DE69528111T2

DE69528111T2 - Biosensor und Verfahren zur Herstellung desselben

Info

Publication number: DE69528111T2
Application number: DE69528111T
Authority: DE
Inventors: Shin Ikeda; Mariko Miyahara; Shiro Nankai; Toshihiko Yoshioka
Original assignee: Matsushita Electric Industrial Co Ltd
Current assignee: Panasonic Corp
Priority date: 1994-06-02
Filing date: 1995-06-01
Publication date: 2003-05-28
Anticipated expiration: 2015-06-02
Also published as: US5575895A; JP3027306B2; EP0685737A1; CA2150791A1; CA2150791C; JPH0850113A; DE69528111D1; EP0685737B1

Description

1. Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft einen Biosensor zum schnellen Quantifizieren einer spezifischen Komponente in einer Probe, insbesondere einer biologischen Probe, mit hoher Genauigkeit in einfacher Weise, und ein Verfahren zum Herstellen desselben. Ein Biosensor der im Oberbegriff des Anspruchs 1 festgelegten Art ist aus der EP-A-0359831 bekannt.

2. Beschreibung des Standes der Technik

Als System zum raschen Quantifizieren einer spezifischen Komponente in einer Probenlösung mit hoher Genauigkeit ist ein Biosensor (beispielsweise aus der japanischen Patentoffenlegungsschrift Nr. Hei 3-202764) bekannt, der nunmehr erläutert wird.
Der offenbarte, herkömmliche Biosensor wird hergestellt durch Ausbilden eines Elektrodensystems, das aus einer Messelektrode und einer Gegenelektrode besteht, auf einer elektrisch isolierenden Basisplatte, woraufhin auf dieser eine Reaktionsschicht gebildet wird, die ein hydrophiles Polymer, eine Oxidoreduktase und einen Elektronenakzeptor umfasst, woraufhin ein Hohlraum gebildet wird, der einen Probenzuführkanal des Sensors bildet, durch Kombinieren einer Abdeckung und eines Abstandhalters mit der Basisplatte.
Wenn die Probenlösung, die ein zu quantifizierendes Substrat enthält, mit einem Einlass des Probenzuführkanals in Kontakt gebracht wird, wird die Probenlösung rasch in die Reaktionsschicht auf Grund von Kapillarwirkung des vorstehend genannten Hohlraums eingeleitet, um die Reaktionsschicht aufzulösen. Das Substrat wird daraufhin mit dem Enzym reagieren gelassen, das in der Reaktionsschicht enthalten ist, und der Elektronenakzeptor wird verringert. Bei Beendigung der Enzymreaktion wird der verringerte Elektronenakzeptor elektrochemisch oxydiert, um einen oxydierten Strom zu erzeugen, und auf Grundlage des Werts des oxydierten Stroms, der durch diese Oxydationsreaktion erhalten wird, kann die Konzentration des Substrats, das in der Probenlösung enthalten ist, ermittelt werden.
Der offenbarte Biosensor wird außerdem durch die Schritte hergestellt: Ausbilden des Elektrodensystems auf der Basisplatte, Ausbilden der Reaktionsschicht auf dem Elektrodensystem und Kombinieren der Abdeckung des Abstandhalters mit der Basisplatte, dem Elektrodensystem und der Reaktionsschicht zur Bildung des Hohlraums.
In der Konfiguration dieses Biosensors gemäß dem Stand der Technik ist der zwischen der Abdeckung und der Basisplatte gebildete Hohlraum rohrförmig, weshalb die zugeführte Probenlösung ausschließlich einen Teil der Reaktionsschicht kontaktiert, der im Wesentlichen identisch zu der Außenform des Elektrodensystems ist. Ein durch den Bereich der Reaktionsschicht eingenommener Bereich, die tatsächlich in der Probenlösung aufgelöst ist, kann unter keinen Umständen konstant gemacht werden, wodurch Anlass zur Beeinträchtigung der Sensorreaktion/Reproduzierbarkeit des Sensors gegeben ist. In Übereinstimmung mit dem Herstellungsverfahren, das darin besteht, die Reaktionsschicht zu bilden durch Titrieren einer Lösung, die die Oxydoreduktase enthält, auf dem Elektroden system, und Trocknen der titrierten Lösung, ist es schwierig, eine homogene Reaktionsschicht zu bilden, weil die Lösung außerhalb des Elektrodensystems überfließt.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die primäre Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, einen Biosensor zu schaffen, der eine schnelle und vereinfachte Quantifizierung einer spezifischen Komponente mit hoher Genauigkeit erlaubt, die in verschiedenen biologischen Proben enthalten ist.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, einen Biosensor mit hoher Sensorreaktion-/Reproduzierbarkeit zu schaffen.
Noch eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein Verfahren zum Herstellen eines Biosensors zu schaffen, das es erlaubt, eine homogene Reaktionsschicht in einem einfachen Vorgang zu bilden.
Gelöst werden diese Aufgaben hinsichtlich des Biosensors durch die Merkmale des Anspruchs 1, und hinsichtlich des Verfahrens zur Herstellung des Biosensors durch die Merkmale des Anspruchs 7.
In dem vorstehend genannten Biosensor umfasst die Reaktionsschicht bevorzugt einen Elektronenakzeptor und/oder ein hydrophiles Polymer.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst die vorstehend genannte Reaktionsschicht einen Träger zum Tragen von zumindest einer Oxydoreduktase.
Außerdem wird die vorstehend genannte Reaktionsschicht bevorzugt auf dem Elektrodensystem in engem Kontakt mit dem Elektrodensystem gebildet.
Während die neuartigen Merkmale der Erfindung vorstehend angeführt sind, lässt sich die Erfindung sowohl hinsichtlich ihres Aufbaus als auch ihres Inhalts zusammen mit weiteren Aufgaben und Merkmalen aus der nachfolgenden, detaillierten Beschreibung und den nachfolgenden Beispielen in Verbindung mit den anliegenden Zeichnungen besser verstehen und würdigen.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Fig. 1 zeigt eine Querschnittsseitenansicht von einem wesentlichen Teil eines Biosensors, der in Übereinstimmung einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung zubereitet ist.
Fig. 2 zeigt eine perspektivische Explosionsansicht des in Fig. 1 gezeigten Biosensors ohne die Reaktionsschicht, von schräg oben aus gesehen.
Fig. 3 zeigt eine Kurvendarstellung der Beziehung zwischen der Glukosekonzentration und dem Reaktionsstrom des Glukose- Sensors in dem Beispiel der vorliegenden Erfindung und dem Vergleichsbeispiel.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER AUS FÜHRUNGSFORMEN

In den folgenden Absätzen sind Ausführungsformen des Biosensors und des Verfahrens zur Herstellung desselben in Überein stimmung mit der vorliegenden Erfindung unter Bezug auf die anliegenden Zeichnungen näher erläutert.
Wie vorstehend erläutert, besitzt der Biosensor in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung eine Konfiguration, demnach im Wesentlichen die gesamte Reaktionsschicht dem Hohlraum ausgesetzt ist, wodurch im Wesentlichen sämtliche verschiedenen Komponenten, die in der Reaktionsschicht enthalten sind, an der Reaktion teilnehmen können. Die Reaktion des Sensors und seine Reproduzierbarkeit kann dadurch deutlich verbessert werden.
Außerdem ist es in Übereinstimmung mit dem vorstehend genannten Herstellungsverfahren möglich, eine homogene Reaktionsschicht in einem einfachen Vorgang wie folgt auszubilden: Zunächst wird die elektrisch isolierende Basisplatte unterteilt, um den durch die Reaktionsschicht eingenommenen Bereich festzulegen, indem ein Abstandhalter in engen Kontakt mit der Basisplatte gebracht wird, woraufhin die Reaktionsschicht durch Titrieren einer Lösung zur Bildung der Reaktionsschicht auf den festgelegten Bereich und Trocknen der titrierten Lösung gebildet wird, oder alternativ durch Anordnen verschiedener, einen Träger tragenden Komponenten, der die Reaktionsschicht in dem wie vorstehend festgelegten Bereich bildet.
Wie vorstehend erläutert, ist es in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung möglich, die Reaktion der Reaktionsschicht deshalb zu verbessern, weil die, die verschiedenen Komponenten enthaltende Reaktionsschicht homogen gebildet werden kann, und weil ein Teil der in der Probenlösung aufzulösenden Reaktionsschicht konstant gemacht werden kann. In folge hiervon kann ein Biosensor mit hoher Reproduzierbarkeit erzeugt werden.
In den nachfolgenden Absätzen wird die vorliegende Erfindung beispielhaft unter Bezug auf die anliegenden Zeichnungen näher erläutert.
Fig. 1 zeigt eine Querschnittsseitenansicht eines wesentlichen Teils eines Biosensors in Übereinstimmung mit einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, während Fig. 2 eine perspektivische Explosionsansicht des in Fig. 1 gezeigten Biosensors, von schräg oben ausgehend gesehen, zeigt (wobei seine Reaktionsschicht zur Vereinfachung der Darstellung weggelassen ist).
Die Struktur bzw. der Aufbau dieses Biosensors ist wie folgt. Eine elektrisch isolierende Basisplatte 1, hergestellt aus Polyethylenterephthalat, wird mit einem Paar von Leitern 2 und 3 versehen, die durch Drucken einer Silberpaste mittels eines Siebdruckprozesses ausgebildet werden. Auf der Basisplatte 1 sind eine Arbeitselektrode 4 und eine Gegenelektrode 5 vorgesehen, die ein Elektrodensystem bilden, das durch Drucken ausgebildet wird unter Verwendung einer elektrisch leitenden Kohlenstoffpaste, die einen Harzbinder enthält. Nach Ausbildung der Leiter 2 und 3 wird eine elektrisch isolierende Schicht 6 unter Verwendung einer elektrisch isolierenden Paste gebildet. Die elektrisch isolierende Schicht 6 dient dazu, eine konstante Fläche (etwa 1 mm²) des freiliegenden Bereichs der Arbeitselektrode 4 aufrecht zu erhalten und die Leiter 2 und 3 teilweise abzudecken.
Auf dem auf der Basisplatte 1 gebildeten Elektrodensystem wird eine Reaktionsschicht 7 vorgesehen, die sich in engem Kontakt mit dem Elektrodensystem befindet. Die detaillierte Konstruktion der Reaktionsschicht ist nachfolgend anhand konkreter Beispiele erläutert.
Ein Gehäuseelement 10 mit einem geschlitzten Abstandhalter 8 und einer Abdeckung 9 wird an die Basisplatte 1 in einer Positionsbeziehung geklebt, die in Fig. 2 durch einfach strichpunktierte Linien gezeigt ist. Der geschlitzte Abstandhalter 8 und die Abdeckung 9 legen einen Hohlraum auf der elektrisch isolierenden Basisplatte fest, der einen Probenzufuhrkanal 12 bildet, wie nachfolgend erläutert.
Wie in Fig. 2 gezeigt, weist der geschlitzte Abstandhalter 8 einen länglichen Schlitz 11 auf, der einen in etwa rechteckigen Probenzufuhreinlass 11a an seinem rechten Ende (in der Figur) und einen bogenförmigen Teil 11b aufweist. Der Einlass 11a stellt ein offenes Ende für den Probenzufuhrkanal 12 dar. Der bogenförmige Teil 11b ist unmittelbar über dem Elektrodensystem vorgesehen und in Übereinstimmung mit der Außenform des Elektrodensystems geformt. Der linke oder am weitesten entfernt gelegene Teil des Schlitzes 11 liegt unmittelbar unter einem Luftauslass 13, der auf der Abdeckung 9 vorgesehen ist.
Im Wesentlichen die gesamte Reaktionsschicht 7 ist dem Hohlraum 12 ausgesetzt, der durch den Abstandhalter 8 zwischen der Oberseite der Basisplatte 1 und der Abdeckung 9 festgelegt ist. D. h., im Wesentlichen die gesamte Reaktionsschicht 7 kommt in dem bogenförmigen Teil 11b des rechteckigen Schlitzes 11 zu liegen, einschließlich dem Probenzufuhreinlass 11a des Sensors. Es ist deshalb bevorzugt, dass der Durchmesser des vorstehend genannten, bogenförmigen Teils 11b in etwa gleich dem Durchmesser der Gegenelektrode 5 ist, und dass die Reaktionsschicht 7 auf dem gesamten Bereich des bogenförmigen Teils 11b gebildet ist.
Da der Schlitz 11 herkömmlicherweise gerade gebildet ist, ist die Reaktionsschicht 7 teilweise durch den Abstandhalter 8 abgedeckt. Hierdurch war es unmöglich, die gesamte Oberfläche der Reaktionsschicht 7 dem Probenzufuhrkanal 12 auszusetzen. Wenn die Breite des Schlitzes 11 vergrößert wird, um die gesamte Oberfläche der Reaktionsschicht 7 dem Probenzufuhrkanal 12 auszusetzen, wird die Querschnittsfläche des Probenzufuhrkanals 12 vergrößert. Hierdurch wird es schwierig, eine Probenlösung in die Reaktionsschicht 7 einzuleiten ausschließlich dadurch, dass die Probenlösung in Kontakt mit dem offenen Ende des Probenzufuhrkanals 12 gebracht wird, und zwar durch Kapillarwirkung des Probenzufuhrkanals 12.
In den vorstehend angeführten Ausführungsformen beträgt die Breite "d" des Schlitzes 11 2,0 mm, der Durchmesser der Kreissektion mit dem bogenförmigen Teil 11b beträgt 3,8 mm, und die Höhe "h" des Probenzufuhrkanals 12, d. h., die Dicke des Abstandhalters 8, beträgt 0,4 mm. Bevorzugt sollte der Probenzufuhrkanal 12 eine derartige Querschnittsfläche aufweisen, d. h., d · h, dass die Probenlösung auf die Reaktionsschicht 7 leicht eingeleitet werden kann, indem die Probenlösung einfach in Kontakt mit dem offenen Ende des Probenzufuhrkanals 12 gebracht wird.
Damit der Sensor eine derartige, bevorzugte Konfiguration aufweisen kann, ist es vorteilhaft, die Reaktionsschicht 7 zu bilden, nachdem der Abstandhalter 8 mit der Basisplatte 1 kombiniert worden ist, und zwar in dem Fall, dass die Reakti onsschicht durch Titrieren einer Lösung gebildet wird, insbesondere eine hydrophiles Polymer enthaltende, wässrige Lösung, gefolgt durch Trocken der titrierten Lösung. Es ist auch möglich, die Reaktionsschicht 7 mit einer vorbestimmten Größe in einer vorbestimmten Position auf der Basisplatte zu bilden und daraufhin die Basisplatte mit dem Gehäuseelement zu kombinieren durch angemessenes Einstellen der Titriermenge und der Viskosität der Lösung zur Bildung der Reaktionsschicht.
Obwohl das Gehäuseelement 10 in der vorstehend genannten Konfiguration mit zwei Komponenten des Abstandhalters 8 und der Abdeckung 9 gebildet ist, kann eine weitere Konfiguration alternativ derart angewendet werden, dass das Gehäuseelement gebildet wird, indem es in einer Kombination des Abstandhalters 8 mit der Abdeckung 9 in einen einheitlichen Körper für den Sensor geformt wird, der durch Verwenden des zuletzt genannten Prozesses zum Ausbilden der Reaktionsschicht konfiguriert wird. In einigen Fällen kann der Abstandhalter lediglich als Gehäuseelement dienen.

Beispiel 1 (Fructose-Sensor I)

Zunächst wurden eine elektrisch isolierende Basisplatte 1, hergestellt aus Polyethylenterephthalat und mit einem Paar von Leitern 2 und 3 versehen, ein Elektrodensystem, bestehend aus einer Arbeitselektrode 4 und einer Gegenelektrode 5 und eine elektrisch isolierende Schicht 6 zubereitet. In diesem Beispiel betrug eine freizulegende, durch den Bereich der Arbeitselektrode 4 einzunehmende Fläche etwa 1 mm².
Auf dem Elektrodensystem der Basisplatte 1 wurden 0,5 Gew.% wässrige Lösung aus Karboxymethylzellulose (nachfolgend als "CMC" bezeichnet) als das hydrophile Polymer titriert und daraufhin getrocknet, um eine CMC-Schicht zu bilden. Daraufhin wurde eine Reaktionsschicht 7 auf der vorstehend genannten CMC-Schicht durch Titrieren von 4 ul einer gemischten Lösung zubreitet durch Auflösen von 1000 U Fructosedehydrogenase (hergestellt durch Toyobo; nachfolgend als "FDH" bezeichnet) als das Enzym, und 33 mg Kaliumferrizyanid als der Elektronenakzeptor in 1 ml einer Phosphorsäure-Zitronensäüre- Pufferlösung (0,2 M Na&sub2;HPO&sub4; - 0,1M C&sub3;H&sub4;(OH)(COOH)&sub3;, pH = 5,0) zubereitet, die CMC mit 0,5 Gew.% enthält, woraufhin die titrierte Lösung in einem Warmlufttrockner bei 50ºC für 10 Minuten getrocknet wurde. In diesem Fall betrug der Durchmesser des Außenrands bzw. -umfangs der Reaktionsschicht etwa 3,6 mm und er befand sich ungefähr in Übereinstimmung mit dem Durchmesser der Gegenelektrode.
Wenn das vorstehend genannte Gemisch aus Phosphorsäure, Zitronensäure, FDH und dem Elektronenakzeptor auf die CMC- Schicht titriert wurde, wurde die zuerst gebildete CMC- Schicht einmal aufgelöst und daraufhin in die Reaktionsschicht 7 in einen Zustand umgesetzt, in dem sie teilweise mit dem Enzym und den übrigen Komponenten während des nachfolgenden Trocknungsprozesses gemischt war. Da jedoch ein vollständig gemischter Zustand nicht erreicht wurde, weil während des Prozesses kein Rühren stattfand, wurde ein Zustand erzielt, demnach die CMC direkt auf die Oberfläche des Elektrodensystems aufgebracht war.
D. h., der Prozess verhindert effektiv eine Absorption eines Proteins auf der Oberfläche des Elektrodensystems sowie eine mögliche Schwankung der Eigenschaften des Elektrodensystems auf Grund einer chemischen Wirkung dieser Substanzen, die Oxydationsfähigkeit besitzen, wie etwa Kaliumferrizyanid und dergleichen, weil das Enzym, der Elektronenakzeptor u. dgl. nicht in direkten Kontakt mit der Oberfläche des Elektrodensystems gebracht worden sind. Infolge hiervon war ein Fructose-Sensor mit hochgenauer Reaktion durch diesen Prozess erzeugbar.
Ein geschlitzter Abstandhalter 8 und eine Abdeckung 9 wurden schließlich auf die Basisplatte 1 in einer in Fig. 2 mit den einfach strichpunktierten Linien gezeigten Positionsbeziehung geklebt. Dieser Abstandhalter 8 und diese Abdeckung 9 zum Festlegen eines Hohlraums, der einen Probenzufuhrkanal bildet, sind nachfolgend erläutert.
Wenn der Abstandhalter 8 und die Abdeckung 9 auf der Basisplatte 1 in der vorstehend genannten Weise angebracht waren, war der Probenzufuhrkanal als Hohlraum 12 zwischen der Basisplatte 1 und der Abdeckung 9 gebildet und durch den Abstandhalter mit dem länglichen Schlitz 11 umgeben bzw. umschlossen. Durch Kapillarwirkung dieses Probenzufuhrkanals kann die Probenlösung in den Teil der Reaktionsschicht problemlos eingeleitet werden, indem die Probenlösung einfach in Kontakt mit dem Probenzufuhreinlass 11b am Vorderende des Sensors gebracht wird. Da die Zufuhrmenge der Probenlösung vom Volumen des Hohlraums abhängt, das durch die Abdeckung und den Abstandhalter festgelegt ist, erübrigt sich eine vorläufige bzw. vorausgehende Quantifizierung der Probenlösung. Da außerdem die gesamte Oberfläche der Reaktionsschicht dem. Hohlraum ausgesetzt ist, ist die aufgelöste Menge der Reaktionsschicht konstant und die Reproduzierbarkeit der Sensorreaktion kann verbessert werden. Da außerdem die Verdampfung der Probenlösung während der Messung auf ein Minimum reduziert werden kann, ist es möglich, eine Messung mit hoher Genauigkeit durchzuführen.
Wenn 3 ul wässrige Fructoselösung als Probenlösung durch den Probenzufuhreinlass 11a des Fructose-Sensors zugeführt wurde, der in der vorstehend genannten Weise hergestellt worden ist, erreicht die Probenlösung schnell einen Teil, der unmittelbar unter dem Luftauslass 13 der Abdeckung 9 zu liegen kommt, und die Reaktionsschicht 7 wurde auf dem Elektrodensystem darin gelöst.
Zu einer gegebenen Zeit nach der Zufuhr der Probenlösung wurde eine Impuls Spannung von +0,5 V auf Grundlage der Spannung an der Gegenelektrode 5 an die Arbeitselektrode 4 angelegt und der Anodenstromwert wurde 5 Sekunden nach dem Anlegen gemessen. Dadurch wurde ein Reaktionsstromwert, der proportional zur Konzentration zur Fructose ist, die in der Probenlösung enthalten ist, erzielt.
Wenn die Reaktionsschicht in der Probenlösung aufgelöst wurde, wurde die Fructose in der Probenlösung durch die FDH oxydiert, um 5-Keto-Fructose zu erzeugen. Kaliumferrizyanid wurde daraufhin auf Kaliumferrozyanid reduziert durch Elektronen, die durch die Oxydationsreaktion verschoben wurden, die durch die FDH bewirkt worden war. Daraufhin wurde ein Oxydationsstrom des resultierenden Kaliumferrozyanids bei Anlegen der vorstehend genannten Impulsspannung zum fließen gebracht. Der Wert dieses Strom entspricht der Konzentration der Fructose, bei der es sich um das zu quantifizierende Substrat handelt.

Beispiel 2 (Fructose-Sensor II)

In derselben Weise wie beim Beispiel 1 wurde eine Basisplatte 1 mit einem gedruckten Elektrodensystem zubereitet und ein Abstandhalter 8 wurde auf die Basisplatte in einer Positionsbeziehung geklebt, die in Fig. 2 durch einfach strichpunktierte Linien gezeigt ist.
Daraufhin wurde auf das vorstehend genannte Elektrodensystem der Basisplatte 1 0,5 Gew.% wässrige Lösung von CMC als das hydrophile Polymer titriert und daraufhin getrocknet, um eine CMC-Schicht zu bilden. Daraufhin wurde eine Reaktionsschicht 7 auf der vorstehend genannten CMC-Schicht durch Titrieren von 4 ul einer gemischten Lösung gebildet, die zubreitet wurde durch Auflösen von 1000 U von FDH als das Enzym, und 33 mg Kaliumferrizyanid als der Elektronenakzeptor in 1 ml einer Phosphorsäure-Zitronensäure-Pufferlösung (0,2 M Na&sub2;HPO&sub4; - 0,1 M C&sub3;H&sub4;(OH)(COOH)&sub3;, pH = 5,0), enthaltend CMC mit 0,5 Gew.%, woraufhin die titrierte Lösung in einem Warmlufttrockner bei 50ºC für 10 Minuten getrocknet wurde. In diesem Fall betrug der Durchmesser des Außenrands bzw. -umfangs der Reaktionsschicht 3,6 mm, was in etwa in Übereinstimmung mit dem Durchmesser der Gegenelektrode steht.
Nach Bilden der Reaktionsschicht 7 in der vorstehend genannten Weise wurde eine Abdeckung 9 auf den Abstandhalter 8 in einer Positionsbeziehung geklebt, die in Fig. 2 durch die einfach strichpunktierten Linien gezeigt ist.
Im Unterschied zum Beispiel 1 sind in diesem Beispiel der Abstandhalter 8 und die Abdeckung 9 getrennt geklebt. Obwohl dies den Herstellungsprozess des Sensors geringfügig kompliziert macht, kann eine homogenere Reaktionsschicht 7 deshalb gebildet werden, weil der Prozess eine konstante Expansion der Reaktionsschicht durch den Abstandhalter 8 gewährleistet.
Wenn 3 ul wässrige Fructoselösung als Probenlösung durch den Probenzufuhreinlass 11a des Fructose-Sensors zugeführt wurde, der in der vorstehend genannten Weise hergestellt worden ist, erreicht die Probenlösung schnell einen Teil, der unmittelbar unter dem Luftauslass 13 der Abdeckung 9 zu liegen kommt, und die Reaktionsschicht 7 auf dem Elektrodensystem wurde darin gelöst.
Eine gegebene Zeit nach Zufuhr der Probenlösung wurde eine Impulsspannung von +0,5 V auf Grundlage der Spannung an der Gegenelektrode 5 an die Arbeitselektrode 4 angelegt und der Anodenstromwert wurde 5 Sekunden nach dem Anlegen gemessen. Dadurch wurde ein Reaktionsstromwert, der proportional zur Konzentration zur Fructose ist, die in der Probenlösung enthalten ist, gewonnen.

Beispiel 3 (Fructose-Sensor III)

Da der Sensor gemäß diesem Beispiel derselbe ist wie derjenige gemäß dem Beispiel 2, mit Ausnahme der Zusammensetzung der Reaktionsschicht 7, wird lediglich die Reaktionsschicht 7 erläutert.
Der Abstandhalter 8 wurde auf die Basisplatte 1 geklebt, auf der das Elektrodensystem bereits in einer Positionsbeziehung gedruckt worden war, die in Fig. 2 mit einfach strichpunktierten Linien gezeigt ist, sowie in einer Weise ähnlich derjenigen im Beispiel 2. Daraufhin wurde die CMC-Schicht auf dem vorstehend genannten Elektrodensystem der Basisplatte 1 durch Titrieren von 0,5 Gew.% wässriger Lösung aus CMC und daraufhin durch Trocknen der titrierten Lösung gebildet. Daraufhin wurde eine erste Schicht auf der vorstehend genannten CMC-Schicht durch Titrieren von 4 ul einer gemischten Lösung gebildet, die gemischt Lösung wurde zubreitet durch Auflösen von 1000 U von FDH als das Enzym in 1 ml Phosphorsäure- Zitronensäure-Pufferlösung (0,2 M Na&sub2;HPO&sub4; - 0,1M C&sub3;H&sub4;(OH)(COOH)&sub3;, pH = 5,0), enthaltend CMC mit 0,5 Gew.%. Daraufhin wurde die titrierte Lösung in einem Warmlufttrockner bei 50ºC für 10 Minuten getrocknet. Daraufhin wurde eine zweite Schicht durch Titrieren von 4 ul 0,5 Gew.% Ethanollösung von Polyvinylpyrrolidon (nachfolgend als "PVP" bezeichnet) als hydrophiles Polymer gebildet, gefolgt vom Trocknen der titrierten Lösung bei Raumtemperatur. Daraufhin wurde eine dritte Schicht auf der vorstehend genannten zweiten Schicht durch Titrieren von 3 ul einer Toluoldispersion gebildet, die zubereitet wurde durch Dispergieren von 190 mg Kaliumferrizyanid als Elektronenakzeptor und Toluol, enthaltend Eigelblecithin mit 1,0 Gew.%, gefolgt vom Trocknen der titrierten Dispersion bei Raumtemperatur.
In diesem Beispiel bestand die Reaktionsschicht 7 aus dem vorstehend genannten ersten, zweiten und dritten Schichten. Auch in diesem Fall betrug der Durchmesser des Außenrands bzw. -umfangs der Reaktionsschicht 7 etwa 3,6 mm, und er befand sich ungefähr in Übereinstimmung mit dem Durchmesser der Gegenelektrode.
Der Sensor dieses Beispiels weist die Reaktionsschicht 7 als Laminatstruktur auf, bestehend aus drei Schichten, und sein Herstellungsprozess ist komplizierter als im Beispiel 2. Da die erste Schicht, die das Enzym enthält, von der dritten Schicht getrennt ist, die den Elektronenakzeptor enthält, und zwar durch die zweite Schicht, die das hydrophile Polymer enthält, befindet sich das Enzym nicht in direktem Kontakt mit dem Elektronenakzeptor, weshalb diese Konfiguration den Vorteil hat, dass eine mögliche Beeinträchtigung der Enzymak tivität während einer Lagerung über einen langen Zeitraum wirksam verhindert werden kann.
Wenn 3 ul wässrige Fructoselösung als Probenlösung durch den Probenzufuhreinlass 11a des Fructose-Sensors zugeführt wurde, der in der vorstehend genannten Weise hergestellt worden ist, erreicht die Probenlösung schnell einen Teil, der unmittelbar unter dem Luftauslass 13 zu liegen kommt, und die Reaktionsschicht 7 auf dem Elektrodensystem wurde darin gelöst.
Eine gegebene Zeit nach Zufuhr der Probenlösung wurde eine Impuls Spannung von +0,5 V auf Grundlage der Spannung an der Gegenelektrode 5 an die Arbeitselektrode 4 angelegt und der Anodenstromwert wurde 5 Sekunden nach dem Anlegen gemessen. Die Messung ergibt einen Reaktionsstromwert, der proportional zur Konzentration zur Fructose ist, die in der Probenlösung enthalten ist.

Beispiel 4 (Glukose-Sensor I)

Zunächst wird der Herstellungs- bzw. Zubereitungsprozess des Glukose-Sensors erläutert. Die Konfiguration des Glukose- Sensors gemäß diesem Beispiel ist dieselbe wie im Beispiel 1, mit der Ausnahme einiger Komponenten in der Reaktionsschicht 7.
Auf dem Elektrodensystem der Basisplatte 1 wurden 0,5 Gew.% wässrige Lösung von CMC als das hydrophile Polymer titriert und daraufhin getrocknet, um die CMC-Schicht zu bilden. Daraufhin wurde eine Reaktionsschicht 7 auf der vorstehend genannten CMC-Schicht durch Titrieren von 4 ul einer gemischten Lösung gebildet, die zubreitet worden war durch Auflösen von Glukoseoxydase (nachfolgend als "GOD" bezeichnet) als das En zym, und Kaliumferrizyanid als der Elektronenakzeptor, woraufhin die titrierte Lösung in einem Warmlufttrockner bei 50ºC für 10 Minuten getrocknet wurde. In diesem Fall betrug der Durchmesser des Außenrands bzw. -umfangs der Reaktionsschicht 7 etwa 3,6 mm sowie in etwa übereinstimmend mit dem Durchmesser der Gegenelektrode 5.
Wenn das vorstehend genannte Gemisch aus GOD und Elektronenakzeptor auf die CMC-Schicht titriert wurde, wurde die zuerst gebildete CMC-Schicht einmal bzw. mit einem Mal aufgelöst und daraufhin in die Reaktionsschicht 7 in einen Zustand umgesetzt, in dem sie mit dem Enzym und den weiteren Komponenten in dem Gemisch während des darauffolgenden Trocknungsprozesses gemischt war. Da jedoch ein vollständig gemischter Zustand nicht erreicht wurde, weil während des Prozesses kein Rühren stattfand, wurde ein Zustand erreicht, demnach lediglich die CMC-Schicht direkt auf der Oberfläche des Elektrodensystems auf getragen war.
Schließlich wurden ein geschlitzter Abstandhalter 8 und eine Abdeckung 9 an bzw. auf die Basisplatte 1 in einer Positionsbeziehung geklebt, die in Fig. 2 durch die einfach strichliierten Linien gezeigt ist.
Wenn 3 ul wässrige Glukoselösung als Probenlösung durch den Probenzufuhreinlass 11a des Glukose-Sensors zugeführt wurde, der in der vorstehend genannten Weise hergestellt worden war, erreichte die Probenlösung schnell einen Teil, der unmittelbar unter dem Luftauslass 13 der Abdeckung 9 zu liegen kommt, und die Reaktionsschicht 7 auf dem Elektrodensystem wurde darin gelöst.
Eine gegebene Zeit nach Zufuhr der Probenlösung wurde eine Impulsspannung von +0,5 V auf Grundlage der Spannung an der Gegenelektrode 5 an die Arbeitselektrode 4 angelegt und der Anodenstromwert wurde 5 Sekunden nach dem Anlegen gemessen, wodurch ein Reaktionsstromwert erhalten wurde, der proportional zur Konzentration zur Glukose war, die in der Probenlösung enthalten ist.
Wenn die Reaktionsschicht in der Probenlösung aufgelöst wurde, wurde die Glukose in der Probenlösung durch die GOD zur Erzeugung von Gluconolocton oxydiert. Daraufhin wurde Kaliumferrizyanid auf Kaliumferrozyanid durch Elektronen reduziert, die durch die Oxydationsreaktion verschoben wurden, die durch die GOD bewirkt wurde. Daraufhin wurde ein Oxydationsstrom des resultierenden Kaliumferrozyanids bei Anlegung der vorstehend genannten Impuls Spannung zum Fließen gebracht. Der Wert dieses Stroms entspricht der Konzentration der Glukose, bei der es sich um das zu quantifizierende Substrat handelt.
Der Glukose-Sensor, im dem im Wesentlichen die gesamte Reaktionsschicht dem Hohlraum ausgesetzt ist, der durch den Abstandhalter und die Abdeckung festgelegt ist, wie bei diesem Beispiel, wird mit "A" bezeichnet. Der Glukose-Sensor gemäß dem Stand der Technik mit dem rohrförmigen Hohlraum, d. h., ein Glukose-Sensor mit einem Schlitz, wie in Fig. 2 gezeigt, wobei der Probenzufuhrkanal 11 den bogenförmigen Teil 11b nicht aufweist, wird mit "B" bezeichnet. Varianzen der Reaktionen, die durch diese Sensoren erhalten wurden, werden als Varianzkoeffizient verglichen und die Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle 1 zusammengefasst. Die Beziehung zwischen der Glukosekonzentration und dem Reaktionsstrom ist in Fig. 3 gezeigt.
Wie in Tabelle 1 und Fig. 3 gezeigt, ergibt sich klar, dass der Glukose-Sensor "A", in dem der Reaktionsstrom des Sensors in Übereinstimmung mit einer Verringerung des Varianzkoeffizienten bei einer Glukosekonzentration größer als 30 mg/dl zunimmt, ist dem Glukose-Sensor "B" überlegen. Tabelle 1

Beispiel 5 (Glukose-Sensor II)

Da der Sensor gemäß diesem Beispiel derselbe ist wie gemäß dem Beispiel 4, mit Ausnahme der Zusammensetzung der Reakti onsschicht 1, erfolgt lediglich eine Erläuterung der Reaktionsschicht 7.
Der Abstandhalter 8 wurde mit der Basisplatte 1 verbunden bzw. verklebt, auf der das Elektrodensystem bereits in einer Positionsbeziehung gedruckt war, die in Fig. 2 durch einfach strichpunktierte Linien gezeigt ist, und zwar in einer Weise ähnlich im Beispiel 4. Daraufhin wurde ein Filterpapierstück, getränkt als GOD als Enzym, und Kaliumferrizyanid als Elektronenakzeptor auf dem vorstehend genannten Elektrodensystem platziert. Daraufhin wurde die Abdeckung 9 auf bzw. an den Abstandhalter 8 in der Positionsbeziehung geklebt, die in Fig. 2 durch die einfach strichpunktierten Linien gezeigt ist, um den Glukose-Sensor fertig zu stellen. In diesem Fall betrug der Durchmesser des Außenrands bzw. -umfangs der Reaktionsschicht 7 etwa 3,6 mm, und er war in etwa in Übereinstimmung mit dem Durchmesser der Gegenelektrode 5.
3 ul wässrige Glukoselösung als Probenlösung wurden durch den Probenzufuhreinlass 11a des Glukose-Sensors zugeführt, der in der vorstehend genannten Weise hergestellt worden war. Die Probenlösung erreichte daraufhin rasch einen Teil, entsprechend dem Luftauslass 13, und das Enzym und der Elektronenakzeptor in der Reaktionsschicht 7 auf dem Elektrodensystem wurden darin gelöst.
Eine gegebene Zeit nach Zufuhr der Probenlösung wurde eine Impulsspannung von +0,5 V auf Grundlage der Spannung an der Gegenelektrode 5 an die Arbeitselektrode 4 angelegt und der Anodenstromwert wurde 5 Sekunden nach dem Anlegen der Impulsspannung gemessen. Diese Messung ergibt einen Reaktionsstromwert, der proportional zur Konzentration zur Konzentration der Glukose ist, die in der Probenlösung enthalten ist.
In den soeben beschriebenen Beispielen 4 und 5 wurden Biosensoren beschrieben bzw. dargestellt, die einen Elektronenakzeptor in der Reaktionsschicht verwenden; der Biosensor kann jedoch auch so konfiguriert werden, dass er keinen Elektronenakzeptor verwendet. D. h., ein technischer Vorteil ähnlich demjenigen in den vorstehend genannten Beispielen wird mit einem Biosensor erzielt, wobei das Elektrodensystem mit Platin, Gold o. dgl. konfiguriert ist, und die Reaktionsschicht, die ausschließlich das Enzym enthält, oder die das Enzym oder das hydrophile Polymer enthält, wird auf dem Elektrodensystem gebildet. In einem derartigen Biosensor wird die Substratkonzentration auf Grundlage der Konzentration von Wasserstoffperoxyd ermittelt, das als Ergebnis der Enzymreaktion erzeugt wird, oder auf Grundlage der Konzentration von Sauerstoff, der durch die Enzymreaktion verbraucht wird.
Obwohl in den vorstehend angeführten Beispielen die Reaktionsschicht in engem Kontakt mit dem Elektrodensystem angeordnet ist, ist die vorliegende Erfindung nicht auf Biosensoren beschränkt, die konfiguriert werden durch Platzieren der Reaktionsschicht in engem Kontakt mit dem Elektrodensystem; vielmehr kann die Erfindung auch in einem Biosensor verkörpert sein, der eine Konfiguration aufweist, demnach ein Freiraum zwischen dem Elektrodensystem und der Reaktionsschicht zu liegen kommt, oder zwischen der Abdeckung und der Reaktionsschicht.
Obwohl die Reaktionsschicht vollständig auf dem Elektrodensystem in den vorstehend genannten Beispielen gebildet ist, ist die Erfindung nicht auf diese Konfigurationen beschränkt, sondern kann eine weitere Konfiguration nutzen, demnach die Reaktionsschicht in dem Hohlraum gebildet ist, der durch das Gehäuseelement festgelegt ist, und demnach im Wesentlichen die gesamte Reaktionsschicht dem Hohlraum ausgesetzt ist, jedoch in einem Zustand, in dem die Reaktionsschicht sich nicht in Übereinstimmung mit dem Elektrodensystem befindet.
Obwohl die Bodenseite bzw. -fläche des vorstehend genannten Hohlraum im Bereich des Elektrodensystems im Wesentlichen übereinstimmt mit der Außengestalt bzw. -form des Elektrodensystems in den vorstehend genannten Beispielen, ist die Erfindung auch nicht hierauf beschränkt, sondern kann in einer Konfiguration verkörpert sein, demnach im Wesentlichen die gesamte Reaktionsschicht dem Hohlraum ausgesetzt ist, und zwar selbst in einem solchen Fall, in dem die Bodenfläche des vorstehend genannten Hohlraums auf den Bereich des Elektrodensystems im Wesentlichen nicht mit der Außenform des Elektrodensystems übereinstimmt.
Obwohl in den vorstehend genannten Beispielen Fructosedehydrogenase (FDH) oder Glukoseoxydase (GOD) als Oxydoreduktase verwendet wird, ist die Erfindung nicht notwendigerweise auf diese Enzyme beschränkt. Alternativ kann eine hervorragende Reaktion des Sensors erzielt werden durch Verwendung eines Enzymsystems, das hergestellt ist durch Kombinieren von Hexokinase, Phosphoglukoseisomerase und Glukose-6-Phosphatdehydrogenade, oder ein anderes Enzymsystem, das durch Kombinieren von Glukoseisomerase mit Glukoseoxydase anstelle des vorstehend genannten FDH hergestellt ist.
Ein technischer Vorteil ähnlich zu demjenigen des vorstehend in den Beispielen erläuterten Frucosesensors kann außerdem mit Sensoren erzielt werden, wie etwa einem Laktasesäuresensor, der Laktasesäureoxydase oder Laktasesäuredehydrogenase als Enzym verwendet, einem Glukose-Sensor, der Glukosede hydrogenase verwendet, einem Cholesterol-Sensor, der Cholesteroloxydase oder Chloesteroldehydrogenase verwendet, einem Harnsäuresensor, der Harnsäure verwendet, oder einem Sucrose-Sensor, der ein Enzymsystem aus einer Kombination aus Glukoseoxydase und Invertase oder einer Kombination aus Fructosedehydrogenase, Invertase und Mutarotase verwendet.
Obwohl Carboxymethylzellulose und/oder Polyvinylpyrrolidon als das hydrophile Polymer in den vorstehend genannten Beispielen zum Einsatz kommt, ist die Erfindung nicht auf diese Konfiguration beschränkt. Ein technischer. Vorteil ähnlich zu diesen kann alternativ erzielt werden durch Verwenden von entweder Polyvinylalkohol, Gelatine und seinen Derivaten, Acrylisäure und seinen Salzen, Methacrylsäure und seinen Salzen, Stärke und seinen Derivaten, Maleinanhydrid und seinen Salzen und Zellulosederivat, genauer gesagt, Hydroxypropylzellulose. Methylzellulose, Ethylzellulose, Hydroxyethylzellulose, Ethylhydroxyethylzellulose und Karboxymethylethylzellulose.
Obwohl Kaliumferrizyanid in den vorstehend genannten Beispielen einen hervorragenden Elektronenakzeptor im Hinblick auf seine Stabilität und Reaktionsrate darstellt, kann andererseits P-Benzoquinon oder Ferrocen alternativ verwendet werden.
Obwohl Filterpapier als Träger verwendet wird, der die Reaktionsschicht in den vorstehend genannten Beispielen bildet, ist die Erfindung nicht hierauf beschränkt; alternativ kann ein unlösliches Polymer, wie etwa Nitrozellulose oder Zellulosetriacetat, verwendet werden. Das vorstehend genannte, hydrophile Polymer kann auch als Träger verwendet werden. In diesem Fall kann eine getrocknete Substanz einer Lösung des hydrophilen Polymers als Reaktionsschicht verwendet werden, die zumindest ein Enzym auflöst.
Obwohl in den vorstehend angeführten Ausführungsformen das Zwei-Elektrodensystem mit Arbeitselektrode und Gegenelektrode dargestellt ist, ist es auch möglich, eine Messung mit höherer Genauigkeit durchzuführen unter Verwendung eines Drei- Elektrodensystems, das außerdem eine Referenzelektrode zusätzlich zur Arbeitselektrode und Gegenelektrode umfasst.
Wie vorstehend klar dargestellt, kann in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung ein Biosensor hoher Zuverlässigkeit hergestellt werden, weil der derart gewonnene Sensor eine homogene Reaktionsschicht aufweist, die insgesamt gleichmäßig an der Reaktion teilnimmt.

Claims

1. Biosensor, auf weisend:

Eine elektrisch isolierende Basisplatte (1),

ein Elektrodensystem (4, 5) mit einer Arbeitselektrode (4) und einer Gegenelektrode (5), die auf einer Hauptfläche der elektrisch isolierenden Basisplatte (1) vorgesehen sind,

eine Reaktionsschicht (7) mit zumindest einer Oxydoreductase,

ein Gehäuseelement (10) mit einem Hohlraum, der einen Probenzufuhrkanal (12) auf der elektrisch isolierenden Basisplatte (1) bildet,

dadurch gekennzeichnet, das ein Teil des Bodens des Hohlraums über dem Elektrodensystem (4, 5) vorgesehen und in Übereinstimmung mit einer Außenform des Elektrodensystems derart geformt ist, dass der gesamte Teil der Reaktionsschicht (7) dem Hohlraum ausgesetzt ist.

2. Biosensor nach Anspruch 1, wobei die Reaktionsschicht (7) einen Elektronenakzeptor umfasst.

3. Biosensor nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Reaktionsschicht (7) außerdem ein hydrophiles Polymer umfasst.

4. Biosensor nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Gehäuseelement (10) einen Abstandhalter (8) mit einem Schlitz (11) mit einem offenen Ende auf weist, das als Probenzufuhreinlass (11a) auf seinem Vorderende dient, und eine Abdeckplatte (9), die mit dem Abstandhalter (8) in Schichtbauweise angeordnet ist.

5. Biosensor nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Reaktionsschicht (7) einen Träger zum Tragen von zumindest der Oxydoreductase umfasst.

6. Biosensor nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Reaktionsschicht (7) auf dem Elektrodensystem in engem Kontakt mit dem Elektrodensystem (4, 5) gebildet ist.

7. Verfahren zum Herstellen eines Biosensors, auf weisend die Schritte:

Bilden eines Elektrodensystems mit einer Arbeitselektrode (4) und einer Gegenelektrode (5) auf einer Hauptfläche einer elektrisch isolierenden Basisplatte (1),

Unterteilen der elektrisch isolierenden Basisplatte (1) derart, dass ein Abschnitt festgelegt ist, in dem das Elektrodensystem (4, 5) frei liegt durch Kombinieren eines Abstandhalters mit einem Hohlraum (8) mit der elektrisch isolierenden Basisplatte (1), und

Bilden einer Reaktionsschicht (7) mit zumindest einer Oxydoreductase in dem Hohlraum, wobei der Abstandhalter (8) einen Schlitz (11) aufweist, der den Hohlraum für einen Probenzufuhrkanal (12) auf der elektrisch isolierenden Basisplatte (1) bildet, wobei ein Teil des Bodens des Hohlraums über dem Elektrodensystem (4, 5) vorgesehen und in Übereinstimmung mit einer Außenform des Elektrodensystems derart geformt ist, dass der gesamte Teil der Reaktionsschicht (7) dem Hohlraum ausgesetzt ist, und wobei der Abstandhalter (8) den Schlitz (11) mit einem offenen Ende auf weist, das als Probenzufuhreinlass an seinem Vorderende dient.

8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei der Abstandhalter (8) in engen Kontakt mit der elektrisch isolierenden Basisplatte (1) gebracht wird, und wobei eine Abdeckung (9) in engen Kontakt mit dem Abstandhalter (8) gebracht wird.

9. Verfahren nach Anspruch 8, wobei der Schritt zum Bilden der Reaktionsschicht (7) das Titrieren einer Lösung, die zumindest die Oxydoreductase auf dem Abschnitt enthält, und das Trocknen der Lösung umfasst.

10. Verfahren nach Anspruch 8, wobei der Schritt zum Bilden der Reaktionsschicht (7) das Anordnen eines Trägers, der zumindest die Oxydoreductase trägt, in dem Abschnitt umfasst.

11. Verfahren nach Anspruch 7 oder 8, wobei der Schritt zum Bilden der Reaktionsschicht (7) das Bilden einer Reaktionsschicht umfasst, die eine Oxydoreductase und einen Elektrodenakzeptor enthält.

12. Verfahren nach Anspruch 7 oder 8, wobei der Schritt zum Bilden der Reaktionsschicht (7) das Bilden einer Reaktionsschicht mit einem hydrophilen Polymer, einer Oxydoreductase und einem Elektronakzeptor enthält.

13. Verfahren nach Anspruch 9, wobei der Träger einen Elektronenakzeptor trägt.