DE69726868T2

DE69726868T2 - DEFORMYLIERUNG VON f-MET PEPTIDEN IN BAKTERIEN EXPRESSIONSSYSTEMEN

Info

Publication number: DE69726868T2
Application number: DE69726868T
Authority: DE
Inventors: Gregg Bogosian
Original assignee: Monsanto Technology LLC
Current assignee: Monsanto Technology LLC
Priority date: 1996-07-19
Filing date: 1997-07-17
Publication date: 2004-10-28
Anticipated expiration: 2017-07-18
Also published as: ATE256748T1; WO1998003664A1; AU731039B2; EP0917580A1; KR100484602B1; US5834243A; BR9710501B1; US6190902B1; CN1230994A; KR20000067927A; AU3668997A; EP0917580B1; ZA976353B; BR9710501A; CA2261016A1; JP2000515017A; DE69726868D1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft Materialien und Verfahren, die für die Erzeugung rekombinanter Proteine in transformierten Bakterien nützlich sind. Bei einer wichtigen Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung Materialien und Verfahren, die für die Verringerung der Retention von N-Formyl-Gruppen an den N-terminalen Methionin-Resten rekombinanter Proteine, welche in großen Mengen in transformierten Bakterien-Wirtszellen erzeugt wurden, geeignet sind. Bei einer anderen Ausführungsform sind neue Verfahren zur Erhöhung der Peptid-Deformylase-Mengen in transformierten Bakterien-Wirtszellen geoffenbart.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Methionin ist der universelle Start-Aminosäurenrest für das Wachsen von Peptidketten (z. B. Proteinsynthese) bei den meisten lebenden Systemen. Damit Methionin als initiierende Aminosäure für die naszente Peptidsynthese in Bakterien funktioniert, muss es eine Reihe von Transformationen durchmachen, und zwar sowohl vor der Initiierung der Proteinsynthese als auch nachdem das Protein erzeugt wurde (vgl. Überblick von Meinnel, T., Mechulam, Y. und Blanquet, S.; 1993). In E. coli wurden alle an diesen Transformationen beteiligten Enzyme und ihre jeweiligen Gene isoliert und/oder sequenziert (Meinnel, T. und Blanquet, S., 1994).
Zwei der bemerkenswertesten Transformationen bei der initiierenden Aminosäure Methionin umfassen die Zugabe einer N-Formyl-Gruppe zu Methionin-Molekülen vor der Initiierung einer Messenger-RNA(mRNA)-Translation und das nachfolgende Entfernen der N-Formyl-Gruppe vom Amino(N-)-terminalen Methionin des naszenten Peptids. Das Entfernen der N-Formyl-Gruppe wird vom Enzym Peptid-Deformylase (EC 3.5.1.27 gemäß der IUB-Nomenklatur, wie in „Enzyme Nomenclature Recommendations" (1992) Academic Press, San Diego, veröffentlicht) bewerkstelligt. Die Peptid-Deformylase (PDF) spaltet die Formyl-Gruppe von den meisten naszenten Formyl-Methionin-Peptiden in einer Substrat-spezifischen Reaktion ab. Es gibt jedoch Ausnahmen zur Routine-Wirkung von PDF. Beispielsweise bleiben einige E. coli-Proteine entweder ganz oder teilweise formyliert. (Hauschild-Rogat, P., 1968; Marasco, W. A., et al., 1984; und Milligan, D. L. und Koshland, Jr., D. E., 1990). Es wurde auch beobachtet, dass mehrere rekombinante Proteine, die normalerweise frei von N-Formyl-Methionin (f-Met) sind, eine signifikante f-Met-Retention aufweisen, wenn sie in rekombinanten E. coli-Stämmen überproduziert werden. Zu den Beispielen für dieses Phänomen gehören die E. coli-Tryptophan-Synthase-alpha- und -beta-Untereinheiten (Sugino, Y., et al., 1980; Tsunasawa, S., et al., 1983); bovines Somatotropin (BST) (Bogosian, G., et al., 1989); Aal-Wachstumshormon (Sugimoto, Y., et al., 1990); E. coli-1-Acyl-sn-glycerin-3-phosphat-acyltransferase (Coleman, J., 1992); humaner Granulozyten-Kolonie-stimulierender Faktor (Clogston, C. L., et al., 1992); bovines Fettsäuren-Bindungs-Protein (Specht, B., et al., 1994); bovines Cytochrom P450 (Dong, M. S., et al., 1995); Methanothermus-fervidus-Histon A (Sandman, K., et al., 1995); humanes Interleukin-5 (Rose, K., et al., 1992); humanes Parathyroid-Hormon (Rabbani, S., et al., 1988; Hogset, A., et al., 1990); humanes Gamma-Interferon (Honda, S., et al., 1989); E. coli-Threonin-Deaminase (Eisenstein, 1991); und E. coli Tol Q-Membran-Protein (Vianney, A., et al., 1994).
Die Retention der Formyl-Gruppe an einem Protein, das in Bakterien-Expressionssystemen exprimiert und daraus gereinigt wurde, ist bei der Herstellung rekombinanter Pharmazeutika unerwünscht. Infolgedessen sind komplexe und teure Reinigungsverfahren notwendig, um das deformylierte Protein, an dem ein Interesse besteht, bis zu einem Grad zu reinigen, der ausreicht, um es für die pharmazeutische Verwendung zu qualifizieren. Außerdem müssen häufig teure Analyseverfahren zur Quantifizierung der formylierten Isoform entwickelt werden, um zu gewährleisten, dass die Menge einer solchen Isoform im Endprodukt unter einer gewünschten Menge liegt. Daher ist es notwendig, eine effiziente Entfernung unerwünschter Weise zurückbehaltener N-Formyl-Gruppen an rekombinianten Proteinen zu erreichen, ohne die Produktionsmenge des rekombinanten Proteins in Bakterien-Expressionssystemen zu stören.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft die Entdeckung von verfahren und Materialien, die nützlich sind bei der Entfernung zurückgehaltener N-Formyl-Gruppen von naszenten rekombinanten N-Formyl-Methionin-Peptiden, die in transformierten Bakterien-Wirten (z. B. E. coli) erzeugt wurden. Im Allgemeinen und insgesamt sieht die Erfindung Verfahren vor, die das Vorkommen zu rückbehaltener N-formyl-Gruppen an rekombinanten, bakteriell exprimiert rekombinanten Peptiden oder Proteinen (kollektiv als „rekombinante Proteine" bezeichnet) verringern können, ohne die Produktionsmenge an rekombinantem Protein im Wesentlichen zu verringern, indem die Bakterien-wirtszellen veranlasst werden, die Expression und/oder die Aktivität von PDF zu erhöhen, beispielsweise durch genetische oder epigenetische Manipulationen. Vorzugsweise wird dieses Ergebnis erreicht, indem ein exprimierbares PDF-Gen in geeignete Bakterien-Wirtszellen transformiert wird, so dass die Menge an PDF in den Bakterien-Wirtszellen erhöht wird. Ebenso in der Erfindung inkludiert sind die so transformierten Wirtszellen.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform sieht die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Erzeugung rekombinanten Proteins mit einer verringerten Retention von N-Formyl-Methionin in transformierten Bakterien-Wirtszellen vor. Dieses Verfahren inkludiert den Schritt des Transformierens von Bakterien-Wirtszellen mit DNA, umfassend eine erste exprimierbare DNA-Sequenz, die für ein Peptid-Deformylase-Enzym codiert, das auch funktionell mit einem Promotor verknüpft ist, der in Bakterien-Wirtszellen funktionell ist, und eine zweite exprimierbare DNA-Sequenz, die für ein rekombinantes Protein codiert, das ebenfalls mit einem Promotor funktionell verknüpft ist, der in den Bakterien-Wirtszellen funktionell ist. Die exprimierbaren DNA-Sequenzen können auf einem einzigen DNA-Segment vorhanden sein, oder alternativ auf verschiedenen Segmenten, die in die Bakterien-Wirtszellen co-transformiert werden können. Man kann dann transformierte Bakterien-Wirtszellen identifizieren, die sowohl die erste als auch die zweite exprimierbare Sequenz aufweisen, und die transformierten Bakterien-Wirtszellen unter Bedingungen züchten, die die Coexpression des rekombinanten Proteins und des PDF-Enzyms bewirken, was zu einer wesentlichen Deformylierung des coexprimierten rekombinanten Proteins führt.
Bei einer mehr bevorzugten Ausführungsform befindet sich jede exprimierbare DNA-Sequenz auf einem DNA-Molekül, das ein Marker-Gen enthält, so dass transformierte Bakterien-Wirtszellen durch Auswahl von Bakterien mit einem Marker-Merkmal, das durch das Marker-Gen übertragen wird, identifiziert werden können.
Bei einer anderen bevorzugten Ausführungsform hat das in der transformierten Wirtszelle erzeugte rekombinante Protein sowohl eine verminderte Retention von N-Formyl-Methionin als auch eine Menge der rekombinanten Protein-Produktion, die im Wesentlichen gleich (d. h., mindestens etwa 80%) ist wie jene von ansonsten identischen Wirtszellen, die nur mit einem DNA-Molekül transformiert wurden, das das für das rekombinante Protein codierende Gen aufweist.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform enthält die zur Transformation verwendete DNA auch ein Marker-Gen. Die transformierten Wirtszellen können dann dadurch identifiziert werden, dass sie ein vom Marker-Gen vermitteltes Marker-Merkmal aufweisen. Der transformierte Wirt kann als universelles Expressionssystem zur Expression von Proteinen, für welche erwünscht ist, dass die Retention von N-Formyl-Methionin verringert ist, verwendet werden.
Zusätzliche Ausführungsformen betreffen Zellen, die Gene, welche für PDF codieren, und das interessierende rekombinante Protein coexprimieren, und Vektoren, die für PDF und das interessierende rekombinante Protein codieren.
BESCHREIBUNG DER FIGUREN
1 Plasmide pBGH1 und pXT179
2 RP-HPLC-Analysen von BST, isoliert aus induzierten Kulturen von W3110G[pBGH1] (A) und W3110G[pXT179] (B). Die Absorption wurde auf Millivolt umgewandelt, um die Fläche unter den Peaks zu bestimmen. Die beiden beobachtbaren Komponenten sind: 1. normales BST; und 2. BST, das eine Formylgruppe am N-terminalen Methionin enthält. Die letztere Sorte wurde sowohl durch Massenspektrometrie als auch durch Hydrolyse zur Entfernung der Formylgruppe vom Protein, gefolgt von RP-HPLC, identifiziert. Die Stämme W3110G[pBGH1] und W3110G[pXT179] wurden in 10 l-Fermentationsgefäßen gezüchtet und mit Indol-Acrylsäure induziert (Bogosian, G., et al., 1989). Einschlusskörper, die BST enthielten, wurden aus den Kulturen durch Homogenisieren und Zentrifugieren isoliert, und das BST wurde aufgelöst und wieder gefaltet (Bogosian, G., et al., 1989). Das BST wurde durch DEAE-Cellulose-Ionenaustausch-Chromatographie weiter gereinigt (Wood, D. C., et al., 1989). Von diesem Material wurde formyliertes BST vom Gesamt-BST mit einem RP-HPLC-System von Perkin Elmer, Series 4, unter Verwendung einer Vydac C-18-Säule abgetrennt. Die Chromatographiebedingungen waren: Fließgeschwindigkeit 1,5 ml/min, mit konstanter 40 mM Trifluoressigsäure, und 54–60% Acetonitril während 24 min, gefolgt von 60–75% Acetonitril während 6 min. Die untere Nachweisgrenze für das formylierte BST ist etwa 0,5% des Gesamt-BST.
BESCHREIBUNG ILLUSTRATIVER AUSFÜHRUNGSFORMEN
Einer der Hauptnachteile der Expression pharmazeutisch nützlicher rekombinanter Proteine in prokaryontischen Expressionssystemen ist die unerwünschte Retention formylierter Isoformen, was dazu führt, dass großtechnische Produktionssysteme teurer und weniger effizient sind, als sie sollten. Daher ist es ein Ziel der vorliegenden Erfindung, eine effiziente Entfernung zurückgehaltener N-Formyl-Gruppen an rekombinanten Proteinen ohne beträchtliche Verringerung der Produktionsmenge solcher Proteine in prokaryontischen Expressionssystemen zu erreichen.
Bei einer Ausführungsform werden die Bakterien-Wirtszellen, die ein rekombinantes Protein, an dem ein Interesse besteht, exprimieren, mit einem Gen transformiert, das für ein PDF-Enzym codiert, so dass die PDF-Expressionsmenge in der Zelle im Vergleich zur Menge seiner ursprünglichen Expression erhöht wird. Für den Zweck der vorliegenden Erfindung ist die Retention von N-Formyl-Methionin verringert, wenn das rekombinante Protein-Produkt, an dem ein Interesse besteht, weniger formyliert ist als wenn es in einer Bakterien-Wirtszelle erzeugt worden wäre, die – ansonsten identisch – nicht mit einem für das PDF-Enzym codierenden Gen transformiert wurde.
Das genetische Material, das für das PDF-Enzym codiert, kann unter Verwendung einer Vielzahl von Techniken, die dem Fachmann bekannt sind, hergestellt werden, einschließlich – ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein – PCT-Technologie, Klonieren aus genomischen DNA-Bibliotheken oder cDNA-Klonierung aus Messenger-RNA, unter Verwendung einer Vielzahl von anwendbaren Screening-Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind, zur Identifizierung von Klonen, die das PDR-Gen aufweisen. Die PCR-Technologie ist in Ronald M. Atlas und S. Asimk Bej, Polymerase Chain Reaction, S. 418–435 in Methods for General and Molecular Biology, Philipp Gerhardt American Society of Microbiology, Wash. D. C. 1994 beschrieben, und andere Klonierungstechniken sind in Sambrook, et al. Molecular Cloning Manual, 2. Ausgabe, 1989. beschrieben, von welchen jedes durch Hinweis darauf hierin mit einbezogen ist.
Eine Vielfalt induzierbarer Kontroll-Systeme kann verwendet werden, um die Menge an PDF zu variieren, und jedes beliebige ist zur Verwendung bei dieser Erfindung geeignet. Bei einer bevorzugten Ausführungsform ist der Promotor, mit welchem die PDF verbunden ist, chemisch induzierbar und wird die transformierte E. coli in Anwesenheit einer Menge einer Inducer-Verbindung gezüchtet, die ausreicht, um die PDF-Produktion auf eine gewünschte Menge zu steigern. Bei der am meisten bevorzugten Ausführungsform ist der Promotor ein durch Indolacrylsäure induzierbarer trp-Promotor, und die Inducer-Verbindung ist Indol-acrylsäure. Die gewünschte Menge an PDF, die je nach dem verwendeten Kontrollsystem variiert, liegt zwischen der Produktionsmenge von nicht-transformierter E. coli und der maximalen Produktionsmenge der transformierten E. coli. Ein Fachmann kann bestimmen, welche besondere PDF-Menge erwünscht ist und welches Kontrollsystem verwendet werden sollte, um den spezifischen Anforderungen des Fachmanns zu entsprechen. Eine Anzahl von Promotoren, die den Fachleuten bekannt sind, kann bei der vorliegenden Erfindung verwendet werden, einschließlich lac, tac, rec A, ara und lambda p1.
Die vorliegende Erfindung ist auch auf die transformierten Bakterien-Wirtszellen gerichtet, die erhöhte Mengen an PDF erzeugen. Der verwendete Bakterienstamm kann von jeglicher transformierbarer Spezies sein. Vorgzusweise ist das Bakterium ein Mitglied der Enterobacteriaceae-Familie. Bei einer bevorzugten Ausführungsform ist das Bakterium E. coli, am meisten bevorzugt ein E. coli K12-Stamm.
Bei einer anderen Ausführungsform sieht die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Deformylierung von rekombinantem, in Bakterien erzeugtem Protein vor, welches die Steigerung der Produktion eines PDF-Enzyms in den Bakterien, in welchen das rekombinante Protein ebenfalls erzeugt wird, umfasst. Mit diesem Verfahren kann man die transformierten Bakterien unter Bedingungen züchten, die eine Koexpression des rekombinanten Proteins und des PDF-Enzyms bewirken. Das PDF-Gen und das für das rekombinante Protein, an dem ein Interesse besteht, codierende Gen sind jeweils so gestaltet, dass sie funktionell verknüpft sind mit einem geeigneten Promotor, an dem ein Interesse besteht, welcher die Expression der PDF und des rekombinanten Proteins, an dem ein Interesse besteht, lenken kann. Bei einer bevorzugten Ausführungsform befinden sich die DNA-Sequenzen, die für das rekombinante Protein und für das PDF-Enzym co dieren, auf dem selben DNA-Molekül und sind mit demselben Promotor funktionell verknüpft. Vorzugsweise stehen diese beiden Sequenzen unter der Kontrolle des durch die Indolacrylsäure induzierbaren trp-Promotors, ohne Transkriptions-Terminator zwischen den beiden Genen, obwohl andere Promotoren und Konfigurationen bestimmt und von den Fachleuten verwendet werden könnten. Bei einer anderen Ausführungsform befinden sich die beiden Sequenzen auf demselben Molekül, sind jedoch mit getrennten Promotoren funktionell verknüpft, die von der gleichen oder von verschiedener Art sein können.
Bei noch einer anderen Ausführungsform liegen die beiden Sequenzen auf zwei verschiedenen DNA-Molekülen vor und stehen unter der Kontrolle separater Promotoren, die auch von der gleichen oder von verschiedener Art sein können. Daher ist es, obwohl der trp-Promotor bei der bevorzugten Ausführungsform zum Treiben der Expression sowohl des PDF-Gens als auch jenes Gens, das für das gewünschte Polypeptid, an dem ein Interesse besteht, codiert, verwendet wird, nicht notwendig, dass der trp-Promotor verwendet wird oder dass sogar beide Gene vom selben Promotor getrieben werden. Alternative Ausführungsformen ermöglichen die Wahl eines Promotors, um die gewünschte Expressionsmenge in einem bestimmten Zelltyp zu erreichen.
Es ist wichtig, ein PDF-Gen zu wählen, welches mit dem Bakterien-Wirt kompatibel ist, so dass es funktionell im Bakterien-Wirt exprimiert wird. Vorzugsweise ist daher die DNA-Sequenz, die für die PDF codiert, im Wesentlichen dieselbe wie die DNA-Sequenz, die für das PDF-Enzym codiert, welches für den verwendeten Bakterienstamm endogen ist. Bei einer bevorzugten Ausführungsform sind der Stamm und das PDF-Enzym von E. coli, und in einer noch mehr bevorzugten Ausführungsform ist das Gen von einem E. coli-K12-Stamm und in einen Stamm desselben Genotyps eingeführt. Für die Zwecke dieser Erfindung ist ein E. coli-PDF-Gen ein solches, welches für ein PDF-Enzym codiert, dessen Aminosäuresequenz im Wesentlichen ähnlich der Aminosäuresequenz des E. coli-PDF-Enzyms ist und welches im E. coli-Wirt exprimierbar und funktionsfähig ist.
Das für das Protein, an dem ein Interesse besteht, codierende „Gen" kann aus einer beliebigen Anzahl heterologer Gene oder cDNAs, die für die Protein-Produktion in einem prokaryontischen Wirt ausgelegt sind, ausgewählt werden. Da die proka ryontische Transkriptions/Translations-Maschinerie die häufig in nicht-verarbeiteter eukaryontischer RNA vorhandenen Introns nicht erkennen und entfernen kann, wird, wenn das Gen, an dem ein Interesse besteht, in der vorliegenden Erfindung ein eukaryontisches Gen ist, welches Introns enthält, die entsprechende cDNA anstelle des Gens selbst als Quelle für die DNA verwendet, die in den Bakterien-Stamm eingeführt wird, welcher zur Produktion des rekombinanten Proteins benützt wird. Bei der am meisten bevorzugten Ausführungsform codiert das Gen, an dem ein Interesse besteht, für Somatotropin. Bei einer anderen bevorzugten Ausführungsform codiert das Gen, an dem ein Interesse besteht, für humanen Granulozyten-Kolonie-stimulierenden Faktor. Es sind jedoch auch andere Gene, die für rekombinante Proteine codieren, welche einen inakzeptablen Anteil der formylierten N-terminalen Methionin-Isoformen zurückhalten, geeignet, einschließlich humanes Interleukin 5 (IL-5), humanes Parathyroidhormon, Aalwachstumshormon, 1-Acyl-sn-glycerin-3-phosphat-acetyltransferase, bovines Fettsäure-Bindungsprotein, bovines Cytochrom p450 und humanes gamma-Interferon.
Optimalerweise sollte das System so konstruiert sein, dass es eine verstärkte PDF-Expressionsmenge ermöglicht, die nicht auf Kosten der Menge der Expression des Proteins, an dem ein Interesse besteht, geht. Bei einer am meisten bevorzugten Ausführungsform sieht die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur wesentlichen Verringerung der Retention von N-Formyl-Methionin ohne wesentliche Verringerung der Menge an erzeugtem rekombinantem Protein vor. Demgemäß erzeugen die transformierten Bakterien am meisten bevorzugt das rekombinante Protein in einer Menge, die größer als etwa 80% jener Menge ist, die von Bakterien erzeugt wird, welche – ansonsten identisch – die für ein PDF-Enzym codierende DNA-Sequenz nicht enthalten.
Vor der Transformation in den Bakterien-Wirt können die für die PDF codierenden DNA-Segmente und das für das Protein, an dem ein Interesse besteht, codierende Gen in jeden aus einer beliebigen Anzahl geeigneter Vektoren für die Transformation in den Bakterien-Wirt inkorporiert werden. Zu den geeigneten Vektoren zählen Plasmid-Vektoren, Cosmid-Vektoren und Phagen-Vektoren, die alle dem Fachmann bekannt sind, beispielsweise wie von Sambrook et al. beschrieben. Das PDF-Gen und das für das Protein, an dem ein Interesse besteht, codierende Gen können auf dem selben oder auf separaten Molekülen vorhanden sein, wobei vorzugsweise jedes DNA-Molekül ein Marker-Gen enthält, so dass transformierte Bakterien-Wirtszellen identifiziert werden können. Wenn die Gene auf separaten Molekülen vorgesehen sind, kann der Bakterien-Wirt mit beiden DNA-Molekülen gleichzeitig oder zu verschiedenen Zeiten transformiert werden. Beispielsweise werden bei einer Ausführungsform die Bakterien mit einem Vektor transformiert, der das für die PDF codierende Gen enthält, welches dann stabil in das Chromosom integriert werden kann. Die resultierenden transformierten Bakterien können dann nach Belieben beibehalten und mit dem zweiten Vektor transformiert werden, der für ein Protein, an dem ein Interesse besteht, codiert. Das Transformationsverfahren ist nicht von kritischer Bedeutung, obwohl es bevorzugt sein kann, dass die Zellen unter Verwendung eines Vektors transformiert werden, der stabil in das Chromosom integriert wird. Ein Vektor dieses Typs ist Bakteriophage lambda. Ein anderes Beispiel ist der Bakteriophage Mu-Vektor, der im US-Patent 5,395.763 geoffenbart ist. Dieser Mu-Vektor wäre bei Verwendung in der vorliegenden Erfindung wegen seiner größeren Stabilität im Vergleich zu Plasmid-Vektoren, seiner kleineren Größe im Vergleich zum Bakteriophagen lambda, und seiner Fähigkeit zu einer strikten Regulierung der rekombinanten Protein-Gen-Expression besonders vorteilhaft. Es wurde auch ein anderer Ansatz zur Konstruktion von E. coli-Stämmen mit zahlreichen, stabilen chromosomalen Insertionen beschrieben, welcher auf Modul-Elementen für die stellen-spezifische Rekombination von Tn1545 und Phage lambda basiert (Peredelchuk, M. und Bennet, G., 1997).
Ein Fachmann würde erkennen und verstehen, dass zahlreiche alternative Ausführungsformen dieser Erfindung Ansätze zur Manipulation endogener PDF-Expression und/oder Aktivität umfassen könnten. Beispielsweise wurden eine Vielfalt von Strategien für gezieltes Ersetzen oder Modifizieren von endogenen Bakterien-Chromosomen-Regionen beschrieben (vgl. z. B. Gutterson, N. I. und Koshland, D., 1983; Hamilton, C., et al., 1989; Moskovitz, J., et al., 1995). Man könnte einen solchen Ansatz verwenden, um genetische Modifizierungen in E. coli einzuführen, die zu einer erhöhten PDF-Expression/Aktivität führen würden. Beispielsweise könnte der endogene PDF-Promotor durch einen starken Promotor, wie den trp-Promotor ersetzt werden, welcher größere Mengen der PDF-Expression ermöglichen würde. Außerdem könnte der endogene PDF-Promotor auf eine Weise modifiziert werden, die entweder ein negatives Transkriptions-Regulations-Element entfernen oder ein Regulations-Element einführen würde, das die Transkription verbessert. Als zusätzliches Mittel, mit welchem die PDF-Expression verstärkt werden könnte, könnte ein rekombinantes DNA-Molekül in die Bakterienzellen eingeführt werden, welches die Erzeugung eines Proteins bewirken würde, das die endogene PDF-Aktivität verstärken kann, wie ein Transkriptionsfaktor, ein Protein, das mit PDF als positivem Regulator physikalisch interagiert, oder ein Protein, das als positiver stromaufwärts-Regulator von PDF wirkt. Alternativ könnte man ein Protein entfernen oder eliminieren, welches normalerweise auf irgendeine Art als negativer Regulator der PDF-Expression und/oder Aktvität wirkt. Dies könnte beispielsweise erreicht werden, indem man eine genetische Modifikations-Strategie, wie oben erwähnt, anwendet, um das für den negativen Regulator codierende Gen zu eliminieren oder zu beeinträchtigen, oder indem man eine Antisense-Inhibierung der Gen-Expression verwendet, um die Produktion des negativen Regulators zu inhibieren.
Die folgenden Beispiele sollen eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung veranschaulichen, diese jedoch nicht einschränken.
Die Herstellung von Expressionssystemen, bei welchen die Retention verschiedener N-formylierter Proteine verringert wurde durch Transformation von Bakterien-Wirten mit DNA-Vektoren, die für Peptid-Deformylase und das interessierende rekombinante Protein codieren, ist dargelegt.
Beispiel 1: Klonierung des E. coli-PDF-Gens
Bei diesem Beispiel führte die Einführung der PDF- und boviner Somatotropin-Gene unter der Kontrolle eines trp-Promotors zu einer Verringerung des N-formylierten BST von einer Menge von etwa fünf Prozent Gesamt-BST in einem Kontroll-Stamm, der das BST-Gen, jedoch nicht das PDF-Gen auf dem Plasmid enthielt, bis zu einer nicht nachweisbaren Menge bei Stämmen, die beide Gene enthalten.
Primer, die beide Enden des E. coli-PDF-Gens flankierten, basierten auf der veröffentlichten Nukleotid(nt)-Sequenz für diese Region (Guillon, J. M., et al., 1992). Der Vorwärts-(Initiierungs-Ende des Gens)-Primer hatte die Sequenz 5'-GCAT- GAGTCGCATGCATTAAGTCTGGAGATT TATGTCAGTT-3' (SEQ. ID Nr. 1), welche die Erkennungsstelle für die Restriktions-Endonuklease SphI (GCATGC) beinhaltet. Der Revers-(Terminations-Ende des Gens)-Primer hatte die Sequenz 5'-GCAGAGTATGCGTCGACTTAAGCCCGGGCTTTCAGACG-3' (SEQ. ID. Nr. 2), welche eine Erkennungsstelle für die Restriktions-Endonuklease SalI (GTCGAC) beinhaltet. Bei einer PCR-Reaktion begrenzen diese Primer ein amplifiziertes Produkt, welches das gesamte PDF-Struktur-Gen, einschließlich der nativen Ribosomen-Bindungsstelle, jedoch ohne jegliche zugehörigen Promotoren oder andere regulierenden Sequenzen inkludiert (Guillon, J. M., et al., 1992). Die PCR wurde unter Verwendung von chromosomaler DNA aus E. coli K-12 Stamm W3110G (Bogosian, G. et al., 1989) als Matrize durchgeführt, was zum vorausgesagten 500 Basenpaar-Produkt führte, welches dann kloniert und nt-sequenziert wurde. Die so erhaltene PDF-Nukleotid-Sequenz war in jeder Hinsicht mit der zuvor veröffentlichen (Guillon, J. M., et al., 1992; Mazel, D., et al., 1994) identisch.
Beispiel 2: Konstruktion und Eigenschaften von pXT179
Das 500 bp-PCR-Produkt, welches das PDF-Gen enthielt, wurde mit SphI und SalI verdaut und in die SphI- und SalI-Stellen an pBGH1 subkloniert, einem Plasmid-Vektor, der für die Überproduktion von bovinem Somatotropin (BST) verwendet werden kann und bereits früher beschrieben wurde (Seeburg, P. H., et al., 1983; Calcott, P. H., et al., 1988; Bogosian, G., et al., 1989, 1990; Kane, J. F., et al., 1990). Das resultierende Konstrukt wurde als pXT179 bezeichnet, ein Plasmid, bei welchem die BST- und PDF-Gene unter der Kontrolle des trp-Promotors stehen. Es gibt keinen Transkriptions-Terminator zwischen den BST- und PDF-Genen im Vektor. Eine Synthese von Proteinen auf hohem Niveau, die von Genen unter der Kontrolle des trp-Promotors codiert werden, auf solchen Plasmiden kann durch Züchten eines mit pXT179 transformierten Stammes ohne Tryptophan in Anwesenheit des Inducers Indolacrylsäure (IAA) erreicht werden (Calcott, P. H., et al., 1988; Bogosian, G., et al., 1989; Kane, J. F., et al., 1990). Um die Auswirkung des PDF-Gens auf die Menge des zurückgehaltenen formylierten BST zu bestimmen, wurde E. coli K-12 Stamm W3110G sowohl mit pBGH1 als auch mit pXT179 transformiert, was zu zwei Stämmen führte, die mit W3110G[pBGH1] bzw. W3110G[pXT179] bezeichnet wurden. Beide Stämme erzeugten BST zu etwa 30% des gesamten Zellproteins.
Beispiel 3: PDF-Produktion und die Deformylierung von BST
Rohextrakte, hergestellt aus mit IAA induzierten Kulturen der beiden transformierten Stämme wurden mittels des Verfahrens von Adams (1968) auf PDF-Aktivität untersucht. Jeder Test wurde an drei unabhängigen Kulturen jedes Stammes dreifach durchgeführt. Der rohe Zellextrakt des Stammes W3110G[pXT179] hatte mehr als 40mal so viel PDF-Aktivität wie der Extrakt aus dem Stamm W3110G[pGH1] (110 ± 10 im Vergleich zu 2,6 ± 0,8 Einheiten). BST wurde aus beiden Stämmen isoliert und RP-HPLC-Analysen unterzogen, um die f-Met-Retention abzuschätzen. Jede dieser Analysen wurde an jeder Probe zweifach durchgeführt. Aus dem Stamm W3110G[pBGH1] gereinigtes BST weist unter solchen Bedingungen zwei Peaks auf. Ein repräsentatives RP-HPLC-Profil ist in 2 gezeigt. Der größere Peak ist Met-BST, und der kleinere Peak ist f-Met-BST (Bogosian, G., et al., 1989), was etwa 5% des gesamten, erzeugten BST darstellt. Der kleinere zweite Peak im RP-HPLC-Profil für BST, das aus Stamm W3110G[pXT179] gereinigt worden war, schien kein f-Met-BST zu enthalten, da der f-Met-BST-Peak eine Retentionszeit von etwa 18,4 min und der kleinere zweite Peak eine Retentionszeit von etwa 18,8 min hatte. Um jedoch diese Möglichkeit auszuschließen, wurde das Material, welches den kleineren Peak aufwies, isoliert und einer Elektrospray-Massenspektrometrie unterzogen, welche das Fehlen von f-Met-BST bestätigte. Das BST aus diesem kleineren Peak hatte eine Masse, die 42–46 Dalton größer als Met-BST war, jedoch würde die Zugabe einer Formylgruppe zu Met-BST die Masse nur um 28 Dalton erhöhen. Das Material des kleineren Peak ist höchstwahrscheinlich BST, das an einem Lysin-Rest carbamyliert ist, was die Masse um 43 Dalton erhöhen würde. Man weiß, dass die Verwendung von Harnstoff zum Auflösen von BST-Einschlusskörpern beim hier verwendeten Reinigungsverfahren (Bogosian, G., et al., 1989) zur Carbamylierung von Lysin in einer sehr kleinen Fraktion des BST führt (unveröffentlichte Beobachtungen). So war, während die f-Met-BST-Isoform in einer Menge von etwa 5% des gesamten, im W3110G[pBGH1]-Stamm erzeugten BST vorhanden war, dieses auf nicht nachweisbare Mengen im Stamm mit den erhöhten PDF-Mengen (d. h., W3110G[pXT179]) reduziert.
Die obigen Daten ergeben drei bedeutende Beobachtungen. Erstens ist das aus E. coli K12-Stamm W3110G erhaltene und in den obigen Beispielen verwendete PDF-Gen mit dem PDF-Gen aus anderen E. coli-Stämmen identisch. Zweitens hatte ein E. coli-Stamm, der das PDF-Gen unter der Kontrolle des trp-Promotors auf einem Plasmid mit hoher Kopienanzahl exprimierte, Mengen an PDF, die um mehr als das 40-fache höher waren als beim entsprechenden Stamm mit einer einzigen Chromosomen-Kopie des PDF-Gens. Drittens führte die Expression der BST- und PDF-Gene auf hohem Niveau zur Eliminierung von nachweisbarem f-Met-BST. Diese Vorgangsweise sollte allgemein zur Verhinderung der f-Met-Retention in in E. coli oder anderen Organismen exprimierten Proteinen anwendbar sein. Diese Daten veranschaulichen die Nützlichkeit der Überexpression von PDF als Mittel zum Entfernen zurückgehaltener Formyl-Gruppen von bakteriell exprimierten rekombinanten Proteinen.
Beispiel 4: Erzeugung von deformyliertem humanen Granulozyten-Kolonie-stimulierenden Faktor (GCSF)
PCR-Primer sind auf Basis der veröffentlichten GCSF-cDNA-Sequenz (Tsuchiya, N., et al., 1986) entworfen, die ein amplifiziertes Produkt begrenzen, welches die gesamte GCSF-Struktur-Codierregion einschließlich der nativen Ribosomen-Bindungsstelle beinhaltet. Die PCR wird unter Verwendung eines Plasmids, das die GCSF-cDNA enthält, als Matrize durchgeführt, und das resultierende Produkt wird sequenziert, um zu verifizieren, dass es mit der entsprechenden veröffentlichten Sequenz identisch ist.
Unter Verwendung molekular-biologischer Standard-Techniken (wie beispielsweise in Sambrook, 1989, beschrieben), wird das PCR-Produkt mit dem (den) entsprechenden Restriktions-Enzym(en) verdaut und in pBGHI an die Stelle der für BST codierenden Sequenzen subkloniert. Das resultierende Plasmid enthält daher das GCSF-Gen unter der Steuerung des trp-Promotors. Das 500 bp-PCR-Produkt, welches die PDF (wie in Beispiel 1 beschrieben) enthält, wird einem Restriktions-Verdau unterzogen und in das trp-GCSF-Plasmid subkloniert, so dass ein neues Plasmid geschaffen wird, bei welchem sowohl die PDF als auch das GCSF unter der Kontrolle des trp-Promotors stehen.
Um die Auswirkung des PDF-Gens auf die Menge des zurückgehaltenen formylierten GCSF zu bestimmen, wird E. coli K-12 Stamm W3110G transformiert, um zwei transformierte Stämme zu erzeugen, einen mit dem Plasmid, das PDF und GCSF enthält, und einen mit dem Plasmid, das nur GCSF enthält. Große Synthesemengen der Proteine werden durch Züchten von W3110G in Anwesenheit von IAA, wie beschrieben, erreicht. Aus mit IAA induzierten Kulturen der beiden transformierten Stämme hergestellte Rohextrakte werden mit dem Verfahren von Adams (1968) auf PDF-Aktivität untersucht, und rekombinanter GCSF wird aus beiden Stämmen isoliert und mittels RP-HPLC analysiert, um die f-Met-Retention zu evaluieren. Unter Verwendung dieser Vorgangsweise würden Ergebnisse erhalten, die ähnlich jenen sind, die für BST in Beispiel 3 beschrieben wurden. Somit würden die Mengen an nachweisbarem f-Met-GCSF vorteilhaft eliminiert.
Beispiel 5: Herstellung von deformyliertem humanem Interleukin-5 (IL-5)
PCR-Primer auf Basis der veröffentlichten IL-5-cDNA-Sequenz (Azuma, C., et al., 1986) werden entworfen, die ein amplifiziertes Produkt begrenzen, welches die gesamte IL-5-Struktur-Codier-Region einschließlich der nativen Ribosomen-Bindungsstelle enthält. PCR wird unter Verwendung von IL-5-cDNA enthaltendem Plasmid als Matrize durchgeführt, und das resultierende Produkt wird sequenziert, um zu verifizieren, dass es mit der entsprechenden veröffentlichten Sequenz identisch ist.
Unter Verwendung von molekular-biologischen Standard-Techniken (beispielsweise wie in Sambrook, 1989, beschrieben) wird das PCR-Produkt mit dem (den) entsprechenden Restriktions-Enzym(en) verdaut und in pBGH1 an die Stelle der für BST codierenden Sequenzen subkloniert. Das resultierende Plasmid enthält daher das IL-5-Gen unter der Kontrolle des trp-Promotors. Das 500 bp-PCR-Produkt, welches PDF enthält (wie in Beispiel 1 beschrieben), wird einem Restriktions-Verdau unterzogen und in das trp-IL-5-Plasmid subkloniert, so dass ein neues Plasmid geschaffen wird, bei welchem sowohl PDF als auch IL-5 unter der Kontrolle des trp-Promotors stehen.
Um die Wirkung des PDF-Gens auf die Menge an zurückgehaltenem formyliertem IL-5 zu bestimmen, wurde E. coli K-12 Stamm W3110G transformiert, um zwei transformierte Stämme zu erzeugen, einen mit dem Plasmid, das PDF und IL-5 enthält, und einen mit dem Plasmid, das nur IL-5 enthält. Die Synthese der Proteine auf hohem Niveau wird erreicht, indem W3110G in Anwesenheit von IAA wie beschrieben gezüchtet wird. Die aus mit IAA induzierten Kulturen der beiden transformierten Stämme erzeugten Rohextrakte werden mit dem Verfahren von Adams (1968) auf PDF-Aktivität un tersucht, und rekombinantes IL-5 wird aus beiden Stämmen isoliert und mittels RP-HPLC analysiert, um die f-Met-Retention zu evaluieren. Unter Verwendung dieser Vorgangsweise würden Ergebnisse ähnlich jenen, die für BST in Beispiel 3 beschrieben wurden, erhalten. Somit würden die Mengen des detektierbaren f-Met-IL-5 vorteilhaft eliminiert.
Beispiel 6: Produktion von deformyliertem humanen gamma-Interferon (IFN-gamma)
PCR-Primer auf Basis der veröffentlichten IFN-gamma-cDNA-Sequenz (Leung, D., et al., 1982) werden entworfen, die ein amplifiziertes Produkt begrenzen, welches das gesamte IFN-gamma-Struktur-Gen einschließlich der nativen Ribosomen-Bindungsstelle enthält. Die PCR wird unter Verwendung von IFN-gamma-cDNA enthaltendem Plasmid als Matrize durchgeführt, und das resultierende Produkt wird sequenziert, um zu verifizieren, dass es mit der entsprechenden veröffentlichten Sequenz identisch ist.
Unter Verwendung molekular-biologischer Standard-Techniken (wie beispielsweise in Sambrook, 1989, beschrieben), wird das PCR-Produkt mit dem (den) entsprechenden Restriktions-Enzym(en) verdaut und in pBGHI an Stelle der für BST codierenden Sequenzen subkloniert. Das resultierende Plasmid enthält daher das IFN-gamma-Gen unter der Steuerung des trp-Promotors. Das 500 bp-PCR-Produkt, welches die PDF (wie in Beispiel 1 beschrieben) enthält, wird einem Restriktions-Verdau unterzogen und in das trp-IFN-gamma-Plasmid subkloniert, so dass ein neues Plasmid geschaffen wird, bei welchem sowohl die PDF als auch das IFN-gamma unter der Kontrolle des trp-Promotors stehen.
Um die Auswirkung des PDF-Gens auf die Menge des zurückgehaltenen formylierten IFN-gamma zu bestimmen, wird E. coli K-12 Stamm W3110G transformiert, um zwei transformierte Stämme zu erzeugen, einen mit dem Plasmid, das PDF und IFN-gamma enthält, und einen mit dem Plasmid, das nur IFN-gamma enthält. Eine hochgradige Synthese der Proteine wird durch Züchten von W3110G in Anwesenheit von IAA, wie beschrieben, erreicht. Aus mit IAA induzierten Kulturen der beiden transformierten Stämme hergestellte Rohextrakte werden mit dem Verfahren von Adams (1968) auf PDF-Aktivität untersucht, und rekombinantes IFN-gamma wird aus beiden Stämmen isoliert und mittels RP-HPCL analysiert, um die f-Met-Retention zu evaluieren. Unter Verwendung dieser Vorgangsweise würden Ergebnisse erhalten, die ähnlich jenen sind, die für BST in Beispiel 3 beschrieben wurden. Somit können die Mengen an nachweisbarem f-Met-IFN-gamma vorteilhaft eliminiert werden.
Der Fachmann würde verstehen, dass unter Verwendung dieser Vorgangsweise die f-Met-Retention in im Wesentlichen jedem rekombinanten Protein, an dem ein Interesse besteht, welches normalerweise nach mikrobieller Produktion eine geringfügige f-Met-Retention aufweist, minimiert oder eliminiert werden könnte.
Die folgenden Literaturstellen können zum Verständnis und zur Ausübung der Erfindung nützlich sein. Das Miteinbeziehen einer Literaturstelle in der folgenden Liste soll jedoch nicht bedeuten, dass zugegeben wird, dass jede dieser Literaturstellen in Bezug auf die vorliegende Erfindung Stand der Technik ist.
LITERATURSTELLEN
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SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verfahren zur Deformylierung von rekombinantem, in einer Bakterien-Wirtszelle erzeugtem Protein, welches Verfahren das Züchten einer Bakterien-Wirtszelle umfasst, die transformiert ist zur Expression von a. einer ersten exprimierbaren DNA-Sequenz, die für ein Peptid Deformylase-Enzym codiert, das mit einem in der Bakterien-Wirtszelle funktionellen Promotor funktionell verknüpft ist; und b. einer zweiten exprimierbaren DNA-Sequenz, die für ein rekombinantes Protein codiert, das mit einem in der Bakterien-Wirtszelle funktionellen Promotor funktionell verknüpft ist.
Verfahren nach Anspruch 1, worin das rekombinante Protein E. coli-Tryptophan-Synthase-alpha, -Tryptophan-synthase-beta, bovines Somatotropin, Aalwachstumshormon, E. coli-1-acyl-sn-glycerin-3-phosphat-acyltransferase, humaner Granulocyten-Koloniestimulierender Faktor, bovines Fettsäure-Bindungsprotein, bovines Cytochrom P450, Methanothermus fervidus histonea, humanes Interleukin-5, humanes Parathyroidhormon, humanes gamma-Interferon, E. coli-Threonin-deaminase oder E. coli-TolQ-Membran-Protein ist.
Verfahren nach Anspruch 2, worin das rekombinante Protein humaner Granulozyten-Kolonie-stimulierender Faktor, bovines Somatotropin, humanes gamma-Interferon oder humanes Interleukin-5 ist.
Verfahren nach Anspruch 1 zur Deformylierung von bovinem, in einer Bakterien-Wirtszelle erzeugtem Somatotropin, welches Verfahren das Züchten einer Wirtszelle umfasst, die transformiert ist zur Expression von a. einer ersten exprimierbaren DNA-Sequenz, die für ein Peptid Deformylase-Enzym codiert, das mit einem in der Bakterien-Wirtszelle funktionellen Promotor funktionell verknüpft ist; und b. einer zweiten exprimierbaren DNA-Sequenz, die für bovines Somatotropin codiert, das mit einem in der Bakterien-Wirtszelle funktionellen Promotor funktionell verknüpft ist.
Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten Proteins mit verringerter Retention von N-Formyl-Methionin in einer transformierten Bakterien-Wirtszelle, welches Verfahren umfasst: a. Transformieren einer Bakterien-Wirtszelle mit DNA, welche umfasst: (i) eine erste exprimierbare DNA-Sequenz, die für ein Peptid-Deformylase-Enzym codiert, das mit einem in der Bakterien-Wirtszelle funktionellen Promotor funktionell verknüpft ist; und (ii) eine zweite exprimierbare DNA-Sequenz, die für ein rekombinantes Protein codiert, das mit einem in der Bakterien-Wirtszelle funktionellen Promotor funktionell verknüpft ist, b. Identifizieren einer transformierten Bakterien-Wirtszelle, die sowohl die erste als auch die zweite exprimierbare Sequenz aufweist, und c. Züchten der in Schritt b transformierten Bakterien-Wirtszelle unter Bedingungen, die die Coexpression des rekombinanten Proteins und des Peptid-Deformylase-Enzyms bewirken.
Verfahren nach Anspruch 5, worin das rekombinante Protein E. coli-Tryptophan-Synthase alpha, Tryptophan-Synthase beta, bovines Somatotropin, Aalwachstumshormon, E. coli-1-acyl-sn-glycerin-3-phosphat-acyltransferase, humaner Granulocyten-Koloniestimulierender Faktor, bovines Fettsäure-Bindungsprotein, bovines Cytochrom P450, Methanothermus fervidus histonea, humanes Interleukin-5, humanes Parathyroidhormon, humanes gamma-Interferon, E. coli-Threonin-deaminase oder E. coli-TolQ-Membran-Protein ist.
Verfahren nach Anspruch 6, worin das rekombinante Protein humaner Granulozyten-Kolonie-stimulierender Faktor, bovines Somatotropin, humanes gamma-Interferon oder humanes Interleukin-5 ist.
Verfahren nach Anspruch 5 zur Herstellung von bovinem Somatotropin mit verringerter Retention von N-Formyl-Methionin in einer transformierten Bakterien-Wirtszelle, welches Verfahren umfasst: a. Transformieren einer Bakterien-Wirtszelle mit DNA, welche umfasst: (i) eine erste exprimierbare DNA-Sequenz, die für ein Peptid-Deformylase-Enzym codiert, das mit einem in der Bakterien-Wirtszelle funktionellen Promotor funktionell verknüpft ist; und (ii) eine zweite exprimierbare DNA-Sequenz, die für bovines Somatotropin codiert, das mit einem in der Bakterien-Wirtszelle funktionellen Promotor funktionell verknüpft ist, b. Identifizieren einer transformierten Bakterien-Wirtszelle, die sowohl die erste als auch die zweite exprimierbare Sequenz aufweist, und c. Züchten der in Schritt b transformierten Bakterien-Wirtszellen unter Bedingungen, die die Coexpression des bovinen Somatotropins und des Peptid-Deformylase-Enzyms bewirken.
Verfahren nach Anspruch 5, 6, 7 oder 8, worin (i) die erste exprimierbare DNA-Sequenz auf einem DNA-Molekül vorliegt, das mindestens ein Marker-Gen aufweist, (ii) die zweite exprimierbare DNA-Sequenz auf einem DNA-Molekül vorliegt, das mindestens ein Marker-Gen aufweist, und (iii) die transformierte Bakterien-Wirtszelle als eine solche identifiziert wird, die ein durch mindestens eines der Marker-Gene vermitteltes Marker-Merkmal hat.
Verfahren nach Anspruch 5, 6, 7 oder 8, worin die erste und die zweite exprimierbare DNA-Sequenz funktionell mit verschiedenen Promotoren verknüpft sind.
Verfahren nach Anspruch 10, worin mindestens einer der Promotoren ein durch Indol-Acrylsäure induzierbarer trp-Promotor ist.
Verfahren nach Anspruch 10, worin die erste und die zweite exprimierbare DNA-Sequenz auf demselben DNA-Molekül vorliegen, welches Molekül mindestens ein Marker-Gen aufweist.
Verfahren nach Anspruch 10, worin die erste und die zweite exprimierbare DNA-Sequenz auf verschiedenen DNA-Molekülen vorliegen, von welchen jedes mindestens ein Marker-Gen aufweist.
Verfahren nach Anspruch 5, 6, 7 oder 8, worin die erste und die zweite exprimierbare DNA-Sequenz funktionell mit demselben Promotor verknüpft sind.
Verfahren nach Anspruch 14, worin der Promotor ein durch Indol-Acrylsäure induzierbarer trp-Promotor ist.
Verfahren nach Anspruch 5, 6, 7 oder 8, worin die transformierte Bakterien-Wirtszelle das von der zweiten exprimierbaren DNA-Sequenz codierte Protein in einer Menge produziert, die größer als etwa 80% jener Menge ist, die von einer Bakterien-Wirtszelle produziert wird, die – ansonsten identisch – die erste exprimierbare DNA-Sequenz nicht enthält.
Verfahren nach Anspruch 5, 6, 7 oder 8, worin mindestens eine der exprimierbaren DNA-Sequenzen in das Bakterien-Chromosom stabil integriert wird.
Verfahren nach Anspruch 1, 2, 3, 4, 5, 6 oder 7, worin die Aminosäuresequenz der Peptid-Deformylase im Wesentlichen dieselbe ist wie die Aminosäuresequenz des Peptid-Deformylase-Enzyms, das für die Bakterien-Wirtszelle endogen ist.
Verfahren nach Anspruch 1, 2, 3, 4, 5, 6 oder 7, worin die Bakterien-Wirtszelle ein Mitglied der Enterobacteriaceae-Familie ist.
Verfahren nach Anspruch 1, 2, 3, 4, 5, 6 oder 7, worin die Bakterien-Wirtszelle E. coli ist.
Verfahren nach Anspruch 20, worin die Aminosäuresequenz der Peptid-Deformylase im Wesentlichen dieselbe wie die Aminosäuresequenz des E. coli-Peptid-Deformylase-Enzyms ist.
Verfahren nach Anspruch 20, worin die Bakterien-Wirtszelle von einem E. coli K12-Stamm stammt.
Transformierte E. coli-Wirtszelle, umfassend eine erste DNA-Sequenz, die für ein E. coli-Peptid-Deformylase-Enzym codiert, das mit einem in E. coli funktionellen Promotor funktionell verknüpft ist, welche transformierte E. coli-Wirts zelle mehr Peptid-Deformylase-Enzym erzeugen kann als eine nicht-transformierte E. coli-Wirtszelle, und welche weiters eine zweite DNA-Sequenz aufweist, die für ein rekombinantes Protein codiert, das mit einem in E. coli funktionellen Promotor funktionell verknüpft ist, welche transformierte E. coli-Wirtszelle das rekombinante Protein erzeugen kann, welches weniger formyliert ist als das von einer transformierten E. coli-Wirtszelle, die – ansonsten identisch – nicht mit der ersten DNA-Sequenz transformiert ist.
Transformierte E. coli-Wirtszelle nach Anspruch 23, worin das rekombinante Protein E. coli-Tryptophan-Synthase alpha, -Tryptophan-Synthase beta, bovines Somatotropin, Aalwachstumshormon, E. coli-1-Acyl-sn-glycerin-3-phosphat-acyltransferase, humaner Granulocyten-Kolonie-stimulierender Faktor, bovines Fettsäure-Bindungsprotein, bovines Cytochrom P450, Methanothermus fervidus histonea, humanes Interleukin-5, humanes Parathyroidhormon, humanes gamma-Interferon, E. coli-Threonin-deaminase oder E. coli-TolQ-Membran-Protein ist.
Transformierte E. coli nach Anspruch 24, worin das rekombinante Protein humaner Granulozyten-Kolonien-stimulierender Faktor, bovines Somatotropin, humanes gamma-Interferon oder humanes Interleukin-5 ist.
Transformierte E. coli-Wirtszelle, welche umfasst: a. eine erste exprimierbare DNA-Sequenz, die für ein E. coli-Peptid-Deformylase-Enzym codiert, das mit einem in E. coli funktionellen Promotor funktionell verknüpft ist; und b. eine zweite exprimierbare DNA-Sequenz, die für bovines Somatotripin codiert, welches mit einem in E. coli funktionellen Promotor funktionell verknüpft ist; wobei die transformierte E. coli-Wirtszelle bovines Somatotropin erzeugen kann, das weniger formyliertes Methionin enthält als jenes, das von einer transformierten E. coli-Wirtszelle erzeugt ist, die – ansonsten identisch – nicht mit der ersten DNA-Sequenz transformiert ist.
Transformierte E. coli-Wirtszelle nach Anspruch 26, worin (i) die erste exprimierbare DNA-Sequenz auf einem DNA-Molekül vorliegt, das mindestens ein Marker-Gen aufweist, (ii) die zweite exprimierbare DNA-Sequenz auf einem DNA-Molekül vorliegt, das mindestens ein Marker-Gen aufweist, und (iii) die transformierte E. coli-Wirtszelle ein von mindestens einem der Marker-Gene vermitteltes Marker-Merkmal hat.
Transformierte E. coli-Wirtszelle nach Anspruch 26, worin das Peptid-Deformylase-Enzym und das bovine Somatotropin mit demselben Promotor funktionell verknüpft sind.
DNA-Zusammensetzung, die einer mit dieser DNA-Zusammensetzung transformierten Bakterien-Wirtszelle die Fähigkeit verleiht, rekombinantes Protein zu erzeugen, das eine verringerte N-Formyl-Methionin-Retention aufweist im Vergleich zu jener, die von einer Bakterien-Wirtszelle erzeugt wird, die – ansonsten identisch – nicht mit dieser DNA-Zusammensetzung transformiert ist, welche DNA-Zusammensetzung aufweist: a. eine erste exprimierbare DNA-Sequenz, die für ein Peptid-Deformylase-Enzym codiert, das mit einem in der Bakterien-Wirtszelle funktionellen Promotor funktionell verknüpft ist, und b. eine zweite exprimierbare DNA-Sequenz, die für ein rekombinantes Protein codiert, welches mit einem in der Bakterien-Wirtszelle funktionellen Promotor funktionell verknüpft ist.
DNA-Zusammensetzung, die einer mit dieser DNA-Zusammensetzung transformierten Bakterien-Wirtszelle die Fähigkeit verleiht, bovines Somatotropin zu erzeugen, das eine verringerte N-Formyl-Methionin-Retention aufweist im Vergleich zu jener, die von einer Bakterien-Wirtszelle erzeugt wird, die – ansonsten identisch – nicht mit dieser DNA-Zusammensetzung transformiert ist, welche DNA-Zusammensetzung aufweist: a. eine erste exprimierbare DNA-Sequenz, die für ein Peptid-Deformylase-Enzym codiert, das mit einem in der Bakterien-Wirtszelle funktionellen Promotor funktionell verknüpft ist, und b. eine zweite exprimierbare DNA-Sequenz, die für ein bovines Somatotropin codiert, welches mit einem in der Bakte rien-Wirtszelle funktionellen Promotor funktionell verknüpft ist.
DNA-Zusammensetzung nach Anspruch 29 oder 30, welche umfasst: a. ein erstes DNA-Molekül, das ein erstes Marker-Gen und die erste exprimierbare DNA-Sequenz, funktionell mit einem ersten Promotor verknüpft, aufweist, und b. ein zweites DNA-Molekül, das ein zweites Marker-Gen und die zweite exprimierbare DNA-Sequenz, funktionell mit einem zweiten Promotor verknüpft, aufweist.
DNA-Zusammensetzung nach Anspruch 29 oder 30, welche ein DNA-Molekül aufweist, umfassend a. ein Marker-Gen, b. die erste exprimierbare DNA-Sequenz, die funktionell mit einem ersten Promotor verbunden ist, und c. die zweite exprimierbare DNA-Sequenz, die funktionell mit einem zweiten Promotor verbunden ist.
DNA-Zusammensetzung nach Anspruch 29 oder 30, welche ein DNA-Molekül aufweist, umfassend a. ein Marker-Gen, und b. die erste und die zweite DNA-Sequenz, die mit einem einzigen Promotor funktionell verknüpft sind.