HINTERGRUND DER ERFINDUNG
1. Gebiet der Erfindung
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Die Erfindung betrifft ein Mittel zum Schutz von Knorpel,
d.h. ein chondroprotektives Mittel, genauer ein
chondroprotektives Mittel, das eine Carbonsäureverbindung
der unten genannten allgemeinen Formel (I) oder ein
cis- oder trans-Isomer hiervon oder ein pharmazeutisch
verträgliches Salz oder einen Ester davon enthält.
2. Beschreibung des Stands der Technik
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Es gibt verschiedene Arten von Arthropatie,
beispielsweise rheumatoide Arthritis, rheumatisches
Fieber und Osteoarthritis. Viele Menschen leiden
besonders unter rheumatoider Arthritis und
Osteoarthritis. Diese Erkrankungen wurden als die
Hauptarten von Arthropatien untersucht. Es gibt eine
angeborene und eine sekundäre Osteoarthritis und ferner
eine primäre Osteoarthritis, die durch die Degeneration
des Gelenkknorpels im Verlauf des Alterungsprozesses
verursacht wird. In jüngerer Zeit trat zusammen mit der
Zunahme der älteren Bevölkerung ebenfalls eine Zunahme
von unter primärer Osteoarthritis leidenden Patienten
auf.
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Obgleich beträchtliche Unterschiede der Ursachen und
Bedingungen zwischen rheumatoider Arthritis und
Osteoarthritis bestehen, wird die Gelenkfunktion
schließlich durch die Zerstörung des Knorpels sowohl bei
der rheumatoiden Arthritis als auch bei der
Osteoarthritis behindert.
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Die erste Wahl von Ärzten für die Behandlung von
rheumatischen Erkrankungen, wie etwa rheumatoide
Arthritis, rheumatisches Fieber, systemischer Lupus
Erythematodes und Osteoarthritis sind analgetische und
entzündungshemmende Mittel, beispielsweise Aspirin oder
Indometacin. Ferner werden Goldverbindungen wie etwa
Shiosol, Immunmodulatoren, Steroide oder D-Penicillamin
als Arzneimittel zur Behandlung von rheumatoider
Arthritis verwendet.
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Die vorstehend genannten herkömmlichen analgetischen und
entzündungshemmenden Mittel waren jedoch nicht gegen die
Zerstörung des Gelenkknorpels wirksam und zeigten
tatsächlich manchmal nachteilige Effekte bei Versuchen,
die Chondrocyten verwendeten. Ferner wurde bei den
vorstehend genannten Arzneimitteln bei der Behandlung von
rheumatoider Arthritis ebenfalls kein hemmender Effekt
auf die Zerstörung des Gelenkknorpels beobachtet.
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Es ist bekannt, daß Coffein-, Ferula-, Isoferula- oder
3-Ethoxy-4-hydroxyzimtsäure für die folgenden
pharmazeutischen Anwendungen verwendet werden können:
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Coffein- und Ferulasäuren zeigen eine antivirale
Aktivität [ungeprüfte japanische Patentveröffentlichung
(Kokai) Nr. 4-234319]. Coffeinsäure kann als
Calciumantagonist [ungeprüfte japanische
Patentveröffentlichung (Kokai) Nr. 4-243822], als
Antiallergikum [ungeprüfte japanische
Patentveröffentlichung (Kokal) Nr. 59-155314] und
ähnliches verwendet werden. Coffeinsäure und
Methylcoffeinsäureester können zur Behandlung von
Autoimmunstörungen verwendet werden (WO 91/17749). Ferner
können Ferula- und Isoferulasäuren als Antitumormittel
zur Verhinderung von Arzneimittelresistenzen in der
Immunchemotherapie verwendet werden [ungeprüfte
japanische Patentveröffentlichung (Kokai) Nr. 56-115716].
Ferner kann Ferulasäure als Mittel für mitigierende
Hyperlipämie und Plättchenaggregation (US-Patent Nr. 4
842 859) verwendet werden. Darüber hinaus zeigen
Ferulasäure und dessen Ester eine entzündungshemmende
Wirkung (A.S. Chawla et al, Indian J. Exp. Biol., Vol
25, Nr. 3, Seiten 187 - 189, 1987).
3-Ethoxy-4-hydroxyzimtsäure kann als Absorbens für ultraviolette Strahlung
in Kosmetika eingesetzt werden [ungeprüfte japanische
Patentveröffentlichung (Kokai) Nr. 64-13018].
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Die oben genannten Carbonsäuren, deren cis- und trans-
Isomere sowie deren Salze und Ester waren jedoch bisher
nicht als chondroprotektive Mittel bekannt.
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Wuhan Daxue Yuebao, Ziran Kexueban (4), 1990, 93-97 und
Acta Zool. Sin. 38(1), März 1992, 106-107 lehren, daß
Ferulasäure bei Injektion von höheren Dosen
Knorpelschäden verursachen kann, d.h. ein drastisches
Abnehmen und eine anormale Verteilung des von den
Knorpelzellen hergestellten Proteinproteoglycans.
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Die vorliegenden Erfinder haben umfangreiche Forschungen
angestellt, um ein chondroprotektives Mittel zur
Unterdrückung der Zerstörung des Gelenkknorpels zu finden
und haben im Ergebnis gefunden, daß bestimmte
Carbonsäureverbindungen, deren cis- und trans-Isomere und
deren pharmazeutisch verträglichen Salze und Ester die
Abnahme von Proteoglycan, welches ein wesentlicher
Bestandteil der Knorpelmatrix ist, in erheblichem Ausmaß
hemmen und daher als chondroprotektive Mittel zur
Verhinderung der Zerstörung von Gelenkknorpel nützlich
sind.
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Demgemäß besteht die Aufgabe der vorliegenden Erfindung
darin, ein chondroprotektives Mittel bereitzustellen,
welches als Wirkstoff einer bestimmten
Carbonsäureverbindung der allgemeinen Formel (I) oder
deren cis- oder trans-Isomere oder ein pharmazeutisch
verträgliches Salz oder Ester davon enthält.
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Weitere Aufgaben und Wirkungen der vorliegenden Erfindung
werden in der folgenden Beschreibung deutlich werden.
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Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung einer
carbonsäureverbindung der allgemeinen Formel (I)
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worin R¹ und R² unabhängig voneinander ein Wasserstoffatom
oder eine Alkylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, oder
ein cis- oder trans-Isomer davon, oder ein pharmazeutisch
verträgliches Salz davon oder einen Ester davon mit einem
aliphatischen Alkohol mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen (im
folgenden die "erfindungsgemäße Verbindung" genannt)
sind, zur Herstellung eines chondroprotektiven Mittels.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN
AUSFÜHRUNGSFORMEN
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In der allgemeinen Formel (I) sind R¹ und R² vorzugsweise
ein Wasserstoffatom oder eine niedere Alkylgruppe mit
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1 bis 4 Kohlenstoffatomen, noch bevorzugter Methyl-,
Ethyl-, n-Propyl-, oder n-Butylgruppen.
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Entsprechend der Konfiguration der Phenyl- und
Carbonylgruppe, die an beiden Enden der Doppelbindung in
der erfindungsgemäßen Verbindung gebunden sind, existiert
eine cis-Form und eine Trans-Form. Jede dieser cis- und
trans-Formen können für das chondroprotektive Mittel der
vorliegenden Erfindung verwendet werden.
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Als pharmazeutisch verträgliche Salze können Salze wie
Alkalimetalle (wie Natrium oder Kalium), Salze mit
Erdalkalimetallen (wie Calcium oder Magnesium),
Aluminiumsalze, Ammoniumsalze, Salze mit verschiedenen
Aminverbindungen (wie primäre, sekundäre oder tertiäre
Amine) oder ähnliche genannt werden.
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Die Ester können solche mit aromatischen oder
aliphatischen Alkoholen sein, vorzugsweise solche mit
aliphatischen Alkoholen, noch bevorzugter solche mit
aliphatischen Alkoholen mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen.
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Noch bevorzugtere Beispiele sind Methyl-, Ethyl-, n-
Propyl-, iso-Propyl-, n-Butyl-, iso-Butyl-, tert.-Butyl-,
n- oder iso-Pentylester.
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Beispiele für die erfindungsgemäßen Verbindungen sind in
Tabelle 1 aufgeführt. Tabelle 1 zeigt nur die trans-
Formen, auf die sich die vorliegende Erfindung jedoch
nicht beschränkt.
Tabelle 1
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Me: Methyl, Et: Ethyl, npr: n-Propyl, nbu: n-Butyl
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Viele der in Tabelle 1 beschriebenen
Carbonsäureverbindungen sind kommerziell erhältlich. Coffeinsäure
ist beispielsweise von Tokyo Kasei Kogyo Co. und
Ferulaund Isoferulasäure sind von Sigma Chemical Co.
erhältlich. 3-Ethoxy-4-hydroxyzimtsäure kann ferner durch
Umsetzen von 3-Ethoxy-4-hydroxybenzaldehyd und Malonsäure
in Gegenwart einer Base wie Pyridin (siehe Beispiel 1
unten) hergestellt werden.
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Die pharmazeutisch verträglichen Salze der freien
Carbonsäuren der allgemeinen Formel (I) können durch
Umsetzen von Alkalimetall-, Erdalkalimetall-, oder
Ammoniumhydroxyden oder -carbonaten mit einer equimolaren
Menge der freien Carbonsäure in einem Lösungsmittel wie
Wasser hergestellt werden.
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Der Ester der freien Carbonsäure der Formel (I) kann
durch Umsetzen von Alkoholverbindungen mit der oben
genannten freien Carbonsäure anhand einer der folgenden
Verfahren hergestellt werden:
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(1) Umsetzen eines Alkohols und der Carbonsäure in einem
geeigneten Lösungsmittel in Gegenwart eines
Säurekatalysators, beispielsweise einer anorganischen
Säure wie Salzsäure, Schwefelsäure oder Phosphorsäure
oder einer organischen Säure wie Essig- oder
p-Toluolsulfonsäure,
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(2) Umsetzen eines Alkohols.und der Carbonsäure in
Gegenwart eines Kondensationsmittels wie
Dicyclohexylcarbodiimid,
N,N'-Carbonyldi-2-methylimidazol, Diphenylketen-n-cyclohexylimin, Alkoxyactylen,
Ethylpolyphosphat, Thionylchlorid oder Oxalylchlorid in
einem organischen Lösungsmittel wie Dimethylformamid,
Aceton, Dioxan, Acetonitril, Chloroform, Ethylenchlorid,
Tetrahydrofuran oder Pyridin üblicherweise bei
Unterkühlung oder bei Raumtemperatur,
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(3) Umsetzen eines Carbonsäureanhydrids und eines
Alkohols in der Gegenwart eines basischen Materials wie
Triethylamin, Pyridin oder Methylethylpyridin oder
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(4) Umsetzen eines Carbonsäurehalogenids, beispielsweise
eines Acylhalogenids wie Chloride oder Bromide und eines
Alkohols in einem Lösungsmittel, das eine basische
Verbindung wie Triethylamin, Pyridin oder
Methylethylpyridin oder in einem basischen Lösungsmittel
wie Pyridin.
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Wie sich aus dem unten aufgezeigten Toxizitätsergebnissen
ergibt, handelt es sich bei der erfindungsgemäßen
Substanz um eine extrem sichere Verbindung.
(1) Akute Toxizität von Coffeinsäure
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Der LDLO-Wert (geringste tödliche Dosis) bei
intraperitonealer Verabreichung in Ratten, liegt bei
1500 mg/kg (Toxicology and Applied Pharmacology, Band 36,
S.227, 1976).
(2) Akute Toxizität von Ferula-, Isoferula- und
3-Ethoxy-4-hydroxyzimtsäure
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Jede der oben genannten Säuren wurde ddY männlichen
Mäusen (fünf Mäuse pro Gruppe) mit einer Dosis von
400 mg/kg verabreicht und die Mäuse eine Woche lang nach
der Verabreichung beobachtet. Die zu testenden Substanzen
wurden nach Dispersion in einer wässrigen Lösung aus
0,3 % CMC (Carboxymetehylcellulose) und 0,05 % Tween 80
(Polyoxylethylensorbitanmonooleat; Tokyo Kasei Kogyo Co.)
oral verabreicht. Keines der Tiere verendete und des
wurden keine Unregelmäßigkeiten in den Körpergewichten
oder allgemeinen Bedingungen bei jeder der zu testenden
Substanzen beobachtet.
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Die gleichen Ergebnisse erhielt man bei Verabreichung von
Natriumferulasäureester, Methylferulasäureester,
Ethylferulasäureester, Propylferulat oder Butylferulat.
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Die LD&sub5;&sub0;-Werte von Methylferulasäureester und
Isopropylferulat bei intraperitonealer Verabreichung in
Mäusen betragen jeweils 1188,5 mg/kg und 1059,2 mg/kg
(A.S. Chawla et al., Indian J. Exp. Biol., Band 25, Nr.
3, 5. 187-189, 1987).
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Als pharmakologischen Effekt zeigt die erfindungsgemäße
Substanz die Funktion der Hemmung der Zerstörung der
Chondrocytenmatrix in Chondrocytenkulturen (aus dem
Knorpel von Kaninchenschultern und Kniegelenken erhalten)
(siehe nachfolgendes Beispiel 2). Obwohl die
erfindungsgemäße Esterverbindung nicht immer einen
derartigen pharmakologischen Effekt in vitro aufweist,
wurde die durch Granuloma induzierte Hemmung der
Knorpelzerstörung in Tierversuchen beim Mouse-Air-Pouch-
Model beobachtet.
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Entsprechend ist die erfindungsgemäße Substanz als ein
chondroprotektives Mittel zur Behandlung von
verschiedenen Arten von Arthropatien, die die
Knorpelzerstörung von Gelenken begleiten, nützlich.
Beispiele derartiger Arthropatien sind rheumatoide
Arthritis, Osteoarthritis, Periarthritis
Humeroscapularis, Schulter-Arm-Hals-Syndrom, Lumbago usw.
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Das die erfindungsgemäße Substanz als einen aktiven
Inhaltsstoff enthaltende chondroprotektive Mittel kann in
Form jeder herkömmlichen Formulierung vorliegen. Das
chondroprotektive Mittel kann die erfindungsgemäße
Substanz allein oder eine Mischung der erfindungsgemäßen
Substanz mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger oder
Verdünnungsmittel enthalten. Das chondroprotektive Mittel
kann den aktiven Inhaltsstoff in einer Menge von 0,01 bis
100 Gew.%, vorzugsweise 0,1 bis 70 Gew.% enthalten.
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Das chondroprotektive Mittel gemäß vorliegender Erfindung
kann oral oder auf anderen Wegen verabreicht werden.
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Die Dosis des chondroprotektiven Mittels gemäß
vorliegender Erfindung variiert je nach Patient (tierisch
oder menschlich), Alter, individuellen Unterschieden,
Erkrankungszustand und dergleichen. Allgemein gesprochen
liegt jedoch bei Behandlung eines Menschen die Dosis der
oralen Verabreichung der erfindungsgemäßen Substanz im
Bereich von 0,1 bis 550 mg/kg (Körpergewicht) pro Tag,
vorzugsweise 0,5 bis 200 mg/kg (Körpergewicht), die
gewöhnlich in 1 bis 4 Dosierungen pro Tag aufgeteilt ist,
obgleich eine Dosis außerhalb des vorstehend genannten
Bereiches gelegentlich verabreicht werden kann.
BEISPIEL
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Die vorliegende Erfindung wird nun anhand der folgenden
Beispiele näher erläutert.
Beispiel 1: Herstellung der erfindungsgemäßen Substanz
(1) Herstellung von 3-Ethyoxy-4-hydroxyzimtsäure
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Malonsäure (1,56 g) und Pyridin (3,0 ml) wurden in einen
länglichen Kolben (100 ml) gegeben. Weiterhin wurden
3-Ethoxy-4-hydroxybenzaldehyd (1,66 g) und Anilin (30 ul)
hier zugegeben und das Gemisch bei 55ºC drei Stunden lang
umgesetzt. Die Reaktionslösung wurde durch Zugabe von
verdünnter Schwefelsäure angesäuert. Die durch Filtration
erhaltenen Rohkristalle wurden mit Wasser gewaschen und
anschließend getrocknet, wobei man die oben angegebene
Verbindung (1,1 g, 56,1 %) als leicht gelbliche Kristalle
erhielt.
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Schmelzpunkt: 157 bis 158ºC
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¹H-NMR (CDCL&sub3;, δppm): 1,40 (t, 3H, J = 6,87 Hz, CH&sub3;), 4,19
(q, 2H, J = 6,87 Hz, CH&sub2;), 6,36 (d, 1H, J = 16,04 Hz),
6,87 (d, 1H, J = 8,2 Hz), 7,13 (dd, 1H, J = 8,2; 1,8 Hz),
7,31 (s, 1H), 7,59 (d, 1H, J = 16,04 Hz)
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IR-Spektrum (cm&supmin;¹) : 3550s, 2980s, 2900s, 2830s, 2700m,
2600m, 2550m, 2510m, 1675s, 1625s, 1590s, 1515s, 1482m,
1435m, 1415m, 1330m, 1290s, 1260s, 1235s, 1195s, 1165s,
1121s, 1035s
(2) Herstellung von Methylferulasäureester
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Ferulasäure (4,85 g) und anschließend Methylalkohol
(50 ml), der Chlorwasserstoff (4 %) enthielt, wurden in
einen länglichen Kolben (200 ml) gegeben und eine Stunde
lang unter Rückfluß erhitzt. Die Abwesenheit von
Ausgangsmaterial wurde durch Dünnschichtchromatographie
(TLC: n-Hexane/Ethylacetat = 2/1) bestätigt, und
anschließend das Lösungsmittel bei vermindertem Druck in
einem Rotationsverdampfer abgezogen. Zu dem Rest wurde
Benzol gegeben und das Lösungsmittel wiederum mit einem
Rotationsverdampfer abgezogen, um das Rohprodukt zu
erhalten. Das dabei entstehende Rohprodukt wurde
abgetrennt und mit Kieselgelsäulenchromatographie
(Durchmesser = 5,5 x 7,0 cm; 60 g; n-Hexane/Ethylacetat =
2/1) gereinigt, wobei die oben genannte Verbindung
erhalten wurde. Das Produkt wurde aus n-Hexan
kristallisiert, wobei weiße Kristalle (5,09 g, 97,9 %)
erhalten wurden.
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Schmelzpunkt: 63 bis 64ºC
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¹H-NMR (CDCl&sub3;, δppm) : 3,79 (s, 3H, COOCH&sub3;), 3,90 (s, 3H,
OCH&sub3;), 6,08 (sm 1H, OH), 6,28 (d, 1H, J = 15,6 Hz, H3),
6,91 (d, 1H, J = 8,25 Hz), 7,01 (d, 1H, J = 1,74 Hz),
7,04 (dd, 1H, J = 8,25; 1,74 Hz), 7,62 (d, 1H, J =
15,6 Hz, H4)
(3) Herstellung von Ethylferulasäureester
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Ferulasäure (4,85 g) und anschließend Ethylalkohol
(50 ml), das Chlorwasserstoff (4 %) enthielt, wurden in
einen länglichen Kolben (200 ml) gegeben und 2,5 Stunden
unter Rückfluß erhitzt. Die Abwesenheit vom
Ausgangsmaterial wurde durch TLC (n-Hexane/Ethylacetat =
2/1) bestätigt und das Lösungsmittel anschließend mit
einem Rotationsverdampfer bei vermindertem Druck
abgezogen. Zu dem Rest wurde Benzol gegeben, wonach das
Lösungsmittel erneut mit einem Rotationsverdampfer
abgezogen wurde, wobei das weinfarbene Rohprodukt
(5,79 g) erhalten wurde. Das so erhaltene Rohprodukt
wurde abgetrennt und mit Kieselgelsäulenchromatographie
(Durchmesser = 5,5 x 7,0 cm; 60 g;
n-Hexan/Ethylacetat - 3/1) gereinigt, wobei die oben genannte Verbindung
(5,06 g; 91,2 %) erhalten wurde. Das Produkt wurde aus
n-Hexan kristallisiert, wobei weiße Kristalle (4,743 g,
85,3 %) erhalten wurden.
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Schmelzpunkt: 41 bis 43ºC
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¹H-NMR (CDCl&sub3;, δppm): 1,33 (t, 3H, COOCH&sub2;CH&sub3;), 3,91 (s, 3H,
OCH&sub3;), 4,25 (q, 2H, J = 7,33 Hz), 6,06 (s, 1H, OH), 6,28
(d, 1H, J = 15,6 Hz), 6,91 (d, 1H, J = 6,8 Hz), 7,02 (s,
1H), 7,06 (d, 1H, J = 8,25 Hz), 7,61 (d, 1H, J = 15,6 Hz)
(4) Herstellung von n-Propylferulasäureester
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Ferulasäure (4,85 g) und anschließend n-Propylalkohol (50
ml), der Chlorwasserstoff (4 %) enthielt, wurden in einen
länglichen Kolben (200 ml) gegeben und über Nacht unter
Rückfluß erhitzt. Nachdem die Abwesenheit von
Ausgangsmaterial durch Dünnschichtchromatographie (TLC:
n-Hexan/Ethylacetat = 2/1) bestätigt wurde, wurde das
Lösungsmittel mit einem Rotationsverdampfer bei
vermindertem Druck abgezogen. Nach Zugabe von Benzol zu
dem Rest, wurde das Lösungsmittel erneut mit einem
Rotationsverdampfer abgezogen, wobei das Rohprodukt
erhalten wurde. Das so erhaltene Rohprodukt wurde
getrennt und mit Kieselgelsäulenchromatographie
(Durchmesser = 5,5 x 7,0 cm; 60 g; n-Hexane/Ethylacetat =
2/1) gereinigt, wobei die oben angegebene Verbindung
(5,48 g, 91,6 %) als farbloses Öl erhalten wurde.
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¹H-NMR (CDCl&sub3;, δppm) : 0,99 (t, 3H, J = 7,33 Hz), 1,72 (s,
2H, J = 7,33 Hz), 3,90 (s, 3H, OCH&sub3;), 4,16 (t, 2H, J =
6,9 Hz), 6,11 (s, 1H, OH), 6,30 (d, 1H, J = 15,6 Hz),
6,91 (d, 1H, J = 8,25 Hz), 7,02 (s, 1H), 7,05 (dd, J =
8,23 Hz), 7,61 (d, 1H, J = 15,6 Hz)
(5) Herstellung von n-Butylferulasäureester
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Ferulasäure (5 g) und n-Butylalkohol (50 ml), der
Chlorwasserstoff (4 %) enthielt, wurden nacheinander in
einen länglichen Kolben (200 ml) gegeben und unter
Rückfluß zwei Stunden lang erhitzt. Nachdem die
Abwesenheit von Ausgangsmaterial mit
Dünnschichtchromatographie (TLC: n-Hexan/Ethylacetat =
2/1) bestätigt wurde, wurde das Lösungsmittel mit einem
Rotationsverdampfer unter vermindertem Druck abgezogen.
Nach Zugabe von Benzol zu dem Rest wurde das
Lösungsmittel nochmals mit einem Rotationsverdampfer
abgezogen, um das Rohprodukt zu erhalten. Das so
erhaltene Rohprodukt wurde abgetrennt und mit
Kieselgelsäulenchromatographie (Durchmesser = 5,5 x
8,5 cm; 70 g; n-Hexan/Ethylacetat = 2/1) gereinigt, wobei
die oben angegebene Verbindung (6,25 g, 99 %) als
farbloses Öl erhalten wurde.
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H-NMR (CDCl&sub3;, δppm): 0,96 (t, 3H, J = 7,33 Hz), 1,44
(seq, 2H, J 7,33 Hz), 1,68 (quint, 2H, J = 6,88 Hz),
3,91 (s, 3H), 4,21 (t, 2H, J = 6,88 Hz), 6,04 (s, 1H,
OH), 6,29 (d, J 16,0 Hz, 1H), 6,91 (d, J = 8,25 Hz),
7,02 (5, 1H), 7,05 (dd, J = 8,25 Hz)
Beispiel 2: Effekt der Testverbindungen auf die
Proteoglycanentleerung in Chondrocytenkulturen
(a) Herstellung der kultivierten Chondrocyten
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Die Knorpel wurden steril aus Schulter- und Kniegelenken
von Kaninchen (weiße Neuseelandkaninchen) (Körpergewicht
von 1 bis 1,5 kg) . Die Knorpel wurden gründlich mit PBS
(-) (frei von Ca , Mg ), Hanks-Lösung und 0,1 % EDTA-PBS
(-) gewaschen und anschließend in kleine Segmente (1 mm x
1 mm x 1mm) geschnitten. Nach Zugabe von PBS (-), das 0,1
% EDTA enthielt, wurden die Segmente in einen Inkubator
mit 37ºC 30 Minuten lang stehen gelassen. Anschließend
wurden die Segmente mit einer Trypsinlösung (0,25 %) bei
37ºC eine Stunde lang behandelt, um das an den Knorpel
anhaftende Bindegewebe zu entfernen. Nach dem Entfernen
des Überstandes wurden die Knorpel 2 bis 2,5 Stunden lang
in einem Ham F-12-Medium behandelt, das 10 % fetales
Rinderserum (FBS) und 0,2 % Kollagenase enthielt.
Anschließend wurde die Kollagenase-Lösung zentrifugiert
(1500 upm) und die Restchondrocyten wurden zweimal mit
Ham F-12-Medium (Chondrozytenkulturmedium), das 10 % FRS
enthielt, gewaschen. Schließlich wurde die resultierende
Suspension so eingestellt, daß die Chondrocyten in der
Konzentration von 3 x 10&sup5; Zellen/ml in dem
Chondrozytenkulturmedium suspendiert waren. Die
Chondrocyten wurden in einer Menge von 1 ml pro
Vertiefung auf Platten mit 24 Vertiefungen eingesetzt.
Die Chondrocyten wurden nach vier Tagen konfluent. Der
Versuch wurde innerhalb von zwei Wochen nach dem
Erreichen des konfluenten Zustandes ausgeführt.
(b) Zugabe der zu testenden Verbindungen und der
Proteoglycan entleerenden Mittel
-
Das Chondrocytenkulturmedium, das zur Kultivierung der
Chondrocyten verwendet worden war, wurde aus jeder
Vertiefung entfernt und 800 ul frisches serumfreies
S-Clone-Medium, das 0,1 % menschliches Serumalbumin
enthielt, wurde zugegeben. Ferner wurden 100 ul S-Clone-
Medium, das die zu testenden Verbindungen enthielt (die
Verbindung in der Konzentration des zehnfachen der
Endkonzentration enthaltend; DMSO-Konzentration = 2,5 %)
zugegeben. Die Chondrocyten wurden in Anwesenheit von
Kohlendioxid (5 %) und Luft (95 %) zwei Stunden lang
kultiviert. Anschließend wurde das Proteoglycan
entleerende Mittel, PMA (Phorbol-Myristatacetat)
(Endkonzentration = 0,1 uh/ml) oder Interleukin-1α
(IL-1α) (Endkonzentration = 20 u/ml) zu dem Kulturmedium
der Chondrocyten zugegeben.
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Es lagen die folgenden zu testenden Verbindungen vor:
Verbindungen der vorliegenden Erfindung: Coffeinsäure
(CFA: Tokyo Kasei Kogyo Co., Ltd.), Ferulasäure
(FLA: Sigma Chemical Co.) und 3-Ethoxy-4-hydroxyzimtsäure
(3-EtO-4-HO-CA: Verbindung hergestellt nach Beispiel
1(1).
Vergleichsubstanzen: Indometacin (Sigma Chemical Co.)
(c) Proteoglycanbestimmung
-
Die Proteoglycanentleerung wurde die Messung des
Glycosaminoglycangehalts (Hauptbestandteil von
Proteoglycan, im folgenden als GAG bezeichnet) nach dem
Aufspalten der Chondrocytenmatrix mit Papain bestimmt.
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Nach zwei Tagen wurde der Überstand der
Chondrocytenkultur entfernt. Anschließend wurde 1 ml
0,03 % Papainlösung zu der verbleibenden
Chondrocytenmatrixschicht zugegeben und eine Reaktion
wurde bei 65ºC eine Stunde lang durchgeführt, um das GAG
aus der Matrixschicht freizusetzen. Der Gehalt des GAG in
der Papainlösung wurde durch das
1,9-Dimethylmethylenblauverfahren bestimmt (siehe R.W. Farndale, Biochim.
Biophys. Acta., Bank 883, S.173-177, 1986). Der GAG-
Gehalt in der Chondrocytenmatrix des Kontrolltests, bei
dem das Proteoglycan entleerendes Mittel nicht zugegeben
wurde, wurde als "100" dargestellt und die relative GAG-
Menge für jeden Versuch mit Ausnahme des Kontrolltests
durch die folgende Formel berechnet:
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Relative GAG-Menge (%) = (B/A) x 100
-
worin A den GAG-Gehalt des Kontrolltests, bei dem das
Proteoglycan entleerende Mittel nicht zugegeben wurde,
darstellt und B den GAG-Gehalt darstellt, bei dem die
Proteoglycan entleerenden Mittel alleine zugegeben
wurden, oder den GAG-Gehalt, bei dem die Proteoglycan
entleerenden Mittel und die zu testenden Verbindungen
zugegeben wurden.
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Der GAG-Gehalt der Kontrolltests variierte in einem
Bereich von 28,0 bis 74,5 ug/ml in Abhängigkeit von dem
Zeitpunkt, an dem die Chondrocyten confluent wurden, bis
zu dem Zeitpunkt, an dem die Chondrocyten in dem
vorstehend beschriebenen Versuch verwendet wurden.
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Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 dargestellt. Der GAG-
Gehalt ist der Wert des mittleren Wertes 1 Standardfehler
(n = 3 bis 6). Für jede der zu testenden Verbindung wurde
der Kontrolltest und der Proteoglycanentleerungstest, bei
dem das Proteoglycan entleerende Mittel zugegeben wurde,
durchgeführt und die Ergebnisse davon sind ebenfalls
dargestellt. Die Signifikanz wurde durch Student's t-test
unter Bezug auf den Proteoglycanentleerungstest
durchgeführt, bei dem Proteoglycan entleerendes Mittel
zugegeben wurde. Die Ergebnisse der Bestimmung sind wie
folgt dargestellt:
-
*: P < 0,05;
-
**: P < 0,01;
-
Im Vergleich mit dem GAG-Gehalt in Kontrolltests, bei
welchen das Proteoglycan entleerende Mittel nicht
zugegeben wurde, induzierte die Zugabe der Proteoglycan
entleerenden Mittel PMA einen, Verlust des GAG-Gehalts.
Unter diesen Bedingungen hemmte oder reduzierte die
erfindungsgemäße Verbindung deutlich den GAG-Gehalt und
zeigte eine Funktion zur Hemmung oder Unterdrückung der
Proteoglycanentleerung. Andererseits zeigte Indomethacin,
ein herkömmliches analgetisches und entzündungshemmendes
Mittel, nicht die Funktion zur Hemmung oder Unterdrückung
der Proteoglycanentleerung, sondern verursachte eine
deutliche Verstärkung der Proteoglycanentleerung.
Tabelle 2
Beispiel 3: Effekt der Testverbindungen auf die
Proteoglycanentleerung im Mouse Air Pouch Model
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Das in diesem Beispiel verwendete Verfahren basierte auf
dem in K.M.K. Bottomley et al., Br. J. Pharmacol., Bank
93, S.627-635 (1988) beschriebenen Verfahren.
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Der Femurkopfknorpel (FHC; 40 bis 50 mg) wurde unter
sterilen Bedingungen bei S.D. Ratten (5,5 Wochen alt,
weiblich) entnommen, in ein Baumwolltuch (5 mm x 5 mm;
etwa 3 mg) gewickelt und anschließend subcutan in die
Rücken (in die am Vortag 5 ml Luft injiziert wurden) von
BALB/c-Mäusen (sieben Wochen alt, weiblich) implantiert.
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n-Propylferulasäureester [nPrFLA; hergestellt nach
Beispiel 1(4)] wurden in einer wässrigen Lösung einer
Mischung aus CMC und Tween 80 (Endkonzentration: CMC =
0,3 %, Tween 80 = 0,05 %) dispergiert und oral bei einer
Dosis von 100 mg/kg, beginnend mit dem dritten Tag nach
der Implantation bei einer Rate von fünfmal pro Woche
verabreicht. Eine wässrige Lösung einer Mischung des CMC
und Tween 80 wurde der Kontrgllgruppe oral verabreicht.
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Die implantierten FHCS wurden am 21. Tag nach der
Implantation herausgenommen und die FHC-Matrizen
anschließend mit einer Papainlösung (4 u/ml Papain,
0,05M PBS, pH 6,5, 10 ml) digestiert. Nach der
Digestation wurde der GAG-Gehalt in der Papainlösung mit
der 1,9-Dimethylmethylenbaumethode (R.W. Farndale, siehe
oben) bestimmt.
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Bei der nicht behandelten Gruppe wurden die FHCs am
dritten Tag nach der Implantation herausgenommen und der
GAG-Gehalt gemessen.
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Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 aufgeführt. Der GAG-
Gehalt/FHC in Tabelle 3 ist der Wert des Mittelwertes
+ Standardfehler (n = 8 bis 10) des GAG-Gehalts pro FHC.
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Die relative GAG-Menge (%) ist die relative Menge zu dem
Zeitpunkt als der GAG-Gehalt/FHC der nicht behandelten
Gruppe 100 beträgt.
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Der Knorpelzerstörungsfaktor wurde aus den neu gebildeten
Granuloma im Umfeld der implantierten FHCS bestimmt.
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Danach wurde eine Verminderung von GAG in der
Kontrollgruppe beobachtet. Auf der anderen Seite wurde
eine Unterdrückung der GAG-Verminderung in der Gruppe
beobachtet, bei der die erfindungsgemäße Substanz
verabreicht wurde. Die Wirkung der erfindungsgemäßen
Substanz zur Unterdrückung von Knorpelzerstörung wurde
damit bestätigt.
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Ferner zeigten Methylferulasäureester,
Ethylferulasäureester und n-Butylferulasäureester ähnliche Effekte wie
n-Propylferulasäureester.
Tabelle 3
Beispiel 4: Formulierung von Granulat
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Die folgenden Inhaltsstoffe wurden homogen gemischt:
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Ferulasäure 20 Gewichtsteile
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Lactose 68 Gewichtsteile
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niedrigsubstituierte
Hydroxypropylcellulose 10 Gewichtsteile
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Hydroxypropylcellulose 2 Gewichtsteile
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Die Mischung wurde unter Verwendung von 32 Gewichtsteilen
eines Befeuchtungsmittels, Ethanol, geknetet.
Anschließend wurde die geknetete Mischung durch
Feuchtgranulation granuliert und getrocknet. Wie oben
erläutert, hemmt die erfindungsgemäße Substanz stark die
Proteoglycanentleerung aus der chondrocyten Matrix und
zeigt eine Funktion zum Schutz von Knorpel. Ferner hat
die erfindungsgemäße Substanz eine niedrige Toxizität.
Entsprechend ist die erfindungsgemäße Substanz zur
Behandlung von Arthropatie, wie etwa rheumatische
Arthritis, Osteoarthritis, Periarthritis
Humeroscapularis, Schulter-Arm-Hals-Syndrom, Lumbago usw.
sehr nützlich.