DE69731982T2

DE69731982T2 - Verfahren zur messung der lymphozytenfunktion

Info

Publication number: DE69731982T2
Application number: DE69731982T
Authority: DE
Inventors: L. Marjorie WIER
Original assignee: Biotechnology Transfer Inc
Current assignee: Biotechnology Transfer Inc
Priority date: 1996-03-26
Filing date: 1997-03-24
Publication date: 2005-12-22
Anticipated expiration: 2017-03-25
Also published as: JP2008178421A; EP1019546A1; CA2248792C; JP2000510687A; ATE284974T1; DE69731982D1; AU2543797A; EP1019546A4; US5773232A; CA2248792A1; ES2235231T3; AU724703B2; US6630316B1; JP4127724B2; WO1997036008A1; JP4151986B2; EP1019546B1

Description

Hintergrund der Erfindung
Bereich der Erfindung
Die Erfindung betrifft Verfahren zur Messung der Funktion von Lymphozyten und ihre Antworten auf Mitogene oder spezifische Antigene. Die Verfahren sind zur Messung der Antworten von T-Lymphozyten geeignet, wenn diese eine Subpopulation von Zellen darstellen, und sie sind weiterhin geeignet zur Messung der Funktion von spezifischen Untergruppen von T-Lymphozyten. Jede dieser Subpopulationen oder Untergruppen einer Subpopulation haben charakteristische Determinanten auf ihrer Zelloberfläche. Die Erfindung betrifft weiterhin Testkits zur Durchführung dieser Verfahren. Die erfindungsgemäßen Verfahren erleichtern ein Screening von komplexen biologischen Fluiden, wie Gesamtblut, durch Inkubation einer Probe des Fluids mit einem Mitogen oder Antigen, Abtrennen der interessierenden Untergruppe, z. B. mittels Affinitätsauftrennung und Nachweis des Vorhandenseins einer inneren zellulären Komponente, ATP, die als Ergebnis der Antwort erhöht ist.
Hintergrund der Erfindung
Das Immunsystem spielt eine zentrale Rolle bei der Kontrolle von Infektionserkrankungen und Krebs. Lymphozyten, eine Klasse von weißen Blutzellen, sind entscheidende Zellarten, die für die Aktivitäten des Immunsystems verantwortlich sind. Lymphozyten können in zwei Hauptkategorien unterteilt werden, T-Lymphozyten und B-Lymphozyten. Eine Gesamtbeurteilung der Funktion des Immunsystems und insbesondere der Lymphozyten ist bei einer Beurteilung einer Immundefizienz aufgrund von genetischen Faktoren, einer Infektionserkrankung, wie HIV, von Arzneimitteln nach Transplantation, durch Stress, durch Alterung oder durch Ernährungsmängel wichtig.
Lymphozyten exprimieren Rezeptoren auf ihrer Zelloberfläche, die spezifische Antigene oder Epitope binden. Ein Aussetzen gegenüber einem Antigen führt zu einer Expansion der Lymphozytenpopulation, die gegenüber dem Antigen reaktiv ist.
Die Messung der Antwort des Immunsystems gegenüber einem spezifischen Antigen kann bei der Diagnose von Infektionserkrankungen, einer Hypersensitivität gegenüber bestimmten Mitteln, einer Exposition von immunologisch reaktiven Arzneimitteln oder bei der Antwort bei Vakzinierung nützlich sein.
Die Funktion der B-Zellen oder ihre Antwort auf ein spezifisches Antigen kann durch Messen des Niveaus eines spezifischen Antikörpers in Körperflüssigkeiten, wie Blut, Speichel oder Urin, bewertet werden. Die Funktion der T-Lymphozyten oder ihre Antwort auf spezifische Antigene ist schwieriger zu messen. Die Messung der Funktion von T-Lymphozyten oder T-Zellen ist aufgrund einer Vielzahl von Faktoren schwierig. Erstens, gibt es verschiedene Unterarten von T-Zellen mit unterschiedlichen Funktionen. Diese Untergruppen werden teilweise durch die Expression von charakteristischen Zelloberflächenmarkern und teilweise durch eine Vielzahl von funktionalen Assays einschließlich der Messung von Zytokinen klassifiziert. Zweitens, T-Zellen antworten auf Antigene nur, wenn diese durch andere Zellen in Verbindung mit den Haupthistokompatibilitäts-Antigenen auf der Oberfläche der präsentierenden Zelle präsentiert werden. Drittens, viele der Funktionen der T-Zellen hängen vom Zell-Zell-Kontakt mit Effektorzellen ab, oder die Funktionen sind kaum lokalisiert. Die derzeitigen Verfahren zur Messung der Immunfunktion sind langwierig, zeitaufreibend und kaum an die Ausstattung der klinischen Labore angepasst.
Verfahren, wie sie derzeit zur Messung der Immunfunktion verwendet werden, schließen ein: Verfahren basierend auf dem Zählen der Anzahl von T-Zellen oder der verschiedenen Untergruppen; Verfahren basierend auf der Messung der Proliferation der Lymphozyten, Verfahren basierend auf der Messung der cytotoxischen Aktivität oder der Sekretion von Zytokinen und Verfahren, die in-vivo benutzt werden, wie Hauttests und adoptiver Transfer. Diese Verfahren sind in der Literatur ausführlich beschrieben (siehe z. B. Groeneveld et al., Journal of the International Federation of Clinical Chemistry, 6: 84–94; 1994; Clough and Roth, JAVMA 206: 1208–1216, 1995).
Die in den klinischen Laboratorien hauptsächlich verwendeten Verfahren basieren auf dem Zählen der Anzahl der T-Zellen oder deren Untergruppen. Eine Vielzahl von Techniken wurden beschrieben einschließlich der Immunfluorenszenzmikroskopie, der Immunzytochemie, der Enzym-Immunoassays und der Durchflusszytometrie. Insbesondere die Durchflusszytometrie wird in Einrichtungen der klinischen Laboratorien verbreitet verwendet. Die Durchflusszytometrie ist insbesondere zur Messung von interessierenden Untergruppen innerhalb einer komplexen Population von Zellen nützlich. Zum Beispiel beschreibt das U.S.-Patent Nr. 4,727,020 von Recktenwald die Verwendung von zwei Fluoreszenzkanälen, um Zellen in einer Subpopulation, die spezifisch mit zwei verschiedenen Immunfluoreszenzmitteln markiert sind, nachzuweisen. U.S.-Patent Nr. 4,284,412 von Hansen et al. beschreibt die Verwendung von Fluoreszenzkanälen, um das Vorwärts- und das Seitwärts-Streulicht der Zellen verschiedener Subpopulationen des Bluts zu messen. Die größten Nachteile der Durchflusszytometrie sind, dass sie eine komplexe und teure Ausrüstung erfordern, jede Probe muss einzeln gemessen und analysiert werden, und die Ergebnisse benötigen einer Interpretation und sind häufig nicht wiederholbar. Diese Nachteile sind insbesondere akut in klinischen Laboren, die täglich eine Vielzahl von Patientenproben verarbeiten müssen und wo die Notwendigkeit von konsistenten und zuverlässigen Ergebnissen extrem wichtig ist.
Die U.S.-Patente 5,385,822 von Melnicoff et al. und 5,374,531 von Jensen offenbaren alternative Verfahren in der Durchflusszytometrie zur Zählung der Anzahl von Lymphozyten oder einer Untergruppe von Lymphozyten innerhalb einer Mischpopulation von Zellen. Die in diesen Patenten beschriebenen Verfahren beinhalten ein Koppeln einer nachweisbaren Reportersubstanz an eine Biomembran oder die Aufnahme einer Reportersubstanz in eine Zelle, ein anschließendes Abtrennen der interessierenden Untergruppe oder Population und Nachweis der Reportersubstanz. Diese Verfahren benutzen die Affinitätstrennung, um interessierende Populationen aus einer komplexen Zellmischung abzutrennen. Diese Technik erlaubt Verbesserungen gegenüber der Durchflusszytometrie, basieren aber nach wie vor auf Zellzähltechniken.
Die Hauptschwierigkeit mit all diesen Zellzähltechniken ist die, dass sie nicht die Funktion der spezifischen Zellen oder ihrer Antworten gegenüber spezifischen Antigenen oder Mitogene messen. Die Zellen, die auf die Mitogene oder Antigene antworten, haben einzigartige Zelloberflächenmarker, die nur auf den antwortenden Zellen gefunden werden. Verfahren zum Zählen der Anzahl der Zellen, die diese Marker aufzeigen, wurden beschrieben. Diese Verfahren sind aber relativ unempfindlich aufgrund der Tatsache, dass die antwortenden Zellen im Allgemeinen eine kleine Fraktion der Gesamtpopulation darstellen. Diese Verfahren sind zeitaufwendig und nur wenig reproduzierbar.
Die direkte Messung von Antworten von Lymphozyten schließt Lymphozyten-Proliferationsassays, Zytotoxizitätsassays und die Messung von Zytokinen ein. Im Allgemeinen benötigen diese Verfahren ein Abtrennen der weißen Zellen von der ursprünglichen Probe, gefolgt von einem Inkubieren mit dem Antigen oder Mitogen. Die Messung der Funktion der spezifischen Untergruppen der Lymphozyten erfordert eine intensive Bearbeitung vor dem Assay. Die Notwendigkeit von Antigenpräsentierenden Zellen bedeutet dann, dass zusätzliche Zellen zu der Kultur zurück gegeben werden müssen. Lymphoproliferations-Assays basieren auf ein Aufteilen der antwortenden Zellen und werden üblicherweise mit radioaktiven Isotopen durchgeführt. Da sie die Teilung einer kleinen Zellpopulation bewerten und Gewebekulturen notwendig machen, dauern diese Assays 3 bis 10 Tage und unterliegen signifikanten Schwankungen aufgrund der speziellen Technik und der im Assay verwendeten Reagenzien. Zytotoxizitätsassays benötigen ebenfalls eine umfangreiche Bearbeitung der Zellen und sind in ähnlicher Weise in Abhängigkeit von den speziellen benutzten Bedingungen stark variabel. Zytokinassays können ebenfalls durchgeführt werden, sie benötigen aber viele Schritte und ein Abtrennen der interessierenden Untergruppe vor Stimulation der Zellen. U.S.-Patent 5,344,755 von McMicheals beschreibt eine Modifikation der Zytotoxizitätsassays basierend auf einer anfänglichen immunmagnetischen Abtrennung der T-Lymphozyten, dieses Verfahren benötigt aber nach wie vor eine umfangreiche Bearbeitung der Effektorzellen. U.S.-Patent Nr. 5,344,755 stellt ein Beispiel der Verwendung von Zytokinmessungen, zur Bewertung des Immunstatus in HIV-positiven Patienten bereit, dieses ist aber zeitaufwendig und erfordert eine Vielzahl von Schritten. Diese Verfahren erfordern ein Abtrennen von kritischen Zellarten, lange Inkubationszeiten und in einigen Fällen die Verwendung von radioaktiven Substanzen. Aus diesen Gründen sind diese Verfahren nicht zur klinischen Anwendung geeignet.
Die Abtrennung der Zellen mittels Affinität unter Verwendung von proteinbeschichteten Magnetpartikeln oder anderen Arten von festen Trägern, wie Polystyrolpartikeln, ist bekannt und wird als ein Teil der verschiedenen, oben genannten Verfahren verwendet, siehe U.S.-Patent Nr. 5,374,531, 5,385,822, 5,344,755. Verschiedene Verfahren zum Sortieren biologischer Populationen mit Hilfe der Affinitätstrennung mit festen Trägern wurden in der Patentliteratur und anderswo beschrieben. Siehe zum Beispiel U.S.-Patent Nr. 3,970,518, 4,710,472, 4,677,067, 4,666,595, 4,230,685, 4,219,411, 4,157,323, siehe auch E. T. Menz et al., Am. Biotech. Lab. (1986); J. S. Kemshead et al., Molec. Cell. Biochem., 67: 11–18 (1985); T. Leivestag et al., Tissue Antigens, 28: 46–52 (1986); und J. S. Bern nan et al., J. Immunol., 138: 2100–03 (1987). Bei der Durchführung solcher Verfahren ist typischerweise ein bindendes Molekül (z. B. ein monoklonaler Antikörper) an die festen Träger, wie Magnetpartikel oder Plastikkügelchen konjugiert und diese werden zu der zu testenden Probe unter Bedingungen, die ein Binden einer charakteristischen Determinante an das interessierende Analyt bewirken, hinzugefügt. Die dann mit dem festen Träger komplexierten Zellen werden von den nicht-komplexierten Zellen in dem sie einem magnetischen Feld ausgesetzt werden oder mit anderen Verfahren in Abhängigkeit von der Art des festen Trägers abgetrennt. Die Verwendung dieser Technik zur Abtrennung bestimmter Subpopulationen von Lymphozyten aus Knochenmarkzellen vor der Transplantation und zur Eliminierung von post-Transplantat graft-versus-host Reaktion wurde berichtet. Siehe A. Butturini et al., Prog. Bone Marrow Transpl. 4: 13–22 (1987). Andere beschriebene Verwendungen dieser Technologie schließen das Abtrennen von Tumorzellen (siehe: Kemshead et al., B. J. Cancer 54: 771–78 (1986)) und das Abtrennen von Lymphozyten Subpopulationen zur anschließenden funktionalen Untersuchung ein.
Die Probleme, die auftreten, wenn die Lymphozyten zuerst mittels magnetischer oder anderer Festphasen Affinitätstechnik oder Gradientenzentrifugationsabtrennung, wie in „Journal of Immun. Meth., 72, 1984, 127–32, Ishizaka, A. „Evaluation of the Proliferative Response of Lymphocyzes by Measurement of Intracellular ATP", und anschließender Verwendung für funktionelle Assays, auftreten, sind, dass die Interaktion des Lymphozyts mit dem bindenden Molekül funktionale Veränderungen in dem Lymphozyt induzieren kann, die spätere Veränderungen, die gemessen werden sollen, verschleiern. Weiterhin können die zur Antwort der Z-Zellen notwendigen akzessorischen Zellen nicht länger vorhanden sein, insbesondere wenn eine spezifische Untergruppe an Zellen isoliert wird. Weiterhin werden die isolierten Zellen aus der natürlichen Umgebung entfernt, und es ist schwierig, die Stabilität der Probe, die zur weiteren Zellkultivierung notwendig ist, aufrechtzuerhalten.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt ein leichtes, zuverlässiges und relativ schnelles Verfahren zur Analyse der Funktion von verschiedenen Gruppen und Untergruppen von Lymphozyten bereit. In einer bevorzugten Ausführungsform beinhaltet das erfindungsgemäße Verfahren ein Inkubieren der Zellpopulation mit einem Mitogen oder Antigen, Abtrennen der gewünschten Untergruppe von Zellen aufgrund der Interaktion mit einem spezifischen bindenden Reagenz, das an eine Festphase angeheftet ist, mit einer Zelloberflächendeterminante, die sich auf der interessierenden Untergruppe von Zellen befindet, Lysieren der abgetrennten Zellen und Messen einer intrazellulären Komponente, die erhöht ist, wenn die Zellen auf den Stimulus antworten. Es können auch andere induzierende Mittel neben Mitogenen und Antigenen am Anfang der Durchführung der Erfindung verwendet werden. Geeignete induzierende Mittel können Zytokine und Wachstumsfaktoren, Allergene, Allo-Antigene, Peptide oder niedermolekulare Verbindungen, konjugiert an einem Proteinträger, wie Kohlenhydrate (Polysaccharide), Lipide und Nukleinsäuren sein.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird die funktionelle Aktivität einer Gruppe oder Untergruppe von Lymphozyten, die sich durch eine charakteristische Zelloberflächen-Determinante unterscheiden und die sich in einer Mischzellpopulation befindet, gemessen durch: Aussetzen der Probe einem Mitogen oder Antigen oder anderen induzierenden Mittels, Inkubieren der Probe für einen Zeitraum, Binden der Gruppe oder Untergruppe von Lymphozyten an einen festen Träger durch die Interaktion der Zelloberflächendeterminante und einer spezifisch bindenden Substanz, die mit dem festen Träger verbunden ist, Waschen der Zellen, um alle nicht gebundenen Zellen zu entfernen, genauso wie mögliche störende Substanzen im Medium, Lysieren der Zellen und Nachweis von ATP in der Lösung. Die erhaltenen Ergebnisse können gegen einen bekannten Standard verglichen werden. Alternativ kann die Probe in zwei oder mehr Teile geteilt werden, wobei mindestens einer der Teile ohne Zugabe irgendeiner Stimulanz inkubiert wird, während der zweite Teil mit Zugabe eines Antigens oder Mitogens oder anderen induzierenden Mitteln inkubiert wird.
Ein Aspekt der Erfindung ist die Bestimmung der Antwort von Lymphozyten gegenüber einem Mitogen. In diesem Falle ist die Antwort einer Gruppe von Lymphozyten gegenüber einem Mitogen ein allgemeines Maß für die Immunfunktion. Diese Anwendung ist insbesondere signifikant bei der Messung der Wirkung von immunsuppressiven Arzneimitteln oder Mitteln bedeutend. In diesem Falle kann die Empfindlichkeit (responsiveness) einer gesamten Lymphozytengruppe, wie der T-Lymphozyten bestimmt werden. Alternativ kann die Wirkung eines Virus, wie HIV, durch Untersuchung der Antwort auf ein Mitogen auf eine Untergruppe von T-Lymphozyten, die CD4 als Zelloberflächendeterminante exprimieren, bewertet werden.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist die Bestimmung der Antwort von Lymphozyten auf Antigene, die infektiöse Mittel, Arzneimittel, Chemikalien, Auto-Antigene oder Tumorantigene einschließen können. Dieser Aspekt der Erfindung ist insbesondere bei der Kontrolle eines Aussetzens eines Individuums einer infektiösen Erkrankung oder einem Mittel oder bei der Diagnose der Hypersensitivität, Autoimmunerkrankung oder Krebs wichtig.
Dieser Aspekt der Erfindung ist weiterhin bei der Überwachung der Wirksamkeit von Vakzinen und bei der Beurteilung der Immuntoxizität von Chemikalien, Arzneimitteln und industriellen Verbindungen nützlich.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist der, dass die Antwort von T-Lymphozyten von verschiedenen Untergruppen einschließlich Untergruppen, die sich aufgrund der Funktion oder der Differenzierung unterscheiden, gegenüber einem Mitogen oder Antigen aufgrund der Expression von verschiedenen Determinanten, die spezifisch für eine Funktion, für die Differenzierung oder als Aktivierungsmarker auf der Zelloberfläche sich befinden, bewertet werden kann. In diesem Aspekt der Erfindung wird ein Antigen zu einer Probe gegeben und über einen Zeitraum inkubiert. Nach der Inkubation wird die interessierende Untergruppe an Zellen durch Binden der Zellen an einen festen Träger über eine Determinante auf der Zelloberfläche isoliert. Die Zellen werden gewaschen und lysiert und das Niveau an einer intrazellulären Komponente, die sich als Ergebnis der Aktivierung erhöht, wird gemessen.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist aufgrund der Messung einer intrazellulären Komponente, dessen Niveau aufgrund der Lymphozytenexposition gegenüber einem Mitogen oder Antigen sich schnell erhöht, ATP, NADP oder PCNA, hochsensitiv. In einer vorteilhaften Ausführungsform wird das Niveau an ATP unter Zuhilfenahme der Biolumineszenzreaktion von Luziferin : Luziferase gemessen. Die Biolumineszenzmessung von ATP ist ein hochsensitives Maß.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist der, dass die für das Verfahren notwendige Gesamtzeit im Allgemeinen zwischen 6 bis 72 Stunden liegt und typischerweise 18 bis 24 Stunden beträgt. Der relativ kurze Zeitraum ist ein Vorteil im Vergleich zu den derzeitigen Verfahren, die bis zum Abschluss 3 bis 10 Tage brauchen.
Testkits werden zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens bereitgestellt. Die Testkits enthalten typischerweise das Antigen oder Mitogen (oder ein anderes induzierendes Mittel), die feste Phase mit geeigneten bindenden Substanzen, die zum Nachweis der ATP-Niveaus notwendigen Reagenzien, geeignete Verdünnungs- und Waschlösungen, Standards oder Instruktionen zu deren Herstellung und gegebenenfalls anderes Zubehör, wie Teströhrchen, magnetische Abtrenner, Wascher und Transferpipetten, die bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens nützlich sind.
Kurze Beschreibung der Abbildungen
Die vorgenannten und weiteren Ziele, Aspekte und Vorteile werden durch die folgende detaillierte Beschreibung von bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung unter Bezugnahme auf die Abbildungen, deutlicher. Diese sind:
1 ist ein Säulendiagramm, das die relativen Lichteinheiten, die von den Lymphozyten, die mit verschiedenen Mitogenen und Antigenen, wie in Beispiel 2 dargestellt, stimuliert wurden, freigesetzt werden, und die
2 ist eine Darstellung mit drei Abbildungen, die die PHA-Stimulation von T-Lymphozyten getrennt über CD4, CD69 oder CD3, aufzeigt.
Ausführliche Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt sensitive und effiziente Verfahren zur Messung der Empfindlichkeit einer Gruppe oder Untergruppe von Lymphozyten (z. B. T-Zellen oder 25 B-Zellen), die sich durch einige charakteristische Determinanten, die auf der Zelloberfläche exprimiert werden, innerhalb einer Mischzellpopulation unterscheiden. Insbesondere betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Messung der Antwort von Lymphozyten auf induzierende Mittel einschließlich Mitogene oder Antigene, genauso wie auf Zytokine und Wachstumsfaktoren, Allergene, Allo-Antigene, Peptide oder niedermolekulare Verbindungen, konjugiert an einem Proteinträger, wie Kohlenhydrate (Polysaccharide), Lipide und Nukleinsäuren.
Die vorliegende Erfindung überwindet die Probleme des Standes der Technik durch Abtrennen der T-Zellen, nachdem die Zellprobe dem Antigen ausgesetzt wurde und in einem Zeitrahmen, bei dem die Interaktion des Lymphozyten mit dem bindenden Molekül auf dem Kügelchen nicht die Ergebnisse beeinflussen.
Ein zweiter und entscheidender Aspekt der Erfindung beinhaltet das Messen der ATP-Niveaus in den Zellen nach Abtrennung der interessierenden Untergruppe. Es ist bekannt, dass die ATP-Niveaus für die Stoffwechselaktivität indikativ sind. Siehe hier z. B. Kangas et al., Med. Biol. 62: 338–43 (1984) und Lundin et al. Meth. Enzymol. 133: 27–42. Die Messung der ATP-Niveaus wurden zu Untersuchungen von chemotherapeutischen Arzneimitteln und anderen Mitteln auf Zelllinien verwendet und wurde verwendet, um die Zunahme der Biomasse und der Zellzahl zu überwachen. Die ATP-Niveaus können sehr sensitiv unter Verwendung der Biolumineszenzreaktion der Glühwürmchen Luciferase mit Luciferin gemessen werden, siehe z. B. Leach und Webster, Meth. Enzymol. 13~: 51–70, (1986). Eine Vielzahl von Verfahren zur Untersuchung der ATP-Niveaus in Bakterien oder in somatischen Zellen wurden berichtet. Siehe z. B. U.S.-Patent Nr. 3,690,832; 5,283,179; 4,144,134; 4,283,490 und 4,303,752. Was bisher nicht im Stand der Technik erkannt wurde, ist, dass ein Ergebnis der Antwort von T-Zellen auf ein induzierendes Mittel, wie auf ein Mitogen oder Antigen, sich die Stoffwechselaktivität der antwortenden Zelle signifikant erhöht und dass diese Erhöhung in einer signifikanten Erhöhung der ATP-Niveaus widergespiegelt wird. Weiterhin können kleine Veränderungen der ATP-Niveaus oder Veränderungen der ATP-Niveaus in einer kleinen Zellzahl aufgrund der Sensitivität des Luciferin : Luciferase-Systems gemessen werden.
Die Erfindung richtet sich auf ein derzeit vorhandenes Hauptproblem zur Verbesserung von Verfahren zur Messung der Empfindlichkeit von T-Lymphozyten auf Mitogene und Antigene, d. h. der T-Zell-Funktion. Diese Verfahren zeigen vergleichbare oder größere Empfindlichkeit als bisher zur Verfügung stehende Verfahren auf. Diese Verfahren erlauben, dass der Benutzer viele Proben in einer relativ kurzen Zeit analysieren kann und eliminiert die Notwendigkeit einer teuren Ausrüstung und für hoch qualifiziertes Personal zur Durchführung des Verfahrens und verwendet keine radioaktiven Materialien.
Die erfindungsgemäßen Verfahren können zusätzlich oder anstelle von Verfahren und Tests, wie sie in den klinischen Laboratorien durchgeführt werden, zur Bestimmung der Zellzahl von Lymphozyten in verschiedenen Subpopulationen verwendet werden. Die hier beschriebenen Verfahren berücksichtigen die notwendige Sensitivität der Assays, die wesentlich länger brauchen mit dem verkürzten Zeitrahmen von Zellzählassays. Die Verwendung von Standards und die Bereitstellung von Testkits, die auf diese Verfahren basieren, und die alle notwendigen Reagenzien beinhalten, führen zu einer erhöhten Reproduzierbarkeit und Konsistenz, die für in den klinischen Laboratorien durchgeführten Tests notwendig sind.
Die erfindungsgemäßen Verfahren haben verschiedene Vorteile über die derzeit bestehenden Verfahren. Die notwendige Zeit einer Antwort ist wesentlich kürzer als bei anderen Assays. Die Bereitstellung von allen Materialien in einem Testkit, die für den Assay notwendig sind und die Einfachheit der Art der Messung führen zu einer Konsistenz in den Ergebnissen von unterschiedlichen Laboren. Weiterhin können eine Vielzahl von Proben gleichzeitig untersucht werden. Die Verfahren sind einfach, schnell, sensitiv und mit den Ausstattungen der klinischen Laboratorien durchführbar.
Induzierende Mittel
Im Zusammenhang mit dieser Erfindung sind induzierende Mittel Substanzen, die mit Lymphozyten interagieren, so dass das Ergebnis der Interaktion eine Veränderung im Zustand der Zelle ist. Insbesondere beziehen sich induzierende Mittel auf Substanzen, die dafür Sorgen, dass ruhende Lymphozyten aktiviert werden und die eine funktionelle Aktivitäten der Zelle induzieren können. Allgemein gesprochen fallen die induzierenden Mittel in zwei Klassen: (i) Mitogene sind induzierende Mittel, die mit allen Lymphozyten einer bestimmten Untergruppe agieren und eine Aktivierung gefolgt von einer Proliferation der antwortenden Zelle induzieren und (ii) Antigene, die durch spezifische Rezeptoren auf einer begrenzten Untergruppen von Zellen interagieren. Es können aber auch andere Substanzen als induzierende Mittel verwendet, einschließlich Zytokine und Wachstumfaktoren, Allergene, Allo-Antigene, Peptide oder niedermolekulargewichtige Verbindungen, konjugiert an Proteinträger, wie Kohlenhydrate (Polysaccharide), Lipide und Nukleinsäuren.
Mitogene für unterschiedliche Populationen von Lymphozyten sind bekannt und schließen Lektine, Antikörper, die gegen bestimmte Zelloberflächenrezeptoren der Lymphozyten, wie CD3 bei T-Lymphozyten oder CD2 für B-Lymphozyten, gerichtet sind, Wachstumsfaktoren und Lymphokine, Phorbolester und andere biochemische Substanzen, die dem Fachmann bekannt sind. Bevorzugte Mitogene schließen Phytohemagluttinin (PHA), Con A und einen monoklonalen Antikörper gegen CD3 ein.
Die Antigene reagieren mit einer kleineren Untergruppe von Lymphozyten über die spezifischen Rezeptoren auf der Zelloberfläche. Jeder Lymphozyt hat auf seiner Zelloberfläche einen Rezeptor für ein spezifisches Antigen oder Molekül. Bei B-Lymphozyten ist der Zelloberflächenrezeptor ein membrangebundener Antikörper. Für T-Lymphozyten ist dies der Zelloberflächenrezeptor der T-Zellrezeptor, der Antigen, das im Zusammenhang mit dem Haupthistokompatibilitätsmolekül auf der Oberfläche einer anderen Zelle präsentiert wird, erkennt. Die Antwort des Immunsystems auf spezifische fremde Eindringlinge basiert auf der Erkennung von Antigenen durch die Rezeptoren auf der Zelloberfläche dieser Zellen und die daraus resultierende funktionale Aktivierung, die als Ergebnis dieser Interaktion eintritt. Im Allgemeinen sind die Antigene, die an diese Zelloberflächenrezeptoren gebunden sind, kleine Teile von größeren Molekülen und können Teile von infektiösen Mitteln, wie Viren, Bakterien, Pilze und dergleichen, Arzneimittel, organische Chemikalien und anorganische Chemikalien, wie Silikon, Metalle, wie Beryllium und Proteine, wie Tumorzellproteine oder Proteine, die von implantierten oder transplantierten Organe stammen. Vorteilhafte Antigene schließen ein: gp120 Protein oder Peptide von gp120 von HIV Hüll-Glykoprotein, die äußeren Oberflächenproteine von Bakterien, wie OSPA, B oder C von Borrelia burgdorferi, SiO₂, zerstörte inaktivierte Q-Fieberzellen, PPD oder Tetanus toxoid.
Ziellymphozyten
Die Untergruppe an interessierenden Zellen sind in Testproben oder Stücken verschiedenen Ursprungs einschließlich biologischen Fluids, wie Gesamtblut, Urin, Stuhl, Speichel, cerebrospinaler Flüssigkeit, Fruchtwasser, Gewebeextrakten, Lavage, Tumorbiopsien, Transplantatbiopsien vorhanden, oder sie können aus einer Kultur stammen. Interessierende Zellen sind von humanem oder tierischem Ursprungs. Die Proben können auch Proben von verschiedenem biologischen Ursprungs, die teilweise mittels Dichtegradientenzentrifugation aufgereinigt wurden oder durch andere Abtrennungsverfahren, die zur Isolierung teilweiser aufgereinigter Zellproben verwendet werden, sein.
Die Erfindung kann mit Langzeitzelllinien, wie MDLT-4, HL-60, TF-1, NFS60 und L-929 durchgeführt werden. Diese Zellen, genauso wie solche aus biologischen Fluiden, können aus gefrorenen Vorräten stammen. In einer bevorzugten Ausführungsform stellt die Verwendung von eingefroren Lymphozyten einen Mechanismus zum Transport von klinischen oder experimentellen Proben ohne Degradation dar.
Bei der Analyse einer Probe, die eine interessierende Zelluntergruppe enthält, mit dem erfindungsgemäßen Verfahren, wird die Zellpopulation in einem natürlichen biologischen Fluid oder in einem geeigneten biologischen oder synthetischem Medium suspendiert, anfänglich einem Mitogen oder einem spezifischen Antigen oder anderen interessierenden induzierenden Mittel ausgesetzt. Es ist ein besonderer Aspekt der Erfindung, dass das Aussetzen für einen relativ kurzen Zeitraum geschieht. In Abhängigkeit von der Art des zu untersuchenden Antigens oder Mitogens ist der Zeitraum der Exposition 6 bis 72 Stunden oder länger, üblicherweise ist sie aber 24 Stunden.
Von besonderem Interesse für diagnostische, therapeutische und Forschungszwecke sind Messungen der Antworten von T-Lymphozyten und Lymphozytenuntergruppen, einschließlich die hauptfunktionellen Untergruppen, wie T-Helferzellen und suppressor/zytotoxische Zellen auf Mitogene oder auf spezifische Antigene. Die Quantifizierung der Empfindlichkeit einer spezifischen Untergruppe von T-Lymphozyten ist bei bestimmten physiologischen Bedingungen wichtig. Z. B. verlieren Individuen, die mit dem humanen Immundefizienz Virus infiziert sind, die Antwortfähigkeit auf Mitogene als auch Antigene in der CD4-Zellpopulation vor dem Verlust einer Aktivität in anderen Zelluntergruppen. In ähnlicher Weise ist die Empfindlichkeit von Subklassen von T-Zellen auf Mitogenen wichtig bei der Überwachung von Individuen, die aufgrund von chronischem Stress, Chemotherapie oder Arzneimittelbehandlung potentiell immunsupprimiert sind. Die Quantifizierung der Empfindlichkeit einer Untergruppe von Lymphozyten auf ein spezifisches Antigen ist wichtig bei der Bestimmung der Exposition eines Individuums gegenüber dem infektiösen Mitteln oder einem Arzneimittel oder einer Verbindung oder zur Bestimmung der Hypersensitivitätsreaktion auf ein Arzneimittel oder einer Chemikalie. Neben den funktionellen Hauptuntergruppen schließen andere interessierende Untergruppen von Zellen Zellen in unterschiedlichen Stufen der Differenzierung oder Zellen zu unterschiedlichen Zeitpunkten nach anfänglicher Interaktion mit einem Mitogen oder Antigen, ein.
Charakteristische Determinanten
Die interessierenden funktionellen Untergruppen unterscheiden sich in der Expression von charakteristischen Zelloberflächendeterminanten. Weiterhin unterscheiden sich Zellen der gleichen Untergruppe aber in verschiedenen Stadien der Differenzierung durch die Expression von charakteristischen Determinanten auf der Zelloberfläche. Zellen mit unterschiedlicher funktionaler Aktivität oder zu unterschiedlichen Zeitpunkten nach anfänglicher Interaktion mit einem Mitogen oder Antigen können also unterschiedliche Zelloberflächendeterminanten exprimieren.
In dieser Erfindung bezeichnet charakteristische Determinante ein Element, das die Art von irgendwas identifiziert oder bestimmt. Wenn es unter Bezug auf die erfindungsgemäßen Verfahren verwendet wird, bedeutet „Determinante" ein Molekül, das auf der Zelloberfläche exprimiert wird, das in einer gewissen Art und Weise charakteristisch für diese Zelle ist. Zell-assoziierende Determinanten schließen z. B. Komponenten der Zellmembran, wie membrangebundene Proteine oder Glykoproteine oder Lipide oder Glykolipide ein und schließen Zelloberflächenantigene von sowohl der Wirtszelle als auch viralen Ursprungs ein, sowie Histokompatibilitätsantigene oder Membranrezeptoren.
Eine Determinante ist ein Teil einer Zelle, der mit einer spezifisch bindenden Substanz interagiert. Die Zellen werden mit Hilfe der spezifischen Interaktion zwischen den Determinanten auf der Zelloberfläche und den spezifischen bindenden Substanzen, die an Festphasen angeheftet sind, abgetrennt. Das Verfahren wird im Folgenden auch als „Affinitätstrennung" bezeichnet. Spezifische bindende Substanzen, die mit Zelloberflächendeterminanten interagieren können, schließen Antikörper ein, die die Determinanten erkennen können.
Die Erfindung kann als ein Verfahren zur Messung von jeden immunologisch aktiven Zellen, die sich durch irgendwelche charakteristischen Oberflächendeterminanten unterscheiden, gemessen werden. Die Erfindung kann z. B. verwendet werden zur Messung von Krebszellen, Thymozyten, dendritischen Zellen, Langhans-Zellen, NK-Zellen, Monozyten, Myeloid-Zellen, Plättchen, Eosinophilen, Basophilen, Megakaryozyten, Granulozyten, Makrophagen, Reed Sternberg-Zellen, Vorläufer B-Zellen, Panmyeloid, hematopoietischen Vorläuferzellen, Endothelzellen, Plasmazellen, Panleukozyten, proliferierende Zellen, Pan B einschließlich Vorläufern, Burketts Lymphom-Zellen, zirkulierenden und interdigitierenden retikulären dendritischen Zellen, Neutrophilen, Mucosa assoziierenden T-Lymphozyten und Choriokarzinom-Zellen.
Bindende Substanzen
Das Bestimmen des Vorhandenseins oder der Menge an Zelluntergruppen gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren wird durch die selektive Interaktion zwischen den Zellen der interessierenden Untergruppe und einer spezifisch bindenden Substanz erzielt. Die spezifisch bindende Substanz, die bei der Durchführung der Erfindung verwendet wird, muss ein selektives Erkennen von charakteristischen zellulären Determinanten aufzeigen. Bei der Analyse einer Mischzellpopulation auf eine Subpopulation und/oder Untergruppe mit einem charakteristischen Zelloberflächenantigen kann z. B. die spezifische bindende Substanz der komplementäre Antikörper sein, der immunspezifisch das interessierende Antigen erkennt. Aufgrund dieser selektiven Erkennung ist die spezifisch bindende Substanz in der Lage, mit der interessierenden Untergruppe zu interagieren und daran zu binden, um Komplexe oder Aggregate zu bilden, die physikalisch oder chemisch aus dem Testmedium oder von anderen Komponenten darin, die nicht von Interesse sind, abzutrennen. In einer bevorzugten Ausführungsform werden Blutproben, die T-Lymphozyten und Monozyten enthalten, die auf das Oberflächenantigen CD4 tragen, einer spezifisch bindenden Substanz umfassend einen CD4 monoklonalen Antikörper ausgesetzt.
Der Ausdruck „Antikörper", wie er hierin verwendet wird, schließt monoklonale oder polyklonale Immunglobuline und immunreaktive Immunglobulinfragmente ein. Andere Arten von spezifisch bindenden Substanzen schließen Lektine, Hormone, Zytokine, Rezeptorliganden usw. ein.
Die monoklonalen Antikörper gegen bestimmte Zelloberflächendeterminanten sind von besonderer Wichtigkeit bei dieser Ausführungsform der Erfindung. Lymphozyten z. B., die eine Subpopulation des Gesamtbluts umfassen, können durch einen monoklonalen Antikörper, der gegen ein Leukozytenoberflächenantigen gerichtet ist, selektioniert werden. Das CD45-Antigen wird einheitlich auf allen Lymphozyten exprimiert; allerdings wird das CD45-Antigen auch auf Monozyten exprimiert. Wenn daher eine selektive Bindung von Lymphozyten gewünscht wird, ist es notwendig, einen CD45 monoklonalen Antikörper auszuwählen, der signifikant mehr Bindungsstellen pro Zelle bei Lymphozyten aufzeigt als bei Monozyten oder der Lymphozyten mit einer größeren Stärke als Monozyten bindet.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist es wünschenswert nur T-Helferzellen aus der Gesamtblutprobe abzutrennen. Dies wird wie oben beschrieben unter Verwendung von monoklonalen Antikörpern, die gegen T-Zelloberflächenantigene gerichtet sind, wie CD4, erreicht oder es wird erreicht durch Verwendung einer Kombination von Antikörpern, die im Wesentlichen mit T-Helferlymphozyten reagieren. In einer weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsform werden Lymphozyten, die durch Aussetzen gegenüber einem spezifischen Antigen aktiviert wurden mit Hilfe von Antikörpern, gerichtet gegen Antigene, die nur nach Aktivierung auf der Zelloberfläche exprimiert werden, abgetrennt. Diese Antikörper reagieren mit einer oder einer Kombination der folgenden Zelloberflächenantigene, CD25, CD69, CD71, CD45RO oder MHC Klasse 11-Antigene. Die Verwendung dieser Antigene zur Abtrennung führt zu einer signifikanten Amplifikation des Signals beim Assay, da nur die Zellen, die diese Marker exprimieren, auf das Signal des Antigens oder Mitogens geantwortet haben.
Spezifisch bindende Substanzen sind üblicherweise an eine Festphase oder einer unlöslichen Fluid-Phase befestigt, um ein Abtrennen aus dem Testmedium zu erleichtern. Eine Vielzahl von Festträgermaterialien können verwendet werden, z. B. Polystyrol, Nylon oder Agarosekugeln und diese sind dem Fachmann wohl bekannt. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung sind die spezifisch bindenden Substanzen an eine Vielzahl von Magnetkügelchen befestigt, diese umfassen ein ferromagnetisches, paramagnetisches oder diamagnetisches Material. Techniken zum Anheften der spezifisch bindenden Substanz an die Kügelchen sind dem Fachmann bekannt. Geeignete Techniken schließen ein Kreuzvernetzen, ein kovalentes Binden oder eine physikalische Absorption ein. Alternativ wird eine Nichtfestphase, im Wesentlichen die spezifisch bindende Substanz in Verbindung mit einer zweiten oder zusätzlichen spezifisch bindenden Substanz, die in der Lage ist, selektiv mit der primär spezifisch bindenden Substanz zu interagieren und die an einer Festphase befestigt ist, verwendet. Beispielhafte primäre und zusätzliche spezifisch bindende Substanzen, die für diese Zwecke hilfreich sind, sind: löslicher Mausantikörper/Protein A befestigt an einer Festphase; löslicher Mausantikörper/anti-Maus-Immunglobulin aus einer anderen Art und befestigt an einer Festphase; und biotinylierter Antikörper/Avidin, das an einer Festphase befestigt ist.
Wenn die zu untersuchende Probe aus einer Kultur stammt oder durch Dichtegradiententrennung vor dem Abtrennen mit einem festen Träger abgetrennt wurde, ist ein einfaches Abtrennungsverfahren ausreichend, um die Untergruppe der interessierenden Lymphozyten von dem Rest der Zellpopulation abzutrennen. Im Falle von umfassenderen Proben, wie Gesamtblut, ist es notwendig, zeitweise den Komplex zu waschen, um Zellen, die sich unspezifisch verfangen oder gebunden haben, zu entfernen. Eine Vielzahl von Lösungen, z. B. 0,15 M Ammoniumchlorid, 1,0 M Kaliumcarbonat, 0,1 M EDTA, pH 7,2), die spezifisch rote Blutzellen, Plättchen oder andere mögliche Verunreinigungen lysieren, sind dem Fachmann bekannt. Weiterhin können Lösungen, die andere Substanzen, wie Proteine, Zucker oder Salze enthalten oder die spezielle pH-Werte aufweisen, nützlich bei der Reduktion der nicht spezifischen Bindung von anderen Zellarten oder bei der Eliminierung oder bei Lyse von Zellarten, die von den Interessierenden abgetrennt werden sollen (z. B. eine Lösung von Hank's gepufferter Salzlösung enthaltend 10% FKS ist insbesondere nützlich) nützlich sein. Nach dem Abtrennen und einem darauf folgenden Waschen, wenn notwendig, wird das Medium von dem Komplex entfernt.
Lyse
Gefolgt von dem Abtrennen der interessierenden Zellen wird die abgetrennte Zellpopulation durch Zugabe einer Lösung, die Substanzen enthält, welche Lymphozyten lysieren können, lysiert. Eine Vielzahl von solchen Lösungen existiert und diese sind dem Fachmann wohl bekannt. Diese Lösungen schließen destilliertes Wasser, Lösungen enthaltend Detergenzien, wie Triton-X oder NP-40 und gepufferte Lösung, wie HEPES enthaltend 0,1 M Benzalkoniumchlorid, pH 7,4, ein. Es ist wichtig, dass das Material und die ausgewählte Lösung nicht mit dem System zur Messung von ATP interferieren, also kein ATP enthalten und ATP nicht abbauen.
Ein wesentliches Merkmal der Erfindung ist es, dass die Zeit von der Exposition der Probe bis zum Zeitpunkt, bei dem Zellen lysiert werden, gering ist, üblicherweise weniger als 2 Stunden, bevorzugt weniger als 1 Stunde. Dies ist wichtig, da eine Interaktion der Lymphozyten mit vielen Antikörpern gegen Zelloberflächenantigene zu einer Antwort führen kann. Dies stellt ein wesentliches Problem bei Bestimmung der Funktion von spezifischen Zellarten dar, da die Isolierung dieser Zellart eine Zellaktivierung induzieren kann.
Messung der ATP-Niveaus
Nach der Lyse der Zellen wird das Niveau an ATP in der Lösung gemessen. In einer bevorzugten Ausführungsform wird das ATP durch Zugabe einer Lösung, die die Luciferase des Glühwürmchens und Luciferin in Anwesenheit von Magnesiumionen enthält, gemessen. ATP kann weiterhin durch andere Mittel einschließlich immunchemischen oder biochemischen Reaktionssystemen gemessen werden. Die Messung einer intrinsischen Komponente einer Zelle ist wichtig, da es einen zusätzlichen Schritt eliminiert, genauso die intrinsische Variabilität irgendeines Markierungsverfahrens. Erhöhtes ATP wird als ein Marker für eine erhöhte Zellmasse verwendet, ist aber relativ unempfindlich, da alle Zellen der Population ein Grundniveau an ATP aufzeigen. Die vorliegende Erfindung funktioniert, da die Messung von ATP nach einer Abtrennung der interessierenden Zellpopulation gemacht wird.
Kits
Die verschiedenen Reagenzien zusammen mit dem verschiedenen Zubehör, das zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens verwendet wird, einschließlich Medien zur Verdünnung, feste Träger zum immobilisieren der Zellen, Lysereagenzien, Antigene oder Mitogene und Waschpuffer, eine oder mehrere Standards, oder Anweisungen zur Herstellung davon werden in geeigneter Weise in einem Testkit verpackt. Die in dem Testkit vorhandenen Reagenzien können verschiedene Formen aufweisen und können im trockenen Zustand mit geeigneten Verdünnern verpackt vorliegen oder können in einer gebrauchtsfertigen Form bereitgestellt werden.
Gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren sind Kits zur Untersuchung der T-Zellantworten vorgesehen. Insbesondere ein Kit enthaltend Antigene oder Mitogene oder andere induzierende Mittel entweder in flüssiger oder lyophilisierter Form, paramagnetische Kugeln, die mit einem Antikörper zur Isolierung einer vorbestimmten Untergruppe von Zellen, Zellkulturmedien zur Verdünnung der Proben, Waschpuffer zum Waschen der Komplexe und damit verbundene Reagenzien zur Durchführung des Assays.
Die folgenden Beispiele werden dargestellt, um die Erfindung weiter zu beschreiben. Diese Beispiele dienen nur der besseren Darstellung spezifischer Anwendungsmöglichkeiten des erfindungsgemäßen Verfahrens und sollen in keiner Weise die Erfindung beschränken.
Beispiele
Beispiel 1: Nachweis der Empfindlichkeit von CD4 positiven T-Lymphozyten gegenüber einem Mitogen, nützlich zur Messung der Immunfunktionen bei HIV-Infektionen in Antwort auf Stress oder nach Chemotherapie
Periphere mononukleäre Zellen aus dem Blut wurden aus Herkunftsleukozyten (Gulf Coast Blutbank), die ursprünglich aus dem peripheren Blut von normalen Personen durch Gradientenzentrifugation über Ficoll-Hypaque erhalten wurden, isoliert. Die Zellen aus der Leukozytenschicht wurden mittels Zentrifugation in RPMI, das 10 fötales Kälberserum (FKS) enthält, gespült und wurden auf eine Zelldichte von ca. 1 × 10⁵ Zellen/ml mit RPMI mit 5% fötales Kälberserum (FKS) eingestellt. Ein Aliquot der Zellen wurde unstimuliert kultiviert, während ein zweites Aliquot der Zellen mit Phytohemaggluttinin (PHA), einem T-Zell-Mitogen, bei einer Konzentration von 1 μm/ml für 24 Stunden stimuliert wurde. Die Aliquots wurden 1 : 20 mit RPMI 1640 mit 10% FKS verdünnt. Der Antikörper gegen CD4 wurde mit einer Konzentration von 2 μm/ml zu den Kulturen gegeben. Die Zellen wurden bei Raumtemperatur für 30 Minuten inkubiert, anschließend wurden 100 μm paramagnetische Kügelchen, die mit einen Ziege-anti-Maus-Antikörper (erhalten von Advanced Magnetics) beschichtet waren, hinzugeben. Die Zellsuspension wurde vorsichtig vermischt und für 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die Zellen und die Kügelchen wurden resuspendiert, an einen permanenten Magneten gestellt, in einer Art, dass das Magnetfeld sich senkrecht zu der Schwerkraft befand. Nachdem die Kügelchen ein dichtes Pellet ausbildeten wurde das Medium abgesaugt und der Magnet entfernt. Weiterer Puffer wurde zugefügt, und die Zellen und die Kügelchen wurden resuspendiert. Dieses Verfahren wurde einige Male wiederholt. Nach vollständiger Entfernung des Mediums wurden die Zellen in den Pellet der Kügelchen mit einer Detergenzlösung, die als somatic cell lysis reagent (Sigma) bezeichnet wird, lysiert und das Röhrchen wurde in ein Luminometer gestellt. 100 μm einer Mischung enthaltend Luciferin, Luciferase und Mg2+ in einer Lösung enthaltend 0,25 mM Hepes, 0,1 mM DTT und 0,5% BSA wurden in das Röhrchen gegeben, und die Werte wurden bestimmt.
Negativkontrollen bestehend aus Lysepuffer oder Zellen, die mit unspezifischen Kügelchen, d. h. Kügelchen, die mit einem anderen Isotyp als der des primären Antikörpers beschichtet waren, wurden ebenfalls getestet. Schließlich wurde ein ATP-Standard bei jedem Assay mitlaufen gelassen, um zu bestätigen, dass die Luciferin : Lucerifase-Reaktion auf entsprechenden Niveaus ablief. Die Tabelle 1 unten zeigt die erhaltenen Ergebnisse.
Tabelle 1
Beispiel 2: Messung der Antwort von CD4 positiven T-Lymphozyten auf Mitogene, Zytokine und auf ein Toxin-Antigen
Periphere mononukleäre Zellen aus dem Blut von verschiedenen unterschiedlichen Individuen wurden mittels Gradientenzentrifugation isoliert, gewaschen und in RPMI 1640 mit 5% FKS kultiviert. Die Zellen wurden aliquotiert und wurden entweder unstimuliert gelassen und wurden mit PHA, CD3-Antikörper, Tetanus-Toxin oder viralen Antigenen von Influenza stimuliert. Alle Proben wurden mit unterschiedlichen Antigenen inkubiert. Nach einer 48 stündigen Inkubation wurden die Zellen mit RPMI 1640 verdünnt mit monoklonalen Antikörpern gegen das CD4-Antigen aus der Maus für 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert, anschließend mit einem Ziege-anti-Maus-IgG konjugiert an paramagnetische Kügelchen (Advanced Magnetics, Inc.) für 30 Minuten bei Raumtemperatur. Nach dem Abtrennen mit Hilfe eines permanenten Magneten und dem Waschen der Probe wurden die Zellen mit dem somatic cell lysis reagent (Sigma Chemical) lysiert. Luciferin/Luciferase-Reagenz (Sigma Chemical) wurde 1 : 10 verdünnt und 100 μl wurden hinzugefügt. Die relativen Lichteinheiten wurden bestimmt. Die 1 zeigt die Antwort der verschiedenen Patientenproben auf diese Mitogene und Antigene und zeigt die Fähigkeit der erfindungsgemäßen Verfahren auf, die Antworten auf Mitogene und Antigene in individuellen Patientenproben nachzuweisen.
Beispiel 3: Vergleich der nach PHA-Stimulation von T-Lymphozyten, die mit CD4, CD69 oder CD3 aufgetrennt wurden, erhaltenen Ergebnisse
Dieses Beispiel untersucht die Fähigkeit die Assays mit verschiedenen Zelloberflächenmarkern durchzuführen. Periphere mononukleäre Zellen wurden entweder nicht stimuliert oder mit PHA (1%) für 24, 48, 72 oder 96 Stunden stimuliert. Aliquots der nicht stimulierten Zellen oder der PHA-stimulierten Zellen wurden mit einem Maus-monoklonalen Antikörper gegen CD3, T-Zellrezeptor, CD4 oder CD69 für 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Alle Aliquots wurden anschließend mit den paramagnetischen Kügelchen an die Ziege-Antimaus-IgG absorbiert waren für 30 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Die Komplexe von Zellen und Kügelchen wurden mit einem permanenten Magnet abgetrennt und dreimal mit RPMI mit 10% FKS gewaschen. Die Zellen wurden mit 0,5% NP-40-Lösung lysiert. Luciferin : Luciferase-Mischung (Sigma Chemical Company) wurde 1 : 10 verdünnt und 100 μl wurden zu jedem Röhrchen gegeben. Die 2 zeigt die Ergebnisse dieser Assays. In allen Fällen waren die relativen Lichteinheiten von den stimulierten Zellen größer als die von den unstimulierten Zellen. Dieses zeigt die Verwendung von verschiedenen Zelloberflächenmarkern zur Untersuchung der Antwort von Lymphozyten aus verschiedenen Untergruppen.
Beispiel 4: Messung der T-Lymphozyten-Antwort auf ein bakterielles Antigen
Balb/c-Mäuse wurden mit insgesamt 100 μg Q-Fieberantigen, hergestellt aus Nine mile strain (Integrated Diagnostics, Inc.) emulgiert in kompletten Freunds-Adjuvant, immunisiert. Blutproben (Prebleeds) wurden aus dem Orbitalsinus von 10 Mäusen genommen. Weiteres Blut wurde 7 Tage nach Inokulation erhalten. Circa 100 bis 200 ml Blut wurden von jeder Maus erhalten. Periphere mononukleäre Zellen aus dem Blut wurden durch Dichtegradientenzentrifugation erhalten. Die Schicht mit den weißen Zellen wurde entfernt und mit RPMI 1640 mit 10% FKS gewaschen. Circa 100 μl der Zellen wurden dann in jedes Röhrchen gegeben. Die Zellpellets wurden entweder ohne irgendwelche Zusätze oder in Anwesenheit von Q-Fieber-Antigen (10 μg/ml oder 1 μg/ml) kultiviert. Nach 24 Stunden wurden die Kulturen 1 : 10 mit RPMI-1640 mit 10% FKS verdünnt und 100 μl von superparamagnetischer Kügelchen beschichtet mit Antikörper gegen Maus-CD4 (Advances Magnetics, Inc.) wurden hinzugefügt. Die Kügelchen und die Zellen wurden bei Raumtemperatur für 30 Minuten inkubiert. Die Kügelchen zusammen mit den komplexierten Zellen wurden mit einem permanenten Magneten abgetrennt und dreimal mit RPMI mit 10% FKS gewaschen. Die Zellen wurden durch Zugabe von 100 μl somatic cell lysis reagent (Sigma Chemical Co.) lysiert. Nach weiteren 10 Minuten bei Raumtemperatur wurden 100 μl Luciferase : Luciferin-Reaktionsmischung (Sigma Chemical Co.) hinzu injiziert und das freigesetzte Licht wurde mit einem Luminometer bestimmt.
Bei den Prebleeds der Mäuse zeigten die mit Q-Fieber-Antigen inkubierten Proben Signale, die identisch waren zu denen inkubiert ohne Q-Fieber-Antigen. Die folgende Tabelle zeigt die Ergebnisse der Proben erhalten nach 7 Tagen nach Injektion des Antigens. Es konnte eine dosisabhängige Antwort der T-Zellen nachgewiesen werden.
Tabelle 2
Beispiel 5: Messung der Antwort von T-Lymphozyten unter Verwendung von Gesamtblut als Probe
Blutproben wurden von normalen Spendern erhalten und in Heparin als Anti-Koagulans gesammelt. Aliquots vom Blut (100 μl) wurden 1 : 5 mit RPMI-1640 verdünnt. Replikate erhielten entweder keinen Zusatz, 1% PHA, oder IL-2 mit 100 U/ml Endkonzentration. Die Proben wurden über Nacht bei 37°C inkubiert. Am folgenden Tag wurden 100 μl der Proben entfernt, mit Maus-monoklonalen Antikörpern gegen CD4-Antigen für 30 Minuten bei 37°C inkubiert. Die paramagnetischen Kügelchen beschichtet mit Ziege-anti-Maus-IgG wurden zu jeder Probe hinzugefügt (100 μl) und für 30 Minuten bei 37°C inkubiert. Die Kugel-Zell-Komplexe wurden aus den Proben mit Hilfe eines permanenten Magneten isoliert, und die Komplexe wurden dreimal mit PBS enthaltend 10% FKS und 0,1% BSA gewaschen. Die Zellen wurden mit destilliertem Wasser lysiert. Luciferin : Luciferase wurde zugegeben und die relativen Lichteinheiten wurden bestimmt. Die folgende Tabelle zeigt die Ergebnisse.
Tabelle 3
Beispiel 6: Messung der Antworten von CD8 positiven T-Lymphozyten auf virales Antigen
Periphere mononukleäre Blutzellen wurden aus heparinisiertem Gesamtblut von normalen Blutspendern mittels Dichtegradientenzentrifugation isoliert. Die Zellen wurden in RPMI mit 10% FKS gewaschen und in diesem Medium in einer Dichte von 1 × 10⁵ Zellen/ml resuspendiert und aliquotiert. Replikate enthielten entweder keine Zugabe oder verschiedene Niveaus an Influenza A-Antigen oder PHA. Nach 24 Stunden wurde ein Maus-monoklonaler Antikörper gegen CD8 hinzugefügt, und die Zellen wurden für 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Paramagnetische Kügelchen gekoppelt mit Ziege-anti-Maus-IgG wurden hinzugefügt, und die Komplexe wurden abgetrennt, indem die Kulturen an einen permanenten Magneten gestellt wurden. Die Komplexe wurden dreimal mit PBS enthaltend 10% FKS gewaschen und anschließend wurden die Zellen mittels 0,05% Triton × 100 in PBS lysiert. Die ATP-Niveaus wurden mittels Luciferin : Luciferase bestimmt. Alle Individuen zeigten Antworten auf PHA mit Stimulationsindizes von > 10, während der Bereich der Stimulationsindizes auf virale Antigene von Influenza im Bereich von 1,2 bis 4,0 lagen.
Beispiel 7: Messung der Antwort von T-Lymphozyten auf Recall-Antigene (Gedächtnisantigene) verglichen mittels Durchflusszytometrie
Blut wurde von normalen Spendern in Sammelröhrchen, die Heparin enthielten, gesammelt. Tetanus-Toxin mit 10 ng/ml, Candida albicans mit 20 ng/ml; Influenza A in einer Verdünnung von 14; humanes Transferrin mit 10 ng/ml oder kein Zusatz wurden zu 500 μl Blut gegeben und bei 37°C für 24 bis 48 Stunden inkubiert. 100 Mikroliter Probe wurden entfernt und mit 20 μl paramagnetischen Kügelchen beschichtet mit Maus-monoklonalen Antikörper gegen CD4-Antigen (Perseptive BioSystems) für 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die Komplexe aus Kügelchen und Zellen wurden aus der Probe mittels einem permanenten Magneten entfernt und dann dreimal mit RPMI 1640 Medium enthaltend 5% FKS gewaschen. Die Zellen wurden durch Zugabe von 15 μl somatic cell lysing reagent (Sigma Chemical Co.) lysiert, gefolgt von einer Zugabe von 150 μl Luciferase : Luciferase-Reaktionsmischung (Sigma Chemical Co.). Die Freisetzung des Lichts wurde mit einem Luminometer bestimmt und die Stimulationsindizes wurden berechnet.
Die Proben für die Durchflusszytometrie wurden hergestellt, indem 50 μl Gesamtblut von jeder Probe, denen ein Recall-Antigen zugegeben wurde, mit 10 μl Mausmonoklonaler Antikörper gegen CD4 konjugiert mit FITC (Dako Corp.) inkubiert wurden. Die Zellen wurden mittels Durchflusszytometer gezählt.
Die folgenden Tabellen zeigen, das messbare T-Zellaktivierung durch Recall-Antigene mit den beschriebenen Verfahren nach 24 Stunden oder 48 Stunden Exposition erreichbar ist. Eine Zunahme in der Zellzahl wurde im parallelen Durchflusszytometrie-Experimenten nicht festgestellt. Dies mag darin begründet sein, dass das Assay-Verfahren sensitiv genug ist, um eine Zunahme in der Stoffwechselaktivität, wie sie durch Zunahme der ATP-Niveaus aufgezeigt wurde, nachgewiesen werden kann, bevor die Niveaus an Zellproliferation ausreichend hoch sind, um für die Durchflusszytometrie messbar zu sein. Humanes Transferrin ist ein natürliches Material, das als nicht fremd erkannt wird, und daher ruft dieses keine Immunantwort hervor. Es wird als Negativkontrolle im Assay verwendet.
Tabelle 4
Tabelle 5

Claims

Verfahren zur Analyse von biologischen, Lymphozyten enthaltenen Proben, die einem induzierenden Mittel ausgesetzt sind, dadurch gekennzeichnet, dass a) die Probe, die eine Mischpopulation von Zellarten einschließlich Lymphozyten enthält, mit diesem induzierenden Mittel inkubiert wird, anschließend b) das ATP-, NADP- oder PCNA-Niveau in einer ausgewählten Untergruppe der Lymphozyten detektiert wird.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das induzierende Mittel ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Mitogenen, Antigenen, Cytokinen, Wachstumsfaktoren, Allergenen, Allo-Antigenen, Peptiden, Arzneimittel, Chemikalien und niedermolekularen Verbindungen, die mit einem Protein-Carrier konjugiert sind.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 oder 2, wobei der Schritt b) umfasst: i) Inkontaktbringen der Probe mit einem festen Trägermaterial mit spezifisch bindender Substanz, diese bindende Substanz ist spezifisch für mindestens eine charakteristische Determinante der Lymphozyten-Untergruppe, dieses führt zur Ausbildung eines Komplexes von Zellen und festen Trägernmaterial; ii) Abtrennen dieses Komplexes vom Rest der Probe; iii) Zugabe einer Lösung zu diesem Komplex, um jede Zelle in diesem Komplex zu lysieren; iv) Detektion des ATP-, NADP- oder PCNA-Niveaus in dem Lyseprodukt von Schritt iii).
Verfahren gemäß Anspruch 2, wobei das Mitogen ein T-Lymphozytenmitogen ist.
Verfahren gemäß Anspruch 2, wobei das Antigen ein infektiöser Organismus ist.
Verfahren gemäß Anspruch 5, wobei der infektiöse Organismus Pilze, Viren oder Bakterien oder eine Subkomponente davon ist.
Verfahren gemäß Anspruch 2, wobei das Antigen ein Protein oder Peptid ist.
Verfahren gemäß Anspruch 1 bis 3, wobei die Lymphozyten-Untergruppe ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus T-Lymphozyten, T-Helfer-Lymphozyten, TH1-Lymphozyten, TH2-Lymphozyten, natürliche Killer-T-Lymphozyten, cytotoxische T-Lymphozyten und Suppressor-T-Lymphozyten.
Verfahren gemäß Anspruch 3, wobei die T-Zell-Determinante ein funktioneller Marker, ein Marker eines bestimmtes Differenzierungszustands oder ein Aktivierungsmarker ist.
Verfahren gemäß Anspruch 3, wobei der feste Träger magnetisches oder paramagnetisches Material umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 10, wobei im Schritt ii) der Komplex durch magnetische Abtrennung abgetrennt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 3, wobei das feste Trägermaterial Polystyrol umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 3, wobei Schritt iv) das Durchführen einer Biolumineszenzreaktion unter Verwendung von Luciferase und Luciferin umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 3, wobei die spezifisch bindende Substanz ein Antikörper ist.
Verfahren gemäß Anspruch 3, wobei die spezifisch bindende Substanz ein Zytokin ist.
Verfahren gemäß Anspruch 3, wobei Schritt i) umfasst (a) Inkontaktbringen der Probe mit einer ersten bindenden Substanz eines Bindungspaars, die spezifisch mindestens an eine Zelloberflächendeterminante bindet, die dieser Untergruppe von Lymphozyten gemein ist und (b) Inkontaktbringen des Produkts von Schritt a) mit einem festen Trägermaterial mit einer zweiten Bindungsoberfläche dieses Bindungspaars, die spezifisch die erste Bindungssubstanz bindet.
Verfahren gemäß Anspruch 16, wobei das Bindungspaar zwei Antikörper umfasst, einen ersten Antikörper, der die Zelloberflächendeterminante erkennt und einen zweiten Antikörper, der den ersten Antikörper erkennt.
Verfahren gemäß Anspruch 16, wobei das Bindungspaar Biotin und Avidin umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 1 bis 3, wobei eine Standardprobe ebenfalls dem Schritt b) unterworfen wird und das ATP-, NADP- oder PCNA-Niveau der Testprobe mit der Standardprobe verglichen wird.
Verfahren gemäß Anspruch 19, wobei die Standardprobe ATP oder NADP enthaltende Liposomen sind.
Verfahren gemäß Ansprüche 1 bis 3, wobei die zum Durchführen aller Schritte benötigte Gesamtzeit 6 bis 72 Stunden ist.
Verfahren gemäß Ansprüche 1 bis 3, wobei die Lymphozytenuntergruppe B-Lymphozyten sind.
Verfahren gemäß Ansprüche 1 bis 3, weiterhin umfassend den Schritt des Vergleichs der ATP-, NADP- oder PCNA-Niveaus in der Probe mit den Standardniveaus von ATP, NADP oder PCNA.
Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, umfassend die Schritte: a) Aufteilen der Testprobe in zwei oder mehreren Teile; b) Inkubieren von mindestens einem dieser Teile mit dem induzierenden Mittel und Inkubieren von mindestens einem dieser Teile ohne induzierende Mittel; c) Inkontaktbringen jedes Teils mit einem festen Träger mit spezifischer Bindungssubstanz, diese bindende Substanz ist spezifisch für mindestens eine charakteristische Determinante auf dieser Lymphozytenuntergruppe, dies führt zur Bildung eines Komplexes von Zellen und festen Trägermaterial für jeden Teil; d) Abtrennen des Komplexes von dem Rest der Probe für jeden Teil; e) Waschen des Komplexes für jeden Teil; f) Zugabe einer Lösung zu diesem Komplex, die jede Zelle in diesem Komplex lysiert; g) Messen des ATP-, NADP- oder PCNA-Niveaus in jedem der Lyseprodukte von Schritt f); und h) Vergleich der Ergebnisse von g) für jeden dieser Teile, die dem induzierenden Mittel ausgesetzt waren mit jedem der Teile, die nicht dem induzierenden Mittel ausgesetzt waren.
Verfahren gemäß Anspruch 24, wobei der Waschschritt e) mit einer Lösung, die rote Blutzellen lysiert, durchgeführt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 24, wobei der Waschschritt e) mit einer Lösung durchgeführt wird, die Blutplättchen lysiert.
Verfahren gemäß Anspruch 24, wobei die charakteristische Determinante ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus CD 3, CD 4, CD 8, CD 69, CD 25, CD 26, CD 27, CD 28, MHC Klasse 2 Antigene und CD 71.
Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei die Lymphozyten die Schritte umfassen: a) Aufteilen der Testprobe in zwei oder mehrere Teile; b) Inkontaktbringen mindestens einem dieser Teile der Testprobe mit dem induzierenden Mittel und nicht Inkontaktbringen mindestens einem Teil der Testprobe mit diesem induzierenden Mittel; c) Inkontaktbringen von jedem Teil mit einem festen Trägermaterial mit spezifischer bindender Substanz, diese bindende Substanz ist spezifisch für mindestens eine Determinante auf der Oberfläche der T-Lymphozyten, dies führt zur Ausbildung eines Komplexes von Zellen und festen Trägermaterial; d) Abtrennen des Komplexes von dem Rest der Probe für jeden Teil; e) Waschen des Komplexes für jeden Teil; f) Zugabe einer Lösung zu jedem Komplex, die jede Zelle in dem Komplex lysiert; g) Messen des ATP-, NADP- oder PCNA-Niveaus in jeder der lysierten Produkte von Schritt f), und h) Vergleich der Ergebnisse aus Schritt g) für jeden dieser Teile, die einem induzierenden Mittel ausgesetzt waren mit jedem der Teile, die nicht dem induzierenden Mittel ausgesetzt waren.
Verfahren gemäß Anspruch 28, wobei die Konzentration der Determinante als Ergebnis der Antwort der T-Lymphozyten auf das induzierende Mittel zunimmt.