JP7618548B2 - ランダムプライミングを使用した単一細胞の全トランスクリプトーム解析 - Google Patents

ランダムプライミングを使用した単一細胞の全トランスクリプトーム解析 Download PDF

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Description

関連出願
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）に基づき、２０１８年１１月８日に出願された米国特許仮出願第６２／７５７，７５７号の利益を主張するものである。この関連出願の内容は、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
配列表の参照
本出願は、電子形式の配列表と共に出願されている。配列表は、２０１９年１１月７日に作成されたサイズが４キロバイトの６８ＥＢ＿２９８７０５＿ＷＯという名称のファイルとして提供されている。配列表の電子形式の情報は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本開示は、概して、分子生物学の分野に、例えば、分子バーコーディングを使用して細胞の遺伝子発現プロファイルを決定することに関する。
現行技術では、細胞の各々をバーコード化試薬ビーズと共にコンパートメント内に共局在化させながら、個々の細胞に由来するポリ（Ａ）ｍＲＮＡ分子に細胞特異的オリゴヌクレオチドバーコードを付着させることにより、大規模並行様式（例えば、＞１０００個の細胞）で単一細胞の遺伝子発現を測定することが可能である。細胞の遺伝子発現を効率的に定量分析することができる系および方法が必要とされている。
本明細書における開示は、試料中の核酸標的を標識するための方法を含む。一部の実施形態では、本方法は、核酸標的のコピーを複数のオリゴヌクレオチドバーコードと接触させることであって、各オリゴヌクレオチドバーコードは、第１のユニバーサル配列、分子標識、および核酸標的のコピーにハイブリダイズすることが可能な標的結合性領域を含む、こと；核酸標的のコピーにハイブリダイズした複数のオリゴヌクレオチドバーコードを伸長して、複数の第一鎖バーコード化ポリヌクレオチドを生成すること；ランダムプライマーを複数の第一鎖バーコード化ポリヌクレオチドと接触させることであって、ランダムプライマーの各々は、第２のユニバーサル配列またはその相補体を含む、こと；ならびに複数の第一鎖バーコード化ポリヌクレオチドにハイブリダイズしたランダムプライマーを伸長して、複数の伸長産物を生成することを含む。
一部の実施形態では、本方法は、第１のユニバーサル配列またはその相補体にハイブリダイズすることが可能なプライマー、および第２のユニバーサル配列またはその相補体にハイブリダイズすることが可能なプライマーを使用して複数の伸長産物を増幅し、それにより第１の複数のバーコード化アンプリコンを生成することを含む。一部の実施形態では、複数の伸長産物の増幅は、配列決定プライマーおよび／もしくは配列決定アダプターの結合部位の配列、それらの相補配列、ならびに／またはそれらの一部を、複数の伸長産物に付加することを含む。一部の実施形態では、本方法は、第１の複数のバーコード化アンプリコンまたはそれらの産物に付随している別個の配列を有する分子標識の数に基づき、試料中の核酸標的のコピー数を決定することを含む。
本明細書における開示は、試料中の核酸標的の数を決定するための方法を含む。一部の実施形態では、本方法は、核酸標的のコピーを複数のオリゴヌクレオチドバーコードと接触させることであって、各オリゴヌクレオチドバーコードは、第１のユニバーサル配列、分子標識、および核酸標的のコピーにハイブリダイズすることが可能な標的結合性領域を含む、こと；核酸標的のコピーにハイブリダイズした複数のオリゴヌクレオチドバーコードを伸長して、複数の第一鎖バーコード化ポリヌクレオチドを生成すること；ランダムプライマーを複数の第一鎖バーコード化ポリヌクレオチドと接触させることであって、ランダムプライマーの各々は、第２のユニバーサル配列またはその相補体を含む、こと；複数の第一鎖バーコード化ポリヌクレオチドにハイブリダイズしたランダムプライマーを伸長して、複数の伸長産物を生成すること；第１のユニバーサル配列またはその相補体にハイブリダイズすることが可能なプライマー、および第２のユニバーサル配列またはその相補体にハイブリダイズすることが可能なプライマーを使用して複数の伸長産物を増幅し、それにより第１の複数のバーコード化アンプリコンを生成すること；ならびに第１の複数のバーコード化アンプリコンまたはそれらの産物に付随している別個の配列を有する分子標識の数に基づき、試料中の核酸標的のコピー数を決定することを含む。
一部の実施形態では、核酸標的のコピーの接触は、複数の核酸標的のコピーを複数のオリゴヌクレオチドバーコードと接触させることを含み、複数のオリゴヌクレオチドバーコードの伸長は、複数の核酸標的のコピーにハイブリダイズした複数のオリゴヌクレオチドバーコードを伸長して、複数の第一鎖バーコード化ポリヌクレオチドを生成することを含み、試料中の核酸標的のコピー数の決定は、複数の核酸標的の各々の配列を含む第１の複数のバーコード化アンプリコンのうちのバーコード化アンプリコンに付随している別個の配列を有する分子標識の数に基づき、試料中の複数の核酸標的の各々の数を決定することを含む。一部の実施形態では、複数の核酸標的の各々の配列は、複数の核酸標的の各々の部分配列を含む。一部の実施形態では、第１の複数のバーコード化アンプリコン中の核酸標的の配列は、核酸標的の部分配列を含む。
一部の実施形態では、本方法は、第１のユニバーサル配列またはその相補体にハイブリダイズすることが可能なプライマー、および第２のユニバーサル配列またはその相補体にハイブリダイズすることが可能なプライマーを使用して第１の複数のバーコード化アンプリコンを増幅し、それにより第２の複数のバーコード化アンプリコンを生成することを含む。一部の実施形態では、第１の複数のバーコード化アンプリコンの増幅は、配列決定プライマーおよび／もしくは配列決定アダプターの結合部位の配列、それらの相補配列、ならびに／またはそれらの一部を、第１の複数のバーコード化アンプリコンに付加することを含む。一部の実施形態では、本方法は、第２の複数のバーコード化アンプリコンまたはそれらの産物に付随している別個の配列を有する分子標識の数に基づき、試料中の核酸標的のコピー数を決定することを含む。一部の実施形態では、核酸標的のコピーの接触は、複数の核酸標的のコピーを複数のオリゴヌクレオチドバーコードと接触させることを含み、複数のオリゴヌクレオチドバーコードの伸長は、複数の核酸標的のコピーにハイブリダイズした複数のオリゴヌクレオチドバーコードを伸長して、複数の第一鎖バーコード化ポリヌクレオチドを生成することを含み、および／または試料中の核酸標的のコピー数の決定は、複数の核酸標的の各々の配列を含む第２の複数のバーコード化アンプリコンのうちのバーコード化アンプリコンに付随している別個の配列を有する分子標識の数に基づき、試料中の複数の核酸標的の各々の数を決定することを含む。一部の実施形態では、複数の核酸標的の各々の配列は、複数の核酸標的の各々の部分配列を含む。一部の実施形態では、第２の複数のバーコード化アンプリコン中の核酸標的の配列は、核酸標的の部分配列を含む。
一部の実施形態では、第１の複数のバーコード化アンプリコンおよび／または第２の複数のバーコード化アンプリコンの１つ１つは、第１のユニバーサル配列、第２のユニバーサル配列、または両方の少なくとも一部分を含む。一部の実施形態では、第１のユニバーサル配列および第２のユニバーサル配列は同じである。一部の実施形態では、第１のユニバーサル配列および第２のユニバーサル配列は異なる。一部の実施形態では、第１のユニバーサル配列および／または第２のユニバーサル配列は、配列決定プライマーおよび／もしくは配列決定アダプターの結合部位、それらの相補配列、ならびに／またはそれらの一部を含む。一部の実施形態では、配列決定アダプターは、Ｐ５配列、Ｐ７配列、それらの相補配列、および／またはそれらの一部を含む。一部の実施形態では、配列決定プライマーは、リード１配列決定プライマー、リード２配列決定プライマー、それらの相補配列、および／またはそれらの一部を含む。
一部の実施形態では、核酸標的のコピーにハイブリダイズした複数のオリゴヌクレオチドバーコードの伸長は、逆転写酵素を使用して、核酸標的のコピーにハイブリダイズした複数のオリゴヌクレオチドバーコードを伸長することを含む。一部の実施形態では、逆転写酵素は、ウイルス逆転写酵素を含む。一部の実施形態では、核酸標的のコピーにハイブリダイズした複数のオリゴヌクレオチドバーコードの伸長は、５’から３’のエキソヌクレアーゼ活性および３’から５’のエキソヌクレアーゼ活性のうちの少なくとも１つを欠如するＤＮＡポリメラーゼを使用して、核酸標的のコピーにハイブリダイズした複数のオリゴヌクレオチドバーコードを伸長することを含む。一部の実施形態では、複数の第一鎖バーコード化ポリヌクレオチドにハイブリダイズしたランダムプライマーの伸長は、５’から３’のエキソヌクレアーゼ活性および３’から５’のエキソヌクレアーゼ活性のうちの少なくとも１つを欠如するＤＮＡポリメラーゼを使用して、複数の第一鎖バーコード化ポリヌクレオチドにハイブリダイズしたランダムプライマーを伸長することを含む。一部の実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼは、Ｋｌｅｎｏｗ断片を含む。
一部の実施形態では、第１の複数のバーコード化アンプリコンおよび／または第２の複数のバーコード化アンプリコンは、全トランスクリプトーム増幅（ＷＴＡ）産物を含む。一部の実施形態では、第１の複数のバーコード化アンプリコンおよび／または第２の複数のバーコード化アンプリコンは、単一細胞のｍＲＮＡの少なくとも１０％に相当する。一部の実施形態では、第１の複数のバーコード化アンプリコンおよび／または第２の複数のバーコード化アンプリコンは、単一細胞のｍＲＮＡの少なくとも５０％または少なくとも９０％に相当する。一部の実施形態では、複数の核酸標的の１つまたは複数は、低発現遺伝子のｍＲＮＡを含む。一部の実施形態では、前記ランダムプライマーは、ヌクレオチドのランダム配列を含み、ヌクレオチドのランダム配列は、約４～約３０ヌクレオチド長であってもよく、さらに前記ヌクレオチドのランダム配列は、６または９ヌクレオチド長であってもよい。一部の実施形態では、標的結合性領域は、オリゴｄＴ配列、ランダム配列、標的特異的配列、またはそれらの組合せを含む。一部の実施形態では、標的結合性領域は、ポリ（ｄＴ）領域を含み、核酸標的は、ポリ（ｄＡ）領域を含む。一部の実施形態では、本方法は、ランダムプライマーを、複数の第一鎖バーコード化ポリヌクレオチドと接触させるステップ、複数の第一鎖バーコード化ポリヌクレオチドにハイブリダイズしたランダムプライマーを伸長するステップ、および複数の伸長産物を増幅するステップを繰り返すことを含む。
一部の実施形態では、本方法は、複数の第一鎖バーコード化ポリヌクレオチドを第３の複数のバーコード化アンプリコンを生成するための鋳型として使用して、第３の複数のバーコード化アンプリコンを合成することを含む。一部の実施形態では、第３の複数のバーコード化アンプリコンの合成は、複数の第一鎖バーコード化ポリヌクレオチドのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅を実施することを含む。一部の実施形態では、第３の複数のバーコード化アンプリコンの合成は、第１のユニバーサル配列またはその相補体にハイブリダイズすることが可能なプライマー、および標的特異的プライマーを使用するＰＣＲ増幅を含む。一部の実施形態では、本方法は、第３の複数のバーコード化アンプリコンまたはそれらの産物の配列情報を得ることを含み、配列情報の取得は、配列決定アダプターを、第３の複数のバーコード化アンプリコンまたはそれらの産物に付着させることを含んでいてもよい。一部の実施形態では、標的特異的プライマーは、免疫受容体と特異的にハイブリダイズし、免疫受容体は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）および／またはＢ細胞受容体（ＢＣＲ）受容体であってもよい。
一部の実施形態では、複数の伸長産物の増幅は、固体支持体の存在下では実施されない。一部の実施形態では、本方法は、ＲＮａｓｅＨ誘導性プライミング、末端修復、および／またはアダプターライゲーションを含まない。一部の実施形態では、本方法は、断片化、タグ付け、または両方を含まない。一部の実施形態では、第一鎖バーコード化ポリヌクレオチドは、バーコード化デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）分子、バーコード化リボ核酸（ＲＮＡ）分子、または両方を含む。
一部の実施形態では、試料は、複数の細胞、複数の単一細胞、組織、腫瘍試料、またはそれらの任意の組合せを含む。一部の実施形態では、試料は、末梢血単核細胞または免疫細胞を含み、免疫細胞は、Ｂ細胞、Ｔ細胞、またはそれらの組合せを含んでいてもよい。一部の実施形態では、核酸標的は核酸分子を含み、核酸分子は、リボ核酸（ＲＮＡ）、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ＲＮＡ分解産物、ポリ（Ａ）テイルを含むＲＮＡ、またはそれらの任意の組合せを含んでいてもよい。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、免疫受容体をコードする。
一部の実施形態では、核酸標的は、細胞成分結合性試薬を含む。一部の実施形態では、核酸分子は、細胞成分結合性試薬に付随している。一部の実施形態では、本方法は、核酸分子および細胞成分結合性試薬を解離させることを含む。一部の実施形態では、複数のオリゴヌクレオチドバーコードのうちの少なくとも１０個は、異なる分子標識配列を含む。一部の実施形態では、複数のオリゴヌクレオチドバーコードの各分子標識は、少なくとも６個のヌクレオチドを含む。
一部の実施形態では、複数のオリゴヌクレオチドバーコードは、固体支持体に付随している。一部の実施形態では、同じ固体支持体に付随している複数のオリゴヌクレオチドバーコードは各々、同一の試料標識を含み、複数のオリゴヌクレオチドバーコードの各試料標識は、少なくとも６個のヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、複数のオリゴヌクレオチドバーコードは各々、細胞標識を含み、複数のオリゴヌクレオチドバーコードの各細胞標識は、少なくとも６個のヌクレオチドを含んでいてもよい。一部の実施形態では、同じ固体支持体に付随しているオリゴヌクレオチドバーコードは、同じ細胞標識を含む。一部の実施形態では、異なる固体支持体に付随しているオリゴヌクレオチドバーコードは、異なる細胞標識を含む。一部の実施形態では、固体支持体は、合成粒子、平面状表面、またはそれらの組合せを含む。
一部の実施形態では、試料は単一細胞を含み、本方法は、複数のオリゴヌクレオチドバーコードを含む合成粒子を、試料中の単一細胞に付随させることを含む。一部の実施形態では、本方法は、合成粒子を単一細胞に付随させた後で単一細胞を溶解することを含み、単一細胞の溶解は、試料を加熱すること、試料を界面活性剤と接触させること、試料のｐＨを変化させること、またはそれらの任意の組合せを含んでいてもよい。一部の実施形態では、合成粒子および単一細胞は同じ区画内に存在し、区画はウェルまたは液滴であってもよい。一部の実施形態では、複数のオリゴヌクレオチドバーコードのうちの少なくとも１つは、合成粒子上に固定化されているか、または部分的に固定化されている。一部の実施形態では、複数のオリゴヌクレオチドバーコードのうちの少なくとも１つは、合成粒子内に封入されているか、または部分的に封入されている。一部の実施形態では、合成粒子は破壊可能であり、合成粒子は、破壊可能なヒドロゲル粒子であってもよい。
一部の実施形態では、合成粒子はビーズを含み、ビーズは、セファロースビーズ、ストレプトアビジンビーズ、アガロースビーズ、磁気ビーズ、コンジュゲートビーズ、プロテインＡコンジュゲートビーズ、プロテインＧコンジュゲートビーズ、プロテインＡ／Ｇコンジュゲートビーズ、プロテインＬコンジュゲートビーズ、オリゴ（ｄＴ）コンジュゲートビーズ、シリカビーズ、ヒドロゲルビーズ、ゲルビーズ、シリカ様ビーズ、抗ビオチンマイクロビーズ、抗蛍光色素マイクロビーズ、またはそれらの任意の組合せを含んでいてもよい。一部の実施形態では、合成粒子は、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ポリスチレン、ガラス、ポリプロピレン、アガロース、ゼラチン、ヒドロゲル、常磁性体、セラミック、プラスチック、ガラス、メチルスチレン、アクリルポリマー、チタン、ラテックス、セファロース、セルロース、ナイロン、シリコーン、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される材料を含む。一部の実施形態では、複数のオリゴヌクレオチドバーコードの各々は、リンカー官能基を含み、合成粒子は、固体支持体官能基を含み、および／または支持体官能基およびリンカー官能基は、互いに付随している。一部の実施形態では、リンカー官能基および支持体官能基は、Ｃ６、ビオチン、ストレプトアビジン、第一級アミン、アルデヒド、ケトン、およびそれらの任意の組合せからなる群から個々に選択される。
非限定的な例示的確率論的バーコードを示す図である。 確率論的バーコーディングおよび電子計数の非限定的な例示的ワークフローを示す図である。 複数の標的からの確率論的バーコード化標的のインデックス化ライブラリーを作成するための非限定的な例示的プロセスを示す略図である。 タンパク質結合性試薬の固有識別子を含むオリゴヌクレオチドとコンジュゲートされている例示的なタンパク質結合性試薬（ここでは抗体が示されている）の略図を示す。 同じ試料または異なる試料からの細胞を決定するために試料インデックス付与のために固有識別子を含むオリゴヌクレオチドがコンジュゲートされている例示的結合性試薬（本図に示す抗体）の略図を示す。 ハイスループット方式で、タンパク質発現および遺伝子発現を同時に決定するために、オリゴヌクレオチドがコンジュゲートされている抗体を使用する例示的ワークフローの略図を示す。 試料インデックス付与のためにオリゴヌクレオチドがコンジュゲートされている抗体を使用する例示的ワークフローの略図を示す。 単一細胞の全トランスクリプトーム解析（ＷＴＡ）を実施するための非限定的な例示的ワークフローの略図である。 単一細胞のライゲーションに基づく全トランスクリプトーム解析を実施するための非限定的な例示的ワークフローの略図である。 ランダムプライミングおよびプライマー伸長を使用して、単一細胞の全トランスクリプトーム解析を効率的に（例えば、他の全トランスクリプトーム解析方法と比較してより短い時間で）実施するための非限定的な例示的ワークフローの略図である。 ランダムプライミングおよびプライマー伸長を使用して全トランスクリプトーム解析を実施するための非限定的な例示的ワークフローの略図である。 ランダムプライミングおよびプライマー伸長を使用して全トランスクリプトーム解析を実施するための非限定的な例示的プロセスを示す図である。 標的化遺伝子発現プロファイリング、ＡｂＯを用いた試料多重化、ＡｂＯを用いたタンパク質発現プロファイリング、および全トランスクリプトーム解析を、１つのワークフローにおいて実施するための略図である。 ライゲーションに基づく全トランスクリプトーム解析、ならびに６ｍｅｒランダマーおよび９ｍｅｒランダマーによるランダムプライミングおよび伸長を用いた全トランスクリプトーム解析の実施の非例示的な感度評価項目を示すプロットを示す図である。 ライゲーションに基づくＷＴＡ法と比較した、本開示のランダムプライミングおよび伸長に基づくＷＴＡ分析の例示的な性能を示す、ｔ分布型確率的近傍埋め込み法（ｔ－ＳＮＥ、ｔ－Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｅｄ Ｓｔｏｃｈａｓｔｉｃ Ｎｅｉｇｈｂｏｒ Ｅｍｂｅｄｄｉｎｇ）を示す図である。 ＩＤ０１０ＮＫ６（ＲＰＥ ＷＴＡノナマー）がＩＤ０１０ＵＧ１（ライゲーションに基づくＷＴＡ法）よりも多くの細胞表面マーカーを捕捉するようであったことを示す非限定的な例示的円グラフを示す図である。 ジャーカット／ラモス細胞および健常ドナー末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）におけるＲＰＥ ＷＴＡ法の性能を示す非限定的な例示的バイオアナライザープロットを示す図である。 ランダムプライミングおよび伸長（１つのランダムプライミングステップおよび１つのＰＣＲステップを含むＲＰＥ法を使用した）によるＷＴＡ分析を実施する一部の実施形態では、鎖置換活性を有するＫｌｅｎｏｗ Ｅｘｏ－が、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼよりも好ましいことを示す非限定的な例示的バイオアナライザープロット（ＲＰＥ ＰＣＲ）を示す図である。 Ｋｌｅｎｏｗ Ｅｘｏ－が、以前に考えられていたほどの鎖置換活性を示さない場合があることを示す非限定的な例示的バイオアナライザープロット（ＲＰＥ ＰＣＲ）を示す図である。 ＲＰＥ ＷＴＡ法の性能に対する、ランダムプライミングステップの数およびランダマーの長さの効果を示す非限定的な例示的バイオアナライザープロットを示す図である。 ＲＰＥに基づくＷＴＡ法の性能に対するＳＰＲＩクリーンアップ比の効果を示す非限定的な例示的データを示す図である。 ＲＰＥに基づくＷＴＡ法の性能に対する、様々なランダムプライマー濃度およびＲＰＥ条件の効果を示す非限定的な例示的バイオアナライザープロット（ＲＰＥ ＰＣＲ、ＳＰＲＩクリーンアップ後）を示す図である。 ＲＰＥ ＷＴＡの性能に対する、コールドビーズの添加および様々なビーズ密度の効果を示す非限定的な例示的配列決定データを示す図である。 ＲＰＥ ＷＴＡの性能に対する、ランダムプライマー濃度およびコールドビーズの効果を示す非限定的な例示的配列決定データを示す図である。 ＲＰＥ ＷＴＡ法に対する様々な細胞数の効果を示す非限定的な例示的バイオアナライザープロット（ＲＰＥ ＰＣＲ）を示す図である。 ＲＰＥ ＷＴＡ法の性能に対する様々な細胞数の効果を示す非限定的な例示的バイオアナライザープロット（インデックスＰＣＲ）を示す図である。 様々な細胞数を用いた本開示のランダムプライミングおよび伸長に基づくＷＴＡ分析の例示的な性能を示すｔ分布型確率的近傍埋め込み（ｔ－ＳＮＥ）投影図である。 ＲＰＥ ＷＴＡ法の性能に対する、連続ＲＰＥ変性およびＲＰＥ反応容積の効果を示す非限定的な例示的バイオアナライザープロットを示す図である。 ２ＰＣＲライブラリー生成プロトコール（図２８Ａ～２８Ｂ）および１ＰＣＲライブラリー生成プロトコール（図２８Ｃ）を用いた本開示のランダムプライミングおよび伸長に基づくＷＴＡ分析の例示的な性能を示す例示的なバイオアナライザープロットを示す図である。 タンパク質発現と遺伝子発現を同時に決定するためのおよび試料インデックス付与のためのオリゴヌクレオチドの非限定的な例示的設計を示す図である。 タンパク質発現と遺伝子発現を同時に決定するためのおよび試料インデックス付与のための非限定的な例示的オリゴヌクレオチド配列の略図を示す。
以下の発明を実施するための形態では、本明細書の一部を形成する添付の図面が参照される。図面では、状況が別様に指示しない限り、類似の記号は、典型的には類似の成分を示す。発明を実施するための形態、図面、および特許請求の範囲に記載されている例示的な実施形態は、限定を意味するものではない。本明細書に提供される主題の趣旨または範囲から逸脱することなく、他の実施形態を使用することができ、他の変更をなすことができる。本明細書に概して説明されており、図に例示されているような本開示の態様は、多種多様な異なる構成に配置されてもよく、置換されてもよく、組み合わせてもよく、分離されてもよく、および設計されてもよく、それらはすべて本明細書において明示的に企図されており、本明細書の開示の一部をなすことが容易に理解されるだろう。
本明細書で参照されているすべての特許、公開特許出願、他の刊行物、ならびにＧｅｎＢａｎｋおよび他のデータベースの配列は、関連技術に関してその全体が参照により組み込まれる。
少数の核酸、例えば、メッセンジャーリボヌクレオチド酸（ｍＲＮＡ）分子の定量化は、例えば、異なる発生段階または異なる環境条件下で細胞において発現される遺伝子を決定するために、臨床的に重要である。しかしながら、特に分子の数が非常に少ない場合、核酸分子（例えば、ｍＲＮＡ分子）の絶対数を決定することは非常に困難なことでもあり得る。試料中の分子の絶対数を決定するための１つの方法は、デジタルポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）である。理想的には、ＰＣＲは、各サイクルにおいて同一コピーの分子を産生する。しかしながら、ＰＣＲには、各分子が確率論的な蓋然性で複製されるという欠点があり、この蓋然性は、ＰＣＲサイクルおよび遺伝子配列により様々であり、増幅バイアスおよび不正確な遺伝子発現測定がもたらされる。固有分子標識（分子インデックス（ＭＩ）とも呼ばれる）を有する確率論的バーコードを使用すると、分子の数を計数し、増幅バイアスを補正することができる。Ｐｒｅｃｉｓｅ（商標）アッセイ（Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．社（パロアルト（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ）、カリフォルニア州））などの確率論的バーコーディングは、逆転写（ＲＴ）中に分子標識（ＭＬ）を使用してｍＲＮＡを標識化することにより、ＰＣＲステップおよびライブラリー調製ステップにより誘導されるバイアスを補正することができる。
Ｐｒｅｃｉｓｅ（商標）アッセイでは、ＲＴステップ中に試料中のすべてのポリ（Ａ）ｍＲＮＡにハイブリダイズさせるためのポリ（Ｔ）オリゴヌクレオチドに多数の、例えば６５６１～６５５３６個の固有分子標識を有する確率論的バーコードの非枯渇プールを使用することができる。確率論的バーコードは、ユニバーサルＰＣＲプライミング部位を含んでいてもよい。ＲＴ中、標的遺伝子分子は確率論的バーコードとランダムに反応する。各標的分子は、確率論的バーコードにハイブリダイズして、確率論的バーコード化相補的リボヌクレオチド酸（ｃＤＮＡ）分子を生成することができる。標識後、マイクロウェルプレートのマイクロウェルの確率論的バーコード化ｃＤＮＡ分子を、ＰＣＲ増幅および配列決定のために単一チューブにプールすることができる。生配列データを分析して、リードの数、固有分子標識を有する確率論的バーコードの数、およびｍＲＮＡ分子の数を得ることができる。
単一細胞のｍＲＮＡ発現プロファイルを決定するための方法は、大規模並行様式で実施することができる。例えば、Ｐｒｅｃｉｓｅ（商標）アッセイを使用すると、１００００個よりも多くの細胞のｍＲＮＡ発現プロファイルを同時に決定することができる。１試料当たりの分析する単一細胞の数（例えば、数百または数千個の単一物）は、現行の単一細胞技術の容量よりも少ない可能性がある。異なる試料に由来する細胞をプールすることにより、現行の単一技術の容量の使用を向上させることができるため、試薬の浪費および単一細胞分析のコストを削減することができる。本開示は、単一細胞分析などの細胞分析のためのｃＤＮＡライブラリーを調製するために異なる試料の細胞を区別するための試料インデックス付与法を提供する。異なる試料に由来する細胞をプールすることにより、異なる試料の細胞のｃＤＮＡライブラリー調製のばらつきを最小限に抑えることができるため、異なる試料のより正確な比較が可能になる。
本明細書における開示は、試料中の核酸標的を標識するための方法を含む。一部の実施形態では、本方法は、核酸標的のコピーを複数のオリゴヌクレオチドバーコードと接触させることであって、各オリゴヌクレオチドバーコードは、第１のユニバーサル配列、分子標識、および核酸標的のコピーにハイブリダイズすることが可能な標的結合性領域を含む、こと；核酸標的のコピーにハイブリダイズした複数のオリゴヌクレオチドバーコードを伸長して、複数の第一鎖バーコード化ポリヌクレオチドを生成すること；ランダムプライマーを複数の第一鎖バーコード化ポリヌクレオチドと接触させることであって、ランダムプライマーの各々は、第２のユニバーサル配列またはその相補体を含む、こと；ならびに複数の第一鎖バーコード化ポリヌクレオチドにハイブリダイズしたランダムプライマーを伸長して、複数の伸長産物を生成することを含む。
本明細書における開示は、試料中の核酸標的の数を決定するための方法を含む。一部の実施形態では、本方法は、核酸標的のコピーを複数のオリゴヌクレオチドバーコードと接触させることであって、各オリゴヌクレオチドバーコードは、第１のユニバーサル配列、分子標識、および核酸標的のコピーにハイブリダイズすることが可能な標的結合性領域を含む、こと；核酸標的のコピーにハイブリダイズした複数のオリゴヌクレオチドバーコードを伸長して、複数の第一鎖バーコード化ポリヌクレオチドを生成すること；ランダムプライマーを複数の第一鎖バーコード化ポリヌクレオチドと接触させることであって、ランダムプライマーの各々は、第２のユニバーサル配列またはその相補体を含む、こと；複数の第一鎖バーコード化ポリヌクレオチドにハイブリダイズしたランダムプライマーを伸長して、複数の伸長産物を生成すること；第１のユニバーサル配列またはその相補体にハイブリダイズすることが可能なプライマー、および第２のユニバーサル配列またはその相補体にハイブリダイズすることが可能なプライマーを使用して複数の伸長産物を増幅し、それにより第１の複数のバーコード化アンプリコンを生成すること；ならびに第１の複数のバーコード化アンプリコンまたはそれらの産物に付随している別個の配列を有する分子標識の数に基づき、試料中の核酸標的のコピー数を決定することを含む。
定義
別様に定義されていない限り、本明細書で使用される技術用語および科学用語は、本開示が属する当業者により一般的に理解されるものと同じ意味を有する。例えば、Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 2nd ed., J. Wiley & Sons (New York, NY 1994); Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (Cold Spring Harbor, NY 1989)を参照されたい。本開示の目的のため、以下の用語を下記にて定義する。
本明細書で使用される場合、用語「アダプター」は、付随している核酸の増幅または配列決定を容易にするための配列を意味することができる。付随している核酸は、標的核酸を含んでいてもよい。付随している核酸は、空間標識、標的標識、試料標識、インデックス付与標識、またはバーコード配列（例えば、分子標識）の１つまたは複数を含んでいてもよい。アダプターは、線状であってもよい。アダプターは、プレアデニル化アダプターであってもよい。アダプターは、二本鎖であってもよくまたは一本鎖であってもよい。１つまたは複数のアダプターが、核酸の５末端’または３’末端に位置していてもよい。アダプターが５’末端および３’末端に既知配列を含む場合、既知配列は、同じ配列であってもよくまたは異なる配列であってもよい。ポリヌクレオチドの５’末端および／または３’末端に位置するアダプターを、表面上に固定化された１つまたは複数のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせることが可能であってもよい。アダプターは、一部の実施形態では、ユニバーサル配列を含んでいてもよい。ユニバーサル配列は、２つまたはそれよりも多くの核酸分子に共通するヌクレオチド配列の領域であってもよい。また、２つまたはそれよりも多くの核酸分子は、異なる配列の領域を有していてもよい。したがって、例えば、５’アダプターは、同一および／またはユニバーサル核酸配列を含んでいてもよく、３’アダプターは、同一および／またはユニバーサル配列を含んでいてもよい。複数の核酸分子の異なるメンバーに存在していてもよいユニバーサル配列は、ユニバーサル配列に相補的な単一のユニバーサルプライマーを使用して、複数の異なる配列の複製または増幅を可能にすることができる。同様に、核酸分子のコレクションの異なるメンバーに存在していてもよい少なくとも１つ、２つ（例えば、一対の）、またはそれよりも多くのユニバーサル配列は、ユニバーサル配列に相補的な少なくとも１つ、２つ（例えば、一対の）、またはそれよりも多くの単一ユニバーサルプライマーを使用して、複数の異なる配列の複製または増幅を可能にすることができる。したがって、ユニバーサルプライマーは、そのようなユニバーサル配列にハイブリダイズすることができる配列を含む。標的核酸配列保有分子を修飾して、ユニバーサルアダプター（例えば、非標的核酸配列）を、異なる標的核酸配列の一方のまたは両方の末端に付着させることができる。標的核酸に付着される１つまたは複数のユニバーサルプライマーは、ユニバーサルプライマーのハイブリダイゼーション用の部位を提供することができる。標的核酸に付着される１つまたは複数のユニバーサルプライマーは、互いに同じであってもよくまたは異なっていてもよい。
本明細書で使用される場合、抗体は、全長（例えば、天然に存在するかもしくは通常の免疫グロブリン遺伝子断片組換えプロセスにより形成される）免疫グロブリン分子（例えば、ＩｇＧ抗体）または抗体断片のような免疫グロブリン分子の免疫学的活性（すなわち、特異的結合性）部分であってもよい。
一部の実施形態では、抗体は、機能的抗体断片である。例えば、抗体断片は、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、およびｓＦｖなどの、抗体の一部であってもよい。抗体断片は、全長抗体により認識されるものと同じ抗原に結合することができる。抗体断片は、重鎖および軽鎖の可変領域からなる「Ｆｖ」断片、ならびに軽鎖可変領域および重鎖可変領域がペプチドリンカーにより接続されている組換え単鎖ポリペプチド分子（「ｓｃＦｖタンパク質」）などの、抗体の可変領域からなる単離断片を含むことができる。例示的な抗体としては、これらに限定されないが、がん細胞に対する抗体、ウイルスに対する抗体、細胞表面受容体（例えば、ＣＤ８、ＣＤ３４、およびＣＤ４５）に結合する抗体、ならびに治療用抗体を挙げることができる。
本明細書で使用される場合、「付随している」または「～に付随している」という用語は、２つまたはそれよりも多くの種が、ある時点で共局在化されていると識別可能であることを意味する場合がある。付随は、２つまたはそれよりも多くの種が同様の容器内に存在するかまたは存在していたことを意味する場合がある。付随は、インフォマティクス的な付随であってもよい。例えば、２つまたはそれよりも多くの種に関するデジタル情報を保存することができ、その種の１つまたは複数がある時点で共局在化されていたことを決定するために使用することができる。また、付随は、物理的な付随であってもよい。一部の実施形態では、２つまたはそれよりも多くの付随している種は、互いにまたは一般的な固体または半固体表面に「係留」、「付着」、または「固定化」されている。付随は、ビーズなどの固体または半固体支持体に標識を付着させるための共有結合手段または非共有結合手段を指す場合がある。付随は、標的と標識との共有結合であってもよい。付随は、２分子間（標的分子と標識との間など）のハイブリダイゼーションを含むことができる。
本明細書で使用される場合、「相補的」という用語は、２つのヌクレオチド間の正確な対合能力を指す場合がある。例えば、核酸の所与の位置にあるヌクレオチドが、別の核酸のヌクレオチドと水素結合することが可能な場合、この２つの核酸は、その位置で互いに相補的であるとみなされる。２つの一本鎖核酸分子間の相補性は、ヌクレオチドの一部のみが結合する「部分的」であってもよく、または一本鎖分子間に完全な相補性が存在する場合は完全であってもよい。第１のヌクレオチド配列は、第１のヌクレオチド配列が第２のヌクレオチド配列に相補的である場合、第２の配列の「相補体」であると言うことができる。第１のヌクレオチド配列は、第１のヌクレオチド配列が、第２のヌクレオチド配列の逆向きである（すなわち、ヌクレオチドの順序が逆である）配列に相補的である場合、第２の配列の「逆相補体」であると言うことができる。本明細書で使用される場合、「相補体」、「相補的」、および「逆相補体」という用語は、同義的に使用することができる。本開示では、分子は、別の分子にハイブリダイズすることができる場合、ハイブリダイズしている分子の相補体であり得ることが理解される。
本明細書で使用される場合、「デジタル計数」という用語は、試料中の標的分子の数を推定するための方法を指す場合がある。デジタル計数は、試料中の、標的に付随している固有標識の数を決定するステップを含んでいてもよい。この方法論は、性質が確率論的であってもよく、分子計数の問題を、同一の分子を捜し出して識別する問題から、１セットの事前に規定されている標識の検出に関する一連のはい／いいえのデジタル的な質問へと変換する。
本明細書で使用される場合、「標識（単数）」または「標識（複数）」という用語は、試料内の標的に付随している核酸コードを指す場合がある。標識は、例えば、核酸標識であってもよい。標識は、完全にまたは部分的に増幅可能な標識であってもよい。標識は、完全にまたは部分的に配列決定可能な標識であってもよい。標識は、別個のものとして識別可能な天然核酸の一部であってもよい。標識は、既知配列であってもよい。標識は、核酸配列の接合部、例えば、天然配列および非天然配列の接合部を含んでいてもよい。本明細書で使用される場合、「標識」という用語は、「インデックス」、「タグ」、または「標識タグ」という用語と同義的に使用することができる。標識は、情報を伝達することができる。例えば、種々の実施形態では、標識を使用して、試料の同一性、試料の供給源、細胞の同一性、および／または標的を決定することができる。
本明細書で使用される場合、「非枯渇リザーバ」という用語は、多数の異なる標識で構成されるバーコード（例えば、確率論的バーコード）のプールを指す場合がある。非枯渇リザーバは、非枯渇リザーバを標的のプールに付随させると、各標的が固有バーコードに付随する可能性が高くなるように、数多くの異なるバーコードを含んでいてもよい。各標識化標的分子の一意性は、ランダム選択の統計により決定することができ、標識の多様性と比較したコレクション内の同一標的分子のコピー数に依存する。得られる標識化標的分子のセットのサイズは、バーコーディングプロセスの確率論的性質により決定することができ、検出されるバーコードの数を分析することにより、元のコレクションまたは試料に存在する標的分子の数を算出することが可能になる。存在する標的分子のコピー数の固有バーコードの数に対する比が低い場合、標識化標的分子は高度に一意性である（すなわち、１つよりも多くの標的分子が、所与の標識で標識されていることになる可能性は非常に低い）。
本明細書で使用される場合、「核酸」という用語は、ポリヌクレオチド配列またはその断片を指す。核酸はヌクレオチドを含むことができる。核酸は、細胞に対して外因性であってもよくまたは内因性であってもよい。核酸は無細胞環境に存在してもよい。核酸は、遺伝子またはその断片であってもよい。核酸はＤＮＡであってもよい。核酸はＲＮＡであってもよい。核酸は、１つまたは複数のアナログ（例えば、変更された骨格、糖、または核酸塩基）を含むことができる。アナログのいくつかの非限定的な例としては、５－ブロモウラシル、ペプチド核酸、ゼノ核酸、モルホリノ、ロックド核酸、グリコール核酸、トレオース核酸、ジデオキシヌクレオチド、コーディセピン、７－デアザ－ＧＴＰ、フルオロフォア（例えば、糖に連結されているローダミンまたはフルオレセイン）、チオール含有ヌクレオチド、ビオチン連結ヌクレオチド、蛍光性塩基アナログ、ＣｐＧアイランド、メチル－７－グアノシン、メチル化ヌクレオチド、イノシン、チオウリジン、プソイドウリジン、ジヒドロウリジン、キューオシン、およびワイオシンが挙げられる。「核酸」、「ポリヌクレオチド」、「標的ポリヌクレオチド」、および「標的核酸」は、同義的に使用することができる。
核酸は、核酸に新しいまたは増強された特徴（例えば、安定性の向上）を提供するために、１つまたは複数の修飾（例えば、塩基修飾、骨格修飾）を含んでいてもよい。核酸は、核酸親和性タグを含むことができる。ヌクレオシドは、塩基－糖の組合せであってもよい。ヌクレオシドの塩基部分は、複素環式塩基であってもよい。そのような複素環式塩基の２つの最も一般的な種類は、プリンおよびピリミジンである。ヌクレオチドは、ヌクレオシドの糖部分に共有結合で連結されているリン酸基をさらに含むヌクレオシドであってもよい。ペントフラノシル糖を含むヌクレオシドの場合、リン酸基は、糖の２’、３’、または５’ヒドロキシル部分に連結されていてもよい。核酸を形成する際、リン酸基は、隣接するヌクレオシドを互いに共有結合で連結して、線状ポリマー化合物を形成することができる。この線状ポリマー化合物のそれぞれの末端が次にさらに接合されて、環状化合物を形成する場合があるが、一般に線状化合物が好適である。加えて、線状化合物は、内部ヌクレオチド塩基相補性を有してもよく、したがって、完全にまたは部分的に二本鎖の化合物を産生するようにフォールディングする場合がある。核酸内では、リン酸基は、一般的に、核酸のヌクレオシド間骨格を形成するものと呼ばれる場合がある。連結または骨格は、３’－５’ホスホジエステル連結であってもよい。
核酸は、修飾骨格および／または修飾ヌクレオシド間連結を含むことができる。修飾骨格としては、骨格にリン原子を保持するものおよび骨格にリン原子を有しないものを挙げることができる。その中にリン原子を含有する好適な修飾核酸骨格としては、例えば、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、３’－アルキレンホスホネート、５’－アルキレンホスホネート、キラルホスホネートなどのメチルおよび他のアルキルホスホネート、ホスフィネート、３’－アミノホスホルアミダートおよびアミノアルキルホスホルアミダート、ホスホロジアミダート、チオノホスホルアミダートを含むホスホルアミダート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、セレノホスフェート、ならびに通常の３’－５’連結を有するボラノホスフェート、２’－５’連結アナログ、ならびに１つまたは複数のヌクレオチド間連結が３’－３’、５’－５’、または２’－２’連結である逆極性を有するものを挙げることができる。
核酸は、短鎖アルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間連結、混合ヘテロ原子およびアルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間連結、または１つもしくは複数の短鎖ヘテロ原子もしくは複素環ヌクレオシド間連結により形成されるポリヌクレオチド骨格を含むことができる。そのようなものとしては、モルホリノ連結を有するもの（ヌクレオシドの糖部分から部分的に形成される）；シロキサン骨格；スルフィド、スルホキシド、およびスルホン骨格；ホルムアセチル（ｆｏｒｍａｃｅｔｙｌ）およびチオホルムアセチル（ｔｈｉｏｆｏｒｍａｃｅｔｙｌ）骨格；メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格；リボアセチル（ｒｉｂｏａｃｅｔｙｌ）骨格；アルケン含有骨格；スルファメート骨格；メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノ骨格；スルホネートおよびスルホンアミド骨格；アミド骨格；ならびに混合Ｎ、Ｏ、Ｓ、ＣＨ2成分部分を有する他のものが挙げられる。
核酸は、核酸模倣物を含むことができる。「模倣物」という用語は、フラノース環のみ、またはフラノース環およびヌクレオチド間連結の両方が、非フラノース基で置き換えられているポリヌクレオチドを含むことが意図されていてもよく、フラノース環のみの置き換えは、糖代用物と呼ばれる場合もある。複素環式塩基部分または修飾複素環式塩基部分は、適切な標的核酸とのハイブリダイゼーションのために維持されていてもよい。１つのそのような核酸は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）であってもよい。ＰＮＡでは、ポリヌクレオチドの糖骨格は、アミド含有骨格、特にアミノエチルグリシン骨格で置き換えられていてもよい。ヌクレオチドは、骨格のアミド部分のアザ窒素原子に直接的にまたは間接的に、保持されていてもよく、結合している。ＰＮＡ化合物の骨格は、ＰＮＡにアミド含有骨格を付与する、２つまたはそれよりも多くの連結されたアミノエチルグリシン単位を含んでいてもよい。複素環塩基部分は、骨格のアミド部分のアザ窒素原子に直接的にまたは間接的に結合していてもよい。
核酸は、モルホリノ骨格構造を含んでいてもよい。例えば、核酸は、リボース環の代わりの６員モルホリノ環を含んでいてもよい。こうした実施形態の一部では、ホスホロジアミダートまたは他の非ホスホジエステルヌクレオシド間連結が、ホスホジエステル連結を置き換えていてもよい。
核酸は、モルホリノ環に付着されている複素環塩基を有する連結モルホリノ単位（例えば、モルホリノ核酸）を含んでいてもよい。連結基は、モルホリノ核酸のモルホリノモノマー単位を連結することができる。非イオン性モルホリノベースオリゴマー化合物は、細胞タンパク質との望ましくない相互作用が少ない場合がある。モルホリノベースポリヌクレオチドは、核酸の非イオン性模倣物であってもよい。異なる連結基を使用して、モルホリノ種類内の様々な化合物を接合することができる。さらなる種類のポリヌクレオチド模倣物は、シクロヘキセニル核酸（ＣｅＮＡ）と呼ばれる場合がある。核酸分子に通常存在するフラノース環を、シクロヘキセニル環と置き換えることができる。ＣｅＮＡ ＤＭＴ保護ホスホラミダイトモノマーを調製し、ホスホラミダイト化学反応を使用してオリゴマー化合物合成に使用することができる。核酸鎖へのＣｅＮＡモノマーの組込みは、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドの安定性を増加させることができる。ＣｅＮＡオリゴアデニレートは、天然複合体と同様の安定性で、核酸相補体と複合体を形成することができる。さらなる修飾は、２’－ヒドロキシル基が糖環の４’炭素原子に連結され、それにより２’－Ｃ、４’－Ｃオキシメチレン連結を形成し、それにより二環式糖部分を形成するロックド核酸（ＬＮＡ）を含んでいてもよい。連結は、２’酸素原子および４’炭素原子を架橋するメチレン（－ＣＨ2），基（式中ｎは１または２である）であってもよい。ＬＮＡおよびＬＮＡアナログは、相補的核酸との非常に高い二重鎖熱安定性（Ｔｍ＝＋３～＋１０℃）、３’－エキソヌクレアーゼ分解に対する安定性、および良好な溶解度特性を示すことができる。
また、核酸は、核酸塩基（単に「塩基」と呼ばれることが多い）修飾または置換を含んでいてもよい。本明細書で使用される場合、「未修飾」または「天然」核酸塩基としては、プリン塩基（例えば、アデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ））ならびにピリミジン塩基（例えば、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、およびウラシル（Ｕ））を挙げることができる。修飾核酸塩基としては、５－メチルシトシン（５－ｍｅ－Ｃ）、５－ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２－アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの６－メチルおよび他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの２－プロピルおよび他のアルキル誘導体、２－チオウラシル、２－チオチミンおよび２－チオシトシン、５－ハロウラシルおよびシトシン、５－プロピニル（－Ｃ＝Ｃ－ＣＨ３）ウラシルおよびシトシン、ならびにピリミジン塩基の他のアルキニル誘導体、６－アゾウラシル、シトシンおよびチミン、５－ウラシル（プソイドウラシル）、４－チオウラシル、８－ハロ、８－アミノ、８－チオール、８－チオアルキル、８－ヒドロキシル、および他の８－置換アデニンおよびグアニン、５－ハロ、特に５－ブロモ、５－トリフルオロメチル、および他の５－置換ウラシルおよびシトシン、７－メチルグアニンおよび７－メチルアデニン、２－Ｆ－アデニン、２－アミノアデニン、８－アザグアニンおよび８－アザアデニン、７－デアザグアニンおよび７－デアザアデニン、ならびに３－デアザグアニンおよび３－デアザアデニンなどの他の合成および天然核酸塩基を挙げることができる。修飾核酸塩基としては、フェノキサジンシチジン（１Ｈ－ピリミド（５，４－ｂ）（１，４）ベンゾキサジン－２（３Ｈ）－オン）、フェノチアジンシチジン（１Ｈ－ピリミド（５，４－ｂ）（１，４）ベンゾチアジン－２（３Ｈ）－オン）などの三環式ピリミジン、置換フェノキサジンシチジン（例えば、９－（２－アミノエトキシ）－Ｈ－ピリミド（５，４－（ｂ）（１，４）ベンゾキサジン－２（３Ｈ）－オン）、フェノチアジンシチジン（１Ｈ－ピリミド（５，４－ｂ）（１，４）ベンゾチアジン－２（３Ｈ）－オン）などのＧ－クランプ、置換フェノキサジンシチジン（例えば、９－（２－アミノエトキシ）－Ｈ－ピリミド（５，４－（ｂ）（１，４）ベンゾキサジン－２（３Ｈ）－オン）、カルバゾールシチジン（２Ｈ－ピリミド（４，５－ｂ）インドール－２－オン）、ピリドインドールシチジン（Ｈ－ピリド（３’，２’：４，５）ピロロ［２，３－ｄ］ピリミジン－２－オン）などのＧ－クランプを挙げることができる。
本明細書で使用される場合、「試料」という用語は、標的を含む組成物を指すことができる。本開示の方法、デバイス、および系による分析に好適な試料としては、細胞、組織、臓器、または生物が挙げられる。
本明細書で使用される場合、「試料採取デバイス」または「デバイス」という用語は、試料の切片を採取し、および／または切片を基材に配置することができるデバイスを指すことができる。試料デバイスは、例えば、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）機械、細胞選別機械、生検針、生検デバイス、組織切片化デバイス、マイクロ流体デバイス、ブレードグリッド、および／またはミクロトームを指すことができる。
本明細書で使用される場合、「固体支持体」という用語は、複数のバーコード（例えば、確率論的バーコード）を付着させることができる、個別の固体または半固体表面を指すことができる。固体支持体は、核酸をそれに固定化することができる（例えば、共有結合でまたは非共有結合で）、プラスチック、セラミック、金属、またはポリマー材料（例えば、ヒドロゲル）で構成されている任意のタイプの中実性、多孔性、または中空の球体、ボール、ベアリング、円柱、または他の類似構成を包含することができる。固体支持体は、球状であってもよく（例えば、マイクロスフェア）、または立方体、立方形、ピラミッド形、円柱状、円錐形、長方形、もしくは円盤形など、非球状もしくは不規則の形状を有してもよい個別の粒子を含んでいてもよい。ビーズは、形状が非球状であってもよい。アレイ状に離間されている複数の固体支持体は、基材を構成しないことがある。固体支持体は、「ビーズ」という用語と同義的に使用される場合がある。
本明細書で使用される場合、「確率論的バーコード」という用語は、本開示の標識を含むポリヌクレオチド配列を指すことができる。確率論的バーコードは、確率論的バーコーディングのために使用することができるポリヌクレオチド配列であってもよい。確率論的バーコードを使用して、試料内の標的を定量化することができる。確率論的バーコードを使用して、標識が標的に付随した後で生じ得るエラーを制御することができる。例えば、確率論的バーコードを使用して、増幅エラーまたは配列決定エラーを評価することができる。標的に付随している確率論的バーコードは、確率論的バーコード－標的または確率論的バーコード－タグ－標的と呼ばれる場合がある。
本明細書で使用される場合、「遺伝子特異的確率論的バーコード」という用語は、標識および遺伝子特異的である標的結合性領域を含むポリヌクレオチド配列を指すことができる。確率論的バーコードは、確率論的バーコーディングのために使用することができるポリヌクレオチド配列であってもよい。確率論的バーコードは、試料内の標的を定量化するために使用することができる。確率論的バーコードは、標識が標的に付随した後で生じ得るエラーを制御するために使用することができる。例えば、確率論的バーコードは、増幅エラーまたは配列決定エラーを評価するために使用することができる。標的に付随している確率論的バーコードは、確率論的バーコード－標的または確率論的バーコード－タグ－標的と呼ばれる場合がある。
本明細書で使用される場合、「確率的バーコーディング」という用語は、核酸のランダム標識付与（例えば、バーコーディング）を指すことができる。確率論的バーコーディングは、再帰的ポアソン戦略を使用して、標的に付随している標識を関連付け、定量化することできる。本明細書で使用される場合、「確率論的バーコーディング」という用語は、「確率論的標識付与」と同義的に使用することができる。
ここで使用される場合、「標的」という用語は、バーコード（例えば、確率論的バーコード）を付随させることができる組成物を指すことができる。本開示の方法、デバイス、および系による分析のための例示的で好適な標的としては、オリゴヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、およびｔＲＮＡなどが挙げられる。標的は、一本鎖であってもよくまたは二本鎖であってもよい。一部の実施形態では、標的は、タンパク質、ペプチド、またはポリペプチドであってもよい。一部の実施形態では、標的は脂質である。本明細書で使用される場合、「標的」は、「種」と同義的に使用することができる。
本明細書で使用される場合、「逆転写酵素」という用語は、逆転写酵素活性を有する（すなわち、ＲＮＡ鋳型からのＤＮＡの合成を触媒する）酵素のグループを指すことができる。一般に、そのような酵素としては、これらに限定されないが、レトロウイルス逆転写酵素、レトロトランスポゾン逆転写酵素、レトロプラスミド逆転写酵素、レトロン逆転写酵素、細菌逆転写酵素、グループＩＩイントロン由来逆転写酵素、およびそれらの突然変異体、変異体、または誘導体が挙げられる。非レトロウイルス逆転写酵素としては、非ＬＴＲレトロトランスポゾン逆転写酵素、レトロプラスミド逆転写酵素、レトロン逆転写酵素、およびグループＩＩイントロン逆転写酵素が挙げられる。グループＩＩイントロン逆転写酵素の例としては、ラクトコッカス・ラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）ＬＩ．ＬｔｒＢイントロン逆転写酵素、サーモシネココッカス・エロンガツス（Ｔｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｅｌｏｎｇａｔｕｓ）ＴｅＩ４ｃイントロン逆転写酵素、またはゲオバチルス・ステアロサーモファイラス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＧｓＩ－ＩＩＣイントロン逆転写酵素が挙げられる。他のクラスの逆転写酵素としては、多くのクラスの非レトロウイルス逆転写酵素（すなわち、中でも、レトロン、グループＩＩイントロン、および多様性を生じさせるレトロエレメント（ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ－ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ ｒｅｔｒｏｅｌｅｍｅｎｔ））を挙げることができる。
「ユニバーサルアダプタープライマー」、「ユニバーサルプライマーアダプター」、または「ユニバーサルアダプター配列」という用語は、バーコード（例えば、確率論的バーコード）とハイブリダイズして遺伝子特異的バーコードを生成するために使用することができるヌクレオチド配列を指すために同義的に使用される。ユニバーサルアダプター配列は、例えば、本開示の方法で使用されるすべてのバーコードにわたってユニバーサルである既知配列であってもよい。例えば、本明細書で開示される方法を使用して複数の標的が標識されている場合、標的特異的配列の各々は、同じユニバーサルアダプター配列に連結されていてもよい。一部の実施形態では、１つよりも多くのユニバーサルアダプター配列を、本明細書で開示される方法に使用することができる。例えば、本明細書で開示される方法を使用して複数の標的が標識されている場合、標的特異的配列のうちの少なくとも２つは、異なるユニバーサルアダプター配列に連結されている。ユニバーサルアダプタープライマーおよびその相補体は、２つのオリゴヌクレオチドに含まれていてもよく、それらの一方は標的特異的配列を含み、他方はバーコードを含む。例えば、ユニバーサルアダプター配列は、標的核酸に相補的なヌクレオチド配列を生成するための標的特異的配列を含むオリゴヌクレオチドの一部であってもよい。バーコードおよびユニバーサルアダプター配列の相補配列を含む第２のオリゴヌクレオチドは、ヌクレオチド配列とハイブリダイズし、標的特異的バーコード（例えば、標的特異的確率論的バーコード）を生成することができる。一部の実施形態では、ユニバーサルアダプタープライマーは、本開示の方法で使用されるユニバーサルＰＣＲプライマーとは異なる配列を有する。
バーコード
確率論的バーコーディングなどのバーコーディングは、例えば、米国特許出願公開第２０１５０２９９７８４号明細書、国際公開第２０１５０３１６９１号パンフレット、およびFu et al, Proc Natl Acad Sci U.S.A. 2011 May 31; 108(22):9026-31に記載されており、こうした刊行物の内容はその全体が本明細書に組み込まれる。一部の実施形態では、本明細書で開示されるバーコードは、標的を確率論的に標識（例えば、バーコード、タグ）するために使用することができるポリヌクレオチド配列であってもよい確率論的バーコードであってもよい。バーコードは、確率論的バーコードの異なるバーコード配列の数および標識されることになる標的のいずれかの出現数の比が、１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１１：１、１２：１、１３：１、１４：１、１５：１、１６：１、１７：１、１８：１、１９：１、２０：１、３０：１、４０：１、５０：１、６０：１、７０：１、８０：１、９０：１、１００：１、もしくは約１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１１：１、１２：１、１３：１、１４：１、１５：１、１６：１、１７：１、１８：１、１９：１、２０：１、３０：１、４０：１、５０：１、６０：１、７０：１、８０：１、９０：１、１００：１、またはこうした値の任意の２つの間の数値もしくは範囲であり得る場合、確率論的バーコードと呼ぶことができる。標的は、同一のまたはほぼ同一の配列を有するｍＲＮＡ分子を含むｍＲＮＡ種であってもよい。バーコードは、確率論的バーコードの異なるバーコード配列の数および標識されることになる標的のいずれかの出現数の比が、少なくとも１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１１：１、１２：１、１３：１、１４：１、１５：１、１６：１、１７：１、１８：１、１９：１、２０：１、３０：１、４０：１、５０：１、６０：１、７０：１、８０：１、９０：１、もしくは１００：１であるか、または最大で１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１１：１、１２：１、１３：１、１４：１、１５：１、１６：１、１７：１、１８：１、１９：１、２０：１、３０：１、４０：１、５０：１、６０：１、７０：１、８０：１、９０：１、もしくは１００：１である場合、確率論的バーコードと呼ぶことができる。確率論的バーコードのバーコード配列は、分子標識と呼ばれる場合がある。
バーコード、例えば、確率論的バーコードは、１つまたは複数の標識を含むことができる。例示的な標識としては、ユニバーサル標識、細胞標識、バーコード配列（例えば、分子標識）、試料標識、プレート標識、空間標識、および／またはプレ空間標識（ｐｒｅ－ｓｐａｔｉａｌ ｌａｂｅｌ）を挙げることができる。図１は、空間標識を有する例示的なバーコード１０４を示す。バーコード１０４は、バーコードを固体支持体１０５に連結することができる５’アミンを含んでいてもよい。バーコードは、ユニバーサル標識、ディメンション標識（ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ ｌａｂｅｌ）、空間標識、細胞標識、および／または分子標識を含んでいてもよい。バーコード内の様々な標識（これらに限定されないが、ユニバーサル標識、ディメンション標識、空間標識、細胞標識、および分子標識を含む）の順序は様々であってもよい。例えば、図１に示されているように、ユニバーサル標識が最も５’側の標識であってもよく、分子標識が最も３’側の標識であってもよい。空間標識、ディメンション標識、および細胞標識は、任意の順序であってもよい。一部の実施形態では、ユニバーサル標識、空間標識、ディメンション標識、細胞標識、および分子標識は、任意の順序である。バーコードは、標的結合性領域を含んでいてもよい。標的結合性領域は、試料中の標的（例えば、標的核酸、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ＤＮＡ）と相互作用することができる。例えば、標的結合性領域は、ｍＲＮＡのポリ（Ａ）テイルと相互作用することができるオリゴ（ｄＴ）配列を含んでいてもよい。一部の場合では、バーコードの標識（例えば、ユニバーサル標識、ディメンション標識、空間標識、細胞標識、およびバーコード配列）は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の、またはそれよりも多くのヌクレオチドにより隔てられていてもよい。
標識、例えば、細胞標識は、規定の長さ、例えば各々が７ヌクレオチド（一部のハミングエラー訂正コードで使用されるビット数に等しい）の固有なセットの核酸部分配列を含んでいてもよく、それらは、エラー訂正能力を提供するように設計されていてもよい。エラー訂正部分配列のセットは、７ヌクレオチド配列を含み、セット内の配列の任意の対の組合せが、規定の「遺伝的距離」（またはミスマッチ塩基の数）を表すように設計することができ、例えば、エラー訂正部分配列のセットは、３ヌクレオチドの遺伝的距離を表すように設計することができる。この場合、標識化標的核酸分子の配列データのセットのエラー訂正配列を精査することにより（下記により完全に記載されている）、増幅エラーまたは配列決定エラーを検出または訂正することが可能になり得る。一部の実施形態では、エラー訂正コードを作出するために使用される核酸部分配列の長さは様々であってもよく、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、３１、４０、５０ヌクレオチド長、もしくは約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、３１、４０、５０ヌクレオチド長、またはこうした値の任意の２つの間の数もしくは範囲のヌクレオチド長であってもよい。一部の実施形態では、他の長さの核酸部分配列を、エラー訂正コードの作出に使用することができる。
バーコードは、標的結合性領域を含んでいてもよい。標的結合性領域は、試料中の標的と相互作用することができる。標的は、リボ核酸（ＲＮＡ）、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ＲＮＡ分解産物、各々がポリ（Ａ）テイルを含むＲＮＡ、またはそれらの任意の組合せであってもよくまたは含んでいてもよい。一部の実施形態では、複数の標的は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を含んでいてもよい。
一部の実施形態では、標的結合性領域は、ｍＲＮＡのポリ（Ａ）テイルと相互作用することができるオリゴ（ｄＴ）配列を含んでいてもよい。バーコードの標識（例えば、ユニバーサル標識、ディメンション標識、空間標識、細胞標識、およびバーコード配列（例えば、分子標識））の１つまたは複数は、スペーサーにより、バーコードの残りの標識の別の１つまたは２つから隔てられていてもよい。スペーサーは、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個、またはそれよりも多くのヌクレオチドであってもよい。一部の実施形態では、バーコードの標識はいずれも、スペーサーにより隔てられていない。
ユニバーサル標識
バーコードは、１つまたは複数のユニバーサル標識を含んでいてもよい。一部の実施形態では、１つまたは複数のユニバーサル標識は、所与の固体支持体に付着されているバーコードのセット内のすべてのバーコードで同じであってもよい。一部の実施形態では、１つまたは複数のユニバーサル標識は、複数のビーズに付着されているすべてのバーコードで同じであってもよい。一部の実施形態では、ユニバーサル標識は、配列決定プライマーにハイブリダイズすることが可能な核酸配列を含んでいてもよい。配列決定プライマーは、ユニバーサル標識を含むバーコードの配列決定に使用することができる。配列決定プライマー（例えば、ユニバーサル配列決定プライマー）は、ハイスループット配列決定プラットフォームに付随する配列決定プライマーを含んでいてもよい。一部の実施形態では、ユニバーサル標識は、ＰＣＲプライマーにハイブリダイズすることが可能な核酸配列を含んでいてもよい。一部の実施形態では、ユニバーサル標識は、配列決定プライマーおよびＰＣＲプライマーにハイブリダイズすることが可能な核酸配列を含んでいてもよい。配列決定プライマーまたはＰＣＲプライマーにハイブリダイズすることが可能なユニバーサル標識の核酸配列は、プライマー結合部位と呼ばれる場合がある。ユニバーサル標識は、バーコードの転写を開始するために使用することできる配列を含んでいてもよい。ユニバーサル標識は、バーコードまたはバーコード内の領域の伸長に使用することができる配列を含んでいてもよい。ユニバーサル標識は、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０ヌクレオチド長、もしくは約１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０ヌクレオチド長、またはこうした値の任意の２つの間の数もしくは範囲のヌクレオチド長であってもよい。例えば、ユニバーサル標識は、少なくとも約１０個のヌクレオチドを含んでいてもよい。ユニバーサル標識は、少なくとも１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、１００、２００、もしくは３００ヌクレオチド長であってもよく、または最大で１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、１００、２００、もしくは３００ヌクレオチド長であってもよい。一部の実施形態では、切断可能なリンカーまたは修飾ヌクレオチドは、バーコードが支持体から切断されることが可能になるようにユニバーサル標識配列の一部であってもよい。
ディメンション標識
バーコードは、１つまたは複数のディメンション標識を含んでいてもよい。一部の実施形態では、ディメンション標識は、標識付与（例えば、確率論的標識付与）が生じたディメンションに関する情報を提供する核酸配列を含んでいてもよい。例えば、ディメンション標識は、標的がバーコード化された時点に関する情報を提供することができる。ディメンション標識は、試料内のバーコーディング（例えば、確率論的バーコーディング）の時点に関連付けられていてもよい。ディメンション標識は、標識付与の時点で活性化されることができる。異なるディメンション標識を異なる時点で活性化することができる。ディメンション標識は、標的、標的のグループ、および／または試料がバーコード化された順序に関する情報を提供する。例えば、細胞の集団を、細胞周期のＧ０期にてバーコード化することができる。細胞を、細胞周期のＧ１期にてバーコード（例えば、確率論的バーコード）で再度パルスすることができる。細胞を、細胞周期のＳ期などにてバーコードで再度パルスすることができる。各パルス（例えば、細胞周期の各期）におけるバーコードは、異なるディメンション標識を含むことができる。このように、ディメンション標識は、細胞周期のどの期でどの標的が標識化されたかに関する情報を提供する。ディメンション標識により、多数の異なる生物学的時点を調査することができる。例示的な生物学的時点としては、これらに限定されないが、細胞周期、転写（例えば、転写開始）、および転写物分解を挙げることができる。別の例では、試料（例えば、細胞、細胞の集団）は、薬物および／または療法による治療前および／または治療後に標識することができる。別個の標的のコピー数の変化は、薬物および／または療法に対する試料の応答を示すことができる。
ディメンション標識は、活性化可能であってもよい。活性化可能なディメンション標識は、特定の時点で活性化することができる。活性化可能な標識は、例えば、構成的に活性化することができる（例えば、オフにならない）。活性化可能なディメンション標識は、例えば、可逆的に活性化することができる（例えば、活性化可能なディメンション標識は、オンおよびオフにすることができる）。例えば、ディメンション標識は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０回、またはそれよりも多くの回数、可逆的に活性化可能であってもよい。ディメンション標識は、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０回、またはそれよりも多くの回数、可逆的に活性化可能であってもよい。一部の実施形態では、ディメンション標識は、蛍光、光、化学的事象（例えば、切断、別の分子のライゲーション、修飾の付加（例えば、ペグ化、ＳＵＭＯ化、アセチル化、メチル化、脱アセチル化、脱メチル化）、光化学的事象（例えば、フォトケージ化）、および非天然ヌクレオチドの導入により活性化することができる。
ディメンション標識は、一部の実施形態では、所与の固体支持体（例えば、ビーズ）に付着されているすべてのバーコード（例えば、確率論的バーコード）で同一であってもよいが、異なる固体支持体（例えば、ビーズ）毎に異なっていてもよい。一部の実施形態では、同じ固体支持体上のバーコードのうちの少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、または１００％が、同じディメンション標識を含んでいてもよい。一部の実施形態では、同じ固体支持体上のバーコードのうちの少なくとも６０％が、同じディメンション標識を含んでいてもよい。一部の実施形態では、同じ固体支持体上のバーコードのうちの少なくとも９５％が、同じディメンション標識を含んでいてもよい。
複数の固体支持体（例えば、ビーズ）には、１０6個ものまたはそれよりも多くの固有ディメンション標識配列が提供されていてもよい。ディメンション標識は、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０ヌクレオチド長、もしくは約１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０ヌクレオチド長、またはこうした値の任意の２つの間の数もしくは範囲のヌクレオチド長であってもよい。ディメンション標識は、少なくとも１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、１００、２００、もしくは３００ヌクレオチド長であってもよく、または最大で１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、１００、２００、もしくは３００ヌクレオチド長であってもよい。ディメンション標識は、長さが約５～約２００個のヌクレオチド、約１０～約１５０個のヌクレオチド、または約２０～約１２５個のヌクレオチドを含んでいてもよい。
空間標識
バーコードは、１つまたは複数の空間標識を含んでいてもよい。一部の実施形態では、空間標識は、バーコードが付随している標的分子の空間的方向性に関する情報を提供する核酸配列を含んでいてもよい。空間標識は、試料の座標に関連付けられてもよい。座標は、固定座標であってもよい。例えば、座標は、基材を基準にして固定されていてもよい。空間標識は、二次元または三次元グリッドを基準していてもよい。座標は、目印を基準にして固定されていてもよい。目印は、空間にて識別可能であってもよい。目印は、画像化することができる構造であってもよい。目印は、生物学的構造、例えば、解剖学的目印であってもよい。目印は、細胞性の目印、例えば細胞小器官であってもよい。目印は、カラーコード、バーコード、磁気特性、蛍光物質、放射能、または固有のサイズもしくは形状などの識別可能な識別子を有する構造などの非天然の目印であってもよい。空間標識は、物理的な区画（例えば、ウェル、容器、または液滴）に関連付けられていてもよい。一部の実施形態では、空間における１つまたは複数の位置をコード化するために、複数の空間標識が一緒に使用される。
空間標識は、所与の固体支持体（例えば、ビーズ）に付着されているすべてのバーコードで同一であってもよいが、異なる固体支持体（例えば、ビーズ）毎に異なっていてもよい。一部の実施形態では、同じ固体支持体上の、同じ空間標識を含むバーコードのパーセンテージは、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、１００％、もしくは約６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、１００％、またはこうした値の任意の２つの間の数値もしくは範囲であってもよい。一部の実施形態では、同じ固体支持体上の、同じ空間標識を含むバーコードのパーセンテージは、少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、もしくは１００％であってもよく、または最大で６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、もしくは１００％であってもよい。一部の実施形態では、同じ固体支持体上のバーコードのうちの少なくとも６０％が、同じ空間標識を含んでいてもよい。一部の実施形態では、同じ固体支持体上のバーコードのうちの少なくとも９５％が、同じ空間標識を含んでいてもよい。
複数の固体支持体（例えば、ビーズ）には、１０6個ものまたはそれよりも多くの固有空間標識配列が提供されていてもよい。空間標識は、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０ヌクレオチド長、もしくは約１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０ヌクレオチド長、またはこうした値の任意の２つの間の数または範囲のヌクレオチド長であってもよい。空間標識は、少なくとも１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、１００、２００、もしくは３００ヌクレオチド長であってもよく、または最大で１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、１００、２００、もしくは３００ヌクレオチド長であってもよい。空間標識は、長さが約５～約２００個のヌクレオチド、約１０～約１５０個のヌクレオチド、または約２０～約１２５個のヌクレオチドを含んでいてもよい。
細胞標識
バーコード（例えば、確率論的バーコード）は、１つまたは複数の細胞標識を含んでいてもよい。一部の実施形態では、細胞標識は、どの標的核酸がどの細胞を起源とするかを決定するための情報を提供する核酸配列を含んでいてもよい。一部の実施形態では、細胞標識は、所与の固体支持体（例えば、ビーズ）に付着されているすべてのバーコードで同一であるが、異なる固体支持体（例えば、ビーズ）毎に異なる。一部の実施形態では、同じ固体支持体上の、同じ細胞標識を含むバーコードのパーセンテージは、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、１００％、もしくは約６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、１００％、またはこうした値の任意の２つの間の数値もしくは範囲であってもよい。一部の実施形態では、同じ固体支持体上の、同じ細胞標識を含むバーコードのパーセンテージは、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、もしくは１００％であってもよく、または約６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、もしくは１００％であってもよい。例えば、同じ固体支持体上のバーコードのうちの少なくとも６０％が、同じ細胞標識を含んでいてもよい。別の例として、同じ固体支持体上のバーコードのうちの少なくとも９５％が、同じ細胞標識を含んでいてもよい。
複数の固体支持体（例えば、ビーズ）には、１０6個ものまたはそれよりも多くの固有細胞標識配列が提供されていてもよい。細胞標識は、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０ヌクレオチド長、もしくは約１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０ヌクレオチド長、またはこうした値の任意の２つの間の数もしくは範囲のヌクレオチド長であってもよい。細胞標識は、少なくとも１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、１００、２００、もしくは３００ヌクレオチド長であってもよく、または最大で１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、１００、２００、もしくは３００ヌクレオチド長であってもよい。例えば、細胞標識は、長さが約５～約２００個のヌクレオチド、約１０～約１５０個のヌクレオチド、または約２０～約１２５個のヌクレオチドを含んでいてもよい。
バーコード配列
バーコードは、１つまたは複数のバーコード配列を含んでいてもよい。一部の実施形態では、バーコード配列は、バーコードにハイブリダイズした特定のタイプの標的核酸種を識別するための情報を提供する核酸配列を含んでいてもよい。バーコード配列は、バーコード（例えば、標的結合性領域）にハイブリダイズした標的核酸種の具体的な出現の計数手段を提供する（例えば、大まかな近似値を提供する）核酸配列を含んでいてもよい。
一部の実施形態では、多様なセットのバーコード配列が、所与の固体支持体（例えば、ビーズ）に付着されている。一部の実施形態では、１０2、１０3、１０4、１０5、１０6、１０7、１０8、１０9個の、もしくは約１０2、１０3、１０4、１０5、１０6、１０7、１０8、１０9個の、またはこうした値の任意の２つの間の数もしくは範囲の固有分子標識配列が存在してもよい。例えば、複数のバーコードは、別個の配列を有する約６５６１個のバーコード配列を含んでいてもよい。別の例として、複数のバーコードは、別個の配列を有する約６５５３６個のバーコード配列を含んでいてもよい。一部の実施形態では、少なくとも１０2、１０3、１０4、１０5、１０6、１０7、１０8、もしくは１０9個の、または最大で１０2、１０3、１０4、１０5、１０6、１０7、１０8、もしくは１０9個の固有バーコード配列が存在してもよい。固有分子標識配列は、所与の固体支持体（例えば、ビーズ）に付着されていてもよい。
バーコードの長さは、インプリメンテーションが異なれば異なっていてもよい。例えば、バーコードは、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０ヌクレオチド長、もしくは約１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０ヌクレオチド長、またはこうした値の任意の２つの間の数もしくは範囲のヌクレオチド長であってもよい。別の例として、バーコードは、少なくとも１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、１００、２００、もしくは３００ヌクレオチド長であってもよく、または最大で１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、１００、２００、もしくは３００ヌクレオチド長であってもよい。
分子標識
バーコード（例えば、確率論的バーコード）は、１つまたは複数の分子標識を含んでいてもよい。分子標識は、バーコード配列を含んでいてもよい。一部の実施形態では、分子標識は、バーコードにハイブリダイズした特定のタイプの標的核酸種を識別するための情報を提供する核酸配列を含んでいてもよい。分子標的は、バーコード（例えば、標的結合性領域）にハイブリダイズした標的核酸種の具体的な出現の計数手段を提供する核酸配列を含んでいてもよい。
一部の実施形態では、多様なセットの分子標識が、所与の固体支持体（例えば、ビーズ）に付着されている。一部の実施形態では、１０2、１０3、１０4、１０5、１０6、１０7、１０8、１０9個の、もしくは約１０2、１０3、１０4、１０5、１０6、１０7、１０8、１０9個の、またはこうした値の任意の２つの間の数もしくは範囲の固有分子標識配列が存在してもよい。例えば、複数のバーコードは、別個の配列を有する約６５６１個の分子標識を含んでいてもよい。別の例として、複数のバーコードは、別個の配列を有する約６５５３６個の分子標識を含んでいてもよい。一部の実施形態では、少なくとも１０2、１０3、１０4、１０5、１０6、１０7、１０8、もしくは１０9個の、または最大で１０2、１０3、１０4、１０5、１０6、１０7、１０8、もしくは１０9個の固有分子標識配列が存在してもよい。固有分子標識配列を有するバーコードは、所与の固体支持体（例えば、ビーズ）に付着されていてもよい。
複数の確率論的バーコードを使用する確率論的バーコーディングの場合、異なる分子標識配列の数および標的のいずれかの出現数の比は、１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１１：１、１２：１、１３：１、１４：１、１５：１、１６：１、１７：１、１８：１、１９：１、２０：１、３０：１、４０：１、５０：１、６０：１、７０：１、８０：１、９０：１、１００：１、もしくは約１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１１：１、１２：１、１３：１、１４：１、１５：１、１６：１、１７：１、１８：１、１９：１、２０：１、３０：１、４０：１、５０：１、６０：１、７０：１、８０：１、９０：１、１００：１、またはこうした値の任意の２つの間の数値もしくは範囲であってもよい。標的は、同一のまたはほぼ同一の配列を有するｍＲＮＡ分子を含むｍＲＮＡ種であってもよい。一部の実施形態では、異なる分子標識配列の数および標的のいずれかの出現数の比は、少なくとも１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１１：１、１２：１、１３：１、１４：１、１５：１、１６：１、１７：１、１８：１、１９：１、２０：１、３０：１、４０：１、５０：１、６０：１、７０：１、８０：１、９０：１、もしくは１００：１であるか、または最大で１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１１：１、１２：１、１３：１、１４：１、１５：１、１６：１、１７：１、１８：１、１９：１、２０：１、３０：１、４０：１、５０：１、６０：１、７０：１、８０：１、９０：１、もしくは１００：１である。
分子標識は、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０ヌクレオチド長、もしくは約１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０ヌクレオチド長、またはこうした値の任意の２つの間の数もしくは範囲のヌクレオチド長であってもよい。分子標識は、少なくとも１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、１００、２００、もしくは３００ヌクレオチド長であってもよく、または最大で１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、１００、２００、もしくは３００ヌクレオチド長であってもよい。
標的結合性領域
バーコードは、捕捉プローブなど、１つまたは複数の標的結合性領域を含んでいてもよい。一部の実施形態では、標的結合性領域は、目的の標的とハイブリダイズすることができる。一部の実施形態では、標的結合性領域は、標的（例えば、標的核酸、標的分子、例えば、分析しようとする細胞性核酸）に、例えば特定の遺伝子配列に特異的にハイブリダイズする核酸配列を含んでいてもよい。一部の実施形態では、標的結合性領域は、特定の標的核酸の特定の位置に付着する（例えば、ハイブリダイズする）ことができる核酸配列を含んでいてもよい。一部の実施形態では、標的結合性領域は、制限酵素部位突出（例えば、ＥｃｏＲＩ粘着末端突出）に対する特異的ハイブリダイゼーションが可能である核酸配列を含んでいてもよい。次いで、バーコードは、制限部位突出に相補的な配列を含む任意の核酸分子にライゲートすることができる。
一部の実施形態では、標的結合性領域は、非特異的標的核酸配列を含んでいてもよい。非特異的標的核酸配列は、標的核酸の特異的配列とは無関係の複数の標的核酸に結合することができる配列を指すことができる。例えば、標的結合性領域は、ランダムマルチマー配列、またはｍＲＮＡ分子上のポリ（Ａ）テイルにハイブリダイズするオリゴ（ｄＴ）配列を含んでいてもよい。ランダムマルチマー配列は、例えば、ランダムダイマー、トリマー、クワトラマー、ペンタマー、ヘキサマー、セプタマー、オクタマー、ノナマー、デカマー、または任意の長さのより高次のマルチマー配列であってもよい。一部の実施形態では、標的結合性領域は、所与のビーズに付着されているすべてのバーコードで同じである。一部の実施形態では、所与のビーズに付着されている複数のバーコードの標的結合性領域は、２つまたはそれよりも多くの異なる標的結合性配列を含んでいてもよい。標的結合性領域は、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０ヌクレオチド長、もしくは約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０ヌクレオチド長、またはこうした値の任意の２つの間の数もしくは範囲のヌクレオチド長であってもよい。標的結合性領域は、最大で約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０ヌクレオチド長、またはそれよりも長いヌクレオチド長であってもよい。
一部の実施形態では、標的結合性領域は、ポリアデニル化末端を含むｍＲＮＡとハイブリダイズすることができるオリゴ（ｄＴ）を含んでいてもよい。標的結合性領域は、遺伝子特異的であってもよい。例えば、標的結合性領域は、標的の特定の領域にハイブリダイズするように構成されていてもよい。標的結合性領域は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６ ２７、２８、２９、３０ヌクレオチド長、もしくは約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６ ２７、２８、２９、３０ヌクレオチド長、またはこうした値の任意の２つの間の数もしくは範囲のヌクレオチド長であってもよい。標的結合性領域は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６ ２７、２８、２９、もしくは３０ヌクレオチド長であってもよく、または最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６ ２７、２８、２９、もしくは３０ヌクレオチド長であってもよい。標的結合性領域は、約５～３０ヌクレオチド長であってもよい。バーコードが遺伝子特異的標的結合性領域を含む場合、バーコードは、本明細書では遺伝子特異的バーコードと呼ばれる場合がある。
方向付け特性
確率論的バーコード（例えば、確率論的バーコード）は、バーコードを方向付ける（例えば、アラインさせる）ために使用することができる１つまたは複数の方向付け特性を含んでいてもよい。バーコードは、等電点電気泳動のための部分を含んでいてもよい。異なるバーコードは、異なる等電点電気泳動点を構成することができる。こうしたバーコードが試料に導入されている場合、バーコードを既知の方向へと方向付けるために、試料を等電点電気泳動にかけることができる。このように、方向付け特性を使用すると、試料内のバーコードの既知マップを作成することができる。例示的な方向付け特性としては、電気泳動移動度（例えば、バーコードのサイズに基づく）、等電点、スピン、導電率、および／または自己組織化を挙げることができる。例えば、自己組織化の方向付け特性を有するバーコードは、活性化されると特定の方向（例えば、核酸ナノ構造）へと自己組織化することができる。
親和性特性
バーコード（例えば、確率論的バーコード）は、１つまたは複数の親和性特性を含んでいてもよい。例えば、空間標識は、親和性特性を含んでいてもよい。親和性特性は、バーコードと別の実体（例えば、細胞受容体）との結合を容易にすることができる化学的および／または生物学的部分を含んでいてもよい。例えば、親和性特性は、抗体、例えば、試料上の特定の部分（例えば、受容体）に対して特異的な抗体を含んでいてもよい。一部の実施形態では、抗体は、バーコードを、特定の細胞タイプまたは分子へと導くことができる。特定の細胞タイプにあるおよび／または付近にある標的を標識する（例えば、確率論的に標識する）ことができる。抗体はバーコードを特定の位置に導くことができるため、一部の実施形態では、親和性特性は、空間標識のヌクレオチド配列に加えて、空間情報を提供することができる。抗体は、治療用抗体、例えば、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体であってもよい。抗体は、ヒト化またはキメラ化されていてもよい。抗体は、ネイキッド抗体または融合抗体であってもよい。
抗体は、全長（すなわち、天然に存在するか、もしくは通常の免疫グロブリン遺伝子断片組換えプロセスにより形成される）免疫グロブリン分子（例えば、ＩｇＧ抗体）または抗体断片のような免疫グロブリン分子の免疫学的活性（すなわち、特異的に結合する）部分であってもよい。
抗体断片は、例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、およびｓＦｖなどの抗体の一部であってもよい。一部の実施形態では、抗体断片は、全長抗体により認識されるものと同じ抗原に結合することができる。抗体断片は、重鎖および軽鎖の可変領域からなる「Ｆｖ」断片、ならびに軽鎖可変領域および重鎖可変領域がペプチドリンカーにより接続されている組換え単鎖ポリペプチド分子（「ｓｃＦｖタンパク質」）などの、抗体の可変領域からなる単離断片を含むことができる。例示的な抗体としては、これらに限定されないが、がん細胞に対する抗体、ウイルスに対する抗体、細胞表面受容体（ＣＤ８、ＣＤ３４、ＣＤ４５）に結合する抗体、および治療用抗体を挙げることができる。
ユニバーサルアダプタープライマー
バーコードは、１つまたは複数のユニバーサルアダプタープライマーを含んでいてもよい。例えば、遺伝子特異的確率論的バーコードなどの遺伝子特異的バーコードは、ユニバーサルアダプタープライマーを含んでいてもよい。ユニバーサルアダプタープライマーは、すべてのバーコードにわたってユニバーサルであるヌクレオチド配列を指すことができる。ユニバーサルアダプタープライマーは、遺伝子特異的バーコードを構築するために使用することができる。ユニバーサルアダプタープライマーは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６ ２７、２８、２９、３０ヌクレオチド長、もしくは約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６ ２７、２８、２９、３０ヌクレオチド長、またはこれらのうちの任意の２つの間の数もしくは範囲のヌクレオチド長であってもよい。ユニバーサルアダプタープライマーは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、もしくは３０ヌクレオチド長であってもよく、または最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、もしくは３０ヌクレオチド長であってもよい。ユニバーサルアダプタープライマーは、５～５０ヌクレオチド長であってもよい。
リンカー
バーコードが、１つよりも多くのタイプの標識を含む場合（例えば、１つの分子標識などの、１つよりも多くの細胞標識または１つよりも多くのバーコード配列）、標識は、リンカー標識配列で分散されていてもよい。リンカー標識配列は、少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０ヌクレオチド長、またはそれよりも長いヌクレオチド長であってもよい。リンカー標識配列は、最大で約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０ヌクレオチド長、またはそれよりも長いヌクレオチド長、例えば、１２ヌクレオチド長であってもよい。リンカー標識配列を使用して、バーコードの合成を容易にすることができる。リンカー標識は、エラー訂正（例えば、ハミング）コードを含んでいてもよい。
固体支持体
本明細書で開示される確率論的バーコードなどのバーコードは、一部の実施形態では、固体支持体に付随していてもよい。固体支持体は、例えば、合成粒子であってもよい。一部の実施形態では、固体支持体上の複数のバーコード（例えば、第１の複数のバーコード）の確率論的バーコード（例えば、第１のバーコード配列）の分子標識などの、バーコード配列の一部またはすべては、少なくとも１つのヌクレオチドが異なる。同じ個体支持体上のバーコードの細胞標識は、同じであってもよい。異なる固体支持体上のバーコードの細胞標識は、少なくとも１つのヌクレオチドが異なっていてもよい。例えば、第１の固体支持体上の第１の複数のバーコードの第１の細胞標識は同じ配列を有してもよく、第２の固体支持体上の第２の複数のバーコードの第２の細胞標識は同じ配列を有してもよい。第１の固体支持体上の第１の複数のバーコードの第１の細胞標識および第２の固体支持体上の第２の複数のバーコードの第２の細胞標識は、少なくとも１つのヌクレオチドが異なっていてもよい。細胞標識は、例えば、約５～２０ヌクレオチド長であってもよい。バーコード配列は、例えば、約５～２０ヌクレオチド長であってもよい。合成粒子は、例えば、ビーズであってもよい。
ビーズは、例えば、シリカゲルビーズ、細孔が制御されたガラスビーズ、磁気ビーズ、ダイナビーズ、セファデックス／セファロースビーズ、セルロースビーズ、ポリスチレンビーズ、またはそれらの任意の組合せであってもよい。ビーズは、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ポリスチレン、ガラス、ポリプロピレン、アガロース、ゼラチン、ヒドロゲル、常磁性体、セラミック、プラスチック、ガラス、メチルスチレン、アクリルポリマー、チタン、ラテックス、セファロース、セルロース、ナイロン、シリコーン、またはそれらの任意の組合せなどの材料を含んでいてもよい。
一部の実施形態では、ビーズは、バーコードまたは確率論的バーコードで官能化されたポリマービーズ、例えば、変形可能ビーズまたはゲルビーズであってもよい（１０Ｘ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ（カリフォルニア州サンフランシスコ）のゲルビーズなど）。一部の実施形態では、ゲルビーズは、ポリマーベースゲルを含んでいてもよい。ゲルビーズは、例えば、１つまたは複数のポリマー前駆体を液滴内に被包することにより生成することができる。ポリマー前駆体を促進剤（例えば、テトラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ））に曝露すると、ゲルビーズを生成することができる。
一部の実施形態では、粒子は分解可能であってもよい。例えば、ポリマービーズは、例えば、所望の条件下で、溶解、融解、または分解することができる。所望の条件は、環境条件を含むことができる。所望の条件は、制御された様式でのポリマービーズの溶解、融解、または分解をもたらすことができる。ゲルビーズは、化学的刺激、物理的刺激、生物学的刺激、熱的刺激、磁気的刺激、電気的刺激、光刺激、またはそれらの任意の組合せにより、溶解、融解、または分解することができる。
オリゴヌクレオチドバーコードなどの分析物および／または試薬は、例えば、ゲルビーズの内部表面（例えば、オリゴヌクレオチドバーコードおよび／もしくはオリゴヌクレオチドバーコードの生成に使用される材料の拡散により接近可能な内部）ならびに／またはゲルビーズもしくは本明細書に記載の他のマイクロカプセルの外部表面にカップリング／固定化されていてもよい。カップリング／固定化は、任意の形態の化学結合（例えば、共有結合、イオン結合）または物理的現象（例えば、ファンデルワールス力、双極子間相互作用など）によるものであってもよい。一部の実施形態では、ゲルビーズまたは本明細書に記載の任意の他のマイクロカプセルとの試薬のカップリング／固定化は、例えば、不安定部分を介する（例えば、本明細書に記載の化学架橋剤を含む化学架橋剤を介する）ものなど、可逆的であってもよい。刺激を適用すると、不安定部分が切断され、固定化されている試薬を解放することができる。一部の実施形態では、不安定部分はジスルフィド結合である。例えば、オリゴヌクレオチドバーコードがジスルフィド結合を介してゲルビーズに固定化されている場合、ジスルフィド結合を還元剤に曝露することにより、ジスルフィド結合を切断し、オリゴヌクレオチドバーコードをビーズから解放することができる。不安定部分は、ゲルビーズもしくはマイクロカプセルの一部として、試薬もしくは分析物をゲルビーズもしくはマイクロカプセルに連結する化学リンカーの一部として、および／または試薬もしくは分析物の一部として含まれていてもよい。一部の実施形態では、複数のバーコードのうちの少なくとも１つのバーコードは、粒子上に固定化されていてもよく、粒子上に部分的に固定化されていてもよく、粒子内に封入されていてもよく、粒子内に部分的に封入されていてもよく、またはそれらの任意の組合せであってもよい。
一部の実施形態では、ゲルビーズは、これらに限定されないが、ポリマー、熱感受性ポリマー、光感受性ポリマー、磁気ポリマー、ｐＨ感受性ポリマー、塩感受性ポリマー、化学感受性ポリマー、高分子電解質、ポリサッカライド、ペプチド、タンパク質、および／またはプラスチックを含む、広範囲の様々なポリマーを含んでいてもよい。ポリマーとしては、これらに限定されないが、ポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）（ＰＮＩＰＡＡｍ）、ポリ（スチレンスルホネート）（ＰＳＳ）、ポリ（アリルアミン）（ＰＡＡｍ）、ポリ（アクリル酸）（ＰＡＡ）、ポリ（エチレンイミン）（ＰＥＩ）、ポリ（ジアリルジメチル－アンモニウムクロリド）（ＰＤＡＤＭＡＣ）、ポリ（ピロール）（ｐｏｌｙ（ｐｙｒｏｌｌｅ））（ＰＰｙ）、ポリ（ビニルピロリドン）（ＰＶＰＯＮ）、ポリ（ビニルピリジン）（ＰＶＰ）、ポリ（メタクリル酸）（ＰＭＡＡ）、ポリ（メチルメタクリレート）（ＰＭＭＡ）、ポリスチレン（ＰＳ）、ポリ（テトラヒドロフラン）（ＰＴＨＦ）、ポリ（フタルアルデヒド）（ｐｏｌｙ（ｐｈｔｈａｌａｄｅｈｙｄｅ））（ＰＴＨＦ）、ポリ（ヘキシルビオロゲン）（ＰＨＶ）、ポリ（Ｌ－リシン）（ＰＬＬ）、ポリ（Ｌ－アルギニン）（ＰＡＲＧ）、ポリ（乳酸－ｃｏ－グリコール酸）（ＰＬＧＡ）などの材料を挙げることができる。
数多くの化学的刺激を使用して、ビーズの破壊、溶解、または分解を誘発することができる。こうした化学的変化の例としては、これらに限定されないが、ビーズ壁に対するｐＨ媒介性変化、架橋結合の化学的切断によるビーズ壁の崩壊、ビーズ壁の解重合誘発、およびビーズ壁スイッチング反応を挙げることができる。また、バルク変化を使用して、ビーズの破壊を誘発することができる。
また、種々の刺激によるマイクロカプセルに対するバルク変化または物理的変化は、試薬放出のためのカプセルの設計に多数の利点を提供する。バルク変化または物理的変化は、肉眼的規模で生じ、ビーズ破裂は、刺激により誘導される機械物理的力の結果である。こうしたプロセスとしては、これらに限定されないが、圧力誘導性破裂、ビーズ壁融解、またはビーズ壁の多孔性の変化を挙げることができる。
また、生物学的刺激を使用して、ビーズの破壊、溶解、または分解を誘発することができる。一般に、生物学的誘発因子は、化学的誘発因子に類似するが、多数の例では、生体分子、または酵素、ペプチド、サッカライド、脂肪酸、および核酸など、生体系に一般的に見出される分子が使用される。例えば、ビーズは、特定のプロテアーゼによる切断に感受性であるペプチド架橋連結を有するポリマーを含んでいてもよい。より具体的には、一例は、ＧＦＬＧＫペプチド架橋連結を含むマイクロカプセルを含むことができる。プロテアーゼカテプシンＢなどの生物学的誘発因子を添加すると、シェル壁のペプチド架橋連結が切断され、ビーズの内容物が放出される。他の場合では、プロテアーゼは、熱活性化することができる。別の例では、ビーズは、セルロースを含むシェル壁を含む。加水分解酵素キトサンの添加は、セルロース結合の切断、シェル壁の解重合、およびその内部内容物の放出のための生物学的誘発因子としての役目を果たす。
また、ビーズは、熱刺激の適用時にそれらの内容物を放出するように誘導することができる。温度の変化は、ビーズに様々な変化を引き起こすことができる。熱の変化は、ビーズの融解を引き起こし、ビーズ壁を崩壊させることができる。他の場合では、熱は、ビーズの内部成分の内圧を上昇させ、ビーズを破裂または爆発させることができる。さらに他の場合では、熱は、ビーズを変形して収縮脱水状態にすることができる。また、熱は、ビーズの壁内の熱感受性ポリマーに作用して、ビーズの破壊を引き起こすことができる。
マイクロカプセルのビーズ壁に磁気ナノ粒子を含めることにより、ビーズの破裂を誘発することならびにビーズをアレイにおいて誘導することが可能になり得る。本開示のデバイスは、いずれの目的のために磁気ビーズを含んでいてもよい。一例では、ビーズを含有する高分子電解質へのＦｅ3Ｏ4ナノ粒子の組込みは、振動磁場刺激の存在下での破裂を誘発する。
また、ビーズは、電気刺激の結果として、破壊、溶解、または分解することができる。前節で説明した磁気粒子と同様に、電気的感受性ビーズは、ビーズの破裂誘発、ならびに電場でのアラインメント、電気伝導性、または酸化還元反応などの他の機能を両方とも可能にすることができる。一例では、電気的感受性材料を含有するビーズは、電場にてアラインされ、内部試薬の放出を制御することができる。他の例では、電場は、ビーズ壁自体内での酸化還元反応を誘導することができ、それにより多孔性を増加させることができる。
また、光刺激を使用して、ビーズを破壊することができる。数多くの光誘発因子が考えられ、特定の波長範囲の光子を吸収可能なナノ粒子および発色団などの種々の分子を使用する系を挙げることができる。例えば、金属酸化物コーティングを、カプセル誘発因子として使用することができる。ＳｉＯ2でコーティングされた高分子電解質カプセルをＵＶ照射すると、ビーズ壁の崩壊を引き起こすことができる。さらに別の例では、アゾベンゼン基などの光スイッチング可能な物質をビーズ壁に組み込むことができる。ＵＶ光または可視光を適用すると、これらのような化学物質は、光子の吸収時に可逆的なシス－トランス異性化を起こす。この態様では、光子スイッチの組込みは、光誘発因子を適用すると崩壊するかまたはより多孔性になり得るビーズ壁をもたらす。
例えば、図２に例示されているバーコーディング（例えば、確率論的バーコーディング）の非限定的な例では、ブロック２０８にて、マイクロウェルアレイの複数のマイクロウェルに単一細胞などの細胞を導入した後、ブロック２１２にて、ビーズをマイクロウェルアレイの複数のマイクロウェルに導入することができる。各マイクロウェルは、１つのビーズを含んでいてもよい。ビーズは、複数のバーコードを含んでいてもよい。バーコードは、ビーズに付着されている５’アミン領域を含んでいてもよい。バーコードは、ユニバーサル標識、バーコード配列（例えば、分子標識）、標的結合性領域、またはそれらの任意の組合せを含んでいてもよい。
本明細書で開示されるバーコードは、固体支持体（例えば、ビーズ）に付随（例えば、付着）していてもよい。固体支持体に付随しているバーコードは各々、固有配列を有する少なくとも１００個または１０００個のバーコード配列を含む群から選択されるバーコード配列を含んでいてもよい。一部の実施形態では、固体支持体に付随している異なるバーコードは、異なる配列を有するバーコードを含んでいてもよい。一部の実施形態では、固体支持体に付随しているあるパーセンテージのバーコードは、同じ細胞標識を含む。例えば、パーセンテージは、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、１００％、もしくは約６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、１００％、またはこうした値の任意の２つの間の数値もしくは範囲であってもよい。別の例として、パーセンテージは、少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、もしくは１００％であってもよく、または最大で６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、もしくは１００％であってもよい。一部の実施形態では、固体支持体に付随しているバーコードは、同じ細胞標識を有してもよい。異なる固体支持体に付随しているバーコードは、固有配列を有する少なくとも１００個または１０００個の細胞標識を含む群から選択される異なる細胞標識を有してもよい。
本明細書で開示されるバーコードは、固体支持体（例えば、ビーズ）に付随（例えば、付着）していてもよい。一部の実施形態では、試料内の複数の標的のバーコーディングは、複数のバーコードが付随している複数の合成粒子を含む固体支持体を用いて実施することができる。一部の実施形態では、固体支持体は、複数のバーコードが付随している複数の合成粒子を含んでいてもよい。異なる固体支持体上の複数のバーコードの空間標識は、少なくとも１つのヌクレオチドが異なっていてもよい。固体支持体は、例えば、二次元または三次元の複数のバーコードを含んでいてもよい。合成粒子は、ビーズであってもよい。ビーズは、シリカゲルビーズ、細孔が制御されたガラスビーズ、磁気ビーズ、ダイナビーズ、セファデックス／セファロースビーズ、セルロースビーズ、ポリスチレンビーズ、またはそれらの任意の組合せであってもよい。固体支持体は、ポリマー、マトリックス、ヒドロゲル、ニードルアレイデバイス、抗体、またはそれらの任意の組合せを含んでいてもよい。一部の実施形態では、固体支持体は、浮遊性であってよい。一部の実施形態では、固体支持体は、半固体または固体アレイに埋め込まれていてもよい。バーコードは、固体支持体に付随していなくともよい。バーコードは、個々のヌクレオチドであってもよい。バーコードは、基材に付随していてもよい。
本明細書で使用される場合、「係留された」、「付着された」、および「固定化された」という用語は、同義的に使用され、バーコードを固体支持体に付着させるための共有結合手段または非共有結合手段を指すことができる。様々な異なる固体支持体のいずれかを、事前に合成されたバーコードを付着させるための、またはバーコードをｉｎ ｓｉｔｕで固相合成するための固体支持体として使用することができる。
一部の実施形態では、固体支持体はビーズである。ビーズは、１つまたは複数のタイプの中実性、多孔性、または中空の球体、ボール、ベアリング、円柱、または核酸を固定化することができる（例えば、共有結合でまたは非共有結合で）他の類似構成を含んでいてもよい。ビーズは、例えば、プラスチック、セラミック、金属、ポリマー材料、またはそれらの任意の組合せで構成されていてもよい。ビーズは、球状であるか（例えば、マイクロスフェア）、または立方体、立方形、ピラミッド形、円柱状、円錐形、長方形、もしくは円盤形など、非球状もしくは不規則の形状を有する個別の粒子であってもよくまたは含んでいてもよい。一部の実施形態では、ビーズは、形状が非球状であってもよい。
ビーズは、これらに限定されないが、常磁性材料（例えば、マグネシウム、モリブデン、リチウム、およびタンタル）、超常磁性材料（例えば、フェライト（Ｆｅ3Ｏ4；マグネタイト）ナノ粒子）、強磁性材料（例えば、鉄、ニッケル、コバルト、それらの一部の合金、および一部の希土類金属化合物）、セラミック、プラスチック、ガラス、ポリスチレン、シリカ、メチルスチレン、アクリルポリマー、チタン、ラテックス、セファロース、アガロース、ヒドロゲル、ポリマー、セルロース、ナイロン、またはそれらの任意の組合せを含む様々な材料を含んでいてもよい。
一部の実施形態では、ビーズ（例えば、標識が付着されるビーズ）は、ヒドロゲルビーズである。一部の実施形態では、ビーズはヒドロゲルを含む。
本明細書で開示される一部の実施形態は、１つまたは複数の粒子（例えば、ビーズ）を含む。粒子の各々は、複数のオリゴヌクレオチド（例えば、バーコード）を含んでいてもよい。複数のオリゴヌクレオチドの各々は、バーコード配列（例えば、分子標識配列）、細胞標識、および標的結合性領域（例えば、オリゴ（ｄＴ）配列、遺伝子特異的配列、ランダムマルチマー、またはそれらの組合せ）を含んでいてもよい。複数のオリゴヌクレオチドの各々の細胞標識配列は同じであってもよい。異なる粒子上のオリゴヌクレオチドの細胞標識配列は、異なる粒子上のオリゴヌクレオチドを識別することができるように、異なっていてもよい。異なる細胞標識配列の数は、インプリメンテーションが異なれば異なっていてもよい。一部の実施形態では、細胞標識配列の数は、１０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１００００、２００００、３００００、４００００、５００００、６００００、７００００、８００００、９００００、１０００００、１０6、１０7、１０8、１０9、もしくは約１０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１００００、２００００、３００００、４００００、５００００、６００００、７００００、８００００、９００００、１０００００、１０6、１０7、１０8、１０9、またはこうした値の任意の２つの間の数もしくは範囲であってもよい。一部の実施形態では、細胞標識配列の数は、少なくとも１０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１００００、２００００、３００００、４００００、５００００、６００００、７００００、８００００、９００００、１０００００、１０6、１０7、１０8、もしくは１０9であってもよく、または最大で１０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１００００、２００００、３００００、４００００、５００００、６００００、７００００、８００００、９００００、１０００００、１０6、１０7、１０8、もしくは１０9であってもよい。一部の実施形態では、複数の粒子の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００個以下、またはそれよりも多くが、同じ細胞配列を有するオリゴヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、同じ細胞配列を有するオリゴヌクレオチドを含む複数の粒子は、最大で０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、またはそれよりも多くともよい。一部の実施形態では、複数の粒子はいずれも、同じ細胞標識配列を有していない。
各粒子上の複数のオリゴヌクレオチドは、異なるバーコード配列（例えば、分子標識）を含んでいてもよい。一部の実施形態では、バーコード配列の数は、１０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１００００、２００００、３００００、４００００、５００００、６００００、７００００、８００００、９００００、１０００００、１０6、１０7、１０8、１０9、もしくは約１０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１００００、２００００、３００００、４００００、５００００、６００００、７００００、８００００、９００００、１０００００、１０6、１０7、１０8、１０9、またはこうした値の任意の２つの間の数もしくは範囲であってもよい。一部の実施形態では、バーコード配列の数は、少なくとも１０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１００００、２００００、３００００、４００００、５００００、６００００、７００００、８００００、９００００、１０００００、１０6、１０7、１０8、もしくは１０9であってもよく、または最大で１０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１００００、２００００、３００００、４００００、５００００、６００００、７００００、８００００、９００００、１０００００、１０6、１０7、１０8、もしくは１０9であってもよい。例えば、複数のオリゴヌクレオチドのうちの少なくとも１００個は、異なるバーコード配列を含む。別の例として、単一粒子において、複数のオリゴヌクレオチドのうちの少なくとも１００、５００、１０００、５０００、１００００、１５０００、２００００、５００００個、こうした値の任意の２つの間の数もしくは範囲、またはそれよりも多くが、異なるバーコード配列を含む。一部の実施形態は、バーコードを含む複数の粒子を提供する。一部の実施形態では、標識しようとする標的の出現（またはコピーもしくは数）および異なるバーコード配列の比は、少なくとも１：１、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、１：１０、１：１１、１：１２、１：１３、１：１４、１：１５、１：１６、１：１７、１：１８、１：１９、１：２０、１：３０、１：４０、１：５０、１：６０、１：７０、１：８０、１：９０、またはそれよりも大きくともよい。一部の実施形態では、複数のオリゴヌクレオチドの各々は、試料標識、ユニバーサル標識、または両方をさらに含む。粒子は、例えば、ナノ粒子またはマイクロ粒子であってもよい。
ビーズのサイズは様々であってもよい。例えば、ビーズの直径は、０．１マイクロメートル～５０マイクロメートルの範囲であってもよい。一部の実施形態では、ビーズの直径は、０．１、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０マイクロメートル、もしくは約０．１、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０マイクロメートル、またはこうした値の任意の２つの間の数値もしくは範囲であってもよい。
ビーズの直径は、基材のウェルの直径に関連していてもよい。一部の実施形態では、ビーズの直径は、ウェルの直径よりも、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、もしくは約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、またはこうした値の任意の２つの間の数値もしくは範囲だけ長くともよくまたは短くともよい。ビーズの直径は、細胞（例えば、基材のウェルに閉じ込められる単一細胞）の直径に関連していてもよい。一部の実施形態では、ビーズの直径は、ウェルの直径よりも、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、もしくは１００％または最大で１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、もしくは１００％長くともよくまたは短くともよい。ビーズの直径は、細胞（例えば、基材のウェルに閉じ込められる単一細胞）の直径に関連していてもよい。一部の実施形態では、ビーズの直径または複数のビーズの平均直径は、細胞の直径よりも、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１５０％、２００％、２５０％、３００％、もしくは約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１５０％、２００％、２５０％、３００％、またはこうした値の任意の２つの間の数値もしくは範囲だけ長くともよくまたは短くともよい。
ビーズは、基材に付着および／または埋め込まれていてもよい。ビーズは、ゲル、ヒドロゲル、ポリマー、および／またはマトリックスに付着および／または埋め込まれていてもよい。基材（例えば、ゲル、マトリックス、スキャフォールド、またはポリマー）内のビーズの空間的位置は、位置アドレスとしての役目を果たすことができる、ビーズ上のバーコードに存在する空間標識を使用して識別することができる。
ビーズの例としては、これらに限定されないが、ストレプトアビジンビーズ、アガロースビーズ、磁気ビーズ、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）、ＭＡＣＳ（登録商標）マイクロビーズ、抗体コンジュゲートビーズ（例えば、抗免疫グロブリンマイクロビーズ）、プロテインＡコンジュゲートビーズ、プロテインＧコンジュゲートビーズ、プロテインＡ／Ｇコンジュゲートビーズ、プロテインＬコンジュゲートビーズ、オリゴ（ｄＴ）コンジュゲートビーズ、シリカビーズ、シリカ様ビーズ、抗ビオチンマイクロビーズ、抗蛍光色素マイクロビーズ、およびＢｃＭａｇ（商標）カルボキシル末端化磁気ビーズを挙げることができる。
ビーズには、ビーズが１つの蛍光光学チャネルまたは複数の光学チャネルにて蛍光発光するように、量子ドットまたは蛍光性色素が付随していてもよい（例えば、含浸されていてもよい）。ビーズに酸化鉄または酸化クロムを付随させて、ビーズを常磁性または強磁性にしてもよい。ビーズは、識別可能であってもよい。例えば、ビーズは、カメラを使用して画像化することできる。ビーズは、ビーズに付随している検出可能なコードを有してもよい。例えば、ビーズはバーコードを含んでいてもよい。ビーズは、例えば、有機溶液または無機溶液での膨潤により、サイズが変化する場合がある。ビーズは疎水性であってもよい。ビーズは親水性であってもよい。ビーズは生体適合性であってもよい。
固体支持体（例えば、ビーズ）は、視覚化することができる。固体支持体は、視覚化タグ（例えば、蛍光性色素）を含んでいてもよい。固体支持体（例えば、ビーズ）は、識別子（例えば、数字）が刻印されていてもよい。識別子は、ビーズを画像化することにより視覚化することができる。
固体支持体は、不溶性、半可溶性、または不溶性の材料を含んでいてもよい。固体支持体は、それに付着されているリンカー、スキャフォールド、構造ブロック、または他の反応性部分を含む場合「官能化」されていると呼ぶことができ、固体支持体は、それに付着されているそのような反応性部分を欠如する場合、「非官能化」されていると呼ぶことができる。固体支持体は、マイクロタイターウェル形式、カラムなどのフロースルー形式、または浸漬スティックなどにおいて、溶液中に浮遊させて使用することができる。
固体支持体は、膜、紙、プラスチック、コーティング表面、平坦表面、ガラス、スライド、チップ、またはそれらの任意の組合せを含んでいてもよい。固体支持体は、樹脂、ゲル、マイクロスフェア、または他の幾何学的構成の形態をとっていてもよい。固体支持体は、シリカチップ、マイクロ粒子、ナノ粒子、プレート、アレイ、毛細管、ガラス繊維フィルター、ガラス表面、金属表面（鋼鉄、金銀、アルミニウム、ケイ素、および銅）などの平坦支持体、ガラス支持体、プラスチック支持体、ケイ素支持体、チップ、フィルター、膜、マイクロウェルプレート、スライド、マルチウェルプレートもしくは膜を含むプラスチック材料（例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリアミド、ポリビニリデンジフルオリドで形成されている）、および／またはウェーハ、コーム、ピン、もしくは針（例えば、コンビナトリアル合成もしくは分析に好適なピンのアレイ）、またはウェーハ（例えば、シリコンウェーハ）、フィルター底部を有するもしくは有しないピットを有するウェーハなどの平坦表面のピットもしくはナノリットルウェルのアレイ中のビーズを含むことができる。
固体支持体は、ポリマーマトリックス（例えば、ゲル、ヒドロゲル）を含んでいてもよい。ポリマーマトリックスは、細胞内空間（例えば、細胞小器官周囲）に浸透することができる場合がある。ポリマーマトリックスは、循環系全体にポンプ送出することができる場合がある。
基材およびマイクロウェルアレイ
本明細書で使用される場合、基材は、あるタイプの固体支持体を指すことができる。基材は、本開示のバーコードまたは確率論的バーコードを含んでいてもよい固体支持体を指すことができる。基材は、例えば、複数のマイクロウェルを含んでいてもよい。例えば、基材は、２つまたはそれよりも多くのマイクロウェルを含むウェルアレイであってもよい。一部の実施形態では、マイクロウェルは、規定容積の小型反応チャンバーを含んでいてもよい。一部の実施形態では、マイクロウェルには、１つまたは複数の細胞を閉じ込めることができる。一部の実施形態では、マイクロウェルには、１つのみの細胞を閉じ込めることができる。一部の実施形態では、マイクロウェルには、１つまたは複数の固体支持体を閉じ込めることができる。一部の実施形態では、マイクロウェルには、１つのみの固体支持体を閉じ込めることができる。一部の実施形態では、マイクロウェルには、単一細胞および単一固体支持体（例えば、ビーズ）を閉じ込める。マイクロウェルは、本開示のバーコード試薬を含むことができる。
バーコーディングの方法
本開示は、物理的試料（例えば、組織、臓器、腫瘍、細胞）中の別個の位置にある別個の標的の数を推定するための方法を提供する。本方法は、バーコード（例えば、確率論的バーコード）を試料の近傍に配置すること、試料を溶解すること、別個の標的にバーコードを付随させること、標的を増幅すること、および／または標的をデジタル的に計数することを含んでいてもよい。本方法は、バーコードにある空間標識から得られる情報を分析および／または視覚化することをさらに含んでいてもよい。一部の実施形態では、方法は、試料中の複数の標的を視覚化することを含む。複数の標的を試料のマップにマッピングすることは、試料の二次元マップまたは三次元マップを生成することを含んでいてもよい。二次元マップおよび三次元マップは、試料中の複数の標的をバーコーディングする（例えば、確率論的にバーコーディングする）前にまたは後で生成することができる。試料中の複数の標的の視覚化は、複数の標的を試料のマップにマッピングすることを含んでいてもよい。複数の標的を試料のマップにマッピングすることは、試料の二次元マップまたは三次元マップを生成することを含んでいてもよい。二次元マップおよび三次元マップは、試料中の複数の標的をバーコーディングする前にまたは後で生成することができる。一部の実施形態では、二次元マップおよび三次元マップは、試料を溶解する前にまたは後で生成することができる。二次元マップまたは三次元マップを生成する前にまたは後で試料を溶解することは、試料を加熱すること、試料を界面活性剤と接触させること、試料のｐＨを変化させること、またはそれらの任意の組合せを含んでいてもよい。
一部の実施形態では、複数の標的をバーコーディングすることは、複数のバーコードを複数の標的とハイブリダイズさせて、バーコード化標的（例えば、確率論的バーコード化標的）を作出することを含む。複数の標的のバーコーディングは、バーコード化標的のインデックス化ライブラリーを生成することを含んでいてもよい。バーコード化標的のインデックス化ライブラリーの生成は、複数のバーコード（例えば、確率論的バーコード）を含む個体支持体を使用して実施することができる。
試料とバーコードとの接触
本開示は、試料（例えば、細胞）を、本開示の基材と接触させるための方法を提供する。例えば、細胞、臓器、または組織の薄い切片を含む試料を、バーコード（例えば、確率論的バーコード）と接触させることができる。例えば、重力流により細胞を接触させることができ、その場合、細胞は沈降して単層を作出することができる。試料は、組織の薄い切片であってもよい。薄い切片を、基材上に配置することができる。試料は１次元であってもよい（例えば、平面状表面を形成してもよい）。試料（例えば、細胞）は、例えば、細胞を基材上で増殖／培養することにより、基材全体に広げることができる。
バーコードが標的の近傍に存在すると、標的は、バーコードにハイブリダイズすることができる。別個の標的の各々に本開示の別個のバーコードが付随し得るように、バーコードを非枯渇比率で接触させることができる。標的とバーコードと効率的な付随を保証するため、標的をバーコードと架橋連結してもよい。
細胞溶解
細胞およびバーコードを配分した後、細胞を溶解して標的分子を遊離させてもよい。細胞溶解は、様々な手段のいずれかにより、例えば、化学的もしくは生化学的手段により、浸透圧ショックにより、または熱溶解、機械的溶解、もしくは光学的溶解により達成することができる。細胞は、界面活性剤（例えば、ＳＤＳ、ドデシル硫酸Ｌｉ、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、Ｔｗｅｅｎ－２０、もしくはＮＰ－４０）、有機溶媒（例えば、メタノールもしくはアセトン）、または消化酵素（例えば、プロテイナーゼＫ、ペプシン、もしくはトリプシン）、またはそれらの任意の組合せを含む細胞溶解緩衝液の添加により溶解することができる。標的へのバーコードの付随を増加させるため、標的分子の拡散速度を、例えば、温度を低減させることおよび／または溶解物の粘度を増加させることにより変更してもよい。
一部の実施形態では、試料は、濾過紙を使用して溶解してもよい。濾過紙は、濾過紙の上部に溶解緩衝液を含浸させることができる。試料の溶解および試料の標的と基材とのハイブリダイゼーションを容易にすることができる圧力で、濾過紙に試料を適用することができる。
一部の実施形態では、溶解は、機械的溶解、熱溶解、光学的溶解、および／または化学的溶解により実施することができる。化学的溶解は、プロテイナーゼＫ、ペプシン、およびトリプシンなどの消化酵素の使用を含んでいてもよい。溶解は、溶解緩衝液を基材に添加することにより実施することができる。溶解緩衝液は、Ｔｒｉｓ ＨＣｌを含んでいてもよい。溶解緩衝液は、少なくとも約０．０１、０．０５、０．１、０．５、または１Ｍ、またはそれよりも高濃度のＴｒｉｓ ＨＣｌを含んでいてもよい。溶解緩衝液は、最大で約０．０１、０．０５、０．１、０．５、または１Ｍ、またはそれよりも高濃度のＴｒｉｓ ＨＣＬを含んでいてもよい。溶解緩衝液は、約０．１ＭのＴｒｉｓ ＨＣｌを含んでいてもよい。溶解緩衝液のｐＨは、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれよりも高くともよい。溶解緩衝液のｐＨは、最大で約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれよりも高くともよい。一部の実施形態では、溶解緩衝液のｐＨは約７．５である。溶解緩衝液は、塩（例えば、ＬｉＣｌ）を含んでいてもよい。溶解緩衝液中の塩濃度は、少なくとも約０．１、０．５、または１Ｍ、またはそれよりも高濃度であってもよい。溶解緩衝液中の塩濃度は、最大で約０．１、０．５、または１Ｍ、またはそれよりも高濃度であってもよい。一部の実施形態では、溶解緩衝液中の塩濃度は、約０．５Ｍである。溶解緩衝液は、界面活性剤（例えば、ＳＤＳ、ドデシル硫酸Ｌｉ、ｔｒｉｔｏｎ Ｘ、ｔｗｅｅｎ、ＮＰ－４０）を含んでいてもよい。溶解緩衝液中の界面活性剤の濃度は、少なくとも約０．０００１％、０．０００５％、０．００１％、０．００５％、０．０１％、０．０５％、０．１％、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、または７％、またはそれよりも高濃度であってもよい。溶解緩衝液中の界面活性剤の濃度は、最大で約０．０００１％、０．０００５％、０．００１％、０．００５％、０．０１％、０．０５％、０．１％、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、または７％、またはそれよりも高濃度であってもよい。一部の実施形態では、溶解緩衝液中の界面活性剤の濃度は、約１％ドデシル硫酸Ｌｉである。溶解法に使用される時間は、使用される界面活性剤の量に依存する場合がある。一部の実施形態では、使用される界面活性剤が多いほど、溶解に必要な時間が短くなる。溶解緩衝液は、キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ）を含んでいてもよい。溶解緩衝液中のキレート剤の濃度は、少なくとも約１、５、１０、１５、２０、２５、または３０ｍＭ、またはそれよりも高濃度であってもよい。溶解緩衝液中のキレート剤の濃度は、最大で約１、５、１０、１５、２０、２５、または３０ｍＭ、またはそれよりも高濃度であってもよい。一部の実施形態では、溶解緩衝液中のキレート剤の濃度は、約１０ｍＭである。溶解緩衝液は、還元剤（例えば、ベータ－メルカプトエタノール、ＤＴＴ）を含んでいてもよい。溶解緩衝液中の還元剤の濃度は、少なくとも約１、５、１０、１５、または２０ｍＭ、またはそれよりも高濃度であってもよい。溶解緩衝液中の還元剤の濃度は、最大で約１、５、１０、１５、または２０ｍＭ、またはそれよりも高濃度であってもよい。一部の実施形態では、溶解緩衝液中の還元剤の濃度は、約５ｍＭである。一部の実施形態では、溶解緩衝液は、約０．１ＭのＴｒｉｓ ＨＣｌ、約ｐＨ７．５、約０．５ＭのＬｉＣｌ、約１％のドデシル硫酸リチウム、約１０ｍＭのＥＤＴＡ、および約５ｍＭのＤＴＴを含んでいてもよい。
溶解は、約４、１０、１５、２０、２５、または３０℃の温度で実施することができる。溶解は、約１、５、１０、１５、または２０分間、またはそれよりも長時間、実施することができる。溶解された細胞は、少なくとも約１０００００、２０００００、３０００００、４０００００、５０００００、６０００００、または７０００００個、またはそれよりも多くの標的核酸分子を含んでいてもよい。溶解された細胞は、最大で約１０００００、２０００００、３０００００、４０００００、５０００００、６０００００、または７０００００個、またはそれよりも多くの標的核酸分子を含んでいてもよい。
標的核酸分子に対するバーコードの付着
細胞を溶解し、それらから核酸分子を放出させた後、核酸分子に、共局在化されている固体支持体のバーコードをランダムに付随させることができる。付随は、バーコードの標的認識領域と標的核酸分子の相補的部分とのハイブリダイゼーションを含んでいてもよい（例えば、バーコードのオリゴ（ｄＴ）は、標的のポリ（Ａ）テイルと相互作用することができる）。ハイブリダイゼーションに使用されるアッセイ条件（例えば、緩衝液ｐＨ、イオン強度、温度など）は、特異的で安定したハイブリッドの形成を促進するように選択することができる。一部の実施形態では、溶解された細胞から放出された核酸分子に、基材上の複数のプローブを付随させる（例えば、基材上のプローブとハイブリダイズする）ことができる。プローブがオリゴ（ｄＴ）を含む場合、ｍＲＮＡ分子は、プローブにハイブリダイズし、逆転写され得る。オリゴヌクレオチドのオリゴ（ｄＴ）部分は、ｃＤＮＡ分子の第一鎖合成のプライマーとして作用することができる。例えば、図２に例示されているバーコーディングの非限定的な例では、ブロック２１６において、ｍＲＮＡ分子を、ビーズ上のバーコードにハイブリダイズさせることができる。例えば、一本鎖ヌクレオチド断片は、バーコードの標的結合性領域にハイブリダイズすることができる。
付着は、バーコードの標的認識領域と標的核酸分子の一部とのライゲーションをさらに含んでいてもよい。例えば、標的結合性領域は、制限部位突出（例えば、ＥｃｏＲＩ粘着末端突出）に対する特異的ハイブリダイゼーションが可能であり得る核酸配列を含んでいてもよい。アッセイ手順は、標的核酸を制限酵素（例えば、ＥｃｏＲＩ）で処理して、制限部位突出を作出することをさらに含んでいてもよい。次いで、バーコードは、制限部位突出に相補的な配列を含む任意の核酸分子にライゲートすることができる。リガーゼ（例えば、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ）を使用して、２つの断片を接合することができる。
例えば、図２に例示されているバーコーディングの非限定的な例では、その後、ブロック２２０において、複数の細胞（または複数の試料）に由来する標識化標的（例えば、標的－バーコード分子）を、例えばチューブにプールしてもよい。標識化標的は、例えば、標的－バーコード分子が付着されているバーコードおよび／またはビーズを回収することによりプールすることができる。
付着されている標的－バーコード分子の固体支持体に基づくコレクションの回収は、磁気ビーズおよび外部から印加される磁場を使用することにより実施することができる。標的－バーコード分子をプールしたら、すべてのさらなる処理は、単一反応容器で進めることができる。さらなる処理は、例えば、逆転写反応、増幅反応、切断反応、解離反応、および／または核酸伸長反応を含んでいてもよい。マイクロウェル内で、すなわち、複数の細胞に由来する標識化標的核酸分子を最初にプールすることなく、さらなる処理反応を実施してもよい。
逆転写
本開示は、逆転写を使用して標的－バーコードコンジュゲートを作出するための方法を提供する（例えば、図２のブロック２２４において）。標的－バーコードコンジュゲートは、バーコードおよび標的核酸のすべてまたは一部の相補配列（すなわち、確率論的バーコード化ｃＤＮＡ分子などのバーコード化ｃＤＮＡ分子）を含んでいてもよい。付随しているＲＮＡ分子の逆転写は、逆転写酵素と共に逆転写プライマーを添加することにより生じ得る。逆転写プライマーは、オリゴ（ｄＴ）プライマー、ランダムヘキサヌクレオチドプライマー、または標的特異的オリゴヌクレオチドプライマーであってもよい。オリゴ（ｄＴ）プライマーは、１２～１８ヌクレオチド長であってもよく、または約１２～１８ヌクレオチド長であってもよく、哺乳動物ｍＲＮＡの３’末端にある内因性ポリ（Ａ）テイルに結合することができる。ランダムヘキサヌクレオチドプライマーは、様々な相補的部位にてｍＲＮＡに結合することできる。標的特異的オリゴヌクレオチドプライマーは、典型的には、選択的に目的のｍＲＮＡからのプライミングを生じる。
一部の実施形態では、標識化ＲＮＡ分子の逆転写は、逆転写プライマーの添加により生じ得る。一部の実施形態では、逆転写プライマーは、オリゴ（ｄＴ）プライマー、ランダムヘキサヌクレオチドプライマー、または標的特異的オリゴヌクレオチドプライマーである。一般に、オリゴ（ｄＴ）プライマーは、１２～１８ヌクレオチド長であり、哺乳動物ｍＲＮＡの３’末端にある内因性ポリ（Ａ）テイルに結合する。ランダムヘキサヌクレオチドプライマーは、様々な相補的部位にてｍＲＮＡに結合することできる。標的特異的オリゴヌクレオチドプライマーは、典型的には、選択的に目的のｍＲＮＡからのプライミングを生じる。
逆転写は、繰り返して生じて、複数の標識化ｃＤＮＡ分子を産生することができる。本明細書で開示される方法は、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００回の逆転写反応を実施することを含んでいてもよい。
増幅
１つまたは複数の核酸増幅反応（例えば、図２のブロック２２８における）を実施して、標識化標的核酸分子の複数コピーを作出することができる。増幅は、複数の標的核酸配列が同時に増幅されるマルチプレックス様式で実施することができる。増幅反応を使用して、配列決定アダプターを核酸分子に付加することができる。増幅反応は、存在する場合、試料標識の少なくとも一部を増幅することを含んでいてもよい。増幅反応は、細胞標識および／またはバーコード配列（例えば、分子標識）の少なくとも一部を増幅することを含んでいてもよい。増幅反応は、試料タグ、細胞標識、空間標識、バーコード配列（例えば、分子標識）、標的核酸、またはそれらの組合せの少なくとも一部を増幅することを含んでいてもよい。増幅反応は、複数の核酸の０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、１００％、またはこうした値の任意の２つの間の範囲もしくは数値を増幅することを含んでいてもよい。本方法は、１つまたは複数のｃＤＮＡ合成反応を実施して、試料標識、細胞標識、空間標識、および／またはバーコード配列（例えば、分子標識）を含む標的－バーコード分子の１つまたは複数のｃＤＮＡコピーを産生することをさらに含んでいてもよい。
一部の実施形態では、増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して実施することができる。本明細書で使用される場合、ＰＣＲは、ＤＮＡの相補鎖の同時プライマー伸長により特定のＤＮＡ配列をｉｎ ｖｉｔｒｏ増幅するための反応を指すことができる。本明細書で使用される場合、ＰＣＲは、これらに限定されないが、ＲＴ－ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、ネステッドＰＣＲ、定量的ＰＣＲ、マルチプレックスＰＣＲ、デジタルＰＣＲ、およびアセンブリＰＣＲを含む、この反応の派生形態を包含することができる。
標識化核酸の増幅は、非ＰＣＲベース法を含んでいてもよい。非ＰＣＲベース法の例としては、これらに限定されないが、複数置換増幅（ＭＤＡ）、転写媒介増幅（ＴＭＡ）、核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、リアルタイムＳＤＡ、ローリングサークル増幅、またはサークルツーサークル増幅（ｃｉｒｃｌｅ－ｔｏ－ｃｉｒｃｌｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）が挙げられる。他の非ＰＣＲベース増幅法としては、ＤＮＡまたはＲＮＡ標的を増幅するためのＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ駆動性ＲＮＡ転写増幅またはＲＮＡ指向性ＤＮＡ合成および転写の複数サイクル、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、およびＱβレプリカーゼ（Ｑβ）法、パリンドロームプローブの使用、鎖置換増幅、制限エンドヌクレアーゼを使用したオリゴヌクレオチド駆動性増幅、プライマーが核酸配列にハイブリダイズし、得られた二重鎖が伸長反応および増幅の前に切断される増幅法、５’エキソヌクレアーゼ活性を欠如する核酸ポリメラーゼを使用した鎖置換増幅、ローリングサークル増幅、ならびに分岐伸長増幅（ＲＡＭ、ｒａｍｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）が挙げられる。一部の実施形態では、増幅は、環状化転写物を産生しない。
一部の実施形態では、本明細書で開示される方法は、標識化核酸（例えば、標識化ＲＮＡ、標識化ＤＮＡ、標識化ｃＤＮＡ）に対してポリメラーゼ連鎖反応を実施して、標識化アンプリコン（例えば、確率論的標識化アンプリコン）を産生することをさらに含む。標識化アンプリコンは、二本鎖分子であってもよい。二本鎖分子は、二本鎖ＲＮＡ分子、二本鎖ＤＮＡ分子、またはＤＮＡ分子にハイブリダイズしたＲＮＡ分子を含んでいてもよい。二本鎖分子の一方または両方の鎖は、試料標識、空間標識、細胞標識、および／またはバーコード配列（例えば、分子標識）を含んでいてもよい。標識化アンプリコンは、一本鎖分子であってもよい。一本鎖分子は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはそれらの組合せを含んでいてもよい。本開示の核酸は、合成のまたは改変された核酸を含んでいてもよい。
増幅は、１つまたは複数の非天然ヌクレオチドの使用を含んでいてもよい。非天然ヌクレオチドは、光不安定性または誘発性ヌクレオチドを含んでいてもよい。非天然ヌクレオチドの例としては、これらに限定されないが、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、モルホリノ、およびロックド核酸（ＬＮＡ）、ならびにグリコール核酸（ＧＮＡ）、およびトレオース核酸（ＴＮＡ）を挙げることができる。非天然ヌクレオチドを、増幅反応の１つまたは複数のサイクルに添加してもよい。非天然ヌクレオチドの添加は、増幅反応の特定のサイクルまたは時点での産物を識別するために使用することができる。
１つまたは複数の増幅反応の実施は、１つまたは複数のプライマーの使用を含んでいてもよい。１つまたは複数のプライマーは、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５個、またはそれよりも多くのヌクレオチドを含んでいてもよい。１つまたは複数のプライマーは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５個、またはそれよりも多くのヌクレオチドを含んでいてもよい。１つまたは複数のプライマーは、１２～１５個未満のヌクレオチドを含んでいてもよい。１つまたは複数のプライマーは、複数の標識化標的（例えば、確率論的標識化標的）の少なくとも一部にアニーリングすることができる。１つまたは複数のプライマーは、複数の標識化標的の３’末端または５’末端にアニーリングすることができる。１つまたは複数のプライマーは、複数の標識化標的の内部領域にアニーリングすることができる。内部領域は、複数の標識化標的の３’末端から少なくとも約５０、１００、１５０、２００、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、または１０００ヌクレオチドであってもよい。１つまたは複数のプライマーは、一定のパネルのプライマーを含んでいてもよい。１つまたは複数のプライマーは、少なくとも１つまたは複数の特注プライマーを含んでいてもよい。１つまたは複数のプライマーは、少なくとも１つまたは複数の対照プライマーを含んでいてもよい。１つまたは複数のプライマーは、少なくとも１つまたは複数の遺伝子特異的プライマーを含んでいてもよい。
１つまたは複数のプライマーは、ユニバーサルプライマーを含んでいてもよい。ユニバーサルプライマーは、ユニバーサルプライマー結合部位にアニーリングすることができる。１つまたは複数の特注プライマーは、第１の試料標識、第２の試料標識、空間標識、細胞標識、バーコード配列（例えば、分子標識）、標的、またはそれらの任意の組合せにアニーリングすることができる。１つまたは複数のプライマーは、ユニバーサルプライマーおよび特注プライマーを含んでいてもよい。特注プライマーは、１つまたは複数の標的を増幅するように設計することができる。標的は、１つまたは複数の試料中の全核酸のサブセットを含んでいてもよい。標的は、１つまたは複数の試料中の全標識化標的のサブセットを含んでいてもよい。１つまたは複数のプライマーは、少なくとも９６個またはそれよりも多くの特注プライマーを含んでいてもよい。１つまたは複数のプライマーは、少なくとも９６０個またはそれよりも多くの特注プライマーを含んでいてもよい。１つまたは複数のプライマーは、少なくとも９６００個またはそれよりも多くの特注プライマーを含んでいてもよい。１つまたは複数の特注プライマーは、２つまたはそれよりも多くの異なる標識化核酸にアニーリングすることができる。２つまたはそれよりも多くの異なる標識化核酸は、１つまたは複数の遺伝子に対応していてもよい。
任意の増幅スキームを、本開示の方法で使用することができる。例えば、１つのスキームにおいて、最初のラウンドのＰＣＲでは、遺伝子特異的プライマーおよびユニバーサルＩｌｌｕｍｉｎａ配列決定プライマー１配列に対するプライマーを使用して、ビーズに付着されている分子を増幅することができる。２回目のラウンドのＰＣＲでは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ配列決定プライマー２配列にフランキングされているネステッド遺伝子特異的プライマー、およびユニバーサルＩｌｌｕｍｉｎａ配列決定プライマー１配列に対するプライマーを使用して、最初のＰＣＲ産物を増幅することができる。３回目のラウンドのＰＣＲでは、Ｐ５およびＰ７および試料インデックスが付加され、ＰＣＲ産物がＩｌｌｕｍｉｎａ配列決定ライブラリーへと変換される。１５０ｂｐ×２配列決定を使用した配列決定により、リード１では細胞標識およびバーコード配列（例えば、分子標識）を、リード２では遺伝子を、ならびにインデックス１リードでは試料インデックスを明らかにすることができる。
一部の実施形態では、化学的切断を使用して核酸を基材から除去することができる。例えば、核酸に存在する化学基または修飾塩基を使用して、固体支持体からの核酸の除去を容易にすることができる。例えば、酵素を使用して、核酸を基材から除去することができる。例えば、核酸は、制限エンドヌクレアーゼ消化により基材から除去することができる。例えば、ｄＵＴＰまたはｄｄＵＴＰを含有する核酸をウラシル－ｄ－グリコシラーゼ（ＵＤＧ）で処理することにより、核酸を基材から除去することができる。例えば、核酸は、脱プリン／脱ピリミジン（ＡＰ）エンドヌクレアーゼなどの塩基切除修復酵素などの、ヌクレオチド切除を実施する酵素を使用して、基材から除去することができる。一部の実施形態では、核酸は、光切断可能基および光を使用して基材から除去することができる。一部の実施形態では、切断可能なリンカーを使用して、核酸を基材から除去することができる。例えば、切断可能なリンカーは、ビオチン／アビジン、ビオチン／ストレプトアビジン、ビオチン／ニュートラアビジン、Ｉｇ－プロテインＡ、光不安定性リンカー、酸もしくは塩基不安定性リンカー基、またはアプタマーのうちの少なくとも１つを含んでいてもよい。
プローブが遺伝子特異的である場合、分子はプローブにハイブリダイズし、逆転写および／または増幅され得る。一部の実施形態では、核酸が合成された後（例えば、逆転写された後）、それを増幅してもよい。増幅は、複数の標的核酸配列が同時に増幅されるマルチプレックス様式で実施することができる。増幅により、配列決定アダプターを核酸に付加することができる。
一部の実施形態では、増幅は、例えばブリッジ増幅により基材上で実施することができる。基材上のオリゴ（ｄＴ）プローブを使用してブリッジ増幅するために適した末端を生成するために、ｃＤＮＡにホモポリマーのテイルを加えてもよい。ブリッジ増幅では、鋳型核酸の３’末端に相補的なプライマーは、中実粒子に共有結合で付着されている各対の第１のプライマーであってもよい。鋳型核酸を含有する試料を粒子と接触させ、単一のサーマルサイクルを実施すると、鋳型分子が第１のプライマーにアニーリングし、ヌクレオチドを添加することにより第１のプライマーをフォワード方向に伸長させて、鋳型分子および鋳型に相補的な新たに形成されたＤＮＡ鎖からなる二重鎖分子を形成することができる。次のサイクルの加熱ステップにて、二重鎖分子を変性させて、鋳型分子を粒子から放出させ、第１のプライマーを介して粒子に付着されている相補的ＤＮＡ鎖を残すことができる。それに続くアニーリングおよび伸長ステップのアニーリング段階では、相補鎖は、第１のプライマーから除去された位置の相補鎖のセグメントに相補的な第２のプライマーにハイブリダイズすることができる。このハイブリダイゼーションは、相補鎖が、共有結合により第１のプライマーにおよびハイブリダイゼーションにより第２のプライマーに保持されている第１および第２のプライマー間の架橋の形成を引き起こすことができる。伸長段階では、同じ反応混合物にヌクレオチドを添加することにより、第２のプライマーをリバース方向に伸長させ、それにより架橋を二本鎖架橋に変換することができる。次いで、次のサイクルが開始され、二本鎖架橋が変性して、各々の一方の末端がそれぞれ第１および第２のプライマーを介して粒子表面に付着されており、各々の他方の末端が付着されていない２つの一本鎖核酸分子を得ることができる。この第２のサイクルのアニーリングおよび伸長ステップでは、各鎖は、同じ粒子上にあり以前に使用されなかったさらなる相補的プライマーにハイブリダイズして、新しい一本鎖架橋を形成することができる。この時点でハイブリダイズしている２つの以前に使用されなかったプライマーが伸長されて、２つの新しい架橋が二本鎖架橋に変換される。
増幅反応は、複数の核酸の少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、または１００％を増幅することができる。
標識化核酸の増幅は、ＰＣＲベース法または非ＰＣＲベース法を含んでいてもよい。標識化核酸の増幅は、標識化核酸の指数関数的増幅を含んでいてもよい。標識化核酸の増幅は、標識化核酸の線形増幅を含んでいてもよい。増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により実施することができる。ＰＣＲは、ＤＮＡの相補鎖の同時プライマー伸長により特定のＤＮＡ配列をｉｎ ｖｉｔｒｏ増幅するための反応を指すことができる。ＰＣＲは、これらに限定されないが、ＲＴ－ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、ネステッドＰＣＲ、定量的ＰＣＲ、マルチプレックスＰＣＲ、デジタルＰＣＲ、サプレッションＰＣＲ、半サプレッシブＰＣＲ（ｓｅｍｉ－ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｖｅ ＰＣＲ）、およびアセンブリＰＣＲを含む、この反応の派生形態を包含することができる。
一部の実施形態では、標識化核酸の増幅は、非ＰＣＲベース法を含む。非ＰＣＲベース法の例としては、これらに限定されないが、複数置換増幅（ＭＤＡ）、転写媒介増幅（ＴＭＡ）、核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、リアルタイムＳＤＡ、ローリングサークル増幅、またはサークルツーサークル増幅が挙げられる。他の非ＰＣＲベース増幅法としては、ＤＮＡまたはＲＮＡ標的を増幅するためのＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ駆動性ＲＮＡ転写増幅もしくはＲＮＡ指向性ＤＮＡ合成および転写の複数サイクル、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、Ｑβレプリカーゼ（Ｑβ）法、パリンドロームプローブの使用、鎖置換増幅、制限エンドヌクレアーゼを使用したオリゴヌクレオチド駆動性増幅、プライマーが核酸配列にハイブリダイズし、得られた二重鎖が伸長反応および増幅の前に切断される増幅法、５’エキソヌクレアーゼ活性を欠如する核酸ポリメラーゼを使用した鎖置換増幅、ローリングサークル増幅、ならびに／または分岐伸長増幅（ＲＡＭ）が挙げられる。
一部の実施形態では、本明細書で開示される方法は、増幅されたアンプリコン（例えば、標的）に対してネステッドポリメラーゼ連鎖反応を実施することをさらに含む。アンプリコンは、二本鎖分子であってもよい。二本鎖分子は、二本鎖ＲＮＡ分子、二本鎖ＤＮＡ分子、またはＤＮＡ分子にハイブリダイズしたＲＮＡ分子を含むことができる。二本鎖分子の一方または両方の鎖は、試料タグまたは分子識別子標識を含んでいてもよい。あるいは、アンプリコンは、一本鎖分子であってもよい。一本鎖分子は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはそれらの組合せを含むことができる。本開示の核酸は、合成のまたは改変された核酸を含んでいてもよい。
一部の実施形態では、本方法は、標識化核酸を繰り返して増幅し、複数のアンプリコンを産生することを含む。本明細書で開示される方法は、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０回の増幅反応を実施することを含んでいてもよい。あるいは、本方法は、少なくとも約２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００回の増幅反応を実施することを含む。
増幅は、複数の核酸を含む１つまたは複数の試料に１つまたは複数の対照核酸を添加することをさらに含んでいてもよい。増幅は、複数の核酸に１つまたは複数の対照核酸を添加することをさらに含んでいてもよい。対照核酸は、対照標識を含んでいてもよい。
増幅は、１つまたは複数の非天然ヌクレオチドの使用を含んでいてもよい。非天然ヌクレオチドは、光不安定性および／または誘発性ヌクレオチドを含んでいてもよい。非天然ヌクレオチドの例としては、これらに限定されないが、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、モルホリノ、およびロックド核酸（ＬＮＡ）、ならびにグリコール核酸（ＧＮＡ）、およびトレオース核酸（ＴＮＡ）が挙げられる。非天然ヌクレオチドを、増幅反応の１つまたは複数のサイクルに添加してもよい。非天然ヌクレオチドの添加は、増幅反応の特定のサイクルまたは時点での産物を識別するために使用することができる。
１つまたは複数の増幅反応の実施は、１つまたは複数のプライマーの使用を含んでいてもよい。１つまたは複数のプライマーは、１つまたは複数のオリゴヌクレオチドを含んでいてもよい。１つまたは複数のオリゴヌクレオチドは、少なくとも約７～９個のヌクレオチドを含んでいてもよい。１つまたは複数のオリゴヌクレオチドは、１２～１５個未満のヌクレオチドを含んでいてもよい。１つまたは複数のプライマーは、複数の標識化核酸の少なくとも一部にアニーリングすることができる。１つまたは複数のプライマーは、複数の標識化核酸の３’末端および／または５’末端にアニーリングすることができる。１つまたは複数のプライマーは、複数の標識化核酸の内部領域にアニーリングすることができる。内部領域は、複数の標識化核酸の３’末端から少なくとも約５０、１００、１５０、２００、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、または１０００ヌクレオチドであってもよい。１つまたは複数のプライマーは、一定のパネルのプライマーを含んでいてもよい。１つまたは複数のプライマーは、少なくとも１つまたは複数の特注プライマーを含んでいてもよい。１つまたは複数のプライマーは、少なくとも１つまたは複数の対照プライマーを含んでいてもよい。１つまたは複数のプライマーは、少なくとも１つまたは複数のハウスキーピング遺伝子プライマーを含んでいてもよい。１つまたは複数のプライマーは、ユニバーサルプライマーを含んでいてもよい。ユニバーサルプライマーは、ユニバーサルプライマー結合部位にアニーリングすることができる。１つまたは複数の特注プライマーは、第１の試料タグ、第２の試料タグ、分子識別子標識、核酸、またはそれらの産物にアニーリングすることができる。１つまたは複数のプライマーは、ユニバーサルプライマーおよび特注プライマーを含んでいてもよい。特注プライマーは、１つまたは複数の標的核酸を増幅するように設計することができる。標的核酸は、１つまたは複数の試料中の全核酸のサブセットを含んでいてもよい。一部の実施形態では、プライマーは、本開示のアレイに付着されているプローブである。
一部の実施形態では、試料中の複数の標的のバーコーディング（例えば、確率論的バーコーディング）は、バーコード化標的（例えば、確率論的バーコード化標的）または標的のバーコード化断片のインデックス化ライブラリーを生成することをさらに含む。異なるバーコードのバーコード配列（例えば、異なる確率論的バーコードの分子標識）は、互いに異なっていてもよい。バーコード化標的のインデックス化ライブラリーの生成は、試料中の複数の標的から複数のインデックス化ポリヌクレオチドを生成することを含む。例えば、第１のインデックス化標的および第２のインデックス化標的を含むバーコード化標的のインデックス化ライブラリーの場合、第１のインデックス化ポリヌクレオチドの標識領域は、第２のインデックス化ポリヌクレオチドの標識領域と、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０個の、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０個の、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０個の、もしくは最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０個の、またはこうした値の任意の２つの間の数もしくは範囲のヌクレオチドが異なっていてもよい。一部の実施形態では、バーコード化標的のインデックス化ライブラリーの生成は、複数の標的、例えばｍＲＮＡ分子を、ポリ（Ｔ）領域および標識領域を含む複数のオリゴヌクレオチドと接触させること；ならびに逆転写酵素を使用して第一鎖合成を実施して、各々がｃＤＮＡ領域および標識領域を含む一本鎖標識化ｃＤＮＡ分子を産生することを含み、複数の標的は、異なる配列の少なくとも２つのｍＲＮＡ分子を含み、複数のオリゴヌクレオチドは、異なる配列の少なくとも２つのオリゴヌクレオチドを含む。バーコード化標的のインデックス化ライブラリーの生成は、一本鎖標識化ｃＤＮＡ分子を増幅して、二本鎖標識化ｃＤＮＡ分子を産生すること；および二本鎖標識化ｃＤＮＡ分子に対してネステッドＰＣＲを実施して、標識化アンプリコンを産生することをさらに含んでいてもよい。一部の実施形態では、本方法は、アダプター－標識化アンプリコンを生成することを含んでいてもよい。
バーコーディング（例えば、確率論的バーコーディング）は、核酸バーコードまたはタグを使用して、個々の核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）分子を標識することを含んでいてもよい。一部の実施形態では、バーコーディングは、ｃＤＮＡ分子がｍＲＮＡから生成される際に、ＤＮＡバーコードまたはタグをｃＤＮＡ分子に付加することを含む。ネステッドＰＣＲを実施して、ＰＣＲ増幅バイアスを最小限に抑えることができる。例えば、次世代配列決定（ＮＧＳ）を使用して配列決定するためのアダプターを付加することができる。配列決定の結果を使用して、細胞標識、分子標識、および標的の１つまたは複数のコピーのヌクレオチド断片の配列を、例えば、図２のブロック２３２にて決定することができる。
図３は、バーコード化ｍＲＮＡまたはそれらの断片などの、バーコード化標的（例えば、確率論的バーコード化標的）のインデックス化ライブラリーを生成するための非限定的で例示的なプロセスを示す概略図である。ステップ１に示されているように、逆転写プロセスでは、固有分子標識、細胞標識、およびユニバーサルＰＣＲ部位を有する各ｍＲＮＡ分子をコード化することができる。特に、１セットのバーコード（例えば、確率論的バーコード）３１０を、ＲＮＡ分子３０２のポリ（Ａ）テイル領域３０８にハイブリダイゼーション（例えば、確率論的ハイブリダイゼーション）させることによりＲＮＡ分子３０２を逆転写して、ｃＤＮＡ領域３０６を含む標識化ｃＤＮＡ分子３０４を産生することができる。バーコード３１０の各々は、標的結合性領域、例えばポリ（ｄＴ）領域３１２、標識領域３１４（例えば、バーコード配列または分子）、およびユニバーサルＰＣＲ領域３１６を含んでいてもよい。
一部の実施形態では、細胞標識は、３～２０個のヌクレオチドを含んでいてもよい。一部の実施形態では、分子標識は、３～２０個のヌクレオチドを含んでいてもよい。一部の実施形態では、複数の確率論的バーコードの各々は、ユニバーサル標識および細胞標識の１つまたは複数をさらに含み、ユニバーサル標識は、固体支持体上の複数の確率論的バーコードで同じであり、細胞標識は、固体支持体上の複数の確率論的バーコードで同じである。一部の実施形態では、ユニバーサル標識は、３～２０個のヌクレオチドを含んでいてもよい。一部の実施形態では、細胞標識は、３～２０個のヌクレオチドを含む。
一部の実施形態では、標識領域３１４は、バーコード配列または分子標識３１８および細胞標識３２０を含んでいてもよい。一部の実施形態では、標識領域３１４は、ユニバーサル標識、ディメンション標識、および細胞標識の１つまたは複数を含んでいてもよい。バーコード配列または分子標識３１８は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００ヌクレオチド長であってもよく、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００ヌクレオチド長であってもよく、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００ヌクレオチド長であってもよく、もしくは最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００ヌクレオチド長であってもよく、またはこうした値のいずれかの間の数もしくは範囲のヌクレオチド長であってもよい。細胞標識３２０は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００ヌクレオチド長であってもよく、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００ヌクレオチド長であってもよく、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００ヌクレオチド長であってもよく、もしくは最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００ヌクレオチド長であってもよく、またはこうした値のいずれかの間の数もしくは範囲のヌクレオチド長であってもよい。ユニバーサル標識は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００ヌクレオチド長であってもよく、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００ヌクレオチド長であってもよく、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００ヌクレオチド長であってもよく、もしくは最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００ヌクレオチド長であってもよく、またはこうした値のいずれかの間の数もしくは範囲のヌクレオチド長であってもよい。ユニバーサル標識は、固体支持体上の複数の確率論的バーコードで同じであってもよく、細胞標識は、固体支持体上の複数の確率論的バーコードで同じである。ディメンション標識は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００ヌクレオチド長であってもよく、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００ヌクレオチド長であってもよく、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００ヌクレオチド長であってもよく、もしくは最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００ヌクレオチド長であってもよく、またはこうした値のいずれかの間の数もしくは範囲のヌクレオチド長であってもよい。
一部の実施形態では、標識領域３１４は、バーコード配列または分子標識３１８および細胞標識３２０などの、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００個の異なる標識を含んでいてもよく、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００個の異なる標識を含んでいてもよく、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００個の異なる標識を含んでいてもよく、もしくは最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００個の異なる標識を含んでいてもよく、またはこうした値のいずれかの間の数もしくは範囲の異なる標識を含んでいてもよい。各標識は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００ヌクレオチド長であってもよく、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００ヌクレオチド長であってもよく、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００ヌクレオチド長であってもよく、もしくは最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００ヌクレオチド長であってもよく、またはこうした値の任意のいずれかの数もしくは範囲のヌクレオチド長であってもよい。１セットのバーコードまたは確率論的バーコード３１０は、１０、２０、４０、５０、７０、８０、９０、１０2、１０3、１０4、１０5、１０6、１０7、１０8、１０9、１０10、１０11、１０12、１０13、１０14、１０15、１０20個のバーコードもしくは確率論的バーコード３１０を含有していてもよく、約１０、２０、４０、５０、７０、８０、９０、１０2、１０3、１０4、１０5、１０6、１０7、１０8、１０9、１０10、１０11、１０12、１０13、１０14、１０15、１０20個のバーコードもしくは確率論的バーコード３１０を含有していてもよく、少なくとも１０、２０、４０、５０、７０、８０、９０、１０2、１０3、１０4、１０5、１０6、１０7、１０8、１０9、１０10、１０11、１０12、１０13、１０14、１０15、１０20個のバーコードもしくは確率論的バーコード３１０を含有していてもよく、または最大で１０、２０、４０、５０、７０、８０、９０、１０2、１０3、１０4、１０5、１０6、１０7、１０8、１０9、１０10、１０11、１０12、１０13、１０14、１０15、１０20個のバーコードもしくは確率論的バーコード３１０を含有していてもよく、あるいはこうした値のいずれかの間の数または範囲のバーコードまたは確率論的バーコード３１０を含有していてもよい。また、１セットのバーコードまたは確率論的バーコード３１０は、例えば、各々が固有標識領域３１４を含有していてもよい。過剰なバーコードまたは確率論的バーコード３１０を除去するために、標識化ｃＤＮＡ分子３０４を精製してもよい。精製は、Ａｍｐｕｒｅビーズ精製を含んでいてもよい。
ステップ２に示されているように、ステップ１の逆転写プロセスの産物を１つのチューブにプールし、第１のＰＣＲプライマープールおよび第１のユニバーサルＰＣＲプライマーを用いてＰＣＲ増幅してもよい。固有標識領域３１４があるため、プールすることが可能である。特に、標識化ｃＤＮＡ分子３０４を増幅して、ネステッドＰＣＲ標識化アンプリコン３２２を産生してもよい。増幅は、マルチプレックスＰＣＲ増幅を含んでいてもよい。増幅は、９６マルチプレックスプライマーを用いた単一反応容積でのマルチプレックスＰＣＲ増幅を含んでいてもよい。一部の実施形態では、マルチプレックスＰＣＲ増幅は、単一反応容積中にて、１０、２０、４０、５０、７０、８０、９０、１０2、１０3、１０4、１０5、１０6、１０7、１０8、１０9、１０10、１０11、１０12、１０13、１０14、１０15、１０20個のマルチプレックスプライマーを使用してもよく、約１０、２０、４０、５０、７０、８０、９０、１０2、１０3、１０4、１０5、１０6、１０7、１０8、１０9、１０10、１０11、１０12、１０13、１０14、１０15、１０20個のマルチプレックスプライマーを使用してもよく、少なくとも１０、２０、４０、５０、７０、８０、９０、１０2、１０3、１０4、１０5、１０6、１０7、１０8、１０9、１０10、１０11、１０12、１０13、１０14、１０15、１０20個のマルチプレックスプライマーを使用してもよく、もしくは最大で１０、２０、４０、５０、７０、８０、９０、１０2、１０3、１０4、１０5、１０6、１０7、１０8、１０9、１０10、１０11、１０12、１０13、１０14、１０15、１０20個のマルチプレックスプライマーを使用してもよく、またはこうした値のいずれかの間の数もしくは範囲のマルチプレックスプライマーを使用してもよい。増幅は、特定の遺伝子を標的とする特注プライマー３２６Ａ～Ｃおよびユニバーサルプライマー３２８を含む第１のＰＣＲプライマープール３２４を使用することを含んでいてもよい。特注プライマー３２６は、標識化ｃＤＮＡ分子３０４のｃＤＮＡ部分３０６’内の領域にハイブリダイズすることができる。ユニバーサルプライマー３２８は、標識化ｃＤＮＡ分子３０４のユニバーサルＰＣＲ領域３１６にハイブリダイズすることができる。
図３のステップ３に示されているように、ステップ２のＰＣＲ増幅の産物を、ネステッドＰＣＲプライマープールおよび第２のユニバーサルＰＣＲプライマーを用いて増幅してもよい。ネステッドＰＣＲは、ＰＣＲ増幅バイアスを最小限に抑えることができる。特に、ネステッドＰＣＲ標識アンプリコン３２２を、ネステッドＰＣＲによりさらに増幅してもよい。ネステッドＰＣＲは、ネステッドＰＣＲプライマー３３２ａ～ｃのネステッドＰＣＲプライマープール３３０および第２ユニバーサルＰＣＲプライマー３２８’を用いた単一反応容積でのマルチプレックスＰＣＲを含んでいてもよい。ネステッドＰＣＲプライマープール３２８は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００個の異なるネステッドＰＣＲプライマー３３０を含有していてもよく、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００個の異なるネステッドＰＣＲプライマー３３０を含有していてもよく、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００個の異なるネステッドＰＣＲプライマー３３０を含有していてもよく、もしくは最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００個の異なるネステッドＰＣＲプライマー３３０を含有していてもよく、またはこうした値のいずれかの間の数もしくは範囲の異なるネステッドＰＣＲプライマー３３０を含有していてもよい。ネステッドＰＣＲプライマー３３２は、アダプター３３４を含有し、標識化アンプリコン３２２のｃＤＮＡ部分３０６’’内の領域にハイブリダイズすることができる。ユニバーサルプライマー３２８’は、アダプター３３６を含有し、標識化アンプリコン３２２のユニバーサルＰＣＲ領域３１６にハイブリダイズすることができる。したがって、ステップ３では、アダプター－標識化アンプリコン３３８が産生される。一部の実施形態では、ネステッドＰＣＲプライマー３３２および第２のユニバーサルＰＣＲプライマー３２８’は、アダプター３３４および３３６を含有していなくともよい。代わりに、アダプター３３４および３３６をネステッドＰＣＲの産物にライゲートさせて、アダプター－標識化アンプリコン３３８を産生してもよい。
ステップ４に示されているように、ライブラリー増幅プライマーを使用して、ステップ３のＰＣＲ産物を、配列決定のためにＰＣＲ増幅してもよい。特に、アダプター３３４および３３６を使用して、アダプター－標識化アンプリコン３３８に対して１つまたは複数の追加のアッセイを実施してもよい。アダプター３３４および３３６は、プライマー３４０および３４２にハイブリダイズすることができる。１つまたは複数のプライマー３４０および３４２は、ＰＣＲ増幅プライマーであってもよい。１つまたは複数のプライマー３４０および３４２は、配列決定プライマーであってもよい。１つまたは複数のアダプター３３４および３３６は、アダプター－標識化アンプリコン３３８のさらなる増幅に使用してもよい。１つまたは複数のアダプター３３４および３３６は、アダプター－標識化アンプリコン３３８の配列決定に使用してもよい。プライマー３４２は、同じセットのバーコードまたは確率論的バーコード３１０を使用して生成されたアンプリコンを、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）を使用して１つの配列決定反応で配列決定することができるように、プレートインデックス３４４を含有していてもよい。
オリゴヌクレオチドが付随している細胞成分結合性試薬を含む組成物
本明細書で開示される一部の実施形態は、オリゴヌクレオチドがコンジュゲートされている細胞成分結合性試薬（タンパク質結合性試薬など）を各々が含む複数の組成物であって、オリゴヌクレオチドは、それがコンジュゲートされている細胞成分結合性試薬の固有識別子を含む組成物を提供する。細胞成分結合性試薬（バーコード化抗体など）およびそれらの使用（細胞の試料インデックス付与など）は、米国特許出願公開第２０１８／００８８１１２号明細書および米国特許出願第１５／９３７，７１３号明細書に記載されている。これらの各々の内容は、参照によりその全体が組み込まれる。
一部の実施形態では、細胞成分結合性試薬は、細胞成分標的に特異的に結合することが可能である。例えば、細胞成分結合性試薬の結合標的は、炭水化物、脂質、タンパク質、細胞外タンパク質、細胞表面タンパク質、細胞マーカー、Ｂ細胞受容体、Ｔ細胞受容体、主要組織適合遺伝子複合体、腫瘍抗原、受容体、インテグリン、細胞内タンパク質、またはそれらの任意の組合せであってもよくまたは含んでいてもよい。一部の実施形態では、細胞成分結合性試薬（例えば、タンパク質結合性試薬）は、抗原標的またはタンパク質標的に特異的に結合することが可能である。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドの各々は、確率論的バーコードなどのバーコードを含んでいてもよい。バーコードは、バーコード配列（例えば、分子標識）、細胞標識、試料標識、またはそれらの任意の組合せを含んでいてもよい。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドの各々は、リンカーを含んでいてもよい。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドの各々は、ポリ（Ａ）テイルなど、オリゴヌクレオチドプローブに対する結合部位を含んでいてもよい。例えば、ポリ（Ａ）テイルは、例えば、固体支持体に繋留されていなくともよく、または固体支持体に繋留されていてもよい。ポリ（Ａ）テイルは、約１０～５０ヌクレオチド長、例えば、１８ヌクレオチド長であってもよい。オリゴヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、または両方を含んでいてもよい。
固有識別子は、例えば、任意の好適な長さ、例えば、約４ヌクレオチド長～約２００ヌクレオチド長、または２５ヌクレオチド長～約４５ヌクレオチド長を有するヌクレオチド配列であってもよい。一部の実施形態では、固有識別子は、４ヌクレオチド、５ヌクレオチド、６ヌクレオチド、７ヌクレオチド、８ヌクレオチド、９ヌクレオチド、１０ヌクレオチド、１５ヌクレオチド、２０ヌクレオチド、２５ヌクレオチド、３０ヌクレオチド、３５ヌクレオチド、４０ヌクレオチド、４５ヌクレオチド、５０ヌクレオチド、５５ヌクレオチド、６０ヌクレオチド、７０ヌクレオチド、８０ヌクレオチド、９０ヌクレオチド、１００ヌクレオチド、２００ヌクレオチドの長さ、約４ヌクレオチド、５ヌクレオチド、６ヌクレオチド、７ヌクレオチド、８ヌクレオチド、９ヌクレオチド、１０ヌクレオチド、１５ヌクレオチド、２０ヌクレオチド、２５ヌクレオチド、３０ヌクレオチド、３５ヌクレオチド、４０ヌクレオチド、４５ヌクレオチド、５０ヌクレオチド、５５ヌクレオチド、６０ヌクレオチド、７０ヌクレオチド、８０ヌクレオチド、９０ヌクレオチド、１００ヌクレオチド、２００ヌクレオチドの長さ、４ヌクレオチド、５ヌクレオチド、６ヌクレオチド、７ヌクレオチド、８ヌクレオチド、９ヌクレオチド、１０ヌクレオチド、１５ヌクレオチド、２０ヌクレオチド、２５ヌクレオチド、３０ヌクレオチド、３５ヌクレオチド、４０ヌクレオチド、４５ヌクレオチド、５０ヌクレオチド、５５ヌクレオチド、６０ヌクレオチド、７０ヌクレオチド、８０ヌクレオチド、９０ヌクレオチド、１００ヌクレオチド、２００ヌクレオチド未満の長さ、もしくは４ヌクレオチド、５ヌクレオチド、６ヌクレオチド、７ヌクレオチド、８ヌクレオチド、９ヌクレオチド、１０ヌクレオチド、１５ヌクレオチド、２０ヌクレオチド、２５ヌクレオチド、３０ヌクレオチド、３５ヌクレオチド、４０ヌクレオチド、４５ヌクレオチド、５０ヌクレオチド、５５ヌクレオチド、６０ヌクレオチド、７０ヌクレオチド、８０ヌクレオチド、９０ヌクレオチド、１００ヌクレオチド、２００ヌクレオチドよりも大きな長さ、または上記の値の任意の２つの間である範囲である長さを有してもよい。
一部の実施形態では、固有識別子は、多様なセットの固有識別子から選択される。多様なセットの固有識別子は、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、５０００個の異なる固有識別子を含んでいてもよく、もしくは約２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、５０００個の異なる固有識別子を含んでいてもよく、またはこうした値の任意の２つの間の数もしくは範囲の異なる固有識別子を含んでいてもよい。多様なセットの固有識別子は、少なくとも２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、もしくは５０００個の異なる固有識別子を含んでいてもよく、または最大で２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、もしくは５０００個の異なる固有識別子を含んでいてもよい。一部の実施形態では、１セットの固有識別子は、分析しようとする試料のＤＮＡまたはＲＮＡ配列に対して最小限の配列相同性を有するように設計されている。一部の実施形態では、１セットの固有識別子の配列は、互いにまたはそれらの相補体と、１ヌクレオチド、２ヌクレオチド、３ヌクレオチド、４ヌクレオチド、５ヌクレオチド、６ヌクレオチド、７ヌクレオチド、８ヌクレオチド、９ヌクレオチド、１０ヌクレオチドだけ異なるか、もしくは約１ヌクレオチド、２ヌクレオチド、３ヌクレオチド、４ヌクレオチド、５ヌクレオチド、６ヌクレオチド、７ヌクレオチド、８ヌクレオチド、９ヌクレオチド、１０ヌクレオチドだけ異なるか、またはこうした値の任意の２つの間の数もしくは範囲だけ異なる。一部の実施形態では、１セットの固有識別子の配列は、互いにまたはそれらの相補体と、少なくとも１ヌクレオチド、２ヌクレオチド、３ヌクレオチド、４ヌクレオチド、５ヌクレオチド、６ヌクレオチド、７ヌクレオチド、８ヌクレオチド、９ヌクレオチド、１０ヌクレオチドだけ異なるか、または最大で１ヌクレオチド、２ヌクレオチド、３ヌクレオチド、４ヌクレオチド、５ヌクレオチド、６ヌクレオチド、７ヌクレオチド、８ヌクレオチド、９ヌクレオチド、１０ヌクレオチドだけ異なる。一部の実施形態では、１セットの固有識別子の配列は、互いにまたはそれらの相補体と、少なくとも３％、少なくとも５％、少なくとも８％、少なくとも１０％、少なくとも１５％。少なくとも２０％、またはそれよりも多くが異なる。
一部の実施形態では、固有識別子は、ユニバーサルプライマーなどのプライマーに対する結合部位を含んでいてもよい。一部の実施形態では、固有識別子は、ユニバーサルプライマーなどのプライマーに対する少なくとも２つの結合部位を含んでいてもよい。一部の実施形態では、固有識別子は、ユニバーサルプライマーなどのプライマーに対する少なくとも３つの結合部位を含んでいてもよい。プライマーは、例えば、ＰＣＲ増幅による固有識別子の増幅に使用することができる。一部の実施形態では、プライマーは、ネステッドＰＣＲ反応に使用することができる。
本開示では、タンパク質結合性試薬、抗体もしくはそれらの断片、アプタマー、小分子、リガンド、ペプチド、オリゴヌクレオチドなど、またはそれらの任意の組合せなど、任意の好適な細胞成分結合性試薬が企図されている。一部の実施形態では、細胞成分結合性試薬は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、組換え抗体、単鎖抗体（ｓｃ－Ａｂ）、またはＦａｂ、Ｆｖなどのそれらの断片であってもよい。一部の実施形態では、複数の細胞成分結合性試薬は、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、５０００個の異なる細胞成分試薬を含んでいてもよく、もしくは約２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、５０００個の細胞成分試薬を含んでいてもよく、またはこうした値の任意の２つの間の数もしくは範囲の異なる細胞成分試薬を含んでいてもよい。一部の実施形態では、複数の細胞成分結合性試薬は、少なくとも２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、もしくは５０００個の異なる細胞成分試薬を含んでいてもよく、または最大で２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、もしくは５０００個の異なる細胞成分試薬を含んでいてもよい。
オリゴヌクレオチドは、種々の機序により細胞成分結合性試薬にコンジュゲートされていてもよい。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、細胞成分結合性試薬に共有結合でコンジュゲートされていてもよい。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、細胞成分結合性試薬に非共有結合でコンジュゲートされていてもよい。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、リンカーを介して細胞成分結合性試薬にコンジュゲートされている。リンカーは、例えば、細胞成分結合性試薬および／またはオリゴヌクレオチドから切断可能または脱離可能であってもよい。一部の実施形態では、リンカーは、オリゴヌクレオチドを細胞成分結合性試薬に可逆的に付着させる化学基を含んでいてもよい。化学基は、例えば、アミン基を介してリンカーにコンジュゲートされていてもよい。一部の実施形態では、リンカーは、細胞成分結合性試薬にコンジュゲートされている別の化学基と安定的な結合を形成する化学基を含んでいてもよい。例えば、化学基は、ＵＶ光切断可能基、ジスルフィド結合、ストレプトアビジン、ビオチン、アミンなどであってもよい。一部の実施形態では、化学基は、リシンなどのアミノ酸の一級アミンまたはＮ末端を介して細胞成分結合性試薬にコンジュゲートされていてもよい。Ｐｒｏｔｅｉｎ－Ｏｌｉｇｏコンジュゲーションキット（Ｓｏｌｕｌｉｎｋ，Ｉｎｃ．、サンディエゴ、カリフォルニア州）、Ｔｈｕｎｄｅｒ－Ｌｉｎｋ（登録商標）オリゴコンジュゲーション系（Ｉｎｎｏｖａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ケンブリッジ、英国）などの市販のコンジュゲーションキットを使用して、オリゴヌクレオチドを細胞成分結合性試薬にコンジュゲートすることができる。
オリゴヌクレオチドは、細胞成分結合性試薬とその細胞成分標的との間の特異的結合を妨害しない限り、細胞成分結合性試薬（例えば、タンパク質結合性試薬）の任意の好適な部位にコンジュゲートすることができる。一部の実施形態では、細胞成分結合性試薬は、抗体などのタンパク質である。一部の実施形態では、細胞成分結合性試薬は、抗体ではない。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、抗体の抗原結合部位以外の任意の場所に、例えば、Ｆｃ領域、ＣH１ドメイン、ＣH２ドメイン、ＣH３ドメイン、ＣLドメインなどにコンジュゲートすることができる。オリゴヌクレオチドを細胞成分結合性試薬（例えば、抗体）にコンジュゲートするための方法は、以前に、例えば米国特許第６，５３１，２８３号明細書に開示されている。この内容は、参照によりその全体が本明細書に明示的に組み込まれる。細胞成分結合性試薬に対するオリゴヌクレオチドの化学量論は様々であってもよい。配列決定において細胞成分結合性試薬特異的オリゴヌクレオチドを検出するための感度を増加させるために、コンジュゲーション中の、オリゴヌクレオチドの細胞成分結合性試薬に対する比を増加させることが有利であり得る。一部の実施形態では、各細胞成分結合性試薬には、単一オリゴヌクレオチド分子がコンジュゲートされていてもよい。一部の実施形態では、各細胞成分結合性試薬は、１つよりも多くのオリゴヌクレオチド分子に、例えば、少なくとも２、３、４、５、１０、２０、３０、４０、５０、１００、１０００個のオリゴヌクレオチド分子に、もしくは最大で２、３、４、５、１０、２０、３０、４０、５０、１００、１０００個のオリゴヌクレオチド分子に、またはそうした値の任意の２つの間の数もしくは範囲のオリゴヌクレオチド分子にコンジュゲートされていてもよく、オリゴヌクレオチド分子の各々は、同じまたは異なる固有識別子を含む。一部の実施形態では、各細胞成分結合性試薬は、１つよりも多くのオリゴヌクレオチド分子に、例えば、少なくとも２、３、４、５、１０、２０、３０、４０、５０、１００、１０００個のオリゴヌクレオチド分子に、または最大で２、３、４、５、１０、２０、３０、４０、５０、１００、１０００個のオリゴヌクレオチド分子にコンジュゲートされていてもよく、オリゴヌクレオチド分子の各々は、同じまたは異なる固有識別子を含む。
一部の実施形態では、複数の細胞成分結合性試薬は、単一細胞、複数の細胞、組織試料、腫瘍試料、または血液試料などの試料中の複数の細胞成分標的に特異的に結合することが可能である。一部の実施形態では、複数の細胞成分標的は、細胞表面タンパク質、細胞マーカー、Ｂ細胞受容体、Ｔ細胞受容体、抗体、主要組織適合遺伝子複合体、腫瘍抗原、受容体、またはそれらの任意の組合せを含む。一部の実施形態では、複数の細胞成分標的は、細胞内細胞成分を含んでいてもよい。一部の実施形態では、複数の細胞成分標的は、細胞内細胞成分を含んでいてもよい。一部の実施形態では、複数の細胞成分は、細胞または生物中の全細胞成分（例えば、タンパク質）の１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、もしくは約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、またはこうした値の任意の２つの間の数値もしくは範囲であってもよい。一部の実施形態では、複数の細胞成分は、細胞または生物中の全細胞成分（例えば、タンパク質）の少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、もしくは９９％であってもよく、または最大で１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、もしくは９９％であってもよい。一部の実施形態では、複数の細胞成分標的は、２、３、４、５、１０、２０、３０、４０、５０、１００、１０００、１００００個の異なる細胞成分標的を含んでいてもよく、もしくは約２、３、４、５、１０、２０、３０、４０、５０、１００、１０００、１００００個の異なる細胞成分標的を含んでいてもよく、またはこうした値の任意の２つの間の数もしくは範囲の異なる細胞成分標的を含んでいてもよい。一部の実施形態では、複数の細胞成分標的は、少なくとも２、３、４、５、１０、２０、３０、４０、５０、１００、１０００、１００００個の異なる細胞成分標的を含んでいてもよく、または最大で２、３、４、５、１０、２０、３０、４０、５０、１００、１０００、１００００個の異なる細胞成分標的を含んでいてもよい。
図４は、抗体の固有識別子配列を含むオリゴヌクレオチドがコンジュゲートされている例示的な細胞成分結合性試薬、例えば、抗体の概略図を示す。細胞成分結合性試薬にコンジュゲートされているオリゴヌクレオチド、細胞成分結合性試薬にコンジュゲーションさせるためのオリゴヌクレオチド、または細胞成分結合性試薬に以前にコンジュゲートされていたオリゴヌクレオチドを、本明細書では、抗体オリゴヌクレオチドと呼ぶ（結合性試薬オリゴヌクレオチドと略記する）ことができる。抗体にコンジュゲートされているオリゴヌクレオチド、抗体にコンジュゲーションさせるためのオリゴヌクレオチド、または抗体に以前にコンジュゲートされていたオリゴヌクレオチドを、本明細書では、抗体オリゴヌクレオチドと呼ぶ（「ＡｂＯｌｉｇｏ」または「ＡｂＯ」と略記する）ことができる。また、オリゴヌクレオチドは、これらに限定されないが、１つまたは複数のリンカー、抗体の１つまたは複数の固有識別子、任意に１つまたは複数のバーコード配列（例えば、分子標識）、およびポリ（Ａ）テイルを含む、追加の成分を含んでいてもよい。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、５’から３’へと、リンカー、固有識別子、バーコード配列（例えば、分子標識）、およびポリ（Ａ）テイルを含んでいてもよい。抗体オリゴヌクレオチドは、ｍＲＮＡ模倣物であってもよい。
図５は、抗体の固有識別子配列を含むオリゴヌクレオチドがコンジュゲートされている例示的な細胞成分結合性試薬、例えば、抗体の概略図を示す。細胞成分結合性試薬は、抗原標的またはタンパク質標的などの少なくとも１つの細胞成分標的に特異的に結合することが可能であってもよい。結合性試薬オリゴヌクレオチド（例えば、試料インデックス付与オリゴヌクレオチド、または抗体オリゴヌクレオチド）は、本開示の方法を実施するための配列（例えば、試料インデックス付与配列）を含んでいてもよい。例えば、試料インデックス付与オリゴヌクレオチドは、試料の１つまたは複数の細胞の試料起源を識別するための試料インデックス付与配列を含んでいてもよい。細胞成分結合性試薬を含む複数の組成物の２つの細胞成分結合性試薬を含む少なくとも２つの組成物（例えば、試料インデックス付与組成物）のインデックス付与配列（例えば、試料インデックス付与配列）は、異なる配列を含んでいてもよい。一部の実施形態では、結合性試薬オリゴヌクレオチドは、種のゲノム配列と相同性ではない。結合性試薬オリゴヌクレオチドは、細胞成分結合性試薬から脱離可能または脱離不能であるように構成されていてもよい。
細胞成分結合性試薬にコンジュゲートされているオリゴヌクレオチドは、例えば、バーコード配列（例えば、分子標識配列）、ポリ（Ａ）テイル、またはそれらの組合せを含んでいてもよい。細胞成分結合性試薬にコンジュゲートされているオリゴヌクレオチドは、ｍＲＮＡ模倣物であってもよい。一部の実施形態では、試料インデックス付与オリゴヌクレオチドは、複数のバーコードのうちの少なくとも１つのバーコードの捕捉配列に相補的な配列を含む。バーコードの標的結合性領域は、捕捉配列を含んでいてもよい。標的結合性領域は、例えば、ポリ（ｄＴ）領域を含んでいてもよい。一部の実施形態では、バーコードの捕捉配列に相補的な試料インデックス付与オリゴヌクレオチドの配列は、ポリ（Ａ）テイルを含んでいてもよい。試料インデックス付与オリゴヌクレオチドは、分子標識を含んでいてもよい。
一部の実施形態では、結合性試薬オリゴヌクレオチド（例えば、試料オリゴヌクレオチド）は、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１２８、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００、６１０、６２０、６３０、６４０、６５０、６６０、６７０、６８０、６９０、７００、７１０、７２０、７３０、７４０、７５０、７６０、７７０、７８０、７９０、８００、８１０、８２０、８３０、８４０、８５０、８６０、８７０、８８０、８９０、９００、９１０、９２０、９３０、９４０、９５０、９６０、９７０、９８０、９９０、１０００ヌクレオチド長のヌクレオチド配列、もしくは約６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１２８、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００、６１０、６２０、６３０、６４０、６５０、６６０、６７０、６８０、６９０、７００、７１０、７２０、７３０、７４０、７５０、７６０、７７０、７８０、７９０、８００、８１０、８２０、８３０、８４０、８５０、８６０、８７０、８８０、８９０、９００、９１０、９２０、９３０、９４０、９５０、９６０、９７０、９８０、９９０、１０００ヌクレオチド長のヌクレオチド配列、またはこうした値の任意の２つの間の数もしくは範囲のヌクレオチド長のヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、結合性試薬オリゴヌクレオチドは、少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１２８、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００、６１０、６２０、６３０、６４０、６５０、６６０、６７０、６８０、６９０、７００、７１０、７２０、７３０、７４０、７５０、７６０、７７０、７８０、７９０、８００、８１０、８２０、８３０、８４０、８５０、８６０、８７０、８８０、８９０、９００、９１０、９２０、９３０、９４０、９５０、９６０、９７０、９８０、９９０、もしくは１０００ヌクレオチド長の、または最大で６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１２８、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００、６１０、６２０、６３０、６４０、６５０、６６０、６７０、６８０、６９０、７００、７１０、７２０、７３０、７４０、７５０、７６０、７７０、７８０、７９０、８００、８１０、８２０、８３０、８４０、８５０、８６０、８７０、８８０、８９０、９００、９１０、９２０、９３０、９４０、９５０、９６０、９７０、９８０、９９０、もしくは１０００ヌクレオチド長のヌクレオチド配列を含む。
一部の実施形態では、細胞成分結合性試薬は、抗体、テトラマー、アプタマー、タンパク質スキャフォールド、またはそれらの組合せを含む。結合性試薬オリゴヌクレオチドは、例えば、リンカーを介して細胞成分結合性試薬にコンジュゲートされていてもよい。結合性試薬オリゴヌクレオチドは、リンカーを含んでいてもよい。リンカーは、化学基を含んでいてもよい。化学基は、細胞成分結合性試薬の分子に可逆的にまたは不可逆的に付着されていてもよい。化学基は、ＵＶ光切断可能基、ジスルフィド結合、ストレプトアビジン、ビオチン、アミン、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択することができる。
一部の実施形態では、細胞成分結合性試薬は、ＡＤＡＭ１０、ＣＤ１５６ｃ、ＡＮＯ６、ＡＴＰ１Ｂ２、ＡＴＰ１Ｂ３、ＢＳＧ、ＣＤ１４７、ＣＤ１０９、ＣＤ２３０、ＣＤ２９、ＣＤ２９８、ＡＴＰ１Ｂ３、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４７、ＣＤ５１、ＣＤ５９、ＣＤ６３、ＣＤ９７、ＣＤ９８、ＳＬＣ３Ａ２、ＣＬＤＮＤ１、ＨＬＡ－ＡＢＣ、ＩＣＡＭ１、ＩＴＦＧ３、ＭＰＺＬ１、ＮＡ Ｋ ＡＴＰａｓｅアルファ１、ＡＴＰ１Ａ１、ＮＰＴＮ、ＰＭＣＡ ＡＴＰａｓｅ、ＡＴＰ２Ｂ１、ＳＬＣ１Ａ５、ＳＬＣ２９Ａ１、ＳＬＣ２Ａ１、ＳＬＣ４４Ａ２、またはそれらの任意の組合せに結合することができる。
一部の実施形態では、タンパク質標的は、細胞外タンパク質、細胞内タンパク質、またはそれらの任意の組合せであるかまたは含む。一部の実施形態では、抗原またはタンパク質標的は、細胞表面タンパク質、細胞マーカー、Ｂ細胞受容体、Ｔ細胞受容体、主要組織適合遺伝子複合体、腫瘍抗原、受容体、インテグリン、またはそれらの任意の組合せであるかまたは含む。抗原またはタンパク質標的は、脂質、炭水化物、またはそれらの任意の組合せであってもよくまたは含んでいてもよい。タンパク質標的は、少なからぬタンパク質標的を含む群から選択することができる。抗原標的またはタンパク質標的の数は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１００００、もしくは約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１００００、またはこうした値の任意の２つの間の数もしくは範囲であってもよい。タンパク質標的の数は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、もしくは１００００であってもよく、または最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、もしくは１００００であってもよい。
細胞成分結合性試薬（例えば、タンパク質結合性試薬）には、同一の配列を有する２つまたはそれよりも多くの結合性試薬オリゴヌクレオチド（例えば、試料インデックス付与オリゴヌクレオチド）が付随していてもよい。細胞成分結合性試薬には、異なる配列を有する２つまたはそれよりも多くの結合性試薬オリゴヌクレオチドが付随していてもよい。細胞成分結合性試薬に付随している結合性試薬オリゴヌクレオチドの数は、インプリメンテーションが異なれば異なっていてもよい。一部の実施形態では、結合性試薬オリゴヌクレオチドの数は、同一配列を有するかまたは異なる配列を有するかに関わらず、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、もしくは約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、またはこうした値の任意の２つの間の数もしくは範囲であってもよい。一部の実施形態では、結合性試薬オリゴヌクレオチドの数は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、もしくは１０００であってもよく、または最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、もしくは１０００であってもよい。
細胞成分結合性試薬を含む複数の組成物（例えば、複数の試料インデックス付与組成物）は、結合性試薬オリゴヌクレオチド（試料インデックス付与オリゴヌクレオチドなど）にコンジュゲートされていない、本明細書では、結合性試薬オリゴヌクレオチドを含まない細胞成分結合性試薬（試料インデックス付与オリゴヌクレオチドを含まない細胞成分結合性試薬など）とも呼ばれる１つまたは複数の追加の細胞成分結合性試薬を含んでいてもよい。複数の組成物中の追加の細胞成分結合性試薬の数は、インプリメンテーションが異なれば異なっていてもよい。一部の実施形態では、追加の細胞成分結合性試薬の数は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、もしくは約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、またはこうした値の任意の２つの間の数もしくは範囲であってもよい。一部の実施形態では、追加の細胞成分結合性試薬の数は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、もしくは１００であってもよく、または最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、もしくは１００であってもよい。一部の実施形態では、細胞成分結合性試薬およびいずれかの追加の細胞成分結合性試薬は同一であってもよい。
一部の実施形態では、１つまたは複数の結合性試薬オリゴヌクレオチド（例えば、試料インデックス付与オリゴヌクレオチド）がコンジュゲートされている細胞成分結合性試薬、および結合性試薬オリゴヌクレオチドがコンジュゲートされていない細胞成分結合性試薬を含む混合物が提供される。この混合物を、本明細書で開示される方法の一部の実施形態にて、例えば、試料および／または細胞との接触に使用することができる。（１）結合性試薬オリゴヌクレオチドがコンジュゲートされている細胞成分結合性試薬の数および（２）結合性試薬オリゴヌクレオチド（例えば、試料インデックス付与オリゴヌクレオチド）または混合物中の他の結合性試薬オリゴヌクレオチドがコンジュゲートされていない別の細胞成分結合性試薬（例えば、同じ細胞成分結合性試薬）の数の比は、インプリメンテーションが異なれば異なっていてもよい。一部の実施形態では、この比は、１：１、１：１．１、１：１．２、１：１．３、１：１．４、１：１．５、１：１．６、１：１．７、１：１．８、１：１．９、１：２、１：２．５、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、１：１０、１：１１、１：１２、１：１３、１：１４、１：１５、１：１６、１：１７、１：１８、１：１９、１：２０、１：２１、１：２２、１：２３、１：２４、１：２５、１：２６、１：２７、１：２８、１：２９、１：３０、１：３１、１：３２、１：３３、１：３４、１：３５、１：３６、１：３７、１：３８、１：３９、１：４０、１：４１、１：４２、１：４３、１：４４、１：４５、１：４６、１：４７、１：４８、１：４９、１：５０、１：５１、１：５２、１：５３、１：５４、１：５５、１：５６、１：５７、１：５８、１：５９、１：６０、１：６１、１：６２、１：６３、１：６４、１：６５、１：６６、１：６７、１：６８、１：６９、１：７０、１：７１、１：７２、１：７３、１：７４、１：７５、１：７６、１：７７、１：７８、１：７９、１：８０、１：８１、１：８２、１：８３、１：８４、１：８５、１：８６、１：８７、１：８８、１：８９、１：９０、１：９１、１：９２、１：９３、１：９４、１：９５、１：９６、１：９７、１：９８、１：９９、１：１００、１：２００、１：３００、１：４００、１：５００、１：６００、１：７００、１：８００、１：９００、１：１０００、１：２０００、１：３０００、１：４０００、１：５０００、１：６０００、１：７０００、１：８０００、１：９０００、１：１００００、もしくは約１：１、１：１．１、１：１．２、１：１．３、１：１．４、１：１．５、１：１．６、１：１．７、１：１．８、１：１．９、１：２、１：２．５、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、１：１０、１：１１、１：１２、１：１３、１：１４、１：１５、１：１６、１：１７、１：１８、１：１９、１：２０、１：２１、１：２２、１：２３、１：２４、１：２５、１：２６、１：２７、１：２８、１：２９、１：３０、１：３１、１：３２、１：３３、１：３４、１：３５、１：３６、１：３７、１：３８、１：３９、１：４０、１：４１、１：４２、１：４３、１：４４、１：４５、１：４６、１：４７、１：４８、１：４９、１：５０、１：５１、１：５２、１：５３、１：５４、１：５５、１：５６、１：５７、１：５８、１：５９、１：６０、１：６１、１：６２、１：６３、１：６４、１：６５、１：６６、１：６７、１：６８、１：６９、１：７０、１：７１、１：７２、１：７３、１：７４、１：７５、１：７６、１：７７、１：７８、１：７９、１：８０、１：８１、１：８２、１：８３、１：８４、１：８５、１：８６、１：８７、１：８８、１：８９、１：９０、１：９１、１：９２、１：９３、１：９４、１：９５、１：９６、１：９７、１：９８、１：９９、１：１００、１：２００、１：３００、１：４００、１：５００、１：６００、１：７００、１：８００、１：９００、１：１０００、１：２０００、１：３０００、１：４０００、１：５０００、１：６０００、１：７０００、１：８０００、１：９０００、１：１００００、または上記の値の任意の２つの間の数値もしくは範囲であってもよい。一部の実施形態では、この比は、少なくとも１：１、１：１．１、１：１．２、１：１．３、１：１．４、１：１．５、１：１．６、１：１．７、１：１．８、１：１．９、１：２、１：２．５、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、１：１０、１：１１、１：１２、１：１３、１：１４、１：１５、１：１６、１：１７、１：１８、１：１９、１：２０、１：２１、１：２２、１：２３、１：２４、１：２５、１：２６、１：２７、１：２８、１：２９、１：３０、１：３１、１：３２、１：３３、１：３４、１：３５、１：３６、１：３７、１：３８、１：３９、１：４０、１：４１、１：４２、１：４３、１：４４、１：４５、１：４６、１：４７、１：４８、１：４９、１：５０、１：５１、１：５２、１：５３、１：５４、１：５５、１：５６、１：５７、１：５８、１：５９、１：６０、１：６１、１：６２、１：６３、１：６４、１：６５、１：６６、１：６７、１：６８、１：６９、１：７０、１：７１、１：７２、１：７３、１：７４、１：７５、１：７６、１：７７、１：７８、１：７９、１：８０、１：８１、１：８２、１：８３、１：８４、１：８５、１：８６、１：８７、１：８８、１：８９、１：９０、１：９１、１：９２、１：９３、１：９４、１：９５、１：９６、１：９７、１：９８、１：９９、１：１００、１：２００、１：３００、１：４００、１：５００、１：６００、１：７００、１：８００、１：９００、１：１０００、１：２０００、１：３０００、１：４０００、１：５０００、１：６０００、１：７０００、１：８０００、１：９０００、もしくは１：１００００であってもよく、または最大で１：１、１：１．１、１：１．２、１：１．３、１：１．４、１：１．５、１：１．６、１：１．７、１：１．８、１：１．９、１：２、１：２．５、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、１：１０、１：１１、１：１２、１：１３、１：１４、１：１５、１：１６、１：１７、１：１８、１：１９、１：２０、１：２１、１：２２、１：２３、１：２４、１：２５、１：２６、１：２７、１：２８、１：２９、１：３０、１：３１、１：３２、１：３３、１：３４、１：３５、１：３６、１：３７、１：３８、１：３９、１：４０、１：４１、１：４２、１：４３、１：４４、１：４５、１：４６、１：４７、１：４８、１：４９、１：５０、１：５１、１：５２、１：５３、１：５４、１：５５、１：５６、１：５７、１：５８、１：５９、１：６０、１：６１、１：６２、１：６３、１：６４、１：６５、１：６６、１：６７、１：６８、１：６９、１：７０、１：７１、１：７２、１：７３、１：７４、１：７５、１：７６、１：７７、１：７８、１：７９、１：８０、１：８１、１：８２、１：８３、１：８４、１：８５、１：８６、１：８７、１：８８、１：８９、１：９０、１：９１、１：９２、１：９３、１：９４、１：９５、１：９６、１：９７、１：９８、１：９９、１：１００、１：２００、１：３００、１：４００、１：５００、１：６００、１：７００、１：８００、１：９００、１：１０００、１：２０００、１：３０００、１：４０００、１：５０００、１：６０００、１：７０００、１：８０００、１：９０００、もしくは１：１００００であってもよい。
一部の実施形態では、この比は、１：１、１．１：１、１．２：１、１．３：１、１．４：１、１．５：１、１．６：１、１．７：１、１．８：１、１．９：１、２：１、２．５：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１１：１、１２：１、１３：１、１４：１、１５：１、１６：１、１７：１、１８：１、１９：１、２０：１、２１：１、２２：１、２３：１、２４：１、２５：１、２６：１、２７：１、２８：１、２９：１、３０：１、３１：１、３２：１、３３：１、３４：１、３５：１、３６：１、３７：１、３８：１、３９：１、４０：１、４１：１、４２：１、４３：１、４４：１、４５：１、４６：１、４７：１、４８：１、４９：１、５０：１、５１：１、５２：１、５３：１、５４：１、５５：１、５６：１、５７：１、５８：１、５９：１、６０：１、６１：１、６２：１、６３：１、６４：１、６５：１、６６：１、６７：１、６８：１、６９：１、７０：１、７１：１、７２：１、７３：１、７４：１、７５：１、７６：１、７７：１、７８：１、７９：１、８０：１、８１：１、８２：１、８３：１、８４：１、８５：１、８６：１、８７：１、８８：１、８９：１、９０：１、９１：１、９２：１、９３：１、９４：１、９５：１、９６：１、９７：１、９８：１、９９：１、１００：１、２００：１、３００：１、４００：１、５００：１、６００：１、７００：１、８００：１、９００：１、１０００：１、２０００：１、３０００：１、４０００：１、５０００：１、６０００：１、７０００：１、８０００：１、９０００：１、１００００：１、もしくは約１：１、１．１：１、１．２：１、１．３：１、１．４：１、１．５：１、１．６：１、１．７：１、１．８：１、１．９：１、２：１、２．５：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１１：１、１２：１、１３：１、１４：１、１５：１、１６：１、１７：１、１８：１、１９：１、２０：１、２１：１、２２：１、２３：１、２４：１、２５：１、２６：１、２７：１、２８：１、２９：１、３０：１、３１：１、３２：１、３３：１、３４：１、３５：１、３６：１、３７：１、３８：１、３９：１、４０：１、４１：１、４２：１、４３：１、４４：１、４５：１、４６：１、４７：１、４８：１、４９：１、５０：１、５１：１、５２：１、５３：１、５４：１、５５：１、５６：１、５７：１、５８：１、５９：１、６０：１、６１：１、６２：１、６３：１、６４：１、６５：１、６６：１、６７：１、６８：１、６９：１、７０：１、７１：１、７２：１、７３：１、７４：１、７５：１、７６：１、７７：１、７８：１、７９：１、８０：１、８１：１、８２：１、８３：１、８４：１、８５：１、８６：１、８７：１、８８：１、８９：１、９０：１、９１：１、９２：１、９３：１、９４：１、９５：１、９６：１、９７：１、９８：１、９９：１、１００：１、２００：１、３００：１、４００：１、５００：１、６００：１、７００：１、８００：１、９００：１、１０００：１、２０００：１、３０００：１、４０００：１、５０００：１、６０００：１、７０００：１、８０００：１、９０００：１、１００００：１、または上記の値の任意の２つの間の数値もしくは範囲であってもよい。一部の実施形態では、この比は、少なくとも１：１、１．１：１、１．２：１、１．３：１、１．４：１、１．５：１、１．６：１、１．７：１、１．８：１、１．９：１、２：１、２．５：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１１：１、１２：１、１３：１、１４：１、１５：１、１６：１、１７：１、１８：１、１９：１、２０：１、２１：１、２２：１、２３：１、２４：１、２５：１、２６：１、２７：１、２８：１、２９：１、３０：１、３１：１、３２：１、３３：１、３４：１、３５：１、３６：１、３７：１、３８：１、３９：１、４０：１、４１：１、４２：１、４３：１、４４：１、４５：１、４６：１、４７：１、４８：１、４９：１、５０：１、５１：１、５２：１、５３：１、５４：１、５５：１、５６：１、５７：１、５８：１、５９：１、６０：１、６１：１、６２：１、６３：１、６４：１、６５：１、６６：１、６７：１、６８：１、６９：１、７０：１、７１：１、７２：１、７３：１、７４：１、７５：１、７６：１、７７：１、７８：１、７９：１、８０：１、８１：１、８２：１、８３：１、８４：１、８５：１、８６：１、８７：１、８８：１、８９：１、９０：１、９１：１、９２：１、９３：１、９４：１、９５：１、９６：１、９７：１、９８：１、９９：１、１００：１、２００：１、３００：１、４００：１、５００：１、６００：１、７００：１、８００：１、９００：１、１０００：１、２０００：１、３０００：１、４０００：１、５０００：１、６０００：１、７０００：１、８０００：１、９０００：１、もしくは１００００：１であってもよく、または最大で１：１、１．１：１、１．２：１、１．３：１、１．４：１、１．５：１、１．６：１、１．７：１、１．８：１、１．９：１、２：１、２．５：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１１：１、１２：１、１３：１、１４：１、１５：１、１６：１、１７：１、１８：１、１９：１、２０：１、２１：１、２２：１、２３：１、２４：１、２５：１、２６：１、２７：１、２８：１、２９：１、３０：１、３１：１、３２：１、３３：１、３４：１、３５：１、３６：１、３７：１、３８：１、３９：１、４０：１、４１：１、４２：１、４３：１、４４：１、４５：１、４６：１、４７：１、４８：１、４９：１、５０：１、５１：１、５２：１、５３：１、５４：１、５５：１、５６：１、５７：１、５８：１、５９：１、６０：１、６１：１、６２：１、６３：１、６４：１、６５：１、６６：１、６７：１、６８：１、６９：１、７０：１、７１：１、７２：１、７３：１、７４：１、７５：１、７６：１、７７：１、７８：１、７９：１、８０：１、８１：１、８２：１、８３：１、８４：１、８５：１、８６：１、８７：１、８８：１、８９：１、９０：１、９１：１、９２：１、９３：１、９４：１、９５：１、９６：１、９７：１、９８：１、９９：１、１００：１、２００：１、３００：１、４００：１、５００：１、６００：１、７００：１、８００：１、９００：１、１０００：１、２０００：１、３０００：１、４０００：１、５０００：１、６０００：１、７０００：１、８０００：１、９０００：１、もしくは１００００：１であってもよい。
細胞成分結合性試薬には、結合性試薬オリゴヌクレオチド（例えば、試料インデックス付与オリゴヌクレオチド）がコンジュゲートされていてもよく、またはコンジュゲートされていなくともよい。一部の実施形態では、結合性試薬オリゴヌクレオチド（例えば、試料インデックス付与オリゴヌクレオチド）がコンジュゲートされている細胞成分結合性試薬および結合性試薬オリゴヌクレオチドがコンジュゲートされていない細胞成分結合性試薬を含む混合物中の、結合性試薬オリゴヌクレオチドがコンジュゲートされている細胞成分結合性試薬のパーセンテージは、０．００００００００１％、０．０００００００１％、０．００００００１％、０．０００００１％、０．００００１％、０．０００１％、０．００１％、０．０１％、０．１％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、もしくは約０．００００００００１％、０．０００００００１％、０．００００００１％、０．０００００１％、０．００００１％、０．０００１％、０．００１％、０．０１％、０．１％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、またはこうした値の任意の２つの間の数値もしくは範囲であってもよい。一部の実施形態では、混合物中の、試料インデックス付与オリゴヌクレオチドがコンジュゲートされている細胞成分結合性試薬のパーセンテージは、少なくとも０．００００００００１％、０．０００００００１％、０．００００００１％、０．０００００１％、０．００００１％、０．０００１％、０．００１％、０．０１％、０．１％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％であってもよく、または最大で０．００００００００１％、０．０００００００１％、０．００００００１％、０．０００００１％、０．００００１％、０．０００１％、０．００１％、０．０１％、０．１％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％であってもよい。
一部の実施形態では、結合性試薬オリゴヌクレオチド（例えば、試料インデックス付与オリゴヌクレオチド）がコンジュゲートされている細胞成分結合性試薬および試料インデックス付与オリゴヌクレオチドがコンジュゲートされていない細胞成分結合性試薬を含む混合物中の、結合性試薬オリゴヌクレオチド（例えば、試料インデックス付与オリゴヌクレオチド）がコンジュゲートされていない細胞成分結合性試薬のパーセンテージは、０．００００００００１％、０．０００００００１％、０．００００００１％、０．０００００１％、０．００００１％、０．０００１％、０．００１％、０．０１％、０．１％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、もしくは約０．００００００００１％、０．０００００００１％、０．００００００１％、０．０００００１％、０．００００１％、０．０００１％、０．００１％、０．０１％、０．１％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、またはこうした値の任意の２つの間の数値もしくは範囲であってもよい。一部の実施形態では、混合物中の、結合性試薬オリゴヌクレオチドがコンジュゲートされていない細胞成分結合性試薬のパーセンテージは、少なくとも０．００００００００１％、０．０００００００１％、０．００００００１％、０．０００００１％、０．００００１％、０．０００１％、０．００１％、０．０１％、０．１％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％であってもよく、または最大で０．００００００００１％、０．０００００００１％、０．００００００１％、０．０００００１％、０．００００１％、０．０００１％、０．００１％、０．０１％、０．１％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％であってもよい。
細胞成分カクテル
一部の実施形態では、細胞成分結合性試薬のカクテル（例えば、抗体カクテル）を使用して、本明細書で開示される方法での標識付与感度を増加させることができる。いかなる特定の理論にも束縛されないが、これは、細胞成分発現またはタンパク質発現が、細胞タイプ間および細胞状態間で様々であり得るため、すべての細胞タイプを標識するユニバーサルな細胞成分結合性試薬または抗体を見出すことが困難であるためであり得ると考えられる。例えば、細胞成分結合性試薬のカクテルを使用すると、より多くの試料タイプのより高感度で効率的な標識付与を可能にすることができる。細胞成分結合性試薬のカクテルは、２つまたはそれよりも多くの異なるタイプの細胞成分結合性試薬、例えば、より広範囲の細胞成分結合性試薬または抗体を含むことができる。異なる細胞成分標的を標識する細胞成分結合性試薬を一緒にプールして、目的のすべての細胞タイプまたは１つもしくは複数の細胞タイプを十分に標識するカクテルを作出することができる。
一部の実施形態では、複数の組成物（例えば、試料インデックス付与組成物）の各々は、細胞成分結合性試薬を含む。一部の実施形態では、複数の組成物のうちの組成物は、２つまたはそれよりも多くの細胞成分結合性試薬を含み、２つまたはそれよりも多くの細胞成分結合性試薬の各々には、結合性試薬オリゴヌクレオチド（例えば、試料インデックス付与オリゴヌクレオチド）が付随しており、２つまたはそれよりも多くの細胞成分結合性試薬の少なくとも１つは、１つまたは複数の細胞成分標的のうちの少なくとも１つに特異的に結合することが可能である。２つまたはそれよりも多くの細胞成分結合性試薬に付随している結合性試薬オリゴヌクレオチドの配列は、同一であってもよい。２つまたはそれよりも多くの細胞成分結合性試薬に付随している結合性試薬オリゴヌクレオチドの配列は、異なる配列を含んでいてもよい。複数の組成物の各々は、２つまたはそれよりも多くの細胞成分結合性試薬を含んでいてもよい。
組成物中の異なるタイプの細胞成分結合性試薬（例えば、ＣＤ１４７抗体およびＣＤ４７抗体）の数は、インプリメンテーションが異なれば異なっていてもよい。２つまたはそれよりも多くの異なるタイプの細胞成分結合性試薬を有する組成物は、本明細書では、細胞成分結合性試薬カクテル（例えば、試料インデックス付与組成物カクテル）と呼ばれる場合がある。カクテル中の異なるタイプの細胞成分結合性試薬の数は様々であってもよい。一部の実施形態では、カクテル中の異なるタイプの細胞成分結合性試薬の数は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１００００、１０００００、もしくは約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１００００、１０００００、またはこうした値の任意の２つの間の数もしくは範囲であってもよい。一部の実施形態では、カクテル中の異なるタイプの細胞成分結合性試薬の数は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１００００、もしくは１０００００であってもよく、または最大で２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１００００、もしくは１０００００であってもよい。異なるタイプの細胞成分結合性試薬には、同じまたは異なる配列（例えば、試料インデックス付与配列）を有する結合性試薬オリゴヌクレオチドがコンジュゲートされていてもよい。
細胞成分標的の定量分析の方法
一部の実施形態では、本明細書に開示された方法はまた、本明細書に開示された組成物およびバーコード配列（例えば、分子標識配列）を細胞成分結合性試薬（例えば、タンパク質結合性試薬）のオリゴヌクレオチドに付随させ得るオリゴヌクレオチドプローブを使用して、試料中の複数の細胞成分標的（例えば、タンパク質標的）の定量分析に使用することができる。細胞成分結合性試薬のオリゴヌクレオチドは、抗体オリゴヌクレオチド、試料インデックス付与オリゴヌクレオチド、細胞識別オリゴヌクレオチド、制御粒子オリゴヌクレオチド、制御オリゴヌクレオチド、相互作用決定オリゴヌクレオチドなどであるか、またはこれらを含んでもよい。一部の実施形態では、試料は、単一細胞、複数の細胞、組織試料、腫瘍試料、血液試料などであり得る。一部の実施形態では、試料は、正常細胞、腫瘍細胞、血液細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞、母体細胞、胎児細胞など、または様々な対象からの細胞の混合物を含み得る。
一部の実施形態では、試料は、マイクロウェルアレイにおけるマイクロウェルなどの個々のコンパートメント中に分離した複数の単一細胞を含み得る。
一部の実施形態では、複数の細胞成分標的（すなわち、細胞成分標的）の結合標的は、炭水化物、脂質、タンパク質、細胞外タンパク質、細胞表面タンパク質、細胞マーカー、Ｂ細胞受容体、Ｔ細胞受容体、主要組織適合遺伝子複合体、腫瘍抗原、受容体、インテグリン、細胞内タンパク質、またはそれらの任意の組合せであるか、またはそれらを含んでもよい。一部の実施形態では、細胞成分標的は、タンパク質標的である。一部の実施形態では、複数の細胞成分標的は、細胞表面タンパク質、細胞マーカー、Ｂ細胞受容体、Ｔ細胞受容体、抗体、主要組織適合遺伝子複合体、腫瘍抗原、受容体、またはそれらの任意の組合せを含む。一部の実施形態では、複数の細胞成分標的は、細胞内細胞成分を含み得る。一部の実施形態では、複数の細胞成分は、生物においてコードされた細胞成分のすべてのうちの少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも６％、少なくとも７％、少なくとも８％、少なくとも９％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、またはそれより高い割合であってもよい。一部の実施形態では、複数の細胞成分標的は、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも１０００、少なくとも１００００、またはそれより多い異なる細胞成分標的を含み得る。
一部の実施形態では、複数の細胞成分結合性試薬を、複数の細胞成分標的との特異的結合のために、試料と接触させる。未結合の細胞成分結合性試薬は、例えば、洗浄することによって除去され得る。試料が細胞を含む実施形態では、細胞に特異的に結合していない任意の細胞成分結合性試薬が除去され得る。
一部の例では、細胞集団に由来する細胞は、本開示の基材のウェル中に分離（例えば、単離）され得る。細胞集団は、分離前に希釈され得る。細胞集団は、基材のウェルの少なくとも１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％が単一細胞を受容するように希釈され得る。細胞集団は、基材のウェルの最大１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％が単一細胞を受容するように希釈され得る。細胞集団は、希釈された集団における細胞の数が、基材上のウェルの数の１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは１００％であるか、または少なくとも１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは１００％であるように希釈され得る。細胞集団は、希釈された集団における細胞の数が、基材上のウェルの数の１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは１００％であるか、または少なくとも１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは１００％であるように希釈され得る。一部の例では、細胞集団は、細胞の数が、基材におけるウェルの数の約１０％であるように希釈される。
単一細胞の基材のウェル中への分配は、ポアソン分布に従ってもよい。例えば、基材のウェルが２つ以上の細胞を有する、少なくとも０．１％、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、もしくは１０％、またはそれより高い確率が存在し得る。基材のウェルが２つ以上の細胞を有する、少なくとも０．１％、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、もしくは１０％、またはそれより高い確率が存在し得る。単一細胞の基材のウェル中への分配は、ランダムであってもよい。単一細胞の基材のウェル中への分配は、ランダムでなくてもよい。細胞は、基材のウェルが１つの細胞のみを受容するように分離されてもよい。
一部の実施形態では、細胞成分結合性試薬は、個々のコンパートメントへの細胞のフローソーティングを可能にするために、蛍光分子とさらにコンジュゲートされてもよい。
一部の実施形態では、本明細書に開示された方法は、複数の細胞成分標的との特異的結合のために、複数の組成物を試料と接触させることを提供する。使用される条件は、細胞成分結合性試薬、例えば、抗体の、細胞成分標的への特異的結合を可能にし得ることが認識されるであろう。接触させるステップの後に、未結合の組成物を除去してもよい。例えば、試料が細胞を含み、かつ組成物が、細胞表面タンパク質などの細胞表面細胞成分である細胞成分標的に特異的に結合する実施形態では、未結合の組成物は、細胞成分標的に特異的に結合する組成物のみが細胞と共に残るように、細胞を緩衝液で洗浄することによって除去され得る。
一部の実施形態では、本明細書に開示された方法は、バーコード配列（例えば、分子標識）、細胞標識、試料標識などを含むオリゴヌクレオチド（例えば、バーコード、または確率論的バーコード）、またはそれらの任意の組合せを、細胞成分結合性試薬に付随している複数のオリゴヌクレオチドに付随させることを含み得る。例えば、バーコードを含む複数のオリゴヌクレオチドプローブを使用して、組成物のうちの複数のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせることができる。
一部の実施形態では、複数のオリゴヌクレオチドプローブは、固体支持体上に固定化されていてもよい。固体支持体は、浮動性、例えば、溶液中のビーズであってもよい。固体支持体は、半固体または固体アレイ中に封入されていてもよい。一部の実施形態では、複数のオリゴヌクレオチドプローブは、固体支持体上に固定化されていなくてもよい。複数のオリゴヌクレオチドプローブが、細胞成分結合性試薬のオリゴヌクレオチドが付随している複数に近接して存在する場合、細胞成分結合性試薬の複数のオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドプローブにハイブリダイズし得る。細胞成分結合性試薬の別個のオリゴヌクレオチドの各々に、本開示の異なるバーコード配列（例えば、分子標識）を有するオリゴヌクレオチドプローブが付随し得るように、オリゴヌクレオチドプローブを非枯渇的比率で接触させてもよい。
一部の実施形態では、本明細書に開示された方法は、細胞成分標的に特異的に結合した細胞成分結合性試薬からオリゴヌクレオチドを脱離させることを提供する。ＵＶ光切断、化学処理（例えば、ジチオトレイトール処理）、加熱、酵素処理、またはそれらの組合せなどの、細胞成分結合性試薬から化学基を分離する種々の方法で、脱離を実施することができる。細胞成分結合性試薬からのオリゴヌクレオチドの脱離は、複数のオリゴヌクレオチドプローブを組成物のうちの複数のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせるステップの前、後、またはその間に実施することができる。
細胞成分と核酸標的の同時定量分析の方法
一部の実施形態では、本明細書に開示された方法はまた、本明細書に開示された組成物および細胞成分結合性試薬のオリゴヌクレオチドと核酸標的分子との両方にバーコード配列（例えば、分子標識配列）に付随し得るオリゴヌクレオチドプローブを使用して、試料中の複数の細胞成分標的（例えば、タンパク質標的）および複数の核酸標的分子の同時定量分析のために使用され得る。複数の細胞成分標的および複数の核酸標的分子の同時定量分析の他の方法は、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１８００８８１１２号明細書に記載されている。一部の実施形態では、試料は、単一細胞、複数の細胞、組織試料、腫瘍試料、血液試料などであり得る。一部の実施形態では、試料は、正常細胞、腫瘍細胞、血液細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞、母体細胞、胎児細胞などの細胞型の混合物、または同じ対象もしくは異なる対象からの細胞の混合物を含み得る。
一部の実施形態では、試料は、マイクロウェルアレイ中のマイクロウェルなどの個々のコンパートメント中に分離された複数の単一細胞を含み得る。
一部の実施形態では、複数の細胞成分標的は、細胞表面タンパク質、細胞マーカー、Ｂ細胞受容体、Ｔ細胞受容体、抗体、主要組織適合遺伝子複合体、腫瘍抗原、受容体、またはそれらの任意の組合せを含む。一部の実施形態では、複数の細胞成分標的は、細胞内細胞成分を含み得る。一部の実施形態では、複数の細胞成分は、生物、または生物の１つもしくは複数の細胞中で発現したタンパク質などのすべての細胞成分のうちの１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、もしくはこれらの値のいずれか２つの間の数もしくは範囲で存在してもよく、または約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、もしくはこれらの値のいずれか２つの間の数もしくは範囲で存在してもよい。一部の実施形態では、複数の細胞成分は、生物、または生物の１つもしくは複数の細胞中で発現され得るタンパク質などのすべての細胞成分のうちの少なくとも、または最大１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、もしくは９９％で存在してもよい。一部の実施形態では、複数の細胞成分標的は、２、３、４、５、１０、２０、３０、４０、５０、１００、１０００、１００００個、もしくはこれらの値のいずれか２つの間の数もしくは範囲の異なる細胞成分標的を含んでもよく、または約２、３、４、５、１０、２０、３０、４０、５０、１００、１０００、１００００個、もしくはこれらの値のいずれか２つの間の数もしくは範囲の異なる細胞成分標的を含んでもよい。一部の実施形態では、複数の細胞成分標的は、少なくとも２、３、４、５、１０、２０、３０、４０、５０、１００、１０００、もしくは１００００個の異なる細胞成分標的を含むか、または最大２、３、４、５、１０、２０、３０、４０、５０、１００、１０００、もしくは１００００個の異なる細胞成分標的を含んでもよい。
一部の実施形態では、複数の細胞成分結合性試薬を、複数の細胞成分標的と特異的に結合させるために、試料と接触させる。未結合の細胞成分結合性試薬は、例えば、洗浄することによって除去され得る。試料が細胞を含む実施形態では、細胞に特異的に結合していない任意の細胞成分結合性試薬が除去され得る。
一部の例では、細胞集団に由来する細胞は、本開示の基材のウェル中に分離（例えば、単離）され得る。細胞集団は、分離前に希釈され得る。細胞集団は、基材のウェルのうちの少なくとも１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％が単一細胞を受容するように希釈され得る。細胞集団は、基材のウェルの最大１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％が単一細胞を受容するように希釈され得る。細胞集団は、希釈された集団における細胞の数が、基材上のウェルの数の１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは１００％であるか、または少なくとも１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは１００％であるように希釈され得る。細胞集団は、希釈された集団における細胞の数が、基材上のウェルの数の１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは１００％であるか、または少なくとも１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは１００％であるように希釈され得る。一部の例では、細胞集団は、細胞の数が、基材におけるウェルの数の約１０％であるように希釈される。
単一細胞の基材のウェル中への分配は、ポアソン分布に従ってもよい。例えば、基材のウェルが２つ以上の細胞を有する、少なくとも０．１％、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、もしくは１０％、またはそれより高い確率が存在し得る。基材のウェルが２つ以上の細胞を有する、少なくとも０．１％、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、もしくは１０％、またはそれより高い確率が存在し得る。単一細胞の基材のウェル中への分配は、ランダムであってもよい。単一細胞の基材のウェル中への分配は、ランダムでなくてもよい。細胞は、基材のウェルが１つの細胞のみを受容するように分離されてもよい。
一部の実施形態では、細胞成分結合性試薬は、個々のコンパートメントへの細胞のフローソーティングを可能にするために、蛍光分子とさらにコンジュゲートされ得る。
一部の実施形態では、本明細書に開示された方法は、複数の細胞成分標的との特異的結合のために、複数の組成物を試料と接触させることを提供する。使用される条件は、細胞成分結合性試薬、例えば、抗体の、細胞成分標的への特異的結合を可能にし得ることが認識されるであろう。接触させるステップの後に、未結合の組成物を除去してもよい。例えば、試料が細胞を含み、かつ組成物が、細胞表面タンパク質などの細胞表面上にある細胞成分標的に特異的に結合する実施形態では、未結合の組成物は、細胞成分標的に特異的に結合する組成物のみが細胞と共に残るように、細胞を緩衝液で洗浄することによって除去され得る。
一部の実施形態では、本明細書に開示された方法は、試料、例えば、細胞から複数の核酸標的分子を放出することを提供し得る。例えば、細胞を溶解させて、複数の核酸標的分子を放出させることができる。細胞溶解は、種々の手段のいずれかによって、例えば、化学処理、浸透圧ショック、熱処理、機械的処理、光学的処理、またはそれらの任意の組合せによって達成され得る。界面活性剤（例えば、ＳＤＳ、Ｌｉドデシルスルフェート、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、Ｔｗｅｅｎ－２０、またはＮＰ－４０）、有機溶媒（例えば、メタノールまたはアセトン）、もしくは消化酵素（例えば、プロテイナーゼＫ、ペプシン、またはトリプシン）、またはそれらの任意の組合せを含む細胞溶解緩衝液を添加することによって、細胞を溶解することができる。
複数の核酸分子が、様々な核酸分子を含み得ることが当業者によって認識されるであろう。一部の実施形態では、複数の核酸分子は、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、ゲノムＤＮＡ分子、ｍＲＮＡ分子、ｒＲＮＡ分子、ｓｉＲＮＡ分子、またはそれらの組合せを含んでもよく、かつ二本鎖または一本鎖であってもよい。一部の実施形態では、複数の核酸分子は、１００、１０００、１００００、２００００、３００００、４００００、５００００、１０００００、１００００００種、もしくはこれらの値のいずれか２つの間の数もしくは範囲の種を含むか、または約１００、１０００、１００００、２００００、３００００、４００００、５００００、１０００００、１００００００種、もしくはこれらの値のいずれか２つの間の数もしくは範囲の種を含む。一部の実施形態では、複数の核酸分子は、少なくとも１００、１０００、１００００、２００００、３００００、４００００、５００００、１０００００、もしくは１００００００種を含むか、または最大１００、１０００、１００００、２００００、３００００、４００００、５００００、１０００００、もしくは１００００００種を含む。一部の実施形態では、複数の核酸分子は、試料、例えば、単一細胞、または複数の細胞に由来し得る。一部の実施形態では、複数の核酸分子は、複数の試料、例えば、複数の単一細胞からプールされ得る。
一部の実施形態では、本明細書に開示された方法は、バーコード配列（例えば、分子標識）、細胞標識、試料標識など、またはそれらの任意の組合せを含み得るバーコード（例えば、確率論的バーコード）を複数の核酸標的分子および細胞成分結合性試薬の複数のオリゴヌクレオチドに付随させることを含み得る。例えば、確率論的バーコードを含む複数のオリゴヌクレオチドプローブを使用して、複数の核酸標的分子と組成物のうちの複数のオリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせることができる。
一部の実施形態では、複数のオリゴヌクレオチドプローブを固体支持体上に固定化させ得る。固体支持体は、浮動性、例えば、溶液中のビーズであってもよい。固体支持体は、半固体または固体アレイ中に封入されていてもよい。一部の実施形態では、複数のオリゴヌクレオチドプローブは、固体支持体上に固定化されていなくてもよい。複数のオリゴヌクレオチドプローブが、複数の核酸標的分子および細胞成分結合性試薬の複数のオリゴヌクレオチドに近接して存在する場合、複数の核酸標的分子および細胞成分結合性試薬の複数のオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドプローブにハイブリダイズし得る。別個の核酸標的分子および細胞成分結合性試薬のオリゴヌクレオチドの各々に、本開示の異なるバーコード配列を有するオリゴヌクレオチドプローブ（例えば、分子標識）が付随し得るように、オリゴヌクレオチドプローブを非枯渇的比率で接触させることができる。
一部の実施形態では、本明細書に開示された方法は、細胞成分標的に特異的に結合した細胞成分結合性試薬からオリゴヌクレオチドを脱離させることを提供する。ＵＶ光切断、化学処理（例えば、ジチオトレイトール処理）、加熱、酵素処理、またはそれらの組合せなどの種々の方法で脱離を実施し、細胞成分結合性試薬から化学基を分離することができる。細胞成分結合性試薬からのオリゴヌクレオチドの脱離は、複数のオリゴヌクレオチドプローブを複数の核酸標的分子および組成物のうちの複数のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせるステップの前、後、またはその間に実施することができる。
タンパク質および核酸標的の同時定量分析
一部の実施形態では、本明細書に開示された方法はまた、複数種の標的分子、例えば、タンパク質および核酸標的の同時定量分析のために使用することができる。例えば、標的分子は、細胞成分であってもよく、または細胞成分を含んでもよい。図６は、単一細胞における核酸標的と他の細胞成分標的（例えば、タンパク質）との両方の同時定量分析の例示的方法の概略図を示す。一部の実施形態では、各々が抗体などの細胞成分結合性試薬を含む複数の組成物６０５、６０５ｂ、６０５ｃなどが提供される。異なる細胞成分標的に結合する、抗体などの異なる細胞成分結合性試薬が、異なる固有識別子とコンジュゲートされる。次に、細胞成分結合性試薬は、複数の細胞６１０を含有する試料とインキュベートされ得る。異なる細胞成分結合性試薬は、細胞マーカー、Ｂ細胞受容体、Ｔ細胞受容体、抗体、主要組織適合遺伝子複合体、腫瘍抗原、受容体、またはそれらの任意の組合せなどの細胞表面上の細胞成分に特異的に結合することができる。未結合の細胞成分結合性試薬は、例えば、緩衝液で細胞を洗浄することにより、除去され得る。次いで、細胞成分結合性試薬を含む細胞は、単一のコンパートメント６１５が単一細胞および単一ビーズ６２０に適合するように所定のサイズにされているマイクロウェルアレイなどの複数のコンパートメント中に分離され得る。各ビーズは、ビーズ上のすべてのオリゴヌクレオチドプローブと共通の細胞標識、およびバーコード配列（例えば、分子標識配列）を含み得る複数のオリゴヌクレオチドプローブを含み得る。一部の実施形態では、各オリゴヌクレオチドプローブは、標的結合性領域、例えば、ポリ（ｄＴ）配列を含み得る。細胞成分結合性試薬にコンジュゲートしたオリゴヌクレオチド６２５は、化学的、光学的または他の手段を使用して、細胞成分結合性試薬から脱離され得る。細胞は溶解されて（６３５）、ゲノムＤＮＡまたは細胞のｍＲＮＡ６３０などの細胞内の核酸を放出し得る。細胞のｍＲＮＡ６３０、オリゴヌクレオチド６２５またはその両方は、ビーズ６２０上のオリゴヌクレオチドプローブによって、例えば、ポリ（ｄＴ）配列にハイブリダイズすることによって、捕捉され得る。逆転写酵素を使用して、細胞のｍＲＮＡ６３０およびオリゴヌクレオチド６２５にハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドプローブを細胞のｍＲＮＡ６３０およびオリゴヌクレオチド６２５を鋳型として使用して伸長することができる。逆転写酵素によって生成された伸長産物は、増幅および配列決定に供され得る。配列決定リードは、試料中の各単一細胞の細胞成分および遺伝子発現のデジタルな表現をもたらすことができる、細胞標識、バーコード（例えば、分子標識）、遺伝子、細胞成分結合性試薬に特異的なオリゴヌクレオチド（例えば、抗体に特異的なオリゴヌクレオチド）などの配列または識別子のデマルチプレクシングに供され得る。
バーコードの付随
細胞成分結合性試薬（例えば、抗原結合性試薬またはタンパク質結合性試薬）および／または核酸分子に付随しているオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドプローブにランダムに付随し得る。本明細書において、結合性試薬オリゴヌクレオチドと称される細胞成分結合性試薬に付随しているオリゴヌクレオチドは、本開示のオリゴヌクレオチド、例えば、抗体オリゴヌクレオチド、試料インデックス付与オリゴヌクレオチド、細胞識別オリゴヌクレオチド、制御粒子オリゴヌクレオチド、制御オリゴヌクレオチド、相互作用決定オリゴヌクレオチドなどであってもよく、またはこれらを含んでもよい。付随は、例えば、標的核酸分子および／またはタンパク質結合性試薬のオリゴヌクレオチドの相補的部分へのオリゴヌクレオチドプローブの標的結合性領域のハイブリダイゼーションを含む。例えば、バーコード（例えば、確率論的バーコード）のオリゴ（ｄＴ）領域は、標的核酸分子のポリ（Ａ）テイルおよび／またはタンパク質結合性試薬のオリゴヌクレオチドのポリ（Ａ）テイルと相互作用可能である。ハイブリダイゼーションに使用されるアッセイ条件（例えば、緩衝液のｐＨ、イオン強度、温度など）は、特定の安定なハイブリッドの形成を促進するように選択することができる。
本開示は、逆転写を使用して、分子標識を標的核酸および／または細胞成分結合性試薬に付随しているオリゴヌクレオチドに付随させる方法を提供する。逆転写は、鋳型としてＲＮＡとＤＮＡとの両方を使用し得る。例えば、細胞成分結合性試薬に元々コンジュゲートしたオリゴヌクレオチドは、ＲＮＡもしくはＤＮＡ塩基のいずれか、またはその両方であってもよい。結合性試薬オリゴヌクレオチドは、コピーされ、結合性試薬配列の配列、またはその一部に加えて、細胞標識およびバーコード配列（例えば、分子標識）に連結（例えば、共有結合で連結）され得る。別の例として、ｍＲＮＡ分子は、コピーされ、ｍＲＮＡ分子の配列、またはその一部に加えて、細胞標識およびバーコード配列（例えば、分子標識）に連結（例えば、共有結合で連結）され得る。
一部の実施形態では、分子標識は、オリゴヌクレオチドプローブ標的結合性領域と標的核酸分子の一部および／または細胞成分結合性試薬に付随している（例えば、現在、または以前に付随した）オリゴヌクレオチドとのライゲーションにより追加され得る。例えば、標的結合性領域は、制限部位オーバーハング（例えば、ＥｃｏＲＩ付着末端オーバーハング）への特異的ハイブリダイゼーションが可能となり得る核酸配列を含み得る。本方法は、制限部位オーバーハングを生成するために制限酵素（例えば、ＥｃｏＲＩ）で標的核酸および／または細胞成分結合性試薬に付随しているオリゴヌクレオチドを処置することをさらに含み得る。２つの断片を接続するために、リガーゼ（例えば、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ）を使用することができる。
固有分子標識配列の数または存在の決定
一部の実施形態では、本明細書に開示された方法は、各固有識別子、各核酸標的分子、および／または各結合性試薬オリゴヌクレオチド（例えば、抗体オリゴヌクレオチド）のための固有分子標識配列の数または存在を決定することを含む。例えば、配列決定リードを使用して、各固有識別子、各核酸標的分子、および／または各結合性試薬オリゴヌクレオチドのための固有分子標識配列の数を決定することができる。別の例として、配列決定リードを使用して、分子標識配列（例えば、配列決定リードにおける標的に付随している分子標識配列、結合性試薬オリゴヌクレオチド、抗体オリゴヌクレオチド、試料インデックス付与オリゴヌクレオチド、細胞識別オリゴヌクレオチド、制御粒子オリゴヌクレオチド、制御オリゴヌクレオチド、相互作用決定オリゴヌクレオチドなど）の存在または非存在を決定することができる。
一部の実施形態では、各固有識別子、各核酸標的分子、および／または各結合性試薬オリゴヌクレオチドのための固有分子標識配列の数は、試料中の各細胞成分標的（例えば、抗原標的またはタンパク質標的）および／または各核酸標的分子の量を示す。一部の実施形態では、細胞成分標的の量およびその対応する核酸標的分子、例えば、ｍＲＮＡ分子の量を互いに比較することができる。一部の実施形態では、細胞成分標的の量およびその対応する核酸標的分子、例えば、ｍＲＮＡ分子の量の比率を計算することができる。細胞成分標的は、例えば、細胞表面タンパク質マーカーであり得る。一部の実施形態では、細胞表面タンパク質マーカーのタンパク質レベルと細胞表面タンパク質マーカーのｍＲＮＡのレベルとの比率は低い。
本明細書に開示された方法は、種々の用途のために使用され得る。例えば、本明細書に開示された方法は、試料のプロテオームおよび／またはトランスクリプトーム分析のために使用され得る。一部の実施形態では、本明細書に開示された方法は、試料中の細胞成分標的および／または核酸標的、すなわち、バイオマーカーを識別するために使用され得る。一部の実施形態では、細胞成分標的および核酸標的は互いに対応する、すなわち、核酸標的は細胞成分標的をコード化する。一部の実施形態では、本明細書に開示された方法は、試料中の細胞成分標的の量とその対応する核酸標的分子、例えば、ｍＲＮＡ分子の量との間で所望の比率を有する細胞成分標的を識別するために使用され得る。一部の実施形態では、その比率は、０．００１、０．０１、０．１、１、１０、１００、１０００、もしくは上記値のいずれか２つの間の数もしくは範囲であるか、または約０．００１、０．０１、０．１、１、１０、１００、１０００、もしくは上記値のいずれか２つの間の数もしくは範囲である。一部の実施形態では、その比率は、少なくとも、または最大０．００１、０．０１、０．１、１、１０、１００、もしくは１０００である。一部の実施形態では、本明細書に開示された方法を使用して、試料中の対応する核酸標的分子の量が、１０００、１００、１０、５、２ １、０、もしくはこれらの値のいずれか２つの間の数もしくは範囲、または約１０００、１００、１０、５、２ １、０、もしくはこれらの値のいずれか２つの間の数もしくは範囲である、試料中の細胞成分標的を識別することができる。一部の実施形態では、本明細書に開示された方法を使用して、試料中の対応する核酸標的分子の量が、１０００、１００、１０、５、２ １、もしくは０を超えるか、または１０００、１００、１０、５、２ １、もしくは０未満である、試料中の細胞成分標的を識別することができる。
組成物およびキット
本明細書に開示された一部の実施形態は、試料中の複数の細胞成分（例えば、タンパク質）および／または複数の核酸標的分子の同時定量分析のためのキットおよび組成物を提供する。キットおよび組成物は、一部の実施形態では、各々がオリゴヌクレオチドとコンジュゲートした複数の細胞成分結合性試薬（例えば、複数のタンパク質結合性試薬）を含むことができ、オリゴヌクレオチドは、細胞成分結合性試薬に対する固有識別子、および複数のオリゴヌクレオチドプローブを含み、複数のオリゴヌクレオチドプローブの各々は、標的結合性領域、バーコード配列（例えば、分子標識配列）を含み、バーコード配列は、固有バーコード配列の多様なセットに由来する。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドの各々は、分子標識、細胞標識、試料標識、またはこれらの任意の組合せを含み得る。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドの各々は、リンカーを含み得る。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドの各々は、オリゴヌクレオチドプローブの結合部位、例えば、ポリ（Ａ）テイルを含み得る。例えば、ポリ（Ａ）テイルは、例えば、ｏｌｉｇｏｄＡ18（固体支持体に係留していない）またはｏｌｉｇｏＡ18Ｖ（固体支持体に係留している）であり得る。オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ残基、ＲＮＡ残基、またはその両方を含み得る。
本明細書の開示には、複数の試料インデックス付与組成物が含まれる。複数の試料インデックス付与組成物の各々は、２つ以上の細胞成分結合性試薬を含み得る。２つ以上の細胞成分結合性試薬の各々に、試料インデックス付与オリゴヌクレオチドに付随させ得る。２つ以上の細胞成分結合性試薬のうちの少なくとも１つは、少なくとも１つの細胞成分標的に特異的に結合することが可能であり得る。試料インデックス付与オリゴヌクレオチドは、試料の１つまたは複数の細胞の試料起源を識別するための試料インデックス付与配列を含み得る。複数の試料インデックス付与組成物のうちの少なくとも２つの試料インデックス付与組成物の試料インデックス付与配列は、異なる配列を含み得る。
本明細書の開示には、細胞を識別するための試料インデックス付与組成物を含むキットが含まれる。一部の実施形態では、２つの試料インデックス付与組成物の各々は、試料インデックス付与オリゴヌクレオチドが付随している細胞成分結合性試薬（例えば、タンパク質結合性試薬）を含み、細胞成分結合性試薬は、１つまたは複数の細胞成分標的（例えば、１つまたは複数のタンパク質標的）のうちの少なくとも１つに特異的に結合することが可能であり、試料インデックス付与オリゴヌクレオチドは、試料インデックス付与配列を含み、２つの試料インデックス付与組成物の試料インデックス付与配列は異なる配列を含む。一部の実施形態では、試料インデックス付与オリゴヌクレオチドは、分子標識配列、ユニバーサルプライマーに対する結合部位、またはそれらの組合せを含む。
本明細書の開示は、細胞を識別するためのキットを含む。一部の実施形態では、キットは、２つ以上の試料インデックス付与組成物を含む。２つ以上の試料インデックス付与組成物の各々は、試料インデックス付与オリゴヌクレオチドが付随している細胞成分結合性試薬（例えば、抗原結合性試薬）を含み、細胞成分結合性試薬は、１つまたは複数の細胞成分標的のうちの少なくとも１つに特異的に結合することが可能であり、試料インデックス付与オリゴヌクレオチドは、試料インデックス付与配列を含み、２つの試料インデックス付与組成物の試料インデックス付与配列は異なる配列を含む。一部の実施形態では、試料インデックス付与オリゴヌクレオチドは、分子標識配列、ユニバーサルプライマーに対する結合部位、またはそれらの組合せを含む。本明細書の開示は、多重識別するためのキットを含む。一部の実施形態では、キットは、２つの試料インデックス付与組成物を含む。２つの試料インデックス付与組成物の各々は、試料インデックス付与オリゴヌクレオチドが付随している細胞成分結合性試薬（例えば、抗原結合性試薬）を含み、抗原結合性試薬は、１つまたは複数の細胞成分標的（例えば、抗原標的）のうちの少なくとも１つに特異的に結合することが可能であり、試料インデックス付与オリゴヌクレオチドは、試料インデックス付与配列を含み、２つの試料インデックス付与組成物の試料インデックス付与配列は、異なる配列を含む。
固有識別子（または結合性試薬オリゴヌクレオチド、抗体オリゴヌクレオチド、試料インデックス付与オリゴヌクレオチド、細胞識別オリゴヌクレオチド、制御粒子オリゴヌクレオチド、制御オリゴヌクレオチド、または相互作用決定オリゴヌクレオチドなどの細胞成分結合性試薬に付随しているオリゴヌクレオチド）は、任意の適切な長さ、例えば、約２５ヌクレオチドから約４５ヌクレオチド長を有し得る。一部の実施形態では、固有識別子は、４ヌクレオチド、５ヌクレオチド、６ヌクレオチド、７ヌクレオチド、８ヌクレオチド、９ヌクレオチド、１０ヌクレオチド、１５ヌクレオチド、２０ヌクレオチド、２５ヌクレオチド、３０ヌクレオチド、３５ヌクレオチド、４０ヌクレオチド、４５ヌクレオチド、５０ヌクレオチド、５５ヌクレオチド、６０ヌクレオチド、７０ヌクレオチド、８０ヌクレオチド、９０ヌクレオチド、１００ヌクレオチド、２００ヌクレオチド、または上記値のいずれか２つの間の範囲であり、約４ヌクレオチド、５ヌクレオチド、６ヌクレオチド、７ヌクレオチド、８ヌクレオチド、９ヌクレオチド、１０ヌクレオチド、１５ヌクレオチド、２０ヌクレオチド、２５ヌクレオチド、３０ヌクレオチド、３５ヌクレオチド、４０ヌクレオチド、４５ヌクレオチド、５０ヌクレオチド、５５ヌクレオチド、６０ヌクレオチド、７０ヌクレオチド、８０ヌクレオチド、９０ヌクレオチド、１００ヌクレオチド、２００ヌクレオチド、または上記値のいずれか２つの間の範囲であり、４ヌクレオチド、５ヌクレオチド、６ヌクレオチド、７ヌクレオチド、８ヌクレオチド、９ヌクレオチド、１０ヌクレオチド、１５ヌクレオチド、２０ヌクレオチド、２５ヌクレオチド、３０ヌクレオチド、３５ヌクレオチド、４０ヌクレオチド、４５ヌクレオチド、５０ヌクレオチド、５５ヌクレオチド、６０ヌクレオチド、７０ヌクレオチド、８０ヌクレオチド、９０ヌクレオチド、１００ヌクレオチド、２００ヌクレオチド未満、または上記値のいずれか２つの間の範囲であり、４ヌクレオチド、５ヌクレオチド、６ヌクレオチド、７ヌクレオチド、８ヌクレオチド、９ヌクレオチド、１０ヌクレオチド、１５ヌクレオチド、２０ヌクレオチド、２５ヌクレオチド、３０ヌクレオチド、３５ヌクレオチド、４０ヌクレオチド、４５ヌクレオチド、５０ヌクレオチド、５５ヌクレオチド、６０ヌクレオチド、７０ヌクレオチド、８０ヌクレオチド、９０ヌクレオチド、１００ヌクレオチド、２００ヌクレオチドを超えるか、または上記値のいずれか２つの間の範囲である長さを有し得る。
一部の実施形態では、固有識別子は、固有識別子の多様なセットから選択される。固有識別子の多様なセットは、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、５０００個、もしくはこれらの値のいずれか２つの間の数もしくは範囲の異なる固有識別子を含んでもよく、または約２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、５０００個、もしくはこれらの値のいずれか２つの間の数もしくは範囲の異なる固有識別子を含んでもよい。固有識別子の多様なセットは、少なくとも２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、もしくは５０００個の異なる固有識別子を含むか、または最大２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、もしくは５０００個の異なる固有識別子を含んでもよい。一部の実施形態では、固有識別子のセットは、分析される試料のＤＮＡまたはＲＮＡ配列に対する最小限の配列相同性を有するよう設計される。一部の実施形態では、固有識別子のセットの配列は、１ヌクレオチド、２ヌクレオチド、３ヌクレオチド、４ヌクレオチド、５ヌクレオチド、６ヌクレオチド、７ヌクレオチド、８ヌクレオチド、９ヌクレオチド、１０ヌクレオチド、もしくはこれらの値のいずれか２つの間の数もしくは範囲で、または約１ヌクレオチド、２ヌクレオチド、３ヌクレオチド、４ヌクレオチド、５ヌクレオチド、６ヌクレオチド、７ヌクレオチド、８ヌクレオチド、９ヌクレオチド、１０ヌクレオチド、もしくはこれらの値のいずれか２つの間の数もしくは範囲で、互いに異なるか、またはその相補体である。一部の実施形態では、固有識別子のセットの配列は、少なくとも、または最大１ヌクレオチド、２ヌクレオチド、３ヌクレオチド、４ヌクレオチド、５ヌクレオチド、６ヌクレオチド、７ヌクレオチド、８ヌクレオチド、９ヌクレオチド、もしくは１０ヌクレオチド互いに異なるか、またはその相補体である。
一部の実施形態では、固有識別子は、プライマー、例えば、ユニバーサルプライマーに対する結合部位を含み得る。一部の実施形態では、固有識別子は、プライマー、例えば、ユニバーサルプライマーに対する少なくとも２つの結合部位を含み得る。一部の実施形態では、固有識別子は、プライマー、例えば、ユニバーサルプライマーに対する少なくとも３つの結合部位を含み得る。プライマーは、例えば、ＰＣＲ増幅によって、固有識別子の増幅のために使用され得る。一部の実施形態では、プライマーは、ネステッドＰＣＲ反応のために使用され得る。
任意のタンパク質結合性試薬（例えば、抗体もしくはその断片、アプタマー、小分子、リガンド、ペプチド、オリゴヌクレオチドなど、またはそれらの任意の組合せ）などの任意の適切な細胞成分結合性試薬が、本開示において企図される。一部の実施形態では、細胞成分結合性試薬は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、組換え抗体、一本鎖抗体（ｓｃＡｂ）、またはその断片、例えば、Ｆａｂ、Ｆｖなどであり得る。一部の実施形態では、複数のタンパク質結合性試薬は、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、５０００種、もしくはこれらの値のいずれか２つの間の数もしくは範囲の異なるタンパク質結合性試薬を含んでもよく、または約２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、５０００種、もしくはこれらの値のいずれか２つの間の数もしくは範囲の異なるタンパク質結合性試薬を含んでもよい。一部の実施形態では、複数のタンパク質結合性試薬は、少なくとも２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、もしくは５０００種の異なるタンパク質結合性試薬を含んでもよく、または最大２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、もしくは５０００種の異なるタンパク質結合性試薬を含んでもよい。
一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、リンカーを介して細胞成分結合性試薬とコンジュゲートされる。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、タンパク質結合性試薬と共有結合でコンジュゲートされ得る。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、タンパク質結合性試薬と非共有結合でコンジュゲートされ得る。一部の実施形態では、リンカーは、オリゴヌクレオチドをタンパク質結合性試薬に可逆的または不可逆的に付着させる化学基を含み得る。化学基は、例えば、アミン基を介してリンカーにコンジュゲートされ得る。一部の実施形態では、リンカーは、タンパク質結合性試薬にコンジュゲートした別の化学基と安定した結合を形成する化学基を含み得る。例えば、化学基は、ＵＶ光切断性基、ジスルフィド結合、ストレプトアビジン、ビオチン、アミンなどであり得る。一部の実施形態では、化学基は、リシンなどのアミノ酸上の第一級アミン、またはＮ末端を介してタンパク質結合性試薬にコンジュゲートされ得る。オリゴヌクレオチドは、タンパク質結合性試薬とそのタンパク質標的との間の特異的結合に干渉しない限り、タンパク質結合性試薬の任意の適切な部位にコンジュゲートされ得る。タンパク質結合性試薬が抗体である実施形態では、オリゴヌクレオチドは、抗原結合部位、例えば、Ｆｃ領域、ＣH１ドメイン、ＣH２ドメイン、ＣH３ドメイン、ＣLドメインなど以外の抗体のどの部位にでもコンジュゲートされ得る。一部の実施形態では、各タンパク質結合性試薬は、単一のオリゴヌクレオチド分子にコンジュゲートされ得る。一部の実施形態では、各タンパク質結合性試薬は、２、３、４、５、１０、２０、３０、４０、５０、１００、１０００個、もしくはこれらの値のいずれか２つの間の数もしくは範囲のオリゴヌクレオチド分子と、または約２、３、４、５、１０、２０、３０、４０、５０、１００、１０００個、もしくはこれらの値のいずれか２つの間の数もしくは範囲のオリゴヌクレオチド分子とコンジュゲートされ得、オリゴヌクレオチド分子の各々は、同じ固有識別子を含む。一部の実施形態では、各タンパク質結合性試薬は、２つ以上のオリゴヌクレオチド分子、例えば、少なくとも、または最大２、３、４、５、１０、２０、３０、４０、５０、１００、もしくは１０００個のオリゴヌクレオチド分子とコンジュゲートされ得、オリゴヌクレオチド分子の各々は、同じ固有識別子を含む。
一部の実施形態では、複数の細胞成分結合性試薬（例えば、タンパク質結合性試薬）は、試料中の複数の細胞成分標的（例えば、タンパク質標的）に特異的に結合することが可能である。試料は、単一細胞、複数の細胞、組織試料、腫瘍試料、血液試料などであってもよく、またはこれらを含んでもよい。一部の実施形態では、複数の細胞成分標的は、細胞表面タンパク質、細胞マーカー、Ｂ細胞受容体、Ｔ細胞受容体、抗体、主要組織適合遺伝子複合体、腫瘍抗原、受容体、またはそれらの任意の組合せを含む。一部の実施形態では、複数の細胞成分標的は、細胞内タンパク質を含み得る。一部の実施形態では、複数の細胞成分標的は、細胞内タンパク質を含み得る。一部の実施形態では、複数の細胞成分標的は、生物中のすべての細胞成分標的（例えば、発現されたまたは発現され得るタンパク質）のうちの１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、もしくはこれらの値のいずれか２つの間の数もしくは範囲で存在してもよく、または約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、もしくはこれらの値のいずれか２つの間の数もしくは範囲で存在してもよい。一部の実施形態では、複数の細胞成分標的は、生物中のすべての細胞成分標的（例えば、発現されたまたは発現され得るタンパク質）のうちの少なくとも、または最大１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、もしくは９９％であってもよい。一部の実施形態では、複数の細胞成分標的は、２、３、４、５、１０、２０、３０、４０、５０、１００、１０００、１００００個、もしくはこれらの値のいずれか２つの間の数もしくは範囲の異なる細胞成分標的を含んでもよく、または約２、３、４、５、１０、２０、３０、４０、５０、１００、１０００、１００００個、もしくはこれらの値のいずれか２つの間の数もしくは範囲の異なる細胞成分標的を含んでもよい。一部の実施形態では、複数の細胞成分標的は、少なくとも２、３、４、５、１０、２０、３０、４０、５０、１００、１０００、もしくは１００００個の異なる細胞成分標的を含むか、または最大２、３、４、５、１０、２０、３０、４０、５０、１００、１０００、もしくは１００００個の異なる細胞成分標的を含んでもよい。
オリゴヌクレオチドとコンジュゲートした細胞成分結合性試薬を使用する試料インデックス付与
本明細書の開示は、試料を識別するための方法を含む。一部の実施形態では、本方法は、複数の試料の各々に由来する１つまたは複数の細胞を、複数の試料インデックス付与組成物のうちの試料インデックス付与組成物と接触させることであって、１つまたは複数の細胞の各々は、１つまたは複数の細胞成分標的を含み、複数の試料インデックス付与組成物の各々は、試料インデックス付与オリゴヌクレオチドが付随している細胞成分結合性試薬を含み、細胞成分結合性試薬は、１つまたは複数の細胞成分標的のうちの少なくとも１つに特異的に結合することが可能であり、試料インデックス付与オリゴヌクレオチドは、試料インデックス付与配列を含み、複数の試料インデックス付与組成物のうちの少なくとも２つの試料インデックス付与組成物の試料インデックス付与配列は、異なる配列を含む、こと；複数のバーコード（例えば、確率論的バーコード）を使用して試料インデックス付与オリゴヌクレオチドをバーコーディング（例えば、確率論的にバーコーディング）して、複数のバーコード化試料インデックス付与オリゴヌクレオチドを生成すること；複数のバーコード化試料インデックス付与オリゴヌクレオチドの配列決定データを得ること；および複数のバーコード化試料インデックス付与オリゴヌクレオチドのうちの少なくとも１つのバーコード化試料インデックス付与オリゴヌクレオチドの試料インデックス付与配列に基づいて、１つまたは複数の細胞のうちの少なくとも１つの細胞の試料起源を識別することを含む。
一部の実施形態では、複数のバーコードを使用して試料インデックス付与オリゴヌクレオチドをバーコーディングすることは、複数のバーコードを試料インデックス付与オリゴヌクレオチドと接触させて、試料インデックス付与オリゴヌクレオチドにハイブリダイズしたバーコードを生成すること、および試料インデックス付与オリゴヌクレオチドにハイブリダイズしたバーコードを伸長して、複数のバーコード化試料インデックス付与オリゴヌクレオチドを生成することを含む。バーコードを伸長することは、ＤＮＡポリメラーゼを使用してバーコードを伸長して、複数のバーコード化試料インデックス付与オリゴヌクレオチドを生成することを含み得る。バーコードを伸長することは、逆転写酵素を使用してバーコードを伸長して、複数のバーコード化試料インデックス付与オリゴヌクレオチドを生成することを含み得る。
抗体にコンジュゲートしたオリゴヌクレオチド、抗体とのコンジュゲーションのためのオリゴヌクレオチド、または抗体に以前にコンジュゲートしたオリゴヌクレオチドは、本明細書において、抗体オリゴヌクレオチド（「ＡｂＯｌｉｇｏ」）と称される。試料インデックス付与の文脈における抗体オリゴヌクレオチドは、本明細書において、試料インデックス付与オリゴヌクレオチドと称される。抗体オリゴヌクレオチドにコンジュゲートした抗体は、本明細書において、ホット抗体またはオリゴヌクレオチド抗体と称される。抗体オリゴヌクレオチドにコンジュゲートされていない抗体は、本明細書において、コールド抗体またはオリゴヌクレオチドフリー抗体と称される。結合性試薬（例えば、タンパク質結合性試薬）にコンジュゲートしたオリゴヌクレオチド、結合性試薬とのコンジュゲーションのためのオリゴヌクレオチド、または結合性試薬に以前にコンジュゲートしたオリゴヌクレオチドは、本明細書において、試薬オリゴヌクレオチドと称される。試料インデックス付与の文脈における試薬オリゴヌクレオチドは、本明細書において、試料インデックス付与オリゴヌクレオチドと称される。抗体オリゴヌクレオチドにコンジュゲートした結合性試薬は、本明細書において、ホット結合性試薬またはオリゴヌクレオチド結合性試薬と称される。抗体オリゴヌクレオチドにコンジュゲートされていない結合性試薬は、本明細書において、コールド結合性試薬またはオリゴヌクレオチドフリー結合性試薬と称される。
図７は、試料インデックス付与のためにオリゴヌクレオチドがコンジュゲートされている細胞成分結合性試薬を使用する例示的ワークフローの略図を示す。一部の実施形態では、各々が結合性試薬を含む複数の組成物７０５ａ、７０５ｂなどが提供される。結合性試薬は、タンパク質結合性試薬、例えば、抗体であり得る。細胞成分結合性試薬は、抗体、テトラマー、アプタマー、タンパク質足場、またはそれらの組合せを含み得る。複数の組成物７０５ａ、７０５ｂの結合性試薬は、同一の細胞成分標的に結合し得る。例えば、複数の組成物７０５、７０５ｂの結合性試薬は、同一であり得る（結合性試薬に付随している試料インデックス付与オリゴヌクレオチドを除いて）。
様々な組成物は、様々な試料インデックス付与配列を有する試料インデックス付与オリゴヌクレオチドにコンジュゲートした結合性試薬を含み得る。様々な組成物の数は、異なるインプリメンテーションにおいて異なっていてもよい。一部の実施形態では、様々な組成物の数は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１００００種、もしくはこれらの値のいずれか２つの間の数もしくは範囲であってもよく、または約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１００００種、もしくはこれらの値のいずれか２つの間の数もしくは範囲であってもよい。一部の実施形態では、様々な組成物の数は、少なくとも、または最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、もしくは１００００種であってもよい。
一部の実施形態では、１つの組成物中の結合性試薬の試料インデックス付与オリゴヌクレオチドは、同一の試料インデックス付与配列を含み得る。１つの組成物中の結合性試薬の試料インデックス付与オリゴヌクレオチドは、同一でなくてもよい。一部の実施形態では、同一の試料インデックス付与配列を有する１つの組成物中の結合性試薬の試料インデックス付与オリゴヌクレオチドのパーセンテージは、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、もしくはこれらの値のいずれか２つの間の数もしくは範囲であってもよく、または約５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、もしくはこれらの値のいずれか２つの間の数もしくは範囲であってもよい。一部の実施形態では、同一の試料インデックス付与配列を有する１つの組成物中の結合性試薬の試料インデックス付与オリゴヌクレオチドのパーセンテージは、少なくとも、または最大５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは９９．９％であってもよい。
組成物７０５ａおよび７０５ｂは、様々な試料のうちの試料を標識するために使用され得る。例えば、組成物７０５ａ中の細胞成分結合性試薬の試料インデックス付与オリゴヌクレオチドは、１つの試料インデックス付与配列を有してもよく、患者の試料などの試料７０７ａにおいて、黒丸として示される細胞７１０ａを標識するために使用され得る。組成物７０５ｂ中の細胞成分結合性試薬の試料インデックス付与オリゴヌクレオチドは、別の試料インデックス付与配列を有してもよく、別の患者の試料または同じ患者の別の試料などの試料７０７ｂにおいて、陰影を付けた丸として示される細胞７１０ｂを標識するために使用され得る。細胞成分結合性試薬は、細胞表面、例えば、細胞マーカー、Ｂ細胞受容体、Ｔ細胞受容体、抗体、主要組織適合遺伝子複合体、腫瘍抗原、受容体、またはそれらの任意の組合せ上の細胞成分標的またはタンパク質に特異的に結合し得る。未結合の細胞成分結合性試薬は、例えば、緩衝液で細胞を洗浄することにより、除去され得る。
次いで、細胞成分結合性試薬を有する細胞は、単一のコンパートメント７１５ａ、７１５ｂが単一細胞７１０ａおよび単一のビーズ７２０ａまたは単一細胞７１０ｂおよび単一のビーズ７２０ｂに適合するように所定のサイズにされているマイクロウェルアレイなどの複数のコンパートメント中に分離され得る。各ビーズ７２０ａ、７２０ｂは、ビーズ上のすべてのオリゴヌクレオチドプローブと共通する細胞標識、および分子標識配列を含み得る複数のオリゴヌクレオチドプローブを含み得る。一部の実施形態では、各オリゴヌクレオチドプローブは、標的結合性領域、例えば、ポリ（ｄＴ）配列を含み得る。組成物７０５ａの細胞成分結合性試薬にコンジュゲートした試料インデックス付与オリゴヌクレオチド７２５ａは、細胞成分結合性試薬から脱離可能であるかまたは脱離不可能であるように構成され得る。組成物７０５ａの細胞成分結合性試薬にコンジュゲートした試料インデックス付与オリゴヌクレオチド７２５ａは、化学的、光学的または他の手段を使用して細胞成分結合性試薬から脱離され得る。組成物７０５ｂの細胞成分結合性試薬にコンジュゲートした試料インデックス付与オリゴヌクレオチド７２５ｂは、細胞成分結合性試薬から脱離可能であるかまたは脱離不可能であるように構成され得る。組成物７０５ｂの細胞成分結合性試薬にコンジュゲートした試料インデックス付与オリゴヌクレオチド７２５ｂは、化学的、光学的または他の手段を使用して細胞成分結合性試薬から脱離され得る。
細胞７１０ａは、溶解されて、ゲノムＤＮＡまたは細胞のｍＲＮＡ７３０ａなどの細胞７１０ａ内の核酸を放出し得る。溶解された細胞７３５ａを破線の丸として示す。細胞のｍＲＮＡ７３０ａ、試料インデックス付与オリゴヌクレオチド７２５ａ、またはその両方は、ビーズ７２０ａ上のオリゴヌクレオチドプローブによって、例えば、ポリ（ｄＴ）配列にハイブリダイズすることによって捕捉され得る。逆転写酵素を使用して、細胞のｍＲＮＡ７３０ａおよびオリゴヌクレオチド７２５ａにハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドプローブを細胞のｍＲＮＡ７３０ａおよびオリゴヌクレオチド７２５ａを鋳型として使用して伸長することができる。逆転写酵素によって生成された伸長産物は、増幅および配列決定に供され得る。
同様に、細胞７１０ｂは、溶解されて、ゲノムＤＮＡまたは細胞のｍＲＮＡ７３０ｂなどの細胞７１０ｂ内の核酸を放出し得る。溶解された細胞７３５ｂを破線の丸として示す。細胞のｍＲＮＡ７３０ｂ、試料インデックス付与オリゴヌクレオチド７２５ｂ、またはその両方は、ビーズ７２０ｂ上のオリゴヌクレオチドプローブによって、例えば、ポリ（ｄＴ）配列にハイブリダイズすることによって捕捉され得る。逆転写酵素を使用して、細胞のｍＲＮＡ７３０ｂおよびオリゴヌクレオチド７２５ｂにハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドプローブを細胞のｍＲＮＡ７３０ｂおよびオリゴヌクレオチド７２５ｂを鋳型として使用して伸長することができる。逆転写酵素によって生成された伸長産物は、増幅および配列決定に供され得る。
配列決定リードは、細胞標識、分子標識、遺伝子同一性、および試料同一性（例えば、試料インデックス付与オリゴヌクレオチド７２５ａおよび７２５ｂの試料インデックス付与配列に関する）のデマルチプレクシングに供され得る。細胞標識、分子標識、および遺伝子同一性のデマルチプレクシングによって、試料中の各単一細胞の遺伝子発現のデジタルな表現を得ることができる。試料インデックス付与オリゴヌクレオチドの試料インデックス付与配列を使用する、細胞標識、分子標識、および試料同一性のデマルチプレクシングを使用して、試料起源を決定することができる。
一部の実施形態では、細胞表面上の細胞成分結合性試薬に対する細胞成分結合性試薬は、固有試料インデックス付与オリゴヌクレオチドのライブラリーにコンジュゲートされ、細胞に試料の同一性を保持させることができる。例えば、細胞表面マーカーに対する抗体は、固有試料インデックス付与オリゴヌクレオチドのライブラリーにコンジュゲートされ、細胞に試料の同一性を保持させることができる。このことにより、複数の試料を同じＲｈａｐｓｏｄｙ（商標）カートリッジ上にロードすることが可能となり、これは、試料供給源に関する情報がライブラリーの調製および配列決定を通して保持されるためである。試料インデックス付与は、複数の試料を単一の実験で一緒にランすること、単純化および実験時間の短縮化、ならびにバッチ効果の排除を可能にすることができる。
本明細書の開示は、試料を識別するための方法を含む。一部の実施形態では、本方法は、複数の試料の各々に由来する１つまたは複数の細胞を、複数の試料インデックス付与組成物のうちの試料インデックス付与組成物と接触させることであって、１つまたは複数の細胞の各々は、１つまたは複数の細胞成分標的を含み、複数の試料インデックス付与組成物の各々は、試料インデックス付与オリゴヌクレオチドが付随している細胞成分結合性試薬を含み、細胞成分結合性試薬は、１つまたは複数の細胞成分標的のうちの少なくとも１つに特異的に結合することが可能であり、試料インデックス付与オリゴヌクレオチドは、試料インデックス付与配列を含み、複数の試料インデックス付与組成物のうちの少なくとも２つの試料インデックス付与組成物の試料インデックス付与配列は、異なる配列を含む、こと；複数の試料インデックス付与組成物のうちの未結合試料インデックス付与組成物を除去することを含む。本方法は、複数のバーコード（例えば、確率論的バーコード）を使用して試料インデックス付与オリゴヌクレオチドをバーコーディング（例えば、確率論的にバーコーディング）して、複数のバーコード化試料インデックス付与オリゴヌクレオチドを生成すること；複数のバーコード化試料インデックス付与オリゴヌクレオチドの配列決定データを得ること；および複数のバーコード化試料インデックス付与オリゴヌクレオチドのうちの少なくとも１つのバーコード化試料インデックス付与オリゴヌクレオチドの試料インデックス付与配列に基づいて、１つまたは複数の細胞のうちの少なくとも１つの細胞の試料起源を識別することを含み得る。
一部の実施形態では、試料を識別するための方法は、複数の試料の各々に由来する１つまたは複数の細胞を、複数の試料インデックス付与組成物のうちの試料インデックス付与組成物と接触させることであって、１つまたは複数の細胞の各々は、１つまたは複数の細胞成分標的を含み、複数の試料インデックス付与組成物の各々は、試料インデックス付与オリゴヌクレオチドが付随している細胞成分結合性試薬を含み、細胞成分結合性試薬は、１つまたは複数の細胞成分標的のうちの少なくとも１つに特異的に結合することが可能であり、試料インデックス付与オリゴヌクレオチドは、試料インデックス付与配列を含み、複数の試料インデックス付与組成物のうちの少なくとも２つの試料インデックス付与組成物の試料インデックス付与配列は、異なる配列を含む、こと；複数の試料インデックス付与組成物のうちの未結合試料インデックス付与組成物を除去すること；および複数の試料インデックス付与組成物のうちの少なくとも１つの試料インデックス付与オリゴヌクレオチドの試料インデックス付与配列に基づいて、１つまたは複数の細胞うちの少なくとも１つの細胞の試料起源を識別することを含む。
一部の実施形態では、少なくとも１つの細胞の試料起源の識別は、複数のバーコード（例えば、確率論的バーコード）を使用して複数の試料インデックス付与組成物の試料インデックス付与オリゴヌクレオチドをバーコーディング（例えば、確率論的にバーコーディング）して、複数のバーコード化試料インデックス付与オリゴヌクレオチドを生成すること；複数のバーコード化試料インデックス付与オリゴヌクレオチドの配列決定データを得ること；および複数のバーコード化試料インデックス付与オリゴヌクレオチドのうちの少なくとも１つのバーコード化試料インデックス付与オリゴヌクレオチドの試料インデックス付与配列に基づいて、細胞の試料起源を識別することを含む。一部の実施形態では、複数のバーコードを使用して試料インデックス付与オリゴヌクレオチドをバーコーディングして複数のバーコード化試料インデックス付与オリゴヌクレオチドを生成することは、複数の確率論的バーコードを使用して、試料インデックス付与オリゴヌクレオチドを確率論的にバーコーディングして、複数の確率論的バーコード化試料インデックス付与オリゴヌクレオチドを生成することを含む。
一部の実施形態では、少なくとも１つの細胞の試料起源の識別は、複数の試料インデックス付与組成物のうちの少なくとも１つの試料インデックス付与オリゴヌクレオチドの試料インデックス付与配列の存在または非存在を識別することを含み得る。試料インデックス付与配列の存在または非存在の識別は、少なくとも１つの試料インデックス付与オリゴヌクレオチドを複製して、複数の複製試料インデックス付与オリゴヌクレオチドを生成すること；複数の複製試料インデックス付与オリゴヌクレオチドの配列決定データを得ること；および配列決定データ中の少なくとも１つのバーコード化試料インデックス付与オリゴヌクレオチドに対応する複数の試料インデックス付与オリゴヌクレオチドの複製試料インデックス付与オリゴヌクレオチドの試料インデックス付与配列に基づいて、細胞の試料起源を識別することを含む。
一部の実施形態では、少なくとも１つの試料インデックス付与オリゴヌクレオチドを複製して、複数の複製試料インデックス付与オリゴヌクレオチドを生成することは、少なくとも１つのバーコード化試料インデックス付与オリゴヌクレオチドを複製する前に、複製用アダプターを少なくとも１つのバーコード化試料インデックス付与オリゴヌクレオチドにライゲートさせることを含む。少なくとも１つのバーコード化試料インデックス付与オリゴヌクレオチドを複製することは、少なくとも１つのバーコード化試料インデックス付与オリゴヌクレオチドにライゲートされた複製用アダプターを使用して、少なくとも１つのバーコード化試料インデックス付与オリゴヌクレオチドを複製して、複数の複製試料インデックス付与オリゴヌクレオチドを生成することを含み得る。
一部の実施形態では、少なくとも１つの試料インデックス付与オリゴヌクレオチドを複製して、複数の複製試料インデックス付与オリゴヌクレオチドを生成することは、少なくとも１つのバーコード化試料インデックス付与オリゴヌクレオチドを複製する前に、捕捉プローブを少なくとも１つの試料インデックス付与オリゴヌクレオチドと接触させて、試料インデックス付与オリゴヌクレオチドにハイブリダイズした捕捉プローブを生成すること、および試料インデックス付与オリゴヌクレオチドにハイブリダイズした捕捉プローブを伸長して、捕捉プローブが付随している試料インデックス付与オリゴヌクレオチドを生成することを含む。少なくとも１つの試料インデックス付与オリゴヌクレオチドを複製することは、捕捉プローブが付随している試料インデックス付与オリゴヌクレオチドを複製して、複数の複製試料インデックス付与オリゴヌクレオチドを生成することを含み得る。
細胞のオーバーローディングおよびマルチプレットの識別
本明細書の開示は、細胞のオーバーローディングおよびマルチプレットを識別するための方法、キットおよびシステムも含む。このような方法、キットおよびシステムは、例えば、オリゴヌクレオチドが付随している細胞成分結合性試薬を用いて細胞成分の発現レベル（例えば、タンパク質発現レベル）を測定するための方法、キットおよびシステムなどの、本明細書に開示された任意の適切な方法、キットおよびシステムにおいて、またはそれらと組み合わせて使用され得る。
現在の細胞ローディング技術を使用すると、約２００００個の細胞が約６００００個のマイクロウェルを有するマイクロウェルカートリッジまたはアレイにロードされる場合に、２つ以上の細胞を有するマイクロウェルまたは液滴の数（ダブレットまたはマルチプレットと称される）が最小限になり得る。しかし、ロードされた細胞の数が増加すると、複数の細胞を有するマイクロウェルまたは液滴の数が著しく増加する場合がある。例えば、約５００００個の細胞がマイクロウェルカートリッジまたはアレイの約６００００個のマイクロウェルにロードされる場合、複数の細胞を有するマイクロウェルのパーセンテージはかなり高く、例えば、１１～１４％になり得る。このように多数の細胞をマイクロウェル中にロードすることは、細胞のオーバーローディングと称される場合がある。しかし、細胞をいくつかの群（例えば、５）に分割し、各群の細胞が別個の試料インデックス付与配列を有する試料インデックス付与オリゴヌクレオチドで標識される場合、２つ以上の試料インデックス付与配列に付随している細胞標識（例えば、確率論的バーコードなどのバーコードの細胞標識）は、配列決定データにおいて識別され、かつ次の処理から除去され得る。一部の実施形態では、細胞を多数の群（例えば、１００００）に分割し、各群の細胞が別個の試料インデックス付与配列を有する試料インデックス付与オリゴヌクレオチドで標識される場合、２つ以上の試料インデックス付与配列に付随している試料標識は、配列決定データにおいて識別され、かつ次の処理から除去され得る。一部の実施形態では、様々な細胞が別個の細胞識別配列を有する細胞識別オリゴヌクレオチドで標識され、２つ以上の細胞識別オリゴヌクレオチドに付随している細胞識別配列は、配列決定データにおいて識別され、かつ次の処理から除去され得る。マイクロウェルカートリッジまたはアレイにおけるマイクロウェルの数に対して、このような多数の細胞をマイクロウェル中にロードすることができる。
本明細書の開示は、試料を識別するための方法を含む。一部の実施形態では、本方法は、第１の複数の細胞および第２の複数の細胞をそれぞれ２つの試料インデックス付与組成物と接触させることであって、第１の複数の細胞の各々と第２の複数の細胞の各々は、１つまたは複数の細胞成分を含み、２つの試料インデックス付与組成物の各々は、試料インデックス付与オリゴヌクレオチドが付随している細胞成分結合性試薬を含み、細胞成分結合性試薬は、１つまたは複数の細胞成分のうちの少なくとも１つに特異的に結合可能であり、試料インデックス付与オリゴヌクレオチドは、試料インデックス付与配列を含み、かつ２つの試料インデックス付与組成物の試料インデックス付与配列が異なる配列を含む、こと；複数のバーコードを使用して試料インデックス付与オリゴヌクレオチドをバーコーディングして、複数のバーコード化試料インデックス付与オリゴヌクレオチドを生成することであって、複数のバーコードの各々は、細胞標識配列、バーコード配列（例えば、分子標識配列）、および標的結合性領域を含み、複数のバーコードのうちの少なくとも２つのバーコードのバーコード配列は、異なる配列を含み、かつ複数のバーコードのうちの少なくとも２つのバーコードは、同一の細胞標識配列を含む、こと；複数のバーコード化試料インデックス付与オリゴヌクレオチドの配列決定データを得ること；ならびに得られた配列決定データにおいて、各々が２つ以上の試料インデックス付与配列に付随している１つまたは複数の細胞標識配列を識別すること；ならびに得られた配列決定データから、各々が２つ以上の試料インデックス付与配列に付随している１つまたは複数の細胞標識配列に関連した配列決定データを除去し、かつ／または次の分析（例えば、単一細胞ｍＲＮＡプロファイリング、または全トランスクリプトーム分析）から、各々が２つ以上の試料インデックス付与配列に付随している１つまたは複数の細胞標識配列に関連した配列決定データを除くことを含む。一部の実施形態では、試料インデックス付与オリゴヌクレオチドは、バーコード配列（例えば、分子標識配列）、ユニバーサルプライマーに対する結合部位、またはそれらの組合せを含む。
例えば、本方法は、試料インデックス付与を使用して、５００００個以上の細胞（１００００～２００００個の細胞と比較して）をロードするために使用され得る。試料インデックス付与により、細胞成分（例えば、ユニバーサルタンパク質マーカー）に対するオリゴヌクレオチドとコンジュゲートした細胞成分結合性試薬（例えば、抗体）または細胞成分結合性試薬を使用して、異なる試料由来の細胞を固有試料インデックスで標識することができる。異なる試料由来の２つ以上の細胞、試料の異なる細胞集団由来の２つ以上の細胞、または試料の２つ以上の細胞が、同じマイクロウェルまたは液滴において捕捉される場合、合わせた「細胞」（または２つ以上の細胞の内容物）には、異なる試料インデックス付与配列（または異なる細胞識別配列を有する細胞識別オリゴヌクレオチド）を有する試料インデックス付与オリゴヌクレオチドに付随させ得る。異なる細胞集団の数は、異なるインプリメンテーションにおいて異なっていてもよい。一部の実施形態では、異なる集団の数は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、もしくはこれらの値のいずれか２つの間の数もしくは範囲であってもよく、または約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、もしくはこれらの値のいずれか２つの間の数もしくは範囲であってもよい。一部の実施形態では、異なる集団の数は、少なくとも、または最大２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、もしくは１００であってもよい。各集団における細胞の数、または平均数は、異なるインプリメンテーションにおいて異なっていてもよい。一部の実施形態では、各集団における細胞の数、または平均数は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００個、もしくはこれらの値のいずれか２つの間の数もしくは範囲であってもよく、または約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００個、もしくはこれらの値のいずれか２つの間の数もしくは範囲であってもよい。一部の実施形態では、各集団における細胞の数、または平均数は、少なくとも、または最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、もしくは１００個であってもよい。各集団における細胞の数、または平均数が十分に少ない（例えば、集団当たり５０、２５、１０、５、４、３、２、もしくは１個の細胞に等しいか、またはそれより少ない）場合、細胞のオーバーローディングおよびマルチプレットの識別のための試料インデックス付与組成物は、細胞識別組成物と称されてもよい。
試料の細胞を複数の集団へと等分することによって、試料の細胞を複数の集団へと分割してもよい。配列決定データにおいて２つ以上の試料インデックス付与配列が付随している「細胞」は、配列決定データにおいて１つの細胞標識配列（例えば、バーコード、例えば、確率論的バーコードの細胞標識配列）が付随している２つ以上の試料インデックス付与配列に基づいて、「マルチプレット」として識別され得る。合わせた「細胞」の配列決定データもまた、本明細書において、マルチプレットと呼ばれる。マルチプレットは、ダブレット、トリプレット、カルテット、クインテット、セクステット、セプテット、オクテット、ノネット、またはそれらの任意の組合せであり得る。マルチプレットは、任意のｎ－プレットであってもよい。一部の実施形態では、ｎは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、もしくはこれらの値のいずれか２つの間の範囲であるか、または約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、もしくはこれらの値のいずれか２つの間の範囲である。一部の実施形態では、ｎは、少なくとも、または最大２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、もしくは２０である。
単一細胞の発現プロファイルを決定する場合、２つの細胞は１つの細胞として識別することができ、２つの細胞の発現プロファイルは、１つの細胞の発現プロファイルとして識別し得る（ダブレット発現プロファイルと称される）。例えば、バーコーディング（例えば、確率論的バーコーディング）を使用して、２つの細胞の発現プロファイルを決定する場合、２つの細胞のｍＲＮＡ分子には、同じ細胞標識を有するバーコードが付随し得る。別の例として、２つの細胞には、１つの粒子（例えば、ビーズ）が付随し得る。粒子は、同じ細胞標識を有するバーコードを含み得る。細胞を溶解させた後、２つの細胞のｍＲＮＡ分子には、粒子のバーコードが付随し、よって、同じ細胞標識が付随し得る。ダブレット発現プロファイルは、発現プロファイルの解釈を歪める場合がある。
ダブレットは、異なる試料インデックス付与配列を有する２つの試料インデックス付与オリゴヌクレオチドが付随している合わせた「細胞」を指し得る。ダブレットはまた、２つの試料インデックス付与配列を有する試料インデックス付与オリゴヌクレオチドが付随している合わせた「細胞」を指し得る。異なる配列の２つの試料インデックス付与オリゴヌクレオチドが付随している２つの細胞（または２つの異なる試料インデックス付与配列を有する試料インデックス付与オリゴヌクレオチドが付随している２つ以上の細胞）が、同じマイクロウェルまたは液滴中に捕捉される場合にダブレットが起こる可能性があり、合わせた「細胞」には、異なる試料インデックス付与配列を有する２つの試料インデックス付与オリゴヌクレオチドが付随し得る。トリプレットは、すべてが異なる試料インデックス付与配列を有する３つの試料インデックス付与オリゴヌクレオチドが付随している合わせた「細胞」、または３つの異なる試料インデックス付与配列を有する試料インデックス付与オリゴヌクレオチドが付随している合わせた「細胞」を指し得る。カルテットは、すべてが異なる試料インデックス付与配列を有する４つの試料インデックス付与オリゴヌクレオチドが付随している合わせた「細胞」、または４つの異なる試料インデックス付与配列を有する試料インデックス付与オリゴヌクレオチドが付随している合わせた「細胞」を指し得る。クインテットは、すべてが異なる試料インデックス付与配列を有する５つの試料インデックス付与オリゴヌクレオチドが付随している合わせた「細胞」、または５つの異なる試料インデックス付与配列を有する試料インデックス付与オリゴヌクレオチドが付随している合わせた「細胞」を指し得る。セクステットは、すべてが異なる試料インデックス付与配列を有する６つの試料インデックス付与オリゴヌクレオチドが付随している合わせた「細胞」、または６つの異なる試料インデックス付与配列を有する試料インデックス付与オリゴヌクレオチドが付随している合わせた「細胞」を指し得る。セプテットは、すべてが異なる試料インデックス付与配列を有する７つの試料インデックス付与オリゴヌクレオチドが付随している合わせた「細胞」、または７つの異なる試料インデックス付与配列を有する試料インデックス付与オリゴヌクレオチドが付随している合わせた「細胞」を指し得る。オクテットは、すべてが異なる試料インデックス付与配列を有する８つの試料インデックス付与オリゴヌクレオチドが付随している合わせた「細胞」、または８つの異なる試料インデックス付与配列を有する試料インデックス付与オリゴヌクレオチドが付随している合わせた「細胞」を指し得る。ノネットは、すべてが異なる試料インデックス付与配列を有する９つの試料インデックス付与オリゴヌクレオチドが付随している合わせた「細胞」、または９つの異なる試料インデックス付与配列を有する試料インデックス付与オリゴヌクレオチドが付随している合わせた「細胞」を指し得る。異なる配列の２つ以上の試料インデックス付与オリゴヌクレオチドが付随している２つ以上の細胞（または２つ以上の異なる試料インデックス付与配列を有する試料インデックス付与オリゴヌクレオチドが付随している２つ以上の細胞）が、同じマイクロウェルまたは液滴中に捕捉される場合にマルチプレットが起こる可能性があり、合わせた「細胞」には、２つ以上の異なる試料インデックス付与配列を有する試料インデックス付与オリゴヌクレオチドが付随し得る。
別の例として、試料をオーバーローディングする状況またはマイクロウェルアレイのマイクロウェルに細胞をロードするかもしくは細胞を含有する液滴を生成する状況であるかに関わらず、本方法は、マルチプレットの識別のために使用することができる。２つ以上の細胞が１つのマイクロウェル中にロードされる場合、合わせた「細胞」（または２つ以上の細胞の内容物）から得られるデータは、異常な遺伝子発現プロファイルを有するマルチプレットである。試料インデックス付与を使用することによって、異なる試料インデックス付与配列を有する２つ以上の試料インデックス付与オリゴヌクレオチド（または２つ以上の試料インデックス付与配列を有する試料インデックス付与オリゴヌクレオチド）に各々が付随しているかまたは割り当てられている細胞標識を探すことにより、これらのマルチプレットの一部を認識することができる。試料インデックス付与配列と共に、本明細書に開示された方法を、マルチプレットの識別のために使用することができる（試料をオーバーローディングするかしないかの状況、またはマイクロウェルアレイのマイクロウェルに細胞をロードするかもしくは細胞を含有する液滴を生成する状況であるかに関わらず）。一部の実施形態では、本方法は、第１の複数の細胞および第２の複数の細胞をそれぞれ２つの試料インデックス付与組成物と接触させることであって、第１の複数の細胞の各々と第２の複数の細胞の各々は、１つまたは複数の細胞成分を含み、２つの試料インデックス付与組成物の各々は、試料インデックス付与オリゴヌクレオチドが付随している細胞成分結合性試薬を含み、細胞成分結合性試薬は、１つまたは複数の細胞成分のうちの少なくとも１つに特異的に結合可能であり、試料インデックス付与オリゴヌクレオチドは、試料インデックス付与配列を含み、かつ２つの試料インデックス付与組成物の試料インデックス付与配列が異なる配列を含む、こと；複数のバーコードを使用して試料インデックス付与オリゴヌクレオチドをバーコーディングして、複数のバーコード化試料インデックス付与オリゴヌクレオチドを生成することであって、複数のバーコードの各々は、細胞標識配列、バーコード配列（例えば、分子標識配列）、および標的結合性領域を含み、複数のバーコードのうちの少なくとも２つのバーコードのバーコード配列は、異なる配列を含み、かつ複数のバーコードのうちの少なくとも２つのバーコードは、同一の細胞標識配列を含む、こと；複数のバーコード化試料インデックス付与オリゴヌクレオチドの配列決定データを得ること；ならびに得られた配列決定データにおいて、各々が２つ以上の試料インデックス付与配列に付随している１つまたは複数のマルチプレット細胞標識配列を識別することを含む。
マイクロウェルカートリッジのマイクロウェルにまたはマイクロフルイディクスデバイスを使用して生成された液滴中にロードされ得る細胞の数は、マルチプレット率によって制限され得る。より多くの細胞をロードすることによって、識別するのが困難で、単一細胞データにおいてノイズを生成し得る、より多くのマルチプレットを引き起こす可能性がある。試料インデックス付与と共に、本方法は、マルチプレットをより正確に標識するかまたは識別し、かつ配列決定データまたは次の分析からマルチプレットを除去するために使用することができる。より高い信頼度でマルチプレットを識別できることによって、マルチプレット率に関するユーザ許容度を増大させることができ、かつ各マイクロウェルカートリッジまたは各々が少なくとも１つの細胞を有する生成中の液滴により多くの細胞をロードすることができる。
一部の実施形態では、第１の複数の細胞および第２の複数の細胞をそれぞれ２つの試料インデックス付与組成物と接触させることは、第１の複数の細胞を２つの試料インデックス付与組成物のうちの第１の試料インデックス付与組成物と接触させること；および第１の複数の細胞を２つの試料インデックス付与組成物のうちの第２の試料インデックス付与組成物と接触させることを含む。複数の細胞の数および複数の試料インデックス付与組成物の数は、異なるインプリメンテーションにおいて異なっていてもよい。一部の実施形態では、複数の細胞および／または試料インデックス付与組成物の数は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１００００、１０００００、１００００００種、もしくはこれらの値のいずれか２つの間の数もしくは範囲であってもよく、または約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１００００、１０００００、１００００００種、もしくはこれらの値のいずれか２つの間の数もしくは範囲であってもよい。一部の実施形態では、複数の細胞および／または試料インデックス付与組成物の数は、少なくとも、または最大２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１００００、１０００００、もしくは１００００００種であってもよい。細胞の数は、異なるインプリメンテーションにおいて異なっていてもよい。一部の実施形態では、細胞の数、または平均数は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１００００、１０００００、１００００００個、もしくはこれらの値のいずれか２つの間の数もしくは範囲であってもよく、または約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１００００、１０００００、１００００００個、もしくはこれらの値のいずれか２つの間の数もしくは範囲であってもよい。一部の実施形態では、細胞の数、または平均数は、少なくとも、または最大２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１００００、１０００００、もしくは１００００００個であってもよい。
一部の実施形態では、本方法は、２つの試料インデックス付与組成物のうちの未結合試料インデックス付与組成物を除去することを含む。未結合試料インデックス付与組成物を除去することは、第１の複数の細胞および第２の複数の細胞のうちの細胞を洗浄緩衝液で洗浄することを含み得る。未結合試料インデックス付与組成物を除去することは、フローサイトメトリーを使用して２つの試料インデックス付与組成物のうちの少なくとも１つの細胞成分結合性試薬に結合した細胞を選択することを含み得る。一部の実施形態では、本方法は、複数の試料の各々に由来する１つまたは複数の細胞を溶解することを含む。
一部の実施形態では、試料インデックス付与オリゴヌクレオチドは、細胞成分結合性試薬から脱離可能であるかまたは脱離不可能であるように構成される。本方法は、細胞成分結合性試薬から試料インデックス付与オリゴヌクレオチドを脱離させることを含み得る。試料インデックス付与オリゴヌクレオチドを脱離させることは、ＵＶ光切断、化学処理（例えば、ジチオトレイトールなどの還元試薬を使用する）、加熱、酵素処理、またはそれらの任意の組合せによって、細胞成分結合性試薬から試料インデックス付与オリゴヌクレオチドを脱離させることを含み得る。
一部の実施形態では、複数のバーコードを使用して試料インデックス付与オリゴヌクレオチドをバーコーディングすることは、複数のバーコードを、試料インデックス付与オリゴヌクレオチドと接触させて、試料インデックス付与オリゴヌクレオチドにハイブリダイズしたバーコードを生成すること；および試料インデックス付与オリゴヌクレオチドにハイブリダイズしたバーコードを伸長して、複数のバーコード化試料インデックス付与オリゴヌクレオチドを生成することを含む。バーコードを伸長することは、ＤＮＡポリメラーゼを使用してバーコードを伸長して、複数のバーコード化試料インデックス付与オリゴヌクレオチドを生成することを含み得る。バーコードを伸長することは、逆転写酵素を使用してバーコードを伸長して、複数のバーコード化試料インデックス付与オリゴヌクレオチドを生成することを含み得る。
一部の実施形態では、本方法は、複数のバーコード化試料インデックス付与オリゴヌクレオチドを増幅して、複数のアンプリコンを生成することを含む。複数のバーコード化試料インデックス付与オリゴヌクレオチドを増幅することは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して、バーコード配列（例えば、分子標識配列）の少なくとも一部および試料インデックス付与オリゴヌクレオチドの少なくとも一部を増幅することを含み得る。一部の実施形態では、複数のバーコード化試料インデックス付与オリゴヌクレオチドの配列決定データを得ることは、複数のアンプリコンの配列決定データを得ることを含み得る。配列決定データを得ることは、バーコード配列の少なくとも一部および試料インデックス付与オリゴヌクレオチドの少なくとも一部を配列決定することを含む。一部の実施形態では、少なくとも１つの細胞の試料起源の識別は、少なくとも１つのバーコード化試料インデックス付与オリゴヌクレオチドの試料インデックス付与配列に基づいて、複数のバーコード化標的の試料起源を識別することを含む。
一部の実施形態では、複数のバーコードを使用して試料インデックス付与オリゴヌクレオチドをバーコーディングして複数のバーコード化試料インデックス付与オリゴヌクレオチドを生成することは、複数の確率論的バーコードを使用して、試料インデックス付与オリゴヌクレオチドを確率論的にバーコーディングして、複数の確率論的バーコード化試料インデックス付与オリゴヌクレオチドを生成することを含む。
一部の実施形態では、本方法は、複数のバーコードを使用して細胞の複数の標的をバーコーディングして、複数のバーコード化標的を生成することであって、複数のバーコードの各々は、細胞標識配列を含み、複数のバーコードのうちの少なくとも２つのバーコードは、同一の細胞標識配列を含む、こと；およびバーコード化標的の配列決定データを得ることを含む。複数のバーコードを使用して複数の標的をバーコーディングして、複数のバーコード化標的を生成することは、標的のコピーをバーコードの標的結合性領域と接触させること；および複数のバーコードを使用して複数の標的を逆転写して、複数の逆転写標的を生成することを含み得る。
一部の実施形態では、本方法は、複数のバーコード化標的の配列決定データを得る前に、バーコード化標的を増幅して複数の増幅されたバーコード化標的を生成することを含む。バーコード化標的を増幅して複数の増幅されたバーコード化標的を生成することは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によってバーコード化標的を増幅することを含み得る。複数のバーコードを使用して細胞の複数の標的をバーコーディングして、複数のバーコード化標的を生成することは、複数の確率論的バーコードを使用して、細胞の複数の標的を確率論的にバーコーディングして、複数の確率論的バーコード化標的を生成することを含み得る。
一部の実施形態では、細胞を識別するための方法は、第１の複数の１つまたは複数の細胞および第２の複数の１つまたは複数の細胞をそれぞれ２つの細胞識別組成物と接触させることであって、第１の複数の１つまたは複数の細胞の各々と第２の複数の１つまたは複数の細胞の各々は、１つまたは複数の細胞成分を含み、２つの細胞識別組成物の各々は、細胞識別オリゴヌクレオチドが付随している細胞成分結合性試薬を含み、細胞成分結合性試薬は、１つまたは複数の細胞成分のうちの少なくとも１つに特異的に結合することが可能であり、細胞識別オリゴヌクレオチドは、細胞識別配列を含み、２つの細胞識別組成物の細胞識別配列は異なる配列を含む、こと；複数のバーコードを使用して細胞識別オリゴヌクレオチドをバーコーディングして、複数のバーコード化細胞識別オリゴヌクレオチドを生成することであって、複数のバーコードの各々は、細胞標識配列、バーコード配列（例えば、分子標識配列）、および標的結合性領域を含み、複数のバーコードのうちの少なくとも２つのバーコードのバーコード配列は、異なる配列を含み、複数のバーコードのうちの少なくとも２つのバーコードは、同一の細胞標識配列を含む、こと；複数のバーコード化細胞識別オリゴヌクレオチドの配列決定データを得ること；ならびに得られた配列決定データにおいて、各々に２つ以上の細胞識別配列が付随している１つまたは複数の細胞標識配列を識別すること；ならびに得られた配列決定データから、各々に２つ以上の細胞識別配列が付随している１つまたは複数の細胞標識配列に関連した配列決定データを除去し、および／または次の分析（例えば、単一細胞ｍＲＮＡプロファイリング、または全トランスクリプトーム分析）から、各々に２つ以上の細胞識別配列が付随している１つまたは複数の細胞標識配列に関連した配列決定データを除くことを含む。一部の実施形態では、細胞識別オリゴヌクレオチドは、バーコード配列（例えば、分子標識配列）、ユニバーサルプライマーに対する結合部位、またはそれらの組合せを含む。
異なる配列の２つ以上の細胞識別オリゴヌクレオチドが付随している２つ以上の細胞（または２つ以上の異なる細胞識別配列を有する細胞識別オリゴヌクレオチドが付随している２つ以上の細胞）が、同じマイクロウェルまたは液滴中で捕捉される場合にマルチプレット（例えば、ダブレット、トリプレットなど）が起こる可能性があり、合わせた「細胞」には、２つ以上の異なる細胞識別配列を有する細胞識別オリゴヌクレオチドが付随し得る。
細胞をオーバーローディングする状況またはマイクロウェルアレイのマイクロウェルに細胞をローディングするかもしくは細胞を含有する液滴を生成する状況であるかに関わらず、細胞識別組成物をマルチプレット識別のために使用することができる。２つ以上の細胞が１つのマイクロウェル中にロードされる場合、合わせた「細胞」（または２つ以上の細胞の内容物）から得られるデータは、異常な遺伝子発現プロファイルを有するマルチプレットである。細胞識別を使用することによって、異なる細胞識別配列を有する２つ以上の細胞識別オリゴヌクレオチド（または２つ以上の細胞識別配列を有する細胞識別オリゴヌクレオチド）が各々に付随しているか、または割り当てられている細胞標識（例えば、確率論的バーコードなどのバーコードの細胞標識）を探すことによって、これらのマルチプレットの一部を認識することができる。細胞識別配列と共に、本明細書に開示された方法を、マルチプレットの識別のために使用することができる（試料をオーバーローディングするかしないかの状況、またはマイクロウェルアレイのマイクロウェルに細胞をロードするかもしくは細胞を含有する液滴を生成する状況であるかに関わらず）。一部の実施形態では、本方法は、第１の複数の１つまたは複数の細胞および第２の複数の１つまたは複数の細胞をそれぞれ２つの細胞識別組成物と接触させることであって、第１の複数の１つまたは複数の細胞の各々と第２の複数の１つまたは複数の細胞の各々は、１つまたは複数の細胞成分を含み、２つの細胞識別組成物の各々は、細胞識別オリゴヌクレオチドが付随している細胞成分結合性試薬を含み、細胞成分結合性試薬は、１つまたは複数の細胞成分のうちの少なくとも１つに特異的に結合することが可能であり、細胞識別オリゴヌクレオチドは、細胞識別配列を含み、２つの細胞識別組成物の細胞識別配列は異なる配列を含む、こと；複数のバーコードを使用して細胞識別オリゴヌクレオチドをバーコーディングして、複数のバーコード化細胞識別オリゴヌクレオチドを生成することであって、複数のバーコードの各々は、細胞標識配列、バーコード配列（例えば、分子標識配列）、および標的結合性領域を含み、複数のバーコードのうちの少なくとも２つのバーコードのバーコード配列は、異なる配列を含み、複数のバーコードのうちの少なくとも２つのバーコードは、同一の細胞標識配列を含む、こと；複数のバーコード化細胞識別オリゴヌクレオチドの配列決定データを得ること；ならびに得られた配列決定データにおいて、各々に２つ以上の細胞識別配列が付随している１つまたは複数のマルチプレット細胞標識配列を識別することを含む。
マイクロウェルカートリッジのマイクロウェルにまたはマイクロフルイディクスデバイスを使用して生成された液滴中にロードされ得る細胞の数は、マルチプレット率によって制限され得る。より多くの細胞をロードすることによって、識別するのが困難で、単一細胞データにおいてノイズを生成し得る、より多くのマルチプレットを引き起こす可能性がある。細胞識別と共に、本方法は、マルチプレットをより正確に標識するかまたは識別し、かつ配列決定データまたは次の分析からマルチプレットを除去するために使用することができる。より高い信頼度でマルチプレットを識別できることによって、マルチプレット率に関するユーザ許容度を増大させることができ、かつ各マイクロウェルカートリッジまたは各々が少なくとも１つの細胞を有する生成中の液滴により多くの細胞をロードすることができる。
一部の実施形態では、第１の複数の１つまたは複数の細胞および第２の複数の１つまたは複数の細胞をそれぞれ２つの細胞識別組成物と接触させることは、第１の複数の１つまたは複数の細胞を２つの細胞識別組成物のうちの第１の細胞識別組成物と接触させること；および第１の複数の１つまたは複数の細胞を２つの細胞識別組成物のうちの第２の細胞識別組成物と接触させることを含む。複数の細胞識別組成物の数は、異なるインプリメンテーションにおいて異なっていてもよい。一部の実施形態では、細胞識別組成物の数は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１００００、１０００００、１００００００種、もしくはこれらの値のいずれか２つの間の数もしくは範囲であってもよく、または約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１００００、１０００００、１００００００種、もしくはこれらの値のいずれか２つの間の数もしくは範囲であってもよい。一部の実施形態では、細胞識別組成物の数は、少なくとも、または最大２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１００００、１０００００、もしくは１００００００種であってもよい。複数の１つまたは複数の細胞の各々における細胞の数、または平均数は、異なるインプリメンテーションにおいて異なっていてもよい。一部の実施形態では、複数の１つまたは複数の細胞の各々における細胞の数、または平均数は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１００００、１０００００、１００００００個、もしくはこれらの値のいずれか２つの間の数もしくは範囲であってもよく、または約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１００００、１０００００、１００００００個、もしくはこれらの値のいずれか２つの間の数もしくは範囲であってもよい。一部の実施形態では、複数の１つまたは複数の細胞の各々における細胞の数、または平均数は、少なくとも、または最大２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１００００、１０００００、もしくは１００００００個であってもよい。
一部の実施形態では、本方法は、２つの細胞識別組成物のうちの未結合細胞識別組成物を除去することを含む。未結合細胞識別組成物を除去することは、第１の複数の１つまたは複数の細胞および第２の複数の１つまたは複数の細胞の細胞を洗浄緩衝液で洗浄することを含み得る。未結合細胞識別組成物を除去することは、フローサイトメトリーを使用して２つの細胞識別組成物のうちの少なくとも１つの細胞成分結合性試薬に結合した細胞を選択することを含み得る。一部の実施形態では、本方法は、複数の試料の各々に由来する１つまたは複数の細胞を溶解することを含む。
一部の実施形態では、細胞識別オリゴヌクレオチドは、細胞成分結合性試薬から脱離可能であるかまたは脱離不可能であるように構成される。本方法は、細胞成分結合性試薬から細胞識別オリゴヌクレオチドを脱離させることを含み得る。細胞識別オリゴヌクレオチドを脱離させることは、ＵＶ光切断、化学処理（例えば、ジチオトレイトールなどの還元試薬を使用する）、加熱、酵素処理、またはそれらの任意の組合せによって、細胞成分結合性試薬から細胞識別オリゴヌクレオチドを脱離させることを含み得る。
一部の実施形態では、複数のバーコードを使用して細胞識別オリゴヌクレオチドをバーコーディングすることは、複数のバーコードを、細胞識別オリゴヌクレオチドと接触させて、細胞識別オリゴヌクレオチドにハイブリダイズしたバーコードを生成すること；および細胞識別オリゴヌクレオチドにハイブリダイズしたバーコードを伸長して、複数のバーコード化細胞識別オリゴヌクレオチドを生成することを含む。バーコードを伸長することは、ＤＮＡポリメラーゼを使用してバーコードを伸長して、複数のバーコード化細胞識別オリゴヌクレオチドを生成することを含み得る。バーコードを伸長することは、逆転写酵素を使用してバーコードを伸長して、複数のバーコード化細胞識別オリゴヌクレオチドを生成することを含み得る。
一部の実施形態では、本方法は、複数のバーコード化細胞識別オリゴヌクレオチドを増幅して、複数のアンプリコンを生成することを含む。複数のバーコード化細胞識別オリゴヌクレオチドを増幅することは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して、バーコード配列（例えば、分子標識配列）の少なくとも一部および細胞識別オリゴヌクレオチドの少なくとも一部を増幅することを含み得る。一部の実施形態では、複数のバーコード化細胞識別オリゴヌクレオチドの配列決定データを得ることは、複数のアンプリコンの配列決定データを得ることを含み得る。配列決定データを得ることは、バーコード配列の少なくとも一部および細胞識別オリゴヌクレオチドの少なくとも一部を配列決定することを含む。一部の実施形態では、少なくとも１つの細胞の試料起源の識別は、少なくとも１つのバーコード化細胞識別オリゴヌクレオチドの細胞識別配列に基づいて、複数のバーコード化標的の試料起源を識別することを含む。
一部の実施形態では、複数のバーコードを使用して細胞識別オリゴヌクレオチドをバーコーディングして複数のバーコード化細胞識別オリゴヌクレオチドを生成することは、複数の確率論的バーコードを使用して、細胞識別オリゴヌクレオチドを確率論的にバーコーディングして、複数の確率論的バーコード化細胞識別オリゴヌクレオチドを生成することを含む。
ランダムプライミングおよび伸長による全トランスクリプトーム解析（ＷＴＡ）
本明細書における開示は、適合する配列決定装置（例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）配列決定装置）で配列決定するために、ｃＤＮＡ産物（例えば、ＢＤ Ｒｈａｐｓｏｄｙ単一細胞分析系のｃＤＮＡ産物）から全トランスクリプトーム解析（ＷＴＡ）ライブラリーを生成するための方法を含む。現在、標準的なＢＤ Ｒｈａｐｓｏｄｙ ＲＮＡワークフローでは、まずＢＤ Ｒｈａｐｓｏｄｙ細胞捕捉ビーズ（以降、「ビーズ」と呼ぶ）での３’捕捉およびｃＤＮＡ合成によりＲＮＡトランスクリプトームを捕捉し、続いて２回の多重化ネステッドＰＣＲ増幅を行って目的のＲＮＡ標的を富化する（標的化アッセイ）。この方法の一部の実施形態では、標的化ＲＮＡ分析は、一般に、低発現標的に対してより高い感度をもたらすが、ＷＴＡ ＲＮＡ分析は、より広い範囲の遺伝子の調査を提供する。一部の実施形態では、所望の標的の増幅を成功させるには、目的のモデル系における各ＲＮＡの３’末端およびそのポリアデニル化部位の使用の十分な理解が必要となる場合がある。例えば、ＢＤ Ｒｈａｐｓｏｄｙを共に使用するＷＴＡ法は、いくつかのレベルの情報の取得を可能にし、１）モデル系において興味深いＲＮＡ標的を識別して、設計しようとする１パネルの遺伝子を識別すること；２）モデル系におけるトランスクリプトームの３’末端を、ＢＤ Ｒｈａｐｓｏｄｙの新世代ＰＣＲパネル設計への入力として特徴付けること；および３）標準的なＢＤ Ｒｈａｐｓｏｄｙ標的化手法と比較してより幅広い遺伝子をアッセイすることにより、ユーザが発見生物学（ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｂｉｏｌｏｇｙ）を行うことを可能にすることを含む。
図８は、単一細胞の全トランスクリプトーム解析（ＷＴＡ）を実施するための非限定的な例示的ワークフロー８００の略図である。ブロック８０４における単一細胞捕捉では、マイクロウェル（ＲｈａｐｓｏｄｙもしくはＩＣＥＬＬ８など）または液滴（ｄｒｏｐｓｅｑ、ｄｄｓｅｑなど）を使用することができる。ブロック８０８におけるｃＤＮＡ合成は、逆転写および第二鎖合成を含んでいてもよく、その後、ブロック８１２における末端修復およびアダプターのライゲーションによる無バイアス様式での５’アダプターの付加が続いてもよい。一部の実施形態では、ブロック８０８およびブロック８１２は、アダプターを付加するための鋳型スイッチの使用による逆転写を含んでいてもよい。ブロック８１４での全トランスクリプトームの増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を含んでいてもよい。ブロック８１６における配列決定（例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ配列決定）用の短いインサートの生成は、ランダムプライミングおよび伸長、それに続くＰＣＲを含んでいてもよい。ブロック８１６は、一部の実施形態では、断片化、末端修復、およびライゲーション、それに続くＰＣＲを含んでいてもよい。
図９は、単一細胞のライゲーションに基づく全トランスクリプトーム解析を実施するための非限定的な例示的ワークフローの略図である。この方法は、バーコード（例えば、各々がユニバーサル配列（Ｕｎｉｖ）、固有分子インデックス（ＵＭＩ）、細胞標識（ＣＬ）、およびオリゴ（ｄＴ）配列を有するバーコード）を使用した逆転写、第二鎖合成、末端調製、全長ｃＤＮＡ増幅、ランダムプライミング、および次いで配列決定ライブラリー増幅を実施することを含んでいてもよい。
本明細書に記載のように、過去に開示されたＷＴＡ法の主な課題は、ＰＣＲ収量が低いため、ビーズを含んだままＷＴＡ ＰＣＲ増幅を達成しなければならないことである。本明細書で開示される新しいＲＰＥに基づくＷＴＡ手法では、例えば、一部の実施形態では、置換ランダムプライミングおよびＤＮＡポリメラーゼ伸長により、ビーズ上でＷＴＡ ＰＣＲを行う必要性を回避することができる。
図１０および図１１Ａは、ランダムプライミングおよびプライマー伸長（ＲＰＥ）を使用して、単一細胞の全トランスクリプトーム解析を効率的に（例えば、他の全トランスクリプトーム解析方法と比較してより短い時間で）実施するための非限定的な例示的ワークフローの略図である。この方法は、バーコード（例えば、各々がユニバーサル配列（「Ｕｎｉｖ」、例えば、リード１（Ｒ１））、固有分子インデックス（ＵＭＩ）、細胞標識（ＣＬ）、およびオリゴ（ｄＴ）配列）を使用する逆転写、第一鎖ｃＤＮＡ合成、ランダムプライミング（例えば、Ｕｎｉｖ（例えば、リード２（Ｒ２））を含むランダマーを使用して）、およびランダムプライマー伸長を実施することを含んでいてもよい。ランダムプライマーは、すべての転写物のコード配列に沿って異なる位置に結合し、伸長して伸長産物（例えば、線形増幅産物）を生成することができる。伸長産物は、ランダムプライマーの結合部位に応じて様々な長さのｃＤＮＡを含むことができる。伸長産物は、配列決定ライブラリー増幅プライマーで増幅することができる。ワークフローは、単一のＰＣＲ増幅（図１０に示されているような）または２ラウンドもしくはそれよりも多くのラウンドのＰＣＲ増幅（図１１Ａに示されているように、ＰＣＲ１、それに続くＰＣＲ２（「インデックスＰＣＲ」）など）を含んでいてもよい。配列決定ライブラリー増幅は、突出を介して配列決定アダプターおよび／またはライブラリーインデックスを付加するライブラリーフォワードおよびリバースプライマーの使用を含んでいてもよい。ライブラリー増幅は、ライブラリーフォワードプライマーおよびライブラリーリバースプライマーの突出を介して、配列決定アダプター（例えば、Ｐ５およびＰ７配列）および試料インデックス（例えば、ｉ５、ｉ７）を付加することができる。ライブラリーアンプリコンを配列決定し、本開示の下流の方法に供することができる。１５０ｂｐ×２個の配列決定リードを生成するために使用するペアエンド配列決定は、リード１の細胞標識、固有分子インデックス、ポリ（Ａ）テイル、および／または遺伝子（もしくは遺伝子の部分配列）、リード２の遺伝子（もしくは遺伝子の部分配列）および／またはポリ（Ａ）テイル、ならびにインデックス１リードの試料インデックスを明らかにすることができる。確率論的バーコードを使用して全トランスクリプトームを増幅するための方法、組成物、系、デバイス、およびキットは、例えば、米国特許出願公開第２０１６／０３１２２７６号明細書に以前に開示されており、その内容は、参照によりその全体が本明細書に明示的に組み込まれる。
図１１Ｂは、ランダムプライミングおよびプライマー伸長を使用して全トランスクリプトーム解析を実施するための非限定的な例示的プロセスである。ブロック１１０４における細胞捕捉、逆転写、および未使用のプライマーを除去するためのＥｘｏＩ処理では、プロセスのパラメータとしては、ビーズを再利用することができるか否か、またはビーズが他の分析方法と適合性であるか否かが挙げられる。このような分析方法としては、オリゴヌクレオチドが付随している（例えば、コンジュゲートされている）抗体（「ＡｂＯ」）を用いて試料のインデックス付与、追跡、または多重化を行うこと、オリゴヌクレオチドが付随している抗体を用いて単一細胞タンパク質発現プロファイリングを行うこと（本明細書では「ＡｂＳｅｑ」とも呼ばれる）、標的化単一細胞分析法（例えば、ＢＤ Ｒｈａｐｓｏｄｙ（商標）標的化アッセイ）、および５’転写物配列を決定するための方法（例えば、細胞のＶ（Ｄ）Ｊ領域の配列を決定するための方法）が挙げられる。ＡｂＯを使用して、単一細胞のタンパク質発現プロファイルを決定し、試料を追跡する（例えば、試料起源を追跡する）実施形態は、米国特許出願公開第２０１８／００８８１１２号明細書として公開されている米国特許出願第１５／７１５，０２８号明細書、および米国特許出願第１５／９３７，７１３号明細書に記載されている。これら文献の各々の内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。５’転写物配列を決定する実施形態は、米国特許出願第６２／７３９，７９５号明細書に記載されている。この文献の内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。ブロック１１０８におけるランダムプライミング伸長では、プロセスのパラメータとしては、１ｕＬ当たりのビーズ数、使用するポリメラーゼ、反応の長さ、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の濃度、およびＡｍｐｕｒｅクリーンアップ条件が挙げられる。ブロック１１１４におけるＰＣＲ１およびクリーンアップでは、プロセスのパラメータとしては、使用するポリメラーゼ、大型細胞または小型細胞のサイクル数、Ａｍｐｕｒｅクリーンアップ条件、および品質管理（ＱＣ）方法が挙げられる。ブロック１１１６におけるインデックスＰＣＲおよびクリーンアップでは、プロセスのパラメータとしては、使用するポリメラーゼ、ＰＣＲ入力量、Ａｍｐｕｒｅクリーンアップ条件、および品質管理方法が挙げられる。
本明細書における開示は、試料中の核酸標的を標識するための方法を含む。一部の実施形態では、本方法は、核酸標的のコピーを複数のオリゴヌクレオチドバーコードと接触させることであって、各オリゴヌクレオチドバーコードは、第１のユニバーサル配列、分子標識、および核酸標的のコピーにハイブリダイズすることが可能な標的結合性領域を含む、こと；核酸標的のコピーにハイブリダイズした複数のオリゴヌクレオチドバーコードを伸長して、複数の第一鎖バーコード化ポリヌクレオチドを生成すること；ランダムプライマーを複数の第一鎖バーコード化ポリヌクレオチドと接触させることであって、ランダムプライマーの各々は、第２のユニバーサル配列またはその相補体を含む、こと；ならびに複数の第一鎖バーコード化ポリヌクレオチドにハイブリダイズしたランダムプライマーを伸長して、複数の伸長産物を生成することを含む。第一鎖バーコード化ポリヌクレオチドは、バーコード化デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）分子、バーコード化リボ核酸（ＲＮＡ）分子、または両方を含んでいてもよい。ランダムプライミングおよび伸長のサイクル数は、インプリメンテーションが異なれば異なっていてもよい。一部の実施形態では、ランダムプライミングおよび伸長のサイクル数は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、６０、７０、８０、９０、１００サイクルのランダムプライミングおよび伸長を含んでいてもよく、もしくは約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、６０、７０、８０、９０、１００サイクルのランダムプライミングおよび伸長を含んでいてもよく、またはこうした値の任意の２つの間の数もしくは範囲のサイクルのランダムプライミングおよび伸長を含んでいてもよい。一部の実施形態では、ランダムプライミングおよび伸長のサイクル数は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、６０、７０、８０、９０、もしくは１００サイクルのランダムプライミングおよび伸長を含んでいてもよく、または最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、６０、７０、８０、９０、もしくは１００サイクルのランダムプライミングおよび伸長を含んでいてもよい。
本方法は、第１のユニバーサル配列またはその相補体にハイブリダイズすることが可能なプライマー、および第２のユニバーサル配列またはその相補体にハイブリダイズすることが可能なプライマーを使用して複数の伸長産物を増幅し、それにより第１の複数のバーコード化アンプリコンを生成することを含んでいてもよい。増幅（例えば、線形増幅、ＰＣＲ増幅）のサイクル数は、インプリメンテーションが異なれば異なっていてもよい。一部の実施形態では、増幅は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、６０、７０、８０、９０、１００サイクルの増幅を含んでいてもよく、もしくは約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、６０、７０、８０、９０、１００サイクルの増幅を含んでいてもよく、またはこうした値の任意の２つの間の数もしくは範囲のサイクルの増幅を含んでいてもよい。一部の実施形態では、線形増幅は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、６０、７０、８０、９０、もしくは１００サイクルの増幅を含んでいてもよく、または最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、６０、７０、８０、９０、もしくは１００サイクルの増幅を含んでいてもよい。第１の複数のバーコード化アンプリコンは、単一細胞のｍＲＮＡの少なくとも１０％に相当してもよい。第１の複数のバーコード化アンプリコンは、単一細胞のｍＲＮＡの少なくとも５０％に相当してもよい。第１の複数のバーコード化アンプリコンは、単一細胞のｍＲＮＡの少なくとも９０％に相当してもよい。一部の実施形態では、第１の複数のバーコード化アンプリコンは、単一細胞のｍＲＮＡの少なくとも５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、またはこうした値の任意の２つの間の数値もしくは範囲に相当してもよい。第１の複数のバーコード化アンプリコンは、全トランスクリプトーム増幅（ＷＴＡ）産物を含んでいてもよい。複数の伸長産物の増幅は、配列決定プライマーおよび／もしくは配列決定アダプターの結合部位の配列、それらの相補配列、ならびに／またはそれらの一部を、複数の伸長産物に付加することを含んでいてもよい。本方法は、第１の複数のバーコード化アンプリコンまたはそれらの産物に付随している別個の配列を有する分子標識の数に基づき、試料中の核酸標的のコピー数を決定することを含んでいてもよい。一部の実施形態では、複数の伸長産物の増幅は、固体支持体の存在下では実施されない。一部の実施形態では、本方法は、ＲＮａｓｅＨ誘導性プライミング、末端修復、および／またはアダプターライゲーションを含まない。一部の実施形態では、本方法は、断片化、タグ付け、または両方を含まない。
本明細書における開示は、試料中の各酸標的の数を決定するための方法を含む。一部の実施形態では、本方法は、核酸標的のコピーを複数のオリゴヌクレオチドバーコードと接触させることであって、各オリゴヌクレオチドバーコードは、第１のユニバーサル配列、分子標識、および核酸標的のコピーにハイブリダイズすることが可能な標的結合性領域を含む、こと；核酸標的のコピーにハイブリダイズした複数のオリゴヌクレオチドバーコードを伸長して、複数の第一鎖バーコード化ポリヌクレオチドを生成すること；ランダムプライマーを複数の第一鎖バーコード化ポリヌクレオチドと接触させることであって、ランダムプライマーの各々は、第２のユニバーサル配列またはその相補体を含む、こと；複数の第一鎖バーコード化ポリヌクレオチドにハイブリダイズしたランダムプライマーを伸長して、複数の伸長産物を生成すること；第１のユニバーサル配列またはその相補体にハイブリダイズすることが可能なプライマー、および第２のユニバーサル配列またはその相補体にハイブリダイズすることが可能なプライマーを使用して複数の伸長産物を増幅し、それにより第１の複数のバーコード化アンプリコンを生成すること；ならびに第１の複数のバーコード化アンプリコンまたはそれらの産物に付随している別個の配列を有する分子標識の数に基づき、試料中の核酸標的のコピー数を決定することを含む。
一部の実施形態では、核酸標的のコピーの接触は、複数の核酸標的のコピーを複数のオリゴヌクレオチドバーコードと接触させることを含み、複数のオリゴヌクレオチドバーコードの伸長は、複数の核酸標的のコピーにハイブリダイズした複数のオリゴヌクレオチドバーコードを伸長して、複数の第一鎖バーコード化ポリヌクレオチドを生成することを含み、試料中の核酸標的のコピー数の決定は、複数の核酸標的の各々の配列を含む第１の複数のバーコード化アンプリコンのうちのバーコード化アンプリコンに付随している別個の配列を有する分子標識の数に基づき、試料中の複数の核酸標的の各々の数を決定することを含む。複数の核酸標的の各々の配列は、複数の核酸標的の各々の部分配列を含んでいてもよい。第１の複数のバーコード化アンプリコン中の核酸標的の配列は、核酸標的の部分配列を含んでいてもよい。
本方法は、第１のユニバーサル配列またはその相補体にハイブリダイズすることが可能なプライマー、および第２のユニバーサル配列またはその相補体にハイブリダイズすることが可能なプライマーを使用して第１の複数のバーコード化アンプリコンを増幅し、それにより第２の複数のバーコード化アンプリコンを生成することを含んでいてもよい。本方法は、第１のユニバーサル配列またはその相補体にハイブリダイズすることが可能なプライマー、および第２のユニバーサル配列またはその相補体にハイブリダイズすることが可能なプライマーを使用して複数の伸長産物を増幅し、それにより第１の複数のバーコード化アンプリコンを生成することを含んでいてもよい。増幅（例えば、線形増幅、ＰＣＲ増幅）のサイクル数は、インプリメンテーションが異なれば異なっていてもよい。一部の実施形態では、増幅は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、６０、７０、８０、９０、１００サイクルの増幅を含んでいてもよく、もしくは約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、６０、７０、８０、９０、１００サイクルの増幅を含んでいてもよく、またはこうした値の任意の２つの間の数もしくは範囲のサイクルの増幅を含んでいてもよい。一部の実施形態では、線形増幅は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、６０、７０、８０、９０、もしくは１００サイクルの増幅を含んでいてもよく、または最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、６０、７０、８０、９０、もしくは１００サイクルの増幅を含んでいてもよい。第２の複数のバーコード化アンプリコンは、単一細胞のｍＲＮＡの少なくとも１０％、単一細胞のｍＲＮＡの少なくとも５０％、または単一細胞のｍＲＮＡの少なくとも９０％に相当してもよい。一部の実施形態では、第２の複数のバーコード化アンプリコンは、単一細胞のｍＲＮＡの少なくとも５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、またはこうした値の任意の２つの間の数値もしくは範囲に相当してもよい。第２の複数のバーコード化アンプリコンは、全トランスクリプトーム増幅（ＷＴＡ）産物を含んでいてもよい。第１の複数のバーコード化アンプリコンの増幅は、配列決定プライマーおよび／もしくは配列決定アダプターの結合部位の配列、それらの相補配列、ならびに／またはそれらの一部を、第１の複数のバーコード化アンプリコンに付加することを含んでいてもよい。
本方法は、第２の複数のバーコード化アンプリコンまたはそれらの産物に付随している別個の配列を有する分子標識の数に基づき、試料中の核酸標的のコピー数を決定することを含んでいてもよい。一部の実施形態では、核酸標的のコピーの接触は、複数の核酸標的のコピーを複数のオリゴヌクレオチドバーコードと接触させることを含み、複数のオリゴヌクレオチドバーコードの伸長は、複数の核酸標的のコピーにハイブリダイズした複数のオリゴヌクレオチドバーコードを伸長して、複数の第一鎖バーコード化ポリヌクレオチドを生成することを含み、および／または試料中の核酸標的のコピー数の決定は、複数の核酸標的の各々の配列を含む第２の複数のバーコード化アンプリコンのうちのバーコード化アンプリコンに付随している別個の配列を有する分子標識の数に基づき、試料中の複数の核酸標的の各々の数を決定することを含む。複数の核酸標的の各々の配列は、複数の核酸標的の各々の部分配列を含んでいてもよい。第２の複数のバーコード化アンプリコン中の核酸標的の配列は、核酸標的の部分配列を含んでいてもよい。
第１の複数のバーコード化アンプリコンおよび／または第２の複数のバーコード化アンプリコンの１つ１つは、第１のユニバーサル配列、第２のユニバーサル配列、または両方の少なくとも一部分を含んでいてもよい。第１のユニバーサル配列および第２のユニバーサル配列は同じであってもよく、または異なっていてもよい。第１のユニバーサル配列および／または第２のユニバーサル配列は、配列決定プライマーおよび／もしくは配列決定アダプターの結合部位、それらの相補配列、ならびに／またはそれらの一部を含んでいてもよい。配列決定アダプターは、Ｐ５配列、Ｐ７配列、それらの相補配列、および／またはそれらの一部を含んでいてもよい。配列決定プライマーは、リード１配列決定プライマー、リード２配列決定プライマー、それらの相補配列、および／またはそれらの一部を含んでいてもよい。
ランダムプライマーは、ヌクレオチドのランダム配列を含んでいてもよい。ヌクレオチドのランダム配列は、約４～約３０ヌクレオチド長であってもよい。一部の実施形態では、前記ヌクレオチドのランダム配列は、６または９ヌクレオチド長である。ヌクレオチドのランダム配列は、インプリメンテーションが異なれば異なる長さを有してもよい。一部の実施形態では、ランダムプライマー内のヌクレオチドのランダム配列は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００ヌクレオチド長であるか、もしくは約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００ヌクレオチド長であるか、またはこうした値の任意の２つの間の数値もしくは範囲のヌクレオチド長である。一部の実施形態では、ランダムプライマー内のヌクレオチドのランダム配列は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００ヌクレオチド長であるか、または最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００ヌクレオチド長である。ランダムプライマーは、インプリメンテーションが異なれば、ランダムプライミングステップ中の濃度が異なっていてもよい。一部の実施形態では、ランダムプライマーは、ランダムプライミング中の濃度が、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１２８ｕＭであるか、もしくは最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１２８ｕＭであるか、またはこうした値の任意の２つの間の数値もしくは範囲のｕＭである。
核酸標的のコピーにハイブリダイズした複数のオリゴヌクレオチドバーコードの伸長は、逆転写酵素（例えば、ウイルス逆転写酵素）を使用して、核酸標的のコピーにハイブリダイズした複数のオリゴヌクレオチドバーコードを伸長することを含んでいてもよい。核酸標的のコピーにハイブリダイズした複数のオリゴヌクレオチドバーコードの伸長は、５’から３’のエキソヌクレアーゼ活性および３’から５’のエキソヌクレアーゼ活性のうちの少なくとも１つを欠如するＤＮＡポリメラーゼを使用して、核酸標的のコピーにハイブリダイズした複数のオリゴヌクレオチドバーコードを伸長することを含んでいてもよい。複数の第一鎖バーコード化ポリヌクレオチドにハイブリダイズしたランダムプライマーの伸長は、５’から３’のエキソヌクレアーゼ活性および３’から５’のエキソヌクレアーゼ活性のうちの少なくとも１つを欠如するＤＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｋｌｅｎｏｗ断片）を使用して、複数の第一鎖バーコード化ポリヌクレオチドにハイブリダイズしたランダムプライマーを伸長することを含む。一部の実施形態では、伸長酵素は、ＫｌｅｎｏｗまたはＫｌｅｎｏｗ ｅｘｏ－である。
一部の実施形態では、複数の第一鎖バーコード化ポリヌクレオチドは、追加の伸長および／または増幅反応のための鋳型として再利用することができる（ランダムプライミングおよび伸長の後で）。本方法は、ランダムプライマーを、複数の第一鎖バーコード化ポリヌクレオチドと接触させるステップ、複数の第一鎖バーコード化ポリヌクレオチドにハイブリダイズしたランダムプライマーを伸長するステップ、および複数の伸長産物を増幅するステップを繰り返すことを含んでいてもよい。本方法は、複数の第一鎖バーコード化ポリヌクレオチドを第３の複数のバーコード化アンプリコンを生成するための鋳型として使用して、第３の複数のバーコード化アンプリコンを合成することを含んでいてもよい。第３の複数のバーコード化アンプリコンの合成は、複数の第一鎖バーコード化ポリヌクレオチドのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅を実施することを含んでいてもよい。第３の複数のバーコード化アンプリコンの合成は、第１のユニバーサル配列またはその相補体にハイブリダイズすることが可能なプライマー、および標的特異的プライマーを使用するＰＣＲ増幅を含んでいてもよい。本方法は、第３の複数のバーコード化アンプリコンまたはそれらの産物の配列情報を得ることを含んでいてもよい。配列情報の取得は、配列決定アダプターを、第３の複数のバーコード化アンプリコンまたはそれらの産物に付着させることを含んでいてもよい。標的特異的プライマーは、免疫受容体（例えば、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）および／またはＢ細胞受容体（ＢＣＲ）受容体）と特異的にハイブリダイズすることができる。図１２は、標的化遺伝子発現プロファイリング、ＡｂＯを用いた試料多重化、ＡｂＯを用いたタンパク質発現プロファイリング、および全トランスクリプトーム解析を、１つのワークフローにおいて実施するための略図である。一部の実施形態では、全トランスクリプトーム解析は、標的化遺伝子発現プロファイリング、ＡｂＯを用いた試料多重化、およびＡｂＯを用いたタンパク質発現プロファイリングの１つまたは複数と１つのワークフローにおいて適合性であってもよく、１つのワークフローにおいて実施することができる。一部の実施形態では、第一鎖バーコード化ポリヌクレオチドの一部（例えば、細胞捕捉およびバーコーディング後のビーズ）をＲＰＥ ＷＴＡのために部分サンプリングし、残りの第一鎖バーコード化ポリヌクレオチドを、標的化（例えば、遺伝子特異的）増幅および分析（例えば、標的化ＰＣＲ２および標的化インデックスＰＣＲ）に使用する。一部の実施形態では、ＲＰＥ ＷＴＡの後、第一鎖バーコード化ポリヌクレオチドは、本明細書に開示のような多重化パネルのプライマーを使用した標的化（例えば、遺伝子特異的）増幅および分析のために再利用することができる。一部の実施形態では、本明細書で提供されるＲＰＥに基づくＷＴＡ法から導出された配列決定情報を使用して、本明細書で開示されるような標的化（例えば、遺伝子特異的）増幅および分析のための１パネルのプライマーを生成する。
試料は、複数の細胞、複数の単一細胞、組織、腫瘍試料、またはそれらの任意の組合せを含んでいてもよい。試料は、末梢血単核細胞または免疫細胞を含んでいてもよい。免疫細胞は、Ｂ細胞、Ｔ細胞、またはそれらの組合せを含んでいてもよい。核酸標的は、核酸分子を含んでいてもよい。核酸分子は、リボ核酸（ＲＮＡ）、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ＲＮＡ分解産物、ポリ（Ａ）テイルを含むＲＮＡ、またはそれらの任意の組合せを含んでいてもよい。ｍＲＮＡは、免疫受容体をコードする。複数の核酸標的の１つまたは複数は、低発現遺伝子のｍＲＮＡを含んでいてもよい。核酸標的は、細胞成分結合性試薬を含んでいてもよい。核酸分子は、細胞成分結合性試薬に付随していてもよい。本方法は、核酸分子および細胞成分結合性試薬を解離させることを含んでいてもよい。標的結合性領域は、オリゴｄＴ配列、ランダム配列、標的特異的配列、またはそれらの組合せを含んでいてもよい。標的結合性領域は、ポリ（ｄＴ）領域を含んでいてもよく、核酸標的は、ポリ（ｄＡ）領域を含んでいてもよい。
本方法は、複数の伸長産物、第１の複数のバーコード化アンプリコン、および／または第２の複数のバーコード化アンプリコンのクリーンアップ（例えば、ａｍｐｕｒｅクリーンアップ）を含んでいてもよい。ＳＰＲＩクリーンアップ比は、インプリメンテーションが異なれば異なっていてもよい。一部の実施形態では、ＳＰＲＩクリーンアップ比は、約０．１×～約３．０×（例えば、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．５、２．７、３．０、およびその間の範囲）である。クリーンアップは、片側であってもよくまたは両側であってもよい。
複数のオリゴヌクレオチドバーコードのうちの少なくとも１０個は、異なる分子標識配列を含んでいてもよい。複数のオリゴヌクレオチドバーコードの各分子標識は、少なくとも６個のヌクレオチドを含んでいてもよい。複数のオリゴヌクレオチドバーコードは、固体支持体に付随していてもよい。同じ固体支持体に付随している複数のオリゴヌクレオチドバーコードは各々、同一の試料標識を含んでいてもよい。複数のオリゴヌクレオチドバーコードの各試料標識は、少なくとも６個のヌクレオチドを含んでいてもよい。複数のオリゴヌクレオチドバーコードは各々、細胞標識を含んでいてもよい。複数のオリゴヌクレオチドバーコードの各細胞標識は、少なくとも６個のヌクレオチドを含んでいてもよい。同じ固体支持体に付随しているオリゴヌクレオチドバーコードは、同じ細胞標識を含んでいてもよい。異なる固体支持体に付随しているオリゴヌクレオチドバーコードは、異なる細胞標識を含んでいてもよい。固体支持体は、合成粒子、平面状表面、またはそれらの組合せを含んでいてもよい。固体支持体（例えば、ビーズ）は、本明細書で提供される反応のインプリメンテーションが異なれば異なる密度を有してもよい。一部の実施形態では、ランダムプライミングおよび伸長反応中の固体支持体の密度は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１２８、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００、６１０、６２０、６３０、６４０、６５０、６６０、６７０、６８０、６９０、７００、７１０、７２０、７３０、７４０、７５０、７６０、７７０、７８０、７９０、８００、８１０、８２０、８３０、８４０、８５０、８６０、８７０、８８０、８９０、９００、９１０、９２０、９３０、９４０、９５０、９６０、９７０、９８０、９９０、１０００個の固体支持体／ｕｌであるか、もしくは約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１２８、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００、６１０、６２０、６３０、６４０、６５０、６６０、６７０、６８０、６９０、７００、７１０、７２０、７３０、７４０、７５０、７６０、７７０、７８０、７９０、８００、８１０、８２０、８３０、８４０、８５０、８６０、８７０、８８０、８９０、９００、９１０、９２０、９３０、９４０、９５０、９６０、９７０、９８０、９９０、１０００個の固体支持体／ｕｌであるか、またはこうした値の任意の２つの間の数もしくは範囲の固体支持体／ｕｌである。一部の実施形態では、固体支持体はすべて、ランダムプライミングおよび伸長反応に使用される。一部の実施形態では、固体支持体の一部のみが、ランダムプライミングおよび伸長反応に使用される（例えば、部分サンプリング）。一部のそのような実施形態では、部分サンプリングは、第一鎖バーコード化ポリヌクレオチドを含まない固体支持体（例えば、「コールド」ビーズ）を、部分サンプリングされた固体支持体に添加することを含む。
試料は単一細胞を含んでいてもよく、本方法は、複数のオリゴヌクレオチドバーコードを含む合成粒子を、試料中の単一細胞に付随させることを含む。本方法は、合成粒子を単一細胞に付随させた後、単一細胞を溶解することを含んでいてもよい。単一細胞の溶解は、試料を加熱すること、試料を界面活性剤と接触させること、試料のｐＨを変化させること、またはそれらの任意の組合せを含んでいてもよい。合成粒子および単一細胞は、同じ区画（例えば、ウェルまたは液滴）に存在してもよい。複数のオリゴヌクレオチドバーコードのうちの少なくとも１つは、合成粒子上に固定化されていてもよく、または部分的に固定化されていてもよい。複数のオリゴヌクレオチドバーコードのうちの少なくとも１つは、合成粒子内に封入されていてもよく、または部分的に封入されていてもよい。合成粒子は破壊可能であってもよい（例えば、破壊可能なヒドロゲル粒子）。合成粒子は、ビーズを含んでいてもよい。ビーズは、セファロースビーズ、ストレプトアビジンビーズ、アガロースビーズ、磁気ビーズ、コンジュゲートビーズ、プロテインＡコンジュゲートビーズ、プロテインＧコンジュゲートビーズ、プロテインＡ／Ｇコンジュゲートビーズ、プロテインＬコンジュゲートビーズ、オリゴ（ｄＴ）コンジュゲートビーズ、シリカビーズ、ヒドロゲルビーズ、ゲルビーズ、シリカ様ビーズ、抗ビオチンマイクロビーズ、抗蛍光色素マイクロビーズ、またはそれらの任意の組合せを含んでいてもよい。合成粒子は、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ポリスチレン、ガラス、ポリプロピレン、アガロース、ゼラチン、ヒドロゲル、常磁性体、セラミック、プラスチック、ガラス、メチルスチレン、アクリルポリマー、チタン、ラテックス、セファロース、セルロース、ナイロン、シリコーン、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される材料を含んでいてもよい。複数のオリゴヌクレオチドバーコードの各々は、リンカー官能基を含んでいてもよく、合成粒子は、固体支持体官能基を含んでいてもよく、および／または支持体官能基およびリンカー官能基は、互いに付随している。リンカー官能基および支持体官能基は、Ｃ６、ビオチン、ストレプトアビジン、第一級アミン、アルデヒド、ケトン、およびそれらの任意の組合せからなる群から個々に選択することができる。
ＲＰＥに基づくＷＴＡ性能
本明細書で開示されるＲＰＥに基づくＷＴＡ法は、低存在量の転写物の感度増加、新しい転写物の検出、新しい細胞タイプの検出、および／または配列決定コストの低減をもたらすことができる。本明細書で提供されるＲＰＥに基づくＷＴＡ法の一部の実施形態は、代替的な、ＲＰＥに基づかないＷＴＡ法（例えば、ライゲーションに基づくＷＴＡ法または断片化に基づくＷＴＡ法）と比較して、低存在量の転写物の感度増加、新しい転写物の検出、新しい細胞タイプの検出、および／または配列決定コストの低減をもたらす。本明細書で使用される場合、「標的」は、「種」と同義的に使用することができる。
本明細書で使用される場合、「種」は、互いに同じであるか、互いに相補体であるか、もしくは互いに逆相補体であるか、または互いにハイブリダイズすることが可能であるか、または同じ遺伝子座に由来する転写物であるか、または同じタンパク質もしくはその断片をコードするなどであるポリヌクレオチド（例えば、ｃＤＮＡ分子などの一本鎖ポリヌクレオチド、試料追跡のための試料インデックス付与オリゴヌクレオチド、およびタンパク質発現プロファイルを決定するためのタンパク質特異的オリゴヌクレオチド）を指す。本明細書で使用される場合、「標的」は、「種」と同義的に使用することができる。一部の実施形態では、種のメンバー（例えば、コピーまたは出現）は、互いにまたはそれらの相補体と、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％相同性である。一部の実施形態では、種のメンバーは、同じ遺伝子座に由来する転写物であり、転写物は、同じ長さであってもよく、または異なる長さであってもよい。種は、一部の実施形態では、ｃＤＮＡまたはｍＲＮＡである。
本明細書で使用される場合、「高存在量種」は、大量に存在する種を指し、例えば、種は、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、もしくはそれよりも多くともよく、約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、もしくはそれよりも多くともよく、少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、もしくはそれよりも多くともよく、または少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、もしくはそれよりも多くともよい。一部の実施形態では、試料は、少なくとも１種、少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも４種、少なくとも５種、少なくとも１０種、少なくとも２０種、少なくとも５０種、少なくとも１００種、少なくとも２００種、少なくとも５００種、少なくとも１０００種、またはそれよりも多くの高存在量種を含んでいてもよい。一部の実施形態では、すべての高存在量種の合計は、試料中の核酸分子または種の少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、またはそれよりも多くを占める。一部の実施形態では、高存在量種は、１つまたは複数のリボソームタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含んでいてもよい。一部の実施形態では、高存在量種は、１つまたは複数のミトコンドリアタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含んでいてもよい。一部の実施形態では、高存在量種は、１つまたは複数のハウスキーピングタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含んでいてもよい。一部の実施形態では、高存在量種は、試料インデックス付与オリゴヌクレオチド（本明細書では試料タグ配列または試料インデックス付与インデックスとも呼ばれる）の配列を含んでいてもよい。一部の実施形態では、高存在量種は、試料追跡に使用されるオリゴヌクレオチドの配列を含んでいてもよい。一部の実施形態では、高存在量種は、試料の１つまたは複数の細胞の試料起源を識別するための試料インデックス付与配列を含んでいてもよい。一部の実施形態では、高存在量種は、細胞成分結合性試薬（例えば、抗体）のための固有識別子配列を含んでいてもよい。一部の実施形態では、高存在量種は、細胞成分結合性試薬にコンジュゲートされた（または以前にコンジュゲートされた）オリゴヌクレオチドの配列を含んでいてもよい。一部の実施形態では、高存在量種は、抗体にコンジュゲートされたかまたは以前にコンジュゲートされたオリゴヌクレオチドの配列を含んでいてもよく、本明細書では、抗体オリゴヌクレオチドと呼ばれる場合がある（「ＡｂＯｌｉｇｏ」または「ＡｂＯ」と略される）。
本明細書で使用される場合、「中存在量種」は、少なくとも１つの種よりも低く、少なくとも１つの他の種よりも多い量で存在する種を指す。一部の実施形態では、中存在量種は、試料中の核酸分子または種の１０％、５％、４％、３％、２％、１％、０．１％、０．０１％であってもよく、少なくとも１０％、５％、４％、３％、２％、１％、０．１％、０．０１％であってもよく、約１０％、５％、４％、３％、２％、１％、０．１％、０．０１％であってもよく、もしくは少なくとも約１０％、５％、４％、３％、２％、１％、０．１％、０．０１％であってもよく、または上記の値の任意の２つの間の範囲であってもよい。一部の実施形態では、試料は、少なくとも１種、少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも４種、少なくとも５種、少なくとも１０種、少なくとも２０種、少なくとも５０種、少なくとも１００種、少なくとも２００種、少なくとも５００種、少なくとも１０００種、またはそれよりも多くの中存在量種を含んでいてもよい。一部の実施形態では、すべての中存在量種の合計は、試料中の核酸分子の約１％、約２％、約３％、約４％、約５％、約１０％、約２０％、約３０％、または上記の値の任意の２つの間の範囲を占める。一部の実施形態では、中存在量種は、１つまたは複数のハウスキーピングタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含んでいてもよい。一部の実施形態では、中存在量種は、試料追跡に使用されるオリゴヌクレオチドの配列を含んでいてもよい。一部の実施形態では、中存在量種は、試料の１つまたは複数の細胞の試料起源を識別するための試料インデックス付与配列を含んでいてもよい。一部の実施形態では、中存在量種は、細胞成分結合性試薬（例えば、抗体）のための固有識別子配列を含んでいてもよい。一部の実施形態では、中存在量種は、細胞成分結合性試薬にコンジュゲートされた（または以前にコンジュゲートされた）オリゴヌクレオチドの配列を含んでいてもよい。一部の実施形態では、中存在量種は、抗体にコンジュゲートされたかまたは以前にコンジュゲートされたオリゴヌクレオチドの配列を含んでいてもよく、本明細書では、抗体オリゴヌクレオチドと呼ばれる場合がある（「ＡｂＯｌｉｇｏ」または「ＡｂＯ」と略される）。
本明細書で使用される場合、「低存在量種」は、少量で存在する種を指し、例えば、種は、試料中の核酸分子または種の１％、０．１％、０．０１％、０．００１％、０．０００１％、もしくはそれ未満であってもよく、約１％、０．１％、０．０１％、０．００１％、０．０００１％、もしくはそれ未満であってもよく、１％、０．１％、０．０１％、０．００１％、０．０００１％未満であってもよく、または約１％、０．１％、０．０１％、０．００１％、０．０００１％未満であってもよい。一部の実施形態では、試料は、少なくとも１種、少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも４種、少なくとも５種、少なくとも１０種、少なくとも２０種、少なくとも５０種、少なくとも１００種、少なくとも２００種、少なくとも５００種、少なくとも１，０００種、またはそれよりも多くの低存在量種を含んでいてもよい。一部の実施形態では、すべての低存在量種の合計は、試料中の核酸分子の２０％未満、１０％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、１％未満、１％未満、０．１％未満、またはそれ未満を占める。一部の実施形態では、低存在量種は、１つまたは複数の転写因子をコードするポリヌクレオチドを含んでいてもよい。一部の実施形態では、低存在量種は、１つまたは複数のＴ細胞受容体をコードするポリヌクレオチドを含んでいてもよい。一部の実施形態では、低存在量種は、１つまたは複数の抗体をコードするポリヌクレオチドを含んでいてもよい。
一部の実施形態では、複数の核酸標的のうちの２つまたはそれよりも多くは、低存在量種を含む。一部の実施形態では、複数の核酸標的のうちの２つまたはそれよりも多くは、低存在量種および／または中存在量種を含む。一部の実施形態では、複数の核酸標的の２つまたはそれよりも多くは、低発現遺伝子のｍＲＮＡを含む。一部の実施形態では、低存在量種である核酸標的のパーセンテージは、０．００００００００１％、０．０００００００１％、０．００００００１％、０．０００００１％、０．００００１％、０．０００１％、０．００１％、０．０１％、０．１％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％であってもよく、もしくは約０．００００００００１％、０．０００００００１％、０．００００００１％、０．０００００１％、０．００００１％、０．０００１％、０．００１％、０．０１％、０．１％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％であってもよく、またはこうした値の任意の２つの間の数値もしくは範囲であってもよい。一部の実施形態では、低存在量種である核酸標的のパーセンテージは、少なくとも０．００００００００１％、０．０００００００１％、０．００００００１％、０．０００００１％、０．００００１％、０．０００１％、０．００１％、０．０１％、０．１％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％であってもよく、または最大で０．００００００００１％、０．０００００００１％、０．００００００１％、０．０００００１％、０．００００１％、０．０００１％、０．００１％、０．０１％、０．１％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％であってもよい。
一部の実施形態では、ＲＰＥ ＷＴＡライブラリーは、本明細書に開示されるようなＲＰＥ ＷＴＡライブラリー調製の産物を含む。一部の実施形態では、ＲＰＥ ＷＴＡライブラリーは、ＲＰＥ ＷＴＡライブラリー調製の産物を鋳型として使用する、本開示の１つまたは複数の下流の方法の産物を含む。一部の実施形態では、本開示のＲＰＥ ＷＴＡ法により生成されるＲＰＥ ＷＴＡライブラリーの配列決定は、代替的な、ＲＰＥに基づかないＷＴＡ法（例えば、ライゲーションに基づくＷＴＡ法または断片化に基づくＷＴＡ法）により生成されるライブラリーの配列決定と比較して、１つまたは複数の低存在量種（例えば、核酸標的、低発現ｍＲＮＡ）のリード数の増加をもたらす。一部の実施形態では、ＲＰＥ ＷＴＡライブラリー中の１つまたは複数の低存在量種のリード数の増加は、ＲＰＥに基づかないＷＴＡライブラリーと比較して、少なくとも２％である（例えば、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、７５％、１００％、またはそれよりも多く、およびこれら内の重複する範囲だけ）。一部の実施形態では、本開示の方法により生成されるＲＰＥ ＷＴＡライブラリーの配列決定は、ＲＰＥに基づかないＷＴＡライブラリーの配列決定と比較して、総リード数に対する１つまたは複数の低存在量種（例えば、核酸標的、低発現ｍＲＮＡ）のリード数の増加をもたらす。一部の実施形態では、ＲＰＥ ＷＴＡライブラリー中の総リード数に対する１つまたは複数の低存在量種のリード数の増加は、ＲＰＥに基づかないＷＴＡライブラリーと比較して、少なくとも２％である（例えば、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、７５％、１００％、またはそれよりも多く、およびこれら内の重複する範囲だけ）。一部の実施形態では、本開示の方法により生成されるＲＰＥ ＷＴＡライブラリーの配列決定は、ＲＰＥに基づかないＷＴＡライブラリーの配列決定と比較して、１つまたは複数の低存在量種（例えば、核酸標的、低発現ｍＲＮＡ）の分子インデックス（ＭＩ）の数の増加をもたらす。一部の実施形態では、ＲＰＥ ＷＴＡライブラリー中の総リード数に対する１つまたは複数の低存在量種のＭＩの数の増加は、ＲＰＥに基づかないＷＴＡライブラリーと比較して、少なくとも２％である（例えば、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、７５％、１００％、またはそれよりも多く、およびこれら内の重複する範囲だけ）。
一部の実施形態では、本明細書で開示される方法は、ＲＰＥ ＷＴＡライブラリー調製後の１つまたは複数の低存在量種の相対存在量を増加させることができる（非ＲＰＥ ＷＴＡライブラリー調製、例えば、ライゲーションに基づくＷＴＡ法または断片化に基づくＷＴＡ法と比較して）。例えば、本明細書で開示される方法は、少なくとも１種、少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも４種、少なくとも５種、少なくとも１０種、少なくとも２０種、少なくとも５０種、少なくとも１００種、少なくとも２００種、少なくとも５００種、少なくとも１，０００種、またはそれよりも多くの低存在量種のＲＰＥ ＷＴＡライブラリーの調製後の相対存在量を増加させることができる（非ＲＰＥ ＷＴＡライブラリー調製と比較して）。一部の実施形態では、本明細書で開示される方法は、１つまたは複数の低存在量種の各々のＲＰＥ ＷＴＡライブラリー調製後の相対存在量を（非ＲＰＥ ＷＴＡライブラリー調製と比較して）、少なくとも約２％（例えば、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、７５％、１００％、１５０％、２００％、２５０％、５００％、１０００％、またはそれよりも多く、およびそれら内の重複する範囲だけ）増加させることができる。一部の実施形態では、本明細書で開示される方法は、ＲＰＥ ＷＴＡライブラリー調製後の１つまたは複数の低存在量種のうちの少なくとも１つの相対存在量を（非ＲＰＥ ＷＴＡライブラリー調製と比較して）、少なくとも約２％（例えば、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、７５％、１００％、１５０％、２００％、２５０％、５００％、１０００％、またはそれよりも多く、およびそれら内の重複する範囲だけ）増加させることができる。一部の実施形態では、本明細書で開示される方法は、ＲＰＥ ＷＴＡライブラリー調製後の総低存在量種の相対存在量を（非ＲＰＥ ＷＴＡライブラリー調製と比較して）、少なくとも約２％（例えば、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、７５％、１００％、１５０％、２００％、２５０％、５００％、１０００％、またはそれよりも多く、およびそれら内の重複する範囲だけ）増加させることができる。
一部の実施形態では、本明細書で開示される方法は、低存在量種の存在量がＲＰＥ ＷＴＡライブラリー調製後に１つまたは複数の高存在量種と比べて増加するように、ＲＰＥ ＷＴＡライブラリー後の１つまたは複数の低存在量種の相対存在量を選択的に増加させることができる（非ＲＰＥ ＷＴＡライブラリー調製と比較して）。一部の実施形態では、本明細書で開示される方法および組成物は、低存在量種の存在量がＲＰＥ ＷＴＡライブラリー調製後に１つまたは複数の高存在量種と比べて増加するように、ＲＰＥ ＷＴＡライブラリー調製後の１つまたは複数の低存在量種の各々の相対存在量を（非ＲＰＥ ＷＴＡライブラリーと比較して）、２％（例えば、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、７５％、１００％、１５０％、２００％、２５０％、５００％、１０００％、もしくはそれよりも多く、およびそれら内の重複する範囲だけ）増加させることができるか、約２％（例えば、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、７５％、１００％、１５０％、２００％、２５０％、５００％、１０００％、もしくはそれよりも多く、およびそれら内の重複する範囲だけ）増加させることができるか、少なくとも２％（例えば、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、７５％、１００％、１５０％、２００％、２５０％、５００％、１０００％、もしくはそれよりも多く、およびそれら内の重複する範囲だけ）増加させることができるか、または少なくとも約２％（例えば、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、７５％、１００％、１５０％、２００％、２５０％、５００％、１０００％、もしくはそれよりも多く、およびそれら内の重複する範囲だけ）増加させることができる。
一部の実施形態では、本開示の方法により生成されるＲＰＥ ＷＴＡライブラリーの配列決定は、非ＲＰＥ ＷＴＡライブラリーの配列決定と比較して、１つまたは複数の標的の同様の遺伝子発現プロファイルおよび／またはタンパク質発現プロファイル（例えば、遺伝子発現パネル結果）をもたらす。一部の実施形態では、ＲＰＥ ＷＴＡライブラリーと非ＲＰＥ ＷＴＡライブラリーとの間の、１つまたは複数の標的の遺伝子発現プロファイルおよび／またはタンパク質発現プロファイルの差は、最大で０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、またはこうした値のいずれかの間の数値もしくは範囲であってもよい。一部の実施形態では、ＲＰＥ ＷＴＡライブラリーおよび非ＲＰＥ ＷＴＡライブラリーの発現プロファイル間のＲ2相関性は、０．６、０．７、０．８、０．９、０．９９０、０．９９９、１．０、およびそれら内の重複する範囲であってもよい。ライブラリー結果の発現プロファイル間の相関性を試験するための方法は、当技術分野で十分に理解されている（例えば、ｔＳＮＥプロットの重合せ）。
ＲＰＥ ＷＴＡライブラリーは、ＲＰＥ ＷＴＡライブラリー中の中存在量種または低存在量種の配列決定リードを増加させることにより、および／または非ＲＰＥ ＷＴＡライブラリー中の高存在量種の配列決定リードを減少させることにより、配列決定の効率を増加させることができる。本開示の方法により生成されるＲＰＥ ＷＴＡライブラリーでは、より低存在量の（例えば、より稀少な）核酸標的を、非ＲＰＥ ＷＴＡライブラリーでの場合よりも容易に識別することができる。ＲＰＥ ＷＴＡライブラリー中のより低存在量の標的の配列決定リードは、非ＲＰＥ ＷＴＡライブラリーでの場合よりも総リードのより大きな部分を含むことができる。ＲＰＥ ＷＴＡライブラリー中の１つまたは複数のより低存在量の標的の配列決定リードは、非ＲＰＥ ＷＴＡライブラリー中の同じ標的のリードと比較して、少なくとも５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、または５００％、またはそれよりも多くのリードを含むことができる。正規化ライブラリー中の１つまたは複数のより低存在量の標的の配列決定リードは、非ＲＰＥ ＷＴＡライブラリー中の同じ標的の配列決定リードよりも、少なくとも１、２、３、４、５、もしくは６倍であってもよく、またはそれよりも高い倍数であってもよい。
ＲＰＥ ＷＴＡライブラリーを作成するための本明細書に記載の方法は、複数の核酸（例えば、核酸ライブラリー）中の中存在量核酸標的および／または低存在量核酸標的の配列決定リードを向上させることができる。例えば、複数の中存在量核酸標的の配列決定リードは、ＲＰＥ ＷＴＡライブラリーの総配列決定リードの少なくとも３０％、少なくとも２０％、少なくとも１０％、少なくとも５％であってもよい。一部の実施形態では、複数の低存在量核酸標的の配列決定リードは、ＲＰＥ ＷＴＡライブラリーの総配列決定リードの少なくとも５０％、少なくとも４０％、少なくとも３０％、少なくとも２０％、少なくとも１０％、少なくとも５％、少なくとも４％、少なくとも３％、少なくとも２％、少なくとも１％であってもよい。一部の実施形態では、複数の低存在量核酸標的の配列決定リードは、ＲＰＥ ＷＴＡライブラリーの総配列決定リードの少なくとも５％である。一部の実施形態では、複数の低存在量核酸標的の配列決定リードは、ＲＰＥ ＷＴＡライブラリーの総配列決定リードの少なくとも１０％である。一部の実施形態では、複数の低存在量核酸標的の配列決定リードは、ＲＰＥ ＷＴＡライブラリーの総配列決定リードの少なくとも２０％である。一部の実施形態では、複数の低存在量核酸標的の配列決定リードは、ＲＰＥ ＷＴＡライブラリーの総配列決定リードの少なくとも３０％である一部の実施形態では、複数の低存在量核酸標的の配列決定リードは、ＲＰＥ ＷＴＡライブラリーの総配列決定リードの少なくとも４０％である。一部の実施形態では、複数の低存在量核酸標的の配列決定リードは、ＲＰＥ ＷＴＡライブラリーの総配列決定リードの少なくとも５０％である。
本明細書で開示されるＲＰＥに基づくＷＴＡ法の一部の実施形態には、代替的な、ＲＰＥに基づかないＷＴＡ法（例えば、ライゲーションに基づくＷＴＡ法または断片化に基づくＷＴＡ法）と比較して、より短いプロトコール時間を有するという利点がある。一部の実施形態では、単一細胞捕捉からｃＤＮＡ合成までの時間、および／またはライブラリー調製からＱＣまでの時間は、ＲＰＥに基づかないＷＴＡ法（例えば、ライゲーションに基づくＷＴＡ法または断片化に基づくＷＴＡ法）と比較して、少なくとも約２％（例えば、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、７５％、１００％、またはそれよりも大きく、およびそれら内の重複する範囲だけ）低減される。
上記の実施形態のいくつかの態様を以下の実施例でさらに詳しく開示するが、これらの実施例は、本開示の範囲を制限することを何ら意図しない。
全トランスクリプトーム解析（ＷＴＡ）のためのランダムプライミングおよび伸長（ＲＰＥ）プロトコール。
以下に提供される本プロトコールは、ランダムプライミング手法を使用してＲｈａｐｓｏｄｙビーズから全トランスクリプトームライブラリーを生成するための例示的な実施形態を概説するものである。以下に提供されるプロトコールと同様の手順を実施例１で使用した。
試薬
ＢＤ Ｒｈａｐｓｏｄｙ標的化ｍＲＮＡおよびＡｂＳｅｑ増幅キット（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、６３３７７４）；ＳＰＲＩｓｅｌｅｃｔ試薬（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｂ２３３１８）；１００％エチルアルコール；無ヌクレアーゼ水；Ｋｌｅｎｏｗ断片（３’－＞５’ｅｘｏ－）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｍ０２１２Ｌ）；１０ｍＭ ｄＮＴＰ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）；ならびに１００ｕＭの濃度に事前希釈したノナマー２（５’ＴＣＡ ＧＡＣ ＧＴＧ ＴＧＣ ＴＣＴ ＴＣＣ ＧＡＴ ＣＴＮＮＮＮＮＮＮＮＮ３’；配列番号１）（１ヌクレオチド内容物当たり２５％の混合塩基を手作業による混合で達成した）。
消耗品
ピペット（Ｐ１０、Ｐ２０、Ｐ２００、Ｐ１０００）；低保持濾過ピペットチップ；１．５ｍＬマイクロ遠心分離チューブ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ、０２２４３１０２１）；ＤＮＡ ＬｏＢｉｎｄチューブ、１．５ｍＬ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ、００３０１０８０５１）；および０．２ｍＬ ＰＣＲストリップチューブ。
機器
１．５～２．０ｍＬチューブ用のマイクロ遠心分離機；０．２ｍＬチューブ用マイクロ遠心分離機；ボルテックス混合器；Ｐｉｐｅｔ－Ａｉｄ；１．５ｍＬチューブ用の６チューブ磁気分離ラック（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｓ１５０６Ｓ）；０．２ｍＬの８ストリップチューブ用の薄型磁気分離スタンド（Ｖ＆Ｐ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ；ＶＰ７７２Ｆ４－１、６３５０１１）；デジタルタイマー；マルチチャネルピペット（Ｐ２０、Ｐ２００）；ヒートブロック；およびＴｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ。
手順
ｍＲＮＡを有していないビーズの生成（「コールド」ビーズ）
１． Ｒｈａｐｓｏｄｙビーズの１つのチューブ（約６００，０００個のビーズ、３セットのカートリッジビーズに添加するのに十分なコールドビーズを含む）を磁石と共にインキュベートした。液体をすべて除去し、ペレットを７５０μｌの試料緩衝液で再懸濁した。
２． チューブを磁石と共にインキュベートし、すべての液体を廃棄した。
３． ビーズを、４２μｌの１×溶解緩衝液（５ｍＭ ＤＴＴを含む）と共に２分間インキュベートした。５ｍＭ ＤＴＴを有する溶解緩衝液は、１０ｕＬの１Ｍ ＤＴＴおよび２ｍＬの溶解緩衝液を組み合わせて製作した。
４． 次いで、各々を１ｍＬの１×溶解緩衝液（５ｍＭ ＤＴＴを含む）で希釈し、磁石と共にインキュベートし、液体をすべて除去した。
５． １．０ｍＬのビーズ洗浄緩衝液を添加した。混合し、磁石と共にインキュベートした後、液体をすべて除去した。
６． １．０ｍＬのビーズ洗浄緩衝液を添加した。
７． ＲＴ緩衝液反応ミックスを、表１に示されているように調製した。
Figure 0007618548000001
８． ビーズを磁石と共にインキュベートし、液体をすべて除去した。
９． ６００μＬのＲＴ緩衝液ミックスをビーズに添加し、ピペッティングで混合した。
１０． ビーズを、ＴｈｅｒｍｏＭｉｘｅｒで１２００ＲＰＭにて振とうしながら、３７℃で２０分間インキュベートした。
１１． チューブを氷上に短時間配置した後、磁石と共にインキュベートし、液体をすべて除去した。
１２． エキソヌクレアーゼＩミックスを、表２に示されているように調製した。
Figure 0007618548000002
１３． ６００μｌのＥｘｏＩミックスをビーズに添加し、ピペッティングで混合した。
１４． ビーズを、ＴｈｅｒｍｏＭｉｘｅｒで１２００ＲＰＭにて振とうしながら、３７℃で３０分間インキュベートした。
１５． ビーズを振とうせずに２０分間８０℃へと移動させ、次いで氷上に１分間配置した。
１６． ビーズを磁石と共にインキュベートし、液体をすべて除去した。
１７． 各ビーズペレットを、６００μＬのビーズ再懸濁緩衝液で再懸濁した。得られた濃度は、およそ１０００ビーズ／μＬだった。一部の場合では、スキャナーのビーズ計数プログラムを使用して、最終ビーズ濃度を決定した。
ｃＤＮＡを有するＢＤ Ｒｈａｐｓｏｄｙビーズ上でのランダムプライミングおよび伸長（ＲＰＥ）
１． 増幅前作業場所において、新しい１．５ｍＬのＬｏＢｉｎｄチューブに、表３に列挙されている成分を表示の順序でピペッティングした。
Figure 0007618548000003
２． ランダムプライマーミックスを、穏やかなピペッティングで混合した。
３． 一部の場合では、エキソヌクレアーゼＩで処理したＢＤ Ｒｈａｐｓｏｄｙ細胞捕捉ビーズの試料全体に対して、ランダムプライミングおよび伸長を実施し、手順を飛ばしてステップ７に進んだ。一部の場合では、エキソヌクレアーゼＩで処理したＢＤ Ｒｈａｐｓｏｄｙ細胞捕捉ビーズの部分試料に対して、ランダムプライミングおよび伸長を実施し、ユーザはステップ４へと進んだ。
４． エキソヌクレアーゼＩで処理したＢＤ Ｒｈａｐｓｏｄｙ細胞捕捉ビーズを部分サンプリングするために、標的化配列決定のために部分サンプリングするビーズの容積を、最終ビーズ再懸濁容積中のビーズ上に捕捉された生細胞の予想数に基づいて決定した。一部の場合では、残りのビーズを４℃で最大３か月間保管した。ビーズをピペット混合で完全に再懸濁し、次いで算出された容積のビーズ懸濁物を、新しい１．５ｍＬのＬｏＢｉｎｄチューブにピペッティングした。部分サンプリングしたビーズを使用する場合、総容積をビーズ再懸濁緩衝液で１００μＬにした。
５． カートリッジ実験のビーズを、最終ビーズ容積が２００μＬになるように「コールド」ビーズと組み合わせた（総ビーズ数は約２００，０００個だった）。例えば、２０００個の細胞を有する４０ｕＬのビーズの場合、１６０ｕＬのコールドビーズを添加した。あるいは、一部の場合では、以下のように計算を実施した：追加するコールドビーズの数＝２０００００＊（１－（部分サンプリングする細胞／ビーズ洗浄後の総細胞））。
６． 組み合わせたビーズを有するチューブを、９５℃のヒートブロックに２分間配置した。次いで、ＢＤ Ｒｈａｐｓｏｄｙ細胞捕捉ビーズを有するチューブを、直ちに１．５ｍＬ磁石に配置し、上清を直ちに除去し廃棄した。ＢＤ Ｒｈａｐｓｏｄｙ細胞捕捉ビーズの乾燥を回避した。
７． チューブを磁石から取り外し、次いで低保持チップを使用して１７５μＬのランダムプライマーミックスをチューブへとピペッティングした。ピペット混合を１０回実施し、ビーズを再懸濁した。
８． チューブを９５℃のヒートブロックに２分間配置し、次いで試料を、３７℃で５分間１，２００ｒｐｍで、２５℃で５分間１，２００ｒｐｍで遠心分離沈降させた。
９． ２５μＬのプライマー伸長反応ミックス（表４に示されている）を、ビーズを含む試料チューブへとピペッティングした（総容積は２００μＬ）。ピペット混合を１０回実施した。
Figure 0007618548000004
１０． チューブを、３７℃で３０分間１，２００ｒｐｍにてｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒに配置した。
１１． チューブを９５℃のヒートブロックに２分間配置し、Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒで約２０秒間振とうし、１．５ｍＬ磁石に配置し、上清（ランダムプライマー伸長産物、すなわちＲＰＥ産物）を直ちに新しい１．５ｍＬのＬｏＢｉｎｄチューブに移し、そのチューブを氷上で保管した。
１２． 一部の場合では、ビーズを、２００μＬのビーズ再懸濁緩衝液（ＰＮ６５０００００６６）に再懸濁した。チューブを、９５℃のヒートブロックに２分間配置し、１．５ｍＬ磁石に配置し、上清を直ちに新しいチューブに移した。
１３． 一部の場合では、２００μＬのコールドビーズ再懸濁緩衝液（ＰＮ６５０００００６６）を、残りのビーズを有するチューブへとピペッティングした。ビーズを、ピペット混合のみで穏やかに再懸濁した（ボルテックスはしなかった）。ビーズを、増幅前作業場所で４℃にて保管した。残りのビーズは、ＢＤ Ｒｈａｐｓｏｄｙ標的化およびＢＤ ＡｂＳｅｑライブラリー生成に使用することできる。
ＲＰＥ産物の精製
１． 新しい５．０ｍＬのＬｏＢｉｎｄチューブに、４．０ｍＬの無水エチルアルコールを１．０ｍＬの無ヌクレアーゼ水にピペッティングすることにより、５ｍＬの新鮮な８０％（容積／容積）エチルアルコールを調製した。チューブを１０秒間ボルテックスした。新鮮な８０％エチルアルコールを作り、２４時間以内に使用した。
２． ＳＰＲＩ Ｓｅｌｅｃｔビーズを、使用前に１分間高速でボルテックスした。ビーズは、均質で均一な色を呈した。
３． ３２０μＬ（１．６×）のＳＰＲＩ Ｓｅｌｅｃｔビーズを、２００μＬのＲＰＥ産物上清を含むチューブにピペッティングした。
４． ピペット混合を少なくとも１０回実施し、次いで短時間遠心分離した。
５． 懸濁物を室温で１０分間インキュベートし、次いでそれを１．５ｍＬチューブ磁石に５分間配置した。
６． 上清を除去した。
７． ビーズを有する元のチューブを磁石上で維持し、このチューブに６００μＬの新鮮な８０％エチルアルコールを穏やかにピペッティングした。
８． 試料を磁石上で３０秒間インキュベートした。
９． 磁石上に置いたまま、ＳＰＲＩ Ｓｅｌｅｃｔビーズを乱すことなく、上清を注意深く除去し、適切に廃棄した。
１０． エタノール洗浄ステップを繰り返して、合計２回の８０％エタノール洗浄を行った。
１１． 磁石上に置いたまま、少容積ピペットを使用して、一切の残留上清をチューブから除去した。
１２． チューブを磁石上で開けたままにして、ＳＰＲＩ Ｓｅｌｅｃｔビーズを、室温で１０～１５分間、またはビーズがもはや光沢を見せなくなるまで乾燥させた。
１３． チューブを磁石から取り外し、３１μＬの溶出緩衝液（ＰＮ６５０００００７５）をチューブへとピペッティングした。溶液が懸濁し、均一な色を呈するまで、懸濁物を少なくとも１０回ピペット混合した。
１４． 試料を室温で２分間インキュベートした。
１５． チューブを短時間遠心分離して、内容物を底部に収集した。
１６． 溶液が透明になるまで（通常は≦３０秒）、チューブを磁石上に配置した。
１７． 溶出液全体（約３０μＬ）を新しいＰＣＲチューブにピペッティングした。これは、精製されたＢＤ Ｒｈａｐｓｏｄｙ ＲＰＥ産物だった。これをＰＣＲするまで氷上または４℃で維持した。
ＲＰＥ ＰＣＲ
１． 増幅前作業場所において、新しい１．５ｍＬのＬｏＢｉｎｄチューブに、表５に示されている成分を表示の順序でピペッティングした。
Figure 0007618548000005
２． ７０μＬのＲＰＥ ＰＣＲミックスを、３０μＬの精製ＲＰＥ産物と組み合わせた。
３． ＲＰＥ ＰＣＲ反応物を、１チューブ当たり５０μＬの反応ミックスを有する２つのＰＣＲチューブに分割した。
４． 表６に示されているＰＣＲプログラムを実行し、ＰＣＲサイクルの数を表７に従って決定した。
Figure 0007618548000006
Figure 0007618548000007

５． ＲＰＥ ＰＣＲ反応が完了したら、チューブを短時間遠心分離して、内容物をチューブの底部に収集した。
６． ２つの反応物を、新しい０．２ｍＬのＰＣＲチューブへと組み合わされた。
ＲＰＥ ＰＣＲ増幅産物の精製（片側クリーンアップ）
１． 一部の場合では、２μＬのＲＰＥ ＰＣＲ反応産物を、バイオアナライザー分析のために採取した（後に精製産物と比較するため）。
２． ＳＰＲＩ Ｓｅｌｅｃｔビーズを室温に戻し、ＳＰＲＩ Ｓｅｌｅｃｔビーズを高速で１分間ボルテックスした。ビーズは、均質で均一な色を呈した。
３． 最終増幅産物を有するチューブを短時間遠心分離した。
４． １００．０μＬ（１．０×）のＳＰＲＩ Ｓｅｌｅｃｔビーズを最終増幅産物へとピペッティングした。
５． 少なくとも１０回のピペット混合を実施し、次いで試料を短時間遠心分離した。
６． 懸濁物を室温で５分間インキュベートし、次いでストリップチューブ磁石に３～５分間配置した。
７． 磁石上に置いたまま、ユーザは、ＳＰＲＩ Ｓｅｌｅｃｔビーズを乱すことなく上清のみを注意深く除去し、適切に廃棄した。
８． チューブを磁石上に維持したまま、２００μＬの新鮮な８０％エチルアルコールを穏やかにピペッティングした。
９． 試料を磁石上で３０秒間インキュベートした。
１０． 磁石上に置いたまま、ユーザは、ＳＰＲＩ Ｓｅｌｅｃｔビーズを乱すことなく上清のみを注意深く除去し、適切に廃棄した。
１１． ８０％エタノール洗浄を繰り返して、合計で２回の洗浄を行った。
１２． チューブを磁石上に維持したまま、少容積ピペットを使用して、一切の残留上清をチューブから除去した。
１３． チューブを磁石上で開けたままにして、ＳＰＲＩ Ｓｅｌｅｃｔビーズを、室温で少なくとも５分間、またはビーズがもはや光沢を見せなくなるまで乾燥させた。
１４． ３０μＬの溶出緩衝液（ＰＮ６５０００００７５）をチューブへとピペッティングし、パルスボルテックスして、ＳＰＲＩ Ｓｅｌｅｃｔビーズを完全に再懸濁した。
１５． 試料を室温で２分間インキュベートした。
１６． チューブを短時間遠心分離して、内容物を底部に収集した。
１７． 溶液が透明になるまで（通常は≦３０秒）、チューブを磁石上に配置した。
１８． 溶出液全体（約３０μＬ）を、新しい１．５ｍＬのＬｏＢｉｎｄチューブへとピペッティングした。これで、ＲＰＥ ＰＣＲ溶出液をインデックスＰＣＲに使う準備ができた。一部の場合では、このステップは休止地点であり、ＲＰＥ ＰＣＲライブラリーを－２０℃で≦６か月間保管することができた。
１９． ユーザは、Ｑｕｂｉｔ ｄｓＤＮＡ ＨＳアッセイを使用したＱｕｂｉｔ（商標）蛍光光度計およびＡｇｉｌｅｎｔ高感度ＤＮＡキットを使用したＡｇｉｌｅｎｔ２１００バイオアナライザーを用いて、ＲＰＥ ＰＣＲ産物を定量化し、品質管理を実施した。バイオアナライザートレースは、２００～１０００ｂｐにブロードピークを適切に示した。２００～１０００ｂｐの濃度を使用して、インデックスＰＣＲに添加する鋳型の量を計算した。一部の場合では、７０ｂｐ付近に小さなピークが観察される場合がある。一部の場合では、７０ｂｐのピークが顕著であった場合、インデックスＰＣＲ後の収量が影響を受けた。
ＷＴＡインデックスＰＣＲ
１． ＲＰＥ ＰＣＲ溶出液を、２００～１０００ｂｐピークの濃度が約１～２ｎＭになるように希釈した。例えば、２００～１０００ｂｐピークのバイオアナライザー測定値が約６ｎＭだった場合、試料を１：３希釈して２ｎＭにした。
２． 表８に示されている成分を、表示の順序で新しい１．５ｍＬチューブにピペッティングした。
Figure 0007618548000008
３． ＷＴＡインデックスＰＣＲミックスを、以下のようにＰＣＲ１鋳型と組み合わせた：（ａ）１つの試料の場合、４７μＬのＷＴＡインデックスＰＣＲミックスを、３μＬの１～２ｎＭのＲＰＥ ＰＣＲ溶出液（鋳型）と組み合わせた；または（ｂ）異なるリバースライブラリーインデックスを有する複数の試料の場合、ＷＴＡインデックスＰＣＲミックスを、５μＬのリバースインデックスおよび３μＬのＲＰＥ ＰＣＲ溶出液（鋳型）と組み合わせた。
４． 表９に示されているＰＣＲプログラムを実行した。
Figure 0007618548000009
５． ＷＴＡインデックスＰＣＲが完了したら、チューブを短時間遠心分離して、内容物をチューブの底部に収集した。
ＷＴＡインデックスＰＣＲ産物の精製（両側クリーンアップ）
１． 一部の場合では、２μＬのＷＴＡインデックスＰＣＲ反応産物を、バイオアナライザー分析のために採取した（後に精製産物と比較するため）。
２． ＳＰＲＩ Ｓｅｌｅｃｔビーズを室温に戻し、ＳＰＲＩ Ｓｅｌｅｃｔビーズを高速で１分間ボルテックスした。ビーズは、均質で均一な色を呈した。
３． ＷＴＡインデックスＰＣＲ産物を有するチューブを短時間遠心分離した。
４． ５０μＬの水を、１００μＬの最終容積になるようにＷＴＡインデックスＰＣＲ産物に添加した。
５． ５５μＬ（０．５５×）のＳＰＲＩ Ｓｅｌｅｃｔビーズを、ＷＴＡインデックスＰＣＲ産物へとピペッティングした。
６． 少なくとも１０回のピペット混合を実施し、次いで試料を短時間遠心分離した。
７． 懸濁物を室温で５分間インキュベートし、次いで０．２ｍＬのストリップチューブ磁石に３分間配置した。
８． ステップ５のストリップチューブが依然として磁石上にある間に、ユーザは、磁石に引き付けられたビーズを乱すことなく１５５μＬの上清を注意深く取り出し、新しい０．２ｍＬストリップチューブへと移し、ピペットで１０回混合した。
９． １５μＬ（０．７０×）のＳＰＲＩ Ｓｅｌｅｃｔビーズを、上清を含む新しいストリップチューブへとピペッティングした。
１０． 懸濁物を室温で５分間インキュベートし、次いで新しいチューブを０．２ｍＬチューブ磁石に５分間配置した。
１１． 磁石上に置いたまま、ユーザは、ＳＰＲＩ Ｓｅｌｅｃｔビーズを乱すことなく上清のみを注意深く除去し、適切に廃棄した。
１２． チューブを磁石上に維持したまま、２００μＬの新鮮な８０％エチルアルコールを穏やかにピペッティングした。
１３． 試料を磁石上で３０秒間インキュベートした。
１４． 磁石上に置いたまま、ユーザは、ＳＰＲＩ Ｓｅｌｅｃｔビーズを乱すことなく上清のみを注意深く除去し、適切に廃棄した。
１５． ８０％エタノール洗浄を繰り返して、合計で２回の洗浄を行った。
１６． チューブを磁石上に維持したまま、少容積ピペットを使用して、一切の残留上清をチューブから除去した。
１７． チューブを磁石上で開けたままにして、ＳＰＲＩ Ｓｅｌｅｃｔビーズを、室温で５分間乾燥させた。
１８． ３０μＬの溶出緩衝液（ＰＮ６５０００００７５）をチューブへとピペッティングし、パルスボルテックスして、ＳＰＲＩ Ｓｅｌｅｃｔビーズを完全に再懸濁した。
１９． 試料を室温で２分間インキュベートした。
２０． チューブを短時間遠心分離して、内容物を底部に収集した。
２１． 溶液が透明になるまで（通常は≦３０秒）、チューブを磁石上に配置した。
２２． 溶出液全体（約３０μＬ）を、新しい１．５ｍＬのＬｏＢｉｎｄチューブへとピペッティングした。ＷＴＡインデックスＰＣＲ溶出液は、最終配列決定ライブラリーだった。一部の場合では、このステップは休止地点だった。インデッスクＰＣＲライブラリーを、配列決定まで－２０℃で≦６か月間保管することができた。
２３． ユーザは、Ｑｕｂｉｔ ｄｓＤＮＡ ＨＳアッセイを使用したＱｕｂｉｔ（商標）蛍光光度計およびＡｇｉｌｅｎｔ高感度ＤＮＡキットを使用したＡｇｉｌｅｎｔ２１００バイオアナライザーを用いて、インデックスＰＣＲライブラリーを定量化し、品質管理を実施した。
配列決定
一部の場合では、１細胞当たり５０，０００リードで配列決定を実施し、２０％ＰｈｉＸを配列決定実行に負荷した。
（実施例１）
全トランスクリプトーム解析（ＷＴＡ）を実施するためのランダムプライミングおよび伸長（ＲＰＥ）に基づく方法の開発および改良
本明細書で提供される全トランスクリプトーム解析（ＷＴＡ）を実施するためのランダムプライミングおよび伸長（ＲＰＥ）に基づく方法を、表１０に提供されている非限定的な例示的ＷＴＡ性能評価項目および現行の利用可能なＷＴＡ法との比較に、部分的に基づいて開発および最適化した。例えば、ＲＰＥに基づくＷＴＡ法は、以下を考慮して開発した：（１）一般的なＷＴＡ評価項目（例えば、１細胞当たりの遺伝子／ＵＭＩ）、しかしながら、異なるＷＴＡ法は異なる遺伝子タイプに由来する固有のバイアスを有するため、これらはバイアスを受けていている可能性がある；および（２）例えば、様々な発現レベルの遺伝子およびバイアス（リボソーム遺伝子、ミトコンドリア遺伝子、ハウスキーピング遺伝子など）にわたるＷＴＡドロップアウト率などの追加の評価項目。一部の場合では、主要な免疫細胞タイプ（Ｂ細胞、ＮＫ、Ｔ細胞、および骨髄細胞）の識別は、ＢＤ ＤａｔａＶｉｅｗのｔＳＮＥおよび特徴選択初期設定を使用して行った。
Figure 0007618548000010
ＲＰＥに基づくＷＴＡ法とライゲーションに基づくＷＴＡ法との比較
ヘキサマー（ＩＤ０１０ＨＫ６）またはノナマー（ＩＤ０１０ＮＫ６）のいずれかを使用して、本明細書で提供されるＷＴＡを実施するためのＲＰＥに基づく方法を、ジャーカット／ラモス細胞（表１１）およびＰＭＢＣ（表１２）において、現行の利用可能なライゲーションに基づくＷＴＡ法（ＩＤ０１０ＵＧ１）と比較した。図１３Ａ～Ｂは、ライゲーションに基づく全トランスクリプトーム解析、ならびに６ｍｅｒランダマーおよび９ｍｅｒランダマーによるランダムプライミングおよび伸長を用いた全トランスクリプトーム解析を実施するための非例示的な感度評価項目を示すプロットである。ジャーカット／ラモス細胞では、ＲＰＥに基づくＷＴＡ法を使用すると、ライゲーションに基づくＷＴＡ法と比較してより多くの遺伝子および分子が検出された。さらに、ノナマーに基づくＲＰＥ法を使用すると、ヘキサマーに基づく方法と比較してより多くの遺伝子および分子が検出された。一部のマーカーは、ジャーカット細胞では発現しなかった。ライゲージョンに基づく方法は、ＩＧＬＣ３のより良好な検出を示すことが認められた。
Figure 0007618548000011
Figure 0007618548000012
図１４は、ライゲーションに基づくＷＴＡ法と比較した、本開示のランダムプライミングおよび伸長に基づくＷＴＡ分析の例示的な性能を示すｔ分布型確率的近傍埋め込み（ｔ－ＳＮＥ）である。ｔＳＮＥ投影図では、所定の遺伝子セットに由来する６６４個の免疫関連遺伝子に焦点を当てた。ＩＤ０１０ＨＫ６（ＲＰＥヘキサマー）およびＩＤ０１０ＮＫ６（ＲＰＥノナマー）試料は、同様の遺伝子発現パターンを有し、ＩＤ０１０ＵＧ１（ライゲーションに基づくＷＴＡ法）よりも細胞クラスター間のばらつきが大きいように見えたが、すべてがより近い２Ｄ空間に集中しているようであった。
図１５Ａ～１５Ｂは、ＩＤ０１０ＮＫ６（ＲＰＥ ＷＴＡノナマー）が、ＩＤ０１０ＵＧ１（ライゲーションに基づくＷＴＡ法）よりも多くの細胞表面マーカーを捕捉するようであったことを示す非限定的な例示的円グラフである。図１５Ａは、特定の遺伝子を発現する細胞の数が、ＲＰＥ ＷＴＡノナマー法またはライゲーションに基づくＷＴＡ法においてより多かったことを示す円グラフである。図１５Ｂは、特定の遺伝子を発現する１細胞当たりのＵＭＩが、ＲＰＥノナマー法またはライゲーションに基づくＷＴＡ法においてより多いことを示す円グラフである。さらに、表１３および１４に示されているように、ノナマーＲＰＥに基づくＷＴＡ法は、ライゲーションに基づくＷＴＡ法よりも多くの細胞表面マーカーを捕捉した。
したがって、こうしたデータは、複数の細胞タイプおよび多数の性能評価項目にわたって、現行の利用可能なライゲーションに基づくＷＴＡ法と比較して、本明細書で提供されるＷＴＡを実施するためのＲＰＥに基づく方法（ヘキサマーまたはノナマーのいずれかを使用した）の性能が増強されたことを実証する。
加えて、本明細書で開示されるＲＰＥに基づくＷＴＡ法は、より短いＷＴＡプロトコールを提供することができる。単一細胞捕捉からｃＤＮＡ合成完了までは、既存の液滴に基づくＷＴＡ法、既存のライゲーションに基づくＷＴＡ法、およびＲＰＥに基づくＷＴＡ法では、それぞれ８５分、１３０分、および１３０分の時間がかかる。ライブラリー調製からＱＣまでは、既存の液滴に基づくＷＴＡ法、既存のライゲーションに基づくＷＴＡ法、およびＲＰＥに基づくＷＴＡ法では、それぞれ３７５分、５２０分、および３３０分の時間がかかる。したがって、本明細書で提供されるＷＴＡを実施するための新規方法には、プロトコール時間を短縮するという利点がある。
Figure 0007618548000013
Figure 0007618548000014
モデル系
ヘキサマーまたはノナマーのいずれかを使用して、本明細書で提供されるＷＴＡを実施するためのＲＰＥに基づく方法を、ＰＢＭＣおよびジャーカット／ラモス細胞で試験した。
図１６Ａ～１６Ｄは、１つのランダムプライミングステップおよび１つのＰＣＲステップを含むＲＰＥ法を使用すると、ジャーカット／ラモスは、健常ドナー末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）よりも高いＲＮＡ含有量を有し（１細胞当たりのＵＭＩ計数を比較すると約５×）、ＰＢＭＣライブラリーは、１６５ｂｐの夾雑物を生成したことを示す非限定的な例示的バイオアナライザープロットである。夾雑物は、これらのピークの配列決定が可能であったため、ランダマーダイマーである可能性が高かった。図１６Ａ～１６Ｂは、それぞれジャーカット／ラモスおよびＰＢＭＣにおけるヘキサマーＲＰＥバイオアナライザープロットを示し、図１６Ｃ～１６Ｄは、それぞれジャーカット／ラモスおよびＰＢＭＣにおけるノナマーＲＰＥバイオアナライザープロットを示す。
表１５には、ジャーカットおよびＰＭＢＣにおけるヘキサマーに基づくおよびノナマーに基づくＲＰＥ ＷＴＡ法のＷＴＡ性能が示されている。一部のマーカーは、ジャーカット細胞では発現しなかった。ＰＢＭＣは、ＲＮＡ含有量が少ないため、より難しいモデル系である。ＰＢＭＣにおいて本方法を開発すれば、感度分析がより向上する。
Figure 0007618548000015
伸長酵素
ヘキサマーまたはノナマーのいずれかを使用して本明細書で提供されるＷＴＡを実施するためのＲＰＥに基づく方法のための伸長酵素の使用を調査した。
図１７Ａ～１７Ｄは、ランダムプライミングおよび伸長（１つのランダムプライミングステップおよび１つのＰＣＲステップを含むＲＰＥ法を使用する）によるＷＴＡ分析を実施する一部の実施形態では、鎖置換活性を有するＫｌｅｎｏｗ Ｅｘｏ－が、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼよりも好ましいことを示す非限定的な例示的バイオアナライザープロット（ＲＰＥ ＰＣＲ）である。様々なポリメラーゼを試験した。部分サンプリングしたジャーカット／ラモス細胞の数は１０００個だった。図１７Ａ～１７Ｂは、それぞれヘキサマーおよびノナマーを使用したＫｌｅｎｏｗ Ｅｃｏ－のバイオアナライザープロットを示し、図１７Ｃ～１７Ｄは、それぞれヘキサマーおよびノナマーを使用したＴ４ ＤＮＡポリメラーゼのバイオアナライザープロットを示す。プロットは、Ｋｌｅｎｏｗ Ｅｘｏ－が中程度の鎖置換活性を有し、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼが鎖置換活性を有しなかったことを示す。２つの酵素の間にはエキソヌクレアーゼ活性にも違いがあった。Ｋｌｅｎｏｗ Ｅｘｏ－は、複数のランダムプライミング伸長産物を生成することができるため、ヘキサマーおよびノナマーの両方でより高い収量をもたらした。一部の実施形態では、Ｋｌｅｎｏｗを伸長に使用する。一部の実施形態では、Ｋｌｅｎｏｗ ｅｘｏ－を伸長に使用する。
図１８Ａ～１８Ｄは、Ｋｌｅｎｏｗ Ｅｘｏ－が、以前に考えられていたほどの鎖置換活性を有しない場合があることを示す非限定的な例示的バイオアナライザープロット（ＲＰＥ ＰＣＲ）である。部分サンプリングしたＰＢＭＣの数は１０００個だった。収量が変化したことを示すＰＣＲ１前のＲＰＥの変性方法を試験した。以下の変数について試験した：（ｉ）９５℃で２分間変性させた後、直ちに上清を取り出す（図１８Ａ）；（ｉｉ）９５℃で２分間変性させた後、１分間待って上清を取り出す（図１８Ｂ）；（ｉｉｉ）０．１Ｎ ＮａＯＨで５分間処理した後、Ｔｒｉｓ Ｃｌ ｐＨ７で中和する（図１８Ｃ）；および（ｉｖ）変性無し（図１８Ｄ）。図１８Ｄは、ＲＰＥ ＰＣＲ収率が低いことが、産物のほとんどがｃＤＮＡビーズに結合したままであることを示唆し、これは、酵素が鎖置換活性をほとんど有しない可能性があることを示す。一部の実施形態では、ｐｈｉ２９酵素などの他の酵素を使用することができる。
ＲＰＥプライマーの長さおよびランダムプライミングステップ
ヘキサマーまたはノナマーのいずれかを使用して本明細書で提供されるＷＴＡを実施するためのＲＰＥに基づく方法のランダムプライミングステップの数およびランダマーの長さを調査した。
図１９Ａ～１９Ｄは、ＲＰＥ ＷＴＡ法に対する、ランダムプライミングステップの数およびランダマーの長さの効果を示す非限定的な例示的バイオアナライザープロットである。部分サンプリングしたジャーカット／ラモス細胞の数は１０００個だった。二重ランダムプライミング（ランダムプライミングおよび伸長を２回ならびに２サイクルのＰＣＲを実施すること）を含むＲＰＥに基づくＷＴＡプロトコールを、ヘキサマーおよびノナマーを使用して試験した（それぞれ、図１９Ａおよび１９Ｂ）。加えて、単一ランダムプライミング（ランダムプライミングおよび伸長を１回ならびに１サイクルのＰＣＲを実施すること）を含むＲＰＥに基づくＷＴＡプロトコールを、ヘキサマーおよびノナマーを使用して試験した（それぞれ、図１９Ｃおよび１９Ｄ）。単一ランダムプライミングを用いると、インデックスＰＣＲ後のプロットに示されているように、配列決定可能なライブラリーを生成することができる。１６５ｂｐの夾雑物が観察された。表１６は、ヘキサマーおよびノナマーを使用した上記の単一ランダムプライミングＲＰＥ変法および二重ランダムプライミングＲＰＥ変法のＷＴＡ性能を示す。単一ランダムプライミングステップは非常に迅速であるが、２つのランダムプライミングステップの方がより高い感度を有するようであった。ノナマーの方が、より多くの遺伝子に対してより良好な感度を有するようであった。本明細書で提供される残りの実験では、１つのランダムプライミングステップを使用した。
Figure 0007618548000016
ＲＰＥクリーンアップ
本明細書で提供されるＷＴＡを実施するためのＲＰＥに基づく方法のための最適なＳＰＲＩクリーンアップ比を調査した。
図２０Ａ～２０Ｆは、ＲＰＥに基づくＷＴＡ法の性能に対するＳＰＲＩクリーンアップ比の効果を示す非限定的な例示的データである。図２０Ａ～２０Ｂは、１．６×（図２０Ａ）および１．０×（図２０Ｂ）ＳＰＲＩクリーンアップ比を比較する非限定的な例示的バイオアナライザープロットである。加えて、リード／細胞（図２０Ｃ）、遺伝子中央値／細胞（図２０Ｄ）、分子中央値／細胞（図２０Ｅ）、ならびにリボソーム分子％およびミトコンドリア分子％（図２０Ｆ）を、１．６×および１．０×のＳＰＲＩクリーンアップ比で比較した。こうしたデータにより、１．６×ＲＰＥクリーンアップ比は、１．０×クリーンアップ比よりも高い収量をもたらし、１．６×クリーンアップ比は、より少ないリード／細胞を有するにも関わらず、１．０×クリーンアップ比よりも多くの分子および遺伝子／細胞の検出をもたらすことが実証される。
ランダムプライマー濃度およびＲＰＥ条件
本明細書で提供されるＷＴＡを実施するためのＲＰＥに基づく方法のための様々なランダムプライマー濃度およびＲＰＥ条件を調査した。
図２１Ａ～２１Ｇは、ＲＰＥに基づくＷＴＡ法に対する様々なランダムプライマー濃度およびＲＰＥ条件の効果を示す非限定的な例示的バイオアナライザープロット（ＲＰＥ ＰＣＲ、ＳＰＲＩクリーンアップ後）である。具体的には、実験では以下の条件を比較した：ＩＤ０１９－１（図２１Ａ、１０ｕＭランダムプライマー；コールドビーズの添加無し、６．１８６ｎＭ）、ＩＤ０１９－２（図２１Ｂ、１０ｕＭランダムプライマー、コールドビーズを添加、２．１３８ｎＭ）、ＩＤ０１９－３（図２１Ｃ、５ｕＭランダムプライマー、コールドビーズを添加、０．５３８ｎＭ）、ＩＤ０１９－４（図２１Ｄ、１ｕＭランダムプライマー、コールドビーズを添加、０．３１４ｎＭ）、ＩＤ０１９－５（図２１Ｅ、０．５ｕＭランダムプライマー、コールドビーズを添加、０．４３８ｎＭ）、ＩＤ０１９－６（図２１Ｆ、１ｕＭランダムプライマー、コールドビーズを添加、０．６５２ｎＭ）、およびＩＤ０１９－７（図２１Ｇ、０．５ｕＭランダムプライマー、コールドビーズを添加、０．２４２ｎＭ）。図２１Ａおよび２１Ｂを比較すると、コールドビーズの添加は、ＲＰＥ ＰＣＲの所望の産物の収量を減少させることが観察される。ＩＤ０１７（下記に記載）は、反対のＰＣＲ収量結果を有したが、これはＰＣＲ条件が異なるためであった可能性があり、ＩＤ０１９でのＲＰＥクリーンアップ条件を片側クリーンアップに改変した。
図２２Ａ～２２Ｆは、ＲＰＥ ＷＴＡに対する、コールドビーズの添加および様々なビーズ密度の効果を示す非限定的な例示的配列決定データである。図２２Ａ～２２Ｃ（ＩＤ０１９）に示されているように、コールドビーズの添加は、ＲＰＥ ＷＴＡアッセイの感度を減少させた。１細胞当たりの遺伝子数の中央値（図２２Ａ、非リボソーム、非ミトコンドリア、非偽遺伝子）、平均リード／細胞（図２２Ｂ）、および平均分子／細胞（図２２Ｃ）をアッセイした。さらに、図２２Ｄ～２２Ｆ（ＩＤ０１７）に示されているように、ＲＰＥでのビーズ密度がより高いと、ＲＰＥ ＷＴＡアッセイの感度が減少する。分子中央値／細胞（図２２Ｄ）、リード／細胞（図２２Ｅ）、および遺伝子中央値／細胞（図２２Ｆ）をアッセイした。
図２３Ａ～２３Ｂは、ＲＰＥ ＷＴＡに対する、ランダムプライマー濃度およびコールドビーズの効果を示す非限定的な例示的配列決定データである。図２３Ａは、１細胞当たりの遺伝子中央値（ＩＤ０１７、コールドビーズ無し）を示し、図２３Ｂは、コールドビーズを用いた１細胞当たりの遺伝子数中央値（非リボソーム、非ミトコンドリア、非偽遺伝子）を示す（ＩＤ０１９）。ＩＤ０１７単一細胞実験およびＩＤ０１９単一細胞実験では両方とも、１０ｕＭのランダムプライマー濃度が、一貫して最も高い感度をもたらした。表１７は、既存のＷＴＡ法のＷＴＡ性能評価項目と、様々なランダムプライマー濃度およびビーズ密度を使用したＲＰＥ ＷＴＡ法との比較を提供する。
Figure 0007618548000017
図２４Ａ～２４Ｅは、ＲＰＥ ＷＴＡ法に対する様々な細胞数の効果を示す非限定的な例示的バイオアナライザープロット（ＲＰＥ ＰＣＲ）である。具体的には、実験では以下の条件を比較した：ＩＤ０１８－１（図２４Ａ、７９７０細胞、１４サイクル、２．６２ｎｇ／ｕＬ）、ＩＤ０１８－２（図２４Ｂ、８７２細胞、１８サイクル、１．１４ｎｇ／ｕＬ）、ＩＤ０１８－３（図２４Ｃ、７５細胞、１８サイクル、０．７７４ｎｇ／ｕＬ）、ＩＤ０１８－４（図２４Ｄ、８７２細胞を部分サンプリングし、コールドビーズを添加、１８サイクル、０．８９２ｎｇ／ｕＬ）、およびＩＤ０１８－５（図２４Ｅ、７５細胞を部分サンプリングし、コールドビーズを添加、１８サイクル、０．５７２ｎｇ／ｕＬ）。矢印は、ブロードビーズ（ｂｅａｄｓ）を示す。これらはおそらくは過剰増幅である。図２５Ａ～２５Ｅは、ＲＰＥ ＷＴＡ法に対する様々な細胞数の効果を示す非限定的な例示的バイオアナライザープロット（インデックスＰＣＲ）である。具体的には、実験では以下の条件を比較した：ＩＤ０１８－１（図２５Ａ、７９７０細胞、６．３６ｎｇ／ｕＬ）、ＩＤ０１８－２（図２５Ｂ、８７２細胞、１．１４ｎｇ／ｕＬ）、ＩＤ０１８－３（図２５Ｃ、７５細胞、０．７７４ｎｇ／ｕＬ）、ＩＤ０１８－４（図２５Ｄ、８７２細胞を部分サンプリングし、コールドビーズを添加、０．８９２ｎｇ／ｕＬ）、およびＩＤ０１８－５（図２５Ｅ、７５細胞を部分サンプリングし、コールドビーズを添加、０．５７２ｎｇ／ｕＬ）。一部の場合では、およそ１００細胞の細胞ライブラリーは良好な品質を有しないことが見出された。表１８は、上記で言及した条件のＷＴＡ性能評価項目を示す。細胞対ビーズ比が低いと、ライブラリー品質が低下する傾向があることが見出された。ビーズ濃度がより高いと、アッセイの感度が低減される場合があり、ユーザは、ＲＰＥ容積を増加させることを望む場合がある。細胞：ビーズ比が低いと、ライブラリー品質が悪化する傾向がある。１０ｕＭのランダムプライマー濃度が、最も高い感度を有することが見出された。一部の場合では、さらにより高い濃度が望ましい場合がある。
Figure 0007618548000018
図２６Ａ～２６Ｆは、様々な細胞数を用いた本開示のランダムプライミングおよび伸長に基づくＷＴＡ分析の例示的な性能を示すｔ分布型確率的近傍埋め込み（ｔ－ＳＮＥ）投影図を示す。図２６ＢはＩＤ０１８－１（１０，０００細胞）を示し、図２６ＣはＩＤ０１８－２（１，０００細胞）を示し、図２６ＤはＩＤ０１８－３（１００細胞）を示し、図２６ＥはＩＤ０１８－４（部分サンプリングし、コールドビーズを添加した１，０００細胞）を示し、図２６Ｆは、ＩＤ０１８－５（部分サンプリングし、コールドビーズを添加した１００細胞）を示し、図２６Ａは、上述の条件すべてを重ね合わせたものを示す。バッチ効果はほとんど観察されなかった。
図２７Ａ～２７Ｄは、ＲＰＥ ＷＴＡ法に対する連続ＲＰＥ変性およびＲＰＥ反応容積の効果を示す非限定的な例示的バイオアナライザープロットである。図２７Ａおよび２７Ｃに示されている単一変性プロトコール（ＲＰＥ反応ミックス中で９５℃の変性を行うことを含む）を、図２７Ｂおよび２７Ｄに示されている連続変性プロトコール（ビーズ再懸濁緩衝液中で９５Ｃでの２回目の変性を行うことをさらに含む）と比較した。さらに、２００ｕＬのＲＰＥ容積の使用（図２７Ａ～２７Ｂ）と１ｍＬのＲＰＥ容積の使用（図２７Ｃ～２７Ｄ）とを比較した。実験は以下の条件下で実施した：図２７Ａ（１２９７１細胞；１３サイクル；４．６４ｎｇ／ｕＬ）；図２７Ｂ（１２９７１細胞；１７サイクル；６８．０７ｎｇ／ｕＬ）、図２７Ｃ（１２５２２細胞；１３サイクル；５．４４ｎｇ／ｕＬ）；および図２７Ｄ（１２５２２細胞；１７サイクル；４９．３０ｎｇ／ｕＬ）。第２の変性では、１ｍＬのＲＰＥ容積および２００ｕＬのＲＰＥ容積の両方で、おおよそ同量のＰＣＲ物質をもたらすことが見出された。
ＰＣＲ増幅の数
図２８Ａ～２８Ｃは、２ＰＣＲライブラリー生成プロトコール（図２８Ａ～２８Ｂ）および１ＰＣＲライブラリー生成プロトコール（図２８Ｃ）を用いた本開示のランダムプライミングおよび伸長に基づくＷＴＡ分析の例示的な性能を示す例示的なバイオアナライザープロットである。図２８Ａは、２ＰＣＲライブラリー生成プロトコールのＰＣＲ１（例えば、ＲＰＥ ＰＣＲ）を示し、図２８Ｂは、２ＰＣＲライブラリー生成プロトコールのＰＣＲ２（例えば、インデックスＰＣＲ）を示し、図２８Ｃは、単一ＰＣＲステップの結果を示す。２ＰＣＲライブラリー生成プロトコール（ＲＰＥ ＰＣＲ）の第１のＰＣＲには、リード１＆２プライマーを使用した。１ＰＣＲライブラリー生成プロトコールの第１のＰＣＲには、インデックスＰ５／Ｐ７プライマーを使用した。インデックスプライマーの使用は、１６サイクル後に＜１ｎｇ／ｕＬだった、強度が高い１６５ｂｐピーク（３０ｕＬで溶出）をもたらした。ＰＣＲ１におけるインデックスプライマーの使用（１ＰＣＲライブラリー生成プロトコ－ル）は、量的に大きな１６５ｂｐピークに結び付いた（図２８Ｃの矢印で示されている）。このピークは、リード１／リード２試料（図２８Ａ）ではそれほど顕著ではなかった（７１ｂｐとして現れた）。したがって、ＰＣＲ１にてＲ１／Ｒ２プライマーを使用すると、ＰＣＲ１で生成される１６５ｂｐピークがより少なくなり、産物がわずかにより少なくなるが、ユーザは、第２のＰＣＲにおいてより多くの収量を得ることができる。したがって、２ＰＣＲライブラリー生成プロトコールでは、１６５ｂｐ夾雑物ピークがより少なく、総ライブラリー収量はより多くなった。したがって、２回のＰＣＲに基づくＲＰＥ ＷＴＡ法は、よりクリーンなライブラリー生成を可能にすることができる。
（実施例２）
タンパク質結合性試薬に付随させるためのオリゴヌクレオチド
この実施例は、タンパク質結合性試薬がコンジュゲートし得るオリゴヌクレオチドの設計について実証する。オリゴヌクレオチドを使用して、タンパク質発現と遺伝子発現を同時に決定することができる。オリゴヌクレオチドを試料インデックス付与のために使用して、同一または異なる試料の細胞を決定することもできる。
９５ｍｅｒのオリゴヌクレオチドの設計
以下の方法を使用して、タンパク質発現と遺伝子発現の同時決定または試料インデックス付与のための、候補オリゴヌクレオチド配列および対応するプライマー配列を生成した。
１． 配列の生成および排除
以下のプロセスを使用して、タンパク質発現と遺伝子発現の同時決定または試料インデックス付与のための候補オリゴヌクレオチド配列を生成した。
ステップ１ａ．所望の長さ（４５ｂｐ）を有するいくつかの候補配列（５００００配列）をランダムに生成する。
ステップ１ｂ．生成した配列の５’末端に転写調節ＬＳＲＲ配列および生成した配列の３’末端にポリ（Ａ）配列（２５ｂｐ）を付加する。
ステップ１ｃ．生成および付加した配列で、４０％～５０％の範囲のＧＣ含量を有さない配列を除去する。
ステップ１ｄ．残った配列で、各々１つまたは複数のヘアピン構造を有する配列を除去する。
残った候補オリゴヌクレオチド配列の数は、４２３であった。
２． プライマー設計
残った４２３の候補オリゴヌクレオチド配列のプライマーを設計するために、以下の方法を使用した。
２．１ Ｎ１プライマー：Ｎ１プライマーとして、ユニバーサルＮ１配列：５’－ＧＴＴＧＴＣＡＡＧＡＴＧＣＴＡＣＣＧＴＴＣＡＧＡＧ－３’（ＬＳＲＲ配列；配列番号４）を使用する。
２．２ Ｎ２プライマー（特定試料インデックスオリゴヌクレオチドの増幅を目的とする；例えば、図２９Ｂ～２９ＤのＮ２プライマー）：
２．２ａ．Ｎ１配列の下流で開始しない候補Ｎ２プライマーを除去する。
２．２ｂ．候補オリゴヌクレオチド配列の最後の３５ｂｐにおいて重複する候補Ｎ２プライマーを除去する。
２．２ｃ．オリゴヌクレオチドを使用して試験される細胞の種のトランスクリプトーム（例えば、ヒトトランスクリプトームまたはマウストランスクリプトーム）とアラインするプライマー候補を除去する。
２．２ｄ．プライマー－プライマー相互作用を最小限にするかまたは回避するために、デフォルト対照としてＩＬＲ２配列（ＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴ；配列番号５）を使用する。
４２３の候補オリゴヌクレオチド配列のうち、３９０候補に対するＮ２プライマーを設計した。
３． フィルタリング
残った３９０の候補プライマー配列をフィルタリングするために、以下のプロセスを使用した。
３ａ．すべてのバーコードについてポリ（Ａ）テイルを同じ長さに維持するために、Ａで終わるランダム配列を有する（すなわち、ポリ（Ａ）配列の有効長さが２５ｂｐを超える）あらゆる候補オリゴヌクレオチド配列を排除する。
３ｂ．Ｇが連続するオリゴ合成では、コストが余分にかかり、しかも収率が低い可能性があるため、４以上の連続するＧ（＞３Ｇ）を含むあらゆる候補オリゴヌクレオチド配列を排除する。
図２９Ａは、上記の方法を使用して生成した非限定的な例示的候補オリゴヌクレオチド配列を示す。
２００ｍｅｒのオリゴヌクレオチドの設計
以下の方法を使用して、タンパク質発現および遺伝子発現の同時決定ならびに試料インデックス付与のための候補オリゴヌクレオチド配列および対応するプライマー配列を生成した。
１．配列の生成および排除
以下を使用して、タンパク質発現および遺伝子発現の同時決定ならびに試料インデックス付与のための候補オリゴヌクレオチド配列を生成した。
１ａ．所望の長さ（１２８ｂｐ）を有するいくつかの候補配列（１０００００配列）をランダムに生成する。
１ｂ．生成した配列の５’末端に転写調節ＬＳＲＲ配列と、非ヒト、非マウスの追加アンカー配列を、および生成した配列の３’末端にポリ（Ａ）配列（２５ｂｐ）を付加する。
１ｃ．生成および付加した配列で、４０％～５０％の範囲のＧＣ含量を有さない配列を除去する。
１ｄ．ヘアピン構造スコアに基づき、残った候補オリゴヌクレオチド配列を選別する。
１ｅ．最も低いヘアピンスコアを有する１０００の残った候補オリゴヌクレオチド配列を選択する。
２．プライマー設計
最も低いヘアピンスコアを有する４００の候補オリゴヌクレオチド配列のプライマーを設計するために、以下の方法を使用した。
２．１ Ｎ１プライマー：Ｎ１プライマーとして、ユニバーサルＮ１配列：５’－ＧＴＴＧＴＣＡＡＧＡＴＧＣＴＡＣＣＧＴＴＣＡＧＡＧ－３’（ＬＳＲＲ配列；配列番号４）を使用する。
２．２ Ｎ２プライマー（特定の試料インデックスオリゴヌクレオチドの増幅を目的とする；例えば、図２９Ｂおよび２９ＣのＮ２プライマー）：
２．２ａ．Ｎ１配列の２３ｎｔ下流で開始しない候補Ｎ２プライマーを除去する（アンカー配列は、すべての候補オリゴヌクレオチド配列についてユニバーサルであった）。
２．２ｂ．標的配列の最後の１００ｂｐにおいて重複する候補Ｎ２プライマーを除去する。得られたプライマー候補は、標的配列の４８番目のヌクレオチドと１００番目のヌクレオチドとの間に存在し得る。
２．２ｃ．オリゴヌクレオチドを使用して試験される細胞の種のトランスクリプトーム（例えば、ヒトトランスクリプトームまたはマウストランスクリプトーム）とアラインするプライマー候補を除去する。
２．２ｄ．プライマー－プライマー相互作用を最小限にするかまたは回避するために、デフォルト対照としてＩＬＲ２配列 ５’－ＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴ－３’（配列番号５）を使用する。
２．２ｅ．標的配列の最後の１００ｂｐにおいて重複するＮ２プライマー候補を除去する。
４００の候補オリゴヌクレオチド配列のうち、３９２候補に対するＮ２プライマーを設計した。
３．フィルタリング
残った３９２の候補プライマー配列をフィルタリングするために、以下を使用した。
３ａ．すべてのバーコードについてポリ（Ａ）テイルを同じ長さに維持するために、Ａで終わるランダム配列を有する（すなわち、ポリ（Ａ）配列の有効長さが２５ｂｐを超える）あらゆる候補オリゴヌクレオチド配列を排除する。
３ｂ．Ｇが連続するオリゴ合成では、コストが余分にかかり、しかも収率が低い可能性があるため、４以上の連続するＧ（＞３Ｇ）を含むあらゆる候補オリゴヌクレオチド配列を排除する。
図２９Ｂは、上記の方法を使用して生成した非限定的な例示的候補オリゴヌクレオチド配列を示す。図２９Ｂに示されるネステッドＮ２プライマーは、標的化増幅のための抗体または試料特異的配列に結合し得る。図２９Ｃは、標的化増幅のためのアンカー配列に対応するネステッドユニバーサルＮ２プライマーを有する同一の非限定的な例示的候補オリゴヌクレオチド配列を示す。図２９Ｄは、ワンステップ標的化増幅のためのＮ２プライマーを有する同一の非限定的な例示的候補オリゴヌクレオチド配列を示す。
まとめると、これらのデータは、タンパク質発現および遺伝子発現の同時決定または試料インデックス付与のために、異なる長さのオリゴヌクレオチド配列を設計することができることを示す。オリゴヌクレオチド配列は、ユニバーサルプライマー配列、抗体特異的オリゴヌクレオチド配列または試料インデックス付与配列、およびポリ（Ａ）配列を含み得る。
（実施例３）
オリゴヌクレオチドが付随している抗体のワークフロー
この実施例は、タンパク質標的の発現プロファイルを決定するためにオリゴヌクレオチドコンジュゲート抗体を使用するワークフローを実証する。
対象の凍結細胞（例えば、凍結末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ））を解凍する。解凍した細胞を一定温度で一定期間（例えば、室温で２０分間）オリゴヌクレオチドコンジュゲート抗体（例えば、０．０６μｇ／１００μｌの抗ＣＤ４抗体（オリゴヌクレオチドコンジュゲート抗体ストックの１：３３３希釈液））で染色する。オリゴヌクレオチドコンジュゲート抗体は、１、２、または３種のオリゴヌクレオチド（「抗体オリゴヌクレオチド」）にコンジュゲートされている。抗体オリゴヌクレオチドの配列を図３０に示す。細胞を洗浄して、未結合のオリゴヌクレオチドコンジュゲート抗体を除去する。目的の細胞（例えば、生細胞）を得るために、フローサイトメトリーによる選別を目的として、細胞をＣａｌｃｅｉｎ ＡＭ（ＢＤ（Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅ、Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ））およびＤｒａｑ７（商標）（Ａｂｃａｍ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ））で染色してもよい。細胞を洗浄して、過剰なＣａｌｃｅｉｎ ＡＭおよびＤｒａｑ７（商標）を除去してもよい。フローサイトメトリーを使用して、Ｃａｌｃｅｉｎ ＡＭ（生細胞）で染色され、Ｄｒａｑ７（商標）（死滅または透過処理していない細胞）で染色されていない単一細胞をＢＤ Ｒｈａｐｓｏｄｙ（商標）カートリッジ中に選別する。
単一細胞とビーズを含有するウェルのうち、ウェル中の単一細胞（例えば、３５００個の生細胞）を溶解緩衝液（例えば、５ｍＭ ＤＴＴの溶解緩衝液）中で溶解する。標的（例えば、ＣＤ４）のｍＲＮＡ発現プロファイルを、ＢＤ Ｒｈａｐｓｏｄｙ（商標）ビーズを使用して決定する。標的（例えば、ＣＤ４）のタンパク質発現プロファイルをＢＤ Ｒｈａｐｓｏｄｙ（商標）ビーズと抗体オリゴヌクレオチドを使用して決定する。簡潔には、細胞溶解後にｍＲＮＡ分子が放出される。ＢＤ Ｒｈａｐｓｏｄｙ（商標）ビーズに、各々が分子標識、細胞標識、およびオリゴ（ｄＴ）領域を含有するバーコード（例えば、確率論的バーコード）を付随させる。溶解した細胞から放出されたｍＲＮＡ分子のポリ（Ａ）領域を確率論的バーコードのポリ（Ｔ）領域にハイブリダイズさせる。抗体オリゴヌクレオチドのポリ（ｄＡ）領域をバーコードのオリゴ（ｄＴ）領域にハイブリダイズさせる。バーコードを使用して、ｍＲＮＡ分子を逆転写させた。バーコードを使用して、抗体オリゴヌクレオチドを複製する。逆転写と複製は、１つの試料アリコート中で同時に起こってもよい。
Ｎ１プライマーを使用して目的の遺伝子のｍＲＮＡ発現プロファイルを決定する、および抗体オリゴヌクレオチドＮ１プライマーを使用して標的のタンパク質発現プロファイルを決定するために、プライマーを使用して、逆転写産物および複製産物をＰＣＲ増幅する。例えば、血液パネルＮ１プライマーを使用して４８８の血液パネル遺伝子のｍＲＮＡ発現プロファイルを決定する、および抗体オリゴヌクレオチドＮ１プライマーを使用してＣＤ４タンパク質の発現プロファイルを決定するために、プライマーを使用して、逆転写産物および複製産物を６０度のアニーリング温度で１５サイクルＰＣＲ増幅することができる（「ＰＣＲ １」）。過剰なバーコードは、Ａｍｐｕｒｅクリーンアップで除去されてもよい。ＰＣＲ １からの産物を２つのアリコートに分割してもよく、１つのアリコートは、目的の遺伝子のためのＮ２プライマーを使用して目的の遺伝子のｍＲＮＡ発現プロファイルを決定するためのものであり、１つのアリコートは、抗体オリゴヌクレオチドＮ２プライマーを使用して目的の標的のタンパク質発現プロファイルを決定するためのものである（「ＰＣＲ ２」）。両方のアリコートをＰＣＲ増幅する（例えば、６０度のアニーリング温度で１５サイクル）。細胞中の標的のタンパク質発現を図３０に示される抗体オリゴヌクレオチドに基づいて決定する（「ＰＣＲ ２」）。配列決定データを得て、配列決定アダプターの付加（「ＰＣＲ ３」）、例えば、配列決定アダプターのライゲーション後に分析する。目的の遺伝子のｍＲＮＡ発現プロファイルに基づいて細胞型を決定する。
まとめると、この実施例は、目的の標的のタンパク質発現プロファイルを決定するためにオリゴヌクレオチドコンジュゲート抗体を使用することを記載する。この実施例は、目的の標的のタンパク質発現プロファイルおよび目的の遺伝子のｍＲＮＡ発現プロファイルを同時に決定することができることをさらに記載する。
以前に記載された実施形態の少なくとも一部では、実施形態において使用される１つまたは複数のエレメントは、このような置き換えが技術的に実施不可能でなければ、別の実施形態において交換可能に使用され得る。特許請求された主題の範囲から逸脱することなく、以上に記載の方法および構造に種々の他の省略、追加および変更を行い得ることが当業者によって認識されるであろう。このような変更および変化はすべて、添付の特許請求の範囲に規定される主題の範囲内に含まれることが意図される。
本明細書の実質的に任意の複数形および／または単数形の用語の使用に関連して、文脈上および／または適用上適切であれば、当業者は、複数形から単数形へおよび／または単数形から複数形への変換が可能である。明確にするために種々の単数形／複数形の入替えを本明細書に明示的に記述し得る。本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、別段に文脈上明確に規定されていなければ、単数形の「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」には、複数の参照が含まれる。本明細書において、「または（ｏｒ）」へのいずれの言及も、別段に記載されていなければ、「および／または（ａｎｄ／ｏｒ）」を包含することを意図する。
一般的には、本明細書において、特に添付の特許請求の範囲（例えば、添付の特許請求の範囲の本文）で使用される用語は、全般的に、「オープン」用語であることが意図されることが当業者によって理解されるであろう（例えば、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という用語は、「以下に限定されないが、～を含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｂｕｔ ｎｏｔ ｌｉｍｉｔｅｄ ｔｏ）」と解釈されるべきであり、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」という用語は、「少なくとも～を有する（ｈａｖｉｎｇ ａｔ ｌｅａｓｔ）」と解釈されるべきであり、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」という用語は「以下に限定されないが、～を含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ ｂｕｔ ｉｓ ｎｏｔ ｌｉｍｉｔｅｄ ｔｏ）」と解釈されるべきであるなど）。さらに、導入された請求項の記載の特定数が意図される場合、このような意図は請求項で明示的に記載され、このような記載の非存在下では、このような意図は存在しないことが、当業者によって理解されるであろう。例えば、理解の一助として、以下の添付の特許請求の範囲は、請求項の記載を導入するために、導入語句「少なくとも１つの（ａｔ ｌｅａｓｔ ｏｎｅ）」および「１つまたは複数の（ｏｎｅ ｏｒ ｍｏｒｅ）」の使用を含み得る。しかし、このような語句の使用は、たとえ同一の請求項が、「１つまたは複数の（ｏｎｅ ｏｒ ｍｏｒｅ）」または「少なくとも１つの（ａｔ ｌｅａｓｔ ｏｎｅ）」という導入句および「ａ」または「ａｎ」のような不定冠詞を含む場合でも、「ａ」または「ａｎ」という不定冠詞による請求項の記載の導入がこのような導入された請求項の記載を含むいかなる特定の請求項もそのような記載を１つのみ含む実施形態に限定することを意味するものと解釈させるべきではなく（例えば、「ａ」および／または「ａｎ」は、「少なくとも１つの（ａｔ ｌｅａｓｔ ｏｎｅ）」または「１つまたは複数の（ｏｎｅ ｏｒ ｍｏｒｅ）」を意味すると解釈されるべきである）、請求項の記載を導入するために使用される定冠詞の使用についても同様である。さらに、たとえ特定数の導入された請求項の記載が明示的に記載されたとしても、このような記載は少なくとも記載された数を意味すると解釈されるべきであることを当業者は認識するであろう（例えば、「２つの記載」という他の修飾語を含まない無修飾の記載は、少なくとも２つの記載、または２つ以上の記載を意味する）。さらに、「Ａ、Ｂ、およびＣの少なくとも１つなど」に類似した慣習が使用される場合、一般的には、このような構成は当業者がその慣習を理解する意味であることが意図される（例えば、「Ａ、Ｂ、およびＣの少なくとも１つを有するシステム」は、以下に限定されないが、Ａ単独、Ｂ単独、Ｃ単独、ＡとＢの両方、ＡとＣの両方、ＢとＣの両方、および／またはＡとＢとＣの全部などを有するシステムを含むことになる）。「Ａ、Ｂ、またはＣの少なくとも１つなど」に類似した慣習が使用される場合、一般的には、このような構成は当業者がその慣習を理解する意味であることが意図される（例えば、「Ａ、Ｂ、またはＣの少なくとも１つを有するシステム」は、以下に限定されないが、Ａ単独、Ｂ単独、Ｃ単独、ＡとＢの両方、ＡとＣの両方、ＢとＣの両方、および／またはＡとＢとＣの全部などを有するシステムを含むことになる）。さらに、２つ以上の代替用語を表す実質上任意の選言的な語および／または語句は、明細書、特許請求の範囲、または図面に関わらず、用語の１つ、用語のいずれか、または用語の両方を含む可能性が企図されると理解されるべきであることが当業者によって理解されるであろう。例えば、「ＡまたはＢ」という語句は、「Ａ」または「Ｂ」または「ＡおよびＢ」の可能性を含むことが理解されるであろう。
さらに、本開示の特徴または態様がマーカッシュ群により記述される場合、それにより、本開示はまた、マーカッシュ群の任意の個別のメンバーまたはメンバーの下位群により記述されることが、当業者に認識されるであろう。
当業者に理解されるように、あらゆる目的で、例えば、記載される明細書の提供に関して、本明細書に開示された範囲はすべて、あらゆる可能な下位範囲およびその下位範囲の組合せも包含する。任意の列挙された範囲は、少なくとも２等分、３等分、４等分、５等分、１０等分などに分解された同じ範囲を十分に記述し可能にすると容易に認識され得る。非限定的な例として、本明細書で考察した各範囲は、下３分の１、中３分の１、上３分の１などに容易に分解可能である。同様に、当業者に理解されるように、「最大」、「少なくとも」、「より多い」、「より少ない」などの表現はすべて、記載された数を含み、以上で考察したように後続的に下位範囲に分解可能な範囲を指す。最後に、当業者によって理解されるように、範囲は、それぞれ個々のメンバーを含む。よって、例えば、１～３個の物品を有する群は、１、２、または３個の物品を有する群を指す。同様に、１～５個の物品を有する群は、１、２、３、４、または５個の物品を有する群を指し、他も同様である。
様々な態様および実施形態が本明細書に開示されているが、他の態様および実施形態が当業者にとって明らかであろう。本明細書に開示される様々な態様および実施形態は、例示を目的とし、限定を意図するものではなく、以下の特許請求の範囲によって示されている真の範囲および精神を有する。

Claims (15)

  1. 試料中の核酸標的を標識するための方法であって、
    核酸標的のコピーを複数のオリゴヌクレオチドバーコードと接触させることであって、各オリゴヌクレオチドバーコードは、第１のユニバーサル配列、分子標識、および前記核酸標的のコピーにハイブリダイズすることが可能な標的結合性領域を含む、こと；
    前記核酸標的のコピーにハイブリダイズした前記複数のオリゴヌクレオチドバーコードを伸長して、複数の第一鎖バーコード化ポリヌクレオチドを生成すること；
    ランダムプライマーを前記複数の第一鎖バーコード化ポリヌクレオチドと接触させることであって、前記ランダムプライマーの各々は、第２のユニバーサル配列またはその相補体を含む、こと；
    前記複数の第一鎖バーコード化ポリヌクレオチドにハイブリダイズした前記ランダムプライマーを伸長して、複数の伸長産物を生成すること；
    前記第１のユニバーサル配列またはその相補体にハイブリダイズすることが可能なプライマー、および前記第２のユニバーサル配列またはその相補体にハイブリダイズすることが可能なプライマーを使用して前記複数の伸長産物を増幅し、それにより第１の複数のバーコード化アンプリコンを生成すること；ならびに
    前記複数の第一鎖バーコード化ポリヌクレオチドを鋳型として使用して、第３の複数のバーコード化アンプリコンを合成することであって、前記第３の複数のバーコード化アンプリコンの合成は、前記第１のユニバーサル配列またはその相補体にハイブリダイズすることが可能なプライマー、および標的特異的プライマーを使用するＰＣＲ増幅を含む、こと
    を含む方法。
  2. 前記複数の伸長産物の増幅は、配列決定プライマーならびに／もしくは配列決定アダプターの結合部位の配列、それらの相補配列、ならびに／もしくはそれらの一部を、前記複数の伸長産物に付加することを含む、請求項１に記載の方法。
  3. 前記第１の複数のバーコード化アンプリコンならびに／もしくは第３の複数のバーコード化アンプリコンまたはそれらの産物に付随している別個の配列を有する分子標識の数に基づき、前記試料中の前記核酸標的のコピー数を決定することを含む、請求項１～２のいずれか１項に記載の方法。
  4. 試料中の核酸標的の数を決定するための方法であって、
    核酸標的のコピーを複数のオリゴヌクレオチドバーコードと接触させることであって、各オリゴヌクレオチドバーコードは、第１のユニバーサル配列、分子標識、および前記核酸標的のコピーにハイブリダイズすることが可能な標的結合性領域を含む、こと；
    前記核酸標的のコピーにハイブリダイズした前記複数のオリゴヌクレオチドバーコードを伸長して、複数の第一鎖バーコード化ポリヌクレオチドを生成すること；
    ランダムプライマーを前記複数の第一鎖バーコード化ポリヌクレオチドと接触させることであって、前記ランダムプライマーの各々は、第２のユニバーサル配列またはその相補体を含む、こと；
    前記複数の第一鎖バーコード化ポリヌクレオチドにハイブリダイズした前記ランダムプライマーを伸長して、複数の伸長産物を生成すること；
    前記第１のユニバーサル配列またはその相補体にハイブリダイズすることが可能なプライマー、および前記第２のユニバーサル配列またはその相補体にハイブリダイズすることが可能なプライマーを使用して前記複数の伸長産物を増幅し、それにより第１の複数のバーコード化アンプリコンを生成すること；
    前記複数の第一鎖バーコード化ポリヌクレオチドを鋳型として使用して、第３の複数のバーコード化アンプリコンを合成することであって、前記第３の複数のバーコード化アンプリコンの合成は、前記第１のユニバーサル配列またはその相補体にハイブリダイズすることが可能なプライマー、および標的特異的プライマーを使用するＰＣＲ増幅を含む、こと；および
    前記第１の複数のバーコード化アンプリコンならびに／もしくは第３の複数のバーコード化アンプリコンまたはそれらの産物に付随している別個の配列を有する分子標識の数に基づき、前記試料中の前記核酸標的のコピー数を決定すること
    を含む方法。
  5. 核酸標的のコピーの接触は、複数の核酸標的のコピーを複数のオリゴヌクレオチドバーコードと接触させることを含み、
    前記複数のオリゴヌクレオチドバーコードの伸長は、前記複数の核酸標的のコピーにハイブリダイズした前記複数のオリゴヌクレオチドバーコードを伸長して、複数の第一鎖バーコード化ポリヌクレオチドを生成することを含み、および
    前記試料中の前記核酸標的のコピー数の決定は、前記複数の核酸標的の各々の配列を含む前記第１の複数のバーコード化アンプリコンのうちのバーコード化アンプリコンに付随している別個の配列を有する前記分子標識の数に基づき、前記試料中の前記複数の核酸標的の各々の数を決定することを含む、請求項３または請求項４に記載の方法。
  6. 前記第１の複数のバーコード化アンプリコン中の前記核酸標的の配列は、前記核酸標的の部分配列を含む、請求項３～５のいずれか１項に記載の方法。
  7. 前記第１のユニバーサル配列またはその相補体にハイブリダイズすることが可能なプライマー、および前記第２のユニバーサル配列またはその相補体にハイブリダイズすることが可能なプライマーを使用して前記第１の複数のバーコード化アンプリコンを増幅し、それにより第２の複数のバーコード化アンプリコンを生成することを含む、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
  8. （a）前記第１の複数のバーコード化アンプリコンの増幅は、配列決定プライマーならびに／もしくは配列決定アダプターの結合部位の配列、それらの相補配列、ならびに／もしくはそれらの一部を、前記第１の複数のバーコード化アンプリコンに付加することを含む;
    （b）前記方法が、前記第２の複数のバーコード化アンプリコンまたはそれらの産物に付随している別個の配列を有する分子標識の数に基づき、前記試料中の前記核酸標的のコピー数を決定することを含む；
    （c）核酸標的のコピーの接触は、複数の核酸標的のコピーを複数のオリゴヌクレオチドバーコードと接触させることを含む；
    （d）前記複数のオリゴヌクレオチドバーコードの伸長は、前記複数の核酸標的のコピーにハイブリダイズした前記複数のオリゴヌクレオチドバーコードを伸長して、複数の第一鎖バーコード化ポリヌクレオチドを生成することを含む；および／または
    （e）前記試料中の前記核酸標的のコピー数の決定は、前記複数の核酸標的の各々の配列を含む前記第２の複数のバーコード化アンプリコンのうちのバーコード化アンプリコンに付随している別個の配列を有する前記分子標識の数に基づき、前記試料中の前記複数の核酸標的の各々の数を決定することを含む、および／または
    （f）前記第２の複数のバーコード化アンプリコン中の前記核酸標的の配列は、前記核酸標的の部分配列を含む、請求項７に記載の方法。
  9. 前記第１の複数のバーコード化アンプリコンおよび／または前記第２の複数のバーコード化アンプリコンの各々は、前記第１のユニバーサル配列、前記第２のユニバーサル配列、または両方の少なくとも一部分を含む、請求項７～８のいずれか１項に記載の方法。
  10. （a）前記第１のユニバーサル配列および前記第２のユニバーサル配列は
    (i)同じである;もしくは
    (ii)異なる；および/または
    （b）前記第１のユニバーサル配列および／または前記第２のユニバーサル配列は、配列決定プライマーならびに／もしくは配列決定アダプターの結合部位、それらの相補配列、ならびに／もしくはそれらの一部を含み；および/または
    （c）前記第１のユニバーサル配列および／または前記第２のユニバーサル配列は、配列決定プライマーならびに／もしくは配列決定アダプターの結合部位、それらの相補配列、ならびに／もしくはそれらの一部を含み、前記配列決定アダプターは、Ｐ５配列、Ｐ７配列、それらの相補配列、ならびに／もしくはそれらの一部を含み；および/または
    （d）前記第１のユニバーサル配列および／または前記第２のユニバーサル配列は、配列決定プライマーならびに／もしくは配列決定アダプターの結合部位、それらの相補配列、ならびに／もしくはそれらの一部を含み、前記配列決定プライマーは、リード１配列決定プライマー、リード２配列決定プライマー、それらの相補配列、ならびに／もしくはそれらの一部を含み；および/または
    （e）前記核酸標的のコピーにハイブリダイズした前記複数のオリゴヌクレオチドバーコードの伸長は、逆転写酵素を使用して、前記核酸標的のコピーにハイブリダイズした前記複数のオリゴヌクレオチドバーコードを伸長することを含み；および／または
    （f）前記核酸標的のコピーにハイブリダイズした前記複数のオリゴヌクレオチドバーコードの伸長は、逆転写酵素を使用して、前記核酸標的のコピーにハイブリダイズした前記複数のオリゴヌクレオチドバーコードを伸長することを含み、かつ前記逆転写酵素は、ウイルス逆転写酵素を含み；および／または
    （g）（i）前記核酸標的のコピーにハイブリダイズした前記複数のオリゴヌクレオチドバーコードの伸長は、５’から３’のエキソヌクレアーゼ活性および３’から５’のエキソヌクレアーゼ活性のうちの少なくとも１つを欠如するＤＮＡポリメラーゼを使用して、前記核酸標的のコピーにハイブリダイズした前記複数のオリゴヌクレオチドバーコードを伸長することを含み；もしくは
    （ii）前記核酸標的のコピーにハイブリダイズした前記複数のオリゴヌクレオチドバーコードの伸長は、５’から３’のエキソヌクレアーゼ活性および３’から５’のエキソヌクレアーゼ活性のうちの少なくとも１つを欠如するＤＮＡポリメラーゼを使用して、前記核酸標的のコピーにハイブリダイズした前記複数のオリゴヌクレオチドバーコードを伸長することを含み、かつ前記ＤＮＡポリメラーゼは、Ｋｌｅｎｏｗ断片を含み；もしくは
    (iii)前記複数の第一鎖バーコード化ポリヌクレオチドにハイブリダイズした前記ランダムプライマーの伸長は、５’から３’のエキソヌクレアーゼ活性および３’から５’のエキソヌクレアーゼ活性のうちの少なくとも１つを欠如するＤＮＡポリメラーゼを使用して、前記複数の第一鎖バーコード化ポリヌクレオチドにハイブリダイズした前記ランダムプライマーを伸長することを含み、；もしくは
    （iv）前記複数の第一鎖バーコード化ポリヌクレオチドにハイブリダイズした前記ランダムプライマーの伸長は、５’から３’のエキソヌクレアーゼ活性および３’から５’のエキソヌクレアーゼ活性のうちの少なくとも１つを欠如するＤＮＡポリメラーゼを使用して、前記複数の第一鎖バーコード化ポリヌクレオチドにハイブリダイズした前記ランダムプライマーを伸長することを含み、かつ前記ＤＮＡポリメラーゼは、Ｋｌｅｎｏｗ断片を含む、
    請求項１～９のいずれか１項に記載の方法。
  11. (a)前記第１の複数のバーコード化アンプリコンならびに／もしくは前記第２の複数のバーコード化アンプリコンは、全トランスクリプトーム増幅（ＷＴＡ）産物を含む；
    (b)前記第１の複数のバーコード化アンプリコンおよび／または前記第２の複数のバーコード化アンプリコンは、単一細胞のｍＲＮＡの少なくとも１０％に相当する；および／または
    (c)前記第１の複数のバーコード化アンプリコンおよび／または前記第２の複数のバーコード化アンプリコンは、単一細胞のｍＲＮＡの少なくとも５０％または少なくとも９０％に相当する、請求項７に記載の方法。
  12. (a)前記複数の核酸標的の１つまたは複数は、低発現遺伝子のｍＲＮＡを含む;
    (b)前記ランダムプライマーは、ヌクレオチドのランダム配列を含む;
    (c)前記ランダムプライマーは、ヌクレオチドのランダム配列を含み、かつ前記ヌクレオチドのランダム配列は、約４～約３０ヌクレオチド長である;
    (d)前記ランダムプライマーは、ヌクレオチドのランダム配列を含み、かつ前記ヌクレオチドのランダム配列は、６または９ヌクレオチド長である;
    (e)前記標的結合性領域は、オリゴｄＴ配列、ランダム配列、標的特異的配列、またはそれらの組合せを含む;
    (f)前記標的結合性領域は、ポリ（ｄＴ）領域を含み、前記核酸標的は、ポリ（ｄＡ）領域を含む;
    (g)前記方法は、ランダムプライマーを、前記複数の第一鎖バーコード化ポリヌクレオチドと接触させるステップ、前記複数の第一鎖バーコード化ポリヌクレオチドにハイブリダイズした前記ランダムプライマーを伸長するステップ、および前記複数の伸長産物を増幅するステップを繰り返すことを含む；
    (h)第３の複数のバーコード化アンプリコンの合成は、前記複数の第一鎖バーコード化ポリヌクレオチドのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅を実施することを含む；
    (i)前記標的特異的プライマーは、免疫受容体に特異的にハイブリダイズする；
    (j)前記標的特異的プライマーは、免疫受容体に特異的にハイブリダイズし、かつ前記免疫受容体は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）および／またはＢ細胞受容体（ＢＣＲ）受容体である；
    (k)前記方法は前記第３の複数のバーコード化アンプリコンまたはそれらの産物の配列情報を得ることを含む；
    (l)前記方法は前記第３の複数のバーコード化アンプリコンまたはそれらの産物の配列情報を得ることを含み、かつ前記配列情報の取得は、配列決定アダプターを、前記第３の複数のバーコード化アンプリコンまたはそれらの産物に付着させることを含む；
    （m）前記試料は、複数の細胞、複数の単一細胞、組織、腫瘍試料、またはそれらの任意の組合せを含む；および／または
    （n）前記試料は、末梢血単核細胞または免疫細胞を含む、および／または
    （o）前記試料は、末梢血単核細胞または免疫細胞を含み、かつ前記免疫細胞は、Ｂ細胞、Ｔ細胞、またはそれらの組合せを含む、
    請求項１～１１のいずれか１項に記載の方法。
  13. 前記複数の伸長産物の増幅は、固体支持体の存在下では実施されない、請求項２～１２のいずれか１項に記載の方法。
  14. （ａ）前記方法が、ＲＮａｓｅＨ誘導性プライミング、末端修復、および／またはアダプターライゲーションを含まない；
    （ｂ）前記方法が、断片化、タグ付け、または両方を含まない；
    （ｃ）前記第一鎖バーコード化ポリヌクレオチドは、バーコード化デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）分子、バーコード化リボ核酸（ＲＮＡ）分子、もしくは両方を含む；
    （ｄ）前記核酸標的は核酸分子を含む、
    （ｅ）前記核酸標的は核酸分子を含み、かつ
    （i）前記核酸分子は、リボ核酸（ＲＮＡ）、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ＲＮＡ分解産物、ポリ（Ａ）テイルを含むＲＮＡ、またはそれらの任意の組合せを含み；ならびに／もしくは
    (ii)前記ｍＲＮＡは免疫受容体をコードし；ならびに／もしくは
    （iii）前記核酸標的は細胞成分結合性試薬を含む；
    （iｖ）前記核酸標的は細胞成分結合性試薬を含み、かつ前記核酸分子は、前記細胞成分結合性試薬に付随し；ならびに／もしくは
    （v）前記核酸標的は細胞成分結合性試薬を含み、前記核酸分子は、前記細胞成分結合性試薬に付随しており、かつ前記方法は、前記核酸分子および前記細胞成分結合性試薬を解離させることを含む；および／または
    （ｆ）前記複数のオリゴヌクレオチドバーコードのうちの少なくとも１０個は、異なる分子標識配列を含む；
    （ｇ）前記複数のオリゴヌクレオチドバーコードの各分子標識は、少なくとも６個のヌクレオチドを含む；
    （ｈ）前記複数のオリゴヌクレオチドバーコードは、固体支持体に付随している；
    （ｉ）前記複数のオリゴヌクレオチドバーコードは、固体支持体に付随しており、かつ
    （i）前記固体支持体は、合成粒子、平面状表面、またはそれらの組合せを含む；ならびに／もしくは
    （ii）同じ固体支持体に付随している前記複数のオリゴヌクレオチドバーコードは各々、同一の試料標識を含み、前記複数のオリゴヌクレオチドバーコードの各試料標識は、少なくとも６個のヌクレオチドを含む；および／または
    （ｊ）前記複数のオリゴヌクレオチドバーコードは各々、細胞標識を含む；
    （ｋ）前記複数のオリゴヌクレオチドバーコードは各々、細胞標識を含み、前記複数のオリゴヌクレオチドバーコードの各細胞標識は、少なくとも６個のヌクレオチドを含む；および／または
    （ｌ）前記複数のオリゴヌクレオチドバーコードは各々、細胞標識を含み、前記複数のオリゴヌクレオチドバーコードの各細胞標識は、少なくとも６個のヌクレオチドを含み、かつ
    （i）同じ固体支持体に付随しているオリゴヌクレオチドバーコードは、同じ細胞標識を含む；ならびに／もしくは
    (ii)異なる固体支持体に付随しているオリゴヌクレオチドバーコードは、異なる細胞標識を含む、請求項１～１３のいずれか１項に記載の方法。
  15. 前記試料は単一細胞を含み、前記方法は、前記複数のオリゴヌクレオチドバーコードを含む合成粒子を、前記試料中の前記単一細胞に付随させることを含み、以下の１以上が適用される：
    （ａ）前記方法は、前記合成粒子を前記単一細胞に付随させた後で前記単一細胞を溶解することを含む；
    （ｂ）前記方法は、前記合成粒子を前記単一細胞に付随させた後で前記単一細胞を溶解することを含み、前記単一細胞の溶解は、前記試料を加熱すること、前記試料を界面活性剤と接触させること、前記試料のｐＨを変化させること、またはそれらの任意の組合せを含む；
    （ｃ）前記合成粒子および前記単一細胞は同じ区画に存在する；
    （ｄ）前記合成粒子および前記単一細胞は同じ区画に存在し、前記区画は、ウェルまたは液滴であり；
    （ｅ）前記複数のオリゴヌクレオチドバーコードのうちの少なくとも１つは、前記合成粒子上に固定化されているかまたは部分的に固定化されている；
    （ｆ）前記複数のオリゴヌクレオチドバーコードのうちの少なくとも１つは、前記合成粒子内に封入されているかまたは部分的に封入されている；
    （ｇ）前記合成粒子は破壊可能である；
    （ｈ）前記合成粒子は破壊可能であり、前記合成粒子は、破壊可能なヒドロゲル粒子である；
    （ｉ）前記合成粒子はビーズを含む；
    （ｊ）前記合成粒子はビーズを含み、前記ビーズは、セファロースビーズ、ストレプトアビジンビーズ、アガロースビーズ、磁気ビーズ、コンジュゲートビーズ、プロテインＡコンジュゲートビーズ、プロテインＧコンジュゲートビーズ、プロテインＡ／Ｇコンジュゲートビーズ、プロテインＬコンジュゲートビーズ、オリゴ（ｄＴ）コンジュゲートビーズ、シリカビーズ、ヒドロゲルビーズ、ゲルビーズ、シリカ様ビーズ、抗ビオチンマイクロビーズ、抗蛍光色素マイクロビーズ、またはそれらの任意の組合せを含む；
    （ｋ）前記合成粒子は、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ポリスチレン、ガラス、ポリプロピレン、アガロース、ゼラチン、ヒドロゲル、常磁性体、セラミック、プラスチック、メチルスチレン、アクリルポリマー、チタン、ラテックス、セファロース、セルロース、ナイロン、シリコーン、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される材料を含む、および／または
    （ｌ）前記複数のオリゴヌクレオチドバーコードの各々は、リンカー官能基を含む、
    前記合成粒子は、固体支持体官能基を含み、ならびに／もしくは
    前記支持体官能基および前記リンカー官能基は互いに付随しており；および／または
    （ｍ）前記複数のオリゴヌクレオチドバーコードの各々は、リンカー官能基を含み、
    前記合成粒子は、固体支持体官能基を含み、ならびに／もしくは
    前記支持体官能基および前記リンカー官能基は互いに付随しており；かつ、前記リンカー官能基および前記支持体官能基は、Ｃ６、ビオチン、ストレプトアビジン、第一級アミン、アルデヒド、ケトン、およびそれらの任意の組合せからなる群から個々に選択されている
    請求項１～１４のいずれか１項に記載の方法。
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