

Jedes der in Tabelle II gezeigten Oligonucleotide wurde auf die Fähigkeit der Resistenz gegenüber exonucleolytischem Abbau getestet. 0,2 O.D. Einheiten Oligonucleotid wurden in 0,5 ml 10 mM Tris (pH 8,5), 10 mM MgCl&sub2;, enthaltend 5 µl/ml Schlangengift- Phosphodiesterase I (Typ VIII S von Crotalus atrox, Sigma, St. Louis, Missouri) aufgelöst und bei 37ºC inkubiert. Der Abbau wurde durch Aufzeichnung der Absorption des UV- Lichts bei 260 nm bestimmt. Die Ergebnisse für jedes Oligonucleotid sind in der nachstehenden Tabelle III gezeigt. TABELLE III EXONUCLEOLYTISCHER ABBAU VON OLIGONUCLEOTIDEN
Diese Ergebnisse zeigen, daß Oligonucleotide mit neuen Carbamat-Internucleosidbindungen stärker resistent sind gegenüber exonucleolytischem Abbau als Oligonucleotide mit Phosphodiester-Internucleosidbindungen. Die Stabilität stieg mit steigender Zahl der 3'- Carbamatbindungen an, vorausgesetzt, daß diese Bindungen aufeinanderfolgend waren und nicht zwischen Phosphordiesterbindungen eingestreut waren. Oligonucleotide mit 3'-Carbamatbindungen und den restlichen Phosphorothioatbindungen waren besonders stabil, wobei nach 30 Minuten noch kein Abbau wahrnehmbar war.

BEISPIEL 4

Bindungseigenschaften von Oligonucleotiden mit neuen Carbamat-Internucleosidbindungen an verschiedenen Positionen

Jedes der in Tabelle II gezeigten Oligonucleotide wurde bezüglich der Bindungseigenschaften mit einem komplementären Oligonucleotidphosphodiester getestet. Für jedes Oligonucleotid wurden 0,2 O.D. Einheiten des Oligos und 0,2 O.D. Einheiten seines komplementären Oligos in 1 ml 10 mM Na&sub2;HPO&sub4; (pH 7,4), 100 mM NaCl in einem geschlossenen Cuvettensystem mit einem thermischen Bereich von 25ºC bis 80ºC (Lambda 2 Spektrometer, Perkin Elmer, Überlingen, Deutschland) aufgelöst. Die Temperatur innerhalb des Bereichs wurde mit einer Rate von 1ºC/Minute erhöht und der Anstieg A&sub2;&sub6;&sub0; wurde gemessen. Die Ergebnisse für jedes Oligonucleotid sind in nachstehender Tabelle IV gezeigt. TABELLE IV BINDUNGSEIGENSCHAFTEN DER OLIGONUCLEOTIDE
¹ 5'CTCTCGCACCCATCTCTCTCCCCCC-3', alle PO; die Sequenz ist identisch mit SEQ ID NO.: 3, mit der Ausnahme, daß die letzten 4 Nucleotide zu C geändert wurden, so daß ein 4- Basenpaar Mismatch zu dem Doppelstrangpartner erzeugt wurde.
² alle Phosphorothioat-Analoga
³ zweites Experiment, ausgeführt in 5 mM Na&sub2;HPO&sub4; (pH 7,4), 50 mM NaCl
&sup4; drittes Experiment, ausgeführt in 2,5 mM Na&sub2;HPO&sub4; (pH 7,4), 25 mM NaCl.
Diese Ergebnisse unterstützen mindestens zwei Schlußfolgerungen. Erstens hat die Einführung von 1, 2 oder 3 neuen Carbamatbindungen in die Positionen, die am nächsten am 3'-Ende gelegen sind, wenig oder keinen Einfluß auf die Fähigkeit, die komplementäre Nucleinsäure zu binden. Im Gegensatz dazu führt das Einführen von drei neuen Carbamatbindungen an stärker im Inneren gelegenen Positionen zu einem bescheidenen inhibitorischen Effekt und das Einführen von zusätzlichen neuen Carbamatbindungen überall in dem Oligonucleotid verursacht eine dramatische Reduktion der Bindungsfähigkeit. Somit sind Olignucleotide mit drei oder weniger neuen Carbamatbindungen an der am nächsten am 3'- Ende gelegenen Position(en) wahrscheinlich die besten Kandidaten als Antisense-Moleküle.
Zweitens stören die Bindungen von drei oder weniger neuen Carbamatbindungen nahe des 3'-Endes eines Oligonucleotids nicht signifikant die Basenstapelung benachbarter Nucleoside. Dieses wird gezeigt durch Vergleich der Stabilität von Oligonucleotid-Doppelsträngen mit 3'-Fehlpaarungen (und dementsprechenden Fehlen der Fähigkeit der terminalen Basenstapelung) mit einem Oligonucleotid-Doppelstrang mit drei neuen Carbamatbindungen am 3'-Ende. Bei hoher Ionenstärke, bei der die Doppelstrangbildung stabilisiert wird, verhalten sich beide ähnlich (Tms von 67,9ºC bzw. 67,4ºC). Wenn jedoch die Ionenstärke reduziert wird, was eine Doppelstrangdissoziation begünstigt, werden die letzteren Oligonucleotide stabiler (Tms von 62,9ºC bzw. 65,0ºC bei 50 mM Salzkonzentration und 59,9ºC bzw. 61,9ºC bei 25 mM Salzkonzentration). Diese Ergebnisse zeigen, daß die terminale Basenpaarung und Basenstapelung in den neuen Carbamat-enthaltenden Oligonucleotiden stattfindet. Somit wird der Doppelstrang mit einem Oligonucleotidphosphodiester stabilisiert, verglichen mit einem Doppelstrang mit terminalen Fehlpaarungen. SEQUENZPROTOKOLL

Claims

1. Ein Baustein zur Verwendung bei der Oligonucleotidsynthese umfassend ein Dinucleosidcarbamat mit der Struktur 5'-Nucleosid-3'-NHCOO-5'-Nucleosid-3'.

2. Baustein zur Verwendung in der Oligonucleotidsynthese umfassend ein Trinucleosid mit einer oder mehreren Carbamatbindungen mit der Struktur und Orientierung der Carbamatbindung des Dinucleosidcarbamats nach Anspruch 1.

3. Baustein zur Verwendung in der Oligonucleotidsynthese umfassend ein Tetranucleosid mit einer oder mehreren Carbamatbindungen mit der Struktur der Carbamatbindung des Dinucleosidcarbamats nach Anspruch 1.

4. Ein Verfahren zur Verwendung eines Bausteins nach einem der Ansprüche 1 bis 3 zum Herstellen eines Oligonucleotids enthaltend eine neue Carbamatbindung, die Methode umfaßt die Schritte der kovalenten Verknüpfung des Bausteins an einen zur Oligonucleotidsynthese geeigneten festen Träger und nachfolgender kovalenter Bindung zusätzlicher Nucleotide an die Bausteine.

5. Verfahren zur Verwendung des Bausteins nach einem der Ansprüche 1 bis 3 zum Herstellen eines Oligonucleotids enthaltend eine neue Carbamatbindung, das Verfahren umfaßt die Schritte der kovalenten Bindung der Bausteine an eine wachsende Oligonucleotidkette während der chemischen Synthese.

6. Oligonucleotid enthaltend eine oder mehrere Carbamatinternucleosidbindung (en) mit der Struktur der Carbamatbindung des Dinucleosidcarbamats nach Anspruch 1.

7. Oligonucleotid nach Anspruch 6, worin die Carbamatinternucleosidbindung (en) an einer oder mehreren der ersten, zweiten und/oder dritten am nächsten am 3'-Ende gelegenen Internucleosidposition (en) in dem Oligonucleotid sind.

8. Oligonucleotid nach Anspruch 7, worin ein oder mehrere der Nichtcarbamatinternucleosidbindungen Phosphorothioatbindungen sind.

9. Oligonucleotid nach Anspruch 7, worin ein oder mehrere der Nichtcarbamatinternucleosidbindungen Phosphodiesterbindungen sind.

10. Verwendung des Oligonucleotids nach einem der Ansprüche 6 bis 9 zur Inhibierung der Nukleinsäureexpression in vitro.

11. Verwendung eines Oligonucleotids nach einem der Ansprüche 6 bis 9 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Hemmung der Nukleinsäureexpression in vivo.