JPS5842971A - 抗体を感作させたマイクロカプセルを用いる細胞性免疫測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は改良された細胞免疫測定法に用いる１イク■カ
プセルおよびそれを用いた細胞免疫測定法−関するもの
で、さらに詳細にはリン／叱球の抗原に対する抗体ｔ−
悪作させたマイクロカプセル、ならびに前記マイクロカ
プセルとヒツジ赤血球音用いてリン／４球の細胞免疫測
定法、１種以上の相互に識別しうる前記のマイクロカプ
セル【用いて９７２球の細胞免疫測定法、およびリン／
Ｒ球ＯＢ！Ｉｌ胞の抗原に対する抗体を感作したマイク
ロカプセルを用いて９７２球のＢ細胞の細胞免疫ＩＩＩ
定法に関するものである。

従来臨床免疫学的にヒ゛−リンＡ球ＯＴ細胞とＢ秦胞ｏ
Ｐｌｙ；ｔま是は針側には、一般にヒツジ赤血球にする
Ｍロゼツト法によＩＴりンパ球の同定ｔたは計ｌｌｌ１
か行われ、ＰＣ受容体十ＣＪ受容体Ｉｎ人またはｉｉｉ
Ａｃｗゼツ１法によハ★次は細胞層表面の免疫グ曹ゾリ
ンを螢光抗体法で検出する螢光抗体法に１９ＢリンＡ球
の同定また嬬計測に用いられている。これらの検査方法
は細胞性免疫の最も基本となる反応であり、近年Ｔ及び
８９７２球の比率を求め、患者の免疫機能の推定に欠く
こと−のできない検量法として、日常検査に次嬉に広く
一行われるようになり＊、か、従来の方法を用いるかぎ
）、別々のプレートを用いて、Ｔ％ＢＪｉｉｌｊｍｔ−
別個に同定・計測しなけれはならず、また螢光抗体法で
は、検体量も比較的多く必要とするために患者の肉体的
負担か大きく、かつ特殊な器具中施設置−要し、技術的
にも熟練ｔ−畳する等の制約會受けるなどの問題点かい
くつかあった。

ｔたＢＷゼット法、ｌＡｗゼット法または８ＡＣロゼツ
ト法においては動物の赤血球音用いゐので、赤血球浮遊
液の１ｍｍＭの究めに會わめてわずられしい操作を必要
とするよＫｉｊｋ期間赤血球を保存することかできない
という間一点かあった。

本発明者らはリンパ球の抗原に対する抗体ｔ−感作させ
次マイク■カプセルｔ−ｔ　ｆｉｎ、壇たは複数種、ま
たはヒツジ赤血球とと４に％ｉイク■ブレートなどの上
に付着させたリンパ球に接触させて免疫反応させること
にょハ従米方法に比べて着しく微量の横−で９７２球の
Ｔ１１ＪＩＩ！、Ｂ１１１ｉ、その他の細１ｉｔ−／回
の操作で同Ｗ＃に簡単に同定・計測しうるむとを見出し
、本発明に到達した・本斃＠Ｏ目的祉各種の９７２球の
測定Ｖｔ７回のａｊｉ！操作を実施できる方法を提供す
ることである・本＠嘴の他の目的は暗富設備中高価な螢
光顕微ｆｌｌｔ必豐とせずに通常の光学鎖黴鋺會用いて
容易な操作で正確に各種のりンパ球の測定を実施できる
方＃Ｃを提供することである。　　。

本発明の儒の目的は、マイクロカプセルのＩＩＩＡｊ！
ｉ内への４ｊシこみによｐ貧食機能ｔもり貧食５ｎｔ−
可視的に区別できることＫｊＪ）、　　リンパ球から貧
食細胞を除去する工１ｉｉｔｔｉ４略して各種のリンパ
球の關ｔｒｔ＊施で自ゐ方法を提供すゐことである・本
尭−のさらに４１Ｎ）目的は合成警れた一イハカプセル
に各種のり７２球の抗ＭＫ対する抗体を感作させたマイ
クロカプセルを用いＡＣとによｐ抗体かきわめて安定で
最期間保存できるので、常に再現性のよい正ＩＩな各種
９７２球の測定ｒａｍできる方法を提供することである
。

本発明のさらに他の目的は帥記の諸目的に有用を９７２
球の抗原に対する抗体ｉ感作させたマイクロカブ＋ルｔ
−提供する仁とである。

本発明のさらに他の目的鉱マイク■カプセルの内部に着
色物質七有し、外壁にりンパ球の抗ｊ［Ｋ対する抗体を
感作させて、光学的′に容易に一別できるマイク−カプ
セル會提供することでめる・本膳明紘、 （１）　　９７２球の抗原に対する抗体ＶＳ作させたマ
イクロカプセル。

（２）リンパ球の抗原に対する抗体倉感作さ−４を九マ
イクロカプセルとヒツジ赤血球を同時にリンパ球に適用
し、しかる後識別されるａｎｔそれヤれ別個に計測する
ことｔ特徴とする癲胞免疫＃Ｉ定法・ （３）　リンパ球の抗原に対するＪｌ１以上の抗体會そ
れ゛ぞれ感作させｆｃＪａ１以上の光学的に相互に識別
しうるマイクロカプセルを同時にリン／櫂球に適用し、
した４ｈ後光学的に識別される細胞會それぞれ別個に計
測することｔ％黴とならびに、 （４）リンｌ電球のＢＪＩｊｌの抗原に対する抗体ｒ＊
ルｔリンノ球に適用 し、し力為る後に識別されうるＢＭＪｉｌｔ−計測する
ことｔ−特徴とする細胞免疫測定法でめる・本発明に於
て用いられる抗体は９７２球の抗原に対する抗体を用い
ることか出来る０例えば抗Ｉｆｆ。

抗ＩｆＭ、抗ＩＰＡ、抗Ｔ抗体、その他すンＡ球表面抗
原として脳共通抗原、胸腺共通抗Ｊｌ［１にどに対する
抗体を使用する仁とか出来る。

本発明に用いられるマイクロカプセル の色調としては各種の色調【用いることかできるか、羊
赤血球と同時に測定する場合拡羊赤血球の色調と１１ｉ
Ｊ様な色調でまく識別針側し晶い色調にすべきであるこ
とは云う迄もない、又二種以上のマイクロカプセルｔｉ
ｉｌ！用する場合でも相互に識別計測しＡ％Ａ色胸にす
べきであることはこれ’＊＊Ｒう迄もないことである。

本発明においては測定計測し易い色素ｆ−ｒイクロカプ
セルの芯材に入れることか出来ることである。従来一般
に用いられている合成された充夷黴粒子に着色したもの
はその着色剤か直接、リンノ（球Ｏ抗１［Ｋ対する抗体
に接触丁ゐので抗体に悪影響を及は丁ことか多く実用す
る１２）Ｋ困難なことか多かった。これに対しマイクロ
カプセルではＩＩｔｉｌＫＦｉ樹脂のみで着色剤は芯材
に入れることかできるので、マイクロカプセルの表面は
樹脂で覆われているため樹脂の１１＠を選択することＫ
ｊｊ）抗体に対し悪影響を与えないことか可能である０
本発用に用いることかできる色素は％＠１８１１−ｆ参
１Ｊｔ号明細書に開示されている色素を用いることかで
き、またマイクロカプセルは同＠細書に開示されている
製造方ｆ＆に従って製造することかでき、さらに抗体【
マイクロカプセルの外１１ＫＪＩ作させる方法は同明細
書ＫＭ示の方法に準じてｌｌ！施することかできる・ 本発明に用いるマイクロカプセルの大き一１１轄す３／
Ａ球の大きさと余ｐ違ゎないことか識別針側上有利であ
る、卸ち１μｍから７０μｍｏ抛同が好適である１ ｙｉｘｓｓおよび比曽例 ■　とツジ赤血球浮遊箪 緩僑生環食塩液（ＰＨ１）でＪＨ洗渉し、ＪＸ／４７”
／ｓｌ　　Ｋ＊るようにクシ胎児血清（Ｆｅ２）に浮遊
させえ。

■　抗ヒト免疫グロブリンＰＩＴＣＩＩＩＩＩウナギ血
清は、ベーリング社の抗血清ｔ１万ｒｐｍでＪＯ分達心
後、平均孔＠６．ＪＪ声鵠Ｏ宅り四フィルターで一過し
、ＰＨ１で１０倍に希釈して使用した。

■　固定染色液ＦｓＰＢ８に、ダルタールアルデヒドを
００ＪＳ嘔、ゾククアントクリシルプル−（Ｃ，１，＄
ｊ／）／＃）を０．００７饅に溶解し使用した。

■　プレートのｐｏｌｙ−Ｌ−１ｙｉ１ａ・（ＰＩ、Ｌ
）処講ハマイクはプレート（ファに’：１ン社製ＪＤＪ
参）の各穴ｆｃ＃０声Ｉ／−のｐｏｌｙ−Ｌ−１ｙｓｉ
ｎ＠　（ＰＬＬ、８１ｇａｓａ社製）／ｆｉｔを入れ、
室温に４０分放置後、蒸讃水で洗浄し、乾燥させて使用
した。

■　リン／櫂球の分離は健康者の肘静脈よシ採血し九へ
／噌すン加末横血液からＢｏｙｍｍの方法に準じて、Ｆ
ｉｃｏｌｌ−Ｉｓｏｐａｑｕ＠を用％／ｍた比重達心渋
でｆＨＩＩｉＬ、Ｊ回洗浄後Ｉ×ｔ６６７−に調整し九
。

■　微量マイクロカプセル法は 上記のＰＬＬ＠濁プレートにリンパ球１．０μｔｔ−付
着させ＊、後、Ｆｅ２で未反応のＰＬ　Ｌ　ｆ；ＩＩ＆
珊し後記する■で得られたマイクロカプセル浮遊１１Ｊ
ｊ声りを加えで反応させ九後転倒静置し、ふりすて（ｆ
ｌｉｃｋｉｍｇ）カシランイツト管で非結合粒子を除去
した。

その後＠ＫＥＩ！した固定染色液で染色し、プレートの
ｔま一黴鏡下でリンΔ球Ｊ００個ｖｔ款え四ゼツＦ形成
率を求めた。計測はすべて三重霧室で行い、平均値で表
現した。

■　膜螢光抗体法： リンパ球Ｊ　Ｘ　／　０’７ｄ　Ｏ、ｊｄＫ　Ｆ　Ｉ　
ＴＣＩＩｗ＆抗ヒト免疫ダ■ゾリンウサギ皇清Ｏ１！血
清加え、室温でＩＯ分反応後、ｊ慢ＦＣ８を含むＰＢ８
でＪＩＩ洗滲し、螢−顯黴鏡でリンパ球１００個を数え
、螢光を見する細胞の百分率を求めた。

■　Ｊｉｏ−ｖット法： リンパ球ｔ−ＰＬＬ処曹プレートに付着後■に記載した
ヒツジ赤血球浮遊＠１０ｅｄｔ加え、室温で２０分、さ
らに参　＠Ｃで一晩反応させ、ヒツジ赤血球を除去臥固
定染色して闘ゼット形成車を求め、Ｔりンー球とした。

■　同時ｎゼット法： ＰＬＬ処理プレートに付着した９７２球に■に記載のｎ
ｏ−ｖ−；ト法と、■に記載Ｏマイク目カプセル法管組
み合せで同時ｗｌ走を行った。この測定は通常の光学顯
黴鏡を用−で行なった。

［相］　マイクロカプセル（ＭＯ）： エリア樹脂を表ｗＫ−ち、平均粒径！、０声鶴、Ｃ０１
，ソルベントゾル−／／（Ｃ。

１、＄４７ｊＪｊ）を内部に包含させて―實色に着色さ
れたマイクロカプセルを用いた。このものは比１ｉ／　
　／７１陰荷電を有しでおり、水中ＫＩＤ憾の割に浮遊
液としたものを原液とし友。

ＯＭＣへの抗ヒト免疫グ彎プリン抗体Ｏ麹合：ＭＣＪｌ
［１１Ｅを生−食塩液でＪ回洗滌し、沈渣ｔコｏ’ｔｔ
ｉ着釈のｐＨ１，６の０．／Ｍトリ゛Ｊ−Ｈα緩１ｉ１
ＥＫ浮遊させ、ｓ、ｔＪｚ憾のゲルタールアルデヒドを
等量論え、Ｊγ０ＣでＪＯ分反応あせた後、同じ溶媒で
Ｊｉｌ洗滌し、沈渣讐コ容のＳ＊に浮遊させた。これに
抗体く抗ｋ）免疫グープリンウサギＩｇＧ）Ｉ岬を加え
、Ｊ？＠Ｃで１時間反応させ、Ｊｌｌ同じｓ厳で洗い、
０６−２嗟の割合ｉグ゛　　リシンを金型せたトリス−
Ｈα緩＊＊に浮、　　・　　　　　；コ 遊させた。

Ｏ２０に記載めり法で簡単に同時測定ができ、再現性よ
く軸度よ〈安迦して’ｒ＠＠ｔｚ嚢、Ｂ細胞Ｉデ憾が得
られえ、その―ｉ頗蘭じ容易に区別で亀、判定には支障
が謙かうた。

Ｂ細胞のみの測定も従−法であゐ、■に記載の方法によ
る測定に比して再現性よ≦精度０２″結、果値”自わめ
１容−な操作により得られた。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 ｔｉ＞・９７２球の抗原に対する抗体を感作させたマイ
   クロカプセル。 （２）　　りンノ球の抗原に対する抗体ｖｔＩＩＡ作さ
   せたマイクロカプセルとヒツジ赤血ｊｌｔ−ｆｉｔｌＮ
   Ｋ　１７ンＡ球に適用し、しかる後識別されるｓｔｍ會
   施免疫測定法・゛ （３）　　リンパ球の抗原に対するＪｌ１以上の抗体を
   それぞれ感作させた２種以上の光学的に相互Ｋｔｊ＆別
   シりるマイクロカプセルを同時−リンノ球に適用し、し
   かる後光学的に識別されるｌｌｌ１ｌｌｉｉｔ−それぞ
   れ別個に針側することｔ轡像とする細胞免疫測定法。 （４）”）７Ａ球のＢＭ轡の抗原に対する抗体を感作さ
   せたマイクロカプセル會すンノＲＫ造Ｍし、しかる後に
   識別されうるＢ＠胞會計側する仁と會特黴とする細胞免
   疫測定法。