DE69736780T2 - Polypeptide mit einzelnem kovalent gebundenen n-terminalen wasserlöslichen polymer - Google Patents

Polypeptide mit einzelnem kovalent gebundenen n-terminalen wasserlöslichen polymer Download PDF

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Description

  • Gebiet der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft Polypeptide, an deren N-Termini ein einzelnes wasserlösliches Polymer gebunden ist. Diese Polypeptide haben Eigenschaften, die sie für die Verwendung als Pharmazeutika und Diagnostika vorteilhaft machen. Die Erfindung betrifft außerdem Verfahren zum Herstellen dieser Polypeptide und zugehörige pharmazeutische Zusammensetzungen und Kits.
  • Allgemeiner Stand der Technik
  • Überall in dieser Anmeldung werden verschiedene Veröffentlichungen zitiert. Die Offenbarung dieser Veröffentlichungen ist hiermit durch Bezugnahme in die Anmeldung aufgenommen, um den Stand der Technik vollständiger zu beschreiben, den diese Erfindung betrifft.
  • In der jüngsten Vergangenheit wurden nichtantigene wasserlösliche Polymere, wie Polyethylenglykol („PEG"), für die kovalente Modifikation von Polypeptiden von therapeutischer und diagnostischer Bedeutung verwendet. Zum Beispiel wurde von kovalenter Anlagerung von PEG an therapeutische Polypeptide, wie Interleukine (M.J. Knauf et al., J. Biol. Chem. 1988, 263, 15 064; Y. Tsutsumi et al., J. Controlled Release 1995, 33, 447), Interferone (Y. Kita et al., Drug Des. Delivery 1990, 6, 157) Katalase (A. Abuchowski et al., J. Biol. Chem. 1977, 252, 3 582), Superoxiddismutase (C.O. Beauchamp et al., Anal. Biochem. 1983, 131, 25) und Adenosindeaminase (R. Chen et al., Biochim. Biophy. Acta 1981, 660, 293), berichtet, um ihre Halbwertzeiten in vivo zu verlängern und/oder ihre Immunogenität und Antigenität zu reduzieren.
  • Solche Verfahren haben jedoch beträchtliche Nachteile. Speziell werden PEG-Moleküle in den meisten Fällen mittels Aminogruppen unter Verwendung von methoxyliertem PEG („mPEG") mit unterschiedlichen reaktionsfähigen Gruppen an Polypeptiden angelagert. Zu solchen Polymeren zählen mPEG-Succinimidylsuccinat, mPEG-Succinimidylcarbonat, mPEG-Imidat und mPEG-Cyanurchlorid. Die Anlagerung unter Verwendung dieser Polymere war gewöhnlich unspezifisch, d. h. erfolgte auf zufällige Weise an verschiedenen Aminogruppen an den Polypeptiden und nicht ausschließlich an einer bestimmten Aminogruppe. Eine solche unspezifische Anlagerung kann Aminosäurereste an aktiven Orten derart modifizieren, dass die biologische Aktivität der Polypeptide eliminiert wird. Zudem können die resultierenden Konjugate eine heterogene Mischung von modifizierten Polypeptiden enthalten, was für die pharmazeutische Verwendung nicht wünschenswert ist.
  • Um diese Probleme zu überwinden, war es wünschenswert, ein Polymer ortsspezifisch an ein Polypeptid anzulagern. Bei dem Polypeptid würde eine solche Vorgehensweise die biologische Aktivität bewahren, die Blutzirkulationszeit verlängern, die Immunogenität reduzieren, die Wasserlöslichkeit erhöhen und die Beständigkeit gegenüber Proteaseverdauung fördern. Ortsspezifische Pegylierung am N-Terminus, an der Seitenkette und am C-Terminus eines potenten Analogons von Somatotropin-releasing-Faktor wurde mittels Festphasensynthese durchgeführt (A.M. Felix et al., Int. J. Peptide Protein Res. 1995, 46, 253). Da die spezifische Pegylierung während der Anordnung des Peptids an einem Harz erzielt wurde, kann das Verfahren nicht auf ein existierendes Peptid angewendet werden.
  • Ein weiteres verwendetes Verfahren schloss das Anlagern eines Peptids an Enden von liposomalen, auf die Oberfläche gepfropften PEG-Ketten in einer ortsspezifischen Weise mittels einer reaktionsfähigen Aldehydgruppe am N-Terminus ein, die durch Natriumperiodat-Oxidation von N-terminalem Threonin erzeugt wurde (S. Zalipsky et al., Bioconj. Chem. 1995, 6, 705). Dieses Verfahren ist jedoch auf Polypeptide mit N-terminalen Serin- oder Threoninresten beschränkt.
  • Enzymunterstützte Verfahren zum Einführen von aktivierten Gruppen speziell am C-Terminus eines Polypeptids wurden ebenfalls beschrieben (A. Schwarz et al., Methods Enzymol. 1990, 184, 160; K. Rose et al., Bioconjugate Chem. 1991, 2, 154; H.F. Gaertner et al., J. Biol. Chem. 1994, 269, 7 224). In der Regel können diese aktiven Gruppen Hydrazid-, Aldehyd- und aromatische Aminogruppen zur anschließenden Anlagerung von funktionellen Sonden an Polypeptiden sein. Da die Verfahren jedoch auf der Spezifität von Proteasen basieren, bedingen sie äußerste Vorsicht und der Umfang ihrer Anwendung ist begrenzt.
  • Ortsspezifische Mutagenese ist ein weiterer Ansatz, der zum Herstellen von Polypeptiden zur ortsspezifischen Anlagerung an Polymeren verwendet wurde. WO 90/12874 beschreibt ortsgerichtete Pegylierung von Proteinen, die durch die Insertion von Cysteinresten oder die Substitution von anderen Resten durch Cysteinreste modifiziert wurden. Diese Veröffentlichung beschreibt außerdem die Herstellung von mPEG-Erythropoetin („mPEG-EPO") durch Umsetzen eines cysteinspezifischen mPEG-Derivats mit einem rekombinant eingeführten Cysteinrest an EPO. In ähnlicher Weise wurde Interleukin-2 an seinem Glykosylierungsort nach einer ortsgerichteten Mutagenese pegyliert (R.J. Goodson et al., Bio/Technology 1990, 8, 343).
  • Glykoproteine stellen Kohlenhydrate als zusätzliche Zielorte zur Modifikation bereit. Das Enzym Peroxidase wurde mit PEG-Diamin über seine Kohlenhydratgruppe modifiziert (M. Urrutiogoity et al., Biocatalysis 1989, 2, 145). WO 94/28024 beschreibt die Verfahren zum Herstellen von mPEG-EPO durch periodatoxidiertes Kohlenhydrat. Die involvierte Chemie war Hydrazonbildung durch Umsetzen von mPEG-Hydrazid mit Aldehydgruppen der Kohlenhydratgruppe an EPO. Diese Art von Modifikation erzeugt reaktionsfähige Aldehydgruppen durch einen Oxidationsschritt, die potentiell verschiedene Arten von Zuckerresten in der Kohlenhydratgruppe und einige Aminosäurereste in dem Polypeptid, wie Methionin, oxidieren können. Ein weiterer Nachteil dieses Verfahrens rührt von der Heterogenität der Kohlenhydratgruppen von EPO her. Aus Eierstockzellen des Chinesischen Hamsters exprimiertes EPO weist vier Kohlenhydratketten auf, die drei N-verknüpfte Ketten an den Asparaginen 24, 38 und 83 und eine O-verknüpfte Kette am Serin 126 beinhaltet. Insgesamt 52 unterschiedliche N-verknüpfte und mindestens 6 O-verknüpfte Oligosaccharidstrukturen wurden identifiziert (R.S. Rush et al., Anal. Chem. 1995, 67, 1 442; K.B. Linsley et al., Anal. Biochem. 1994, 219, 207). Dementsprechend ist es schwierig, die Anzahl oder Anlagerungsorte von Polymermolekülen zu kontrollieren, wenn EPO oder ein anderes Protein über seine Kohlenhydratketten modifiziert wird.
  • Kurz gesagt, die Verfahren in der Technik zum Anlagern eines wasserlöslichen Polymers an ein Polypeptid leiden unter beträchtlichen Nachteilen. Diese Nachteile beinhalten die folgenden: (a) ein Mangel an Präzision, sowohl stöchiometrisch als auch bezüglich des Anlagerungssitus; (b) das Erfordernis, schwierige und laborintensive Techniken wie ortsspezifische Mutagenese durchzuführen; (c) das Erfordernis, Festphasenpeptidsynthese gleichzeitig mit Polymeranlagerung anzuwenden, anstatt ein Polymer an einem vorher vorhandenen Polypeptid anzulagern; und (d) das unumstößliche Erfordernis, dass die Identität des N-terminalen Aminosäurerests Threonin oder Serin sein muss.
  • Seit einiger Zeit hat Bedarf an einem allgemeinen Verfahren zum ortsspezifischen Anlagern eines wasserlöslichen Polymers an dem N-terminalen Aminosäurerest eines Polypeptids bestanden, wobei dieses Verfahren nicht unter den oben identifizierten Nachteilen leidet. Ein solches Verfahren gibt es jedoch nicht.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Diese Erfindung stellt zwei Stoffzusammensetzungen bereit. Die erste Stoffzusammensetzung besteht im wesentlichen aus einem Polypeptid und einem wasserlöslichen Polymer, kovalent über eine Hydrazonbindung oder reduzierte Hydrazonbindung an dem N-terminalen α-Kohlenstoffatom des Polypeptids gebunden, unter der Bedingung, dass (a) das Polymer ein Molekulargewicht von 700 bis 20 000 Daltons hat, (b) die natürliche Funktion des Polypeptids bei Entfernung seiner N-terminalen α-Aminogruppe nicht eliminiert wird, und (c) der N-terminale Aminosäurerest des Polypeptids nicht Serin oder Threonin ist.
  • Diese Erfindung stellt auch vier Verfahren zum kovalenten Binden eines wasserlöslichen Polymers an das N-terminale α-Kohlenstoffatom eines Polypeptids bereit. Das erste Verfahren, das das Polymer über eine Hydrazonbindung an das Kohlenstoffatom bindet, umfasst die Schritte:
    • (a) In-Kontakt-Bringen des Polypeptids mit (i) einem Glyoxylation oder einem Derivat davon in einer Konzentration von 0,1 M bis 2,0 M, (ii) einem Übergangsmetallion in einer Konzentration von 10 μM bis 1 M und (iii) einer Lewis-Base in einer Konzentration von 10 mM bis 10 M, bei einem pH von 5,0 bis 7,0 und einer Temperatur von 0°C bis 100°C, um ein transaminiertes Polypeptid mit einer N-terminalen α-Carbonylgruppe zu bilden; und
    • (b) In-Kontakt-Bringen des transaminierten Polypeptids bei einem pH von 3,0 bis 5,0 mit einem wasserlöslichen Polymer, das eine daran kovalent gebundene Gruppe hat, die mit der N-terminalen α-Carbonylgruppe des transaminierten Polypeptids reagiert, um eine Hydrazonbindung zu bilden, wodurch das Polymer über eine Hydrazonbindung an das N-terminale α-Kohlenstoffatom des Polypeptids kovalent gebunden wird, unter der Bedingung, dass das PEG ein Molekulargewicht von 700 bis 20 000 Daltons hat und die natürliche Funktion des Polypeptids bei Entfernen seiner N-terminalen α-Aminogruppe nicht eliminiert wird.
  • Diese Erfindung stellt auch eine pharmazeutische Zusammensetzung bereit, die eine wirksame Menge der vorliegenden ersten Zusammensetzung und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger umfasst.
  • Schließlich stellt diese Erfindung Kits zur Verwendung beim Herstellen der vorliegenden Zusammensetzungen bereit. Das erste Kit zum Herstellen der ersten vorliegenden Zusammensetzung umfasst folgendes:
    • (a) ein Glyoxylation oder Derivat davon;
    • (b) ein Übergangsmetallion;
    • (c) eine Lewis-Base; und
    • (d) ein wasserlösliches Polymer mit einem Molekulargewicht von 700 bis 20 000 Daltons und mit einer kovalent angebundenen Gruppe, die mit einer N-terminalen α-Carbonylgruppe des transaminierten Polypeptids reagiert, um eine Hydrazonbindung zu bilden, wodurch das Polymer an das N-terminale α-Kohlenstoffatom des Polypeptids kovalent gebunden wird.
  • Kurzbeschreibung der Figuren
  • 1 zeigt ein Schema zum Herstellen von N-terminalem modifiziertem EPO. Dabei handelt es sich um eine Reaktion mit zwei Schritten: Transaminierung und Pegylierung. Vier mPEG5000-Derivate (d. h. mPEG mit einem MG von 5 000 Daltons) mit funktionellen Hydrazincarboxylat-(HZC), Hydrazid-(HZ), Semicarbazid-(SCZ) und Oxylamingruppen wurden verwendet.
  • 2 zeigt das Gelfiltrationschromatogramm von mPEG-EPO mit einer Hydrazonbindung, die unter Verwendung einer Hydrazincarboxylatgruppe (HZC-Gruppe) gebildet wurde, nativem EPO und mPEG5000-Hydrazincarboxylat auf einer TSK-G3000SWXL-Säule (7,5 × 30 mm). Die mobile Phase ist 20 mM Natriumcitrat (pH 7,0), das 100 mM NaCl enthält.
  • 3 zeigt ein matrixunterstütztes Laserdesorptionslaufzeitmassenspektrum von mPEG5000-Hydrazincarboxylat, nativem EPO und mPEG-EPO mit einer Hydrazonbindung, die unter Verwendung einer Hydrazincarboxylatgruppe (HZC-Gruppe) gebildet wurde.
  • 4 zeigt die Charakterisierung von mPEG-EPO mittels Elektrophoreseverfahren: (1) 4-15%-ige SDS-PAGE, Coomassie-Färbung; (2) Western-Blot; (3) 4-15%-ige SDS-PAGE, Iodfärbung und (4) isoelektrische Fokussierung (IEF, pH 3-7). Spur 1: MG- oder pI-Markierungen; Spur 2: natives EPO; Spur 3: transaminiertes EPO und Spuren 4 und 5: mPEG-EPO mit Hydrazonbindungen, die unter Verwendung von Hydrazincarboxylatgruppen (HZC-Gruppen) bzw. Hydrazidgruppen (HZ-Gruppen) gebildet wurden.
  • 5 zeigt einen Graph von Ergebnissen eines ELISA-Assays für mPEG-EPO mit Hydrazonbindungen, die unter Verwendung von Hydrazincarboxylatgruppen (HZC-Gruppen) und Hydrazidgruppen (HZ-Gruppen) gebildet wurden.
  • 6 zeigt einen Graph der Ergebnisse eines Zellproliferationsassays von nativem EPO, transaminiertem EPO und mPEG-EPO mit Hydrazonbindungen, die unter Verwendung von Hydrazincarboxylatgruppen (HZC-Gruppen) und Hydrazidgruppen (HZ-Gruppen) gebildet wurden.
  • 7 zeigt einen Graph von Ergebnissen eines Bioassays an exhypoxischen Mäusen für mPEG-EPO mit Hydrazonbindungen, die unter Verwendung von Hydrazincarboxylatgruppen (HZC-Gruppen), Hydrazidgruppen (HZ-Gruppen) und Semicarbazidgruppen (SCZ-Gruppen) gebildet wurden.
  • Ausführliche Beschreibung der Erfindung
  • Diese Erfindung stellt zwei Stoffzusammensetzungen bereit. Die erste Stoffzusammensetzung besteht im wesentlichen aus einem Polypeptid und einem wasserlöslichen Polymer, kovalent über eine Hydrazonbindung oder reduzierte Hydrazonbindung an dem N-terminalen α-Kohlenstoffatom des Polypeptids gebunden, unter der Bedingung, dass (a) das Polymer ein Molekulargewicht von 700 bis 20 000 Daltons hat, (b) die natürliche Funktion des Polypeptids bei Entfernung seiner N-terminalen α-Aminogruppe nicht eliminiert wird, und (c) der N-terminale Aminosäurerest des Polypeptids nicht Serin oder Threonin ist.
  • Wie hierin verwendet, beinhaltet „Polypeptid" sowohl Peptide als auch Proteine. „Peptid" steht für ein Polypeptid, das weniger als 10 Aminosäurereste lang ist, und „Protein" steht für ein Polypeptid, das 10 oder mehr Aminosäurereste lang ist. In dieser Erfindung können die Polypeptide natürlich vorkommen oder rekombinant sein (d. h. mittels rekombinanter DNA-Technologie produziert) und können Mutationen (z. B. Punkt-, Insertions- und Deletionsmutationen) als auch andere kovalente Modifikationen (z. B. Glykosylierung und Markierung [über Biotin, Streptavidin, Fluoracin und Radioisotope wie [131]) enthalten. Darüber hinaus kann jede vorliegende Zusammensetzung mehr als ein einzelnes Polypeptid enthalten, d. h. jedes kann ein Monomer (ein an ein Polymer gebundenes Polypeptid) oder ein Multimer (zwei oder mehr an ein Polymer oder aneinander gebundene Polypeptide) sein.
  • Zu Polypeptiden zählen beispielsweise monoklonale und polyklonale Antikörper, Cytokine, wie M-CSF und GM-CSF, Lymphokine, IL-2, IL-3, Wachstumsfaktoren, wie PDGF und EGF, Peptidhormone, wie hGH, EPO und Derivate davon, Blutgerinnungsfaktoren, wie Faktor VIII, Immungene, Enzyme, Enzyminhibitoren und andere Liganden. In der bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Zusammensetzungen ist das Polypeptid EPO oder ein Derivat davon. Das EPO kann natürlich vorkommen oder rekombinant sein. Derivate von EPO beinhalten, sind aber nicht darauf beschränkt, die Polypeptide
    GGLYLCRFGPVTWDCGYKGG,
    GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG,
    GGDYHCRMGPLTWVCKPLGG,
    VGNYMCHFGPITWVCRPGGG,
    GGVYACRMGPITWVCSPLGG,
    VGNYMAHMGPITWVCRPGG,
    GGTYSCHFGPLTWVCKPQ,
    GGLYACHMGPMTWVCQPLRG,
    TIAQYICYMGPETWECRPSPKA,
    YSCHFGPLTWVCK und
    YCHFGPLTWVC
    sowie die in Tabelle 1 unten aufgeführten Mutationen. Tabelle 1
    Figure 00080001
    Figure 00090001
    Figure 00100001
    Figure 00110001
  • Figure 00110002
    In Bezug auf den Wildtyp ist wie folgt definiert:
    • ++++ = Wildtyp- oder bessere Aktivität
    • +++ = ca. 75% der Wildtyp-Aktivität
    • ++ = ca. 50% der Wildtyp-Aktivität
    • + = ca. 25% der Wildtyp-Aktivität
    • +/– = Mutanten-EPO als aktiv angegeben, Daten jedoch nicht vollständig zur Einschätzung der Aktivität in Bezug auf den Wildtyp.
  • Zitierte Literaturhinweise
    • (1) K. Akai, K. Yamaguchi und M. Ueda, Modified forms of human erythropoietin and DNA sequences encoding genes which can express them, EP 0427 189 A1 .
    • (2) T. Bittorf, R. Jaster und J. Brock (1993), FEBS Letts. 336: 133-136.
    • (3) Ergebnisse von H.F. Bunn et al.
    • (4) T.E. Byrne und S.G. Elliott, Erythropoietin isoforms, EP 0 668 351 A1 .
    • (5) Y. Chern, T. Chung und A.J. Sytkowski (1991), Eur. J. Biochem. 202: 225-229.
    • (6) A. Funakoshi, H. Muta, T. Baba und S. Shimizu (1993), Biochem. Biophys. Res. Commun. 195: 717-722.
    • (7) G. Okasinski, P.J. Devries, B.S. Mellovitz, J.L. Meuth und V.G. Schaefer, Erythropoietin analog compositions and methods, WO 94/25055.
    • (8) J. Grodberg, K.L. Davis und A.J. Sytkowski (1993), Eur. J. Biochem. 218: 597-601.
    • (9) Ergebnisse von V. Pulito et al.
    • (10) C.B. Shoemaker, Erythropoietin composition, U.S. 4,835,260 .
  • Wie hierin verwendet, steht die „natürliche Funktion" eines Polypeptids für seine Funktion vor der kovalenten Modifikation seiner N-terminalen α-Aminogruppe. Zu natürlichen Funktionen zählen beispielsweise enzymatische Aktivität, Rezeptorbindung (z. B. Antikörper), Ligandenbindung und Immunogenität.
  • Die unten vollständiger beschriebenen vorliegenden Verfahren bewirken den Verlust der N-terminalen α-Aminogruppe des Polypeptids, das kovalent modifiziert wird. Demgemäß muss das Polypeptid eine derartige primäre Struktur aufweisen, dass seine natürliche Funktion nach der kovalenten Modifikation bewahrt wird und nicht eliminiert werden kann. Die natürliche Funktion des Polypeptids wird durch die Entfernung seiner N-terminalen α-Aminogruppe „eliminiert", wenn eine solche Entfernung die Fähigkeit des Polypeptids, seine natürliche Funktion auszuüben, um mehr als 99% reduziert. In einer Ausführungsform reduziert die Entfernung die Fähigkeit des Polypeptids, seine natürliche Funktion auszuüben, nicht um mehr als 90%. In der bevorzugten Ausführungsform reduziert die Entfernung die Fähigkeit des Polypeptids, seine natürliche Funktion auszuüben, nicht um mehr als 50%.
  • Wie hierin verwendet, ist eine „Hydrazonbindung" eine Bindung, die die kovalente Struktur NH-N=C umfasst, und eine „reduzierte Hydrazonbindung" ist eine Bindung, die die kovalente Struktur NH-NH-C umfasst. Hierin sind Verbindungen, die reduzierte Hydrazonbindungen umfassen, bereitgestellt, da diese Bindungen über eine größere chemische Beständigkeit verfügen.
  • Wie oben erörtert, sind in der Technik Verfahren zum Binden von wasserlöslichen Polymeren an das N-terminale α-Kohlenstoffatom eines Polypeptids über eine Hydrazonbindung bekannt, solange der N-terminale Aminosäurerest Serin oder Threonin ist. Diese bekannten Verfahren werden nicht mit Polypeptiden mit einem beliebigen anderen N-terminalen Rest funktionieren. Obgleich sich diese bekannten Verfahren grundlegend von den vorliegenden Verfahren unterscheiden, resultieren sie in N-terminalen Serin- und Threonin-Polypeptiden mit einem Polymer, das über eine Hydrazonbindung an das N-terminale α-Kohlenstoffatom gebunden ist. Aus diesem Grund umfasst die vorliegende erste Zusammensetzung nicht ein Polypeptid, das über eine Hydrazonbindung an ein Polymer gebunden ist, wobei der N-terminale Aminosäurerest des Polypeptids Serin oder Threonin ist.
  • Zu den in der vorliegenden Erfindung verwendeten wasserlöslichen Polymeren zählen Polyalkylenglykol und Derivate davon, einschließlich PEG, mPEG, PEG-Homopolymere, Polypropylenglykol-Homopolymere, Copolymere von Ethylenglykol mit Propylenglykol, wobei die Homopolymere und Copolymere unsubstituiert oder an einem Ende mit einer Alkylgruppe substituiert sind. Diese Polymere können linear, verzweigt oder sternförmig mit einer großen Auswahl von Molekulargewichten sein. In der bevorzugten Ausführungsform ist das Polymer mPEG.
  • Wenn die vorliegenden Zusammensetzungen als Pharmazeutika verwendet werden sollen, ist das Polymer nichttoxisch. Des Weiteren, wenn von einem Polymer gesagt wird, dass es ein gegebenes Molekulargewicht hat, kann dieses Molekulargewicht nur ungefähr sein, wobei es das durchschnittliche Molekulargewicht eines Bestands von Polymermolekülen widerspiegelt, die sich in Bezug auf einander hinsichtlich der Anzahl der in jedem Molekül vorhandenen Untereinheiten unterscheiden.
  • In der bevorzugten Ausführungsform hat das PEG oder Derivat davon ein Molekulargewicht von etwa 5 000 Daltons. Außerdem ist das Polypeptid in der bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Zusammensetzungen EPO und das Polymer ist mPEG mit einem Molekulargewicht von etwa 5 000 Daltons.
  • Diese Erfindung stellt auch vier Verfahren zum kovalenten Binden eines wasserlöslichen Polymers an das N-terminale α-Kohlenstoffatom eines Polypeptids bereit. Das erste Verfahren, das das Polymer über eine Hydrazonbindung an das Kohlenstoffatom bindet, umfasst die Schritte:
    • a) In-Kontakt-Bringen des Polypeptids mit (i) einem Glyoxylation oder einem Derivat davon in einer Konzentration von 0,1 M bis 2,0 M, (ii) einem Übergangsmetallion in einer Konzentration von 10 μM bis 1 M und (iii) einer Lewis-Base in einer Konzentration von 10 mM bis 10 M, bei einem pH von 5,0 bis 7,0 und einer Temperatur von 0°C bis 100°C, um ein transaminiertes Polypeptid mit einer N-terminalen α-Carbonylgruppe zu bilden; und
    • b) In-Kontakt-Bringen des transaminierten Polypeptids bei einem pH von 3,0 bis 5,0 mit einem wasserlöslichen Polymer, das eine daran kovalent gebundene Gruppe hat, die mit der N-terminalen α-Carbonylgruppe des transaminierten Polypeptids reagiert, um eine Hydrazonbindung zu bilden, wodurch das Polymer über eine Hydrazonbindung an das N-terminale α-Kohlenstoffatom des Polypeptids kovalent gebunden wird, unter der Bedingung, dass das PEG ein Molekulargewicht von 700 bis 20 000 Daltons hat und die natürliche Funktion des Polypeptids bei Entfernen seiner N-terminalen α-Aminogruppe nicht eliminiert wird.
  • Das dritte Verfahren umfasst die Schritte des ersten Verfahrens als auch einen weiteren Schritt des Reduzierens der in Schritt (b) gebildeten Hydrazonbindung. Der Reduzierungsschritt kann gemäß bekannten Verfahren unter Verwendung von beispielsweise Natriumtetrahydridoborat (NaBH4) und Natriumcyanoborhydrid (NaBH3CN) durchgeführt werden.
  • Glyoxylationderivate beinhalten, sind aber nicht darauf beschränkt, Glyoxylamid- und Phenylglyoxylionen. Übergangsmetallionen beinhalten, sind aber nicht darauf beschränkt, Kupfer(II)-, Nickel(II)-, Cobalt(II)- und Zink(II)-Ionen. Lewis-Basen beinhalten, sind aber nicht darauf beschränkt, Acetat und Pyridin.
  • Gruppen, die mit der N-terminalen α-Carbonylgruppe des transaminierten Polypeptids reagieren, um eine Hydrazonbindung zu bilden, beinhalten, sind aber nicht darauf beschränkt, Hydrazincarboxylat, Hydrazin, Semicarbazid, Hydrazid, Thiosemicarbazid, Kohlensäuredihydrazid, Carbazid, Thiocarbazid und Arylhydrazid. Wasserlösliche Polymere mit diesen Gruppen, die kovalent daran gebunden sind, sind im Handel erhältlich. Darüber hinaus beinhalten Gruppen, die mit der N-terminalen α-Carbonylgruppe des transaminierten Polypeptids reagieren, um eine Oximbindung zu bilden, Oxylamin, sind aber nicht darauf beschränkt. Wasserlösliche Polymere mit Oxylamin (sowie andere oximbildende Gruppen), die kovalent daran gebunden sind, sind im Handel erhältlich.
  • In der bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Verfahren ist das Protein EPO oder ein Derivat davon.
  • In der bevorzugten Ausführungsform hat das PEG oder das Derivat davon ein Molekulargewicht von etwa 5 000 Daltons.
  • In einer Ausführungsform des ersten Verfahrens ist die Gruppe, die an das Polymer gebunden ist, das mit dem transaminierten Polypeptid umgesetzt wird, Hydrazincarboxylat. In der bevorzugten Ausführungsform ist das Polypeptid EPO, das Polymer ist mPEG mit einem Molekulargewicht von etwa 5 000 Daltons und die Gruppe, die kovalent an das Polymer gebunden ist, ist Hydrazincarboxylat.
  • In jedem der vorliegenden Verfahren ist die bevorzugte Kontaktzeit für Schritt (a) von 20 Minuten bis 2 Stunden und ist die bevorzugte Kontaktzeit und die bevorzugte Temperatur für Schritt (b) von 10 bis 50 Stunden bzw. von 4°C bis Raumtemperatur.
  • Bei bestimmten Polypeptiden ist der N-Terminus eines Polypeptids „vergraben", d. h. nicht Lösemitteln oder Reagenzien darin ausgesetzt, wenn das Polypeptid in seiner nativen Konformation ist. Reagenzien, wie Tetramethylharnstoff oder Harnstoff, können dazu verwendet werden, ein solches Polypeptid zu entfalten, um seinem N-terminalen Rest zu ermöglichen, die erforderlichen Reaktionen der vorliegenden Verfahren einzugehen.
  • Diese Erfindung stellt auch eine pharmazeutische Zusammensetzung bereit, die eine wirksame Menge der vorliegenden ersten oder zweiten Zusammensetzung und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger umfasst. Die vorliegende pharmazeutische Zusammensetzung kann beispielsweise eine Menge des vorliegenden mPEG-EPO umfassen, die zum Behandeln eines Patienten, der unter Anämie leidet, wirksam ist.
  • Pharmazeutisch akzeptable Träger sind dem Fachmann wohl bekannt und beinhalten, sind aber nicht darauf beschränkt, 0,01-0,1 M und vorzugsweise 0,05 M Phosphatpuffer oder 0,8%-ige Kochsalzlösung. Darüber hinaus können solche pharmazeutisch akzeptablen Träger wässrige oder nichtwässrige Lösungen, Suspensionen und Emulsionen sein. Beispiele von nichtwässrigen Lösemitteln sind Propylenglykol, Polyethylenglykol, pflanzliche Öle, wie Olivenöl, und injizierbare organische Ester, wie Ethyloleat. Zu wässrigen Trägern zählen Wasser, alkoholische/wässrige Lösungen, Emulsionen oder Suspensionen, darunter Kochsalzlösung und gepufferte Medien. Zu parenteral verabreichbaren Vehikeln zählen Natriumchloridlösung, Ringer-Dextrose, Dextrose und Natriumchlorid, Ringer-Laktat oder nichtflüssige Öle. Zu intravenös verabreichbaren Vehikeln zählen Mittel zum Wiederauffüllen der Flüssigkeits- und Nährstoffpegel, Mittel zum Wiederauffüllen des Elektrolytpegels, wie die auf Ringer-Dextrose basierten, und dergleichen. Konservierungsstoffe und andere Zusatzstoffe können ebenfalls vorliegen, wie beispielsweise antimikrobielle Mittel, Antioxidantien, Chelatbildner, Inertgase und dergleichen.
  • Schließlich stellt diese Erfindung Kits zur Verwendung beim Herstellen der vorliegenden Zusammensetzungen bereit. Das erste Kit zum Herstellen der ersten vorliegenden Zusammensetzung umfasst folgendes:
    • (a) ein Glyoxylation oder Derivat davon;
    • (b) ein Übergangsmetallion;
    • (c) eine Lewis-Base; und
    • (d) ein wasserlösliches Polymer mit einem Molekulargewicht von 700 bis 20 000 Daltons und mit einer kovalent angebundenen Gruppe, die mit einer N-terminalen α-Carbonylgruppe des transaminierten Polypeptids reagiert, um eine Hydrazonbindung zu bilden, wodurch das Polymer an das N-terminale α-Kohlenstoffatom des Polypeptids kovalent gebunden wird.
  • Die Reagenzien in diesen Kits können in einer vorherbestimmten Quantität verpackt und in separaten Fächern enthalten sein. Alternativ können bestimmte Reagenzien in ein und demselben Fach enthalten sein, so es die Einschränkungen des vorliegenden Verfahrens gestatten. Schließlich können die Kits weiterhin reduzierende Reagenzien zum Erzeugen von reduzierten Hydrazonbindungen gemäß den vorliegenden Verfahren sowie geeignete Puffer und Reaktionsgefäße enthalten.
  • Diese Erfindung wird durch Bezugnahme auf die folgenden Versuchsbeispiele besser verstanden werden, der Fachmann wird jedoch bereitwillig zu schätzen wissen, dass die detaillierten spezifischen Versuche die Erfindung lediglich veranschaulichen, wie sie in den Ansprüchen vollständiger beschrieben ist, die danach folgen.
  • Versuchsbeispiele
  • 1. Herstellung von transaminiertem EPO
  • 5 mg EPO in 20 mM Natriumcitrat (pH 6,9) und 100 mM NaCl wurden unter Verwendung von Centricon-10 (Amicon, Beverly, MA, USA) mit 100 mM Natriumacetatpuffer (pH 7,0) ausgetauscht. Die Endkonzentrationen wurden auf 1 mg/ml EPO, 2 M Natriumacetat, 0,4 M Essigsäure, 0,1 M Glyoxylsäure und 10 mM Kupfer(II)-sulfat (pH 5,5) eingestellt (1). Die Reaktion wurde 2 Stunden bei Raumtemperatur laufengelassen und wurde durch Zugabe von 100 ml 0,5 M EDTA gestoppt. Transaminiertes EPO wurde mittels einer Sephadex G-25-Säule (Pharmacia, Piscataway, NJ, USA) unter Verwendung eines 100 mM Natriumacetatpuffers (pH 4,5) gereinigt.
  • Das Ausmaß der Transaminierung wurde mittels 2,4-Dinitrophenylhydrazin geschätzt, wie in der Literatur beschrieben (R. Fields et al., Biochem. J., 1971, 121, 587). Die Extinktion bei 370 nm wurde nach den ersten paar Minuten und nach einer Stunde gemessen. Die Extinktionsdifferenz ist zur Anzahl der an dem EPO-Molekül vorhandenen Carbonylgruppen proportional. Das transaminierte EPO wurde zudem einer Aminosäureanalyse auf einem ABI 420H-System (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) unter Anwendung von Vorsäulen-PITC-Chemie unterzogen. Die Ergebnisse zeigen, dass Lysinreste, d. h. nicht-N-terminale Reste, nicht transaminiert wurden.
  • 2. Herstellung von mPEG-EPO mit mPEG-Hydrazincarboxylat
  • Transaminiertes EPO (1 mg) in 100 mM Natriumacetat (pH 4,5) wurde mit 0,5 M Natriumchlorid auf ein Endvolumen von 1 ml eingestellt, zu dem 10 mg mPEG5000-Hydrazincarboxylat (Shearwater Polymers, Hunstville, AL, USA) gegeben wurden. Die Reaktionsmischung wurde 40 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und mittels einer Sephacryl s-200-Säule (Pharmacia, Piscataway, NJ, USA) unter Verwendung eines 20 mM Natriumcitratpuffers (7,0), der 100 mM NaCl enthielt, gereinigt. Darüber hinaus kann 0,1%-iges SDS zu der Reaktionsmischung gegeben werden, um die Vereinigungsausbeute zu erhöhen.
  • In einer Gelpermeationschromatographie zeigte das mPEG-EPO-Konjugat ein im Vergleich zu denen von EPO und mPEG5000-Hydrazincarboxylat erheblich erhöhtes Molekulargewicht (2).
  • Matrixunterstützte Laserdesorptionsmassenspektrometrie (Finnigan-MAT LaserMAT 2000, lineare Laufzeit) wurde angewendet, um mPEG-EPO mittels Bestimmung des Molekulargewichts zu charakterisieren (3). mPEG5000-Hydrazincarboxylat zeigt ein Ion bei m/z 5 157,4. EPO zeigt ein zweifach geladenes Monomer (m/z 14 604), ein einfach geladenes Monomer (m/z 28 569), ein Dimer (m/z 57 208) und ein Trimer (m/z 85 284). In ähnlicher Weise zeigt mPEG-EPO ein zweifach geladenes Monomer (m/z 17 092), ein einfach geladenes Monomer (m/z 34 279), ein Dimer (m/z 69 071) und ein Trimer (m/z 102 955).
  • Ein Zirkulardichroismus-Spektrum (CD-Spektrum) (Jobin-YVON CD6, Dichrograph Spectrometer Instruments, SA, Edison, NJ, USA) von mPEG-EPO zeigte, dass das Protein die in nativem EPO vorliegende α-helikale Bündelstruktur bewahrte (Daten nicht gezeigt). Dieses Ergebnis bedeutet, dass ein PEG-Molekül an dem N-terminalen Ende von EPO seine sekundäre Struktur nicht stört.
  • 3. Herstellung von mPEG-EPO mit mPEG-Hydrazid
  • Transaminiertes EPO (1 mg) in 100 mM Natriumacetat (pH 4,5) wurde mit 0,5 M Natriumchlorid, 0,1%-igem SDS auf ein Endvolumen von 1 ml eingestellt und 10-20 mg mPEG5000-Hydrazid wurden zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde 40 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und mittels einer Sephacryl S-200-Säule (Pharmacia, Piscataway, NJ, USA) unter Verwendung eines 20 mM Natriumcitratpuffers (7,0), der 100 mM NaCl enthielt, gereinigt.
  • Die mPEG-EPO-Konjugate wurden mittels 4-15%-iger SDS-PAGE (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) mit verschiedenen Verfahren analysiert: Coomassie-Färbung (für Proteine spezifisch), Western-Blot (für EPO spezifisch) und Iodfärbung (für PEG spezifisch). Die Migrationsdistanz von mPEG-EPO-Konjugaten mit höherem Molekulargewicht auf SDS-PAGE war geringer als die von nativem EPO. Das isoelektrische Fokussierungsmuster weist darauf hin, dass der isoelektrische Punkt (pI) von EPO bei Modifikation nicht wesentlich verändert wird. Transaminiertes EPO ist jedoch etwas azidischer als natives EPO und mPEG-EPO.
  • Da die EPO- und mPEG-EPO-Banden durch SDS-PAGE gut getrennt werden, kann diese Technik zum Überwachen der Effizienz der Konjugationsreaktion verwendet werden. Es wurde beobachtet, dass die Konjugationsreaktion zu > 95% abgeschlossen war, wenn mPEG5000-Hydrazincarboxylat verwendet wurde, wohingegen die Reaktion nur zu etwa 20% abgeschlossen war, wenn mPEG5000-Hydrazid, mPEG5000-Semicarbazid oder mPEG5000-Oxylamin verwendet wurde. Folglich scheint die Hydrazincarboxylatgruppe gegenüber Carbonylgruppen reaktionsfähiger zu sein als die Hydrazid-, Semicarbazid- oder Oxylamingruppe.
  • 4. Reaktivität von mPEG-EPO mit Anti-EPO-Antikörper
  • Die Antigenität von mPEG-EPO wurde unter Verwendung eines QuantikineTM IVDTM EPO ELISA-Kits (R & D Systems, Minneapolis, MN, USA) untersucht. Das Assay besteht aus einer Mikrotiterplatte, die mit einem monoklonalen Antikörper zu EPO beschichtet ist. EPO oder mPEG-EPO werden mit der beschichteten Platte wechselwirken gelassen. Nach dem Waschen der Platte wird ein Konjugat von polyklonalem Anti-EPO-Antikörper und Meerrettichperoxidase zugegeben. Nach dem Entfernen des überschüssigen Konjugats wird ein Chromogen in die Näpfe gegeben und mittels der Enzymreaktion oxidiert, um einen Komplex von blauer Farbe zu bilden. Die Extinktion dieses Komplexes wird bei 450 nm gemessen.
  • Die Ergebnisse des ELISA-Assays für mPEG-EPO mit einer Hydrazonbindung, die aus Hydrazincarboxylat (HZC) und Hydrazid (HZ) gebildet wurde, sind in 5 dargestellt. Die Daten zeigen, dass selbst ein PEG-Molekül, das an den N-Terminus von EPO angelagert ist, die Affinität für monoklonale Antikörperbindung an EPO erheblich verringert, möglicherweise aufgrund sterischer Hinderung.
  • 5. In-vitro-Aktivität von mPEG-EPO
  • Die biologische Aktivität von mPEG-EPO in vitro wurde mit einem Zellproliferationsassay unter Verwendung von FDC-P1/HER-Zellen, einer hämatopoetischen Mauszelllinie, beurteilt. Die Zelllinie exprimiert den EPO-Rezeptor und ist in Bezug auf Wachstum vom EPO abhängig. Nachdem man die Zellen 24 Stunden in Abwesenheit von EPO hat wachsen lassen, wurde den Zellen EPO oder mPEG-EPO zugesetzt. Die Zellen wurden 42 Stunden inkubiert und dann wurde den Zellen tritiiertes Thymidin zugesetzt. Nach 6 Stunden wurde das Zellwachstum durch Beimischung von Thymidin bestimmt.
  • Die Ergebnisse des Zellproliferationsassays für transaminiertes EPO und mPEG-EPO mit Hydrazonbindungen, die aus Hydrazincarboxylat (HZC) und Hydrazid (HZ) gebildet wurden, sind in 6 dargestellt. Transaminiertes EPO zeigt volle biologische Aktivität im Vergleich zu nativem EPO, wie durch seinen ED50-Wert bestimmt. Die mPEG-EPO-Proben mit Hydrazonbindungen, die aus Hydrazincarboxylat (HZC) und Hydrazid (HZ) gebildet wurden, bewahren nur 38,5% bzw. 25% Aktivität, wie durch ihre ED50-Werte bestimmt. Die Daten zeigen, dass ein PEG-Molekül, das an den N-Terminus von EPO angelagert ist, die Affinität von EPO für seinen Rezeptor erheblich verringert, möglicherweise aufgrund sterischer Hinderung.
  • 6. In-vivo-Aktivität von mPEG-EPO
  • Die In-vivo-Aktivität von mPEG-EPO wurde mit einem Bioassay an exhypoxischen Mäusen (P.M. Coates et al., Nature, 1961, 191, 1 065) beurteilt. Die Bildung von endogenen Erythrozyten in den Mäusen wurde mittels der Polyzythämie unterdrückt, die durch Einwirkung von vermindertem Druck erzeugt wurde. Das EPO- oder mPEG-EPO-Konjugat wird mit einer Konzentration von 1 Einheit/Maus injiziert. 48 Stunden nach der Injektion von EPO oder mPEG-EPO wurde Eisen-59 verabreicht. Die Eisen-59-Aufnahme, die die Bildung von neuen Erythrozyten anzeigt, wurde 48, 72 und 96 Stunden nach der Verabreichung von EPO oder mPEG-EPO gemessen.
  • Die Ergebnisse des Bioassays an exhypoxischen Mäusen für mPEG-EPO mit Hydrazonbindungen, die mit Hydrazincarboxylat (HZC), Hydrazid (HZ) und Semicarbazid (SCZ) gebildet wurden, sind in 7 dargestellt. Die mPEG-EPO-Proben zeigen eine hohe In-vivo-Aktivität sowie eine längere Aktivitätsdauer im Vergleich zu nativem EPO. Die In-vivo-Ergebnisse zeigen, dass mPEG-EPO-Proben eine längere Zirkulationszeit in vivo und eine retardierte Abgabe von EPO während der Zirkulation aufweisen.
  • 7. Herstellung von mPEG-Fibrin-17-29-Dimer
  • Das Fibrin-17-29-Dimer weist die folgende Struktur auf:
    Figure 00200001
  • 2 mg Fibrin-17-29-Dimer wurden in 0,5 ml 2 M Natriumacetat, 0,4 M Essigsäure, 0,1 M Glyoxylsäure und 10 mM Kupfer(II)-sulfat (pH 5,5) gelöst. Die Reaktion wurde 2 Stunden bei Raumtemperatur weiterlaufen gelassen und wurde durch Zugabe von 20 ml 0,5 M EDTA gestoppt. Transaminiertes Fibrin-Dimer wurde mittels einer Sephadex G-10-Säule (Pharmacia, Piscataway, NJ, USA) unter Verwendung eines 100 mM Natriumacetatpuffers (pH 4,5) gereinigt. Transaminiertes Fibrin-Dimer zeigte in der Aminosäureanalyse erheblich reduziertes Gly, was auf die Transaminierung von N-terminalem Gly hindeutet.
  • 1 mg transaminiertes Fibrin-Dimer in 0,5 ml 100 mM Natriumacetat (pH 4,5) wurde 10 mg mPEG5000-Hydrazincarboxylat zugesetzt. Die Reaktionsmischung wurde 24 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das mPEG-Fibrin-Dimer wurde mittels Anionenaustausch-Chromatographie mit einer HEMA IEC BIO CM-Säule (Alltech) gereinigt. Die mobile Phase A war 20 mM Natriumacetat (pH 5,5). Die mobile Phase B war 0,2 M MOPS, 0,05 M einwertiges Kaliumphosphat und 0,25 M zweiwertiges Kaliumphosphat (pH 7,5). Der Gradient war 100% A für 5 Minuten, dann 0 bis 100% B in 25 Minuten. Ein neuer Peak bei 14,5 Minuten, der vor dem unmodifizierten Fibrin-Dimer (18 Minuten) erschien, wurde zur weiteren Analyse gesammelt. Ein Laserdesorptionsmassenspektrum zeigte das Ion bei m/z 8 070,9, was bewies, dass ein PEG-Molekül an dem Fibrin-Dimer angelagert war (m/z 2 986,6).

Claims (12)

  1. Stoffzusammensetzung, bestehend im wesentlichen aus einem Peptid oder einem Protein und PEG oder einem Derivat davon, kovalent an dem N-terminalen α-Kohlenstoffatom des Polypeptids gebunden, unter der Bedingung, daß (a) das PEG und Polypeptid aneinander über eine Hydrazonbindung oder reduzierte Hydrazonbindung gebunden sind, (b) das PEG ein Molekulargewicht von 700 bis 20 000 Daltons hat, (c) die natürliche Funktion des Polypeptids bei Entfernung seiner N-terminalen Aminogruppe nicht eliminiert wird, und (d) der N-terminale Aminosäurerest des Proteins nicht Serin oder Threonin ist.
  2. Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei das Protein EPO oder ein Derivat davon ist.
  3. Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei das PEG oder Derivat davon ein Molekulargewicht von ungefähr 5 000 Daltons hat.
  4. Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei das Protein EPO ist und das PEG mPEG mit einem Molekulargewicht von ungefähr 5 000 Daltons ist.
  5. Verfahren zum kovalenten Binden von PEG an das N-terminale α-Kohlenstoffatom eines Polypeptids, das die Schritte umfaßt: a) In-Kontakt-Bringen des Polypeptids mit (i) einem Glyoxylation oder einem Derivat davon in einer Konzentration von 0,1 M bis 2,0 M, (ii) einem Übergangsmetallion in einer Konzentration von 10 μM bis 1 M und (iii) einer Lewis-Base in einer Konzentration von 10 mM bis 10 M, bei einem pH von 5,0 bis 7,0 und einer Temperatur von 0°C bis 100°C, um ein transaminiertes Polypeptid mit einer N-terminalen α-Carbonylgruppe zu bilden; und b) In-Kontakt-Bringen des transaminierten Polypeptids bei einem pH von 3,0 bis 5,0 mit PEG oder einem Derivat davon, das eine daran kovalent gebun dene Gruppe hat, die mit der N-terminalen α-Carbonylgruppe des transaminierten Polypeptids reagiert, um eine Hydrazonbindung zu bilden, wodurch das PEG an das N-terminale α-Kohlenstoffatom des Polypeptids kovalent gebunden wird, unter der Bedingung, daß das PEG ein Molekulargewicht von 700 bis 20 000 Daltons hat und die natürliche Funktion des Polypeptids bei Entfernen seiner N-terminalen α-Aminogruppe nicht eliminiert wird.
  6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei das Protein EPO oder ein Derivat davon ist.
  7. Verfahren nach Anspruch 5, wobei das PEG oder Derivat davon ein Molekulargewicht von ungefähr 5 000 Daltons hat.
  8. Verfahren nach Anspruch 5, wobei die Gruppe, die kovalent an das PEG gebunden ist, Hydrazincarboxylat ist.
  9. Verfahren nach Anspruch 5, wobei das Protein EPO ist, das PEG mPEG mit einem Molekulargewicht von ungefähr 5 000 Daltons ist und die an das PEG kovalent gebundene Gruppe Hydrazincarboxylat ist.
  10. Verfahren nach Anspruch 5, das weiterhin den Schritt des Reduzierens der in Schritt (b) gebildeten Hydrazonbindung umfaßt, um eine reduzierte Hydrazonbindung zu bilden.
  11. Pharmazeutische Zusammensetzung, die eine wirksame Menge der Zusammensetzung nach Anspruch 1 und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger umfaßt.
  12. Kit zur Verwendung beim Herstellen der Zusammensetzung nach Anspruch 1, der folgendes umfaßt: (a) ein Glyoxylation oder Derivat davon; (b) ein Übergansmetallion; (c) eine Lewis-Base; und (d) PEG oder ein Derivat davon mit einem Molekulargewicht von 700 bis 20 000 Daltons und mit einer kovalenten angebundenen Gruppe, die mit ei ner N-terminalen α-Carbonylgruppe des transaminierten Polypeptids reagiert, um eine Hydrazonbindung zu bilden, wodurch das PEG an das N-terminale α-Kohlenstoffatom des Polypeptids kovalent gebunden wird.
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Families Citing this family (186)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100361933B1 (ko) 1993-09-08 2003-02-14 라 졸라 파마슈티칼 컴파니 화학적으로정의된비중합성결합가플랫폼분자및그것의콘주게이트
US6458953B1 (en) * 1998-12-09 2002-10-01 La Jolla Pharmaceutical Company Valency platform molecules comprising carbamate linkages
US7666400B2 (en) * 2005-04-06 2010-02-23 Ibc Pharmaceuticals, Inc. PEGylation by the dock and lock (DNL) technique
KR100773323B1 (ko) 2000-01-10 2007-11-05 맥시겐 홀딩스 리미티드 지-씨에스에프 접합체
CA2739933A1 (en) 2000-02-11 2001-08-16 Bayer Healthcare Llc Factor vii or viia-like molecules
US6586398B1 (en) * 2000-04-07 2003-07-01 Amgen, Inc. Chemically modified novel erythropoietin stimulating protein compositions and methods
ME00673B (me) 2000-05-15 2011-12-20 Hoffmann La Roche Nova farmaceutska smjesa
WO2001093914A2 (en) 2000-06-08 2001-12-13 La Jolla Pharmaceutical Company Multivalent platform molecules comprising high molecular weight polyethylene oxide
MXPA03000310A (es) * 2000-07-12 2004-12-13 Gryphon Therapeutics Inc Quimiocinas sinteticas bioactivas, modificadas con polimeros y metodos para su elaboracion y uso.
US7118737B2 (en) 2000-09-08 2006-10-10 Amylin Pharmaceuticals, Inc. Polymer-modified synthetic proteins
KR20030057529A (ko) * 2000-09-08 2003-07-04 그리폰 테라퓨틱스, 인코포레이티드 합성 적혈구생성 자극 단백질
WO2002032957A1 (en) * 2000-10-16 2002-04-25 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Peg-modified erythropoietin
AU2002233230B2 (en) 2000-12-20 2007-02-01 F. Hoffmann-La Roche Ag Erythropoietin conjugates
DE60219961T8 (de) 2001-02-02 2008-04-17 Ortho-Mcneil Pharmaceutical, Inc. Behandlung von neurologischen funktionsstörungen mit fructopyranosesulfamaten und erythropoetin
WO2002074806A2 (en) 2001-02-27 2002-09-26 Maxygen Aps New interferon beta-like molecules
US20040077835A1 (en) * 2001-07-12 2004-04-22 Robin Offord Chemokine receptor modulators, production and use
US7696163B2 (en) 2001-10-10 2010-04-13 Novo Nordisk A/S Erythropoietin: remodeling and glycoconjugation of erythropoietin
US7795210B2 (en) 2001-10-10 2010-09-14 Novo Nordisk A/S Protein remodeling methods and proteins/peptides produced by the methods
US7173003B2 (en) 2001-10-10 2007-02-06 Neose Technologies, Inc. Granulocyte colony stimulating factor: remodeling and glycoconjugation of G-CSF
US7214660B2 (en) 2001-10-10 2007-05-08 Neose Technologies, Inc. Erythropoietin: remodeling and glycoconjugation of erythropoietin
US6818613B2 (en) 2001-11-07 2004-11-16 Ortho-Mcneil Pharmaceutical, Inc. Aqueous sustained-release formulations of proteins
US7473680B2 (en) 2001-11-28 2009-01-06 Neose Technologies, Inc. Remodeling and glycoconjugation of peptides
WO2003045423A1 (en) 2001-11-28 2003-06-05 Ortho-Mcneil Pharmaceutical, Inc. Erythropoietin dosing regimen for treating anemia
WO2003078959A2 (en) 2002-03-11 2003-09-25 Ortho Mcneil Pharmaceutical, Inc Methods for shp1 mediated neuroprotection
UA86744C2 (en) 2002-06-21 2009-05-25 Ново Нордиск Хэлс Кеа Аг Pegylated factor vii glycoforms
EP1534269B1 (de) * 2002-07-19 2013-10-30 The General Hospital Corporation Oxim-konjugate und verfahren zu ihrer bildung und verwendung
US20040091961A1 (en) * 2002-11-08 2004-05-13 Evans Glen A. Enhanced variants of erythropoietin and methods of use
GEP20084487B (en) * 2002-12-26 2008-09-25 Mountain View Pharmaceuticals Polymer conjugates of cytokines, chemokines, growth factors, polypeptide hormones and antagonists thereof
JP5207590B2 (ja) * 2002-12-26 2013-06-12 マウンテン ビュー ファーマシューティカルズ，インコーポレイテッド 増強された生物学的能力を有するインターフェロン−βのポリマー結合体
EP1616003A4 (de) 2002-12-30 2007-06-20 Gryphon Therapeutics Inc Wasserlösliche thioester- und selenoesterverbindungen sowie verfahren zur herstellung und verwendung davon
NZ542094A (en) 2003-03-14 2008-12-24 Neose Technologies Inc Branched polymer conjugates comprising a peptide and water-soluble polymer chains
EP1613261A4 (de) 2003-04-09 2011-01-26 Novo Nordisk As Intrazelluläre bildung von peptidkonjugaten
PL1615945T3 (pl) 2003-04-09 2012-03-30 Ratiopharm Gmbh Sposoby glikopegylacji i białka/peptydy wytwarzane tymi sposobami
ATE428727T1 (de) 2003-05-12 2009-05-15 Affymax Inc Neue, an den erythropoietinrezeptor bindende peptide
US7919118B2 (en) 2003-05-12 2011-04-05 Affymax, Inc. Spacer moiety for poly (ethylene glycol) modified peptide based compounds
CN1820024B (zh) 2003-05-12 2011-06-22 阿费麦克斯公司 新的聚(乙二醇)修饰的化合物及其用途
AU2004238868B2 (en) * 2003-05-12 2010-01-21 Affymax, Inc. Peptides that bind to the erythropoietin receptor
US7074755B2 (en) * 2003-05-17 2006-07-11 Centocor, Inc. Erythropoietin conjugate compounds with extended half-lives
CA2527665A1 (en) * 2003-05-30 2004-12-16 Centocor, Inc. Formation of novel erythropoietin conjugates using transglutaminase
US9005625B2 (en) 2003-07-25 2015-04-14 Novo Nordisk A/S Antibody toxin conjugates
CN1867581B (zh) 2003-10-10 2012-02-01 诺沃挪第克公司 Il-21衍生物
EP2641611A3 (de) 2003-10-17 2013-12-18 Novo Nordisk A/S Kombinationstherapie
US20080305992A1 (en) 2003-11-24 2008-12-11 Neose Technologies, Inc. Glycopegylated erythropoietin
US7842661B2 (en) 2003-11-24 2010-11-30 Novo Nordisk A/S Glycopegylated erythropoietin formulations
EP1694347B1 (de) 2003-11-24 2013-11-20 BioGeneriX AG Glycopegyliertes Erythropoetin
US7368169B2 (en) * 2003-12-01 2008-05-06 Rutgers, The State University Of New Jersey Hydrazide compounds with angiogenic activity
NZ548123A (en) 2004-01-08 2010-05-28 Novo Nordisk As O-linked glycosylation of peptides
ES2642214T3 (es) 2004-01-21 2017-11-15 Novo Nordisk Health Care Ag Conjugación de péptidos mediante transglutaminasa
US20070105770A1 (en) * 2004-01-21 2007-05-10 Novo Nordisk A/S Transglutaminase mediated conjugation of peptides
BRPI0507169A (pt) 2004-02-02 2007-06-26 Ambrx Inc polipeptìdeos do hormÈnio de crescimento humano modificados e seu usos
KR20070027621A (ko) * 2004-06-08 2007-03-09 알자 코포레이션 4-성분 축합 반응에 의한 고분자 콘쥬게이트의 제조
US7632924B2 (en) 2004-06-18 2009-12-15 Ambrx, Inc. Antigen-binding polypeptides and their uses
US20080300173A1 (en) 2004-07-13 2008-12-04 Defrees Shawn Branched Peg Remodeling and Glycosylation of Glucagon-Like Peptides-1 [Glp-1]
WO2006091231A2 (en) 2004-07-21 2006-08-31 Ambrx, Inc. Biosynthetic polypeptides utilizing non-naturally encoded amino acids
US7597884B2 (en) 2004-08-09 2009-10-06 Alios Biopharma, Inc. Hyperglycosylated polypeptide variants and methods of use
WO2006031811A2 (en) 2004-09-10 2006-03-23 Neose Technologies, Inc. Glycopegylated interferon alpha
WO2006050247A2 (en) 2004-10-29 2006-05-11 Neose Technologies, Inc. Remodeling and glycopegylation of fibroblast growth factor (fgf)
JP2008519858A (ja) * 2004-11-11 2008-06-12 アフィーマックス・インコーポレイテッド エリスロポエチンレセプターに結合する新規ペプチド
WO2006062685A2 (en) * 2004-11-11 2006-06-15 Affymax, Inc. Novel peptides that bind to the erythropoietin receptor
PT2363414T (pt) * 2004-11-12 2022-08-04 Bayer Healthcare Llc Modificação de fviii direcionada a sítio
BRPI0519430A2 (pt) 2004-12-22 2009-02-10 Ambrx Inc hormânio do crescimento humano modificado
EP1836316A4 (de) 2004-12-22 2009-07-22 Ambrx Inc Verfahren zur expression und reinigung von rekombinantem menschlichem wachstumshormon
EP2399893B1 (de) 2004-12-22 2018-08-15 Ambrx, Inc. Zusammensetzungen und Verfahren mit sowie Verwendungen von nichtnatürlichen Aminosäuren und Polypeptiden
CN103520735B (zh) * 2004-12-22 2015-11-25 Ambrx公司 包含非天然编码的氨基酸的人生长激素配方
EP1836298B1 (de) 2004-12-22 2012-01-18 Ambrx, Inc. Zusammensetzungen von aminoacyl-trna-synthetase und verwendungen davon
US9029331B2 (en) 2005-01-10 2015-05-12 Novo Nordisk A/S Glycopegylated granulocyte colony stimulating factor
US7365127B2 (en) * 2005-02-04 2008-04-29 Enzon Pharmaceuticals, Inc. Process for the preparation of polymer conjugates
US7714114B2 (en) 2005-02-16 2010-05-11 Nektar Therapeutics Conjugates of an EPO moiety and a polymer
WO2007010552A2 (en) * 2005-03-17 2007-01-25 Serum Institute Of India Limited N- terminal peg conjugate of erythropoietin
EP1868652A2 (de) 2005-04-05 2007-12-26 Istituto di Richerche di Biologia Molecolare P. Angeletti S.p.A. Verfahren zur abschirmung von funktionalen stellen oder epitopen auf proteinen
WO2006121569A2 (en) 2005-04-08 2006-11-16 Neose Technologies, Inc. Compositions and methods for the preparation of protease resistant human growth hormone glycosylation mutants
US7919461B2 (en) 2005-06-03 2011-04-05 Affymax, Inc. Erythropoietin receptor peptide formulations and uses
US8324159B2 (en) * 2005-06-03 2012-12-04 Affymax, Inc. Erythropoietin receptor peptide formulations and uses
AU2006255122B2 (en) 2005-06-03 2010-10-21 Ambrx, Inc. Improved human interferon molecules and their uses
US7550433B2 (en) 2005-06-03 2009-06-23 Affymax, Inc. Erythropoietin receptor peptide formulations and uses
WO2006135930A2 (en) * 2005-06-13 2006-12-21 Nastech Pharmaceutical Company Inc. Transmucosal delivery of peptide derivatives
ES2553160T3 (es) 2005-06-17 2015-12-04 Novo Nordisk Health Care Ag Reducción y derivatización selectivas de proteínas Factor VII transformadas por ingeniería que comprenden al menos una cisteína no nativa
AU2005335491B2 (en) 2005-08-18 2010-11-25 Ambrx, Inc. Compositions of tRNA and uses thereof
US20070105755A1 (en) 2005-10-26 2007-05-10 Neose Technologies, Inc. One pot desialylation and glycopegylation of therapeutic peptides
US8293708B2 (en) * 2005-08-30 2012-10-23 Novo Nordisk Health Care A/G Liquid formulations N-terminal serine of pegylated growth hormone
US20080171696A1 (en) * 2005-10-21 2008-07-17 Avigenics, Inc. Pharmacodynamically enhanced therapeutic proteins
AU2006304856A1 (en) * 2005-10-21 2007-04-26 Synageva Biopharma Corp. Glycolated and glycosylated poultry derived therapeutic proteins
WO2007056191A2 (en) 2005-11-03 2007-05-18 Neose Technologies, Inc. Nucleotide sugar purification using membranes
DK2339014T3 (en) 2005-11-16 2015-07-20 Ambrx Inc Methods and compositions comprising non-natural amino acids
CN101062407A (zh) 2006-04-29 2007-10-31 中国科学院上海生命科学研究院 促红细胞生成素在预防或治疗视网膜损伤中的用途
US7851438B2 (en) * 2006-05-19 2010-12-14 GlycoFi, Incorporated Erythropoietin compositions
KR20090013816A (ko) 2006-05-24 2009-02-05 노보 노르디스크 헬스 케어 악티엔게젤샤프트 연장된 생체내 반감기를 갖는 인자 ⅸ 유사체
BRPI0713963A2 (pt) 2006-07-07 2012-11-27 Novo Nordisk Healthcare Ag conjugados de proteìna e métodos para sua preparação
EP2049144B8 (de) 2006-07-21 2015-02-18 ratiopharm GmbH Glycosylierung von peptiden über o-verbundene glycosylierungssequenzen
PL2054074T3 (pl) * 2006-08-04 2015-03-31 Prolong Pharmaceuticals Llc Zmodyfikowana erytropoetyna
CN106008699A (zh) 2006-09-08 2016-10-12 Ambrx公司 经修饰的人类血浆多肽或Fc骨架和其用途
EP2064333B1 (de) 2006-09-08 2014-02-26 Ambrx, Inc. Unterdrücker-trna-transkription für wirbeltierzellen
JP5399906B2 (ja) 2006-09-08 2014-01-29 アンブルックス，インコーポレイテッド 脊椎動物細胞用のハイブリッドサプレッサーｔｒｎａ
US7985783B2 (en) 2006-09-21 2011-07-26 The Regents Of The University Of California Aldehyde tags, uses thereof in site-specific protein modification
EP2054521A4 (de) 2006-10-03 2012-12-19 Novo Nordisk As Verfahren zur reinigung von polypeptid-konjugate
EP2114427B1 (de) 2007-01-30 2014-06-25 New York University Peptide zur behandlung von zuständen im zusammenhang mit stickoxid
EP2118127A4 (de) * 2007-01-31 2010-12-01 Affymax Inc Linker auf stickstoffbasis zur bindung modifizierender gruppen an polypeptide und andere makromoleküle
CN107501407B (zh) 2007-03-30 2022-03-18 Ambrx公司 经修饰fgf-21多肽和其用途
HRP20130382T1 (hr) 2007-04-03 2013-05-31 Biogenerix Ag Postupci lijeäśenja pomoä†u glikopegiliranog g-csf
US8114630B2 (en) 2007-05-02 2012-02-14 Ambrx, Inc. Modified interferon beta polypeptides and their uses
CA2690611C (en) 2007-06-12 2015-12-08 Novo Nordisk A/S Improved process for the production of nucleotide sugars
US20110159523A1 (en) * 2007-06-27 2011-06-30 Cedars-Sinai Medical Center N-terminal specific chemical labeling for proteomics applications
MX2010005317A (es) 2007-11-20 2010-06-02 Ambrx Inc Polipeptidos de insulina modificados y sus usos.
CN101456911A (zh) * 2007-12-12 2009-06-17 江苏豪森药业股份有限公司 促红细胞生成素模拟肽衍生物及其可药用盐和其制备方法与用途
CA2707979A1 (en) * 2007-12-13 2009-06-18 Biovectra Inc. Polypeptides modified by protein trans-splicing technology
MX344166B (es) 2008-02-08 2016-12-07 Ambrx Inc Leptina-polipeptidos modificados y sus usos.
PL2257311T3 (pl) 2008-02-27 2014-09-30 Novo Nordisk As Koniugaty cząsteczek czynnika VIII
CN102159230A (zh) 2008-07-23 2011-08-17 Ambrx公司 经修饰的牛g-csf多肽和其用途
EP2157432A1 (de) * 2008-08-15 2010-02-24 Qiagen GmbH Verfahren zur Analyse einer komplexen Probe durch Massenspektrometrie
AU2009296267B2 (en) 2008-09-26 2013-10-31 Ambrx, Inc. Non-natural amino acid replication-dependent microorganisms and vaccines
BR122012024318A2 (pt) 2008-09-26 2019-07-30 Ambrx, Inc. Polipeptídeos modificados de eritropoetina animal e seus usos
WO2010129248A1 (en) 2009-05-06 2010-11-11 Centocor Ortho Biotech Inc. Melanocortin receptor binding conjugates
EP3093029A1 (de) * 2009-07-27 2016-11-16 Baxalta GmbH Koagulationsproteinkonjugate
BR112012015597A2 (pt) 2009-12-21 2017-01-31 Ambrx Inc peptídeos de somatotropina suínos modificados e seus usos
MX349301B (es) 2009-12-21 2017-07-21 Ambrx Inc Polipéptidos de somatotropina bovina modificados y sus usos.
US9815876B2 (en) 2010-03-05 2017-11-14 Omeros Corporation Chimeric inhibitor molecules of complement activation
WO2011143274A1 (en) 2010-05-10 2011-11-17 Perseid Therapeutics Polypeptide inhibitors of vla4
EA030886B1 (ru) 2010-08-17 2018-10-31 Амбркс, Инк. Модифицированные полипептиды релаксина, содержащие некодируемую в природе аминокислоту, связанную с полимером, и их применение
US9567386B2 (en) 2010-08-17 2017-02-14 Ambrx, Inc. Therapeutic uses of modified relaxin polypeptides
TWI480288B (zh) 2010-09-23 2015-04-11 Lilly Co Eli 牛顆粒細胞群落刺激因子及其變體之調配物
CN102652836A (zh) * 2011-03-03 2012-09-05 华中科技大学同济医学院附属协和医院 靶向释药的抗癌蛋白质或多肽聚合物前药及其制备方法
RU2014103288A (ru) 2011-07-01 2015-08-10 Байер Интеллектчуал Проперти Гмбх Слитые полипептиды релаксина и их применение
CN103747807B (zh) 2011-07-05 2016-12-07 比奥阿赛斯技术有限公司 P97‑抗体缀合物和使用方法
EP2859017B1 (de) 2012-06-08 2019-02-20 Sutro Biopharma, Inc. Antikörper mit nichtnatürlichen stellenspezifischen aminosäureresten, verfahren zu deren herstellung und verfahren zu deren verwendung
WO2014004639A1 (en) 2012-06-26 2014-01-03 Sutro Biopharma, Inc. Modified fc proteins comprising site-specific non-natural amino acid residues, conjugates of the same, methods of their preparation and methods of their use
CA3140358A1 (en) 2012-07-31 2014-02-06 Bioasis Technologies, Inc. Dephosphorylated lysosomal storage disease proteins and methods of use thereof
EP2890402B1 (de) 2012-08-31 2019-04-17 Sutro Biopharma, Inc. Modifizierte aminosäuren mit einer azidogruppe
US9310374B2 (en) 2012-11-16 2016-04-12 Redwood Bioscience, Inc. Hydrazinyl-indole compounds and methods for producing a conjugate
WO2014078733A1 (en) 2012-11-16 2014-05-22 The Regents Of The University Of California Pictet-spengler ligation for protein chemical modification
CN102935236B (zh) * 2012-11-21 2015-08-26 武汉平华生物医药科技有限公司 一种具有p-糖蛋白抑制功能的抗肿瘤前药
AU2014243816B2 (en) 2013-03-13 2019-01-31 Bioasis Technologies Inc. Fragments of p97 and uses thereof
WO2015006555A2 (en) 2013-07-10 2015-01-15 Sutro Biopharma, Inc. Antibodies comprising multiple site-specific non-natural amino acid residues, methods of their preparation and methods of their use
US20150093399A1 (en) 2013-08-28 2015-04-02 Bioasis Technologies, Inc. Cns-targeted conjugates having modified fc regions and methods of use thereof
EP3055298B1 (de) 2013-10-11 2020-04-29 Sutro Biopharma, Inc. Modifizierte aminosäuren mit funktionellen tetrazingruppen, verfahren zur herstellung und verfahren zu deren verwendung
NZ758049A (en) 2013-10-15 2024-03-22 Seagen Inc Pegylated drug-linkers for improved ligand-drug conjugate pharmacokinetics
CN115504924A (zh) 2013-11-27 2022-12-23 雷德伍德生物科技股份有限公司 肼基-吡咯并化合物及用于生成缀合物的方法
CN114805532A (zh) 2014-10-24 2022-07-29 百时美施贵宝公司 修饰的fgf-21多肽及其用途
EP3373937B1 (de) 2015-11-09 2021-12-22 R.P. Scherer Technologies, LLC Anti-cd22-antikörper-maytansin-konjugate und verfahren zur verwendung davon
US11793880B2 (en) 2015-12-04 2023-10-24 Seagen Inc. Conjugates of quaternized tubulysin compounds
KR20180090290A (ko) 2015-12-04 2018-08-10 시애틀 지네틱스, 인크. 사차화 튜불리신 화합물들의 컨쥬게이트들
CN109843919A (zh) 2016-03-25 2019-06-04 西雅图基因公司 用于制备聚乙二醇化的药物-接头及其中间体的方法
AU2017250778B2 (en) 2016-04-15 2021-09-23 Beckman Coulter, Inc. Photoactive macromolecules and uses thereof
JP7097885B2 (ja) 2016-12-12 2022-07-08 ベクトン・ディキンソン・アンド・カンパニー 水溶性ポリマー色素
JP7244987B2 (ja) 2016-12-14 2023-03-23 シージェン インコーポレイテッド 多剤抗体薬物コンジュゲート
PE20191716A1 (es) 2017-02-08 2019-12-05 Bristol Myers Squibb Co Polipeptidos de relaxina modificada que comprenden un mejorador farmacocinetico y sus usos
KR102648564B1 (ko) 2017-03-24 2024-03-19 씨젠 인크. 글루쿠로니드 약물-링커의 제조 공정 및 그 중간물
CN119286279A (zh) 2017-12-26 2025-01-10 贝克顿·迪金森公司 深紫外线可激发的水溶剂化聚合物染料
EP3775052B1 (de) 2018-03-30 2024-06-05 Becton, Dickinson and Company Wasserlösliche polymere farbstoffe mit seitenständigen chromophoren
TWI851577B (zh) 2018-06-07 2024-08-11 美商思進公司 喜樹鹼結合物
EP3813867A1 (de) 2018-07-22 2021-05-05 Bioasis Technologies Inc. Behandlung von lymphatischen metastasen
CA3111576A1 (en) 2018-09-11 2020-03-19 Ambrx, Inc. Interleukin-2 polypeptide conjugates and their uses
JP2022512746A (ja) 2018-10-19 2022-02-07 アンブルックス，インコーポレイテッド インターロイキン－１０ポリペプチド複合体、その二量体、およびそれらの使用
CN109400695B (zh) * 2018-10-31 2020-06-30 中南大学湘雅医院 一种多肽的修饰方法及应用
CA3128081A1 (en) 2019-02-12 2020-08-20 Ambrx, Inc. Compositions containing, methods and uses of antibody-tlr agonist conjugates
CN114929284A (zh) 2019-10-04 2022-08-19 西根公司 喜树碱肽缀合物
EP4117732A1 (de) 2020-03-11 2023-01-18 Ambrx, Inc. Interleukin-2-polypeptidkonjugate und verfahren zur verwendung davon
AU2021251875A1 (en) 2020-04-10 2022-11-03 Seagen Inc. Charge variant linkers
US20210355468A1 (en) 2020-05-18 2021-11-18 Bioasis Technologies, Inc. Compositions and methods for treating lewy body dementia
US20210393787A1 (en) 2020-06-17 2021-12-23 Bioasis Technologies, Inc. Compositions and methods for treating frontotemporal dementia
JP2023538071A (ja) 2020-08-20 2023-09-06 アンブルックス，インコーポレイテッド 抗体－ｔｌｒアゴニストコンジュゲート、その方法及び使用
JP2024503508A (ja) 2021-01-15 2024-01-25 シージェン インコーポレイテッド 免疫調節性抗体－薬物コンジュゲート
BR112023015561A2 (pt) 2021-02-03 2023-11-14 Univ Minnesota Compostos imunoestimuiladores e conjugados
BR112023018676A2 (pt) 2021-03-18 2023-10-10 Seagen Inc Conjugado anticorpo-fármaco, composição farmacêutica, métodos de tratamento de uma doença ou condição e de um câncer, e, composição de conjugado ligante-fármaco
CA3213805A1 (en) 2021-04-03 2022-10-06 Feng Tian Anti-her2 antibody-drug conjugates and uses thereof
AU2022283467A1 (en) 2021-05-28 2023-12-07 Seagen Inc. Anthracycline antibody conjugates
EP4155349A1 (de) 2021-09-24 2023-03-29 Becton, Dickinson and Company Wasserlösliche gelbe grünabsorbierende farbstoffe
WO2023083900A1 (en) 2021-11-09 2023-05-19 Tubulis Gmbh Conjugates comprising a phosphorus (v) and a drug moiety
ES3001145T1 (es) 2021-11-09 2025-03-04 Tubulis Gmbh Conjugados que comprenden un fosforo (v) y un resto de camptotecina
WO2023178289A2 (en) 2022-03-17 2023-09-21 Seagen Inc. Camptothecin conjugates
EP4518905A1 (de) 2022-05-06 2025-03-12 Seagen Inc. Immunmodulatorische antikörper-wirkstoff-konjugate
US20250383357A1 (en) 2022-07-01 2025-12-18 Beckman Coulter, Inc. Novel fluorescent dyes and polymers from dihydrophenanthrene derivatives
JP2025525904A (ja) 2022-08-03 2025-08-07 シージェン インコーポレイテッド 免疫刺激性抗ｐｄ－ｌ１－薬物コンジュゲート
EP4321522A1 (de) 2022-08-12 2024-02-14 Seagen Inc. Zytotoxische verbindungen und konjugate davon
WO2024044327A1 (en) 2022-08-26 2024-02-29 Beckman Coulter, Inc. Dhnt monomers and polymer dyes with modified photophysical properties
JP2025536308A (ja) 2022-10-18 2025-11-05 テューブリス ゲーエムベーハー 新規なＮａＰｉ２ｂ抗体を有する新規な抗体－薬物コンジュゲート、治療的方法、ならびにそれらの使用
PE20251849A1 (es) 2022-10-18 2025-07-22 Tubulis Gmbh Novedosos anticuerpo anti-tpbg y conjugados-anticuerpo-droga basados en el mismo, metodos terapeuticos y usos de los mismos
EP4619045A1 (de) 2022-11-17 2025-09-24 Sanofi Ceacam5-antikörper-wirkstoff-konjugate und verfahren zur verwendung davon
WO2024129756A1 (en) 2022-12-13 2024-06-20 Seagen Inc. Site-specific engineered cysteine antibody drug conjugates
EP4637832A1 (de) 2022-12-22 2025-10-29 Tubulis GmbH Konjugate mit einer phosphor(v)-einheit und einem arzneimittel
EP4680677A1 (de) 2023-03-17 2026-01-21 Beckman Coulter, Inc. Benzothienpyrrolcyaninfarbstoffe
WO2024220889A1 (en) 2023-04-20 2024-10-24 Seagen Inc. Sting agonist compounds and conjugates thereof
AU2024332412A1 (en) 2023-09-01 2026-03-12 Tubulis Gmbh Methods of preparing phosphonamidate compounds
CN121866309A (zh) 2023-09-21 2026-04-14 贝克曼库尔特有限公司 用于流式细胞术的二氢菲（dhp）桥接染料
AR134171A1 (es) 2023-10-24 2025-12-10 Seagen Inc Compuestos quimioterapéuticos y métodos de uso
WO2025149947A1 (en) 2024-01-12 2025-07-17 Seagen Inc. Antibody-drug conjugates
WO2026043823A2 (en) 2024-08-19 2026-02-26 Sutro Biopharma, Inc. Antibodies comprising site-specific non-natural amino acid residues, methods of preparation and uses thereof

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4835260A (en) * 1987-03-20 1989-05-30 Genetics Institute, Inc. Erythropoietin composition
US5166322A (en) * 1989-04-21 1992-11-24 Genetics Institute Cysteine added variants of interleukin-3 and chemical modifications thereof
DE69023314T2 (de) 1989-04-26 1996-03-28 Fanuc Ltd Verfahren zur rotationssteuerung einer hauptwelle.
KR100221066B1 (ko) 1989-10-13 1999-10-01 스튜어트 엘.왓트 에리트로포이에틴 유사체와 그를 포함하는 제약학적 조성물
JPH03151399A (ja) * 1989-11-07 1991-06-27 Snow Brand Milk Prod Co Ltd 変異ヒトエリスロポエチン
JPH06506217A (ja) * 1991-03-18 1994-07-14 エンゾン，インコーポレーテッド ポリペプチドまたはグリコポリペプチドとポリマーとのヒドラジン含有結合体
RU2010858C1 (ru) * 1991-07-03 1994-04-15 Институт биохимии Литовской Академии наук Способ иммобилизации алкогольоксидазы
NZ250375A (en) * 1992-12-09 1995-07-26 Ortho Pharma Corp Peg hydrazone and peg oxime linkage forming reagents and protein derivatives
BR9406490A (pt) 1993-04-29 1996-03-05 Abbott Lab Análogo de eritropoietina humana,DNA de filamento duplo,vetor de expressão célula de mamiferos em cultura composição farmaceutica segundo e terceiro análogo de eritropoietina humana e processos para fabricar um segundo análogo de eritropoietina e para usar um segundo análogo
WO1994028024A1 (en) * 1993-06-01 1994-12-08 Enzon, Inc. Carbohydrate-modified polymer conjugates with erythropoietic activity
EP0652806B1 (de) 1993-06-03 1998-09-30 Beckman Coulter, Inc. Probentraeger
US5643575A (en) * 1993-10-27 1997-07-01 Enzon, Inc. Non-antigenic branched polymer conjugates

Also Published As

Publication number Publication date
ES2273373T3 (es) 2007-05-01
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WO1998005363A3 (en) 1998-05-07
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ATE341344T1 (de) 2006-10-15

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