DE69719019T2

DE69719019T2 - Antibiotischer cocktail und verwendungsverfahren

Info

Publication number: DE69719019T2
Application number: DE69719019T
Authority: DE
Inventors: Chigoke Adoma; G. Brockbank; E. Dawson; Steven Goldstein; K. Sheldon
Original assignee: Cryolife Inc
Current assignee: Artivion Inc
Priority date: 1996-03-29
Filing date: 1997-03-24
Publication date: 2003-12-11
Anticipated expiration: 2017-03-25
Also published as: CA2250036A1; EP0889690A1; AR002228A1; JP2000507953A; DK0889690T3; EP0889690A4; EP0889690B1; WO1997036479A1; BR9708306A; DE69719019D1; AU2541897A; IL126123A; ATE232360T1; CN1219103A; CA2250036C; ES2192676T3; IL126123A0; US5741782A; AU708060B2

Description

Fachgebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Dekontaminieren eines Gewebes, wie Herzklappen, für die Transplantation, während die Lebensfähigkeit des Gewebes aufrechterhalten wird. Außerdem betrifft die Erfindung einen antibiotischen Cocktail, der in dem Verfahren verwendet wird.

Stand der Technik

Die klinische Leistung von allogenen Herzklappen-Transplantafen war von der Lebensfähigkeit der Klappensegel-Fibroblasten bei der Transplantation abhängig. Vgl. O'Brien et al., J. Card. Surg. 2 (Suppl.), 153-167 (1987), und Sark, J. Thoracic Cardiovasc. Surg. 97, 1-9 (1989). Deshalb müssen während der gesamten Bearbeitungsprozedur die höchsten Lebensfähigkeits-Standards aufrechterhalten werden, wobei diese Prozedur das Beschaffen, den Transport, das Dekontaminieren, Einfrieren, Lagern, Auftauen und die Transplantation umfasst.
Antibiotische Cocktails sind für den Schritt zum Dekontaminieren bekannt, mit denen ein Gewebe mikrobiell dekontaminiert werden kann. Insbesondere sind verschiedene antibiotische Cocktails bekannt, die mehrere antibakterielle Mittel und ein einziges antimykotisches Mittel enthalten (Amphotericin B oder gelegentlich Nystatin). Vgl. z. B. Watts et al., Ann. Thorac. Surg. 21, 230-236 (1976); Strickett et al., Pathology 15, 457- 462 (1983); Armiger et al., Pathology 15, 67-73 (1983); Kirkllin und Barratt-Boyes, Cardiac Surgery 421-422 (1986); Heacox et al., in: Cardiac Valve Allografts 1962-1987, 37- 42, (Yankeh et al., Hrsg., 1988); Angell et al., J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 98, 48-56 (1989); Lange und Hopkins, in: Cardiac Reconstruction With Allograft Heart Valves, 37- 63, (Hopkins, Hrsg., 1989); US-Patent Nr. 4 890 457; US-Patent Nr. 4 695 536; und PCT-Anmeldung WO 92/12632.
Amphotericin B wird als das wirksamste antimykotische Mittel angesehen, das verfügbar ist. Jedoch wurde gefunden, dass Amphotericin B für die Zeilen toxisch ist, die für eine lange Lebensdauer des allogenen Transplantats in den Patienten verantwortlich sind, weshalb es aus einigen Lösungen zum Dekontaminieren von Herzklappen entfernt wurde. Vgl. Hu et al., Cardiovasc. Res. 23, 960-964 (1989); Lange und Hopkins, in: Cardiac Reconstruction With Allograft Heart Valves, 37-63, (Hopkins, Hrsg., 1989); McNally und Brockbank, J. Med. Engineer. F~ Tech. 16, 34-38 (1992). Dies hat zur Folge, dass eine Verunreinigung mit Hefen zurzeit in einer signifikanten Zahl von Fällen die Ursache für die Abstoßung von Herzklappen ist. Vgl. McNally und Brockbank, J. Med. Engineer. & Tech. 16, 34-38 (1992).

Zusammenfassung der Erfindung

Die Erfindung stellt einen antibiotischen Cocktail zum Dekontaminieren von Gewebe bereit. Der Cocktail umfasst: 1) Amphotericin B und Fluconazol als antimykotische Mittel; und 2) mehrere antibakterielle Mittel. Die Mittel liegen in dem Cocktail in Mengen vor, die bewirken, dass das Wachstum sowohl von Hefen als auch von Bakterien im Wesentlichen gehemmt wird, während die Lebensfähigkeit des Gewebes im Wesentlichen aufrechterhalten wird.
Außerdem stellt die Erfindung ein Verfahren zum Dekontaminieren eines Gewebes bereit, welches das Inkontaktbringen des Gewebes mit einem antibiotischen Cocktail gemäß der Erfindung umfasst. Das Gewebe wird mit dem antibiotischen Cocktail bei einer Temperatur und während eines Zeitraums in Kontakt gebracht, die bewirken, dass das Wachstum von Hefen und von Bakterien im Wesentlichen gehemmt wird, während die Lebensfähigkeit des Gewebes im Wesentlichen aufrechterhalten wird.
Ein Ergebnis der Verwendung der erfindungsgemäßen antibiotischen Cocktails besteht darin, dass viele Gewebe, die früher aufgrund einer Verunreinigung durch Hefen oder Bakterien verworfen wurden, jetzt für eine Transplantation eingesetzt werden können. Dies ist eine signifikante Errungenschaft, wenn man bedenkt, dass immer Mangel an Gewebe herrscht, das für eine Transplantation zur Verfügung steht.

Genaue Beschreibung der Erfindung

"Mengen, die bewirken" soll bedeuten, das jedes der Mittel in einer ausreichenden Konzentration vorliegt, so dass der Cocktail das Wachstum von Hefen und Bakterien im Wesentlichen hemmt, jedoch die Lebensfähigkeit des Gewebes, das dekontaminiert wird, im Wesentlichen nicht verringert. Diese Mengen können durch einen Dosis- Antwort-Test ermittelt werden, wie er dem Fachmann bekannt ist, wobei herkömmliche mikrobiologische Tests und Lebensfähigkeits-Tests wie die nachstehend beschriebenen eingesetzt werden. Vorzugsweise liegen die Mitteil in dem Cocktail in Mengen vor, die diejenigen Hefen und Bakterien abtöten, die häufig aus Gewebe isoliert werden.
"Im Wesentlichen hemmen" bedeutet, dass der Cocktail das Wachstum von Hefen und Bakterien in mindestens 90%, vorzugsweise mindestens 95%, am stärksten bevorzugt mindestens 99% der Gewebe, die mit dem Cocktail dekontaminiert werden, vollständig hemmt. "Das Wachstum von Hefen und Bakterien vollständig hemmen" bedeutet, dass durch herkömmliche mikrobiologische Tests kein Wachstum von Hefen und Bakterien nachweisbar ist, nachdem das Gewebe mit dem Cocktail behandelt wurde.
Die Lebensfähigkeit kann durch verschiedene Verfahren gemessen werden.
Vorzugsweise wird das Gewebe jedoch mit einer radioaktiv markierten Aminosäure inkubiert, und der Einbau der Aminosäure in Proteine wird überwacht, indem die Zerfälle pro Minute (dpm) pro Gewebeeinheit gezählt werden. "Im Wesentlichen Aufrechterhalten der Lebensfähigkeit" ist deshalb so definiert, dass das Gewebe, das mit dem Cocktail behandelt wurde, mindestens etwa 85% der dpm pro Gewebeeinheit einbaut, die ein Gewebe einbaut, das nicht mit dem Cocktail behandelt wurde.
Die antimykotischen Mittei, die in den Cocktails der Erfindung eingesetzt werden, sind Amphotericin B und Fluconazol. Die Verwendung dieser zwei antimykotischen Mittel in Kombination hemmt das Wachstum von Hefen im Wesentlichen, während die Lebensfähigkeit des Gewebes, das mit den Mitteln behandelt wird, im Wesentlichen aufrechterhalten wird. Dieses Ergebnis ist hinsichtlich der berichteten Toxizität von Amphotericin B gegenüber Gewebe sehr erstaunlich (vgl. den vorstehenden Abschnitt Stand der Technik).
Geeignete Konzentrationen von Amphotericin B und Fluconazol können durch einen Dosis-Antwort-Test ermittelt werden, wie er dem Fachmann bekannt ist, wobei herkömmliche mikrobiologische Tests und Lebensfähikgkeits-Tests wie die nachstehend beschriebenen eingesetzt werden. Weder Amphotericin B noch Fluconazol hemmt alleine im Wesentlichen das Wachstum von Hefen in den Dosen, bei denen die Lebensfähigkeit des Gewebes im Wesentlichen aufrechterhalten wird, jedoch tut dies die Kombination dieser zwei antimykotischen Mittel. Dabei wurde gefunden, dass die Kombination von Amphotericin B und Fluconazol eine nicht zu erwartende synergistische, gegen Hefen gerichtete Aktivität besitzt (vgl. die Beispiele 14 und 15).
Eine Konzentration von etwa 0,3 ug/ml bis etwa 2,0 ug/ml Amphotericin B ist für die Verwendung in antibiotischen Cocktails zum Sterilisieren von Herzklappen bevorzugt. Eine Konzentration von Fluconazol von etwa 50 ug/ml bis etwa 100 ug/ml ist für die Verwendung in antibiotischen Cocktails zum Sterilisieren von Herzklappen bevorzugt.
Die antibakteriellen Mittel, die zum Durchführen der Erfindung eingesetzt werden können, sind so ausgewählt, dass die Kombination der antibakteriellen Mittel gegen ein großes Spektrum von Bakterien wirksam ist, einschließlich gramnegativer, grampositiver, aerober und anaerober Bakterien. Außerdem sind die antibakteriellen Mittel so ausgewählt, dass die Kombination der Mittel gegen solche Bakterien wirksam ist, die häufig als Verunreinigung des Gewebes gefunden werden, das behandelt wird. Viele solche Bakterien sind bekannt (z. B. Staphylokokken, Streptokokken und Propionibakterien), und andere können durch herkömmliche mikrobiologische Tests identifiziert werden (vgl. z. B. das nachstehende Beispiel 19). Somit sind antibakterielle Mittel mit einem breiten Spektrum aus zwei oder mehr Familien bevorzugt. Schließlich darf die Kombination der antibakteriellen Mittel die Lebensfähigkeit des Gewebes, das behandelt wird, im Wesentlichen nicht herabsetzen:
Vorzugsweise sind die mehreren antibakteriellen Mitteln aus den folgenden Familien ausgewählt: Cephalosporine, Glykopeptide, Aminoglykoside, Lincosamide, Betalactame und Rifamycine. Stärker bevorzugt umfasst die Kombination von antibakteriellen Mitteln Vancomycin und Imipenem, und am stärksten bevorzugt Vancomycin, Imipenem und Netilmicin. Zum Dekontaminieren von Herzklappen ist eine Kombination von 50 ug/ml Vancomycin, etwa 10 bis 100 ug/ml Ilmipenem und etwa 20 bis 50 ug/ml Netilmicin bevorzugt.
Imipenem ist ein Betalactam-Antibiotikum. Es ist wirksam gegen die meisten aeroben grampositiven und gramnegativen Bakterien und gegen die meisten anaeroben grampositiven und gramnegativen Bakterien.
Vancomycin ist ein trizyklisches Glykopeptid. Es ist wirksam gegen viele grampositive Organismen, einschließlich Staphylokokken, Streptokokken, Enterokokken, Clostridium und Corynebacterium. Gegen gramnegative Bakterien ist es nicht wirksam.
Netilmicin gehört zur Familie der Aminoglykoside und ist wirksam gegen viele aerobe gramnegative Bakterien und einige aerobe drampositive Bakterien. Netilmicin ist nicht wirksam gegen die meisten Streptokokken und die meisten anaeroben Bakterien.
Die Konzentrationen der antibakteriellen Mittel sind so ausgewählt, dass sie mindestens das Vier- bis Achtfache der minimalen Hemmkonzentrationen für die Zielbakterien betragen, die durch herkömmliche mikrobiologische Empfindlichkeits-Tests bestimmt wurden. Innerhalb dieser Parameter können die Konzentrationen der antibakteriellen Mittel anhand der Dosis-Antwort-Tests an Gewebe unter Verwendung herkömmlicher mikrobiologischer Tests und Lebensfähigkeits-Tests wie nachstehend beschrieben eingestellt werden.
Aus dem Vorstehenden ist zu ersehen, dass bevorzugte antibiotische Cocktails gemäß der Erfindung Amphotericin B, Fluconazol, Vancomycin, Imipenem und Netilmicin enthalten. Zum Sterilisieren von Herzklappen sind antibiotische Cocktails bevorzugt, die etwa 0,3 bis 1,0 ug/ml Amphotericin B, etwa 50 bis 100 ug/ml Fluconazol, etwa 50 ug/ml Vancomycin, etwa 10 bis 100 ug/ml Imipenem und etwa 20 bis 50 ug/ml Netilmicin enthalten. Stärker bevorzugt ist der folgende Cocktail:
1,0 ug/ml Amphotericin B,
100 ug/ml Fluconazol,
50 ug/ml Vancomycin,
96 ug/ml Imipenem und
50 ug/ml Netilmicin.
Die Erfindung stellt auch ein Verfahren zum Sterilisieren eines Gewebes bereit, welches das Inkontaktbringen des Gewebes mit einem antibiotischen Cocktail gemäß der Erfindung umfasst. Auf diese Weise können dlie verschiedensten Gewebe dekontaminiert werden, einschließlich Herzklappen, Perikard, Gefäße und Muskel-Skelett- Bindegewebe. In der Verwendung hier umfasst der Begriff "Muskel-Skelett-Bindegewebe" Gewebe, wie Sehnen, Bänder und Menisken, und schließt Gewebe wie Knochen aus.
Das Gewebe wird mit dem antibiotischen Cocktail bei einer Temperatur und während eines Zeitraums in Kontakt gebracht, die bewirken, dass das Wachstum von Hefen und von Bakterien im Wesentlichen gehemmt wird, während die Lebensfähigkeit des Gewebes im Wesentlichen aufrechterhalten wird. Solche Zeiträume und Temperaturen können empirisch bestimmt werden, wie dem Fachmann bekannt ist. Es wurde gefunden, dass Herzklappen wirksam dekontaminiert werden können, indem sie in einem antibiotischen Cocktail gemäß der Erfindung 24 bis 48 Stunden bei einer Temperatur von 35 bis 39ºC inkubiert werden.

Beispiele

Beispiel 1

Dieses Beispiel beschreibt das Testen von vier antibiotischen Cocktails an Herzklappengewebe.

A. Beschaffen und Zubereiten der Herzklaapen

Herzklappen, die als ungeeignet für eine allogene Transplantation befunden wurden, wurden für die Verwendung in den Experimenten zugeteilt, nachdem die informierte Einwilligung der Organspendeorganisation vorlag; die für die Verhandlungen mit der Familie des Spenders verantwortlich ist. Die Herzklappen wurden wie im US-Patent Nr. 4 890 457 beschrieben seziert.

B. Sterilisieren

Die Klappensegel wurden halbiert und jede Hälfte in 4 ml Dulbeccos modifiziertem Eagle Medium (DMEM) (GIBCO) inkubiert, das mit 25 mM 4-(2-Hydroxyethyl)-1- piperazinethansulfonsäure (HEPES) gepuffert war und 10% fetales Rinderserum enthielt (nachstehend als "Lösung B" bezeichnet) und das außerdem Antibiotika der Typen und in den Konzentrationen wie nachstehend angegeben aufwies. Die Antibiotika umfassten zwei Kombinationen von antibakteriellen Mitteln, die mit Cocktail B und Cocktail C bezeichnet wurden und die folgende Formulierungen aufwiesen:

Cocktail B: 62 ug/ml Rifampin

57 ug/ml Netilmicin
114 ug/ml Vancomycin
136 ug/ml Cefotaxim
136 ug/ml Lincomycin;

Cocktail C: 12 ug/ml Imipenem

50 ug/ml Vancomycin.
Zusätzlich wurden zwei weitere Cocktails getestet. Diese Cocktails waren die gleichen wie die Cocktails B und C, außer dass sie noch 100 ug/ml Fluconazol enthielten.
Um eine Vorratslösung von Rifampin herzustellen, wurden 600 mg steriles Rifampin in 10 ml sterilem Wasser gelöst. Rifampin wurde von Merrell Dow bezogen (Markenname RIFADIN).
Eine Lösung von 100 mg/ml Netilmicinsulfat, bezogen von Schering-Plough (Markenname NETROMYCIN), wurde als Vorratslösung dieses Antibiotikums verwendet.
Eine Vorratslösung von Vancomycin wurde hergestelltt, indem 500 mg steriles Vancomycin-Hydrochlorid in 10 ml sterilem Wasser gelöst wurden. Vancomycin- Hydrochlorid wurde von Eli Lilly & Co. bezogen (Markenname VANCOCIN HCl).
Eine Cefotaxim-Vorratslösung wurde hergestellt, indem 2,0 g steriles Natriumcefotaxim in 3 ml sterilem Wasser gelöst wurden. Natriumcefotaxim wurde von Hoechst-Roussel bezogen (Markenname CLAFORAN).
Eine Lösung von 300 mg/ml Lincomycin-Hydrochlorid, erhalten von Upjohn (Markenname LINCOCIN), wurde als Vorratslösung dieses Antibiotikums verwendet.
Eine Vorratslösung von Imipenem wurde hergestellt, indem 20 ml sterile Kochsalzlösung zu einer 250-mg-Flasche Imipenem zugefügt wurde, das von Merck & Co. bezogen wurde (Markenname PRIMAXIN).
Schließlich wurde eine Lösung von 2 mg/rnl Fluconazol, bezogen von Pfizer Roerig (Markenname DIFLUCAN), als Vorratslösung verwendet.
Eine geeignete Menge von jeder Vorratslösung wurde zu Lösung B zugefügt, so dass die Endkonzentrationen erhalten wurden, die in den Cocktails B und C und in den Cocktails B und C plus Fluconazol verwendet wurden.
Experiment 1: Paarweise Hälften von Klappensedeln wurden entweder mit Cocktail B oder mit Cocktail B plus Fluconazol behandelt. Genauso wurden paarweise Hälften von Klappensegeln entweder mit Cocktail C oder mit Cocktail C plus Fluconazol behandelt. Alle I< lappensegelhälften wurden 48 Stunden bei 37ºC in den antibiotischen Cocktails inkubiert und danach gefrierkonserviert.
Experiment 2: Wieder wurden paarweise Hälften von Klappensegeln verwendet. Die eine Hälfte wurde als frische Kontrolle eingesetzt und unmittelbar mit ³H-Glycin markiert, wodurch die Lebensfähigkeit der Klappensegel-Fibroblasten bestimmt wurde (vgl. nachstehend). Die andere Hälfte jedes Klappensegels wurde in Cocktail B oder in Cocktail B plus Fluconazol inkubiert. Genauso wurde die eine Hälfte eines anderen Paars als frische Kontrolle eingesetzt und die andere Hälfte in Cocktail C oder in Cocktail C plus Fluconazol inkubiert. Die mit Antibiotika behandelten Klappensegel wurden 48 Stunden bei 37ºC in den antibiotischen Cocktails inkubiert und danach gefrierkonserviert.

B. Gefrierkonservieren

Nachdem die Behandlungen mit den antibiotischen Cocktails abgeschlossen waren, wurden die Klappensegelhälften verpackt, gefrierkonserviert und gelagert, wie im US-Patent Nr. 4 890 457 beschrieben, wobei das Programm zum Einfrieren so modifiziert wurde, dass die einzelnen Klappensegelhälften mit einer Kühlrate von ~ -1ºC pro Minuten in ~1,6 ml Gefrierschutzlösung konserviert werden konnten. Ein 1,8-ml- Nalge-Gefrierfläschchen wurde eingesetzt, in dem das Klappensegelgewebe enthalten war. Anhand des Einfrierprogramms wird das Gewebe in etwa 80 bis 90 Minuten von +4ºC auf -80ºC gebracht.

C. Lagern

Die Klappensegelhälften wurden mindestens zwei Tage, jedoch nicht länger als drei Wochen in flüssigem Stickstoff gelagert, bevor sie aufgetaut wurden.

D. Auftauen

Die Klappensegelhälften wurden aufgetaut, indem das Klappensegelgewebe, das aufgetaut werden sollte, aus dem flüssigen Stickstoff entnommen wurde. So schnell wie möglich wurde das Gewebe in ein 37ºC-Wasserbad überführt. Sobald sich das gesamte Eis aufgelöst hatte (nach etwa zwei Minuten), wurde das Gefrierfläschchen in einen Abzug gestellt, sodann wurden für jedes aufctetaute Gefierfläschchen 4 ml einer auf Raumtemperatur gebrachten laktatierten Ringen-Lösung plus 5% Dextrose (DSLR) in ein 5-mi-Röhrchen mit Schnappverschluss (Falcon) gefüllt. Das Gefrierfläschchen wurde außen mit 70% Isopropanol abgespült und vor dem Öffnen abgetrocknet. Mit Hilfe einer sterilen Pinzette wurde das Klappensegelgewebe in das Röhrchen überführt, das die D5LR-Lösung enthielt. Das Gewebe wurde fünf Minuten in D5LR belassen.

E. Test der Lebensfähigkeit

Die Lebensfähigkeit des Gewebes wurde festgestellt, indem der Einbau von ³H- Glycin in die Proteine wie folgt gemessen wurde. Die aufgetauten Klappensegelhälften wurden in Röhrchen mit Schnappverschluss (Falcon) gegeben, die 16 uCi tritiiertes Glycin (DuPont New England Nuclear) in 1 ml DMEM, angereichert mit 15 ug/ml Ascorbinsäure, enthielten. Der Einbau des radiomarkierten Glycins wurde nach einer Inkubation von 48 Stunden bei 37ºC in einer Atmosphäre bestimmt, die aus 5% Kohlendioxid in Luft bestand. Anschließend wurde das Gewebe viermal mit Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung gewaschen, mit Ethanol und Ether entwässert, luftgetrocknet und gewogen. Danach wurden die Gewebeproben mit 200 ul Wasser wieder hydratisiert und durch Zugabe von 500 ul 1 M NaOH solubilisiert. Nach Inkubation von einer Stunde bei 60ºC wurden die Proben zweimal 20 Sekunden beschallt. Die Homogenisate wurden bei 12 000 · g zentrifugiert und 100-ul-Aliquots der Überstände auf Glasfaser- Filterscheibchen aufgetragen (Whatman Nr. 1822024; Whatman Chemical Separation Inc., Clifton, N. J.). Die Filterscheibchen wurden getrocknet und die Proteine durch Zugabe von eiskalter 10% Trichloressigsäure in 30 Minuten ausgefällt. Anschließend wurden die Scheibchen fünfmal mit Ethanol und zweimal mit Ether gespült und sodann getrocknet. Danach wurden die Scheiben in 10 ml Szintillationsflüssigkeit gegeben (Cytoscint Es, ICN Biomedicals, Inc., Irvine, CA). Ger Einbau von Tritium wurde durch Szintillationszählung unter Verwendung eines Zählers LS1701 gemessen (Beckman Instruments, Inc., Palo Alto, CA).
In Experiment 1 wurde die Lebensfähigkeit auch getestet, indem einige der Klappensegelhälften für die Autoradiographie mit ³H-Hypoxanthin markiert wurden. Hierfür wurde eine Lösung hergestellt, die 15 uCl/ml ³H-Hypoxanthin (DuPont/NEN) in serumfreiem Medium (DMEM) enthielt, enthaltend 5 mg/100 ml Gentamicin (Sigma) und 15 mg/100 ml Ascorbinsäure (Sigma). Jede Klappensegelhälfte wurde in ein steriles 5-ml-Röhrchen mit Schnappverschluss gegeben. Mit einer Mikropipette wurden 0,75 ml der ³H-Hypoxanthin-Lösung zu dem Gewebe in dem Röhrchen zugegeben. Die Röhrchen wurden 48 Stunden bei 37ºC mit 5% CO&sub2; inkubiert. Danach wurde das tritiierte Medium abgegossen und das Gewebe zweimal mit 3 bis 4 ml PBS (GIBCO) gewaschen. Weitere 3 bis 4 ml PBS wurden zugefügt und die Röhrchen 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert, danach wurde die Flüssigkeit entfernt. Anschließend wurden zu jedem Röhrchen 3 bis 4 ml PBS zugegeben und die Röhrchen 18 bis 72 Stunden bei 4ºC inkubiert. Die PBS wurde dekantiert und das Gewebe in ein 7-ml-Szintillationsfläschchen aus Glas überführt. Das Fläschchen wurde mit 10% neutralem gepuffertem Formalin (Fisher) gefüllt, verschlossen und bei Raumtemperatur gelagert, bis die Probe durch eine Autoradiographie analysiert wurde, die wie nachstehend durchgeführt wurde.
Das Gewebe wurde in 15% Saccharose in 0,1 M Natriumphosphatpuffer, pH 7,4, zwei Stunden bis über Nacht eingeweicht. Die Lösung lag zuerst bei Raumtemperatur vor und wurde dann auf 4ºC abgekühlt. Das Gewebe wurde zerkleinert, in einer Form aus Kunststoff mit OCT eingebettet und danach in flüssigem Stickstoff eingefroren. Auf einem Kryostaten wurden gefrorene Schnitte mit 6 um geschnitten und auf Chromalaun-beschichtete Objektträger aufgelegt (die Objektträger wurden zweimal in eine 37ºC-Lösung eingetaucht, die 3,0 g eines Gelatineblocks 275 und 0,3 g Chromkaliumsulfat in 1000 ml destilliertem Wasser enthielt). Die Objektträger wurden in einem Ofen bei 37ºC über Nacht bis 48 Stunden getrocknet und das OCT aus den Schnitten entfernt. Danach wurden die Schnitte in Ethanol von 95%, 75% bis hinunter zu 50% hydratisiert. Die Objektträger wurden zehn Minuten in 50% Ethanol belassen und danach 30 Sekunden in destilliertem Wasser gespült. Die Schnitte wurden durch Entwässerung in Ethanol zu Xylol entfettet. Danach wurden die Schnitte in den gleichen Ethanollösungen bis hinunter zu doppelt destilliertem Wasser hydratisiert. Die Schnitte wurden zum Trocknen in einen Ofen bei 37ºC gelegt (eine Stunde bis über Nacht). Liquid Emulsion Kodak NTB2 wurde in einem 40ºC-Wasserbad 30 Minuten geschmolzen und dann 1 : 1 mit destilliertem Wasser verdünnt. Die Objektträger wurden jeweils einzeln langsam zweimal in diese verdünnte Emulsion eingetaucht (sechs Sekunden) und eine Stunde, oder bis sie trocken waren, stehen gelassen. Die Gefäße wurden dicht verschlossen und in einem Trockenmittel in einem Kühlraum (4ºC) aufbewahrt, bis die Objektträger entwickelt wurden.
Wenn die Objektträger entwickelt werden sollten, ließ man sie zuerst auf 14ºC erwärmen, während sie noch dicht verschlossen blieben (etwa elf Minuten bei Raumtemperatur). Hierdurch kann vermieden werden, dass auf den Objektträgern eine Kondensation entsteht, durch die die Signale abgeschwächt werden. Alle Schritte wurden bei einer Temperatur von 14ºC durchgeführt. Die Objektträger wurden in einen Glas- Objektträger-Ständer gestellt und unmittelbar danach 2,5 Minuten in einem D-19- Entwickler entwickelt (Kodak Katalog-Nr. 146 4593). Danach wurden die Objektträger 30 Sekunden in destilliertem Wasser gespült und anschließend fünf Minuten in Kodak- Fixierer fixiert (Polymax T Fixer, Katalog-Nr. 829 5321). Die Objektträger wurden unter fließendem Leitungswasser bei 14ºC gespült und die Temperatur des Wassers langsam, für zehn Minuten, auf Raumtemperatur von 21ºC erwärmt. Schließlich wurden die Objektträger mit Harris Hematoxylin (Sigma, Kat.-Nr. HHS-32) und Eosin Y, alkoholische Lösung (Sigma, Kat.-Nr. HT 110-1-32), gegengefärbt.
Die Ergebnisse sind in den folgenden Tabellen dargestellt. Der Einbau von ³H- Glycin in die Proteine ist als Zerfälle pro Minute (dpm) pro mg Trockengewebe angegeben. Die Ergebnisse der Autoradiographie sind als Prozentsatz der lebenden Zellen, gezählt pro Gesamtzahl der gezählten Zellen, angegeben. Experiment 1 Experiment 2 (dpm/mg)
*Prozent d. frischen Gew.
Experiment 1: Die Ergebnisse zeigen, dass die Behandlung mit Cocktail C, der Fluconazol enthielt, ein Herzklappengewebe hervorbrachte, das mindestens so lebensfähig war wie das nach der Behandlung mit Cocktail C ohne Fluconazol. Die ist in den Szintillationsergebnissen und in der Autoradiogralhie zu sehen. Auch der Cocktail B, der Fluconazol enthält, ist im Wesentlichen gleichwertig wie der Cocktail B ohne Fluconazol. Mit Cocktail B ist das Gewebe jedoch von Anfang an weniger lebensfähig.
Experiment 2: Im Durchschnitt ergab der Fluconazol-enthaltende Cocktail B Ergebnisse, die 84% von denjenigen entsprachen, die mit dem Cocktail B ohne Fluconazol erhalten wurden. Im Durchschnitt ergab der Fluconazol-enthaltende Cocktail C Ergebnisse, die 116% von denjenigen des Cocktail C ohne Fluconazol entsprachen. Wenn man die antibiotischen Behandlungen mit den Werten des frischen Gewebes vergleicht, sind sie alle höher als beim frischen Gewebe.
Aus den Ergebnissen der Experimente 1 und 2 kann gefolgert werden, dass die Zugabe von 100 ug/ml Fluconazol zu Cocktail B oder Cocktail C das Gewebe nicht schädigt.

Beispiel 2

Cocktails, die die folgenden Antibiotika in den folgenden Konzentrationen enthielten, wurden hergestellt und getestet wie in Beispiel 1 beschrieben:
Imipenem 12 ug/ml
Vancomycin 50 ug/ml
Fluconazol 100 ug/ml
Rifampin 0, 10, 30 oder 100 ug/ml.
Paarweise Klappensegelhälften wurden verwendet. Die eine Hälfte jedes Klappensegels diente als Kontrolle. Sie wurde in dem antibiotischen Cocktail inkubiert, der kein Rifampin enthielt. Die andere Hälfte wurde mit einem der antibiotischen Cocktails behandelt, die Rifampin enthielten. Die Ergebnisse des Tests des Einbaus von ³H-Glycin in die Proteine sind in der folgenden Tabelle in dpm/mg und als Prozentsatz der Kontrolle angegeben. Konzentration des zugegebenen Rifampin

Beispiel 3

Antibiotische Cocktails wurden hergestellt und getestet wie in Beispiel 1 beschrieben. Paarweise Klappensegelhälften wurden verwendet. Die eine Hälfte jedes Klappensegels diente als Kontrolle und wurde mit dem folgenden antibiotischen Cocktail behandelt:
Imipenem 12 ug/ml
Vancomycin 50 ug/ml
Fluconazol 100 ug/ml.
Die andere Hälfte wurde mit einem der folgenden antibiotischen Test-Cocktails behandelt:
Imipenem 12, 24 oder 48 ug/ml
Vancomycin 50 ug/ml
Fluconazol 100 ug/ml
Rifampin 10 ug/ml.
Die Ergebnisse des Tests des Einbaus von ³H-Glycin in die Proteine sind in der folgenden Tabelle in dpm/mg und als Prozentsatz der Kontrolle angegeben. Die mit 12, 24 und 48 ug bezeichneten Spalten zeigen die Menge von Imipenem, die pro ml in den Testcocktails (Nicht-Kontrolle) eingesetzt wurde.

Beispiel 4

Antibiotische Cocktails, die die folgenden Antibiotika in den folgenden Konzentrationen enthielten, wurden hergestellt und getestet wie in Beispiel 1 beschrieben:
Imipenem 12, 24, 48 oder 96 ug/ml
Vancomycin 50 ug/ml
Fluconazol 100 ug/ml.
Paarweise Klappensegelhälften wurden verwendet. Die eine Hälfte jedes Klappensegels diente als Kontrolle und wurde mit dem antibiotischen Cocktail behandelt, der 12 ug/ml Imipenem enthielt. Die andere Hälfte wurde mit einem der antibiotischen Test-Cocktails behandelt, die 24, 48 oder 96 ug/ml Imipenem enthielten. Die Ergebnisse des Tests des Einbaus von ³H-Glycin in die Proteine sind in der folgenden Tabelle in dpm/mg und als Prozentsatz der Kontrolle angegeben. Die mit 24, 48 und 96 ug bezeichneten Spalten zeigen die Menge von Imipenern, die pro ml in den antibiotischen Testcocktails einge wurde.

Beispiel 5

Antibiotische Cocktails, die die folgenden Antibiotika in den folgenden Konzentrationen enthielten, wurden hergestellt und getestet wie in Beispiel 1 beschrieben:
Imipenem 12 ug/ml
Vancomycin 50 ug/ml
Fluconazol 100 ug/ml
Rifampin 10 ug/ml
Amphotericin B 0, 0,3, 1,0 oder 3,0 ug/ml.
Die Verdünnungen von Amphotericin B wurden wie folgt hergestellt. Eine Flasche, die 50 mg Amphotericin B enthielt (E. R. Squibb & Sons, Inc., Princeton, NJ; Markenname FUNGIZONE), wurde mit 10 ml sterilem Wasser rekonstituiert. Ein ml dieser Lösung wurde entnommen und mit 9 ml von Lösung B weiter verdünnt, so dass eine Konzentration von 500 ug/ml erhalten wurde. Aus dieser Vorratslösung wurden weitere Verdünnungen in Lösung B zubereitet.
Paarweise Klappensegelhälften wurden verwendet. Die eine Hälfte jedes Klappensegels diente als Kontrolle und wurde mit dem antibiotischen Cocktail ohne Amphotericin B behandelt. Die andere Hälfte wurde mit einem der antibiotischen Test- Cocktails behandelt, die Amphotericin B enthielten. Die Ergebnisse des Tests des Einbaus von ³H-Glycin in die Proteine sind in der folgenden Tabelle in dpm/mg und als Prozentsatz der Kontrolle angegeben. In der Tabelle beziehen sich die Konzentrationen auf die Konzentration von Amphotericin B, die in den antibiotischen Testcocktails eingesetzt wurde.
Eine Konzentration von 0,3 ug/ml Amphotericin B im Antibiotikagemisch ergab ein Gewebe mit einer durchschnittlichen Lebensfähigkeit, die höher war als die der Kontrolle. Die Lebensfähigkeit des Gewebes wurde durch 1 und 3 ug/ml Amphotericin B auf 74% bzw. 72% der Kontrolle reduziert.

Beispiel 6

Antibiotische Cocktails, die die folgenden Antibiotika in den folgenden Konzentrationen enthielten, wurden hergestellt und getestet wie in clen Beispielen 1 und 5 beschrieben, mit der Ausnahme, dass die Klappensegelhälften in den antibiotischen Cocktails nur 24 Stunden statt 48 Stunden inkubiert wurden:
Imipenem 48 ug/ml
Vancomycin 50 ug/ml
Fluconazol 100 ug/ml
Rifampin 0, 10, 30 oder 60 ug/ml
Amphotericin B 0,3 ug/ml.
Paarweise Klappensegelhälften wurden verwendet. Die eine Hälfte jedes Klappensegels diente als Kontrolle und wurde mit dem antibiotischen Cocktail ohne Rifampin behandelt. Die andere Hälfte wurde mit einem der antibiotischen Test-Cocktails behandelt, die Rifampin enthielten. Die Ergebnisse des Tests des Einbaus von ³H-Glycin in die Proteine sind in der folgenden Tabelle in dpm/mg und als Prozentsatz der Kontrolle angegeben. In der Tabelle beziehen sich die Konzentrationen auf die Konzentration von Rifampin, die in den antibiotischen Testcocktails eingesetzt wurde.

Beispiel 7

Ein Experiment wurde durchgeführt, um den Einbau von ³H-Glycin durch frisches Gewebe mit dem ³H-Glycin-Einbau durch ein Gewebe zu vergleichen, das nach verschiedenen Verfahren behandelt worden war. Alle Verfahren waren wie in den Beispielen 1 und 5 beschrieben, außer wenn nachstehend etwas anderes angegeben ist.
Die drei Klappensegel wurden aus jeder von acht Herzklappen entnommen und jedes Klappensegel in die Hälfte geschnitten. Die sechs Klappensegelhälften wurden wie folgt behandelt:
Klappensegel 1A Frische Kontrolle, keine Antibiotikabehandlung, keine Gefrierkonservierung.
Klappensegel 1B Inkubiert in Lösung B bei 37ºC für 24 Stunden und gefrierkonserviert.
Klappensegel 2A Frische Kontrolle, keine Antibiotikabehandlung, keine Gefierkonservierung.
Klappensegel 2B Inkubiert mit einem antibiotischen Cocktail bei 37ºC für 24 Stunden und gefrierkonserviert.
Klappensegel 3A Inkubiert in Lösung B bei 37ºC für 24 Stunden und gefrierkonserviert.
Klappensegel 3B Inkubiert mit einem antibiotischen Cocktail bei 37ºC für 24 Stunden und gefrierkonserviert.
Alle frischen Kontroll-Klappensegelhälften wurden sofort mit ³H-Glycin markiert und für die Szintillationszählung zubereitet. Nach dem Auftauen wurden auch die mit Lösung B und mit Antibiotika behandelten Klappensegelhälften mit ³H-Glycin markiert und für die Szintillationszählung zubereitet.
Der antibiotische Cocktail bestand aus:
Imipenem 48 ug/ml
Vancomycin 50 ug/ml
Fluconazol 100 ug/ml
Amphotericin B 0,3 ug/ml.
Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle dargestellt. Die Zahlen stellen dpmlmg dar.
Es gibt einen statistisch signifikanten Unterschied zwischen der frischen Kontrollgruppe und den zwei Gruppen, die vor der Gefrierkonservierung bei 37ºC inkubiert wurden. Es gibt keinen statistischen Unterschied zwischen den mit Lösung B behandelten und den mit Antibiotika behandelten Gruppen. Die statistische Analyse erfolgte unter Verwendung des Student-Newman-Keuls-Verfahrens.

Beispiel 8

Antibiotische Cocktails, die die folgenden Antibiotika in den folgenden Konzentrationen enthielten, wurden hergestellt und getestet wie in den Beispielen 1 und 5 beschrieben:
Imipenem 48, 72 oder 96 ug/ml
Vancomycin 50 ug/ml
Fluconazol 100 ug/ml
Amphotericin B 0,3 ug/ml.
Die drei Klappensegel aus jeder Herzklappe wurden halbiert. Die eine Hälfte jedes Klappensegels wurde mit einem antibiotischen Cocktail, der eine bestimmte Konzentration von Imipenem enthielt, 24 Stunden inkubiert, und die andere Hälfte wurde mit dem gleichen antibiotischen Cocktail 48 Stunden inkubiert, und zwar folgendermaßen:
Klappensegel 1A 48 ug/ml Imipenem, 24 Stunden
1 B 48 ug/ml Imipenem, 48 Stunden
2A 72 ug/ml Imipenem, 24 Stunden
2B 72 ug/ml Imipenem, 48 Stunden
3A 96 ug/ml Imipenem, 24 Stunden
3B 96 ug/ml Imipenem, 48 Stunden.
Die Ergebnisse des Tests des Einbaus von ³H-Glycin in die Proteine sind in der folgenden Tabelle in dpm/mg angegeben. In der Tabelle beziehen sich die Konzentrationen auf die Konzentration von Imipenem, die in den antibiotischen Cocktails eingesetzt wurde.
Die statistische Analyse dieser Werte durch den Student-T-Test zeigt, dass kein statistischer Unterschied zwischen den Behandlungsgruppen vorlag.

Beispiel 9

Antibiotische Cocktails, die die folgenden Antibiotika in den folgenden Konzentrationen enthielten, wurden hergestellt und getestet wie in den Beispielen 1 und 5 beschrieben, mit der Ausnahme, dass die Klappensegelhälften nur 24 Stunden in den antibiotischen Cocktails inkubiert wurden:
Imipenem 96 ug/ml
Vancomycin 50 ug/ml
Fluconazol 100 ug/ml
und eines der folgenden:
0,3 ug/ml Amphotericin B Kontrolle
0,6 ug/ml Amphotericin B I
1,0 ug/ml Amphotericin B II
0,6 ug/ml Amphotericin B plus 50 ug/ml Netilmicin III.
Die Ergebnisse des Tests des Einbaus von ³H-Glycin in die Proteine sind in der folgenden Tabelle angegeben (Einheiten in dpm/mg). Es ist zu beachten, dass bei den Herzklappen B1307, B1310 und B1311 eine falsche Konzentration Netilmicin zu dem Cocktail zugefügt wurde. Deshalb wurden diese Werte nicht aufgenommen.
Unter Verwendung des "Kruskal-Wallis One way ANOVA on Ranks" zeigt sich, dass kein statistischer Unterschied zwischen den Gruppen vorliegt (p = 0,994). Somit stellen die getesteten antibiotischen Schemata ein Gewebe bereit, das gleichermaßen lebensfähig ist.

Beispiel 10

Antibiotische Cocktails wurden hergestellt und getestet wie in den Beispielen 1 und 5 beschrieben, mit der Ausnahme, dass die Klappensegelhälften nur 24 Stunden in den antibiotischen Cocktails inkubiert wurden. Paarweise Klappensegelhälften wurden verwendet. Die eine Hälfte jedes Klappensegels diente als Kontrolle und wurde mit dem folgenden antibiotischen Cocktail behandelt:
Imipenem 96 ug/ml
Vancomycin 50 ug/ml
Fluconazol 100 ug/ml
Amphotericin B 0,6 ug/ml.
Die andere Hälfte wurde mit einem der folgenden antibiotischen Testcocktails behandelt:
Imipenem 96 ug/ml
Vancomycin 50 ug/ml
Fluconazol 100 ug/ml
Amphotericin B 0,6 ug/ml
Netilmicin 20, 30 oder 50 ug/ml.
Die Ergebnisse des Tests des Einbaus von ³H-Glycin in die Proteine sind in der folgenden Tabelle in dpm/mg und als Prozentsatz der Kontrolle angegeben. Die mit 20, 30 und 50 ug/ml bezeichneten Spalten zeigen die Konzentration von Netilmicin, die in den Testcocktails (Nicht-Kontrolle) eingesetzt wurde.

Beispiel 11

Antibiotische Cocktails wurden hergestellt und getestet wie in den Beispielen 1 und 5 beschrieben, mit der Ausnahme, dass die Klappensegelhälften nur 24 Stunden in den antibiotischen Cocktails inkubiert wurden. Paarweise Klappensegelhälften wurden verwendet. Die eine Hälfte jedes Klappensegels diente als Kontrolle und wurde mit dem folgenden antibiotischen Cocktail behandelt:
Imipenem 96 ug/ml
Vancomycin 50 ug/ml
Fluconazol 100 ug/ml
Netilmicin 50 ug/ml.
Die andere Hälfte wurde mit einem der folgenden antibiotischen Testcocktails behandelt:
Imipenem 96 ug/ml
Vancomycin 50 ug/ml
Fluconazol 100 ug/ml
Netilmicin 50 ug/ml
Amphotericin B 0,3, 0,6, 1,0, 2,0 oder 3,0 ug/ml.
Die Ergebnisse des Tests des Einbaus von ³H-Glycin in die Proteine sind in der folgenden Tabelle in dpm/mg angegeben. Die Ergebnisse für die ³H-Hypoxanthin-Autoradiographie sind in der zweiten Tabelle als Prozentsatz der lebenden Zellen im Vergleich zur Gesamtzahl der Zellen angegeben. Die mit 0,3, 0,6, 1,0, 2,0 oder 3,0 ug/ml bezeichneten Spalten zeigen die Konzentration von Amphotericin B, die in den Testcocktails (Nicht-Kontrolle) eingesetzt wurde.

Beispiel 12

Ein Experiment wurde durchgeführt, um die Lebensfähigkeit von Klappensegeln zu bestimmen, die mit Cocktail C, mit Cocktail D oder mit Cocktail B plus Cocktail C behandelt worden waren. Die Formulierungen der Cocktails B und C finden sich in Beispiel 1. Cocktail D hat die folgende Formulierung:
Imipenem 96 ug/ml
Vancomycin 50 ug/ml
Fluconazol 100 ug/ml
Amphotericin B 0,3 ug/ml.
Wenn nicht anders angegeben, wurden die Cocktails wie in den Beispielen 1 und 5 beschrieben hergestellt und getestet.
Elf menschliche Herzklappen wurden verwendet. Ein Klappensegel aus jeder Herzklappe wurde mit Cocktail D 24 Stunden inkubiert (Verfahren G). Ein anderes Klappensegel wurde in Cocktail C 24 Stunden inkubiert (Verfahren D), oder es wurde 24 Stunden in Cocktail C und anschließend 24 Stunden in Cocktail B inkubiert (Verfahren E). Nach dem Auftauen wurde jedes Klappensegel halbiert. Die eine Hälfte wurde mit ³H-Glycin und die andere Hälfte mit ³H-Hypoxanthin markiert. Die Ergebnisse des Einbaus von ³H-Glycin in die Proteine sind in der folgenden Tabelle dargestellt (Einheiten in dpmlmg).
Somit führte die Behandlung mit Cocktail D, der die antimykotischen Mittel Fluconazol und Amphotericin B enthielt (Verfahren G), zu einer Lebensfähigkeit der Klappensegel, die vergleichbar war mit der bei der Behandlung mit den Cocktails B und C, die keine antimykotischen Mittel enthielten (Verfahren D und E), oder die sogar besser war als diese.

Beispiel 13

Ein Experiment wurde durchgeführt, um die Lebensfähigkeit von Herzklappengeweben zu vergleichen, die jeweils nach einem der folgenden Verfahren bearbeitet wurden:
Verfahren F: Gewebe mit einer längeren Ischämiezeit (möglicherweise geringere Lebensfähigkeit der Zellen), das 24 Stunden mit Cocktail C inkubiert wurde, worauf gegebenenfalls eine Inkubation von 24 Stunden mit Cocktail B folgte (die Formulierungen sind in Beispiel 1 angegeben). Die Entscheidung, ob das Gewebe mit Cocktail B zu behandeln ist, wurde aufgrund der Ergebnisse der mikrobiologichen Kulturen des Gewebes getroffen, das vor der Antibiotikabehandlung mit Cocktail C entnommen wurde, wie in McNally und Brockbank, J. Med. Engineer. & Technol. 16, 34-38 (1992), und in der PCT-Anmeldung WO 92/12631 beschrieben.
Verfahren H: Inkubation von 24 Stunden mit dem folgenden antibiotischen Cocktail, der als Cocktail E bezeichnet wird:
Imipenem 94-100 ug/ml
Vancomycin 50 ug/ml
Netilmicin 50 ug/ml
Fluconazol 100 ug/ml
Amphotericin B 1,0 ug/ml.
Die Cocktails B, C und E wurden wie in den Beispielen 1 und 5 beschrieben hergestellt und getestet, außer wenn hier andere Angalben gemacht werden.
Ein Klappensegel wurde beim Sezieren aus jeder Harzklappe entnommen und halbiert. Die eine Hälfte wurde sofort mit ³H-Glycin markiert, und die andere Hälfte wurde sofort mit ³H-Hypoxanthin markiert. Diese dienten als die frischen Kontrollen.
Der Rest der Herzklappe wurde halbiert, wobei in jeder Hälfte ein ganzes Klappensegel intakt gelassen wurde. Die eine dieser Klappenhälifen wurde nach dem Verfahren F behandelt (Cocktail C, gegebenenfalls gefolgt von einer Behandlung mit Cocktail B). Die andere Klappenhälife wurde nach dem Verfahren H behandelt (Cocktail E). Die gefrorenen Klappenhälften wurden aufgetaut und halbiert. Die eine Hälfte wurde mit ³H-Glycin markiert, und eine Hälfte wurde mit ³H-Hypoxanthin markiert.
Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle dargestellt (Einheiten in dpm/mg für den Einbau von ³H-Glycin in die Proteine und Einheiten des Prozentsatzes der lebenden Zellen im Vergleich zu den gesamten Zellen bei der ³H-Hypoxanthin-Autoradiographie).
Die Vergleiche zwischen den Behandlungsgruppen wurden anhand des nichtparametrischen "Mann-Whitney Rank sum Tests" durchgeführt. Wenn ³H-Glycin zur Markierung des Gewebes verwendet wurde, gab es keinen signifikanten Unterschied zwischen den Behandlungen (p = 0,655). Genauso wurde kein signifikanter Unterschied zwischen den zwei behandelten Gruppen festgestellt, wenn 3H- Hypoxanthin zur Markierung des Gewebes verwendet wunde (p = 0,684). Bei Verwendung des "Kruskal-Wallis One way ANOVA on Ranks" bestand kein signifikanter Unterschied zwischen den drei Gruppen, wenn ³H-Glycin eingesetzt wurde.
* ND = Nicht durchgeführt; ** sehr schwere Plaque

Beispiel 14

In diesen Untersuchungen wurde der Candida albicans-Stamm ATCC 14053 verwendet (American Type Culture Collection). Die Reinheit des Stamms wurde vor und nach der Züchtung bestätigt.
Der Testorganismus wurde auf einer Sabouraud-Agarplatte gezüchtet, wobei er für die Isolierung ausgestrichen und 24 Stunden bei 35ºC inkubiert wurde. Eine Einzelkolonie wurde mit einem sterilen Wattetupfer entnommen und in 5,0 ml sterile Kochsalzlösung eingebracht. Das Gemisch wurde gevortext und sodann so lange Verdünnungen davon hergestellt und mit einem herkömmlichen Trübungsmuster verglichen, bis die Trübung mit einem Trübungsstandard von 0,5 übereinstimmte (einer 0,5 MacFarlang-Trübungsstandardsuspension). Serielle Verdünnungen wurden wie folgt hergestellt: (1) 0,5 ml des 0,5 MacFarland-Trübungsstandards wurden zu 4,5 ml einer sterilen normalen Kochsalzlösung zugegeben (Röhrchen A; zu erwartende Population 105 cfu/ml); (2) 0,1 ml der Suspension von Röhrchen A wurde zu 9,9 ml einer sterilen normalen Kochsalzlösung zugefügt (Röhrchen B; zu erwartende Population 103 cfu/ml); und (3) 0,1 ml der Suspension von Röhrchen B wunde zu 9,9 ml einer sterilen normalen Kochsalzlösung zugefügt (Röhrchen C; zu erwartende Population 10 cfu/ml). Jede serielle Verdünnung wurde 30 Sekunden gevortext, bevor der nächste Überführungsschritt erfolgte.
Lösungen von Fluconazol und Amphotericin B, die die in der folgenden Tabelle angegebenen Konzentrationen aufwiesen, wurden in Lösung 13 verwendet.
Die Röhrchen B und C wurden mit diesen Cocktails behandelt. Jeder Cocktail (24,0 ml) wurde in einen sterilen 115-ml-Becher aus Kunststoff gegeben, und anschließend wurde 1,0 ml der Hefepopulation aus dem Röhrchen B oder C zugegeben. Die Becher wurden vorsichtig gemischt, verschlossen und 24 Stunden in einen Inkubator bei 35ºC gestellt. Nach dem vorgeschriebenen Inkubationszeitraum wurde aus jedem Röhrchen 1,0 ml des Hefe-Cocktail-Gemisches entnommen und so bearbeitet, dass die überlebenden Hefeorganismen gezählt werden konnten. Das restliche Gemisch wurde in den Inkubator zurückgestellt und weitere 24 Stunden inkukbiert. Nach diesem Inkubationszeitraum wurden die Becher herausgenommen und vorsichtig aufgewirbelt, sodann wurde 1,0 ml entnommen, anschließend wurde das vorstehende Verfahren wiederholt.
Die Hefen wurde wie folgt gezählt; jede Probe wurde in doppelter Ausführung getestet. Ein Milliliter (1,0 ml) der Hefesuspension wurde auf den Aufsatz einer sterilen Einweg-Filterapparatur aufgetragen, der 99 ml sterile normale Kochsalzlösung enthielt. Der Inhalt wurde vorsichtig gemischt und filtriert. Das Filterplättchen wurde mit einer sterilen Einwegpinzette keimfrei entnommen und auf Sabouraud-Agarplatten gelegt. Die Platten wurden 24 Stunden bei 35ºC inkubiert und anschließend die Kolonien gezählt.
Die Ergebnisse sind in den folgenden Tabelllen dargestellt. Röhrchen B enthielt zum Zeitpunkt Null 734 koloniebildende Einheiten (cfu) von C. albicans pro ml, und Röhrchen C enthielt zum Zeitpunkt Null 13 cfu/ml.
Die Ergebnisse von Röhrchen B zeigen, dass 100 ug/ml Fluconazol bewirkte, dass die biologische Belastung mit C. albicans nach 24 Stunden von 734 Kolonien auf 31 Kolonien zurückgegangen war. Nach 48 Stunden legt die Zahl der Kolonien (34) ein Toleranz- oder statisches Phänomen nahe. Amphotericin B bei 0,6 ug/ml und die Kombination von 100 ug/ml Fluconazol und 0,3 ug/ml Amphotericin B waren fungizid.

Beispiel 15

Die folgenden antibiotischen Cocktails wurden wie in clen Beispielen 1 und 5 beschrieben hergestellt und an zehn Hefeisolaten getestet:
Die zehn Hefeisolate wurden ausgewählt, da es sich hierbei um klinisch signifikante menschliche Hefeisolate handelt. Die folgenden zehn Hefeisolate wurden getestet:
1. Rhodotorula rubra*
2. Candida lusitaniae*
3. Saccharomyces cerevisiae*
4. Cryptococcus laurentü*
5. Candida guilliermondü*
6. Torulopsis glabrata*
7. Candida tropicalis*
8. Candida albicans@
9. Trichosporon beigeli*
10. Candida parasilosis*
* Bereitgestellt vom American College of Pathologists
@ Das Candida albicans-Isolat wurde aus einem Spendergewebe erhalten, in dem das Hefeisolat eine Inkubation mit einem antibiotischen Cocktail überlebt hatte. Die Identifizierung erfolgte anhand des Keimschlauch-Tests, wodurch Candida albicans bestätigt wurde. Der Keimschlauch-Test umfasst das Anlegen einer Suspension des Isolats in einer kommerziell hergestellten Lösung von Rinderserum (REMEL). Das Gemisch wird zwei bis vier Stunden bei 35ºC inkubiert und mikroskopisch untersucht. Als Bestätigung eines positiven Keimschlauchs dient die Bildung von Pseudohyphen, die aus der Hefe- Sprosszelle sprossen (Keimung).
Die antibiotischen Cocktails wurden mit zehn einzelnen Hefesuspensionen mit einer vorher bestimmten biologischen Belastung wie im vorstehenden Beispiel beschrieben getestet. Die Sabouraud-Agarplatten wurden fünf Tage bei 35ºC inkubiert, anschließend wurden die Kolonien gezählt und die Platten am Tag sieben auf ein weiteres Wachstum von Hefekolonien untersucht. Der Inkubations/Zählungs-Zeitraum von fünf bis sieben Tagen wurde gewählt, da hier die besten Aussichten bestanden, die überlebenden Hefeisolate gewinnen zu können, die möglichennreise wachsen, nachdem sie sich von den durch das Vorliegen der antimykotischen Mittel zugefügten Schäden erholt haben.
Die Ergebnisse sind in den folgenden Tabellen dargestellt. Cocktail III zeigte bei allen Hefeisolaten die größte fungizide Aktivität. Ergebnisse mit den Hefeisolaten nach 24 Stunden (cfu/ml) Ergebnisse mit den Hefeisolaten nach 48 Stunden (cfu/ml) Vergleich von Cocktail I (0,3 ug Amphotericin B) nach 24 und nach 48 Stunden
Der Vergleich von Cocktail I nach 24 Stunden und Cocktail I nach 48 Stunden zeigt das für Hefen übliche Toleranzphänomen. Vergleich der Cocktails I und IV (0,3 up Amphotericin B mit und ohne Fluconazol) nach 24 Stunden
Cocktail IV ohne Fluconazol war nach 24 Stunden nicht so wirksam wie Cocktail I mit Fluconazol. Die Werte zeigen, dass die zwei antimykotischen Mittel zu synergistischen Ergebnissen führen, wenn sie zusammen eingesetzt werden. Vgl. auch das vorstehende Beispiel. Vergleich der Cocktails II und V (0,6 ug Amphotericin B mit und ohne Fluconazol) nach 24 Stunden
Cocktail V ohne Fluconazol war nach 24 Stunden nicht so wirksam wie Cocktail II mit Fluconazol. Die Werte zeigen, dass die zwei antimykotischen Mittel zu synergistischen Ergebnissen führen, wenn sie zusammen eingesetzt werden. Vgl. auch das vorstehende Beispiel. Vergleich der Cocktails III und VI (1,0 ug Amphotericin B mit und ohne Fluconazol) nach 24 Stunden
Cocktail VI ohne Fluconazol war nach 24 Stunden nicht so wirksam wie Cocktail III mit Fluconazol. Die Werte zeigen, dass die zwei antimykotischen Mittel zu synergistischen Ergebnissen führen, wenn sie zusammen eingesetzt werden. Vgl. auch das vorstehende Beispiel. Beispiel 16 Beispiel 15 wurde unter Verwendung der folgenden antibiotischen Cocktails wiederholt:
Amphotericin B 1,0 ug/ml.
Zehn verschiedene Hefeisolate wurden verwendet. Diese Organismen wurden gewählt, weil sie aus kardiovaskulärem Spendergewebe isoliert worden waren. Hierbei handelt es sich um:
11. Candida albicans
12. Candida albicans
13. Candida albicans
14. Candida albicans
15. Candida albicans
16. Hefe, nicht Candida albicans
17. Hefe, nicht Candida albicans
18. Candida albicans
19. Hefe, nicht Candida albicans
20. Hefe, nicht Candida albicans
Die Identifizierung erfolgte anhand des Keimschlauch-Tests. Die Ergebnisse nach 24 Stunden Inkubation in den antibiotischen Cocktails sind in der folgenden Tabelle dargestellt (Einheiten in cfu/ml).
Die Zugabe von Netilmicin in 50 ug/ml (Cocktails VII und VIII) hatte keine ungünstigen Effekte auf die fungizide Aktivität von Fluconazol und Amphotericin B. Die Erhöhung von Amphotericin B von 0,3 ug/ml (Cocktail I) auf 1,0 ug/ml (Cocktails VII und VIII) zeigt eine größere fungizide Aktivität. Die Verringerung von Fluconazol von 100 ug/ml auf 50 ug/ml in Gegenwart von 1,0 ug/ml Amphotericin 1B (Cocktail VII gegenüber Cocktail VIII) hatte keinen entscheidenden Einfluss auf die fungizide Aktivität.

Beispiel 17

Herzklappen von 223 Spendern wurden wie im US-Patent Nr. 4 890 457 beschrieben seziert. Die sezierten Herzklappen wurden dekontaminiert, indem eines der nachstehend angeführten Verfahren verwendet wurde.
Beim Sezieren wurden doppelte Sätze von Proben hergestellt, die aus etwa 1 g Gewebe bestanden. Der eine Satz der Proben wurde durch das Verfahren D, E oder F nach dem Stand der Technik behandelt (wie in den Beispielen 12 und 13 beschrieben).
Der restlichen Satz der Proben wurde unter Verwendung eines einzelnen Antibiotikagemisches, Cocktail E, gemäß der Erfindung behandelt.
Die mikrobiologischen Analysen wurden wie folgt durchgeführt. Für jedes sezierte Herz wurden beim Sezieren drei Sätze von Gewebeproben präpariert, die das Produkt vor der Behandlung mit Antibiotika ("vor der Behandlung") und nach der Antibiotikabehandlung ("nach der Behandlung") repräsentierten. Die entnommenen Proben waren Stücke des äußeren Herzmuskelgewebes, Stücke der Mitral- oder Trikuspidalklappe, Stücke des proximal zur Aorten- oder Pulmonalklappe gelegenen Muskelgewebes und mehrere Milliliter der Lösung, in der das Herz geliefert worden war.
Nach dem Sezieren wurde der "Vorder-Behandlung"-Satz der Proben dem mikrobiologischen Labor für die mikrobielle Analyse der vorliegenden Organismen übermittelt. Von den restlichen doppelten Sätzen von Proben wurde der eine Satz zusammen mit den Herzklappen nach dem Verfahren D, E oder F behandelt. Der andere Satz wurde nach dem Verfahren Z behandelt.
Am Ende jedes Behandlungszeitraums wurden die Proben keimfrei entnommen und zur Analyse an das mikrobiologische Labor geschickt. Jeder Satz von Proben wurde getrennt getestet.
Die Gewebeproben wurden homogenisiert, indem jeweils die Probe in einen sterilen Kunststoffbeutel gegossen und dieser 30 bis 60 Sekunden in einen "Stomacher" gebracht wurde. Die homogenisierten Gewebeproben wurden auf den folgenden Medien gezüchtet: Blutagarplatte; Schokoladeagarplatte; Blutagarplatte (anaerob); angereicherte Thioglykolatbrühe; Sabouraud-Agar mit Gentamicin; und Sabouraud-Herzinfusionsagar mit Blut.
Sowohl die Blutagar- als auch die Schokoladenagarplatten wurden vier Tage in 5 bis 10% CO&sub2; in Luft bei 35ºC inkubiert und am zweiten und vierten Tag begutachtet. Die Röhrchen mit der Thioglykolatbrühe wurden 14 Tage bei 35ºC inkubiert und die ersten sieben Tage täglich und danach in regelmäßigen Abständen begutachtet. Die Sabouraud-Agarplatten wurden bei 30ºC inkubiert und jeweils zweimal in der ersten Woche und wieder nach 14 Tagen begutachtet.
Das Wachstum der Kulturen wurde visuell überwacht. Gramfärbungen wurden mit allen positiven Kulturen und auch mit den negativen Thioglykolatbrühen durchgeführt, um die "negative" visuelle Beurteilung zu bestätigen. Zum Identifizieren der positiven Kulturen wurden mikrobiologische Tests verwendet, die nach dem Stand der Technik anerkannt sind.
Die Ergebnisse der mikrobiologischen Analysen sind nachstehend angegeben: Verfahren D im Vergleich zu Verfahren H Verfahren E im Vergleich zu Verfahren H, Verfahren F im Vergleich zu Verfahren H

Ergebnisse insgesamt:

Verfahren D, E, F Verfahren H
216 Kein Wachstum, Wirksamkeit 97% 223 Kein Wachstum, Wirksamkeit 100% 7 Wachstum
Kein Bakterien- oder Pilzwachstum wurde in Proben des Verfahrens H festgestellt. Somit hemmt der Cocktail E besser als die Cocktails B und C (die in den Verfahren D, E und F einzeln oder in Kombination eingesetzt wurden) das Bakterienwachstum und außerdem das Wachstum von Hefen. Kein Bakterien- oder Pilzwachstum wurde in Proben des Verfahrens H festgestellt. Somit hemmt der Cocktail E besser als die Cocktails B und C (die in den Verfahren D, E und F einzeln oder in Kombination eingesetzt wurden) das Bakterienwachstum und außerdem das Wachstum von Hefen.
Die vorstehende genaue Beschreibung soll lediglich der Erläuterung dienen und in keiner Weise die Erfindung einschränken, vielmehr ist es so zu verstehen, dass der Umfang der vorliegenden Erfindung durch die folgenden Patentansprüche definiert ist.

Claims

1. Antibiotischer Cocktail zum Dekontaminieren von Gewebe für eine Transplantation, umfassend:

Amphotericin B und Fluconazol als antimykotische Mittel; und

eine Mehrzahl von antibakteriellen Mitteln;

wobei die Mittel in Mengen vorhanden sind, die bewirken, dass das Wachstum von Hefen und Bakterien im Wesentlichen gehemmt wird, während die Lebensfähigkeit des Gewebes im Wesentlichen aufrechterhalten wird.

2. Antibiotischer Cocktail nach Anspruch 1, wobei dlie antibakteriellen Mittel Vancomycin und Imipenem umfassen.

3. Antibiotischer Cocktail nach Anspruch 2, wobei die antibakteriellen Mittel außerdem Netilmicin umfassen.

4. Antibiotischer Cocktail nach Anspruch 1, wobei das Amphotericin B in einer Konzentration von ungefähr 0,3 ug pro Milliliter bis ungefähr 2,0 ug pro Milliliter vorhanden ist und das Fluconazol in einer Konzentration von ungefähr 50 ug pro Milliliter bis ungefähr 100 ug pro Milliliter vorhanden ist.

5. Antibiotischer Cocktail nach Anspruch 4, wobei die antibakteriellen Mittel Vancomycin und Imipenem umfassen.

6. Antibiotischer Cocktail nach Anspruch 5, wobei das Vancomycin in einer Konzentration von ungefähr 50 ug pro Milliliter und das Imipenem in einer Konzentration von ungefähr 10-100 ug pro Milliliter vorhanden ist.

7. Antibiotischer Cocktail nach Anspruch 6, wobei das Amphotericin B in einer Konzentration von 0,3 ug pro Milliliter vorhanden ist, das Fluconazol in einer Konzentration von 100 ug pro Milliliter vorhanden ist, das Vancomycin in einer Konzentration von 50 ug pro Milliliter vorhanden ist und das Imipenem in einer Konzentration von 96 ug pro Milliliter vorhanden ist.

8. Antibiotischer Cocktail nach Anspruch 5, wobei die antibakteriellen Mittel außerdem Netilmicin umfassen.

9. Antibiotischer Cocktail nach Anspruch 8, wobei das Vancomycin in einer Konzentration von ungefähr 50 ug pro Milliliter, das Imipenem in einer Konzentration von ungefähr 10-100 ug pro Milliliter und das Netilmicin in einer Konzentration von ungefähr 20-50 ug pro Milliliter vorhanden ist.

10. Antibiotischer Cocktail nach Anspruch 9, wobei das Amphotericin B in einer Konzentration von 1,0 ug pro Milliliter vorhanden ist, das Fluconazol in einer Konzentration von 100 ug pro Milliliter vorhanden ist, das Vancomycin in einer Konzentration von 50 ug pro Milliliter vorhanden ist, das Imipenem in einer Konzentration von 96 ug pro Milliliter vorhanden ist und das Netilmicin in einer Konzentration von 50 ug pro Milliliter vorhanden ist.

11. Verfahren zum Dekontaminieren eines Gewebes für eine Transplantation, umfassend:

Inkontaktbringen des Gewebes mit dem antibiotischen Cocktail nach einem der Ansprüche 1-10 bei einer Temperatur und während eines Zeitraums, die bewirken, dass das Wachstum von Hefen und Bakterien im Wesentlichen gehemmt wird, während die Lebensfähigkeit des Gewebes im Wesentlichen aufrechterhalten wird.

12. Verfahren nach Anspruch 11, wobei das Gewebe eine Herzklappe, ein Gefäß, ein Pericardium oder Muskel-Knochen-Gewebe ist.

13. Verfahren nach Anspruch 12, wobei die Temperatur 35-39ºC beträgt und der Zeitraum 24-48 Stunden beträgt.