DE69735532T2

DE69735532T2 - Bestimmung von antigenen mittels oligonukleotid-antikörper-konjugaten

Info

Publication number: DE69735532T2
Application number: DE69735532T
Authority: DE
Inventors: W. Thor Haddonfield NILSEN
Original assignee: Polyprobe Inc
Current assignee: Genisphere LLC
Priority date: 1996-10-29
Filing date: 1997-10-22
Publication date: 2006-11-23
Anticipated expiration: 2017-10-23
Also published as: WO1998018488A1; EP0951297B1; JP2001503517A; ATE320819T1; ES2260787T3; US6110687A; DE69735532D1; JP3786970B2; EP0951297A4; CA2270227A1; AU4914097A; AU718804B2; CA2270227C; US6117631A; EP0951297A1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung ist auf ein Verfahren zum Nachweis eines Antigen-Antikörper-Komplexes durch die Bildung von Immunodendrimeren, d.h. Oligonucleotid-Antikörper-Konjugaten, die an markierte Dendrimere hybridisiert sind, gerichtet. Immunodendrimere können das Signal verstärken, das in herkömmlichen Verfahren beobachtet wird, indem sie einem einzigen Antigen-Antikörper-Komplex mehrere Markermoleküle zuführen.
In dieser Anmeldung wird auf mehrere Veröffentlichungen Bezug genommen, deren vollständige Zitierungen im Text der Beschreibung gefunden werden. Diese Literaturstellen beschreiben den Stand der Technik, dem diese Erfindung angehört.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die Antigen-Antikörper-Wechselwirkung ist eine bimolekulare Assoziation, die einer Enzym-Substrat-Wechselwirkung ähnlich ist, mit dem wichtigen Unterschied, dass es sich um einen reversiblen Prozess handelt. Die Wechselwirkungen zwischen einem Antikörper und einem Antigen werden von verschiedenen nichtkovalenten Wechselwirkungen zwischen der Antigen-Determinanten oder dem Epitop des Antigens und der Domäne der variablen Region des Antikörper-Moleküls regiert. Die Spezifität eines Antikörpers für ein Antigen hat zu der Entwicklung einer Vielfalt von immunologischen Assays geführt, die zum Nachweis der Anwesenheit von Antikörper oder Antigen verwendet werden können, um die Anwesenheit von Antikörper oder Antigen nachzuweisen. Diese Assays sind Instrumente bei der Diagnose von Krankheiten, der Überwachung des Grades der humoralen Immunantwort und der Identifikation von Molekülen von biologischem Interesse.
Antigene werden routinemäßig auf Membranen (Western-Blots) und in situ (Immunhistochemie, Immunfluoreszenz, Immunfärbung usw.) nachgewiesen. Es gibt viele Abwandlungen der verfügbaren Verfahren zum Nachweis von Antigenen, abhängig von der Zahl und den Arten der verwendeten Antikörper, der Markierung und dem Substrat. Unabhängig von der Abwandlung hängt der Antigen-Nachweis im Wesentlichen von einer spezifischen Antikörper-Antigen-Reaktion ab, die einen Antikörper-Antigen-Komplex bildet.
Die nicht-kovalenten Wechselwirkungen, die eine Antigen-Antikörper-Bindung umfassen, umfassen Wasserstoffbrückenbindungen und ionische, hydrophobe und van-der-Waals-Wechselwirkungen, von denen jede relativ schwach im Vergleich zu einer kovalenten Bindung ist und wobei jede wirksame Wechselwirkung über eine sehr kurze Entfernung stattfindet. Deshalb erfordert eine starke Antigen-Antikörper-Wechselwirkung eine große Zahl derartiger Assoziationen und eine sehr starke Passgenauigkeit zwischen dem Antigen und dem Antikörper aufgrund des hohen Maßes an Spezifität, das für Antigen-Antikörper-Wechselwirkungen charakteristisch ist.
Der Nachweis des primären Antikörper-Antigen-Komplexes ist auf zahllose Weisen demonstriert worden. Nachweisverfahren umfassen direkt markierte monoklonale Antikörper, wobei die Markierung aus einem Enzym, z.B. alkalischer Phosphatase (AP) und Meerrettichperoxidase (HRP); einem Fluorochrom (einer fluoreszierenden Verbindung), z.B. Fluorescein, Rhodamin, Texas-Rot, Cy-3 und Cy-5; einem Schwermetall-Chelat, wie Europium, Lanthan, Yttrium und Gold; einem radioaktiven Isotop, wie ¹²⁵I, ¹³¹I, ³H, ¹⁴C und ³⁵S, besteht oder die Markierung ein zweiter Reporter sein kann, z.B. Biotin, Streptavidin, Avidin, Digoxigenin oder Dinitrophenyl. Alternativ können die Nachweisverfahren auch direkt markierte polyklonale Antikörper einschließen, wobei die Markierung aus den oben beschriebenen Elementen besteht, die für monoklonale Antikörper aufgeführt wurden. Weiter kann ein markierter sekundärer Antikörper, der ein polyklonaler anti-erster Antikörper ist, wie Ziegen-anti-Maus-IgG-Konjugat, als Nachweisverfahren verwendet werden. Andere Nachweisverfahren umfassen die Verwendung eines markierten zweiten Reagens, bei dem es sich nicht notwendigerweise um einen Antikörper handelt, wie AP-Streptavidin; eines markierten sekundären Antikörpers, der ein anti-konjugiertes Epitop ist, wie HRP-Ziegen-Antifluorescein und AP-Kaninchen-anti-DNP; und eines unmarkierten sekundären Antikörpers, der mit einem markierten tertiären Antikörper oder einer markierten tertiären Komponente nachgewiesen wird.
In Extrakten, in denen die antigenen Proteine nur einen winzigen Bruchteil des Gesamt-Proteins darstellen, kann die Zahl und die Größe der Proteine mit einem speziellen Epitop rasch durch Western-Blotting bestimmt werden. Wester-Blotting besteht aus der elektrophoretischen Übertragung eines antigenen Proteins oder antigener Proteine aus einem Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgel (SDS-PAGE) auf ein Nitrocellulose-Filter, das auf einer Seite auf das Gel gegeben wird, und wenn das Protein übertragen wird, wird dessen Position auf dem SDS-PAGE-Gel konserviert. Das übertragene Protein bindet fest und nicht-kovalent an die Nitrocellulose und kann einem primären Antikörper ausgesetzt werden, der sich daran binden wird. Dieser gebundene primäre Antikörper kann dann an einen sekundären Antikörper gebunden werden, der eine kovalent angebrachte Markierung enthält, die sichtbar gemacht werden kann. Wenn ein markierter spezifischer Antikörper nicht verfügbar ist, können Antigen-Antikörper-Komplexe durch Zugabe eines sekundären Anti-Isotop-Antikörpers, der entweder radiomarkiert oder Enzym-markiert ist, nachgewiesen werden, und die Bande wird durch Autoradiographie oder Substratzugabe sichtbar gemacht. Nur die Proteine mit dem Epitop werden auf diese Weise sichtbar gemacht, und wenn mehrere Proteine mit verschiedenen Molekulargewichten das Epitop aufweisen, wird jedes als getrennte Bande auf der Nitrocellulose gesehen (S. Hockfield et al., Selected Methods for Antibody and Nucleic Acid Probes, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1993, S. 293–316).
Western-Blotting kann entweder ein gegebenes Protein-Antigen oder einen spezifischen Antikörper identifizieren. Zum Beispiel wurde Western-Blotting verwendet, um die Hüllen- oder Kernproteine von HIV und die Antikörper zu diesen Komponenten im Serum von HIV-infizierten Individuen zu identifizieren.
Immuno-PCR, ein Hybrid aus PCR- und Immunassay-System, vereinigt die vielseitige molekulares Erkennung von Antikörpern mit dem Amplifikationspotential der DNA-Replikation. Die Technik beinhaltet die in-situ-Zusammenführung des markierten DNA-Antikörper-Komplexes während des Assays, was eine variable Stöchiometrie sowohl der Anbringung der DNA-Markierung als auch der Zusammenstellung der Komponenten schafft.
Die komplexe Vorgehensweise von Immuno-PCR ist durch die direkte chemische Anbringung von DNA an analytische Antikörper verringert worden, wodurch immobilisierte Einfang-Antikörper und ein Reporter-Antikörper, der eine kovalent angebrachte DNA-Markierung trägt, verwendet werden, und die Assay-Antwort wird durch PCR der DNA-Markierung und den Nachweis der Amplifikationsprodukte erhalten. Diese Technik ist modifiziert worden, um einen Immuno-PCR-Sandwich-Assay für mehrere Analyten zu entwickeln (siehe R.D. Joerger et al., Clinical Chemistry, 1995, 41(9): 1371–1377; E.R. Hendrickson et al., Nucl. Acids Res., 1995, 23(3): 522–529; und T. Sano et al., Science, 1992, 258: 120–122).
Jedoch ist Immuno-PCR, obwohl sie gegenüber herkömmlichen Verfahren eine erhöhte Empfindlichkeit zeigt, zeitaufwändig, komplex und eignet sich nicht für eine Automatisierung.
Um eine spezielle Nucleinsäuresequenz nachzuweisen, wird eine hoch spezifische Sonden-DNA- oder RNA-Sequenz (die zum Ganzen oder einem Teil der zu bestimmenden Sequenz komplementär ist) isoliert, durch Klonieren amplifiziert, bis zur Homogenität gereinigt und mit einem geeigneten Marker markiert. Die gereinigte, markierte DNA wird zu einer Hybridisierungslösung gegeben, die denaturierte Nucleinsäuren (RNA oder DNA) aus einer zu testenden Probe enthält. Die wässrigen Bedingungen der Hybridisierungslösung werden so angepasst, dass eine Nucleinsäure-Hybridisierung oder -Renaturierung dadurch ermöglicht wird, dass markierte Moleküle mit unmarkierten komplementären Sequenz-Gegenstücken hybridisieren. Die Doppelstrang-Bildung kann durch Verdau mit Einzelstrang-spezifischen Nucleasen (wie S1-Nuclease) überwacht werden. Die Gewinnung und Quantifizierung von beständigem, d.h. doppelsträngigem rehybridisiertem Material liefert ein Maß für die Nucleinsäure-Sequenz, auf die getestet wird. Die Hybridisierungsmenge ist eine Funktion der anfänglichen DNA-Konzentration und der Zeit, die für die Rehybridisierung gestattet wird. Deshalb kann eine erhöhte anfängliche DNA-Konzentration zu wesentlich verringerten Hybridisierungszeiten führen.
Ein Beispiel für die Verwendung von spezifischer Hybridisierung, um Sequenzen von Oligonucleotiden nachzuweisen, ist jenes, das von Southern, E., J. Mol. Biol. 98: 503, 1997, beschrieben wurde. In diesem Assay wird eine Probe, welche die nachzuweisende DNA-Sequenz enthält, gereinigt, mit geeigneten Restriktionsendonucleasen verdaut, und die Fragmente werden durch Gelelektrophorese getrennt. Die Fragmente werden dann an einen geeigneten festen Träger, wie Nitrocellulose, gebunden. Diese Bindung erfordert mindestens 12 bis 16 Stunden in Anwesenheit einer Lösung, die eine relativ hohe Konzentration an Natriumchlorid enthält. Eine markierte Sonde, die komplementär zu den zu bestimmenden Sequenzen ist, wird dann zu der Nitrocellulose gegeben und über eine Zeitspanne von 12 bis 48 Stunden hybridisieren gelassen. Nach dieser Zeitspanne muss die Nitrocellulose unter geeigneten Salz- und Temperaturbedingungen gewaschen werden, da anderenfalls die markierte Sonde nichtspezifisch sowohl an die Membran als auch an andere nicht-homologe DNA-Sequenzen binden, was zu Hintergrund "rauschen" oder "falsch Positiven" führt.
In einer vereinfachten Version des oben beschriebenen Southern-Hybridisierungsassays werden zu analysierende Nucleinsäure-Proben in nicht-fraktioniertem Zustand auf einen festen Träger "getüpfelt". Der feste Träger wird dann wie in dem Southern-Hybridisierungsassay sondiert, gewaschen, und die Menge an gebundener Probe wird quantifiziert.
Jedoch gibt es keine Lehren im Stand der Technik zur Verwendung der oben identifizierten Techniken als Mittel zur Überwachung der Anwesenheit eines interessierenden Antigens in einer Western-Blot-Assay ohne das zusätzliche Erfordernis der PCR der DNA-Markierung und des Nachweises der Amplifikationsprodukte.
Die internationale Veröffentlichung Nr. WO 95/27902 betrifft den statistischen Nachweis von Antigenen mit Antikörpern, die an Reagenzien vom Dendrimer-Typ immobilisiert sind. Die in dieser Patentveröffentlichung offenbarten Dendrimere sind "starburst*"-Dendrimere, die von der Dow Chemical Company hergestellt werden und die keine Nucleinsäuren enthalten. Die Veröffentlichung in Clinical Chemistry (Band 42, Nr. 6, S. S202) betrifft eine Dendrimer-Signalverstärkung in Blot-Assays, welche die Anwesenheit von Nucleinsäuren nachweisen. Die internationale Veröffentlichung Nr. WO 94/26932 ist auf einen Assay gerichtet, der die Anwesenheit eines Antigens oder Antikörpers, das auf einem festen Träger immobilisiert ist, durch Umsetzen desselben mit einem immunoreaktiven Liganden nachweist, der an ein Oligonucleotid gebunden ist. Die Anwesenheit des Antigens oder Antikörpers wird indirekt durch Nachweisen der Anwesenheit des Oligonucleotids auf dem festen Träger nachgewiesen.
Die U.S. Patente Nr. 5,175,270 und 5,487,973 an Nilsen et al. sind auf Dendrimere gerichtet, eine Klasse von Reagenzien zum Bestimmen von Nucleinsäuresequenzen, die aufeinanderfolgende Schichten von Polynucleotiden umfassen, die eine doppelsträngige Taille und einzelsträngige freie Arme an den Enden des Moleküls einschließen und durch Hybridisierung der Arme an benachbarte Molekülarme gebildet werden. Die Polynucleotide der Außenschicht sind durch ihre nicht-hybridisierten freien einzelsträngigen Arme für die zu identifizierende Sequenz spezifisch, wie in der US-A-5 175 270 beschrieben; das heißt, ein dendritisches Polynucleotid mit einer Vielzahl von einzelsträngigen Hybridisierungsarmen; wobei das dendritische Polynucleotid eine Vielzahl von Matrix-Polynucleotid-Monomeren umfasst, die durch Hybridisierung zusammengebunden sind; wobei jedes Matrix-Polynucleotid-Monomer, bevor es durch Hybridisierung an andere Matrix-Polynucleotid-Monomere gebunden wird, mindestens drei einzelsträngige Hybridisierungsregionen aufweist; und in dem dendritischen Polynucleotid ist jedes Matrix-Polynucleotid-Monomer an mindestens ein weiteres Matrix-Polynucieotid-Monomer an mindestens einer derartigen Hybridisierungsregion durch Hybridisierung gebunden, und wenn es durch Hybridisierung an mehr als eine derartige Hybridisierungsregion desselben Matrix-Polynucleotid-Monomers gebunden ist, gibt es eine Zwischenregion, wo die zwei Monomere nicht durch Hybridisierung gebunden sind; wobei jedes Matrix-Polynucleotid-Monomer vor der Bindung durch Hybridisierung eine lineare doppelsträngige Taillenregion mit einem ersten Ende und einem zweiten Ende aufweist, wobei das erste Ende in zwei einzelsträngigen Hybridisierungsregionen endet, jede aus einem Strang aus der Taillenregion, und das zweite Ende mit einer oder zwei einzelsträngigen Hybridisierungsregion(en) endet, jede aus einem Strang der Taillenregion; und die Vielzahl der vorhandenen Polynucleotid-Monomere nicht die Sättigung des dendritischen Polynucleotids überschreitet.
Es wäre vorteilhaft, ein Verfahren zum Antikörper-Nachweis zu entwickeln, das eine Western-Blot-Technik mit den Oligonucleotid-Antikörper-Konjugaten und der Empfindlichkeit von DNA-Dendrimeren ohne die Notwendigkeit zur Durchführung von PCR der Oligonucleotid-Markierung verwendet, um den Antigen-Antikörper-Komplex nachzuweisen.
GEGENSTÄNDE UND ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Es ist ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zum Nachweis eines Antigens bereitzustellen, wie es in den Ansprüchen 1, 9 oder 16 beansprucht ist. Weitere Aspekte der vorliegenden Erfindung sind in den Ansprüchen 2–8, 10–15 und 17 beansprucht.
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung stellt ein Mittel zum In-Kontakt-Bringen eines immobilisierten Antigens mit einem primären oder sekundären Antikörper bereit, der durch ein an dem Antikörper angebrachtes Oligonucleotid an ein Dendrimer komplexiert ist, wodurch ein Immunodendrimer gebildet wird, das mittels einer an dem Dendrimer angebrachten Markierung oder durch In-Kontakt-Bringen des festen Trägers mit einem Anti-Dendrimer-Antikörper nachgewiesen werden kann.
Weiter ist es ein Gegenstand der Erfindung, einen Oligonucieotid-Antikörper-Komplex bereitzustellen, in dem das Oligonucleotid mit ³²P markiert ist.
Es ist ein weiterer Gegenstand der Erfindung, ein Verfahren zum Nachweis eines markierten Immunodendrimers bereitzustellen, in dem die Markierung ein Fluorochrom, ein Enzym, ein Schwermetall-Chelat, ein zweiter Reporter oder ein radioaktives Isotop ist.
Diese und andere Ausführungsformen sind in der folgenden detaillierten Beschreibung offenbart oder werden daraus ersichtlich.
KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
1A zeigt eine schematische Darstellung eines ³²P-Assays für den Nachweis eines Antigen-Antikörpers-Komplexes mit einem C(–)-Oligonucleotid-konjugierten sekundären Antikörper, der durch ³²P-markiertes C(+)-Oligonucleotid markiert ist; und
1B zeigt eine schematische Darstellung eines ³²P-Immunodendrimer-Assays, in dem C(+)-Arme des Dendrimers durch ein C(–)-Oligonucleotid an einen sekundären Antikörper konjugiert sind und in dem das Dendrimer durch ein ³²P-markiertes A(–)-Oligonucleotid nachgewiesen wird, das an die A(+)-Arme des Dendrimers hybridisiert ist.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Der Nachweis von Antigen kann über Oligonucleotid-Antikörper-Konjugate, die unter Bildung von Immunodendrimeren an Dendrimere hybridisiert sind, signifikant verstärkt werden. Einer der Schlüsselvorteile der Oligonucleotid-Antikörper-Konjugate ist die leichte Markierung der Oligonucleotid-Einheit mit radioaktivem Phosphor, Biotin, Digoxigenin und vielen anderen Marker. Immunodendrimere können das Signal in herkömmlichen Western-Blots und in der Immunhistochemie amplifizieren, indem sie mehrere Markermoleküle einem einzigen Antigen-Antikörper-Komplex zuführen.
In einem herkömmlichen Western-Blot-Assay wird das Antigen mit einem primären Antikörper markiert, und der primäre Antikörper wird durch einen an ein Reportermolekül konjugierten sekundären Antikörper nachgewiesen. Der Antigen-Antikörper-Komplex wird durch Analyse der Anwesenheit jedes Reportermoleküls nachgewiesen, was auf ein einziges Reportermolekül pro Antigen-Antikörper-Komplex beschränkt ist. Wenn der Antigen-Antikörper-Komplex bei sehr niedrigen Konzentrationen vorliegt, kann der Nachweis des Reportermoleküls schwierig und von unspezifischen Wechselwirkungen überschattet sein.
Es wurde überraschend gefunden, dass durch die Verwendung eines entweder primären oder sekundären Antikörpers, der mit einem interessierenden Antigen einen Antigen-Antikörperkomplex bilden kann, wobei der Antikörper mit einem Oligonucleotid komplexiert ist, das mit einem markierten DNA-Dendrimer hybridisiert ist, die Empfindlichkeit des Nachweises des Antigen-Antikörper-Komplexes wesentlich erhöht wird. Die markierten DNA-Dendrimere, die als Reportermoleküle dienen, ermöglichen, dass eine Mehrzahl von Markermolekülen mit einem einzigen Antikörper-Antigen-Komplex assoziiert ist, wodurch das Nachweissignal um einen Faktor gleich der Zahl der markierten Dendrimere, die an das Oligonucleotid komplexiert sind, verstärkt wird.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Antigen an einem festen Träger immobilisiert und mit einem ersten Antikörper in Kontakt gebracht, wodurch ein Antigen-Antikörper-Komplex gebildet wird. Der feste Träger wird dann mit einer Lösung in Kontakt gebracht, die ein Immunodendrimer umfasst, wobei das Immunodendrimer einen anti-ersten Antikörper (oder sekundären Antikörper) umfasst, der ein daran komplexiertes Oligonucleotid und ein markiertes Dendrimer aufweist, das durch ein oder mehrere der äußersten Schichten des Dendrimers, d.h. die einzelsträngigen ("Arm-") Sequenzen des Dendrimers, an das Oligonucleotid hybridisiert ist. Der anti-erste Antikörper des Immunodendrimers bildet einen Komplex mit dem ersten Antikörper, und das Antigen wird durch Nachweis der Anwesenheit von Immunodendrimer quantifiziert.
Alternativ kann ein Antigen durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung nachgewiesen werden, indem man ein Antigen an einem festen Träger immobilisiert und den festen Träger mit einer Lösung in Kontakt bringt, die ein Immunodendrimer umfasst, wobei das Immunodendrimer einen Antikörper umfasst, der einen Antigen-Antikörper-Komplex mit dem immobilisierten Antigen bilden kann, wobei Antikörper ein daran komplexiertes Oligonucleotid aufweist, wobei ein markiertes Dendrimer mit dem Oligonucleotid hybridisiert ist. Das Antigen wird durch Nachweis der Anwesenheit von Immunodendrimer quantifiziert.
In einer weiteren alternativen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann ein Antigen nachgewiesen werden, indem man das Antigen an einem festen Träger immobilisiert und den festen Träger mit einer Lösung in Kontakt bringt, die einen ersten Antikörper umfasst, wodurch ein Antigen-Antikörper-Komplex gebildet wird. Anschließend wird der feste Träger mit einer Lösung in Kontakt gebracht, die ein Immunodendrimer umfasst, wobei das Immunodendrimer einen anti-ersten Antikörper (d.h. sekundären Antikörper) umfasst, der ein daran komplexiertes Oligonucleotid und ein mit dem Oligonucleotid hybridisiertes Dendrimer aufweist, wobei der anti-erste Antikörper einen Komplex mit dem ersten Antikörper bildet. Danach wird der feste Träger mit einer Lösung in Kontakt gebracht, die einen markierten teritären Anti-Dendrimer-Antikörper umfasst, wobei der tertiäre Antikörper einen Komplex mit dem mit dem Oligonucleotid hybridisierten Dendrimer bildet und die Menge an Antigen durch Nachweis der Anwesenheit von markiertem tertiärem Antikörper quantifiziert wird.
In einer Ausführungsform der Erfindung können die Dendrimere durch Standardtechniken, d.h. durch die Verwendung von Fluorochromen (oder fluoreszierenden Verbindungen), Enzymen (z.B. alkalische Phosphatase und Meerrettichperoxidase), Schwermetall-Chelaten, zweiten Reportern oder radioaktiven Isotopen, markiert werden.
Alternativ können die Oligonucleotide, die im Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden, mit radioaktivem Phosphor radiomarkiert werden. In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Oligonucleotid am 5'-Ende an den Antikörper komplexiert, und das 3'-Ende wird mit ³²P markiert. Die ³²P-markierten Oligonucleotid-Antikörper-Konjugate können durch dem Fachmann wohlbekannte herkömmliche Verfahren gebildet werden, z.B. durch direkte kovalente Verknüpfung des Oligonucleotids mit dem Antikörper, wobei der Antikörper und das 5'-Amino-modifizierte Oligonucleotid unabhängig mittels getrennter heterobifunktioneller Vernetzungsmittel aktiviert werden (siehe E. Hendrickson, T. Hatfield Truby, R. Joerger, W. Majarian und R. Ebersole, Nucl. Acids Res., 1995, 23(3): 522-529). Derartige Oligonucleotid-Antikörper-Konjugate sind aufgrund der hohen Energie von radioaktivem Phosphor und der relativ kurzen Halbwertszeit sehr attraktive Markierungen. Weiter ermöglicht die Verwendung von radioaktivem Phosphor die Verwendung einer Phosphorbildgebungsvorrichtung zum Nachweis der Menge an Isotop in dem Antigen-Antikörper-Komplex. Phosphorbildgebungsvorrichtungen liefern eine quantitative Information über die Menge an Isotop auf einer Membran, wodurch die Quantifizierung des Signals in einem Western-Blot-Assay verbessert wird.
Die in der vorliegenden Erfindung verwendeten DNA-Dendrimere sind Konstrukte, die DNA-Schichten umfassen. Die äußerste Schicht eines gegebenen DNA-Dendrimers weist einzelsträngige Sequenzen ("Arme") auf, die an der Oberfläche freiliegen und mit einer vorbestimmten Nucleinsäuresequenz hybridisieren werden, die an den Antikörper komplexiert ist.
Weiter kann das Oligonucleotid mit einer ersten Sequenz des Dendrimers hybridisiert werden und gleichzeitig auch mit einer zweiten Sequenz des Dendrimers hybridisiert werden. Alternativ können mehrere markierte Dendrimere, von denen jedes Sequenzen aufweist, die zu einer anderen Sequenz der Oligonucleotid-Arme komplementär sind, mit einem einzigen an einen Antikörper komplexierten Oligonucleotid hybridisiert werden, wodurch ermöglicht wird, dass eine Mehrzahl von markierten Molekülen an den Antigen-Antikörper-Komplex komplexiert wird und der Nachweis des Signals verstärkt wird, das mit jedem Antigen-Antikörper-Komplex verbunden ist.
Jede Schicht des Dendrimer-Moleküls ist aus einer speziellen Klasse von Matrix-Monomeren zusammengesetzt. Matrix-Monomere weisen die Eigenschaft auf, dass die aufeinanderfolgende Addition von Monomeren eine dreidimensionale DNA-Dendrimer-Matrix liefert. Die Dendrimere sind analog zu biologischen Membranen, indem sie für spezifische Substanzen, z.B. komplementäre DNA-Sequenzen, die an einen Antikörper komplexiert sind, selektiv permeabel sind.
Verfahren zur Herstellung und Verwendung der DNA-Dendrimere, die in dem Assay der vorliegenden Erfindung verwendet werden, sind in den U.S. Patenten Nr. 5,175,270 und 5,487,973 beschrieben.
Zusätzlich kann ein direkt markierter monoklonaler oder polyklonaler primärer Antikörper, der an ein Oligonucleotid konjugiert ist, das mit einem Dendrimer hybridisiert werden kann, im Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Das Dendrimer kann durch einen zweiten Reporter, wie Biotin, ein Fluorochrom, ein Enzym, ein Schwermetall-Chelat oder ein radioaktives Isotop, markiert werden und durch Standardverfahren nachgewiesen werden. Alternativ kann das Dendrimer (oder Immunodendrimer) durch In-Kontakt-Bringen des festen Trägers mit einem markierten Anti-Dendrimer-Antikörper und Verwendung herkömmlicher Verfahren zur Quantifizierung der vorhandenen Markierungsmenge nachgewiesen werden.
Die im Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendeten Antikörper können entweder monoklonal oder polyklonal sein. Kurz gesagt, werden monoklonale Antikörper durch Hybridome sekretiert, welche durch Fusion einer unsterblichen Zelle (einer Myelomzelle) mit einer Antikörper-sekretierenden Zelle (einem Lymphozyten), die aus einem immunisierten Tier geerntet wird, produziert werden. Die polyklonale Antwort eines Tiers auf ein Antigen oder eine Mischung derselben kann dadurch durch den Einzelzellen-Klonierungsprozess, der an der Hybridom-Produktion beteiligt ist, in ihre einzelnen Komponenten zerlegt werden.
Zusätzlich kann auch ein Antikörper, der ein anti-konjugiertes Hapten ist, im Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Antikörper dieser Art sind typisch monoklonal und erkennen das spezielle Hapten, wie Dinitrophenol (DNP), wenn es typisch an einen zweiten Antikörper, wie Ziegen-anti-Maus, konjugiert ist.
Darüber hinaus kann markierter sekundärer Antikörper, bei dem es sich um polyklonalen anti-ersten Antikörper handelt, verwendet werden. Alternativ können unmarkierte sekundäre Antikörper, die durch einen markierten tertiären antisekundären Antikörper oder einen tertiären Anti-Dendrimer-Antikörper (wenn ein Dendrimer, das an ein Oligonucleotid komplexiert ist, welches an einen gebundenen sekundären Antikörper geknüpft ist, verwendet wird) nachgewiesen wird, in der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
Verfahren zur Erzeugung von sowohl polyklonalen als auch monoklonalen Antikörpern können in Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Aufl. von J. Sambrook, E.F. Fritsch und T. Maniatis (1989), Bd. 3, S. 18.2–18.18, und Selected Methods for Antibody and Nucleic Acid Probes, von S. Hockfield et al. (1993), S. 59–109, gefunden werden.
Die verschiedenen Permutationen bei den Antikörpern, die zur Verwendung im Verfahren der vorliegenden Erfindung erhältlich sind, sind dem gewöhnlichen Fachmann auf dem Gebiet der Immunologie offenkundig. Der Fachmann erkennt, dass ungeachtet der Kombinationen von verwendeten Antikörpern das Verfahren der vorliegenden Erfindung universell verwendet werden kann, um ein Dendrimer an einen Antikörper für den Nachweis von Antigen zu komplexieren.
Weiter kann jedes herkömmliche Verfahren zur Markierung von Dendrimeren (oder Oligonucleotiden) für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Diese Verfahren umfassen die Verwendung von Enzymen, wie alkalischer Phosphatase und Meerrettichperoxidase, zweiten Reportern, wie Biotin, mit zweiten Reportermolekülen, die dazu komplementär sind, wie Avidin, Streptavidin und Anti-Biotin-Antikörpern, Schwermetall-Chelaten, wie Gold, radioaktiven Isotopen, d.h. ¹²⁵I, ³H, ³⁵S und ³²P, und Fluorochromen (fluoreszierenden Verbindungen), d.h. Fluorescein und Rhodamin.
Ähnlich kann jedes Verfahren, das für den Nachweis der oben angegebenen Markierungen verfügbar ist, im Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden, wie Autoradiographie, Fluorographie, Phosphorbildgebung und Fluorimetrie. Der Fachmann erkennt, dass jede der oben erwähnten Permutationen im Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann, ohne vom Geist oder Bereich derselben abzuweichen und ohne die Bürde übermäßiger Experimente.
Die vorliegende Erfindung wird weiter in den folgenden Beispielen beschrieben und erläutert. Weitere Gegenstände dieser Erfindung werden zusammen mit zusätzlichen Merkmalen, die dazu beitragen, und Vorteile, die daraus erwachsen, aus den folgenden Beispielen der Erfindung ersichtlich. Man wird anerkennen, dass Abwandlungen und Modifikationen der Produkte und Verfahren vom Fachmann vorgenommen werden können, ohne vom Geist oder Bereich der Erfindung abzuweichen, wie er in den beigefügten Ansprüchen definiert ist.
BEISPIELE
Beispiel 1 - Signal-Amplifikation in Western-Blot
Beta-Galactosidase (Sigma) wurde 1:10 reihenverdünnt und auf 4–20% SDS-PAGE-Gel (Novex) aufgetragen. Monoklonaler Maus-anti-bgal (Klon gal-13) wurde als primärer Antikörper verwendet. Polyklonaler Kaninchen-anti-Maus-AP wurde als der markierte sekundäre Antikörper im herkömmlichen Western-Blot-Nachweismodus verwendet. Polyklonaler Ziegen-anti-Maus-Antikörper wurde durch Synthetic Genetics an 5'-NH₃-Oligonucleotid konjugiert. DNA-Dendrimere wurden von Polyprobe Inc. erhalten und wurden mit dem Rad-Free^TM-Markierungssystem mit Biotin markiert.
In einem Standard-Western-Blot-Assay wurden reihenverdünnte Proben von beta-Galactosidase-Antigen durch SDS-PAGE aufgetrennt, und die Proteinbanden wurden unter Verwendung einer halbtrockenen Vorrichtung (Novex) auf das Nitrocellulose-Filter übertragen.
Als die Übertragung der Proteine auf die Nitrocellulose beendet war, wurde die Nitrocellulose von dem SDS-PAGE-Gel getrennt und in einer konzentrierten nichtantigenen Proteinlösung, d.h. Blockierungslösung, z.B. 5% Gew./Vol. fettfreie Trockenmilch, eingeweicht. Das Protein in der Lösung bindet sich unspezifisch an alle Bereiche auf der Nitrocellulose, die nicht bereits Protein aus dem SDS-PAGE-Gel adsorbiert haben, in einem Versuch, zu verhindern, dass die Antikörper unspezifisch an die Nitrocellulose binden, und um die Wahrscheinlichkeit zu erhöhen, dass sie nur an die immobilisierten Antigen-Proteine binden. Um weiter sicherzustellen, dass die Antikörper nicht unspezifisch an die Nitrocellulose oder irrelevante Proteine auf der Nitrocellulose binden, wurden die Antikörper in der nicht-antigenen Proteinlösung verdünnt, bevor sie auf die Nitrocellulose aufgetragen wurden.
Die Nitrocellulose wurde mit verdünntem monoklonalem Maus-anti-beta-Galactosidase sondiert, und die Membran wurde daraufhin in Puffer (TBS/Tween 20, worin TBS Tris-gepufferte Kochsalzlösung ist und Tween 20 PEG (20)-Sorbitanmonolaurat ist; der TBS/Tween 20-Puffer besteht aus 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl und 0,1% Tween 20) bei Raumtemperatur gewaschen. Die Waschlösung wurde verworfen, und die Membran wurde mit Kaninchen-anti-Maus-AP sondiert. Die Antikörperlösung wurde entfernt, und die Membran wurde daraufhin in TBS/Tween 20 gewaschen. Luminphos-530 wurde dazugegeben, und die Nitrocellulose wurde Röntgenfilm ausgesetzt (Ergebnisse nicht gezeigt).
Im Assay der vorliegenden Erfindung wurden reihenverdünnte Proben von beta-Galactosidase-Antigen (unter Verwendung des gleichen Verdünnungsverhältnisses, das im vorstehend beschriebenen herkömmlichen Western-Assay verwendet wird) durch SDS-PAGE aufgetrennt, und die Proteinbanden wurden auf das Nitrocellulose-Filter übertragen.
Als die Übertragung der Proteine auf die Nitrocellulose beendet war, wurde die Nitrocellulose von dem SDS-PAGE-Gel getrennt und in einer konzentrierten nichtantigenen Proteinlösung (d.h. Blockierungslösung, z.B. 5% Gew./Vol. fettfreie Trockenmilch) eingeweicht.
Die Nitrocellulose wurde mit verdünntem, monoklonalem Maus-anti-beta-Galactosidase sondiert, und die Membran wurde daraufhin in TBS/Tween 20 gewaschen. Die Waschlösung wurde verworfen, und die Membran wurde mit Ziegen-anti-Maus-Dendrimer sondiert. Die Membran wurde daraufhin in TBS/Tween 20 gewaschen, und die Membran wurde mit Streptavidin-AP sondiert. Die Antikörper-Lösung wurde entfernt, und die Membran wurde daraufhin in TBS/Tween 20 gewaschen. Luminphos-530 wurde dazugegeben, und die Nitrocellulose wurde Röntgenfilm ausgesetzt (Ergebnisse nicht gezeigt).
Die Daten (nicht gezeigt) demonstrierten klar eine überlegene Empfindlichkeit des Blots, der mit DNA-Dendrimeren sondiert wurde.
Beispiel 2 - ³²P-Western-Assay
Beta-Galactosidase (Sigma) wurde reihenverdünnt (1:10) und auf 4–20% SDS-PAGE (NOVEX) aufgetragen. Monoklonaler Maus-anti-bgal (Klon gal-13) war der primäre Antikörper; polyklonaler Ziegen-anti-Maus-Antikörper, der durch Synthetic Genetics an 5'-Oligonucleotid konjugiert war (das C(–)-Oligonucleotid), war der sekundäre Antikörper; und 5'-³²P-markiertes C(+)-Oligonucleotid war die Sonde. Immunodendrimere wurden durch Vereinigen von etwa 100 ng C(–)-Oligonucleotid eines C(–)-Antikörper-Konjugats (Synthetic Genetics) und insgesamt 1 μg Vierschicht-Dendrimer in 100 μl TBS/Tween 20 gebildet. Man ließ das Oligonucleotid mindestens 1 Stunde lang bei 37°C hybridisieren.
In einem ³²P-Western-Assay wurden reihenverdünnte Proben von beta-Galactosidase durch SDS-PAGE aufgetrennt, und die Proteinbanden wurden auf ein Nitrocellulose-Filter überführt.
Als die Übertragung der Proteine auf die Nitrocellulose beendet war, wurde die Nitrocellulose von dem SDS-PAGE-Gel getrennt und in konzentrierter nichtantigener Proteinlösung, d.h. Blockierungslösung, z.B. 5% Gew./Vol. fettfreie Trockenmilch, eingeweicht.
Die Nitrocellulose wurde mit verdünntem monoklonalem Maus-anti-beta-Galactosidase sondiert, die Membran wurde daraufhin in TBS/Tween 20 gewaschen, und die Waschlösung wurde verworfen. ³²P-C(+)-Oligonucleotid wurde mit sekundärem C(–)-Antikörper-Konjugat hybridisiert. Die Membran wurde mit dem ³²P-C(+)-Oligonucleotid-C(–)-Antikörper-Konjugat sondiert, daraufhin in TBS/Tween 20 gewaschen und Röntgenfilm ausgesetzt. Der Assay ist schematisch in 1A gezeigt.
Zum Vergleich ist ein Antigen-Nachweis durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung, d.h. unter Verwendung eines Immunodendrimers und einer ³²P-markierten Oligonucleotid-Sonde, schematisch in 1B gezeigt. Kurz gesagt, wurden in einem ³²P-Western-Assay reihenverdünnte Proben von beta-Galactosidase durch SDS-PAGE aufgetrennt und auf Nitrocellulose übertragen, wie vorstehend beschrieben.
Die Nitrocellulose wurde mit verdünntem monoklonalem Maus-anti-beta-Galactosidase sondiert, und die Membran wurde daraufhin in TBS/Tween 20 gewaschen.
Ein Vierschicht-Dendrimer mit C(+)-Oligonucleotid-Armen, die komplementär zu dem C(–)-Oligonucleotid waren, das an den sekundären Antikörper komplexiert war, und A(+)-Oligonucleotid-Armen (wobei die Oligonucleotid-Arme, die als A(+) und C(+) bezeichnet werden, verschieden sind), wurde als Sonde verwendet. ³²P-A(–)-Oligonucleotid und C(–)-Antikörper-Konjugat wurden mit einem Vierschicht-Dendrimer hybridisiert, wobei das 5'-³²P-markierte A(–)-Oligonucleotid komplementär zu den A(+)-Armen des Immunodendrimers war. Die Membran wurde mit der vorhybridisierten markierten Konjugat-Dendrimer-Zusammenstellung sondiert, und die Membran wurde in TBS/Tween 20 gewaschen. Die Membran wurde daraufhin in TBS/Tween 20 gewaschen und Röntgenfilm ausgesetzt.
Die Ergebnisse demonstrierten klar das verstärkte Signal, das mit der Verwendung eines Immunodendrimers verbunden war. ³²P-markierte Oligonucleotid-Antikörper-Konjugate sind aufgrund der hohen Energie von ³²P und der kurzen Halbwertszeit sehr attraktive Markierungen. Zusätzlich können als Alternative zum Röntgennachweis Phosphorbildgebungsvorrichtungen verwendet werden, die in der Lage sind, eine quantitative Information über die Menge an Isotop auf einem Western-Blot zu liefern, wodurch die Quantifizierung des Western-Blot-Assays verbessert wird.

Claims

In-vitro-Verfahren zum Nachweis eines Antigens, umfassend: Immobilisieren eines Antigens an einem festen Träger; In-Kontakt-Bringen des festen Trägers mit einer ersten Lösung, die einen ersten Antikörper umfasst, der das immobilisierte Antigen bindet; In-Kontakt-Bringen des festen Trägers mit einer zweiten Lösung, die ein Immunodendrimer umfasst, wobei das Immunodendrimer einen Anti-ersten-Antikörper umfasst, der ein daran komplexiertes Oligonukleotid und ein markiertes DNA-Dendrimer aufweist, welches an das Oligonukleotid hybridisiert ist, wobei der Anti-erste-Antikörper einen Komplex mit dem ersten Antikörper bildet; und quantitatives Bestimmen der Menge des vorhandenen Antigens durch Nachweisen der Anwesenheit von Immunodendrimer.
Verfahren nach Anspruch 1, in dem das Oligonukleotid an einen ersten einzelsträngigen Hybridisierungsarm des markierten DNA-Dendrimers hybridisiert ist und ein zweites markiertes Oligonukleotid an einen zweiten einzelsträngigen Hybridisierungsarm des markierten DNA-Dendrimers durch Hybridisierung gebunden ist.
Verfahren nach Anspruch 1, in dem das Oligonukleotid ein 3'- und ein 5'-Ende aufweist, wobei das Oligonukleotid an dem 5'-Ende an den Anti-ersten-Antikörper komplexiert ist und das 3'-Ende des Oligonukleotids mit ³²P markiert ist.
Verfahren nach Anspruch 3, in dem das Oligonukleotid an einen ersten einzelsträngigen Hybridisierungsarm des markierten DNA-Dendrimers hybridisiert ist und ein zweites markiertes Oligonukleotid an einen zweiten einzelsträngigen Hybridisierungsarm des markierten DNA-Dendrimers hybridisiert ist.
Verfahren nach Anspruch 1, in dem das markierte DNA-Dendrimer mit einem ersten sekundären Reporter markiert ist und die Menge des Antigens durch Zugabe eines zweiten sekundären Reporters nachgewiesen wird, der komplementär zu dem ersten sekundären Reporter ist und an ein Molekül konjugiert ist, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem Fluorochrom, einem Enzym, einem Schwermetall-Chelat und einem radioaktiven Isotop.
Verfahren nach Anspruch 5, in dem der erste sekundäre Reporter Biotin ist und der zweite sekundäre Reporter ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Avidin, Streptavidin und Anti-Biotin-Antikörper.
Verfahren nach Anspruch 1, in dem das markierte DNA-Dendrimer mit einem Molekül markiert ist, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem Fluorochrom, einem Enzym, einem Schwermetall-Chelat und einem radioaktiven Isotop.
Verfahren nach Anspruch 1, in dem der erste Antikörper monoklonal ist und der Anti-erste-Antikörper polyklonal ist.
In-vitro-Verfahren zum Nachweise eines Antigens, umfassend: Immobilisieren eines Antigens an einem festen Träger; In-Kontakt-Bringen des festen Trägers mit einer Lösung, die ein Immunodendrimer umfasst, wobei das Immunodendrimer einen Antikörper umfasst, der das immobilisierte Antigen bindet, wobei der Antikörper ein daran komplexiertes Oligonukleotid aufweist, wobei das Oligonukleotid ein daran hybridisiertes markiertes DNA-Dendrimer aufweist, und quantitatives Bestimmen der Menge des vorhandenen Antigens durch Nachweisen der Anwesenheit von Immunodendrimer.
Verfahren nach Anspruch 9, in dem das Oligonukleotid ein 3'- und ein 5'-Ende aufweist, wobei das Oligonukleotid an dem 5'-Ende an den Antikörper komplexiert ist und das 3'-Ende des Oligonukleotids mit ³²P markiert ist.
Verfahren nach Anspruch 9, in dem das markierte DNA-Dendrimer mit einem ersten sekundären Reporter markiert ist und die Menge des Antigens durch Zugabe eines zweiten sekundären Reporters nachgewiesen wird, der komplementär zu dem ersten sekundären Reporter ist und an ein Molekül konjugiert ist, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem Fluorochrom, einem Enzym, einem Schwermetall-Chelat und einem radioaktiven Isotop.
Verfahren nach Anspruch 11, in dem der erste sekundäre Reporter Biotin ist und der zweite sekundäre Reporter ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Avidin, Streptavidin und Anti-Biotin-Antikörper.
Verfahren nach Anspruch 9, in dem das markierte DNA-Dendrimer mit einem Molekül markiert ist, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem Fluorochrom, einem Enzym, einem Schwermetall-Chelat und einem radioaktiven Isotop.
Verfahren nach Anspruch 9, in dem der Antikörper monoklonal ist.
Verfahren nach Anspruch 9, in dem das Oligonukleotid an einen ersten einzelsträngigen Hybridisierungsarm des DNA-Dendrimers hybridisiert ist und ein markiertes Oligonukleotid an einen zweiten einzelsträngigen Hybridisierungsarm des DNA-Dendrimers durch Hybridisierung gebunden ist.
In-vitro-Verfahren zum Nachweis eines Antigens, umfassend: Immobilisieren eines Antigens an einem festen Träger; In-Kontakt-Bringen des festen Trägers mit einer ersten Lösung, die einen ersten Antikörper umfasst, der das immobilisierte Antigen bindet; In-Kontakt-Bringen des festen Trägers mit einer zweiten Lösung, die ein Immunodendrimer umfasst, wobei das Immunodendrimer einen Anti-ersten-Antikörper umfasst, der den ersten Antikörper bindet, wobei der Anti-erste-Antikörper daran komplexiert ein Oligonukleotid und ein DNA-Dendrimer aufweist, das an das Oligonukleotid hybridisiert ist, In-Kontakt-Bringen des festen Trägers mit einer dritten Lösung, die einen markierten Tertiär-Anti-Dendrimer-Antikörper umfasst, wobei der markierte Tertiär-Anti-Dendrimer-Antikörper das Immunodendrimer bindet; und quantitatives Bestimmen der Menge des vorhandenen Antigens durch Nachweisen der Anwesenheit von Immunodendrimer.
Verfahren nach Anspruch 16, in dem der markierte Tertiärantikörper mit einem Molekül markiert ist, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem Fluorochrom, einem Enzym, einem Schwermetall-Chelat, einem sekundären Reporter und einem radioaktiven Isotop.