DE69524639T2

DE69524639T2 - Modifizierte mehrfach ungesättigte fettsäuren

Info

Publication number: DE69524639T2
Application number: DE69524639T
Authority: DE
Inventors: John Easton; Antonio Ferrante; Joseph Pitt; Alfred Poulos; Ann Rathjen; Alistair Robertson
Original assignee: Womens and Childrens Hospital Adelaide; Peptech Ltd
Current assignee: Womens and Childrens Hospital Adelaide; Teva Pharmaceuticals Australia Pty Ltd
Priority date: 1994-10-13
Filing date: 1995-10-13
Publication date: 2002-08-08
Anticipated expiration: 2015-10-14
Also published as: EP0869941B1; ATE210640T1; CA2202503A1; EP0869941A4; US6376688B1; WO1996011908A1; KR100463709B1; CA2202503C; EP0869941A1; JPH10507179A; CN1088058C; KR970707088A; DE69524639D1; CN1163609A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft neue mehrfach ungesättigte Fettsäuren mit Antimalaria- Wirkung und/oder neutrophil stimulierender Wirkung.
Über die Hälfte der Weltbevölkerung wird von Malaria bedroht, mit über 500 Millionen akuten Infektionen und etwa einer Million Toten pro Jahr. (Tropical Diseases Progress in International Research, 1987-1988, Ninth Programme Report, UNDP/World Bank/WHO, Geneva, 43-49, Stevenson mm Preface In: Stevenson mm.Ed. Malaria, Host responses to Infection, CRC Press, Inc). Die Verwendung von Antimalaria-Arzneimitteln wird wegen zunehmender Resistenz und toxischer Nebenwirkungen von größeren Problemen begleitet. Die in letzter Zeit verwendeten Antimalariamittel sind für die Verwendung bei Kindern (die am meisten von potentiell tödlicher cerebraler Malaria bedroht sind), schwangeren Frauen und älteren Menschen ungeeignet.
Entzündungen können von Bakterien, Viren und/oder anderen Infektionsmitteln, opportunistischen Infektionen (die auf einen immundepressiven Zustand folgen können, der beispielsweise von einer Krebstherapie, insbesondere einer cytotoxischen Arzneimitteltherapie oder Radiotherapie herrührt), Autoimmunität oder auf andere Weise verursacht werden. Viele der klinischen Merkmale eines Gram-negativen septischen Schocks können in Tieren durch die Verabreichung von LPS reproduziert werden. Mit der Injektion von LPS einhergehend ist die extensive Produktion von pro-entzündlichen Cytokinen wie dem Tumor-Nekrose-Factor-alpha (TNFα). Kachexie, welche charakteristisch für die chronische Exposition auf TNF oder Interleukin-6 ist, ist ein übliches Symptom für fortgeschrittene Malignität oder schwere Infektion. Für sie typisch ist ein abnormer Protein- und Glucose-Metabolismus und Verfall des Körpers. Die chronische Verabreichung von TNF und IL-1 an Mäuse, Ratten und/oder Menschen verursacht Anorexie, Gewichtsverlust und Schwund von Körperlipid und -Protein innerhalb von sieben bis zehn Tagen (Cerami et al., 1985, Immunol. Lett., 11, 173; Fong et al., 1989, J. Exp. Med. 170, 1627, Moldawer et al., Am. J. Physiol, 254 G450-G456, 1988, Fong et al. Am. J. Physiol. 256. R659- R665/1989), McCarthy et al., Am. J. Clin. Nature, 42, 1179-1182, 1982). TNF-Niveaus sind an Patienten mit Krebs und chronischer Erkrankung, welche mit Kachexie einhergeht, bestimmt worden.
TNFα und IL-1, mit ihren gemeinsamen funktionalen Aktivitäten wie der Pyrogenizität, Somnogenizität und ihrer Mediatorenwirkung für Entzündungen, sind mit der Pathologie anderer Krankheiten in Verbindung gebracht worden, die, abgesehen von toxischem Schock und Krebsabhängiger Kachexie, mit chronischen Entzündungen assoziiert wurden. TNF ist in Synovialflüssigkeit bei Patienten sowohl mit rheumatoider als auch reaktiver Arthritis nachgewiesen worden und im Serum von Patienten mit rheumatoider Arthritis (Saxne et al., 1988. Arthrit. Rheumat. 31, 1041). Erhöhte Spiegel von TNF sind in Patienten mit Nierentransplantation festgestellt worden während akuter Abstoßungsphasen (Maury and Teppo 1987, J. Exp. Med. 166, 1132). Bei Tieren wurde TNF als beteiligt bei der Pathogenese von Graft-versus-Host- Krankheiten der Haut und des Magens im Anschluß an allogene Knochenmarks- Transplantation nachgewiesen.
Die Verabreichung von Kaninchen-Anti-Murin-TNF-Antikörpern wurde nachgewiesen, histologische Änderungen, die mit Graft-versus-Host-Krankheit in Verbindung gebracht werden, zu verhindern und die Sterblichkeit zu reduzieren (Piguet et al. 1987, J. Exp. Med. 166, 1220). Es wurde ebenso nachgewiesen, dass TNF signifikant zur Pathologie von Malaria beiträgt (Clark et al. 1987, Am. J. Pathol. 129, 192-199). Es wurde weiterhin berichtet, dass erhöhte Serumspiegel von TNF in Malariapatienten vorkommen (Scuderi et al., 1986, Lancet 2, 1364-1365).
Multiple Sklerose (MS) ist eine chronische Entmarkungskrankheit des Zentralnervensystems und ist die häufigste chronische neutroligische Krankheit junger Erwachsener. Die Häufigkeit von MS und ihr Verteilungsmuster haben sich seit Dekaden nicht verändert. Die Krankheit bleibt im Wesentlichen unheilbar.
MS befällt üblicherweise weite Bereiche der weißen Hirnsubstanz im zentralen Nervensystem (ZNS), am Häufigsten die preventrikuale weiße Hirnsubstanz, den Gehirnstamm, das Rückenmark und die optischen Nerven. Der primäre Prozess zerstört die Myelinschichten und tötet gelegentlich die Oligodendrocyten, die die charakteristischen Plaques des MS bilden.
Die frühe Entwicklung der Plaques ist gekennzeichnet durch die Entwicklung perivaskulärer Entzündungen, gefolgt durch die Migration von Lymphocyten, Plasmazellen und Makrophagen in die Läsion. Darauf folgen die Astrocytengliose und die Versuche der Entmarkung durch Oligodendrocyten. Der Plaque wird von Lymphocyten umgeben.
Anti-T-Zellen-Mittel wie Anti-CD4-Behandlung sind wirksam. Solche Mittel verhindern die Proliferation von T-Zellen.
Obwohl die Ätiologie von MS weiterhin unbekannt ist, war das Hauptaugenmerk der Forschungsanstrengungen, welche zu plausiblen Hypothesen geführt haben, auf die Immun- Disregulierung, einschließlich Autoimmunität und genetischer Prädisposition, welche beide in der tatsächlichen Entwicklung der Krankheit eine Rolle spielen könnten, gerichtet. Sowohl TNFβ (Lymphotoxin) und TNFα sollen eine Rolle in der Pathophysiologie spielen.
Multiple immunologische Abnormitäten werden wiederholt bei Patienten in einem akuten Stadium der Krankheit gefunden. Die Synthese von Immunoglobulinen, die in der Peripherie normal ist, ist im zentralen Nervensystem erhöht, und die produzierten Antikörper haben ein charakteristisches Bandenmuster. Die antigene Spezifität dieser Antikörper ist nicht bekannt, und es ist unklar, ob sie eine Rolle im Fortschreiten der Krankheit zu spielen haben.
Verschiedene Stressfaktoren sind bekannt dafür, das Immunsystem zu aktivieren, wie virale Infektionen oder Operationen auch eine Verschlimmerung von MS herbeiführen können. Andere Aktivatoren wie γ-Interferon erzeugen ähnliche Wirkungen, wenn sie verabreicht werden. Zusätzlich kann beispielsweise eine immunosuppressive Anti-Entzündungs-Therapie mit Corticosteroiden eine leichte Remission oder zumindest Erleichterung für kurze Zeiträume schaffen.
Myelopathie, eine Krankheit des Rückenmarks, kann viele verschiedene Ätiologien haben, von denen die meisten durch Entzündungen vermittelt sind, einschließlich der folgenden:
Neurosyphillis;
B&sub1;&sub2;- oder Folat-Mangel;
Sarcoidose;
transverse Myelitis;
Arachidonitis;
cervicale Spondylitis;
Krankheit der motorischen Neuronen;
Neurofibromatose;
Rückenmarkskompression wegen Tumors, Platte oder Arthritis;
Lupus-Erythematose des Rückenmarks und
virale Encephalomyelitis.
Chronische Entzündungen, oder, besser bekannt als chronische Immunsystemaktivierung, entsteht in Antwort auf persistentes Antigen, dessen Ursprung exogen sein kann oder von einem Autoimmunzustands herrühren kann. Solche chronischen Entzündungen führen zu lokaler Gewebezerstörung und, abhängig vom Typ der Entzündung, können sie wegen der zurückgehaltenen Herstellung von Entzündungsmediatoren zu systemischen Effekten führen. Solche Entzündungsmediatoren schließen die Cytokine ein, welche lösliche Mediatoren sind, die durch aktivierte Lymphocyten und Makrophagen hergestellt werden und die zelluläre Kommunikation und physiologische Antwort bewirken. Chronische Immunaktivierung kann als Folge von infektiösen Krankheiten wie dem chronischen Ermüdungssyndrom oder toxischen Schocksyndrom auftreten oder durch Autoimmun-Mechanismen, die zu solchen Zuständen wie rheumatoider Arthritis, entzündlicher Darmkrankheit, Crohns-Krankheit und anderen Krankheiten wie der Graft-versus-Host-Krankheit.
Rheumatoide Arthritis (Marrow et al., I "Autoimmune Rheumatic Disease", Blackwell Scientific Publ, Oxford, UK, Kap. 4, S. 148-207 (1987)) ist eine Krankheit, die durch chronische Entzündungen und Erosion der Gelenke charakterisiert wird, die bis zu 3% der Bevölkerung, einschließlich Kindern, befallen kann. Symptome der rheumatoiden Arthritis schließen morgendliche Steifheit, Anschwellen und Schmerzen bei Bewegung in wenigstens einem Gelenk und Gelenkschwellung ein. Nicht spezifische Symptome umfassen Lethargie, Anorexie und Schwächung als auch Fieber, und Lymphadenopathie (charakteristisch für Immunaktivierung) kann der Auswirkung auf die Gelenke vorangehen. Extra-artikuläre Manifestationen von rheumatoider Arthritis schließen Vasculitis, Katarakte, Uveitis, interstitielle Fibrose, Pericarditis und Myocarditis, periphere Neuropathie, Myeloidablagerungen, chronische Anämie und subkutane oder Lungen-Knötchen ein.
Genetische Faktoren und infektiöse Mittel, einschließlich Bakterien, Pilze, Mycoplasmen und Viren, sind mit der Entwicklung von rheumatoider Arthritis in Verbindung gebracht worden. Milde rheumatoide Arthritis kann mit nicht-steroiden Anti-Entzündungs-Arzneimitteln behandelt werden, während schwere Fälle systemische Corticosteroide, Antimetaboliten oder cytotoxische Mittel erfordern. Experimentell sind monoklonale Anti-CD4-Antikörper und Anti-TNFα-Antikörper zur Behandlung rheumatoider Arthritis eingesetzt worden (Horneff et al., Cytokine 3, 266-267 (1991), Horneff et al., Arth. Rheum. 34, 129-140 (1991) und Shoenfeld et al., Clin. Exp. Rheum. 9, 663-673 (1991), Williams et al., 1992, PNAS 89, 9784).
Entzündliche Darmkrankheit (IBD) und Crohns-Krankheit sind chronische entzündliche Zustände, die einige der Kriterien einer Autoimmunkrankheit erfüllen (Snook, Gut 31, 961-963 (1991)). Entzündung und Gewebeschäden schließen die Rekrutierung und Aktivierung von Neutrophilen, Makrophagen und Lymphocyten ein (MacDermott et al., Adv. Immunol. 42, 285- 328 (1988)), die Cytokine und pro-entzündliche Moleküle wie Prostaglandine und Leukotriene erzeugen (MacDermott, Mt. Sinai J. Med. 57, 273-278 (1990)). Als Ergebnis der chronischen Aktivierung immunokompetenter Zellen sind IL-1, IL-6 (Starter, Immunol. Res. 10,273-278 (1990), Fiocchi, Immunol. Res. 10, 239-246 (1991)) und TNFα (MacDermott, Mt. Sinai J. Med. 57, 273-278 (1990)) bei Patienten mit IBD und Crohns-Krankheit erhöht.
Zur Verwendung von IBD und Crohns-Krankheit verwendete Arzneimittel schließen Antientzündungsmittel wie Sulfasalazin-(5-ASA)-Corticosteroide, Cyclosporin A und Azathiprin (Hanauer, Scand. J. Gastroenterol. 25 (Supl. 175) 97-106 (1990), Peppercorn, Annal. Intern. Med. 112, 50-60 (1990)) ein. Experimentell sind Anti-CD4 und Anti-TNF-monoklonale Antikörper erfolgreich zur Behandlung von ulcerativer Colitis eingesetzt worden (Emmerich et al., Lancet 338, 570-571 (1991)).
Während ein Wirt gegen ein genetisch inkompatibles Transplantat, welches eine Host-versusgraft-Antwort erzeugt, reagieren kann, reagiert ein immunokompetentes Transplantat (wie Knochenmark oder Darmgewebe) gegen den Wirt und führt zu einer Graft-versus-Host-Krankheit. Diese Reaktionen werden durch allogene Antworten vermittelt, die gegen ein fremdes MHC- Molekül gerichtet sind und in vitro durch die gemischte Lymphocytenreaktion (MLR) nachgeahmt wird. Transplantat/Wirt-Interaktionen führen zu chronischer Entzündung, welche das transplantierte Gewebe umgeben, mit einem Anstieg der Marker der Immunaktivierung, wie in ADS festgestellt wird (Grant, Immunol. Today 12, 171-172 (1991)). Die Behandlung von Transplantat/Wirt-Interaktionen schließt gegenwärtig entweder Azathioprin, Cyclosporin A oder Methylprednison ein und, in letzter Zeit, Rapamycin (Spekowski et al., Transplantation 53, 258-264 (1992), Huber et al., Bibliotheca Cardiolociga, 43, 103-110 (1988)). Für CD3 spezifische monoklonale Antikörper (Wissing et al., Clin Exp Immunol. 83, 333-337 (1991)), CD4 (Reinke et al., Lancet 338, 702-703 (1991)) und TNFα sind experimentell verwendet worden, um Graft/Host- Reaktionen zu verhindern.
Mehrfach ungesättigte Fettsäuren (Polyunsaturated fatty acids, PUFAs) besitzen einen breiten Bereich wertvoller biologischer Aktivitäten (siehe z. B. internationale Patentanmeldungen WO 93/00084 und WO 95/00607 und die dort zitierten Literaturstellen). Wegen ihrer beschränkten Stabilität in vivo ist die Verwendung der PUFAs als Arzneimittel leider nicht weit verbreitet. Die Erfinder dieser Erfindung haben substituierte PUFAs entwickelt, die, während sie ihre biologische Aktivität beibehalten, eine in vivo erhöhte Stabilität besitzen, d. h. einen langsameren metabolischen Durchsatz. Diese neuen PUFA-Verbindungen haben direkte Anti-Malaria- Wirksamkeit. Zusätzlich zu ihrer direkten Anti-Malaria-Wirkung aktivieren die neuen PUFAs menschliche Neutrophile, die die Freisetzung von Granulum-Inhaltsstoffen verursachen, und zeigen Synergie mit TNF bei der Herstellung von Superoxiden. Die Aktivierung menschlicher Neutrophile durch die PUFAs führte zu einer verstärkten Fähigkeit dieser Zellen, Malaria- Parasiten (P. falciparum) innerhalb roter Blutkörperchen abzutöten und auch das Bakterium Staphylococcus aureus.
Weiterhin haben die Erfinder der vorliegenden Erfindung gefunden, das die mehrfach ungesättigten Fettsäuren, vor allem ihre Hydroxy- und Hydroperoxy-Derivate, die Produktion von Cytokinen unterdrücken.
Im folgenden bedeutet das Wort "Substitution" im Zusammenhang mit β-Oxa, β-Thia, γ-Oxa und γ-Thia den Ersatz eines Kohlenstoffatoms durch ein Sauerstoff- oder Schwefelatom, während im Zusammenhang mit Hydroxy, Hydroperoxy, Peroxy und Carboxymethyl das Wort "Substitution" sich auf die Addition dieser Gruppen an ein Kohlenstoffatom durch Ersatz des Wasserstoffatoms bezieht.
Die neuen PUFAs schließen mindestens eine β-Oxa-, β-Thia-, γ-Oxa- oder γ-Thia-Substitution ein. Während die gesättigten β-Oxa-Fettsäuren unter Verwendung des Standardverfahrens für die Ethersynthese durch Reaktion der Alkylhalogenide mit den Dianionen der α-Hydroxysäuren oder durch Behandlung der α-Halogensäuren mit deprotonierten Alkoholen erhalten werden können, sind die ungesättigten β-Oxa-Fettsäuren der vorliegenden Erfindung unter Verwendung normaler Verfahren nicht erhältlich. Versuche, die ungesättigten Verbindungen in dieser Weise zu erhalten, führen lediglich zu Zersetzungsprodukten, die aus ungewünschten Nebenreaktionen an den olefinischen und allylischen Kohlenstoffatomen herrühren.
In einer neueren Variation des Standardverfahrens wurden gesättigte β-Oxa-Fettsäuren durch nucleophile Substitutionsreaktionen unter weniger harten Bedingungen erhalten, durch Behandlung von durch Komplexierung mit Bortrifluorid-Etherat aktivierten Diazoacetaten mit Alkoholen. Bortrifluorid-Etherat ist jedoch bekannt dafür, Isomerisierung von Alkenen zu verursachen, und es ist deshalb ungeeignet für die Verwendung bei der Synthese von ungesättigten β-Oxa-Fettsäuren.
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben nun gefunden, dass ungesättigte β-Oxa-Fettsäuren in guten Ausbeuten erhalten werden können, indem Carbene in die O-H-Bindung von Alkoholen eingefügt werden. Es gibt keine Komplikationen durch andere Carben-Einfügungsreaktionen und, besonders wichtig, die Olefineinheiten bleiben unter den Reaktionsbedingungen unbeinflusst.
Das Carben kann aus dem entsprechenden Diazoacetat oder Diazoalkan durch Behandlung mit einem Katalysator wie einem Rhodiumsalz hergestellt werden. Die Reaktion des Carbens mit dem komplementären Alkohol, der entweder ein Derivat von α-Hydroxy-Essigsäure oder ein ungesättigter Fettsäurealkohol ist, ergibt die ungesättigte β-Oxa-Fettsäure. In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Alkohole solche, die durch Reduktion von natürlich vorkommenden ungesättigten Fettsäuren oder den entsprechenden Estern erhalten werden, und die Reaktion mit einem Ester der Diazoessigsäure ergibt die ungesättigte β-Oxa-Fettsäure.
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben außerdem gezeigt, dass sowohl β-Oxa- als auch β-Thia-substituierte Fettsäuren nicht in der Lage sind, β-Oxidationen einzugehen. Zusätzlich zeigen einige der neuen Verbindungen andere Eigenschaften, die sich von denen der natürlichen PUFAs unterscheiden, einschließlich erhöhter Löslichkeit, wechselnder Oxidations- Reduktions-Potentiale und unterschiedlicher Ladung und Polarität.
Entsprechend besteht die vorliegende Erfindung in einem ersten Aspekt in einer mehrfach ungesättigten Fettsäure mit Antimalaria- und/oder neutrophil stimulierender Wirkung, worin die mehrfach ungesättigte Fettsäure 18-25 Kohlenstoffatome und 1-6 Doppelbindungen enthält und worin die mehrfach ungesättigte Fettsäure eine oder zwei Substitutionen aufweist, die ausgewählt sind aus der Gruppe, die aus β-Oxa, γ-Oxa, β-Thia und γ-Thia besteht.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung schließt die mehrfach ungesättigte Fettsäure eine weitere Substitution ein, die ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus Hydroxy, Hydroperoxy, Peroxy und Carboxymethyl-Substitutionen besteht. In einer weiteren Ausführungsform ist die substituierte Fettsäure kovalent an eine Aminosäure gebunden.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung enthält die mehrfach ungesättigte Fettsäure 20-25 Kohlenstoffatome und 3-6 Doppelbindungen und ist vorzugsweise eine n-3- bis n-6-Fettsäure.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung besitzt die mehrfach ungesättigte Fettsäure 21 Kohlenstoffatome mit 3-4 Doppelbindungen, enthaltend eine β- Oxa oder β-Thia-Substitution, 22 Kohlenstoffatome mit 3-4 Doppelbindungen, enthaltend eine γ-Thia oder β-Oxa-Substitution, 23 Kohlenstoffatome mit 3-4 Doppelbindungen, enthaltend eine β-Thia-Substitution, 24 Kohlenstoffatome mit 3-4 Doppelbindungen, enthaltend eine γ- Thia-Substitution, 25 Kohlenstoffatome mit 3-6 Doppelbindungen, enthaltend eine β-Oxa- Substitution, 25 Kohlenstoffatome mit 3-6 Doppelbindungen, enthaltend eine β-Thia- Substitution, oder 23 Kohlenstoffatome mit 3-6 Doppelbindungen, enthaltend β-Thia und α- Carboxmethyl-Gruppe.
In noch einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung besitzt die mehrfach ungesättigte Fettsäure eine ω-Hydroxy-Substitution.
In einer weiteren bevorzugten Form der Erfindung ist die mehrfach ungesättigte Fettsäure an eine Aminosäure gebunden, vorzugsweise Asparaginsäure oder Glycin.
In einem zweiten Aspekt der vorliegenden Erfindung besteht diese in einem Verfahren zur Herstellung einer ungesättigten, Oxa-substituierten Fettsäure, umfassend die Reaktion eines ungesättigten Fettsäurealkohols mit einem Carben, sodass das Carben in die O-H-Bindung des Alkohols eingeschoben wird.
In einer bevorzugten Ausführungsform dieses Aspekts der vorliegenden Erfindung enthält der ungesättigte Fettsäurealkohol 18-25 Kohlenstoffatome und 1-6 Doppelbindungen.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform dieses Aspekts der Erfindung wird das Carben durch Rhodiumacetat-katalysierte Behandlung einer Diazoverbindung hergestellt.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform dieses Aspekts der vorliegenden Erfindung wird eine ungesättigte β-Oxa-substituierte Fettsäure hergestellt.
In einem dritten Aspekt besteht die vorliegende Erfindung in einem Hydroxy-, Hydroperoxy- oder Peroxy-Derivat einer mehrfach ungesättigten Fettsäure der Erfindung zur Verwendung in einem Verfahren zur Behandlung von Entzündungen des menschlichen oder tierischen Körpers.
In einer bevorzugten Ausführungsform dieses Aspekts der vorliegenden Erfindung wird die mehrfach ungesättigte Fettsäure ausgewählt aus der Gruppe, die besteht aus der C20 : 4n-6 (5, 8,11,14-Eicosatetraensäure), C20 : 5n-3 (5,8,11,14,17-Eicosapentaen), C22 : 6n-3 (4,7,10, 13,16,19-Docosahexaensäure) und Arachidonsäure.
Neutrophil/Macrophagen-stimulierende Mittel können in der Behandlung anderer Infektionen angewendet werden, einschließlich Candida sp, Trypanosom, Schistosomiasis, Tuberkulose, Viren, z. B. Herpes, Sindbis-Virus, Legionella, Listeriose, Pneumocystis und Pseudomonas. Sie sind ebenfalls nützlich als Adjunkt-Therapie bei immunkompromittierten Individuen, einschließlich solcher, die einer Krebs-Chemotherapie unterzogen werden, und Transplantations- Empfängern und Verbrennungspatienten. Zusätzlich zu anderen können sogenannte normale Individuen behandelt werden, z. B. alte Menschen, Kinder unter zwei und Alkoholiker, die bekanntlich eine geringe phagocytische Zellaktivität besitzen.
Damit das Wesen der vorliegenden Erfindung klarer verstanden werden kann, werden nun bevorzugte Formen unter Bezug auf die folgenden Beispiele und Figuren beschrieben, in denen:
Fig. 1a Arachidonsäure-5,8,11,14-eicosatetraensäure zeigt
Fig. 1b 5-Hydroperoxy-6E,8Z,11Z,14Z-eicosatetraensäure zeigt
Fig. 1c 9-Hydroperoxy-5Z,7E,11Z,14Z-eicosatetraensäure zeigt
Fig. 1d 8-Hydroperoxy-5Z,9E,11Z,14Z-eicosatetraensäure zeigt
Fig. 1e 12-Hydroperoxy-5Z,8Z,10E,14Z-eicosatetraensäure zeigt
Fig. 1f 11-Hydroperoxy-5Z,8Z,12E,14Z-eicosatetraensäure zeigt
Fig. 1g 15-Hydroperoxy-5Z,8Z,11Z,13E-eicosatetraensäure zeigt
Fig. 1h 5-Hydroxy-6E,8Z,11Z,14Z-eicosatetraensäure zeigt
Fig. 1i 9-Hydroxy-5Z,7E,11Z,14Z-eicosatetraensäure zeigt
Fig. 1j 8-Hydroxy-5Z,9E,11Z,14Z-eicosatetraensäure zeigt
Fig. 1k 12-Hydroxy-5Z,8Z,10E,14Z-eicosatetraensäure zeigt
Fig. 1l 11-Hydroxy-5Z,8Z,12E,14Z-eicosatetraensäure zeigt
Fig. 1m 15-Hydroxy-5Z,8Z,11Z,13E-eicosatetraensäure zeigt
Fig. 1n bis 1z einen Bereich substituierter PUFAs zeigt, in denen Y Hydroxy, Hydroperoxy oder Peroxy ist,
Fig. 2a β-Oxa-23 : 4 (n-6) zeigt
Fig. 2b β-Oxa-21 : 3 (n-6) zeigt
Fig. 2c β-Oxa-21 : 3 (n-3)
Fig. 2d β-Oxa-25 : 6 (n-3)
Fig. 2e β-Oxa-21 : 4 (n-3)
Fig. 2f β-Thia 23 : 4 (n-6)
Fig. 2g β-Thia 21 : 3 (n-6)
Fig. 2h β-Thia 21 : 3 (n-3)
Fig. 2i β-Thia 25 : 6 (n-3)
Fig. 2j α-Carboxymethyl-β-thia 23:4 (n-6)
Fig. 2k γ-Thia 24 : 4 (n-6)
Fig. 2l γ-Thia 22 : 3 (n-6)
Fig. 2m γ-Thia 22 : 3 (n-3)
Fig. 2n 16-OH-β-oxa 22 : 3 (n-6)
Fig. 2o 16-OH-β-oxa 22 : 3 (n-3).
Fig. 3 die Wirkung von 20 : 4, 20 : 4-Methylester (ME), 20 : 4-Hydroperoxy (HP) und 20 : 4 Hydroxy (H) auf die Cytokin-Produktion von menschlichen peripheren mononuclearen Blutzellen (PBMC) zeigt, die durch das Mitogen PHA stimuliert sind. 20 : 4-Hydroperoxy und 20 : 4-Hydroxy verhindern Cytokin-Produktion, sowohl die der Macrophagen-abgeleiteten Cytokine (TNFα) und der T-Zellen-abgeleiteten Cytokine (Lymphokine, Interferon, IL-2).
Fig. 4 die Wirkung von 22 : 6, 22 : 6 HP, 22 : 6 H, 20 : 5, 20 : 5 HP und 20 : 5 H auf die PHA- induzierte Cytokin-Produktion zeigt. Diese Verbindungen inhibieren in vitro die Produktion von Macrophagen- und T-Zellen-abgeleiteten Cytokinen.
Fig. 5 zeigt, dass 20 : 4, 20 : 4-Hydroperoxy (HP) und 20 : 4-Hydroxy (OH) die TNFα- induzierte Expression der E-Selektion durch menschliche Nabelvenen-Endothelzellen inhibiert.
Fig. 6 zeigt die Fettsäure-stimulierte Freisetzung aus neutrophil azurophilen Granula.
Fig. 7 zeigt die Fettsäure-stimulierte Freisetzung aus neutrophil spezifischen Granula.
Fig. 8 zeigt den Anstieg der neutrophil vermittelten Tötung von Staphilococcus aureus durch Fettsäuren.
Fig. 9(a) zeigt die komparativen Fähigkeiten von Arachidonsäure und β-Oxa-23 : 4 (n-3), β- Oxidation einzugehen
Fig. 9(b) zeigt, dass die Verbindung die β-Oxidation von Arachidonsäure nicht behindert und daher wahrscheinlich nicht in den normalen Zellmetabolismus eingreift.
Tabelle 1 zeigt die direkte Antimalaria-Aktivität der neuen Fettsäuren gegen Chloroquinsensitive P. falciparum.
Tabelle 2 zeigt die Fähigkeit der neuen Fettsäuren, Neutrophile zu stimulieren, um P. falciparum abzutöten.
Tabelle 3 zeigt die direkte Wirkung der neuen Fettsäuren auf das Überleben von Chloroquin-resistenten P. falciparum.
Tabelle 4 zeigt die Inhibierung der Mitogen-stimulierten Proliferation von Peripherblut- Mononuclearproliferation durch Fettsäuren.
Tabelle 5 zeigt die Inhibierung von PHA-stimulierter TNFα-Produktion durch Fettsäuren.
Tabelle 6 zeigt die Inhibition von Staphilococcus aureus-stimulierter Interferon-γ-Produktion durch Fettsäuren.

VERFAHREN

NACHWEIS VON TNF-INDUZIERTEN ELAM-1 UND ICAM-1

Menschliche Nabelschnur-Endothelzellen (5 · 10&sup4; Durchgang 1) wurden in den mittleren 60 Mulden einer 96-Mulden-Mikroplatte plaziert, und die übrigen Mulden wurden mit Pyrogenfreiem destillierten Wasser gefüllt, um die Verdampfung in den Zellen enthaltenden Mulden zu reduzieren. Die Zellen wurden mit frischem Medium versorgt (M199, angereichert mit 20% FCS und Endothel-Zellen-Wachstumsergänzung) jeden zweiten Tag, bis sie zusammenflossen. Am Tag vor der Auswertung wurden die Zellen mit HBSS gewaschen und erneut versorgt. Am Tag der Auswertung wurde das Medium aspiriert, und in Medium hergestellte Fettsäuren wurden jeder Mulde zugefügt und unterschiedliche Zeiten lang bei 37ºC in 5% CO&sub2; inkubiert, wie in den Figuren dargestellt. Nach dieser Inkubation wurden die Zellen gewaschen und entweder mit TNF oder PMA behandelt, bevor sie dreimal in PBS gewaschen und fixiert wurden (100 uf, 0.025% Glutaraldehyd in PBS, über Nacht bei 4ºC). Die Mulden wurden mit PBS gewaschen, und entweder Anti-ELAM (Becton-Dickinson, 100 ul, 1/1000 in M199, enthaltend 20% FCS) oder Anti-ICAM (Immunotech, 100 ul, 12/2500 in M199, enthaltend 20% FCS) wurden zugesetzt und eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert, wonach die Mulden mit PBS gewaschen wurden und 100 ul Kaninchen-Anti-Maus-Ig-HRP-Konjugat zugesetzt wurde (1/1000, Dako). Es folgte eine weitere Inkubation bei Raumtemperatur eine Stunde lang, bevor die Platten dreimal gewaschen wurden, bevor 100 ul des Substrats (ABTS) zugegeben wurden. Die Farbentwicklung wurde bei 410 nm in einem Mikroplatten-Lesegerät gemessen.

MONONUCLEARE ZELL-PROLIFERATIONS-ASSAYS

Mononucleare Zellen wurden aus Peripherblut normaler menschlicher Spender separiert, wie von Ferrante und Thong (1978) beschrieben. Die mononuclearen Zellen wurden in RPMI-1640, enthaltend 20% Human-AB-Serum, resuspendiert und in 96-Mulden-Mikroplatten platziert (50 ul pro Mulde, Zelldichte 4 · 10&sup6; Zellen/ml). Dann wurde Fettsäure (66 um) in 50 ul zugesetzt und mit den Zellen 30 Minuten lang bei 37ºC in 5% CO&sub2; präinkubiert. Anschließend wurde Mitogen (PHA, ConA, PWM, Staphilococcus aureus) in 100 ul zugegeben, und die Zellen wurden 66 Stunden bei 37ºC in 5% CO&sub2; inkubiert, vor der Zugabe von tritiiertem Thymidin (1 uCi/Mulde). Nach einer Gesamtzeit von 72 Stunden in der Kultur wurden die Zellen geerntet und die Poliferation (Thymidin-Inkorporierung) und die Überstände auf die Anwesenheit von Cytokinen untersucht.

CYTOKIN-ASSAYS

Die Cytokinspiegel in den Kultur-Überständen wurden durch spezifische ELISA unter Verwendung von Anti-Cytokin-Antikörpern bestimmt. Die folgenden Cytokinspiegel wurden bestimmt: TNFα, TNFβ, Interferon-γ, IL-1β und IL-2.

HERSTELLUNG VON FETTSÄURE-MIZELLEN UND VORBEHANDLUNG VON NEUTROPHILEN

Um der Unlöslichkeit der Fettsäuren in wässriger Lösung zu begegnen, wurden gemischte Dipalmitoyl-Phophatidylcholin (DPC, 400 ug): Fettsäure (100 ug)-Mizellen in HBSS durch Ultraschallbehandlung hergestellt. Neutrophile wurden 30 Minuten bei 37ºC vorbehandelt. In einigen Experimenten wurden die PUFAs in Ethanol solubilisiert.

MALARIA-WACHTUMS-INHIBIERUNGS-ASSAY

Aliquots von RBC (5 · 10&sup6; mit 305% Parasitemie) wurden mit Neutrophilen (10&sup6;) in den Mulden einer 96-Mulden-Mikrotiterplatte gemischt und dann zwei Stunden bei 37ºC in 5% CO&sub2; in Luft inkubiert, bevor 1 uCi ³H-Hypoxanthin zugesetzt wurde. Die Platten wurden dann über Nacht inkubiert. Die individuellen Muldeninhalte wurden auf Glasfilterpapier gesammelt, und das inkorporierte ³H in einem Flüssigscintillationszähler gemessen. Dann wurde der Prozentsatz Wachstumsinhibierung des Parasiten berechnet.

MESSUNG DER NEUTROPHILEN CHEMILUMINESZENZ

Zu 100 ul der Neutrophile (1 · 10&sup6;) in HBSS wurden 100 ul Fettsäure-Mizellen oder DPC allein und zusätzliche 300 ul HBSS zugefügt. Darauf folgte unmittelbar der Zusatz von 500 ul Lucigenin (0,25 mg/ml in PBS), und die resultierende Lichtabgabe (mV) gegen die Zeit wurde in einem Luminometer gemessen.
Die Experimente wurden dreifach durchgeführt mit Zellen aus einem gesonderten Individuum, und die dargestellten Werte stellen Peakwerte der Antworten dar.

MESSUNG DER DEGRANULATION

Die Degranulation wurde bestimmt durch Messen von Vitamin B12-bindendem Protein (wie von Gottlieb et al., 1965, Blatt 25, 875-883, beschrieben) und der β-Glucuronidase-Freisetzung (wie von Kolodeney und Mumford, 1976, Clin Chem. Acta 70, 247-257).

BAKTERIZIDER ASSAY

Die neutrophile bakterizide Wirkung gegen Staphilococcus aureus wurde nach dem von Ferrante und Abell, 1986, Infekt. Immun. 51, 607 beschriebenen Verfahren gemessen. CHEMISCHE SYNTHESE Synthese von β-Oxa-Fettsäuren
a: R = CH&sub3;(CH&sub2;)&sub4;(CHcis=CHCH&sub2;)&sub4;(CH&sub2;)&sub3;-
b: R = CH&sub3;(CH&sub2;)&sub4;(CHcis=CHCH&sub2;)&sub3;(CH&sub2;)&sub4;-
c: R = CH&sub3;CH&sub2;(CHcis=CHCH&sub2;)&sub3;(CH&sub2;)&sub7;-
d: R = CH&sub3;CH&sub2;(CHcis=CHCH&sub2;)&sub6;(CH&sub2;)&sub2;-
e: R = CH&sub3;CH&sub2;(CHcis=CHCH&sub2;)&sub4;(CH&sub2;)&sub5;-

REAGENZIEN

Arachidonylalkohol (1a) - Nu Chek Prep., Elysian, MN, USA
Gamma-Linolenylalkohol (1b) - Nu Chek Prep., Elysian, MN, USA
Linolenylalkohol (1c) - Nu Chek Prep., Elysian, MN, USA
Docosahexanylalkohol (1d) - Nu Chek Prep., Elysian, MN, USA
Z,Z,Z,Z-6,9,12,15-Octadecatetraenylalkohol (1e) - synthetisiert durch Lithiumaluminiumhydrid-Reduktion von Methyl-6,9,12,15-octadecatetraenoat.
Methyl-Z,Z,Z,Z-6,9,12,15-ocadecatetraenoat - Sigma Chemcial Company
Rhodiumacetat-Dimer - Aldrich Chemical Company
tert-Butyldiazoacetat (2) - synthetisiert aus tert-Butylacetoacetat gemäß:
Regitz, M, Hocker, J, Leidhegener, A., Organic Syntheses Coll, vol. 5, 179
tert-Butylacetoacetat - Fluka AG
Trifluoracetessigsäure - Aldrich Chemical Company
Alle Lösemittel wurden vor der Verwendung destilliert.
Säulenchromatographien wurden unter positivem Stickstoffdruck an Merck-Silicagel 60 (230- 400 mesh), Art. 9385, durchgeführt.

VORGEHENSWEISE

tert-Butylalkyloxyacetat 3

Der relevante Fettalkohol 1 (1 Mol-Äquivalent) wurde in einem Zweihals-Rundkolben unter trockenem Stickstoff eingewogen und in Dichlormethan gelöst. Zu der gerührten Lösung wurde Rhodiumacetat-Dimer (0,5 Mol%) zugegeben, gefolgt von der tropfenweisen Zugabe einer Lösung von tert-Butyldiazoacetat 2 (2,5 Mol-Äquivalente) in Dichlormethan mit einer Spritze. Nach vollendeter Zugabe wurde die Reaktionsmischung zwei Stunden lang unter Stickstoff bei Raumtemperatur gerührt. Die rohe Reaktionsmischung wurde unter einem Strom von trockenem Stickstoff konzentriert, und der Rückstand wurde durch Säulenchromatographie an Silica durch Eluieren mit Hexan/Diethylether (9 : 1) gereinigt, um das relevante tert-Butylalkoxyacetat 3 als Öl zu erhalten.

ALKYLOXYESSIGSÄUREN 4

Das relevante tert-Butylalkyloxyacetat 3 (ca. 100 mg, 1 Mol-Äquivalent) wurde unter Stickstoff in einen Zweihals-Rundkolben eingewogen und durch Zugabe von Dichlormethan (ca. 4 ml) gelöst. Zu dieser gerührten Lösung wurde Trifluoressigsäure (1 ml) zugegeben, und die Reaktionsmischung wurde unter Stickstoff zwei Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. Die rohe Reaktionsmischung wurde unter einem Strom trockenen Stickstoffs konzentriert, und der Rückstand wurde durch Säulenchromatographie an Silica durch Eluieren mit Hexan/Diethylether/Essigsäure (40 : 60 : 2) gereinigt, um die relevante Alkyloxyessigsäure 4 als ein Öl zu ergeben.

t-Butyt-(5,8,11,14-eicosatetraenyloxy)-acetat (3a)

[t-Bu-β-oxa 23 : 4 (n-6)]

¹H n.m.r. (200 mnz. CDC1&sub3;) δ 0.89 (3H. t. J 6.7 Hz. C20'-H&sub3;. 1.25-1.38 (8H. m. C3'-H&sub2;. C17'-H&sub2;. C18'-H&sub2;. C19'-H&sub2;). 1.49 (9H. s. C(CH&sub3;)&sub3;), 1.56-1.69 (2H. m. C2'-H&sub2;), 2.01-2.15 (4H. m. C4'-H&sub2;. C16'-H&sub2;). 2.79-2.87 (6H. m. C7'- H&sub2;, C10'-H&sub2;. C13'-H&sub2;), 3.52 (2H. t. J6.6 Hz. C1'-H&sub2;). 3.94 (2H. s. C2-H&sub2;). 5.32- 5.45 (8H. m. C5'-H. C6'-H. C8'-H. C9'-H. C11'-H. C12'-H. C14'-H. C15'-H);
¹³C n.m.r. (50 MHz. CDCL&sub3;) δ 169.82s. 130.48d. 129.97d. 128.55d. 128.42d. 128.08d. 128.02d. 127.96d, 127.59d. 81.40S. 71.63t. 68.83t. 31.58t, 29.29t. 29.07t. 28.14q. 27.23t. 27.01t. 26.09t. 25.66t. 22.57t. 14.09q.

t-Butyl-Z,Z,Z-(6,9,12-octadecatrienyloxy)-acetat (3b)

[t-Bu-β-oxa 21 : 3 (n-6)]

¹H n.m.r. (200 MHz. CDC1&sub3;) δ 0.89 (3H. t. J 6.7 Hz. C18'-H&sub3;. 1.25- 1.45 (10H. m. C3'-H&sub2;. C4'-H&sub2;. C15'-H&sub2;. C16'-H&sub2;. C17'-H&sub2;), 1.48 (9H. s. C(CH&sub3;)&sub3;), 1.56-1.68 (2H. m. C2'-H&sub2;), 2.01-2.13 (4H. m. C5'-H&sub2;, C14'-H&sub2;), 2.77-2.84 (4H. m. C8'-H&sub2;, C11'-H&sub2;), 3.51 (2H. t. J6.6 Hz. C1'-H&sub2;), 3.94 (2H, s, C2-H&sub2;). 5.27-5.48 (6H. m. C6'-H. C7'-H. C9'-H. C10'-H. C12'-H. C13'-H);
¹³C n.m.r. (50 MHz. CDCl&sub3;) δ 169.82s. 130.41d. 130.10d. 128.33d. 128.21d. 127.87d. 127.64d. 81.39s. 71.72t. 68.82t. 31.52t. 29.57t. 29.49t. 28.12q. 27.18t. 25.74t. 25.63t. 22.561. 14.04q.

t-Butyl-Z,Z,Z-(9,12,15-octadecatrienyloxy)-acetat (3c)

[t-Bu-β-oxa-21 : 3 (n-3)]

¹H n.m.r. (200 MHz. CDC1&sub3;) δ 0.98 (3H. t. J 7.5 Hz. C18'-H&sub3;), 1.25- 1.40 (10H. m. C3'-H&sub2;, C4'-H&sub2;. C5'-H&sub2;, C6'-H&sub2;. C7'-H&sub2;). 1.48 (9H. s. C(CH&sub3;)&sub3;), 1.51-1.67 (2H. m. C2'-H&sub2;). 2.01-2.15 (4H. m. C8'-H&sub2;, C17'-H&sub2;), 2.75-2.86 (4H. m. C11'-H&sub2;. C14'-H&sub2;). 3.50 (2H. t. J6.6 Hz. C1'-H&sub2;). 3.95 (2H. s. C2-H&sub2;). 5.31-5.43 (6H. m. C9'-H. C10'-H. C12'-H. C13'-H. C15'-H. C16'-H);
¹³C n.m.r. (50 MHz. CDC1&sub3;) δ 169.84s. 131.94d. 130.35d. 128.27d. 127.66d. 127.13d. 81.30 s. 71.83t. 68.82t. 29.64t. 29.45t. 29.25t. 28.12q. 27.24t. 26.04t. 25.62t. 25.531. 20.53t. 14.25q.

t-Butyl-Z,Z,Z,Z,Z,Z-(4,7,10,13,16,19-docosahexaenyloxy)-acetat (3d)

[t-Bu-β-oxa 25 : 6 (n-3)]

¹H n.m.r. (200 MHz. CDC1&sub3;) δ 0.98 (3H. t. J 7.5 Hz. C22'-H&sub3;). 1.48 (9H, s. C(CH&sub3;)&sub3;). 1.58-1.76 (2H. m. C2'-H&sub2;). 2.00-2.21 (4H. m. C3'-H&sub2;, C21'-H&sub2;), 2.79-2.87 (10H. m. C6'-H&sub2;. C9'-H&sub2;. C12'-H&sub2;. C15'-H&sub2;. C18'-H&sub2;). 3.52 (2H. t, J 6.6 Hz. C1'-H&sub2;). 3.95 (2H. s. C&sub2;-H&sub2;). 5.28-5.46 (12H. m. C4'-H. C5'-H. C7'-H. C8'-H. C10'-H. C11'-H. C13'-H. C14'-H. C16'-H. C17-H. C19'-H. C20'-H):
¹³C n.m.r. (50 MHz. CDCL&sub3;) δ 169.76s. 132.03d. 129.41d. 128.57d. 128.39d. 128.36d. 128.24d. 128.21d. 128.16d. 128.12d. 128.02d. 127.88d. 127.02d. 81.40s. 71.08t. 68.83t. 29.53t. 28.12q. 25.63t. 25.59t. 25.54t. 23.72t, 20.55t. 14.25q.

t-Butyl-Z,Z,Z,Z-(6,9,12,15-octadecatetraenyloxy)-acetat (3e)

[t-Bu-β-oxa 21 : 4 (n-3)]

¹H n.m.r. (200 MHz. CDC1&sub3;) δ 0.98 (3H. t. J 7.5 Hz. C18'-H&sub3;), 1.21- 1.52 (4H. m. C3'H&sub2;), 1.48 (9H. s. C(CH&sub3;)&sub3;) 1.53-1.66 (2H. m. C2'-H&sub2;,), 2.01- 2.15 (4H. m. C5-H&sub2;. C17'-H&sub2;). 2.77-2.87 (6H. m C8'-H&sub2;. C11'-H&sub2;. C14'-H&sub2;), 3.51 (3H. t. J6.6 Hz. C1'-H&sub2;). 3.95 (2H. s. C2-H2). 5.28-5.47 (8H. m C6'-H, C7'H. C9'-H. C10'-H. C12'-H. C13'-H. C15'-H. C16'-H);
¹³C n.m.r. (50 MHz. CDC1&sub3;) δ 169.82s. 132.00d. 130.15d. 128.49d. 128.42d. 128.01d, 127.96d. 127.78d. 127.05d. 81.39 s. 71.72t. 68.81t. 29.571. 29.49t. 28.12q, 27.18t. 25.74t. 25.63t. 25.54t. 20.55t. 14.25q.

Z,Z,Z,Z-(5,8,11,14-Eicosatetraenyloxy)-essigsäure (4a)

[β-Oxa 23 : 4 (n-3)]

¹H n.m.r. (200 MHz. CDC1&sub3;) δ 0.89 (3H. t. J 6.6 Hz. C20'-H&sub3;'. 1.25- 1.490 (8H, m. C3'-H&sub2;. C17'-H&sub2;. C18'-H&sub2;. C19'-H&sub2;). 1.57-1.74 (2H, m. C2'-H&sub2;), 2.00-2.14 (4H. m. C4'-H&sub2;. C16'-H&sub2;), 2.78-2.85 (6H. m. C7'-H&sub2;. C10'-H&sub2;, C13'-H&sub2;) 3.58 (2H, br t, J6.0 Hz. C1'-H&sub2;), 4.08 (2H. s. C2-H&sub2;), 5.29-5.46 (8H. m. C5'-H. C6'-H. C8'-H. C9'-H. C11'-H. C12'-H. C14'-H. C15'-H):
¹³C n.m.r. (50 MHz. CDC1&sub3;) δ 173.37s. 130.47d. 129.64d. 128.55d. 128.24d. 128.13d. 128.02d. 127.86d. 127.152d. 71.81t. 31.49t. 29.49t. 29.21t. 27.20t. 26.88t. 26.03t. 25.63t. 25.63t. 22.54t. 14.02q.

Z,Z,Z-(6,9,12-Octadecatetraenyloxy)-essigsäure (4b)

[β-Oxa-21 : 3 (n-6)]

¹H n.m.r. (200 Mhz. CDC1&sub3;) δ 0.89 (3H. t. J 6.8 Hz. C18'-H&sub3;). 1.23- 1.43 (10H. m. C3'-H2. C4'-H2. C15'-H2. C16'-H2. C17'-H2)), 1.51-1.71 (2H. m. C2'-H2). 2.00-2.10 (4H. m. C5'-H2. C14'-H2). 2.75-2.86 (4H. m. C8'-H2, C11'-H2). 3.60 (2H. t. J 6.6 Hz. C1'-H2) 4.17 (2H. s. C2-H2). 5.26-5.47 (6H. m. C6'-H. C7'-H. C9'-H. C10'-H. C12'-H. C13'-H)
¹³C n.m.r. (50 MHz. CDC1&sub3;) δ 171.74s. 130.45d. 129.84d. 128.40d. 128.20d. 128.10d. 127.59d. 71.13d. 31.51d. 29.36d. 29.31d. 27.20d. 27.10d. 25.62d. 22.57d. 22.55d. 14.04q.

Z,Z,Z-(9,12,15-Octadecatrienyloxy)-essigsäure (4c)

[β-Oxa-21 : 3 (n-3)]

¹H n.m.r. (200 MHz. CDC1&sub3;) δ 0.97 (3H. t. J 7.5 Hz. C18'-H&sub3;), 1.25- 1.43 (10H. m. C3'-H&sub2;. C4'-H&sub2; C5'-H&sub2;. C6'-H&sub2;. C7'-H&sub2;), 1.51-1.63 (2H, m. C2'- H&sub2;), 2.01-2.15 (4H. m. C8'-H&sub2;. C17'-H&sub2;), 2.75-2.86 (4H. m. C11'-H&sub2;, C14'- H&sub2;), 3.55 (2H. t. J 6.5 H&sub2;. C1'-H&sub2;), 4.12 (2H. s. C2'-H&sub2;), 5.28-5.46 (6H, m. C9'- H. C10'-H. C12'-H. C13'-H. C15'-H. C16'-H)
¹³C n.m.r. (50 MHz. CDCL&sub3;) δ 174.73s. 131.93d. 130.29d. 128.25d. 127.68d. 127.11d. 72.16t. 29.60t. 29.41t. 29.20t. 27.21t. 25.88t. 25.60t. 25.52t. 20.53t. 14.24q.

Z,Z,Z,Z,Z,Z-(4,7,10,13,16,19-Docosahexaenyloxy)-essigsäure (4d)

[β-Oxa-25 : 6 (n-3)]

¹H n.m.r. (200 MHz. CDC1&sub3;) δ 0.97 (3H. t. J 7.5 Hz. C22'-H&sub3;), 1.65- 1.78 (2H. m. C2'-H&sub2;). 2.01-2.21 (4H. m. C3'-H&sub2;. C21'-H&sub2;), 2.75-2.92 (10H, m, C6'-H&sub2;. C9'-H&sub2;. C12'-H&sub2;. C15'-H&sub2;. C18'-H&sub2;), 3.57 (2H. t, J 6.4 Hz. C1'-H&sub2;), 4.12 (2H. s. C2-H&sub2;.). 5.28-5.46 (12H. m. C4'-H. C5'-H. C7'-H. C8'-H. C10'-H. C11'- H. C13'-H. C14'-H. C16'-H. C17'-H. C19'-H. C20'-H). 10.22 (1H. br. CO&sub2;H)
¹³C n.m.r. (50 MHz. CDC1&sub3;) δ 172.99s. 132.04d. 128.98d. 128.75d, 128.59d. 128.49d. 128.38d. 128.28d. 128.22d. 128.17d. 128.08d. 127.86d. 127.01d. 71.48t. 29.26t. 25.64t. 25.59t. 25.54t. 23.55t. 14.25q.

Z,Z,Z,Z-(6,9,12,15-Octadecatetraenyloxy)-essigsäure (4e)

[β-Oxa-21 : 4 (n-3)]

¹H n.m.r. (200 Mhz. CDC1&sub3;) δ 0.97 (3H. t. J 7.5 Hz. C18'-H&sub3;). 1.33- 1.40 (4H. m. C3'-H&sub2;. C4'-H&sub2;). 1.54-1.68 (2H, m. C2'-H&sub2;). 2.00-2.15 (4H. m. C5'-H&sub2;. C17'-H&sub2;). 2.77-2.87 (6H. m. C8'-H&sub2;. C11'-H&sub2;. C14'-H&sub2;). 3.56 (3H. t. J 6.6 Hz. C1'-H&sub2;). 4.11 (2H. s. C2-H2). 5.24-5.45 (8H. m. C6'-H. C7'-H. C9'-H. C10'-H. C12'-H. C13'-H. C15'-H, C16'-H);
¹³C n.m.r. (50 MHz. CDC1&sub3;) δ 172.05s. 132.03d. 139.92d. 128.53d. 128.35d. 128.08d. 128.01d. 127.94d. 127.04d. 71.10t. 29.341, 27.10t. 25.64t, 25.55t. 20.55t. 14.25q. Synthese von β- und γ-Thia-Fettsäuren
a: R = CH&sub3;(CH&sub2;)&sub4;(CHcis=CHCH&sub2;)&sub4;(CH&sub2;)&sub3;-
b: R = CH&sub3;(CH&sub2;)&sub4;(CHcis=CHCH&sub2;)&sub4;(CH&sub2;)&sub4;-
c: R = CH&sub3;CH&sub2;(CHcis=CHCH&sub2;)&sub3;(CH&sub2;)&sub7;-
d: R = CH&sub3;CH&sub2;(CHcis=CHCH&sub2;)&sub6;(CH&sub2;)&sub2;-

REAGENZIEN

Fettsäurebromide (1a-1d) - synthetisiert aus den entsprechenden Fettalkoholen durch Behandlung mit Triphenylphosphin und Kohlentetrabromid in Dichlormethan.
Arachidonylalkohol - Nu Chek Prep.
Gamma-Linolenylalkohol - Nu Chek Prep.
Linolenylalkohol - Nu Chek Prep.
Docosahexaenylalkohol - Nu Chek Prep.
Mercaptoessigsäure - Aldrich Chemical Company
Mercaptopropionsäure - Aldrich Chemical Company
Alle Lösemittel wurden vor Verwendung destilliert.
Säulenchromatographien wurden unter positivem Stickstoffdruck an Merck-Silicagel 60 (230- 400 mesh), Art. 9385, durchgeführt.

VORGEHENSWEISE

Alkylthioessigsäuren 3a-d

Natrium (3 Mol-Äquivalente) wurde in einem Zweihals-Rundkolben unter trockenem Stickstoff in Methanol gelöst, und zu dieser gerührten Lösung wurde Mercaptoessigsäure (1,2 Mol- Äquivalente) zugesetzt. Nachdem sich der anfängliche weiße Niederschlag gelöst hatte, wurde eine Lösung des relevanten Bromids 1 (1 Mol-Äquivalent) in Diethylether über eine Spritze zugesetzt, und die Mischung wurde bei Raumtemperatur unter Stickstoff 16 Stunden lang gerührt. Die rohe Reaktionsmischung wurde in ein gleiches Volumen Salzsäure (10% v/v) gegossen und mit Diethylether extrahiert. Der resultierende Extrakt wurde unter einem Strom trockenen Stickstoffs konzentriert, und der Rückstand wurde durch Blitzchromatographie an Silica durch Eluieren mit Hexan/Diethylether/Essigsäure (40 : 60 : 2) gereinigt, um die relevante Alkylthioessigsäure 3 als Öl zu ergeben.

Alkyhlthiopropionsäuren 5a-c

Die Alkylthiopropionsäuren 5a-c wurden durch alkalische Kondensation der entsprechenden Fettsäurebromide 1a-c mit Mercaptoproprionsäure 4 in analoger Weise zu der oben für die Alkylthioessigsäuren 3a-d beschriebenen hergestellt.

Z,Z,Z,Z-(5,8,11,14-Eicosatetraenylthio)-bernsteinsäure 7a

(5,8,11,14-Eicosatetraenylthio)-bernsteinsäure 7a wurde durch Kondensation des Fettsäurebromids 1a (1 Mol-Äquivalent) mit Mercaptobernsteinsäure 6 (1,2 Mol-Äquivalente) in Gegenwart in Natrium (4,5-Mol-Äquivalente) in analoger Weise zu der oben für die Alkylthioessigsäuren 3a-d beschriebenen hergestellt.

Z,Z,Z,Z-(5,8,11,14-Eicosatetraenylthio)-essigsäure (3a)

[β-Thia-23 : 4 (n-6)]

¹H n.m.r. (200 MHz. CDC1&sub3;) δ 0.89 (3H. t. J 6.7 Hz. C20'-H&sub3;), 1.21- 1.54 (8H. m. C3'-H&sub2;. C17'-H&sub2; C18'-H&sub2;, C19'-H&sub2;). 1.57-1.72 (2H. m. C2'-H&sub2;). 2.01-2.14 (4H. m. C4'-H&sub2;. C16'-H&sub2;), 2.67 (2H. t. J 7.2 Hz. C1'-H&sub2;)). 2.73-2.88 (6H. m. C7'-H&sub2; C10'-H&sub2;. C13'-H&sub2;). 3.25 (2H. s. C2-H&sub2;). 5.27-5.47 (8H. m. C5'- H. C6'-H. C8'-H. C9'-H. C11'-H. C12'-H. C14'-H. C15'-H);
¹³C n.m.r. (50 MHz. CDC1&sub3;) δ 175.69s. 130.49d. 129.54d. 128.56d. 128.27d. 128.15d. 127.89d. 127.55d. 33.45t. 32.70t. 31.51t. 30.38t. 29.32t. 28.62t. 28.46t. 27.23t. 26.73t. 25.651, 22.57t. 14.05q.

Z,Z,Z,Z-(6,9,12-Ocadecatrienylthio)-essigsäure (3b)

[β-Thia-21 : 3 (n-6)]

¹H n.m.r. (200 MHz, CDC1&sub3;) δ 0.89 (3H. t. J 6.6 Hz. C18'-H&sub3;), 1.23- 1.48 (10H. m. C3'-H&sub2;. C4'-H&sub2; C15'-H&sub2;. C16'-H&sub2;. C17'-H&sub2;), 1.52-1.70 (2H. m. C2'-H&sub2;), 1.89-2.15 (4H. m. C5'-H&sub2;. C14'-H&sub2;). 2.63 (2H. t, J 7.0 Hz. C1'-H&sub2;)), 2.70-2.87 (4H. m. C8'-H&sub2; C11'-H&sub2;), 3.26 (2H. s. C2-H&sub2;), 5.29-5.47 (6H. m. C6'-H. C7'-H. C9'-H. C10'-H. C12'-H. C13'-H):
¹³C n.m.r. (50 MHz. CDCI&sub3;) δ 176.54s. 130.41d. 129.86d. 128.367d. 128.11d. 128.03d. 128.59d. 33.49t. 32.74t. 31.51t. 30.36t. 29.31t. 29.14t. 28.81t. 28.34t. 27.21t. 27.05t. 25.63t. 22.55t 14.04q.

Z,Z,Z-(9,12,15-Octadecatrienylthio)-essigsäure (3c)

[β-Thia-21 : 3 (n-3)]

¹H n.m.r. (200 MHz. CDC1&sub3;) δ 0.89 (3H. t. J 6.7 Hz. C18'-H&sub3;), 1.21- 1.52 (10H. m. C3'-H&sub2;. C4'-H&sub2; C5'-H&sub2;. C6'-H&sub2;. C7'-H&sub2;), 1.54-1.72 (2H. m. C2'- H&sub2;), 2.01-2.15 (4H. m. C8'-H&sub2;. C17'-H&sub2;), 2.67 (2H. t. J 7.2 Hz. C1'-H&sub2;)), 2.73- 2.87 (4H. m. C11'-H&sub2;. C14'-H&sub2;), 3.25 (2H, s. C2-H&sub2;), 5.27-5.48 (6H. m. C9'-H, C10'-H. C12'-H. C13'-H. C15'-H. C16'-H);
¹³C n.m.r. (50 MHz. CDC1&sub3;) δ 176.21s. 131.94d. 130.29d. 128.26d. 127.69d. 127.11d. 33.49t. 32.82t. 30.39t. 29.60t. 29.36t. 29.20t. 29.12t. 28.89t. 28.70t. 27.21t. 25.61t. 25.52t. 20.53t. 14.25q.

Z,Z,Z,Z,Z,Z-(9,12,15-Octadecatrienylthio)-essigsäure (3d)

[β-Thia 25 : 6 (n-3)]

¹H n.m.r. (200 MHz. CDCl&sub3;) δ 0.99 (3H. t. J 7.5 Hz. C22'-H&sub3;). 1.62- 1.77 (2H. m. C2'-H&sub2;.). 2.02-2.24 (4H. m. C3'-H&sub2;. C21'-H&sub2;). 2.68 (2H. t, J 7.4 Hz. C1'-H&sub2;). 2.83-2.85 (10H. m.. C6'-H&sub2;. C9'-H&sub2;. C12'-H&sub2;. C15'-H&sub2;. C18'-H&sub2;), 3.26 (2H, s. C2-H&sub2;). 5.29-5.47 (12H. m. C4'-H&sub2;. C5'-H. C7'-H. C8'-H. C10'-H. C11'-H. C13'-H. C14'-H. C16'-H. C17'-H. C19'-H. C20'-H):
¹³C n.m.r. (50 MHz. CDCl&sub3;) δ 176.37s. 132.01d. 128.94d. 128.68d. 128.55d. 128.24d. 128.18d. 128.12d. 128.07d. 127.85d. 126.99d. 33.41t. 32.21t. 28.67t. 26.12t. 25.64t. 25.22t. 20.53t. 14.24q.

Z,Z,Z,Z-(5,8,11,14-Eicosatetraenylthio)-propionsäure (5a)

[γ-Thia-24 : 4(n-6)]

¹H n.m.r. (300 MHz. CDCl&sub3;) δ 0.89 (3H. t. J 6.8 Hz. C20'-H&sub3;), 1.26- 1.38 (6H. m. C17'-H&sub2;), C18'-H&sub2;, C19'-H&sub2;), 1.41-1.51 (2H, m. C3'-H&sub2;), 1.56- 1.66 (2H. m. C2'-H&sub2;), 2.02-2.12 (4H. m. C4'-H&sub2;. C16'-H&sub2;). 2.54 (2H. t, J 7.3 Hz. C1'-H&sub2;). 2.66 (2H. t. J 6.6 Hz C3-H&sub2;), 2.78 (2H. t. J 6.6 Hz. C2-H&sub2;), 2.78- 2.86 (6H. m. C7'-H&sub2;. C10'-H&sub2;. C13'-H&sub2;). 5.29-5.44 (8H. m. C5'-H. C6'-H. C8'- H. C9'-H. C11'-H. C12'-H. C14'-H. C15'-H):
¹³C n.m.r. (50 MHz. CDCl&sub3;) δ 178.22s. 130.37d. 129.58d. 128.46d. 128.19d. 128.10d. 128.03d. 127.81d. 127.48d. 34.68t. 32.046t. 31.44t. 29.25t. 29.01t. 28.67t. 27.15t. 26.70t. 26.54t. 25.57t. 22.50t. 13.98q.

Z,Z,Z-(6,9,12-Octadecatrienylthio)-propionsäure (5b)

[γ-Thia-22 : 3 (n-6)]

¹H n.m.r. (200 MHz. CDCl&sub3;) δ 0.89 (3H. t. J 6.8 Hz. C18'-H&sub3;), 1.25- 1.42 (10H. m. C3'-H&sub2;. C4'-H&sub2;. C15'-H&sub2;. C16'-H&sub2;. C17'-H&sub2;), 1.53-1.65 (2H, m, C2'-H&sub2;). 2.01-2.10 (4H. m. C5'-H&sub2;, C14'-H&sub2;), 2.53 (2H. t. J 7.3 Hz. C1'-H&sub2;)), 2.66 (2H. t. J 6.8 Hz. C3-H&sub2;). 2.78 (2H. t, J 6.8 Hz C2-H&sub2;), 2.74-2.83 (4H. m, C8'-H. C11'-H) 5.26-5.47 (6H. m. C6'-H. C7'-H. C9'-H. C10'-H. C12'-H. C13'- H);
¹³C n.m.r. (50 MHz. CDCl&sub3;) δ 178.14s. 130.38d. 129.90d. 128.33d. 128.10d. 127.97d. 127.58D. 34.69t. 32.13t. 31.49t. 29.41t. 29.29t. 29.18t. 28.46t. 27.19t. 27.06t. 26.58t. 25.61t. 14.03q.

Z,Z,Z-(9,12,15-Octadecatrienylthio)-propionsäure (5c)

[γ-Thia-22 : 3 (n-3)]

¹H n.m.r. (200 MHz. CDC1&sub3;) δ 0.98 (3H. t. J 7.5 Hz. C18'-H&sub3;), 1.26- 1.35 (10H. m. C3'-H&sub2;. C4'-H&sub2; C5'-H&sub2;, C6'-H&sub2;. C7'-H&sub2;). 1.51-1.65 (2H. m, C2'- H&sub2;), 1.98-2.15 (4H. m. C8'-H&sub2;. C17'-H&sub2;), 2.53 (2H. t. J 7.3 Hz. C1'-H&sub2;), 2.66 (2H. t, J 6.7 Hz. C3'-H&sub2;). 2.78 (2H. t. J 7.3 Hz. C1-H&sub2;). 2.66 (2H. t. J 6.7 Hz. C3'- H&sub2;). 2.78 (2H. t. J 6.7 Hz. C2'-H&sub2;). 2.75-2.84 (4H. m. C11'-H&sub2;. C14'-H&sub2;) 5.27 = 5.46 (6H. m. C9'-H. C10'-H. C12'-H. C13'-H. C15'-H. C16'-H):
¹³C n.m.r. (50 MHz. CDC1&sub3;) δ 178.03s. 131.92d. 130.28d. 128.24d, 127.66d. 127.10d. 34.67t. 32.19t. 29.58t. 29.50t. 29.37t. 29.20t. 29.16t. 28.81t. 27.19t. 26.59t. 25.59t. 25.50t, 20.52t. 14.245q.

Z,Z,Z,Z-(5,8,11,14-Octadecatrienylthio)-bernsteinsäure (7a)

[α-Carboxymethyl-β-thia-23 : 4 (n-6)]

¹H n.m.r. (300 MHz, CDC1&sub3;) δ 0.89 (3H, t, J 6.8 Hz. C20'-H&sub3;), 1.23- 1.53 (8H. m. C3'-H&sub2;, C17'-H&sub2; C18'-H&sub2;, C19'-H&sub2;), 1.56-1.70 (2H. m, C2'-H&sub2;), 2.03-2.13 (4H, m. C4'-H&sub2;, C16'-H&sub2;), 2.65-2.86 (9H. m, C7'-H&sub2;. C10'-H&sub2;, C13'-H&sub2;. C1'-H&sub2;. CHHCO&sub2;H). 3.01 (1H. dd. J 12.1. 17.6 Hz.CHHCO&sub2;H), 3.64 (1H. dd. J 4.0. 12.1 Hz.C2-H), 5.32-5.43 (8H. m. C5'-H. C6'-H. C8'-H. C9'-H. C11'-H. C12'-H. C14'-H. C15'-H);

SYNTHESE DER HYDROXY- UND HYDROPEROXY-DERIVATE

Die Hydroperoxy-Derivate der Arachidonsäure (Fig. 1b-1g) werden separat durch Enzymkatalysierte Reaktionen von Fig. 1a erhalten, oder als eine Mischung durch Autooxidation von Fig. 1a. Die Komponenten der Autooxidations-Mischung Fig. 1b-1g, die in ihrem Verhältnis abhängig von den Reaktionsbedingungen variieren, können durch Hochleistungs- Flüssigchromatographie an Silica getrennt werden. Die Reduktion der Hydroperoxide Fig. 1b-1g, entweder allein oder als Mischung, ergibt die entsprechenden Alkohole Fig. 1h- 1m. Diese können durch Behandlung mit einer Vielzahl von Reagenzien, einschließlich der entsprechenden Alkyl- oder Arylhydrohalogenide (ROX) in die entsprechenden Peroxide Fig. 1n (R - Alkyl oder Aryl) mit demselben Substitutionsmuster wie die Hydroperoxide Fig. 1b-1g und Alkohole Fig. 1h-1m umgewandelt werden. Die Mischungen der Alkohole Fig. 1h -1m oder der Peroxide Fig. 1n können ebenfalls durch Hochleistungs- Flüssigchromatographie getrennt werden.
In ähnlicher Weise können andere natürlich vorkommende ungesättigte Fettsäuren (z. B. 22 : 6 (n-3)) und modifizierte Fettsäuren wie Fig. 1o-1x (Y = H) und verwandte Verbindungen durch Umsetzung von anderen Säuren als Arachidonsäure zur Herstellung der Hydroperoxy-, Hydroxy- und Peroxy-Derivate Fig. 1o-1x (Y = OOH, OH, OOR) analog zu Fig. 1b-1n hergestellt werden, worin das Substitutionsmuster durch die allylische Oxidation bestimmt wird. Die Säuren Fig. 1o und 1p (Y = H) können durch Aldolkondensation der entsprechenden Aldehyde von Fig. 1a hergestellt werden, und Fig. 1p kann ebenfalls durch Wittig-Reaktion desselben Aldehyds oder des entsprechenden Halogenids hergestellt werden, währen die Säure Fig. 1q durch Wittig-Reaktion des entsprechenden C19-Aldehyds oder -Halogenids hergestellt werden kann. Die Säure Fig. 1r kann durch Aldolkondensation eines entsprechenden Esters der Fig. 1a hergestellt werden, während Fig. 1s-1x erhalten werden durch Ether- oder Thioether-Synthese über nucleophile Substitution oder Metall-katalysierte Kupplungsreaktionen, und die Thioether Fig. 1v-1x können zu den entsprechenden Sulfoxiden und Sulfonen oxidiert werden. Die Aminsäure-Derivate Fig. 1y und Fig. 12 können durch Kupplung der entsprechenden Fettsäure (Fig. 1a) mit Glycin beziehungsweise Asparaginsäure erhalten werden. Synthese der Hydroxy-β-oxa-Fettsäuren

REAGENZIEN

β-Oxa-Fettsäuren (1,3) - hergestellt aus den entsprechenden Fettalkoholen durch Rhodiumacetat-katalysierte Kupplung mit Diazoacetatestern.
Triphenylphosphin - Aldrich Chemical Company
Kaliumdihydrogenorthophosphat - Ajax Chemicals
Sojabohnen-15-Lipoxygenase - Aldrich Chemical Company
Alle Lösemittel wurden vor Verwendung destilliert.
Präparative Dünnschichtchromatographien wurden an Merck-Silicagel 60 PF&sub2;&sub5;&sub4;, gipshaltig, Art. 7749, durchgeführt.

VORGEHENSWEISE

Hydroxy-β-oxa-Fettsäuren 2 und 4

Die relevante Fettsäure, 1 und 3, (ca. 50 ml) wurde in Phosphatpuffer (0,1 M, pH = 9,0, ca. 45 ml) bei 30ºC gelöst. Sojabohnen-15-Lipoxygenase (ca. 8 mg) in Phosphatpuffer (ca. 5 ml) wurde zugesetzt, und Sauerstoff wurde durch die gerührte Lösung 10 Minuten lang eingeblasen. Triphenylphosphin (ca. 50 mg) wurde in Dichlormethan (ca. 50 ml) zugesetzt, gefolgt von Salzsäure (0,2 M, ca. 20 ml), und die Lösung wurde 20 Minuten lang bei 0ºC gerührt. Die rohe Reaktionsmischung wurde mit Dichlormethan extrahiert, und der resultierende Extrakt wurde in einem Strom trockenen Stickstoffs konzentriert. Der Rückstand wurde durch präparative Dünnschichtchromatographie an Silicagel durch Eluieren mit Ethylacetat/Hexan/Essigsäure (80 : 20 : 0,1) gereinigt, um die entsprechende Hydroxy-β-oxa-Fettsäure 2 oder 4 als Öl zu ergeben.

Z,Z,E-(13-Hydroxy-6,9,11-octadecatrienyloxy)-essigsäure (2)

[16'-OH-β-oxa-21 : 3 (n-6)]

¹H n.m.r. (300 MHz. CDCI&sub3;) δ 0.89 (3H. t, J 6.8 Hz. C18'-H&sub3;). 1.25- 1.45 (10H. m. C3'-H&sub2;. C4'-H&sub2;. C15'-H&sub2;. C16'-H&sub2;. C17'-H&sub2;). 1.59-1.73 (2H. m. C2'-H&sub2;). 2.01-2.12 (4H. m. C5'-H&sub2;. C14'-H&sub2;). 2.81 (2H. t. J 5.8 Hz. C8'-H&sub2;), 3.52-3.60 (2H. m. C1'-H&sub2;). 4.10 (2H. s, C2-H&sub2;). 4.20 (1H. dt. J 6.0. 6.7 Hz. C13'-H) 5.29-5.45 (3H m. C6'-H. C7'-H. C9'-H). 5.70 (1H. dd. J 6.7 15.2 Hz. C12'-H) 5.99 (1H. dd. J 10.9 Hz. C10'-H) 6.55 (1H. dd, J 10.9. 15.2 Hz. C11'-H)

Z,E,Z-(13-Hydroxy-9,11,15-octadecatrienyloxy)-essigsäure (4)

[16'-OH-β-oxa-21 : 3 (n-6)]

¹H n.m.r. (300 MHz. CDCI&sub3;) δ 0.95 (3H. t. J 7.6 Hz. C18'-H&sub3;), 1.17- 1.40 (10H. m. C3'-H&sub2;. C4'-H&sub2; C5'-H&sub2;. C6'-H&sub2;, C7'-H&sub2;), 1.48-1.63 (2H. m. C2'- H&sub2;), 1.99-2.12 (2H. m. C8'-H&sub2;). 2.13-2.22 (2H. m, C14'-H&sub2;) 2.28-2.37 (2H, m. C17'-H&sub2;). 3.44-3.50 (2H. m, C1'-H&sub2;), 3.80-3.92 (2H. s, C2'-H&sub2;) 4.14-4.20 (1H. dt. J 6.4. 14.9 Hz. C13'-H). 5.30-5.60 (3H. m. C9'-H. C15'-H. C16'-H), 5.67 (1H. dd. J 6.4. 14.9 Hz. C12'-H). 5.95 (1H. dd. J 11.1. 11.1 Hz. C10'-H), 6.49 (1H. dd, J 11.1. 14.9 Hz C11'-H)

Einfluss der neuen Fettsäuren auf die Wirkung von Acyl-CoA-Oxidase

β-Oxidation von Fettsäuren

Die β-Oxidation ist das hauptsächliche oxidative metabolische Schicksal der Fettsäuren (1), wobei der Nettoprozess gekennzeichnet ist durch den Abbau der Fettsäure-Kohlenstoffkette um zwei Kohlenstoffatome bei gleichzeitiger Produktion äquimolarer Mengen von Acetyl-Coenzym A (4) (Schema 1) Schema 1

Acyl-CoA-Oxidase

Der erste Schritt im β-Oxidationsweg wird durch Acyl-CoA-Oxidase kontrolliert. In Peroxisomen katalysiert Acyl-CoA-Oxidase die Reaktion von Acyl-Coenzym-A-Thioestern mit Sauerstoff, um Enoyl-Coenzym A-Thioester zu ergeben. In Gegenwart von Peroxidase-Enzym wird die gleichzeitige Produktion von Wasserstoffperoxid zurückgeführt zu Sauerstoff mit der Nettogenerierung von einem Mol Wasser pro Mol oxidiertem Acyl-Coenzym A-Thioester.

Neue Fettsäuren

Es wurde angenommen, dass Fettsäuren mit einer blockierenden Gruppe in β-Position gegen den gewöhnlichen Verlauf der β-Oxidation inert sind. Es wurden daher neue Fettsäuren mit einem Heteroatom in der β-Position synthetisiert. Die in den vorliegenden Untersuchungen verwendeten Verbindungen waren Arachidonyloxyessigsäure [β-Oxa-23 : 4 (n-6)], γ-Linolenyloxyessigsäure [β-Oxa-21 : 3 (n-6)], Linolenyloxyessigsäure [β-Oxa-21 : 3 (n-3)] und Arachidonylthioessigsäure [β-Thia-23 : 4 (n-6)]. Die Oxidation von Arachidonyl-thiopropionsäure [γ- Thia-22 : 4 (n-6)] wurde ebenfalls untersucht, um die Wirkung einer blockierenden Gruppe in der γ-Position einer Fettsäure bei β-Oxidation zu untersuchen.

Acyl-CoA-Oxidase-Assay

Acyl-CoA-Oxidase aus Arthrobacter-Spezies ist in Form stabilisierter Tabletten von Boehringer Mannheim erhältlich und wird gewöhnlich zusammen mit Acyl-CoA-Synthetase zur Messung freier Säuren in Serum oder Plasma verwendet.

Assay-Prinzip

Freie Fettsäuren werden, in Gegenwart des Enzyms Acyl-CoA-Synthetase (Acyl-CS), durch Adenosin-5'-triphosphat (ATP) und Coenzym A (CoA) in Acyl-Coenzym A (Acyl-CoA) umgewandelt, wobei Adenosin-5'-monophosphat (AMP) und Pyrophosphat hergestellt werden.
Acyl-CoA reagiert mit Sauerstoff (O&sub2;) in Gegenwart von Acyl-CoA-Oxidase (ACOD), um das 2,3-Enoyl-Coenzym A (Enyl-CoA) unter Bildung von Wasserstoffperoxid zu ergeben.
Das resultierende Wasserstoffperoxid (H&sub2;O&sub2;) wandelt 4-Aminopyrin (4-AA) und 2,4,6-Tribrom- 3-hydroxybenzoesäure (TBHB) in Gegenwart von Peroxidase (POD) in einen roten Farbstoff um. Der Farbstoff wird im sichtbaren Bereich bei 546 nm gemessen.

Assay-Vorgehen

Wellenlänge: 546 nm
Microküvette: 1 cm Lichtweg
Temperatur: 25ºC (±1ºC)
Assay-Volumen: 1,15 ml
Messung der Reaktionsmischung gegen Luft
In Küvette pipettiert:
1,00 ml Reaktionsmischung: KH&sub2;PO&sub4; (87 mMol/l), Mg²&spplus; (1,3 mMol/l), ATP (1,5 mMol/l), CoA (0,26 mMol/l, POD (21,7 kU/l), Acyl CS (165 U/l),
0,05 ml Probenlösung der freien Fettsäure(n)
[für einen blanken (Vergleichs-)Assay wurden 0,05 ml destilliertes Wasser verwendet]
Die Probe wurde gemischt und etwa 10 Minuten lang bei 25ºC temperiert. Anschließend wurden zugegeben:
0,05 ml N-Ethylmaleinamid-Lösung: (0,86 mMol/l)
Die Absorption (A1) der Lösung wurde bei 546 nm gemessen, gefolgt von der Addition von:
0,05 ml ACOD-Lösung: (8,7 kU/l).
Bei t = 10 Sekunden nach Zugabe des ACOD zu der Reaktionsmischung wurde die Änderung der sichtbaren Absorption der Lösung bei 546 nm 20 Minuten lang gemessen.

Assay-Kalibrierung/Authentifikation

Probenkonzentrationsabhängigkeit

Arachidonsäure (20 : 4 (n-6), 10) wurde bei den folgenden Konzentrationen untersucht:
4,3 mM, 2,1 mM, 0,99 mM, 0,49 mM, 0,25 mM, und 0 mM (blanker Assay).
Gemäß Fig. 1 zeigt der Assay Ratenabhängkeit von der Konzentration der Fettsäure.

Enzym (ACOD)-Konzentrationsabhängigkeit

Eine Probenlösung von Arachidonsäure (20 : 4 (n-6), 10) mit einer Konzentration von 0,99 mM wurde unter Verwendung von Acyl-CoA-Oxidase-Konzentrationen wie folgt untersucht:
200 kU/l, 100 kU/l, und 50 kU/l.
Gemäß Fig. 2 zeigt der Assay Ratenabhängigkeit von der Konzentration des Enzyms (ACOD).

Assay der neuen Fettsäuren

Lösungen der neuen Verbindungen mit Konzentrationen von 1,0 mM, 1,0 mM, 1,0 mM, 1,0 mM, und 1,1 mM wurden unter Verwendung einer Acyl-CoA-Oxidase-Konzentration von 100 kU/l untersucht.
Gemäß Fig. 3-6 zeigt der Assay, dass die β-Oxa-Verbindungen und die β-Thia-Verbindungen keine Substrate für Acyl-CoA-Oxidase sind (Fig. 11a).

Wirkung der neuen Verbindungen auf den Arachidonsäure-Metabolismus durch Acyl- CoA-Oxidase

Probenlösungen, die äquimolare Konzentrationen von Arachidonsäure (10) und jeder der neuen Verbindungen enthielten, wurden unter Verwendung einer Acyl-CoA-Oxidase-Konzentration von 100 kU/l untersucht.
Der Assay zeigt, dass die neuen Verbindungen keinen Effekt auf die Aufnahme von Arachidonsäure durch Acyl-CoA-Oxidase haben.
Weiterhin wurden Proben untersucht, die die neuen Verbindungen und Arachidonsäure (10) in relativen Konzentrationen von 4 : 1 und 16 : 1 enthielten. Die Proben zeigten keinen erkennbaren Effekt auf die Aufnahme von Arachidonsäure durch Acyl-CoA-Oxidase (nicht gezeigt).

Kovalente Kopplung von Fettsäuren an Aminosäuren

Mehrfach ungesättigte Fettsäuren (1,80 mMol), HOSu (0,41g, 3,60 mMol) und der Aminosäuret-butylester (3,60 mMol) wurden zusammen in Dimethylformamid (3 ml) gelöst, und die Mischung wurde in einem Eisbad gekühlt.
Dicyclohexylcarbodiimid (0,44 g, 2,16 mMol) in DMF (0,3 ml) und N-Methylmorpholin (0,73 g, 7,20 mMol) wurden zugesetzt. Die Mischung wurde 20 Stunden gerührt, wonach etwas nicht umgesetzte mehrfach ungesättigte Fettsäure verblieb. Mehr DCC (0,10 g) wurde zugesetzt, und die Mischung wurde weitere 20 Stunden gerührt. Das DCU wurde abfiltriert und das Produkt durch Umkehrphasen-HPLC isoliert. Das gereinigte Produkt wurde zu einem Öl konzentriert, und Trifluoressigsäure (30 ml) wurde zugefügt. Nach einer Stunde Rühren wurde Trifluoressigsäure evaporiert, um das Produkt als braunes Öl zurückzulassen, welches erneut in CH&sub3;CN (6 ml) gelöst und durch Umkehrphasen-HPLC gereinigt wurde. Die erhaltenen gereinigten Fraktionen wurden kombiniert, konzentriert und lyophilisiert (in t-Butanol) um das Produkt als braunes Öl zurückzulassen.

TABELLE 1

DIREKTE ANTIMALARIA-WIRKSAMKEIT DER NEUEN FETTSÄUREN

VERBINDUNG EC50 (uM)

β-Oxa 21 : 3 (n-6) < 30
β-Oxa 21 : 3 (n-3) 30
β-Oxa 21 : 4 (n-3) 40
β-Thia 21 : 3 (n-6) 30-50
β-Thia 21 : 3 (n-3) 30-35
β-Oxa 25 : 6 (n-3) < 60
γ-Thia 22 : 9 (n-6) 45
γ-Thia 22 : 3 (n-6) 45
β-Oxa 23 : 4 (n-6) < 30
β-Thia 23 : 4 (n-6) 15-30
γ-Thia 24 : 4 (n-6) 15
β-Thia 25 : 6 (n-3) 25
α-Carboxymethyl-β-thia 23 : 4 (n-6) 50
16-OH-β-oxa 21 : 3 (n-6) 50
16-OH-β-oxa 21 : 3 (n-3) 40

TABELLE 2

FETTSÄURE-STIMULIERTE NEUTROPHIL-VERMITTELTE ANTIMALARIA-WIRKUNG

VERBINDUNG % INHIBITION RELATIV ZU 22 : 6 BEI 16 uM

β-Oxa 21 : 3 (n-3) 45
β-Oxa 21 : 4 (n-3) 85
β-Thia 21 : 3 (n-6) 85
β-Thia 21 : 3 (n-3) 73
β-Thia 23 : 4 (n-6) 150
γ-Thia 24 : 4 (n-6) 91
β-Thia 25 : 6 (n-3) 47
16-OH-β-oxa 21 : 3 (n-6) 33

TABELLE 3

WIRKUNG VON MP8, MP11, MP14 AUF KI - CHLOROQUIN-RESISTENTE P. FALCIPARUM

VERBINDUNG % WACHSTUMSINHIBIERUNG

Chloroquin 12,4
β-Thia 23 : 4 (n-6) 97
γ-Thia 24 : 4 (n-6) 97
β-Thia 25 : 6 (n-3) 98

TABELLE 4

WIRKUNG DER FETTSÄUREN AUF MITOGEN-INDUZIERTE PROLIFERATION MONONUCLEARER PERIPHER-BLUTZELLEN

VERBINDUNG % INHIBIERUNG DER INDUZIERTEN PROLIFERATION BEI 20 uM PUFA

β-Oxa 21 : 3 (n-6) 17
β-Thia 21 : 3 (n-3) 28
β-Thia 25 : 6 (n-3) 97
16-OH-β-oxa 21 : 3 (n-6) 50

TABELLE 5

WIRKUNG VON PUFA AUF DIE PHA -INDUZIERTE TNFα-PRODUKTION

Verbindung % Inhibierung der Cytokin-Produktion (PUFA) bei 20 uM

β-Oxa 21 : 3 (n-6) 38
β-Oxa 21 : 3 (n-3) 39
β-Thia 21 : 3 (n-6) 17
β-Thia 21 : 3 (n-3) 17
γ-Thia 22 : 3 (n-6) 41
γ-Thia 22 : 3 (n-3) 25
β-Oxa 23 : 4 (n-6) 25
β-Thia 23 : 4 (n-6) 35
γ-Thia 24 : 4 (n-6) 34
β-Thia 25 : 6 (n-3) 90
16-OH-β-oxa 21 : 3 (n-6) 71
16-OH-β-oxa 21 : 3 (n-3) 68

TABELLE 6

WIRKUNG VON PUFA AUF STAPH AUREUS-INDZUZIERTE INTERFERON-γ-PRODUKTION DURCH MONONUCLEARE PERIPHER-BLUTZELLEN

Verbindung % Inhibierung (PUFA bei 20 uM)

β-Oxa 21 : 3 (n-6) 89
β-Thia 21 : 3 (n-6) 45
β-Oxa 25 : 6 (n-3) 44
β-Oxa 23 : 4 (n-6) 89
β-Thia 23 : 4 (n-6) 64
β-Thia 25 : 6 (n-6) 96
16-OH-β-oxa 21 : 3 (n-6) 77
16-OH-β-oxa 21 : 3 (n-3) 65

Claims

1. Mehrfach ungesättigte Fettsäure mit Antimalaria- und/oder neutrophil stimulierender Wirkung, wobei die mehrfach ungesättigte Fettsäure 18-25 Kohlenstoffatome und 1-6 Doppelbindungen enthält und die mehrfach ungesättigte Fettsäure eine oder zwei Substitutionen enthält, die ausgewählt sind aus der Gruppe, welche aus β-Oxa, γ-Oxa, β-Thia und γ-Thia besteht.

2. Mehrfach ungesättigte Fettsäure wie in Anspruch 1 beansprucht, in der die mehrfach ungesättigte Fettsäure eine weitere Substitution enthält, die ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus Hydroxy-, Hydroperoxy-, Peroxy- und Carboxymethyl-Substitutionen besteht, und/oder an eine Aminosäure gebunden ist.

3. Mehrfach ungesättigte Fettsäure wie in Anspruch 1 oder Anspruch 2 beansprucht, in der die mehrfach ungesättigte Fettsäure 20-25 Kohlenstoffatome und 3-6 Doppelbindungen enthält.

4. Mehrfach ungesättigte Fettsäure wie in einem der Ansprüche 1 bis 3 beansprucht, in der die mehrfach ungesättigte Fettsäure eine n-3- bis n-6-Fettsäure ist.

5. Mehrfach ungesättigte Fettsäure wie in einem der Ansprüche 1 bis 4 beansprucht, in der die mehrfach ungesättigte Fettsäure aufweist:

(a) 20 Kohlenstoffatome mit 3-4 Doppelbindungen und eine β-Oxa- oder β-Thia- Substitution enthaltend;

(b) 21 Kohlenstoffatome mit 3-4 Doppelbindungen und eine β-Oxa- oder β-Thia- Substitution enthaltend;

(c) 22 Kohlenstoffatome mit 3-4 Doppelbindungen und eine γ-Thia- oder β-Oxa- Substitution enthaltend;

(d) 23 Kohlenstoffatome mit 3-4 Doppelbindungen und eine β-Thia-Substitution enthaltend;

(e) 24 Kohlenstoffatome mit 3-4 Doppelbindungen und eine γ-Thia-Substitution enthaltend;

(f) 25 Kohlenstoffatome mit 3-6 Doppelbindungen und eine β-Oxa-Substitution enthaltend oder

(g) 25 Kohlenstoffatome mit 3-6 Doppelbindungen und eine β-Thia-Substitution enthaltend.

6. Mehrfach ungesättigte Fettsäure wie in einem der Ansprüche 1 bis 5 beansprucht, in der die mehrfach ungesättigte Fettsäure eine ω-Hydroxy-Substitution enthält.

7. Mehrfach ungesättigte Fettsäure wie in einem der Ansprüche 1 bis 4 beansprucht, in der die mehrfach ungesättigte Fettsäure 23 Kohlenstoffatome, 3-6 Doppelbindungen, β- Thia- und α-Carboxymethyl-Gruppen enthält.

8. Mehrfach ungesättigte Fettsäure wie in einem der Ansprüche 1 bis 7 beansprucht, in welcher die mehrfach ungesättigte Fettsäure über die Carboxy-Endgruppe kovalent an eine Aminosäure gebunden ist, um dadurch ein mehrfach ungesättigtes Fettsäureamid zu bilden.

9. Mehrfach ungesättigte Fettsäure wie in Anspruch 8 beansprucht, in der die mehrfach ungesättigte Fettsäure-Verbindung kovalent an Asparaginsäure oder Glycin gebunden ist.

10. Verfahren zur Herstellung einer ungesättigten, Oxa-substituierten Fettsäure, umfassend die Umsetzung eines ungesättigten Fettsäurealkohols mit einem Carben, so dass das Carben in die O-H-Bindung des Alkohols eingefügt wird.

11. Verfahren wie in Anspruch 10 beansprucht, in dem der ungesättigte Fettsäurealkohol 18 -25 Kohlenstoffatome und 1-6 Doppelbindungen enthält.

12. Verfahren wie in Anspruch 10 oder Anspruch 11 beansprucht, in dem das Carben hergestellt ist über eine Rhodiumacetat-katalysierte Behandlung einer Diazoverbindung.

13. Verfahren wie in einem der Ansprüche 10 bis 12 beansprucht, in dem die ungesättigte, β-Oxa-substituierte Fettsäure hergestellt wird.

14. Mehrfach ungesättigte Fettsäure wie in einem der Ansprüche 1 bis 9 beansprucht zur Verwendung in einem Verfahren zur Behandlung von Entzündungen im menschlichen oder tierischen Körper.

15. Verwendung einer mehrfach ungesättigten Fettsäure wie in einem der Ansprüche 1 bis 9 beansprucht zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Entzündungen.

16. Verwendung einer mehrfach ungesättigten Fettsäure wie in einem der Ansprüche 1 bis 9 beansprucht zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von rheumatoider Arthritis oder Multipler Sklerose.