DE69610077T2

DE69610077T2 - Sesquiterpenverbindungen

Info

Publication number: DE69610077T2
Application number: DE69610077T
Authority: DE
Inventors: Jun-Ich Masuda; Shigeo Nozoe; Hideo Suzuki; Akira Takahashi; Ken-Ichi Tanaka
Original assignee: Toagosei Co Ltd
Current assignee: Toagosei Co Ltd
Priority date: 1995-02-15
Filing date: 1996-02-14
Publication date: 2001-04-12
Anticipated expiration: 2016-02-15
Also published as: EP0810198A4; EP0810198B1; DE69610077D1; EP0810198A1; JP3453758B2; US5840927A; WO1996025385A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine neue Familie von Sesquiterpenverbindungen, die aus Fruchtkörpern der Basidiomycota isoliert und wegen ihrer antifungalen Aktivitäten medizinisch eingesetzt werden können.
Die Entwicklung antimikrobieller Arzneimittel mit Antibiotika in zentraler Rolle ist in bemerkenswerter Weise fortgeschritten, während die Entwicklung antifungaler Arzneimittel unter dem Gesichtspunkt ihrer Vielfalt und Wirksamkeit nicht notwendigerweise befriedigend ist. Insbesondere stellen die opportunistischen Mykosen innerer Organe, verursacht durch Infektionen mit Candida, Aspergillus und Cryptococcus mycetes durch die Herabsetzung der Körperabwehr, die durch extensive Verabreichung von carcinostatischen Mitteln, Immunosuppressantien, Steroidhormonen etc. ebenso wie AIDS (acquired immunodeficiency syndrome) in den letzten Jahren induziert wird, ein wichtiges medizinisches Problem dar. Deshalb besteht ein großer Bedarf an der Entwicklung von Arzneimitteln gegen Mykosen.
Andererseits wurden physiologisch aktive Bestandteile in Pilzen seit frühen Zeiten untersucht. Elfvingia applanata (kofuki-saru-no-koshikake, Ganodermataceae) und Coriolus versicolor (Kawara-take, Polyporaceae) wurden als legendäre Kräutermedizin oder Volksmedizin für gastritischen Krebs, Esophaguskrebs, Brustkrebs, Prostatakrebs, etc. verwendet. Insbesondere wurde β-D-Glucan-Proteinkomplex (PS-K), extrahiert vom Mycelia von Coriolaceae (Kawara-take) in Kultur, extensiv als carcinostatisches Mittel verwendet. Darüberhinaus wurde die Isolierung eines carcinostatischen Proteinpolysaccharids aus wässrigen Extrakten und von Ergosterol von CHCl&sub3;-MeOH Extrakten von Hitokuchitake von Lee et al. (1981) bzw. Kim et al. (1982) in Korea [Asakawa et al., Trans. Mycol. Soc. Japan, 29, 281-296 (1988)] berichtet.
Darüberhinaus wurde das Isolieren von kryptoporischen Säuren A-G [Asakawa et al., Trans. Mycol. Soc. Japan, 29, 281-296 (1988); Asakawa et al., Phytochemistry, 31(2), 579- 592 (1992)] und kryptoporische Säure H [M. Hirotani et al., Phytochemistry, 30(5), 1555-1559 (1991)] aus diesem Hitokuchitake berichtet.
Auf der Suche nach neuen physiologisch aktiven Ingredienzen in Pilzen unternahmen die Erfinder erhebliche Anstrengungen, um Verbindungen zu finden, die starke antifungale Aktivität gegen die oben genannten Eumyzeten aufweisen, die die opportunistische Mykosis interner Organe induzieren, das heißt, Verbindungen, die wirksam verwendbar als antifungale Mittel sind. Aufgabe der Erfindung ist es, wirksame Verbindungen als antifungale Mittel zur Verfügung zu stellen.
Basierend auf sorgfältigen Studien gelang es den Erfindern, neue Sesquiterpenverbindungen von niederen Alkohol- oder Acetonextrakten von Fruchtkörpern des Roseofomes subflexibilis (Hounen-take) (Berk. et Curt. Aoshi.) in der Polyporaceaefamilie zu isolieren, und Sie vervollständigten die vorliegende Erfindung durch weiteres Auffinden der antifungalen Aktivität dieser Verbindungen im Assay antibiotischer Aktion. In den chemischen Formeln gemäß Erfindung können, wenn die Reste R¹ in einer gegebenen Verbindung mehrfach vorhanden sind, gleich oder verschieden sein. Gleiches gilt für R³ und R&sup4;.
Die vorliegende Erfindung betrifft Sesquiterpenverbindungen gemäß der folgenden allgemeinen Strukturformel I:
in der eine der beiden R¹ Gruppen -COOR³ ist und die andere eine der Gruppen gemäß den folgenden Formeln, in denen R² und R³ unabhängig voneinander Wasserstoff oder Alkyl oder Acyloxyalkyl und R&sup4; Hydroxyl oder Alkoxy sind:
In den bevorzugtesten Ausführungsformeln der Erfindung sind R² und R³ Wasserstoff oder niederes Alkyl und R&sup4; ist Hydroxyl.
Die vorliegende Erfindung umfasst ebenso antimikrobielle Mittel, die Sesquiterpenverbindung gemäß der folgenden allgemeinen Formel II enthalten:
in der R¹ -COOR² (wobei R² Wasserstoff, Alkyl oder Acyloxyalkyl ist), oder eine der Gruppen gemäß der folgenden Formeln (wobei R³ Hydroxyl oder Alkoxyl ist) ist.
Am bevorzugtesten dieser antimikrobiellen Mittel sind die mit Gehalt an Sesquiterpenverbindungen gemäß der folgenden Formel I:
wobei eine der beiden R¹-Gruppen in der Formel -COOR³ und die andere COOH oder eine der Gruppen gemäß der folgenden Formeln ist, wobei R² und R³ unabhängig voneinander Wasserstoff, Alkyl oder Acyloxyalkyl sind, oder beide Wasserstoff, wenn die andere R¹-Gruppe -COOH ist, und wobei R&sup4; Hydroxyl oder Alkoxy ist.
Die Erfindung wird im folgenden näher beschrieben.
Zuerst wird das Verfahren zum Isolieren der neuen Verbindungen gemäß Erfindung von Roseofomes subflexibilis (Hounen-take) in der Polyporaceaefamilie beschrieben.
Die neuen Verbindungen gemäß Erfindung können aus den Fruchtkörpern des Roseofomes subflexibilis (Hounen-take) der Polyporaceaefamilie, der normalerweise auf gefällten Bäumen im Unterholz von Sommer bis Herbst gezogen wird.
Die Fruchtkörper von Hounen-take werden fein zerteilt und in Aceton oder niederen Alkohol wie Methanol 1 bis 3 Tage bei Zimmertemperatur getaucht. Nach Konzentration des Extrakts im Vakuum wird der Siruprückstand in Wasser suspendiert und mit Äthylacetat extrahiert. Der auf diese Weise erhaltene Äthylacetatextrakt wird mittels Silicagelchromatographie und präparativer Dünnschichtchromatographie, die üblicherweise zur Trennung von Antibiotika verwendet wird, gereinigt; darüberhinaus, in Kombination mit hochauflösender Flüssigchromatographie, werden die neuen Verbindungen gemäß Erfindung einschließlich TG101, TG102, TG103, TG104 und andere kryptoporische Säure A (CA-A) fraktioniert.
Obgleich diese neuen Verbindungen nicht kristallisiert werden können, können sie als farbloses oder schwachgelbes Pulver durch Auswahl geeigneter Lösungsmittel zu deren Lösung, Einengen und Trocknen, gewonnen werden. Darüberhinaus können Derivate jeder einzelnen isolierten Verbindung durch chemische Synthese hergestellt werden.
Im folgenden wird das Verfahren zur Herstellung neuer Verbindungen gemäß Erfindung mit Bezug auf die Beispiele beschrieben; hierdurch soll die Erfindung jedoch nicht beschränkt werden.

Kurzbeschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 zeigt ein ¹H NMR (500 MHz; CDCl&sub3;)-Spektrum von TG101.
Fig. 2 ist eine teilweise Vergrößerung des ¹H NMR (500 MHz; CDCl&sub3;)-Spektrums von TG101.
Fig. 3 zeigt eine teilweise Vergrößerung des ¹H NMR (500 MHz; CDCl&sub3;)-Spektrums von TG 101.
Fig. 4 zeigt das ¹³C NMR (125 MHz; CDCl&sub3;)-Spektrum von TG 101.
Fig. 5 zeigt das ¹H NMR (500 MHz; CDCl&sub3;)-Spektrum von TG102.
Fig. 6 zeigt eine teilweise Vergrößerung des ¹H NMR (500 MHz; CDCl&sub3;)-Spektrums von TG102.
Fig. 7 zeigt eine teilweise Vergrößerung des ¹H NMR (500 MHz; CDCl&sub3;)-Spektrums von TG102.
Fig. 8 zeigt das ¹H NMR (500 MHz; CDCl&sub3;)-Spektrum von TG 103.
Fig. 9 zeigt eine teilweise Vergrößerung des ¹H NMR (500 MHz; CDCl&sub3;)-Spektrums von TG103.
Fig. 10 zeigt das ¹³C NMR (125 MHz; CDCl&sub3;)-Spektrum von TG103.
Fig. 11 zeigt das ¹H NMR (500 MHz; CDCl&sub3;)-Spektrum von TG104.
Fig. 12 zeigt eine teilweise Vergrößerung des ¹H NMR (500 MHz; CDCl&sub3;)-Spektrums von TG104.
Fig. 13 zeigt eine teilweise Vergrößerung des ¹H NMR (500 MHz; CDCl&sub3;)-Spektrums von TG104.
Fig. 14 zeigt das ¹H NMR (500 MHz; CDCl&sub3;)-Spektrum von CA-A.
Fig. 15 zeigt ein Infrarotabsorptionsspektrum (KBr) von CA-A.
Fig. 16 zeigt das ¹H NMR (500 MHz; CDCl&sub3;)-Spektrum von TG103-OX.
Fig. 17 zeigt ein Infrarotabsorptionsspektrum (KBr) von TG103-OX.
Fig. 18 zeigt das ¹H NMR (500 MHz; CDCl&sub3;)-Spektrum von CA-H.
Fig. 19 zeigt ein Infrarotabsorptionsspektrum (KBr) von CA-H.
Fig. 20 zeigt das ¹H NMR (500 MHz; CDCl&sub3;)-Spektrum von CA-H-Me.
Fig. 21 zeigt ein Infrarotabsorptionsspektrum (KBr) von CA-H-Me.
Fig. 22 zeigt das ¹H NMR (500 MHz; CDCl&sub3;)-Spektrum und dessen teilweisen Vergrößerungen von TG101-Me.
Fig. 23 zeigt ein Infrarotabsorptionsspektrum (KBr) von TG101-Me.
Fig. 24 zeigt das ¹H NMR (500 MHz; CDCl&sub3;)-Spektrum und dessen teilweisen Vergrößerungen von TG103-Me.
Fig. 25 zeigt ein Infrarotabsorptionsspektrum (KBr) von TG103-Me.
Fig. 26 zeigt das ¹H NMR (500 MHz; CDCl&sub3;)-Spektrum von TG101-POM.
Fig. 27 zeigt ein Infrarotabsorptionsspektrum (KBr) von TG101-POM.
Fig. 28 zeigt das ¹H NMR (500 MHz; CDCl&sub3;)-Spektrum von TG103-POM.
Fig. 29 zeigt ein Infrarotabsorptionsspektrum (KBr) von TG103-POM.
Fig. 30 zeigt das ¹H NMR (500 MHz; CDCl&sub3;)-Spektrum von TG105.
Fig. 31 zeigt ein Infrarotabsorptionsspektrum (KBr) von TG105).

Bevorzugteste Ausführungsformen zur Durchführung der Erfindung

[Verbindungen, isoliert von Roseofomes subflexibilis (Hounen-take)]

< Isolierung von TG101, TG102, TG103 und TG104>

Die Fruchtkörper (60 g) von Hounen-take, die im Oktober 1992 in Aoba-yama in Sendai City, Japan, geerntet wurden, wurden für einen Tag in Aceton (300 ml) getaucht, um den Acetonextrakt zu erhalten; dann wurde der unlösliche Rückstand in Methanol (30 ml) zum Erhalt des Methanolextraktes getaucht. Nach Abdestillation der Lösungsmittel der beiden Extrakte im Vakuum wurde Wasser (25 ml) jedem Rückstand zugesetzt und mit Äthylacetat (50 ml, 2 mal) extrahiert. Nachdem mittels Dünnschichtchromatographie festgestellt wurde, daß beide äthylacetatlöslichen Fraktionen neue Verbindungen enthielten, wurden die Fraktionen vereinigt.
Die äthylacetatlösliche Fraktion (1,52 g) wurde der Silicagel-Säulenchromatograhpie (16 g; 1,5 cm innerer Durchmesser · 20 cm) unterzogen und nach und nach mit gemischten Lösungsmitteln mit Gehalt an n-Hexan/Äthylacetat, Chloroform/Äthylacetat und Chloroform/Methanol eluiert.
Nachdem die mit Chloroform/Methanol (95/5 bis 90/10) eluierten Fraktionen vereinigt und im Vakuum konzentriert waren, wurde der Rückstand (308 mg) weiter mittels Silicagelsäurechromatographie (Eluent, Chloroform/Methanol = 99/1 bis 90/10) fraktioniert; es wurde die Fraktion (149 mg), eluiert mit Chloroform/Methanol (98/2 bis 96/4) erhalten.
Andererseits wurde die Fraktion (161 mg), eluiert mit Chloroform/Methanol (90/10 bis 80/20), in gleicher Weise fraktioniert, und die Fraktion (68 mg), eluiert mit Chloroform/Methanol (95/5 bis 90/10), erhalten.
Die erhaltenen Fraktionen wurden mittels präparativer Dünnschichtchromatographie [auf TLC-Platte Silicagel 60F&sub2;&sub5;&sub4;, 20 cm · 20 cm · 0,5 mm (E. Merck); Eluent, Chloroform/Methanol = 95/5 bis 90/10] gereinigt; es wurden vier Arten neuer farbloser oder schwachgelber sirupartigen Verbindungen erhalten.
Die Ausbeuten an Verbindungen TG101, TG102, TG103 und TG104 betrugen 52,3 mg, 2,8 mg, 31,1 mg bzw. 5,4 mg.
Die Strukturformeln und physicochemischen Eigenschaften der neuen Verbindungen, wie sie vom Hounen-take wie zuvor beschrieben isoliert wurden, sind die folgenden: Strukturformel von TG101
Physicochemische Eigenschaften von TG101 sind
(1) Beschreibung: schwachgelber Sirup,
(2) Spezifische Rotation: [α]D²&sup4; - 20,9 (c = 0,23, Chloroform),
(3) Molekulargewicht: 642,
(4) Molekularformel: C&sub3;&sub7;H&sub5;&sub4;O&sub9;,
(5) EI-Massenspektrum: m/z 642 (M&spplus;),
(6) HREI-Massenspektrum: m/z 642.3748 (M&spplus;: C&sub3;&sub7;H&sub5;&sub4;O&sub9;),
gefunden: 642.3768,
(7) Ultraviolettabsorptionsspektrum (nm) λmax (MeOH) (log ):
201 (4.12), 228 (3.98), 296 (2.96)
(8) Infrarotabsorptionsspektrum (cm&supmin;¹)νmax (CHCl&sub3;):
3600-2400 (br), 2925, 2850, 1750 (sh), 1720, 1680, 1640, 1460, 1440, 1380, 1360, 1300-1200 (br), 1170, 1130
(9) ¹H NMR-Spektrum: abgebildet in Fig. 1 bis 3
(10) ¹³C NMR-Spektrum: abgebildet in Fig. 4,
(11) Löslichkeit: leicht löslich in Methanol, Aceton und Äthylacetat, löslich in Chloroform, und etwas löslich in Wasser
(12) Rf-Werte: Silicagel-Dünnschichtchromatographie auf Kieselgel 60F&sub2;&sub5;&sub4; (Merck)
0.46 (Chloroform/Methanol = 90/10)
0.17 (Chloroform/Äthylacetat/Methanol = 15/15/1)
(13) Farbreaktion: positiv auf Ehrlich's Reagenz (rötlich purpur). Strukturformel von TG102
Physicochemische Eigenschaften von TG102:
(1) Beschreibung: farbloser Sirup,
(2) Molekulargewicht: 642,
(3) Molekularformel: C&sub3;&sub7;H&sub5;&sub4;O&sub9;,
(4) EI-Massenspektrum: m/z 642 (M&spplus;),
(5) ¹H NMR-Spektrum: gemäß Fig. 5 bis 7,
(6) Löslichkeit: leicht löslich in Methanol, Aceton und Äthylacetat, löslich in Chloroform, und etwas löslich in Wasser,
(7) Rf-Werte: Silicagel-Dünnschichtchromatographie auf Kieselgel 60F&sub2;&sub5;&sub4; (Merck),
0.41 (Chloroform/Methanol = 90/10)
0.13 (Chloroform/Äthylacetat/Methanol = 15/5/1),
(8) Farbreaktion: positiv auf Ehrlich's Reagenz (rötlich purpur) Strukturformel von TG103
Physicochemische Eigenschaften von TG103:
(1) Beschreibung: farbloser Sirup,
(2) Spezifische Rotation: [α]D²&sup6; + 10.6º (c = 0,17, Chloroform),
(3) Molekulargewicht: 644,
(4) Molekularformel: C&sub3;&sub7;H&sub5;&sub6;O&sub9;,
(5) FAB-Massenspektrum: m/z 667 [(M + Na)&spplus;],
(6) HREI-Massenspektrum: m/z 626.3838 (M&spplus;-H&sub2;O: C&sub3;&sub7;H&sub5;&sub4;O&sub8;) gefunden 626.3819,
(7) Infrarotabsorptionsspektrum (cm&supmin;¹) νmax (CHCl&sub3;):
3625-2400 (br), 2940, 2860, 1750 (sh), 1730, 1640, 1460, 1440, 1390, 1360, 1320-1400 (br), 1130, 1010
(8) ¹H NMR-Spektrum: gemäß Fig. 8 und 9,
(9) ¹³C NMR-Spektrum: gemäß Fig. 10,
(10) Löslichkeit: leicht löslich in Methanol, Aceton und Äthylacetat, löslich in Chloroform und etwas löslich in Wasser,
(11) Rf-Werte: Silicagel-Dünnschichtchromatographie auf Kieselgel 60F&sub2;&sub5;&sub4; (Merck)
0.29 (Chloroform/Methanol = 90/10),
0.07 (Chloroform/Äthylacetat/Methanol = 15/5/1),
(12) Farbreaktion: positiv auf Ehrlich's Reagenz (rötlich purpur). Strukturformel von TG104
Physicochemische Eigenschaften von TG104:
(1) Beschreibung: farbloser Sirup,
(2) Spezifische Rotation: [α]D²&sup4; + 25.6º (c = 0,36, Chloroform),
(3) Molekulargewicht: 644,
(4) Molekularformel: C&sub3;&sub7;H&sub5;&sub6;O&sub9;,
(5) FAB-Massenspektrum: m/z 667 [(M + Na)&spplus;],
(6) HREI-Massenspektrum: m/z 626.3859 (M&spplus; - H&sub2;O: C&sub3;&sub7;H&sub5;&sub4;O&sub8;), gefunden 626.3819,
(7) Infrarotabsorptionsspektrum (cm&supmin;¹) νmax (CHCl&sub3;)
3625-2400 (br), 2930, 2850, 1740, 1720 (sh), 1640, 1460, 1440, 1390, 1360, 1340-1150 (br), 1130, 1010
(8) ¹H NMR-Spektrum: gemäß Fig. 11 bis 13,
(9) Löslichkeit: leicht löslich in Methanol, Aceton und Äthylacetat, löslich in Chloroform, etwas löslich in Wasser,
(10) Rf-Werte: Silicagel-Dünnschichtchromatographie auf Kieselgel 60F&sub2;&sub5;&sub4; (Merck),
0.24 (Chloroform/Methanol = 90/10)
0.03 (Chloroform/Äthylacetat/Methanol = 15/5/1),
(11) Farbreaktion: positiv auf Ehrlich's Reagenz (rötlich purpur)

Prüfbeispiel

Von den beschriebenen Verbindungen wurden TG101 und TG103 bezüglich ihrer antimikrobiellen Aktivität in vitro gegenüber Candida albicans, Kryptococcus neoformans, Aspergillus nigar und Aspergillus fumigatus als Fungi unter Bestätigung ihrer antifungalen Aktivitäten geprüft. Im folgenden werden Beispiele von antifungalen Prüfverfahren beschrieben.
Bei den Versuchen wurden mikrobielle Standardstämme, bezogen vom Research Center for Eumyceta and Mycosis, Teikyo University, Japan als Testfungi und Yeast Morphology Ager (DIFCO) als Medium für arzneimittelsensitive Versuche verwendet.
Zuerst wurde der jeweilige Fungus auf Kartoffel-Dextrose Agarmedien (Nissui Seiyaku) in geneigter Anordnung geschmiert, über 1 Tag bei 30ºC (im Fall von Candida albicans und Kryptococcus neoformans) oder über 4 Tage (in den Fällen von Aspergillus nigar und Aspergillus fumigatus) inkubiert; dann wurde der Fungus, der auf der Schrägen gewachsen war, mit sterilisierter physiologischer Salzlösung mit Gehalt an 0,1% Tween 80 gewaschen. Der ausgewaschene Fungus wurde durch einen Filter mit 15 um Löchern gegeben und, nachdem die Anzahl Fungus auf der Zellplatte für Blutzellen gezählt war, wurde eine Suspension mit Gehalt an 105 CFU/ml Fungus zur Verwendung als Inokulationslösung hergestellt. Nachdem diese Lösung (0,02 ml) in Yeast Morphology Ager mit Gehalt an einem Arzneimittel in Konzentrationen in serieller Doppelverdünnung inokuliert wurde, wurde entweder 1 Tag oder 4 Tage bei 30ºC kultiviert.
Antifungale Wirkungen wurden mit bloßem Auge bestimmt; die minimale Inhibitorkonzentration (MIC) wurde definiert als die Arzneimittelkonzentration, bei der das fugale Wachstum offensichtlich inhibiert war, im Vergleich zum Vergleichsmedium, das kein Arzneimittel enthielt. Tabelle 1 zeigt die antifungale Aktivität von TG101 und TG103, die wie zuvor beschrieben bestimmt wurde. Tabelle 1

< Isolierung von kryptoporischer Säure A (CA-A)>

Die Fruchtkörper (678 g) von Hounen-take wurden im September 1995 in Makabe-cho, Ibaraki Prefecture, Japan geerntet, bei Zimmertemperatur getrocknet und dann mit einer Mischvorrichtung pulverisiert. Die pulverisierten Fruchtkörper (310 g) wurden durch Eintauchen in Äthylacetat (4 l) bei Zimmertemperatur über einen Tag extrahiert. Die gleiche Extraktion wurde zweimal wiederholt und nach Analyse der Extrakte auf die Ingredienzien mittels Dünnschichtchromatographie vereinigt.
Dann wurde dieser Äthylacetatextrakt (11 g) der Silicagel-Säulenchromatographie (Silicagel 110 g; 4,5 cm ID) unterworfen und mit Chloroform/Äthylacetat und Chloroform/- Methanol eluiert. Von den sechs erhaltenen Fraktionen wurde die Fraktion (4,3 g), die mit Chloroform/Methanol (90/10) eluiert wurde, der Säulenchromatographie auf 10% wasserhaltigem Silicagel (43 g: 3,0 cm ID, Eluierungsmittel: Chloroform/Methanol = 99/1 bis 95/5) unterzogen. Dann wurden die Fraktionen (1,9 g) mit Gehalt an TG101 und TG102 (eluiert mit Chloroform/Methanol = 98/2 bis 97/3) weiter mittels Chromatographie auf einer Sephadex LH-20-Säüle (225 cc: 2,0 cm ID, Eluierungsmittel: Methanol) fraktioniert. Von den erhaltenen Fraktionen wurden jene mit Gehalt an TG101 und TG102 im Vakuum zur Trockne eingeengt; ein Teil (560 mg) des Rückstands wurde wiederholt der Säulenchromatographie (60 cc: 2,0 cm ID, Eluierungsmittel: Wasser/Methanol = 25/75 bis 0/100) auf Cosmosyl 75C&sub1;&sub8;-OPN (Nakalai Tesue, Japan) unterzogen; es wurde kryptoporische Säure A (CA-A, 31,6 mg) als weißes Pulver erhalten.
In Fig. 14 ist ein 500 MHz ¹H NMR-Spektrum (CDCl&sub3;) von CA-A wiedergegeben; dessen Infrarotabsorptionsspektrum (KBr) wird in Fig. 15 wiedergegeben.

[Synthese von Derivaten]

< Synthese des Oxidationsprodukts von TG103 (TG103-OX)>

Zu einer Lösung von TG103 (120 mg: 0,2 mmol) in Aceton (2 ml) wurde eine kleine Menge Celit und dann tropfenweise Jones-Reagenz (100 ul) unter Rühren bei Eistemperatur zugegeben. Nach 30 minutigem Rühren bei gleicher Temperatur wurde der Reaktionsmischung Isopropanol (0,5 ml) zur Zersetzung von überschüssigem Reagenz zugesetzt. Der Reaktionslösung wurde Äther (20 ml) zugesetzt; der gebildete Nieder schlag wurde abfiltriert. Nach Waschen des Filtrats mit Wasser wurde die Ätherschicht über Magnesiumsulfat getrocknet; das Lösungsmittel wurde dann abdestilliert. Die Reinigung des erhaltenen Rückstands mittels Silcagel-Säulenchromatographie (Eluierungsmittel: Chloroform/(Methanol) ergab das Oxidationsderivat (80 mg) als weißes Pulver.
Ein ¹H NMR-Spektrum (500 MHz, CDCl&sub3;) von TG103-OX wird in Fig. 16 wiedergegeben dessen Infrarotabsorptionsspektrum (KBr) in Fig. 17.

< Synthese von kryptoporischer Säure H (CA-H)>

Zu einer Lösung von TG103 (32 mg: 0,05 mmol) in Äthanol (1 ml) wurde eine 1 N Natriumhydroxidlösung (1 ml) zugesetzt; die Mischung wurde dann 3 Stunden am Rückfluß erhitzt. Nach Beendigung der Reaktion wurde die Reaktionslösung mit Wasser (4 ml) verdünnt und mit Äthylacetat (10 ml jeweils) zweimal gewaschen. Dann wurde die wässrige Lösung mit 1 N HCl angesäuert und zweimal mit Äthylacetat (jeweils 10 ml) extrahiert. Die vereinigten Extrakte wurden hintereinander mit Wasser und gesättigter Natriumchloridlösung gewaschen und dann über Magnesiumsulfat getrocknet. Nach Abdestillation des Lösungsmittels wurde der Rückstand mittels ODS-Säulenchromatographie (COSMOSIL 75C&sub1;&sub8; OPN: 2,0 cm ID, Eluierungs mittel: Wasser/Methanol = 30/70 bis 0/100) gereinigt und ergab kryptoporische Säure H (13 mg) als weißes Pulver.
Ein ¹H NMR-Spektrum 500 MHz (CDCl&sub3;) von CA-H wird in Fig. 18 und dessen Infrarotabsorptionsspektrum (KBr) in Fig. 19 wiedergegeben.
Der MIC-Versuch von kryptoporischer Säure H wurde nach der beschriebenen Verfahrensweise durchgeführt. Die Ergebnisse werden in Tabelle 2 wiedergegeben.

Tabelle 2

MIC

Fungusstamm/Arzneimittel Kryptoporische Säure H
Candida albicans TIMM1623 200 ug/ml
Saccharomyces cerevisiae JCM2216 200 ug/ml
Aspergillus fumigatus TIMM0063 200 ug/ml
Aspergillus niger TIMM0113 200 ug/ml <

Synthese des Trimethylesters von kryptoporischer Säure H (CA-H-Me)>

Zu einer Lösung von TG101 (19 mg: 0,05 mmol) in Äthanol (1 ml) wurde eine 1 N Natriumhydroxidlösung (1 ml) zugegeben; die Reaktionslösung wurde 2 Stunden am Rückfluß erhitzt. Nach Beendigung der Reaktion wurde die Reaktionslösung mit Wasser (3 ml) verdünnt und zweimal mit Äthylacetat (jeweils 5 ml) gewaschen. Dann wurde die wässrige Schicht mit 1 N HCl angesäuert und mit Äthylacetat (jeweils 5 ml) zweimal extrahiert. Die vereinigten Extrakte wurden nacheinander mit Wasser und gesättigter Natriumchloridlösung gewaschen. Nach Trocknung über Magnesiumsulfat wurde das Lösungsmittel abdestilliert. Der erhaltene Rückstand wurde in Methanol gelöst und in Äther mit Diazomethan behandelt. Die Lösungsmittel wurden aus der Reaktionslösung abgezogen, und der Rückstand wurde mittels Silicagel-Säulenchromatographie (Eluierungsmittel: n-Hexan/Äthylacetat) gereinigt; es wurde das Trimethylesterderivat von CA-H (CA-H-Me) als weißes Pulver (7 mg) erhalten.
Ein ¹H NMR-Spektrum (500 MHz) (CDCl&sub3;) von CA-H-Me wird in Fig. 20 und dessen Infrarotabsorptionsspektrum (KBr) in Fig. 21 wiedergegeben.

Methylierung von TG101 und TG103>

Zu einer Lösung von TG101 (640 mg: 1 mmol) in Äther/Methanol (4 ml/2 ml) wurde eine 10%ige Lösung von Trimethylsilyldiazomethan in n-Hexan (1,8 ml) tropfenweise unter Rühren bei Eistemperatur zugegeben; die Reaktionslösung wurde bei der gleichen Temperatur 30 Minuten gerührt. Nach Abdestillation des Lösungsmittels wurde der Rückstand mittels Silicagel-Säulenchromatographie (20 g: 2,0 cm ID, Eluierungsmittel: n-Hexan-Äthylacetat) gereinigt; es wurde das Methylesterderivat von TG101 (537 mg) als weißes Pulver erhalten.
Ein ¹H NMR-Spektrum 500 MHz (CDCl&sub3;) von TG101-Me wird in Fig. 22 und dessen Infrarotabsorptionsspektrum in Fig. 23 wiedergegeben.
Andererseits wurde im Fall von TG101 die Methylierung durchgeführt, indem eine 10%ige Lösung von Trimethylsilyldiazomethan in n-Hexan (0,6 ml) einer Lösung von TG103 (236 mg; 0,37 mmol) in Äther/Methanol (2 ml/2 ml) zugegeben wurde. Das Reaktionsprodukt wurde mittels Silicagel-Säulenchromatographie (Silicagel 5 g: 1,5 cm ID, Eluierungsmittel: n- Hexan/Äthylacetat) gereinigt; es wurde das Methylesterderivat von TG103 (TG103-Me, 220 mg) als weißes Pulver erhalten.
Ein 500 MHz ¹H NMR-Spektrum (CDCl&sub3;) von TG103-Me wird in Fig. 24 und dessen Infrarotabsorptionsspektrum (KBr) in Fig. 25 wiedergegeben.

< Pivaloyloxymethylierung von TG101 und TG103>

TG101 (96 mg: 0,15 mmol) wurden in Dichlormethan (1 ml) gelöst; dann wurden Pivaloyloxymethylchlorid (43 ul: 0,3 mmol) und Diisopropyläthylamin (53 ul: 0,3 mmol) unter Rühren bei Eistemperatur zugesetzt; dann wurde die Reaktionsmischung über 48 Stunden bei Zimmertemperatur gerührt. Nach Zugabe von Wasser (10 ml) wurde die Reaktionsmischung zweimal mit Äthylacetat extrahiert. Die vereinigten Extrakte wurden nacheinander mit 1 N Salzsäure, gesättigter Natriumbicarbonatlösung und gesättigter Natriumchloridlösung gewaschen und dann über Magnesiumsulfat getrocknet. Nach Abdestillation des Lösungsmittels unter Vakuum wurde der Rückstand mittels Silicagel-Säulenchromatographie (Silicagel 6 g: 1,0 cm ID, Eluierungsmittel: Chloroform/Äthylacetat) gereinigt; es wurde das Pivaloyloxymethylesterderivat von TG101 (TG101-POM, 40 mg) als weißes Pulver zusammen mit unumgesetztem Ausgangsmaterial (17 mg) erhalten.
Ein 500 MHz ¹H NMR-Spektrum (CDCl&sub3;) von TG101-POM wird in Fig. 26 und dessen Infrarotabsorptionsspektrum (KBr) in Fig. 27 wiedergegeben.
Andererseits wurden im Fall von TG101 Pivaloyloxymethylchlorid (70 ul: 0,48 mmol) und Diisopropylamin (84 uml: 0,48 mmol) zu einer Lösung von TG103 (128 mg: 0,2 mmol) in Dichlormethan (1 ml) zugesetzt. Nach Beendigung der Reaktion wurde die Reaktionsmischung in gleicher Weise wie im Fall von TG101 behandelt; das Produkt wurde dann mittels Silicagel-Säulenchromatographie (Silicagel 5 g; 1,0 cm ID; Eluierungsmittel: Chloroform/Äthylacetat) gereinigt; es wurde das pivaloyloxymethylierte Derivat von TG103 (TG103-POM, 48 mg) als weißes Pulver zusammen mit nicht umgesetztem Ausgangsmaterial (19 mg) erhalten.
Ein 500 MHz ¹H NMR-Spektrum (CDCl&sub3;) von TG103-POM wird in Fig. 28 und dessen Infrarotabsorptionsspektrum (KBr) in Fig. 29 wiedergegeben.

Synthese von TG105)

Zu einer Lösung von TG101 (13 mg: 0,02 mmol) in Methanol (1 ml) wurde Cer(III)chloridheptahydrat (7,5 mg: 0,02 ml) zugesetzt; die Reaktionslösung wurde 20 Minuten bei Zimmertemperatur gerührt. Nach Beendigung der Reaktion wurde das Lösungsmittel abdestilliert; der Rückstand wurde mittels Silicagel-Säulenchromatographie (Eluierungsmittel: Chloroform/Methanol) gereinigt es wurde TG105 (13 mg) als weißes Pulver erhalten.
Ein 500 MHz ¹H NMR-Spektrum (CDCl&sub3;) von TG105 wird in Fig. 30 und dessen Infrarotabsorptionsspektrum (KBr) in Fig. 31 wiedergegeben.

Industrielle Anwendbarkeit

Die neuen erfindungsgemäßen Sesquiterpenverbindungen besitzen antifungale Wirkung gegenüber Eumycetes wie Candida albicans und sind geeignete Wirkstoffe in antifungalen (Arznei-)mitteln.

Claims

1. Sesquiterpenverbindungen gemäß folgender Strukturformel I:

in der eine der beiden R¹-Gruppen -COOR³ und die andere eine der Gruppen gemäß folgenden Formeln sind, wobei R² und R³ unabhängig voneinander Wasserstoff, Alkyl oder Acyloxyalkyl und R&sup4; Hydroxyl oder Alkoxy sind:

2. Sesquiterpenverbindungen nach Anspruch 1, wobei R² bzw. R³ unabhängig voneinander Methyl sind.

3. Sesquiterpenverbindungen nach Anspruch 1, wobei R² und/oder R³ t-Butylcarbonyloxymethyl sind.

4. Sesquiterpenverbindungen nach Anspruch 1, wobei R&sup4; Hydroxyl oder Methoxy ist.

5. Verwendung der Verbindungen der folgenden Strukturformel II:

in der R¹ -COOR² (wobei R² Wasserstoff, Alkyl oder Alcyloxyalkyl ist), oder eine der Gruppen gemäß der folgenden Strukturformeln (wobei R³ Hydroxyl oder Alkoxy ist) als antimikrobielles Mittel:

6. Verwendung von Verbindungen gemäß folgender Strukturformel III:

in der eine der beiden R¹-Gruppen -COOR³ und die andere -COOH oder eine der Gruppen gemäß folgenden Strukturformeln sind, wobei R² bzw. R³ unabhängig voneinander Wasserstoff, Alkyl oder Acyloxyalkyl oder beide Wasserstoff sind, wenn die verbleibende R¹-Gruppe -COOH ist, und R&sup4; Hydroxyl oder Alkoxyl ist, als antimikrobielles Mittel: