DE69937352T2

DE69937352T2 - Maiszellulosesynthasen und deren verwendungen

Info

Publication number: DE69937352T2
Application number: DE69937352T
Authority: DE
Inventors: Kanwarpal S. Johnston DHUGGA; Timothy G. Ankeny HELENTJARIS; Benjamin A. Berkeley BOWEN; Xun San Diego WANG
Original assignee: Pioneer Hi Bred International Inc
Current assignee: Pioneer Hi Bred International Inc
Priority date: 1998-08-17
Filing date: 1999-08-16
Publication date: 2008-07-17
Anticipated expiration: 2019-08-17
Also published as: ES2296405T3; US7312377B2; HUP0103556A3; US20090151017A1; NZ510202A; WO2000009706A2; AU5569899A; CA2339483A1; DE69937352D1; US6803498B2; US20030167528A1; EP1105502B1; WO2000009706A3; ATE376060T1; US20060272055A1; CA2339483C; HUP0103556A2; AU772064B2; US7582808B2; US20080083043A1

Description

TECHNISCHES GEBIET
Die vorliegende Erfindung bezieht sich allgemein auf Pflanzenmolekularbiologie. Sie bezieht sich spezifischer auf Nucleinsäuren und Verfahren zur Modulierung ihrer Expression in Pflanzen.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Polysaccaride bilden die Masse der Pflanzenzellwände und werden traditionell in drei Kategorien klassifiziert: Cellulose, Hemicellulose und Pectin. Fry, S. C. (1988) The growing plant cell wall: Chemical and metabolic analysis. New York: Longman Scientific & Technical. Während Cellulose an der Plasmamembran hergestellt wird und direkt in die Zellwand abgelegt wird, werden Hemicellulose- und Pectinpolymere zuerst im Golgi-Apparat hergestellt und dann durch Exocytose zu der Zellwand exportiert. Ray, P. M., et al., (1976), Ber. Deutsch. Bot. Ges. Bd. 89, 121–146. Die Vielzahl chemischer Verknüpfungen in den Pectin- und Hemicellulosepolysacchariden zeigt, dass es im Golgi-Apparat mehrere zehn Polysaccaridsynthasen geben muss. Darvill et al., (1980). The primary cell walls of flowering plants. In The Plant Cell (N. E. Tolbert, Herausg.), Bd. 1 in der Reihe: The biochemistry of plants: A comprehensive treatise, Herausg., P. K. Stumpf und E. E. Conn (New York: Academic Press), S. 91–162.
Cellulose hat aufgrund ihrer Fähigkeit, semikristalline Mikrofibrillen zu bilden, eine sehr hohe Zugfestigkeit, die an die einiger Metalle heranreicht. Niklas, K. J. (1992). Plant Biomechanis: An engineering approach to plant form and function, The University of Chicago Press, S. 607. Es wurde festgestellt, dass die Biegefestigkeit des Stengels von normaler Gerste und die von Mutanten mit brüchigem Stengel in direkter Korrelation mit der Cellulosekonzentration in der Zellwand steht. Kokubo, et al., (1989), Plant Physiology 91, 876–882; Kokubo, et al., (1991) Plant Physiology 97, 509–514.
Obwohl Zucker- und Polysaccaridzusammensetzungen der Pflanzenzellwände gut charakterisiert wurden, wurde ein sehr limitierter Fortschritt in Richtung der Identifizierung der Enzyme, die bei der Bildung der Polysaccaride involviert sind, gemacht, wobei der Grund ihre labile Natur und ihre Widerspenstigkeit gegenüber einer Solubilisierung durch verfügbare Detergenzien ist. Gelegentliche Ansprüche auf die Identifizierung von Cellulosesynthase aus Pflanzenquellen wurden über die Jahre gestellt. Callaghan, T. und Benziman, M. (1984), Nature 311, 165–167; Okuda, et al., (1993), Plant Physiol. 101, 1131–1142. Allerdings wurde diesen Ansprüchen mit Skepsis begegnet. Callaghan, T. und Benziman, M. (1985), Nature 314. 383–384; Delmer, et al., (1993), Plant Physiol. 103, 307–308. Erst kürzlich wurde ein vermeintliches Gen für Pflanzencellulosesynthasen (CelA) aus sich entwickelnden Baumwollfasern, basierend auf Homolgie zu dem bakteriellen Gen, kloniert. Pear, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 93, 12637–12642; Saxena, et al., (1990), Plant Molecular Biology 15, 673–684; siehe auch WO 9818949 . WO 9800549 stellt auch Gene bereit, die für Polypeptide codieren, welche bei der Cellulosebiosynthese in Pflanzen involviert sind.
Ein brüchiger Halmknoten ist ein Hauptproblem bei der Getreidezüchtung bzw. Maiszüchtung, wobei auf dem Fachgebiet Zusammensetzungen und Verfahren zum Manipulieren der Cellulosekonzentration in der Zellwand und dadurch Verleihen von Pflanzenstengelqualität für verbessertes Standvermögen oder verbesserte Silage benötigt werden. Die vorliegende Erfindung stellt diese und andere Vorteile bereit.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Ganz allgemein besteht die Aufgabe der vorliegenden Erfindung in der Bereitstellung von Nucleinsäuren und Proteinen, die sich auf Cellulosesynthasen beziehen. Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung von: 1) Nucleinsäuren und Proteinen, die sich auf Maiscellulosesynthasen beziehen; 2) transgenen Pflanzen, die die Nucleinsäuren der vorliegenden Erfindung umfassen; 3) Verfahren zum Modulieren einer transgenen Pflanze, der Expression der Nucleinsäuren der vorliegenden Erfindung.
Daher stellt die vorliegende Erfindung in einem Aspekt eine isolierte Cellulosesynthase-Nucleinsäure bereit, die ein Polypeptid mit Cellulosesynthaseaktivität codiert, und umfasst:

(a) ein Polynucleotid von SEQ ID NO: 5, 9 oder 25;
(b) ein Polynucleotid, das ein Polypeptid von SEQ ID NO: 6, 10 oder 26 codiert.

Die isolierte Nucleinsäure kann DNA oder RNA sein.
In einem anderen Aspekt bezieht sich die vorliegende Erfindung auf rekombinante Expressionskassetten, die eine Nucleinsäure der vorliegenden Erfindung funktionell verknüpft mit einem Promotor umfassen. In einigen Ausführungsformen ist die Nucleinsäure funktionell in Antisense-Orientierung mit dem Promotor verknüpft.
In einem anderen Aspekt ist die vorliegende Erfindung auf eine Wirtszelle gerichtet, die mit der rekombinanten Expressionskassette transfiziert ist. Vorzugsweise ist die Zelle eine Pflanzenzelle.
In einem weiteren Aspekt umfasst die vorliegende Erfindung ein isoliertes Protein mit Cellulosesynthaseaktivität und ausgewählt aus:

(a) einem Polypeptid von SEQ ID NO: 6, 10 oder 26; und
(b) einem Polypeptid, das durch eine Nucleinsäure der Erfindung codiert wird.

In noch einem anderen Aspekt bezieht sich die vorliegende Erfindung auf eine transgene Pflanze, die eine rekombinante Expressionskassette umfasst, die einen Pflanzenpromotor funktionell verknüpft mit einer der isolierten Nucleinsäuren der vorliegenden Erfindung umfasst. In einigen Ausführungsformen ist die transgene Pflanze Zea mays. Die vorliegende Erfindung stellt auch Samen aus der transgenen Pflanze bereit.
In einem weiteren Aspekt bezieht sich die vorliegende Erfindung auf ein Verfahren zum Modulieren der Expression der Gene, die Proteine der vorliegenden Erfindung codieren, in einer Pflanzenzelle, die zur Pflanzenregeneration fähig ist, umfassend die Schritte: (a) Transformieren einer Pflanzenzelle mit einer rekombinanten Expressionskassette, umfassend ein Polynucleotid der vorliegenden Erfindung, funktionell verknüpft mit einem Promotor; (b) Wachsenlassen der Pflanzenzelle unter Pflanzenwachstumsbedingungen; und (c) Induzieren der Expression des Polynucleotids für eine Zeit, die ausreicht, um die Expression der Gene in der Pflanze zu modulieren. In einigen Ausführungsformen ist die Pflanze Mais. Eine Expression der Gene, die die Proteine der vorliegenden Erfindung codieren, kann im Vergleich zu einer nicht-transformierten Kontrollpflanze erhöht oder verringert sein.
Definitionen
Einheiten, Präfixe und Symbole können in ihrer akzeptierten SI-Form angegeben werden. Wenn nichts anderes angegeben ist, werden Nucleinsäuren von links nach rechts in 5'- zu 3'-Orientierung geschrieben; Aminosäuresequenzen werden von links nach rechts in Amino-zu-Carboxy-Orientierung geschrieben. Numerische Bereiche sind für die Zahlen, die den Bereich definieren, einschließlich und umfassen jede ganze Zahl innerhalb des definierten Bereichs. Aminosäuren können entweder durch ihre allgemein bekannten Drei-Buchstaben-Symbole oder durch die Ein-Buchstaben-Symbole, die durch die IUPAC-IUB-Biochemical Nomenclature Commission empfohlen sind, benannt werden. Nucleotide können entsprechend mit ihren allgemein akzeptierten Ein-Buchstaben-Codes bezeichnet werden. Wenn nichts anderes angegeben ist, sind Software-, elektrische und elektronische Begriffe, wie sie hierin verwendet werden, wie in The New IEEE Standard Dictionary of Electrical and electronics Terms (5. Ausgabe, 1993) definiert. Die nachfolgend definierten Begriffe werden unter Bezugnahme auf die Beschreibung als ganzes vollständiger definiert.
Mit „amplifiziert" ist die Konstruktion von mehreren Kopien einer Nucleinsäuresequenz oder mehreren Kopien, die komplementär zu der Nucleinsäuresequenz sind, gemeint, wobei wenigstens eine der Nucleinsäuresequenzen als Matrize verwendet wird. Amplifikationssysteme umfassen das Polymerase-Ketten-Reaktions (PCR)-System, das Ligase-Kettenreaktions (LCR)-System, eine Amplifikation auf Nucleinsäurebasis (NASBA, Cangene, Mississauga, Ontario), Q-Beta-Replikase-Systeme, ein Amplifikationssystem auf Transkriptionsbasis (TAS) und eine Strand-Displacement-Amplification (SDA). Siehe z. B., Diagnostic Molecular Microbiology: Principles and Applications, D. H. Persing et al., Herausg., American Society for Microbiology, Washington, D. C. (1993). Das Amplifikationsprodukt wird als ein Amplicon bezeichnet.
Der Ausdruck "Antikörper" umfasst eine Bezugnahme auf Antigen bindende Formen von Antikörpern (z. B. Fab, F(ab)₂). Der Ausdruck „Antikörper" bezieht sich häufig auf ein Polypeptid, das im Wesentlichen durch ein Immunglobulingen oder durch Immunglobulingene oder Fragmente davon codiert wird, das spezifisch an einen Analyten (Antigen) bindet und diesen erkennt. Obgleich verschiedene Antikörperfragmente bezüglich des Verdaus eines intakten Antikörpers definiert werden können, wird ein Fachmann erkennen, dass solche Fragmente de novo entweder chemisch oder unter Nutzung der DNA-Rekombinations-Methodologie synthetisiert werden können. So umfasst der Ausdruck Antikörper, wie er hierin verwendet wird, auch Anti körperfragmente, z. B. Einzelketten-Fv, chimäre Antikörper (d. h. die konstante und variable Regionen aus verschiedenen Spezies umfassen), humanisierte Antikörper (d. h. die eine Komplementarität bestimmende Region (CDR) aus einer nicht-humanen Quelle umfassen) und Heterokonjugat-Antikörper (z. B. bispezifische Antikörper).
Der Ausdruck „Antigen" umfasst die Bezeichnung einer Substanz, gegen die ein Antikörper erzeugt werden kann und/oder gegen die der Antikörper spezifisch immunreaktiv ist. Die spezifischen immunreaktiven Stellen im Antigen sind als Epitope oder antigene Determinanten bekannt. Diese Epitope können eine lineare Anordnung von Monomeren in einer polymeren Zusammensetzung sein – z. B. Aminosäuren in einem Protein – oder aus einer komplexeren Sekundär- oder Tertiärstruktur bestehen oder diese umfassen. Der Fachmann wird erkennen, dass alle Immunogene (d. h. Substanzen, die fähig sind, eine Immunantwort auszulösen) Antigene sind; allerdings sind einige Antigene, z. B. Haptene, nicht immunogen, können aber durch Kupplung an ein Trägermolekül immunogen gemacht werden. Ein Antikörper, der immunologisch reaktiv mit einem bestimmten Antigen ist, kann in vivo erzeugt werden oder durch rekombinante Verfahren, z. B. Selektion von Bibliotheken rekombinanter Antikörper in Phagen oder ähnlichen Vektoren, erzeugt werden. Siehe z. B. Huse et al., Science 246: 1275–1281 (1989); und Ward, et al., Nature 341: 544–546 (1989); und Vaughan et al., Nature Biotech. 14: 309–314 (1996).
„Antisense-Orientierung" bzw. „Antisinn-Orientierung", wie der Begriff hierin verwendet wird, umfasst eine Bezugnahme auf eine Duplex-Polynucleotidsequenz, die funktionell mit einem Promotor in einer Orientierung verknüpft ist, in der der Antisense-Strang transkribiert wird. Der Antisense-Strang ist ausreichend komplementär zu einem endogenen Transkriptionsprodukt, so dass eine Translation des endogenen Transkriptionsproduktes oft inhibiert wird.
Der Ausdruck „chromosomale Region", wie er hierin verwendet wird, umfasst eine Bezugnahme auf eine Länge eines Chromosoms, die durch Bezugnahme auf das lineare DNA-Segment, das es umfasst, gemessen werden kann. Die chromosomale Region kann durch Bezugnahme auf zwei einzigartige DNA-Sequenzen, d. h. Marker, definiert werden.
Der Ausdruck „konservativ modifizierte Varianten" findet sowohl auf Aminosäure- als auch auf Nucleinsäuresequenzen Anwendung. Für bestimmte Nucleinsäuresequenzen bezeichnen konservativ modifizierte Varianten solche Nucleinsäuren, die für identische oder konservativ modifizierte Varianten der Aminosäuresequenzen codieren. Wegen der Degeneriertheit des genetischen Codes codiert eine große Zahl von funktionell identischen Nucleinsäuren für ein gegebenes Protein. Zum Beispiel codieren die Codons GCA, GCC, GCG und GCU alle für die Aminosäure Alanin. Demnach kann in jeder Position, in der ein Alanin durch ein Codon spezifiziert wird, das Codon in ein beliebiges der entsprechenden Codons verändert werden, ohne dass das codierte Polypeptid verändert wird. Solche Nucleinsäurevariationen sind „stumme Variationen" und stellen eine Spezies einer konservativ modifizierten Variation dar. Jede Nucleinsäuresequenz, die für ein Polypeptid codiert, beschreibt hierin auch jegliche mögliche stumme Variation der Nucleinsäure. Ein Fachmann wird erkennen, dass jedes Codon in einer Nucleinsäure (außer AUG, das normalerweise das einzige Codon für Methionin ist, und UGG, das normalerweise das einzige Codon für Tryptophan ist) modifiziert werden kann, um ein funktionell identisches Molekül zu ergeben. Dementsprechend ist jede stumme Variation einer Nucleinsäure, die für ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung codiert, in jeder beschriebenen Polypeptidsequenz implizit und hierin durch Bezugnahme aufgenommen.
Was Aminosäuresequenzen angeht, wird ein Fachmann erkennen, dass einzelne Substitutionen, Deletionen oder Additionen an einer Nucleinsäure-, Peptid-, Polypeptid- oder Proteinsequenz, die eine einzelne Aminosäure oder einen geringen prozentualen Anteil an Aminosäuren in der codierten Sequenz verändert, addiert oder deletiert, eine „konservativ modifizierte Variante", in der die Veränderung in der Substitution einer Aminosäure durch eine chemisch ähnlich Aminosäure resultiert. Demnach kann eine beliebige Anzahl von Aminosäureresten, ausgewählt aus der Gruppe von ganzen Zahlen, bestehend von 1 bis 15, verändert werden. So können z. B. 1, 2, 3, 4, 5, 7 oder 10 Veränderungen durchgeführt werden. Konservativ modifizierte Varianten stellen typischerweise eine ähnliche biologische Aktivität wie die unmodifizierte Polypeptidsequenz, von der sie abgeleitet sind, bereit. Zum Beispiel ist die Substratspezifität, Enzymaktivität oder Ligand/Rezeptor-Bindung im Allgemeinen wenigstens 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% oder 90% des nativen Proteins für sein natives Substrat. Tabellen über konservative Substitutionen, die funktionell ähnliche Aminosäuren bereitstellen, sind auf dem Fachgebiet gut bekannt.
Die folgenden sechs Gruppen enthalten jeweils Aminosäuren, die konservative Substitutionen füreinander sind:

1) Alanin (A), Serin (S), Threonin (T);
2) Asparaginsäure (D), Glutaminsäure (E);
3) Asparagin (N), Glutamin (Q);
4) Arginin (R), Lysin (K):
5) Isoleucin (I), Leucin (L), Methionin (M), Valin (V); und
6) Phenylalanin (F), Tyrosin (Y), Tryptophan (W).

Siehe auch Creighton (1984) Proteins W. H. Freeman and Company.
Mit "codierend" oder "codiert" ist bei einer spezifizierten Nucleinsäure gemeint, umfassend die Information zur Translation in das spezifizierte Protein. Eine Nucleinsäure, die ein Protein codiert, kann nicht-translatierte Sequenzen (z. B. Introns) innerhalb translatierter Regionen der Nucleinsäure umfassen oder ein Fehlen solcher intervenierender nicht-translatierter Sequenzen aufweisen (z. B. in cDNA). Die Information, durch welche ein Protein codiert wird, wird durch die Verwendung von Codons spezifiziert. Typischerweise ist die Aminosäuresequenz durch die Nucleinsäure unter Verwendung des „universellen" genetischen Codes codiert. Allerdings können Varianten des universellen Codes, wie sie in einigen Pflanzen-, Tier- und Pilzmitochondrien, dem Bacterium Mycoplasma capricolum (Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 82: 2306–2309 (1985)) oder der Ziliate Macronucleus vorliegen, verwendet werden, wenn die Nucleinsäure unter Verwendung dieser Organismen exprimiert wird.
Wenn die Nucleinsäure synthetisch hergestellt oder verändert wird, können Vorteile aus bekannten Codonpräferenzen des vorgesehenen Wirts gezogen werden, in dem die Nucleinsäure exprimiert werden soll. Obgleich Nucleinsäuresequenzen der vorliegenden Erfindung sowohl in Monocotylen- als auch Dicotylen-Pflanzenspezies exprimiert werden können, können Sequenzen so modifiziert werden, dass sie die spezifischen Codonpräferenzen und GC-Gehalt-Präferenzen von Monocotylen oder Dicotylen berücksichtigen, da sich diese Präferenzen als verschieden erwiesen haben (Murray et al. Nucl. Acids Res. 17: 477–498 (1989)). So kann das von Mais bevorzugte Codon für eine bestimmte Aminosäure aus bekannten Gensequenzen aus Mais abgeleitet werden. Die Mais-Codonverwendung für 28 Gene aus Maispflanzen ist in Tabelle 4 von Murray et al., oben, aufgelistet.
Der Ausdruck „Volllängen-Sequenz", wie er hierin verwendet wird, bedeutet unter Bezugnahme auf ein spezifiziertes Polynucleotid oder sein codiertes Protein die gesamte Aminosäuresequenz einer nativen (nicht-synthetischen), endogenen, katalytisch aktiven Form des spezifizierten Proteins aufweisend. Verfahren, um zu bestimmen, ob eine Sequenz eine Volllängen-Sequenz ist, sind auf dem Fachgebiet gut bekannt; sie umfassen z. B. Techniken, wie Northern- oder Western-Blots, Primer-Verlängerung, S1-Schutz und Ribonukleaseschutz. Siehe z. B. Plant Molecular Biology: A Laboratory Manual, Clark, Herausg., Springer-Verlag, Berlin (1997). Ein Vergleich mit bekannten homologen (orthologen und/oder paralogen) Volllängen-Sequenzen kann ebenfalls verwendet werden, um Volllängen-Sequenzen der vorliegenden Erfindung zu identifizieren. Zusätzlich unterstützen Konsensus-Sequenzen, die typischerweise an den 5'- und 3'-untranslatierten Regionen von mRNA vorliegen, die Identifizierung eines Polynucleotids als Volllängen-Polynucleotid. Zum Beispiel unterstützt die Konsensus-Sequenz ANNNNAUGG, in der das unterstrichene Codon das N-terminale Methionin darstellt, die Bestimmung, ob das Polynucleotid ein vollständiges 5'-Ende hat. Konsensus-Sequenzen am 3'-Ende, z. B. Polyadenylierungssequenzen, unterstützen die Bestimmung, ob das Polynucleotid ein vollständiges 3'-Ende hat. Der Ausdruck „Genaktivität" bezieht sich auf einen Schritt oder mehrere Schritte, der/die bei der Genexpresssion involviert ist/sind, einschließlich Transkription, Translation, und auch das Funktionieren des Proteins, das durch das Gen codiert wird.
„Heterolog", wie der Ausdruck für eine Nucleinsäure verwendet wird, ist eine Nucleinsäure, die von einer fremden Spezies stammt oder, wenn sie von derselben Spezies stammt, im Vergleich zu ihrer nativen Form in Zusammensetzung und/oder genomischem Ort durch einen willkürlichen menschlichen Eingriff wesentlich modifiziert ist. Zum Beispiel stammt ein Promotor, der funktionell mit einem heterologen Strukturgen verknüpft ist, aus einer anderen Spezies als die, aus der das Strukturgen stammt, oder, wenn sie aus der gleichen Spezies stammen, ist einer oder beide im Vergleich zu ihrer ursprünglichen Form wesentlich modifiziert. Ein heterologes Protein kann aus einer fremden Spezies stammen oder, wenn es aus derselben Spezies stammt, ist es durch einen willkürlichen menschlichen Eingriff im Vergleich zu seiner ursprünglichen Form wesentlich modifiziert.
Mit „Wirtszelle" ist eine Zelle gemeint, die einen Vektor enthält und die Replikation und/oder Expression des Expressionsvektors stützt. Wirtszellen können prokaryotische Zellen, z. B. E. coli, oder eukaryotische Zellen, z. B. Hefe-, Insekten-, Amphibien- oder Säugerzellen, sein. Wirtszellen sind vorzugsweise Zellen einer monocotylen oder dicotylen Pflanze. Eine besonders bevorzugte monocotyle Wirtszelle ist eine Mais-Wirtszelle.
Der Ausdruck „Hybridisierungskomplex" umfasst die Bezugnahme auf eine Duplex-Nucleinsäurestruktur, die durch zwei einzelsträngige Nucleinsäuresequenzen, die selektiv miteinander hybridisiert sind, gebildet wird.
Mit „immunologisch reaktive Bedingungen" oder „immunreaktive Bedingungen" sind Bedingungen gemeint, die es einem Antikörper, der gegen ein bestimmtes Epitop erzeugt wurde, erlauben an das Epitop zu binden, und zwar zu einem detektierbar höheren Grad (z. B. wenigstens 2-fach stärker als der Hintergrund) als der Antikörper an im Wesentlichen alle anderen Epitope in einem Reaktiongemisch, das das bestimmte Epitop umfasst, bindet. Immunologisch reaktive Bedingungen sind von dem Format der Antikörperbindungsreaktion abhängig und typischerweise sind sie solche, wie sie in Immunoassayprotokollen verwendet werden. Siehe Harlow und Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications, New York (1988), bezüglich einer Beschreibung von Immunoassay-Formaten und -Bedingungen.
Der Ausdruck „eingeführt" bedeutet im Kontext mit Insertieren einer Nucleinsäure in eine Zelle „Transfektion" oder „Transformation" oder „Transduktion" und umfasst eine Bezugnahme auf einen Einbau einer Nucleinsäure in eine eukaryotische oder prokaryotische Zelle, wo die Nucleinsäure in das Genom der Zelle (z. B. Chromosom, Plasmid, Plastid oder Mitochondrien-DNA) eingebaut werden kann, in ein autonomes Replikon umgewandelt werden kann oder transient exprimiert werden kann (z. B. transfizierte mRNA).
Der Ausdruck „isoliert" bezieht sich auf Material, z. B. eine Nucleinsäure oder ein Protein, das ist: (1) substantiell oder im Wesentlichen frei von Komponenten, die normalerweise mit ihm assoziiert sind oder mit ihm wechselwirken, wenn es in seiner natürlich vorkommenden Umgebung gefunden wird. Das isolierte Material umfasst gegebenenfalls Material, das mit dem Material in seiner natürlichen Umgebung nicht gefunden wird; oder (2) wenn das Material in seiner natürlichen Umgebung ist, wurde das Material synthetisch (nicht-natürlich) durch einen willkürlichen menschlichen Eingriff bezüglich der Zusammensetzung verändert und/oder an eine Stelle in der Zelle (z. B. Genom oder subcelluläre Organelle) platziert, die für das in jener Umgebung gefundene Material nicht nativ ist. Die Veränderung unter Erhalt des synthetischen Materials kann an dem Material in seinem natürlichen Zustand oder entfernt aus seinem natürlichen Zustand durchgeführt werden. Zum Beispiel wird eine natürlich vorkommende Nucleinsäure eine isolierte Nucleinsäure, wenn sie verändert wird oder wenn sie aus DNA, die durch nicht-natürliche, synthetische (d. h. „von Menschen gemachte") Verfahren, die innerhalb der Zelle, aus der sie stammt, durchgeführt wurden, verändert wurde, transkribiert wird. Siehe z. B. Compounds and Methods for Site Directed Mutagenesis in Eukaryotic Cells, Kmiec, U.S. Patent Nr. 5,565,350 ; In Vivo Homologous Sequence Targeting in Eukaryotic Cells; Zarling et al., PCT/US93/03868 . Entsprechend wird eine natürlich vorkommende Nucleinsäure (z. B. ein Promotor) isoliert, wenn er durch nicht natürlich vorkommende Mittel an eine Stelle des Genoms eingeführt wird, die für jene Nucleinsäure nicht nativ ist. Nucleinsäuren, die „isoliert" sind, wie der Begriff hierin definiert ist, werden auch als „heterologe" Nucleinsäuren bezeichnet.
Wenn nichts anderes angegeben ist, bezeichnet der Ausdruck „Cellulosesynthase-Nucleinsäure" eine Nucleinsäure der vorliegenden Erfindung und meint eine Nucleinsäure, die ein Polynucleotid der vorliegenden Erfindung (ein „Cellulosesynthase-Polynucleotid") umfasst, das für ein Cellulosesynthase-Polypeptid codiert. Ein „Cellulosesynthase-Gen" ist ein Gen der vorliegenden Erfindung und bezieht sich auf eine nicht-heterologe genomische Form eines Volllängen-Cellulosesynthase-Polynucleotids.
So wie der Ausdruck „lokalisiert innerhalb der chromosomalen Region, definiert durch und umfassend" für bestimmte Marker verwendet wird, bezieht er sich auf eine fortlaufende Länge eines Chromosoms, die durch die angegebenen Marker begrenzt wird und diese beinhaltet.
„Marker", wie der Ausdruck hierin verwendet wird, bezieht sich auf einen Locus auf einem Chromosom, der dazu dient, eine einzigartige Position auf dem Chromosom zu identifizieren. Ein „polymorpher Marker" umfasst eine Bezugnahme auf einen Marker, der in mehreren Formen (Allelen) auftritt, so dass unterschiedliche Formen des Markers, wenn sie in einem homologen Paar vorliegen, die Übertragung von jedem der Chromosome in das Paar erlauben, das verfolgt werden soll. Ein Genotyp kann durch die Verwendung eines Markers oder einer Vielzahl von Markern definiert werden.
Wie der Ausdruck „Nucleinsäure" hierin verwendet wird, bezieht er sich auf ein Desoxyribonucleotid- oder Ribonucleotidpolymer, entweder in einzelsträngiger oder doppelsträngiger Form und, wenn nichts anderes angegeben ist, umfasst er Analoga, die die essentielle Natur von natürlichen Nucleotiden dahingehend haben, dass sie in ähnlicher Weise wie natürlich vorkommende Nucleotide an einzelsträngige Nucleinsäuren hybridisieren (z. B. Peptid-Nucleinsäuren).
Mit „Nucleinsäurebibliothek" ist eine Sammlung von isolierten DNA- oder RNA-Molekülen gemeint, die die gesamte transkribierte Fraktion eines Genoms eines spezifizierten Organismus umfasst und im Wesentlichen darstellt. Die Konstruktion von beispielhaften Nucleinsäurebibliotheken, z. B. genomischen und cDNA-Bibliotheken, wird in Standardwerken der Molekularbiologie gelehrt, z. B. in Berger und Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology, Bd. 152, Academic Press, Inc., San Diego, CA (Berger); Sambrook et al., Molecular Cloning – A Laboratory Manual, 2. Ausgabe, Band 1–3 (1989); und Current Protocols in Molecular Biology, F. M. Ausubel et al., Herausg., Current Protocols, ein Gemeinschaftsunternehmen zwischen Greene Publishing Associates, Inc. und John Wiley & Sons, Inc. (1994 Ergänzung).
Der Ausdruck „funktionell verknüpft", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf eine funktionelle Verknüpfung zwischen einem Promotor und einer zweiten Sequenz, wobei die Pro motorsequenz eine Transkription der DNA-Sequenz, die der zweiten Sequenz entspricht, initiiert und vermittelt. Im Allgemeinen bedeutet funktionell verknüpft, dass die Nucleinsäuresequenzen fortlaufend verknüpft sind und, wenn notwendig, um zwei Protein-codierende Regionen zu verbinden, fortlaufend und in demselben Leseraster sind.
Der Ausdruck „Pflanze", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf ganze Pflanzen, Pflanzenteile oder Organe (z. B. Blätter, Stengel, Wurzeln usw.), Pflanzenzellen, Samen und die Nachkommenschaft derselben. Eine Pflanzenzelle, wie der Ausdruck hierin verwendet wird, umfasst ohne Beschränkung Zellen, die erhalten werden aus oder gefunden werden in: Samen, Suspensionskulturen, Embryos, Merystemregionen, Callusgewebe, Blättern, Wurzeln, Schösslingen, Gametophyten, Sporophyten, Pollen und Mikrosporen. Pflanzenzellen können auch so verstanden werden, dass sie modifizierte Zellen, z. B. Protoplasten, erhalten aus den vorher genannten Geweben, umfassen. Die Klasse von Pflanzen, die in den Verfahren der Erfindung eingesetzt werden kann, ist im Allgemeinen so breit wie die Klasse höherer Pflanzen, die Transformationstechniken zugänglich ist, einschließlich monocotyler und dicotyler Pflanzen. Besonders bevorzugte Pflanzen umfassen Mais, Sojabohnen, Sonnenblumen, Sorghum, Canola, Weizen, Alfalfa, Baumwolle, Reis, Gerste und Hirse.
„Polynucleotid", wie der Ausdruck hierin verwendet wird, bezieht sich auf ein Desoxyribopolynucleotid, Ribopolynucleotid oder Analoga davon, die die essentielle Natur eines natürlichen Ribonucleotids dahingehend haben, dass sie unter stringenten Hybridisierungsbedingungen an im Wesentlichen dieselbe Nucleotidsequenz wie natürlich vorkommende Nucleotide hybridisieren und/oder eine Translation in dieselbe(n) Aminosäure(n) wie das natürlich vorkommende Nucleotid (die natürlich vorkommenden Nucleotide) erlauben. Ein Polynucleotid kann ein Volllängen-Polynucleotid oder eine Untersequenz eines nativen oder heterologen strukturellen oder regulatorischen Gens sein. Wenn nichts anderes angegeben ist, bezieht sich der Ausdruck auf die spezifizierte Sequenz sowie die komplementäre Sequenz derselben. Somit sind DNAs oder RNAs mit Grundgerüsten, die aus Stabilitätsgründen oder anderen Gründen modifiziert sind, „Polynucleotide", wie der Ausdruck hierin bestimmt ist. Darüber hinaus sind DNAs oder RNAs, die ungewöhnliche Basen, z. B. Inosin, oder modifizierte Basen, z. B. tritylierte Basen, um gerade zwei Beispiele zu nennen, Polynucleotide, wie der Ausdruck hierin verwendet wird. Es wird einzusehen sein, dass eine große Vielzahl von Modifikationen an DNA und RNA durchgeführt wurde, damit diese Ziele nützliche Zwecke erfüllen, wie es dem Fachmann bekannt ist. Der Ausdruck Polynucleotid, wie er hierin verwendet wird, umfasst solche chemisch, enzymatisch oder metabolisch modifizierten Formen von Polynucleotiden sowie die chemischen Formen von DNA und RNA, die für Viren und Zellen, einschließlich unter anderem einfache und komplexe Zellen, charakteristisch sind.
Die Ausdrücke „Polypeptid", „Peptid" und „Protein" werden hierin austauschbar verwendet und beziehen sich auf ein Polymer aus Aminosäureresten. Die Ausdrücke finden Anwendung auf Aminosäurepolymere, in denen ein Aminosäurerest oder mehrere Aminosäurereste ein künst liches chemisches Analogon einer entsprechenden natürlich vorkommenden Aminosäure ist/sind, sowie auf natürlich vorkommende Aminosäurepolymere. Die essentielle Natur solcher Analoga von natürlich vorkommenden Aminosäuren ist, dass, wenn sie in ein Protein eingebaut sind, dieses Protein spezifisch reaktiv gegenüber Antikörpern ist, die durch dasselbe Protein, das aber ganz aus natürlich vorkommenden Aminosäuren besteht, erzeugt werden. Die Ausdrücke „Polypeptid", „Peptid" und „Protein" schließen auch Modifikationen, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, Glycosylierung, Lipidanheftung, Sulfatierung, gamma-Carboxylierung von Glutaminsäureresten, Hydroxylierung und ADP-Ribosylierung, ein. Beispiele für Modifikationen sind in den meisten Basiswerken, z. B. Proteins – Structure and Molecular Properties, 2. Ausg., T. E. Creighton, W. H. Freeman and Company, New York (1993) beschrieben. Über dieses Thema gibt es viele detaillierte Übersichtsartikel, z. B. Wold, F., Post-Translational Protein Modifications: Perspectives and Prospects, S. 1–12 in Posttranslational Covalent Modification of Proteins, B. C. Johnson, Herausg., Academic Press, New York (1983); Seifter et al., Meth. Enzymol. 182: 626–646 (1990) und Rattan et al., Protein Synthesis: Posttranslational Modifications and Aging, Ann. N. Y. Acad. Sci. 663: 48–62 (1992). Es wird einzusehen sein, wie es auch bekannt und oben angegeben wurde, dass Polypeptide nicht immer ganz linear sind. Zum Beispiel können Polypeptide als Resultat einer Ubiquitinierung verzweigt sein und können mit oder ohne Verzweigung ringförmig sein, im Allgemeinen als Resultat von Posttranslationsereignissen, einschließlich eines natürlichen Prozessierungsereignisses und Ereignissen, die durch Manipulation durch den Menschen entstanden sind, die nicht natürlich vorkommen. Ringförmige, verzweigte und verzweigte ringförmige Polypeptide können durch einen natürlichen Nicht-Translations-Prozess und auch durch vollständig synthetische Verfahren synthetisiert werden. Modifikationen können irgendwo in einem Polypeptid, einschließlich der Peptidhauptkette, der Aminosäureseitenketten und der Amino- oder Carboxyl-Termini, auftreten. In der Tat ist eine Blockierung der Amino- oder Carboxylgruppe in einem Polypeptid oder beider durch eine kovalente Modifikation bei natürlich vorkommenden und synthetischen Polypeptiden üblich und solche Modifikationen können ebenfalls in Polypeptiden der vorliegenden Erfindung vorliegen. Zum Beispiel wird der aminoterminale Rest von Polypeptiden, die in E. coli oder anderen Zellen hergestellt werden, vor einer proteolytischen Prozessierung fast gleich bleibend N-Formylmethionin sein. Während einer posttranslationalen Modifikation des Peptids kann ein Methioninrest an dem NH₂-Terminus deletiert werden. Dementsprechend zieht diese Erfindung die Verwendung sowohl der Varianten des Proteins der Erfindung mit Methionin am Aminoterminus als auch ohne Methionin am Aminoterminus in Betracht. Im Allgemeinen umfasst der Ausdruck Polypeptid, wie er hierin verwendet wird, alle derartigen Modifikationen, insbesondere solche, die in Polypeptiden vorliegen, die durch Exprimieren eines Polynucleotids in einer Wirtszelle synthetisiert werden.
Der Ausdruck „Promotor", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf eine DNA-Region stromaufwärts vom Transkriptionsstart, die bei der Erkennung und Bindung von RNA-Polymerase und anderen Proteinen unter Initiierung der Transkription involviert ist. Ein „Pflan zenpromotor" ist ein Promotor, der fähig ist, eine Transkription in Pflanzenzellen zu initiieren. Beispiele für Pflanzenpromotoren umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, solche, die aus Pflanzen, Pflanzenviren und Bakterien erhalten werden, die Gene umfassen, die in Pflanzenzellen exprimiert werden, z. B. Agrobacterium oder Rhizobium. Beispiele für Promotoren unter Entwicklungskontrolle umfassen Promotoren, die bevorzugt eine Transkription in bestimmten Geweben, z. B. Blättern, Wurzeln oder Samen, initiieren. Solche Promotoren werden als „Gewebe-bevorzugt" bezeichnet. Promotoren, welche eine Transkription nur in bestimmtem Gewebe initiieren, werden als „Gewebe-spezifisch" bezeichnet. Ein „Zelltyp"-spezifischer Promotor steuert in erster Linie eine Expression in bestimmten Zelltypen in einem Organ oder mehreren Organen, z. B. Gefäßzellen in Wurzeln oder Blättern. Ein „induzierbarer" Promotor ist ein Promotor, der unter Umweltkontrolle steht. Beispiele für Umweltbedingungen, die eine Transkription durch induzierbare Promotoren bewirken, umfassen anaerobe Bedingungen oder das Vorliegen von Licht. Gewebe-spezifische, Gewebe-bevorzugte, Zelltyp-spezifische und induzierbare Promotoren bilden die Klasse von „nicht-konstitutiven" Promotoren. Ein „konstitutiver" Promotor ist ein Promotor, der unter den meisten Umweltbedingungen aktiv ist.
Der Ausdruck „Cellulosesynthase-Polypeptid" ist ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung und bezieht sich auf eine Aminosäuresequenz oder mehrere Aminosäuresequenzen in glycosylierter oder nicht-glycosilierter Form. Der Ausdruck umfasst auch Fragmente, Varianten, Homologe, Allele oder Vorläufer (z. B. Preproproteine oder Proproteine) davon. Ein „Cellulosesynthase-Protein" ist ein Protein der vorliegenden Erfindung und umfasst ein Cellulosesynthase-Polypeptid.
Der Ausdruck „rekombinant", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf eine Zelle oder einen Vektor, die/der durch die Einführung einer heterologen Nucleinsäure modifiziert wurde oder auf die Zelle, die aus einer so modifizierten Zelle abgeleitet ist. So exprimieren z. B. rekombinante Zellen Gene, die in identischer Form in der nativen (nicht-rekombinanten) Form der Zelle nicht gefunden werden, oder exprimieren native Gene, die ansonsten abnormal exprimiert, unter-exprimiert oder überhaupt nicht exprimiert werden, als Resultat eines beabsichtigten menschlichen Eingriffs. Der Ausdruck „rekombinant", wie er hierin verwendet wird, umfasst die Veränderung der Zelle oder des Vektors durch natürlich vorkommende Ereignisse (z. B. spontane Mutation, natürliche Transformation/Transduktion/Transposition), z. B. solche, die ohne bewussten menschlichen Eingriff auftreten, nicht.
Der Ausdruck „eine rekombinante Expressionskassette", wie er hierin verwendet wird, ist ein Nucleinsäurekonstrukt, das rekombinant oder synthetisch erzeugt wurde, mit einer Reihe von spezifizierten Nucleinsäureelementen, welche die Transkription einer bestimmten Nucleinsäure in einer Wirtszelle erlauben. Die rekombinante Expressionskassette kann in ein Plasmid, Chromosom, in Mitochondrien-DNA, Plastid-DNA, Virus oder ein Nucleinsäurefragment eingebaut werden. Typischerweise umfasst der Teil der rekombinanten Expressionskassette eines Expressions vektors unter anderen Sequenzen eine Nucleinsäure, die zu transkribieren ist, und einen Promotor.
Die Ausdrücke „Rest" oder „Aminosäurerest" oder „Aminosäure" werden hierin austauschbar verwendet, um eine Aminosäure zu bezeichnen, die in ein Protein, Polypeptid oder Peptid (kollektiv „Protein") eingebaut ist. Die Aminosäure kann eine natürlich vorkommende Aminosäure sein und kann, es sei denn, es gibt eine andere Beschränkung, bekannte Analoga von natürlichen Aminosäuren umfassen, die in ähnlicher Weise wie natürlich vorkommende Aminosäuren funktionieren.
Der Ausdruck „hybridisiert selektiv" bezieht sich auf eine Hybridisierung einer Nucleinsäuresequenz unter stringenten Hybridisierungsbedingungen an eine spezifizierte Target-Nucleinsäuresequenz zu einem detektierbar höheren Ausmaß (z. B. wenigstens 2-fach gegenüber dem Hintergrund) als ihre Hybridisierung an Nicht-Target-Nucleinsäuresequenzen und unter substantiellem Ausschluss von Nicht-Target-Nucleinsäuren. Selektiv hybridisierende Sequenzen haben typischerweise etwa wenigstens 80% Sequenzidentität, vorzugsweise 90% Sequenzidentität und am bevorzugtesten 100% Sequenzidentität (d. h. komplementär) miteinander.
Der Ausdruck „spezifisch reaktiv" bezieht sich auf eine Bindungsreaktion zwischen einem Antikörper und einem Protein, das ein Epitop hat, das durch die Antigenbindungsstelle des Antikörpers erkannt wird. Diese Bindungsreaktion ist für das Vorliegen eines Proteins mit dem erkannten Epitop bei Vorliegen einer heterogenen Population von Proteinen und anderen biologischen Materialien determinativ. Unter bezeichneten Immunoassaybedingungen binden demnach die spezifizierten Antikörper zu einem wesentlich höheren Grad (wenigstens 2-fach gegenüber dem Hintergrund) an einen Analyten als im Wesentlichen an alle anderen in der Probe vorliegenden Analyten, denen das Epitop fehlt.
Die Ausdrücke „stringente Bedingungen" oder „stringente Hybridisierungsbedingungen" beziehen sich auf Bedingungen, unter denen eine Sonde zu einem detektierbar größeren Grad als andere Sequenzen (z. B. wenigstens 2-fach gegenüber dem Hintergrund) an ihre Targetsequenz hybridisieren wird. Stringente Bedingungen sind Sequenz-abhängig und werden in verschiedenen Fällen unterschiedlich sein. Indem die Stringenz der Hybridisierungs- und/oder Waschbedingungen kontrolliert wird, können Targetsequenzen identifiziert werden, die 100% komplementär zu der Sonde sind (homologes Sondieren). Alternativ können Stringenzbedingungen so eingestellt werden, dass sie eine gewisse Fehlpaarung in Sequenzen zulassen, so dass niedrigere Similaritätsgrade detektiert werden (heterologes Sondieren). Im Allgemeinen hat eine Sonde eine Länge von weniger als etwa 1000 Nucleotiden, vorzugsweise eine Länge von weniger als 500 Nucleotiden.
Typischerweise werden stringente Bedingungen solche sein, bei denen die Salzkonzentration geringer als etwa 1,5 M Na-Ionen, typischerweise etwa 0,01 bis 1,0 M Na-Ionen-Konzentration (oder an anderen Salzen), bei pH 7,0 bis 8,3 ist und die Temperatur wenigstens etwa 30°C für kurze Sonden (z. B. 10 bis 50 Nucleotide) und wenigstens etwa 60°C für lange Sonden (z. B. größer als 50 Nucleotide) ist. Stringente Bedingungen können auch durch die Zugabe von destabilisierenden Mitteln, z. B. Formamid, erreicht werden. Beispielhafte Bedingungen niederer Stringenz umfassen eine Hybridisierung mit einer Pufferlösung von 30 bis 35% Formamid, 1 M NaCl, 1% SDS (Natriumdodecylsulfat) bei 37°C und ein Waschen in 1 × bis 2 × SSC (20 × SSC = 3,0 M NaC1/0,3 M Trinatriumcitrat) bei 50 bis 55°C. Beispielhafte Bedingungen moderater Stringenz umfassen eine Hybridisierung in 40 bis 45% Formamid, 1 M NaCl, 1% SDS bei 37°C und ein Waschen in 0,5 × bis 1 × SSC bei 55 bis 60°C. Beispielhafte Bedingungen hoher Stringenz umfassen Hybridisierung in 50% Formamid, 1 M NaCl, 1% SDS bei 37°C und ein Waschen in 0,1 × SSC bei 60 bis 65°C.
Spezifität ist typischerweise die Funktion von Nach-Hybridisierungs-Waschschritten, wobei die kritischen Faktoren die Ionenstärke und die Temperatur der Endwaschlösung sind. Für DNA-DNA-Hybride kann die T_m mit der Gleichung von Meinkoth und Wahl, Anal. Biochem., 138: 267–284 (1984): T_m = 81,5°C + 16,6 (log M) + 0,41 (%GC) – 0,61 (% Form) – 500/L näherungsweise bestimmt werden; worin M die Molarität von einwertigen Kationen ist, %GC der Prozentgehalt an Guanosin- und Cytosinnucleotiden in der DNA ist, % Form der Prozentgehalt von Formamid in der Hybridisierungslösung ist und L die Länge des Hybrids in Basenpaaren ist. Die T_m ist die Temperatur (unter definierter Ionenstärke und definiertem pH), bei der 50% einer komplementären Targetsequenz an eine perfekt passende Sonde hybridisieren. T_m wird um etwa 1°C für je 1% Fehlpaarung verringert; demnach können T_m, Hybridisierungs- und/oder Waschbedingungen so eingestellt werden, dass eine Hybridisierung an Sequenzen der gewünschten Identität erfolgt. Wenn z. B. Sequenzen mit ≥ 90% Identität gesucht werden, kann die T_m 10°C gesenkt werden. Im Allgemeinen werden stringente Bedingungen so gewählt, dass sie etwa 5°C unter dem thermischen Schmelzpunkt (T_m) für die spezifische Sequenz und ihr Komplement bei einer definierten Ionenstärke und definiertem pH liegen. Allerdings können streng stringente Bedingungen eine Hybridisierung und/oder ein Waschen bei 1, 2, 3, oder 4°C unter dem thermischen Schmelzpunkt (T_m) verwenden; moderat stringente Bedingungen können eine Hybridisierung und/oder ein Waschen bei 6, 7, 8, 9 oder 10°C niedriger als der thermische Schmelzpunkt (T_m) verwenden. Bedingungen niedriger Stringenz können eine Hybridisierung und/oder ein Waschen bei 11, 12, 13, 14, 15 oder 20°C unter dem thermischen Schmelzpunkt (T_m) verwenden. Unter Verwendung der Gleichung, der Hybridisierung und der Waschflüssigkeitenzusammensetzungen und der gewünschten T_m wird der Fachmann erkennen, dass Variationen in der Stringenz der Hybridisierung und/oder der Waschlösungen inhärent beschrieben sind. Wenn der gewünschte Grad der Fehlpaarung in einer T_m von weniger als 45°C (wässrige Lösung) oder 32°C (Formamidlösung) resultiert, ist es bevorzugt, die SSC-Konzentration zu erhöhen, so dass eine höhere Temperatur verwendet werden kann. Eine ausgiebige Anleitung für die Hybridisierung von Nucleinsäuren wird in Tijssen, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes, Teil I, Kapitel 2 „Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleid acid probe assays", Elsevier, New York (1993); und Current Pro tocols in Molecular Biology, Kapitel 2, Ausubel, et al., Herausg., Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York (1995) gefunden.
Der Ausdruck "transgene Pflanze", wie er hierin verwendet wird, umfasst Bezugnahme auf eine Pflanze, die in ihrem Genom ein heterologes Polynucleotid umfasst. Im Allgemeinen ist das heterologe Polynucleotid stabil im Genom integriert, so dass das Polynucleotid auf nachfolgende Generationen übergeht. Das heterologe Polynucleotid kann allein oder als Teil einer rekombinanten Expressionskassette in das Genom integriert werden. „Transgen" wird hierin verwendet, um eine beliebige Zelle, Zelllinie, einen beliebigen Callus, ein beliebiges Gewebe, einen beliebigen Pflanzenteil oder eine beliebige Pflanze, deren/dessen Genotyp durch das Vorliegen einer heterologen Nucleinsäure verändert wurde, wobei solche Transgenen eingeschlossen sind, die ursprünglich so verändert wurden, wie auch jene, die durch sexuelle Kreuzungen oder asexuelle Vermehrung aus dem ursprünglichen Transgen erzeugt wurden, zu beschreiben. Der Ausdruck „Transgen", wie er hierin verwendet wird, umfasst nicht die Veränderung des Genoms (chromosomales oder extra-chromosomales) durch herkömmliche Pflanzenzüchtungsverfahren oder durch natürlich auftretende Ereignisse, z. B. statistische Fremdbefruchtung, nicht-rekombinante Virusinfektion, nicht-rekombinante bakterielle Transformation, nicht-rekombinante Transposition oder spontane Mutation.
Der Ausdruck „Vektor", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf eine Nucleinsäure, die bei der Transfektion einer Wirtszelle verwendet wird, und in welcher ein Polynucleotid insertiert werden kann. Vektoren sind oft Replicons. Expressionsvektoren erlauben eine Transkription einer darin insertierten Nucleinsäure.
Die folgenden Ausdrücke werden verwendet, um die Sequenzbeziehungen zwischen zwei oder mehr Nucleinsäuren oder Polypeptiden zu beschreiben: (a) „Referenzsequenz", (b) „Vergleichsfenster", (c) „Sequenzidentität", (d) „Prozentwert der Sequenzidentität" und (e) „substantielle Identität".

(a) Der Ausdruck „Referenzsequenz", wie er hierin verwendet wird, ist eine definierte Sequenz, die als Basis für einen Sequenzvergleich verwendet wird. Eine Referenzsequenz kann ein Untersatz oder die Gesamtheit einer spezifizierten Sequenz, zum Beispiel ein Segment einer Volllängen-cDNA- oder Gensequenz oder die vollständige cDNA oder Gensequenz sein.
(b) Der Ausdruck „Vergleichsfenster", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf ein fortlaufendes und spezifiziertes Segment einer Polynucleotidsequenz, wobei die Polynucleotidsequenz mit einer Referenzsequenz verglichen werden kann und wobei der Teil der Polynucleotidsequenz im Vergleichsfenster Additionen oder Deletionen (d. h. Gaps) im Vergleich zur Referenzsequenz (die keine Additionen oder Delektionen umfasst) zur optimalen Anordnung der zwei Sequenzen umfassen kann. Im Allgemeinen ist das Vergleichsfenster wenigstens 20 fortlaufende Nucleotide lang und kann gegebenenfalls 30, 40, 50, 100 Nucleotide lang oder länger sein. Der Fachmann wird verstehen, dass zur Vermeidung einer hohen Similarität mit einer Referenzse quenz infolge des Einschlusses von Gaps in die Polynucleotidsequenz typischerweise eine „gap penalty" eingeführt wird und von der Zahl der Übereinstimmungen subtrahiert wird.

Verfahren zur Anordnung (alignment) von Sequenzen zum Vergleich sind auf dem Fachgebiet gut bekannt. Eine optimale Anordnung von Sequenzen für einen Vergleich kann durchgeführt werden: durch den lokalen Homologiealgorithmus von Smith und Waterman, Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981); durch den Homologieanordnungsalgorithmus von Needleman und Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443 (1970); durch die Suche nach einem Similaritätsverfahren von Pearson und Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. 85: 2444 (1988); durch Durchführung dieser Algorithmen mittels Computer, einschließlich, aber nicht beschränkt auf: CLUSTAL im PC/Gene-Programm von Intelligenetics, Mountain View, Kalifornien, GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA und TFASTA im Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Dr., Madison, Wisconsin, USA; das CLUSTAL-Programm ist von Higgins und Sharp, Gene 73: 237–244 (1988); Higgins und Sharp, CABIOS 5: 151–153 (1989); Corpet, et al., Nucleic Acids Research 16: 10881–90 (1988); Huang et al., Computer Applications in the Biosciences 8: 155–65 (1992) und Pearson, et al., Methods in Molecular Biology 24: 307–331 (1994) gut beschrieben. Die BLAST-Familie von Programmen, die für Datenbank-Similaritätssuchen eingesetzt werden kann, umfasst: BLASTN für Nucleotid-Query-Sequenzen gegen Nucleotid-Datenbank-Sequenzen; BLASTX für Nucleotid-Query-Sequenzen gegen Protein-Datenbank-Sequenzen; BLASTP für Protein-Query-Sequenzen gegen Protein-Datenbank-Sequenzen; TBLASTN für Protein-Query-Sequenzen gegen Nucleotid-Datenbank-Sequenzen und TBLASTX für Nucleotid-Query-Sequenzen gegen Nucleotid-Datenbank-Sequenzen. Siehe Current Protocols in Molecular Biology, Kapitel 19, Ausubel et al., Herausg., Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York (1995).
Wenn nichts anderes angegeben ist, beziehen sich Sequenzidentitäts/Similaritäts-Werte, die hierin bereitgestellt werden, auf den Wert, der unter Verwendung des BLAST 2.0-Satzes von Programmen unter Verwendung von Default-Parametern erhalten wurde. Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25: 3389–3402 (1997) Software zur Durchführung von BLAST-Analysen ist allgemein verfügbar, z. B. vom National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Dieser Algorithmus involviert zunächst Identifizieren von High Scoring Sequence Pairs (HSPs) durch Identifizieren kurzer Wörter mit der Länge W in der Query-Sequenz, die einem gewissen positiven Schwellenscore T entsprechen oder genügen, wenn sie mit einem Wort derselben Länge in der Datenbanksequenz vergleichend angeordnet werden. T wird als die Nachbarschaftswort-Scoreschwelle bezeichnet (Altschul et al, supra). Diese Anfangsnachbarschaftsworttreffer wirken als Keime zur Initiierung von Suchen, um längere HSPs, die sie enthalten, zu finden. Die Worttreffer werden dann in beiden Richtungen entlang jeder Sequenz ausgedehnt, soweit der kumulative Anordnungsscore erhöht werden kann. Kumulative Scores werden errechnet, indem für Nucleotidsequenzen die Parameter M (Belohnungsscore für ein Paar übereinstimmender Reste; immer > 0) und N (Penalty-Score für Fehlpaarungsreste; im mer < 0) verwendet werden. Für Aminosäuresequenzen wird eine Scoring-Matrix verwendet, um den kumulativen Score zu berechnen. Eine Extension der Worttreffer in jede Richtung wird angehalten, wenn: der kumulative Anordnungsscore um die Menge X von seinem maximal erreichten Wert abfällt; der kumulative Score gegen null oder darunter geht, und zwar durch Akkumulation von einer oder mehreren negativen Scoringrestanordnungen, oder das Ende jeder Sequenz erreicht ist. Die BLAST-Algorithmus-Parameter W, T und X bestimmen die Sensitivität und die Geschwindigkeit der Anordnung. Das BLASTN-Programm (für Nucleotidsequenzen) verwendet als Default eine Wortlänge (W) von 11, eine Erwartung (E) von 10, einen Cutoff-Wert von 100, M = 5, N = –4 und einen Vergleich beider Stränge. Für Aminosäuresequenzen verwendet das BLASTP-Programm als Default eine Wortlänge (W) von 3, eine Erwartung (E) von 10 und die BLOSUM62-Scoring-Matrix (siehe Henikoff & Henikoff (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915).
Der BLAST-Algorithmus führt zusätzlich zur Berechnung des Prozentwerts der Sequenzidentität auch eine statistische Analyse der Similarität zwischen zwei Sequenzen durch (siehe z. B. Karlin & Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873–5787 (1993)). Ein Maß für die Similarität, das durch den BLAST-Algorithmus bereitgestellt wird, ist die kleinste Summenwahrscheinlichkeit (P(N)), die einen Hinweis für die Wahrscheinlichkeit liefert, mit der eine Übereinstimmung zwischen zwei Nucleotid- oder Aminosäuresequenzen zufällig auftreten würde.
BLAST-Suchen nehmen an, dass Proteine als statistische Sequenzen modelliert werden können. Allerdings umfassen viele reelle Proteine Regionen von nicht-statistischen Sequenzen, die polymere Züge, Wiederholungen kurzer Periode oder Regionen, die an einer Aminosäure oder mehreren Aminosäuren angereichert sind, sein können. Solche Regionen mit niedriger Komplexität können zwischen nicht-verwandten Proteinen angeordnet sein, selbst wenn andere Regionen des Proteins vollständig verschieden sind. Eine Reihe von Niedrigkomplexitäts-Filterprogrammen können verwendet werden, um solche Anordnungen mit niedriger Komplexität zu reduzieren. Zum Beispiel können die SEG (Wooten und Federhen, Comput. Chem., 17: 149–163 (1993)) und XNU (Claverie und States, Comput. Chem., 17: 191–201 (1993))-Niedrigkomplexitäts-Filter allein oder in Kombination verwendet werden.

(c) „Sequenzidentität" oder „Identität" im Kontext von zwei Nucleinsäure- oder Polypeptidsequenzen beziehen sich, wie die Ausdrücke hierin verwendet werden, auf Reste in den zwei Sequenzen, die bei Anordnung auf maximales Übereinstimmen über ein spezifiziertes Vergleichsfenster gleich sind. Wenn der Prozentwert der Sequenzidentität bei Proteinen verwendet wird, wird anerkannt, dass Restpositionen, die nicht identisch sind, sich oft durch konservative Aminosäuresubstitutionen unterscheiden, in denen Aminosäurereste für andere Aminosäurereste mit ähnlichen chemischen Eigenschaften (z. B. Ladung oder Hydrophobie) eingesetzt sind und daher die funktionellen Eigenschaften des Moleküls nicht verändern. Wenn Sequenzen sich in konservativen Substitutionen unterscheiden, kann der Prozentwert der Sequenzidentität nach oben eingestellt werden, um eine Korrektur bezüglich der konservativen Natur der Substitution durchzufüh ren. Sequenzen, die sich durch solche konservativen Substitutionen unterscheiden, werden als mit „Sequenzsimilarität" oder „Similarität" bezeichnet. Mittel zur Durchführung dieser Einstellung sind dem Fachmann gut bekannt. Typischerweise umfasst dies ein Scoring einer konservativen Substitution als eine partielle anstelle einer vollständigen Fehlpaarung, wodurch der Prozentwert der Sequenzidentität erhöht wird. Wenn z. B. einer identischen Aminosäure ein Score von 1 gegeben wird und einer nicht-konservativen Substitution ein Score von null gegeben wird, wird einer konservativen Substitution ein Score zwischen null und 1 gegeben. Das Scoring bzw. die Bewertung von konservativen Substitutionen wird z. B. nach dem Algorithmus von Meyers und Miller, Computer Applic. Biol. Sci., 4: 11–17 (1988) errechnet, z. B. wie es in dem Programm PC/GENE (Intelligenetics, Mountain View, Kalifornien, USA) durchgeführt wird.
(d) Wie der Ausdruck „Prozentwert der Sequenzidentität" hierin verwendet wird, bedeutet er den Wert, der durch Vergleich von zwei optimal angeordneten Sequenzen über ein Vergleichsfenster bestimmt wird, wobei der Teil der Polynucleotidsequenz in dem Vergleichsfenster Additionen oder Deletionen (d. h. Gaps) verglichen mit der Referenzsequenz (die keine Additionen oder Deletionen umfasst) zur optimalen Anordnung der zwei Sequenzen umfassen kann. Der Prozentwert wird errechnet, indem die Anzahl von Positionen bestimmt wird, an denen die identische Nucleinsäurebase oder der Aminosäurerest in beiden Sequenzen auftritt, um so die Zahl der übereinstimmenden Positionen zu bestimmen, die Anzahl der übereinstimmenden Positionen durch die Gesamtzahl der Positionen im Vergleichsfenster dividiert wird und das Resultat mit 100 multipliziert wird, wodurch der Prozentwert der Sequenzidentität erhalten wird.
(e) (i) Der Ausdruck „substantielle Identität" von Polynucleotidsequenzen bedeutet, dass ein Polynucleotid eine Sequenz umfasst, die wenigstens 70% Sequenzidentität, vorzugsweise wenigstens 80%, bevorzugter wenigstens 90% und am bevorzugtesten wenigstens 95% Sequenzidentität zu einer Referenzsequenz hat, wobei eines der beschriebenen Anordnungsprogramme unter Verwendung von Standardparametern verwendet wird. Ein Fachmann wird erkennen, dass diese Werte geeigneterweise eingestellt werden können, um eine entsprechende Identität von Proteinen zu bestimmen, die durch zwei Nucleotidsequenzen codiert werden, indem die Codondegeneriertheit, die Aminosäuresimilarität, die Leserasterpositionierung und dergleichen berücksichtigt werden. Substantielle Identität von Aminosäuresequenzen bedeutet zu diesem Zweck normalerweise eine Sequenzidentität von wenigstens 60%, bevorzugter wenigstens 70%, 80%, 90% und am bevorzugtesten wenigstens 95%.

Ein anderer Hinweis, dass Nucleotidsequenzen im Wesentlichen identisch sind, ist, wenn zwei Moleküle unter stringenten Bedingungen aneinander hybridisieren. Allerdings sind Nucleinsäuren, die unter stringenten Bedingungen nicht aneinander hybridisieren, noch im Wesentlichen identisch, wenn die Polypeptide, die sie codieren, substantiell identisch sind. Dies kann auftreten, z. B. wenn eine Kopie einer Nucleinsäure unter Verwendung der maximalen Codondegeneriertheit, die durch den genetischen Code zugelassen wird, erzeugt wird. Ein Hinweis, dass zwei Nucleinsäuresequenzen substantiell identisch sind, ist, dass das Polypeptid, das durch die erste Nucleinsäure codiert wird, immunologisch kreuzreaktiv mit dem Polypeptid ist, das durch die zweite Nucleinsäure codiert wird.

(e) (ii) Der Ausdruck „substantielle Identität" im Kontext eines Peptids gibt an, dass ein Peptid eine Sequenz mit wenigstens 70% Sequenzidentität mit einer Referenzsequenz, vorzugsweise 80%, bevorzugter 85%, am bevorzugtesten wenigstens 90% oder 95% Sequenzidentität mit einer Referenzsequenz über ein spezifiziertes Vergleichsfenster hat. Vorzugsweise wird eine optimale Anordnung unter Verwendung des Homologie-Anordnungsalgorithmus von Needleman und Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443 (1970) durchgeführt. Ein Hinweis, dass zwei Peptidsequenzen substantiell identisch sind, ist, dass ein Peptid immunologisch reaktiv mit Antikörpern ist, die gegen das zweite Peptid entwickelt wurden. Somit ist ein Peptid substantiell identisch mit einem zweiten Peptid, z. B. wenn die zwei Peptide sich nur durch eine konservative Substitution unterscheiden. Peptide, die „substantiell ähnlich" sind, teilen Sequenzen, wie sie oben angegeben sind, außer dass Restpositionen, die nicht identisch sind, sich durch konservative Aminosäureänderungen unterscheiden können.

Übersicht
Die vorliegende Erfindung stellt unter anderem Zusammensetzungen und Verfahren zum Modulieren (d. h. Erhöhen oder Senken) des Levels von Polypeptiden der vorliegenden Erfindung in Pflanzen bereit. Die Polypeptide der vorliegenden Erfindung können insbesondere in Entwicklungsstadien in Geweben und/oder in Mengen, die für die nicht-rekombinant gentechnisch manipulierten Pflanzen nicht charakteristisch sind, exprimiert werden. Somit stellt die vorliegende Erfindung Verwendbarkeit in solchen beispielhaften Anwendungen, wie die Verbesserung der Stengelqualität für einen verbesserten Stand oder eine verbesserte Silage bereit. Außerdem sorgt die vorliegende Erfindung für eine erhöhte Cellulosekonzentration im Pericarp für eine Härtung des Kerns bzw. des Korns und somit für eine Verbesserung seiner Handhabbarkeit.
Isolierte Nucleinsäuren, die Polynucleotide ausreichender Länge und Komplementarität zu einem Gen der vorliegenden Erfindung umfassen, können als Sonden oder Amplifikationsprimer bei der Detektion, quantitativen Bestimmung oder Isolierung von Gentranskripten verwendet werden. Beispielsweise können isolierte Nucleinsäuren der vorliegenden Erfindung als Sonden beim Detektieren von Defizienzien auf dem Level von mRNA beim Screening auf gewünschte transgene Pflanzen, zum Detektieren von Mutationen im Gen (z. B. Substitutionen, Deletionen oder Additionen), zur Überwachung der Hochregulierung der Expression oder von Änderungen bei der Enzymaktivität in Screening-Assays von Verbindungen, zur Detektion einer Reihe von Allelvarianten (Polymorphismen) des Gens oder zur Verwendung als molekulare Marker in Pflanzenzüchtungsprogrammen verwendet werden. Die isolierten Nucleinsäuren der vorliegenden Erfindung können auch für eine rekombinante Expression ihrer codierten Polypeptide oder zur Verwendung als Immunogene bei der Herstellung und/oder dem Screening von Antikörpern eingesetzt werden. Die isolierten Nucleinsäuren der vorliegenden Erfindung können auch zur Verwendung bei der Sense- oder Antisense-Suppression eines oder mehrerer Gen(e) der vorliegen den Erfindung in einer Wirtszelle, in einem Gewebe oder einer Pflanze eingesetzt werden. Eine Bindung chemischer Agenzien, welche an die isolierten Nucleinsäuren der vorliegenden Erfindung binden, mit diesen interkalieren, sie spalten und/oder vernetzen, können ebenfalls eingesetzt werden, um eine Transkription oder Translation zu modulieren.
Die vorliegende Erfindung stellt auch isolierte Proteine bereit, die ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung umfassen (z. B. Preproenzym, Proenzym oder Enzyme). Die vorliegende Erfindung stellt auch Proteine bereit, die wenigstens ein Epitop aus einem Polypeptid der vorliegenden Erfindung umfassen. Die Proteine der vorliegenden Erfindung können in Assays auf Enzymagonisten oder Antagonisten der Enzymfunktion oder zur Verwendung als Immunogene oder Antigene unter Erhalt von Antikörpern, die spezifisch immunreaktiv mit einem Protein der vorliegenden Erfindung sind, verwendet werden. Solche Antikörper können in Assays auf Expressionslevel, zur Identifizierung und/oder Isolierung von Nucleinsäuren der vorliegenden Erfindung aus Expressionsbibliotheken oder zur Reinigung von Polypeptiden der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
Die isolierten Nucleinsäuren und Proteine der vorliegenden Erfindung können bei einem breiten Bereich von Pflanzentypen, insbesondere bei Monocotylen, wie den Spezies der Graminiae-Familie, einschließlich Sorghum bicolor und Zea mays, verwendet werden. Die isolierten Nucleinsäuren und Proteine der vorliegenden Erfindung können auch in Spezies aus den Gattungen: Cucurbita, Rosa, Vitis, Juglans, Fragaria, Lotus, Medicago, Onobrychis, Trifolium, Trigonella, Vigna, Citrus, Linum, Geranium, Manihot, Daucus, Arbidopsis, Brassica, Raphanus, Sinapis, Atropa, Capsicum, Datura, Hyoscyamus, Lycopersicon, Nicotiana, Solanum, Petunia, Digitalis, Majorana, Ciahorium, Helianthus, Lactuca, Bromus, Asparagus, Antirrhinum, Heterocallis, Nemesis, Pelargonium, Panieum, Pennisetum, Ranunculus, Senecio, Salpiglossis, Cucumis, Browaalia, Glycine, Pisum, Phaseolus, Lolium, Oryza, Avena, Hordeum, Secale, Triticum, Bambusa, Dendrocalamus und Melocanna eingesetzt werden.
Nucleinsäuren
Die vorliegende Erfindung stellt unter anderem isolierte Nucleinsäuren von RNA, DNA und Analoga und/oder Chimären davon, die ein Polynucleotid der vorliegenden Erfindung umfassen, bereit.
Ein Polynucleotid der vorliegenden Erfindung umfasst:

(a) ein Polynucleotid, das ein Polypeptid von SEQ ID NO: 6, 10 oder 26 und konservativ modifizierte und polymorphe Varianten davon codiert, einschließlich z. B. der Polynucleotide von SEQ ID NO: 5, 9 oder 25.

A. Polynucleotide, die für ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung oder konservativ modifizierte oder polymorphe Varianten davon codieren.
Wie in (a) oben angegeben wurde, stellt die vorliegende Erfindung isolierte Nucleinsäuren bereit, die ein Polynucleotid der vorliegenden Erfindung umfassen, wobei das Polynucleotid für ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung oder konservativ modifizierte oder polymorphe Vari anten davon codiert. Der Fachmann wird erkennen, dass die Degeneriertheit des genetischen Codes einer Vielzahl von Polynucleotiden ermöglicht, für die identische Aminosäuresequenz zu codieren. Solche „stummen Variationen" können z. B. verwendet werden, um Allelvarianten von Polynucleotiden der vorliegenden Erfindung selektiv zu hybridisieren und zu detektieren. Folglich umfasst die vorliegende Erfindung Polynucleotide von SEQ ID NO: 5, 9 und 25 und stumme Variationen von Polynucleotiden, die ein Polypeptid von SEQ ID NO: 6, 10 und 26 codieren. Die vorliegende Erfindung stellt ferner isolierte Nucleinsäuren bereit, die Polynucleotide umfassen, die für konservativ modifizierte Varianten eines Polypeptids von SEQ ID NO: 6, 10 und 26 codieren. Zusätzlich stellt die vorliegende Erfindung isolierte Nucleinsäuren bereit, die Polynucleotide umfassen, die für eine oder mehrere polymorphe (allelische) Varianten von Polypeptiden/Polynucleotiden codieren. Polymorphe Varianten werden häufig verwendet, um die Segregation von chromosomalen Regionen in z. B. Marker-unterstützen Selektionsverfahren zur Ernteverbesserung zu verfolgen.
B. Polynucleotide, amplifiziert aus einer Zea mays-Nucleinsäurebibliothek
Polynucleotide der vorliegenden Erfindung können aus einer Zea mays-Nucleinsäurebibliothek als zusätzliche Sequenzen amplifiziert werden. Die Zea mays-Linien B73, PHRE1, A632, BMS-P2#10, W23 und Mo17 sind bekannt und allgemein verfügbar. Andere allgemein bekannte und verfügbare Maislinien können von der Maize Genetics Cooperation (Urbana, IL) erhalten werden. Die Nucleinsäurebibliothek kann eine cDNA-Bibliothek, eine genomische Bibliothek oder eine Bibliothek, die allgemein aus nuklearen Transkripten in einer beliebigen Stufe der Intronprozessierung konstruiert wurde, sein. cDNA-Bibliotheken können normalisiert werden, um die Repräsentation von relativ seltenen cDNAs zu erhöhen. In optionalen Ausführungsformen wird die cDNA-Bibliothek unter Verwendung eines Volllängen-cDNA-Syntheseverfahrens konstruiert. Beispiele für solche Verfahren umfassen Oligo-Capping (Maruyama, K. und Sugano, S. Gene 138: 171–174, 1994), Biotinylierten CAP-Trapper (Carninci, P., Kvan, Ca. et al. Genomics 37: 372–336, 1996) und CAP-Retentionsverfahren (Edery, E., Chu, L. L. et al. Molecular and Cellular Biology 15: 3363–3371, 1995). Eine cDNA-Synthese wird oft bei 50–55°C katalysiert, um die Bildung von RNA-Sekundärdstruktur zu verhindern. Beispiele für reverse Transkriptasen, die bei diesen Temperaturen relativ stabil sind, sind Superscript II-Reverse Transkriptase (Life Technologies, Inc.), AMV-Reverse Transkriptase (Boehringer Mannheim) und Retro-Amp-Reverse-Transkriptase (Epicenter). Als mRNA-Quellen werden vorzugsweise schnell wachsende Gewebe oder sich schnell teilende Zellen verwendet, z. B. aus dem sich streckenden Internodium von Getreidepflanzen bzw. Maispflanzen.
Polynucleotide können unter Verwendung der folgenden Primerpaare amplifiziert werden:
SEQ ID NO: 3 und 4, welche ein Amplicon liefern, das eine Sequenz mit substantieller Identität zu SEQ ID NO: 1 umfasst;
SEQ ID NO: 7 und 8, die ein Amplicon liefern, das eine Sequenz mit substantieller Identität zu SEQ ID NO: 5 der Erfindung umfasst; und
SEQ ID NO: 11 und 12, die ein Amplicon liefern, das eine Sequenz mit substantieller Identität zu SEQ ID NO: 9 der Erfindung umfasst.
SEQ ID NO: 15 und 16, die ein Amplicon liefern, das eine Sequenz mit substantieller Identität zu SEQ ID NO: 13 umfasst.
SEQ ID NO: 19 und 20, die ein Amplicon liefern, das eine Sequenz mit substantieller Identität zu SEQ ID NO: 17 umfasst;
SEQ ID NO: 23 und 24, die ein Amplicon liefern, das eine Sequenz mit substantieller Identität zu SEQ ID NO: 21 umfasst;
SEQ ID NO: 27 und 28, die ein Amplicon liefern, das eine Sequenz mit substantieller Identität zu SEQ ID NO: 25 der Erfindung umfasst;
SEQ ID NO: 31 und 32, die ein Amplicon liefern, das eine Sequenz mit substantieller Identität zu SEQ ID NO: 29 umfasst.
SEQ ID NO: 35 und 36, die ein Amplicon liefern, das eine Sequenz mit substantieller Identität zu SEQ ID NO: 33 umfasst;
SEQ ID NO: 39 und 40, die ein Amplicon liefern, das eine Sequenz mit substantieller Identität zu SEQ ID NO: 37 umfasst; und
SEQ ID NO: 43 und 44, die ein Amplicon liefern, das eine Sequenz mit substantieller Identität zu SEQ ID NO: 41 umfasst.
SEQ ID NO: 47 und 48, die ein Amplicon liefern, das eine Sequenz mit substantieller Identität zu SEQ ID NO: 45 umfasst.
SEQ ID NO: 51 und 52, die ein Amplicon liefern, das eine Sequenz mit substantieller Identität zu SEQ ID NO: 49 umfasst;
SEQ ID NO: 55 und 56, die ein Amplicon liefern, das eine Sequenz mit substantieller Identität zu SEQ ID NO: 53 umfasst; und
SEQ ID NO: 59 und 60, die ein Amplicon liefern, das eine Sequenz mit substantieller Identität zu SEQ ID NO: 57 hat.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf Untersequenzen der Polynucleotide der vorliegenden Erfindung. Eine Vielzahl von Untersequenzen kann unter Verwendung von Primern erhalten werden, welche unter stringenten Bedingungen selektiv an wenigstens zwei Stellen in einem Polynucleotid der vorliegenden Erfindung oder an zwei Stellen in der Nucleinsäure, welche ein Polynucleotid der Erfindung flankiert und umfasst, oder an eine Stelle in einem Polynucleotid der Erfindung und eine Stelle in der Nucleinsäure, die sie umfasst, hybridisieren. Primer werden so ausgewählt, dass sie unter stringenten Hybridisierungsbedingungen selektiv an ein Polynucleotid der vorliegenden Erfindung hybridisieren. Im Allgemeinen sind die Primer komplementär zu einer Untersequenz der Zielnucleinsäure, welche sie amplifizieren. Wie der Fachmann erkennen wird, werden die Stellen, an welche das Primerpaar selektiv hybridisieren wird, so gewählt, dass unter den gewünschten Amplifikationsbedingungen eine einzelne fortlaufende Nucleinsäure gebildet werden kann.
Die Primer können so konstruiert sein, dass sie unter stringenten Bedingungen selektiv an eine Sequenz (oder ihr Komplement) in der Zielnucleinsäure hybridisieren, welche das Codon, das für den Carboxy- oder Amino-terminalen Aminosäurerest codiert (d. h. die 3'-terminale codierende Region bzw. die 5'-terminale codierende Region) der Polynucleotide der vorliegenden Erfindung umfasst. Gegebenenfalls werden die Primer so konstruiert sein, dass sie selektiv vollständig in der codierenden Region des Targetpolynucleotids bzw. Zielpolynucleotids der vorliegenden Erfindung hybridisieren, so dass das Amplifikationsprodukt eines cDNA-Targets aus der codierenden Region jener cDNA bestehen wird. Die Primerlänge in Nucleotiden wird aus der Gruppe von ganzen Zahlen, bestehend aus wenigstens 15 bis 50, ausgewählt. So können die Primer eine Länge von wenigstens 15, 18, 20, 25, 30, 40 oder 50 Nucleotiden haben. Der Fachmann wird erkennen, dass eine verlängerte Primersequenz verwendet werden kann, um die Bindungsspezifität (d. h. ein Annealing) an eine Targetsequenz zu erhöhen. Eine Nicht-Annealing-Sequenz am 5'-Ende eines Primers (ein „Schwanz") kann addiert werden, zum Beispiel um eine Klonierungsstelle an den terminalen Enden des Amplicons einzuführen.
Die Amplifikationsprodukte können unter Verwendung von Expressionssystemen, die dem Fachmann auf dem Fachgebiet gut bekannt sind und die unten diskutiert werden, translatiert werden. Die resultierenden Translationsprodukte können als Polypeptide der vorliegenden Erfindung bestätigt werden, indem zum Beispiel auf die geeignete katalytische Aktivität (z. B. spezifische Aktivität und/oder Substratspezifität) analysiert wird oder das Vorliegen eines linearen Epitops oder mehrerer linearer Epitope verifiziert wird, das/die für ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung spezifisch ist/sind. Verfahren zur Proteinsynthese aus durch PCR abgeleitete Matrizen sind auf dem Fachgebiet bekannt und im Handel erhältlich. Siehe z. B. Amersham Life Sciences, Inc, Katalog '97, S. 354.
Verfahren zum Erhalt von 5'- und/oder 3'-Enden eines Vektorinserts sind auf dem Fachgebiet gut bekannt. Siehe z. B. RACE (Rapid Amplification of Complementary Ends), beschrieben in Frohman, M. A., in PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, M. A. Innis, D. H. Gelfand, J. J. Sninsky, T. J. White, Herausg. (Academic Press, Inc., San Diego, (1990), S. 28–38.); siehe auch U.S. Patent Nr. 5,470,722 und Current Protocols in Molecular Biology, Unit 15.6, Ausubel et al., Herausg., Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York (1995); Frohman und Martin, Techniques 1: 165 (1989).
C. Polynucleotide, die selektiv an ein Polynucleotid von (A) oder (B) hybridisieren
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf isolierte Nucleinsäuren, die Polynucleotide der vorliegenden Erfindung umfassen, wobei die Polynucleotide unter selektiven Hybridisierungsbedingungen selektiv an ein Polynucleotid der Abschnitte (A) oder (B), wie sie oben diskutiert wurden, hybridisieren. Solche Polynucleotide können zum Isolieren, Detektieren und/oder Quantifizieren von Nucleinsäuren, die die Polynucleotide der Erfindung von (A) oder (B) umfassen, verwendet werden. Solche Polynucleotide können zum Beispiel verwendet werden, um Partial- oder Volllängenklone in einer hinterlegten Bibliothek zu identifizieren, zu isolieren oder zu amplifizieren. Solche Polynucleotide können genomische oder cDNA-Sequenzen sein, die isoliert wurden oder ansonsten komplementär zu einer cDNA aus einer Dicotylen- oder Monocotylen-Nucleinsäurebibliothek sind. Beispiele für Spezies von Monocotylen und Dicotylen umfassen, sind aber nicht beschränkt auf: Mais, Canola, Sojabohne, Baumwolle, Weizen, Sorghum, Sonnenblume, Hafer, Zuckerrohr, Hirse, Gerste und Reis. Gegebenenfalls umfasst die cDNA-Bibliothek wenigstens 80% Volllängensequenzen, vorzugsweise wenigstens 85% oder 90% Volllängensequenzen, bevorzugter wenigstens 95% Volllängensequenzen. Die cDNA-Bibliotheken können zur Erhöhung der Repräsentation von seltenen Sequenzen normalisiert werden. Hybridisierungsbedingungen niedriger Stringenz werden typischerweise, aber nicht ausschließlich, mit Sequenzen verwendet, die eine verringerte Sequenzidentität bezüglich komplementärer Sequenzen haben. Bedingungen moderater und hoher Stringenz können gegebenenfalls für Sequenzen mit größerer Identität verwendet werden. Bedingungen niedriger Stringenz erlauben eine selektive Hybridisierung von Sequenzen, die etwa 70% Sequenzidentität haben, und können verwendet werden, um orthologe oder paraloge Sequenzen zu identifizieren.
E. Polynucleotide, die für ein Protein codieren, welches eine Untersequenz aus einem Prototyp-Polypeptid hat und mit dem Prototyp-Polypeptid kreuzreaktiv ist
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf isolierte Nucleinsäuren, die Polynucleotide der vorliegenden Erfindung umfassen, wobei die Polynucleotide ein Protein codieren, das eine Untersequenz von fortlaufenden Aminosäuren aus einem Prototyp-Polypeptid der vorliegenden Erfindung, wie sie z. B. in (a) oben bereitgestellt werden, hat. Die Länge der fortlaufenden Aminosäuren aus dem Prototyp-Polypeptid wird aus der Gruppe von ganzen Zahlen ausgewählt, bestehend aus wenigstens 10 bis zu der Zahl von Aminosäuren in der Prototyp-Sequenz. So kann zum Beispiel ein derartiges Polynucleotid für ein Polypeptid codieren, das eine Untersequenz mit wenigstens 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 oder 50 fortlaufenden Aminosäuren aus dem Prototyp-Polypeptid hat. Außerdem kann die Zahl solcher Untersequenzen, die durch ein Polynucleotid der vorliegenden Ausführungsform codiert werden, eine ganze Zahl, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus 1 bis 20, z. B. 2, 3, 4 oder 5, sein. Die Untersequenzen können durch eine beliebige ganze Zahl von Nucleotiden von 1 bis zu der Anzahl der Nucleotide in der Sequenz, z. B. wenigstens 5, 10, 15, 25, 50, 100 oder 200 Nucleotide, getrennt sein.
Wenn solche Proteine als Immunogen präsentiert werden, lösen sie die Produktion von polyklonalen Antikörpern aus, die spezifisch an ein Prototyp-Polypeptid binden, z. B., aber nicht beschränkt auf, ein Polypeptid, das durch das Polynucleotid von (a) oder (b) oben codiert wird. Im Allgemeinen bindet allerdings ein Protein, das durch ein solches Polypeptid codiert wird, nicht an Antiseren, die gegen das Prototyp-Polypeptid erzeugt wurden, wenn die Antiseren vollständig mit dem Prototyp-Polypeptid immunsorbiert wurden. Verfahren zur Herstellung und zur Untersuchung auf Antikörperbindungsspezifität/affinität sind auf dem Fachgebiet gut bekannt. Beispiele für Immunoassayformate umfassen ELISA, kompetitive Immunoassays, Radioimmunoassays, Western-Blots, indirekte Immunofluoreszenzassays und dergleichen.
In einem bevorzugten Analysenverfahren bzw. Assayverfahren können vollständig immunsorbierte und gepoolte Antiseren, die gegen das Prototyp-Polypeptid hervorgebracht wurden, in einem kompetitiven Bindungsassay verwendet werden, um das Protein zu untersuchen. Die erforderliche Konzentration des Prototyp-Polypeptids zur Inhibierung von 50% der Bindung der Antiseren an das Prototyp-Polypeptid wird bestimmt. Wenn die Menge des Proteins, die erforderlich ist, um Bindung zu inhibieren, weniger als das 2-Fache der Menge des Prototyp-Proteins ist, dann wird gesagt, dass es spezifisch an die auf das Immunogen erzeugten Antiseren bindet. Dementsprechend umfassen die Proteine der vorliegenden Erfindung allelische Varianten, konservativ modifizierte Varianten und geringere rekombinante Modifikationen für ein Prototyp-Polypeptid.
Ein solches Polynucleotid codiert gegebenenfalls ein Protein, das ein Molekulargewicht als das nicht-glycosylierte Protein innerhalb von 20% des Molekulargewichts der nicht-glycosylierten Volllängen-Polypeptide der vorliegenden Erfindung hat. Das Molekulargewicht kann in einfacher Weise durch SDS-PAGE unter reduzierenden Bedingungen bestimmt werden. Vorzugsweise liegt das Molekulargewicht innerhalb 15% eines Volllängen-Polypeptids der vorliegenden Erfindung, bevorzugter innerhalb von 10 oder 5% und am bevorzugtesten innerhalb von 3%, 2% oder 1% eines Volllängen-Polypeptids der vorliegenden Erfindung. Eine Molekulargewichtsbestimmung eines Proteins kann zweckmäßigerweise durch SDS-PAGE unter denaturierenden Bedingungen durchgeführt werden.
Gegebenenfalls werden solche Polynucleotide dieser Ausführungsform ein Protein codieren, das eine spezifische Aktivität von wenigstens 50%, 60%, 80% oder 90% des nativen, endogenen (d. h. nicht-isolierten) Volllängen-Polypeptids der vorliegenden Erfindung hat. Außerdem werden die Proteine, die durch solche Polynucleotide codiert werden, gegebenenfalls eine im Wesentlichen ähnliche Affinitätskonstante (K_m) und/oder katalytische Aktivität (d. h. die mikroskopische Ratenkonstante, k_cat) wie natives endogenes Volllängenprotein haben. Der Fachmann wird erkennen, dass der k_cat/K_m-Wert die Spezifität für kompetitierende Substrate bestimmt, und er wird oft als die Spezifitätskonstante bezeichnet. Solche Proteine können einen k_cat/K_m-Wert von wenigstens 10% desjenigen eines nicht-isolierten Volllängen-Polypeptids der vorliegenden Erfindung, wie er unter Verwendung des endogenen Substrats jenes Polypeptids gemessen wird, haben. Gegebenenfalls wird der k_cat/K_m-Wert wenigstens 20%, 30%, 40%, 50% und am bevorzugtesten wenigstens 60%, 70%, 80%, 90% oder 95% des k_cat/K_m-Werts des nicht-isolierten Volllängen-Polypeptids der vorliegenden Erfindung sein. Eine Bestimmung von k_cat, K_m und k_cat/K_m kann durch eine Reihe von Mitteln, die dem Fachmann gut bekannt sind, erfolgen. Beispielsweise können die Anfangsraten (d. h. die ersten 5% oder weniger der Reaktion) unter Verwendung von schnellen Misch- und Probenahmetechniken (z. B. Techniken des kontinuierlichen Flusses, des gestoppten Flusses oder des raschen Abschreckens), unter Verwendung von Flashphotolyse oder Relaxationsverfahren (z. B. Temperatursprünge) in Verbindung mit solchen beispielhaften Messverfahren, wie Spektralphotometrie, Spektralfluorometrie, kernmagnetische Resonanz oder ra dioaktive Verfahren, bestimmt werden. Kinetische Werte werden zweckdienlicherweise unter Verwendung eines Lineweaver-Burk- oder Eadie-Hofstee-Plots erhalten.
F. Polynucleotide, die zu den Polynucleotiden von (A)–(E) komplementär sind
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf isolierte Nucleinsäuren, die Polynucleotide umfassen, welche zu den Polynucleotiden der Abschnitte A–E oben komplementär sind. Wie der Fachmann erkennen wird, paaren sich Basen komplementärer Sequenzen über die Gesamtheit ihrer Länge mit den Polynucleotiden A–E (d. h. sie haben über ihre gesamte Länge 100% Sequenzidentität). Komplementäre Basen assoziieren durch Wasserstoffbindung in doppelsträngige Nucleinsäuren. Beispielsweise sind die folgenden Basenpaare komplementär: Guanin und Cytosin; Adenin und Thymin; und Adenin und Uracil.
G. Polynucleotide, die Untersequenzen der Polynucleotide von (A)–(F) sind
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf isolierte Nucleinsäuren, welche Polynucleotide umfassen, die wenigstens 15 fortlaufende Basen von den Polynucleotiden von (A) bis (F), wie sie oben diskutiert wurden, umfassen. Die Länge des Polynucleotids wird als ganze Zahl angegeben, die aus der Gruppe, bestehend aus wenigstens 15 bis zu der Länge der Nucleinsäuresequenz, aus welcher das Polynucleotid eine Untersequenz ist, ausgewählt ist. So können z. B. solche Polynucleotide wenigstens 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 75 oder 100 fortlaufende Nucleotide in der Länge aus den Polynucleotiden von (A)–(F) umfassen. Gegebenenfalls kann die Anzahl solcher Untersequenzen eine beliebige ganze Zahl sein, die aus der Gruppe, bestehend aus 1 bis 20, z. B. 2, 3, 4 oder 5, ausgewählt ist. Die Untersequenzen können durch eine beliebige ganze Zahl von Nucleotiden von 1 bis zu der Anzahl der Nucleotide in der Sequenz, z. B. wenigstens 5, 10, 15, 25, 50, 100 oder 200 Nucleotide, getrennt sein. Solche Untersequenzen können strukturelle Charakteristika der Sequenz, aus der sie abgeleitet sind, umfassen. Alternativ können den Untersequenzen bestimmte strukturelle Charakteristika der größeren Sequenz, aus der sie abgeleitet sind, fehlen. Zum Beispiel kann eine Untersequenz aus einem Polynucleotid, die für ein Polypeptid codiert, das wenigstens ein lineares Epitop mit einer Prototyp-Polypeptidsequenz, wie sie in (a) oben bereitgestellt wird, gemeinsam hat, für ein mit der Prototyp-Sequenz gemeinsames Epitop codieren. Alternativ kann die Untersequenz nicht für ein mit der Prototyp-Sequenz gemeinsames Epitop codieren, sondern kann verwendet werden, um die größere Sequenz, z. B. durch Nucleinsäurehybridisierung mit der Sequenz, aus der es stammt, zu isolieren. Untersequenzen können verwendet werden, um eine Genexpression zu modulieren oder zu detektieren, indem in die Untersequenzen Verbindungen eingeführt werden, die an die Nucleinsäuren binden, mit diesen interkalieren, diese spalten und/oder vernetzen. Beispiele für solche Verbindungen umfassen Acridin-, Psoralen-, Phenanthrolin-, Naphthochinon-, Daunomycin- oder Chlorethylaminoaryl-Konjugate.
Konstruktion von Nucleinsäuren
Die isolierten Nucleinsäuren der vorliegenden Erfindung können unter Verwendung von (a) Standard-Rekombinationsverfahren, (b) Synthesetechniken oder Kombinationen davon herge stellt werden. In einigen Ausführungsformen werden die Polynucleotide der vorliegenden Erfindung kloniert, amplifiziert oder in anderer Weise aus einer Monocotyle konstruiert werden. In bevorzugten Ausführungsformen ist die Monocotyle Zea mays.
Die Nucleinsäuren können zweckdienlicherweise Sequenzen zusätzlich zu einem Polynucleotid der vorliegenden Erfindung umfassen. Beispielsweise kann eine Multiklonierungsstelle, die eine oder mehrere Endonuklease-Restriktionsstelle(n) umfasst, in die Nucleinsäure insertiert werden, um eine Isolierung des Polynucleotids zu unterstützen. Es können auch translatierbare Sequenzen insertiert werden, um die Isolierung des translatierten Polynucleotids der vorliegenden Erfindung zu unterstützen. Eine Hexahistidinmarkersequenz stellt z. B. zweckdienliche Mittel bereit, um die Proteine der vorliegenden Erfindung zu reinigen. Ein Polynucleotid der vorliegenden Erfindung kann an einen Vektor, Adapter oder Linker zur Klonierung und/oder Expression eines Polynucleotids der vorliegenden Erfindung gebunden werden. Weitere Sequenzen können an solche Klonierungs- und/oder Expressionssequenzen addiert werden, um ihre Funktion bei einer Klonierung und/oder Expression zu optimieren, eine Isolierung des Polynucleotids zu unterstützen oder die Einführung des Polynucleotids in eine Zelle zu verbessern. Typischerweise ist die Länge einer Nucleinsäure der vorliegenden Erfindung kleiner als die Länge ihres Polynucleotids der vorliegenden Erfindung, ist weniger als 20 Kilobasenpaare, oft weniger als 15 kb und häufig weniger als 10 kb. Eine Verwendung von Klonierungsvektoren, Expressionsvektoren, Adaptern und Linkern ist gut bekannt und auf dem Fachgebiet umfangreich beschrieben. Für eine Beschreibung von verschiedenen Nucleinsäuren siehe z. B. Stratagene Cloning Systems, Kataloge 1995, 1996, 1997 (La Jolla, CA); und Amersham Life Sciences, Inc., Katalog '97 (Arlington Heights, IL).
A. Rekombinante Verfahren zum Konstruieren von Nucleinsäuren
Die isolierten Nucleinsäurezusammensetzungen dieser Erfindung, z. B. RNA, cDNA, genomische DNA oder ein Hybrid davon, können aus biologischen Pflanzenquellen unter Verwendung einer Reihe von Klonierungsmethodologien, die dem Fachmann bekannt sind, erhalten werden. In einigen Ausführungsformen werden Oligonucleotidsonden, die unter stringenten Bedingungen selektiv an die Polynucleotide der vorliegenden Erfindung hybridisieren, verwendet, um die gewünschte Sequenz in einer cDNA- oder genomischen DNA-Bibliothek zu identifizieren. Obgleich eine Isolierung von RNA und die Konstruktion von cDNA und genomischen Bibliotheken dem Fachmann gut bekannt ist, beleuchtet das Folgende einige der verwendeten Verfahren.
A1. mRNA-Isolierung und -Reinigung
Die Gesamt-RNA aus Pflanzenzellen umfasst solche Nucleinsäuren, wie mitochondriale RNA, Chlorplasten-RNA, rRNA, tRNA, hnRNA und mRNA. Eine Gesamt-RNA-Präparation involviert typischerweise die Lyse von Zellen und die Entfernung von Proteinen, gefolgt von einer Präzipitation von Nucleinsäuren. Eine Extraktion von Gesamt-RNA aus Pflanzenzellen kann durch eine Reihe von Mitteln erreicht werden. Häufig umfassen Extraktionspuffer ein starkes Detergens, z. B. SDS, und ein organisches Denaturierungsmittel, z. B. Guanidiniumisothiocyanat, Guanidinhydrochlorid oder Phenol. Nach Gesamt-RNA-Isolierung wird Poly(A)⁺-mRNA typischerweise aus der verbleibenden RNA unter Verwendung von Oligo(dT)Cellulose gereinigt. Beispielhafte Gesamt-RNA- und mRNA-Isolierungsprotokolle sind in Plant Molecular Biology: A Laboratory Manual, Clark, Herausg., Springer-Verlag, Berlin (1997); und Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, et al., Herausg., Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York (1995) beschrieben. Gesamt-RNA- und mRNA-Isolierungskits sind im Handel erhältlich von Lieferanten, z. B. Stratagene (La Jolla, CA), Clonetech (Palo Alto, CA), Pharmacia (Piscataway, NJ) und 5'-3' (Paoli, PA). Siehe auch die U.S. Patente Nr. 5,614,391 und 5,459,253 . Die mRNA kann zu Populationen mit Größenbereichen von etwa 0,5, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5 oder 3,0 kb fraktioniert werden. Die cDNA, die für jede dieser Fraktionen synthetisiert wurde, kann nach Größe so ausgewählt werden, dass sie dieselbe Größe wie ihre mRNA vor Vektorinsertion hat. Dieses Verfahren hilft, trunkierte cDNA zu eliminieren, die durch unvollständig reverse transkribierte mRNA gebildet wurde.
A2. Konstruktion einer cDNA-Bibliothek
Die Konstruktion einer cDNA-Bibliothek zieht im Allgemeinen fünf Schritte mit sich. Erstens, eine Erststrang-cDNA-Synthese wird aus einer Poly(A)⁺-mRNA-Matrize unter Verwendung eines Poly(dT)Primers oder statistischer Hexanucleotide initiiert. Zweitens, das resultierende RNA-DNA-Hybrid wird in doppelsträngige cDNA umgewandelt, typischerweise durch eine Kombination von RNAse H und DNA-Polymerase I (oder Klenow-Fragment). Drittens, die Termini der doppelsträngigen cDNA werden an Adaptoren ligiert. Eine Ligation der Adaptoren wird kohäsive Enden zur Klonierung produzieren. Viertens, eine Größenselektion der doppelsträngigen cDNA eliminiert überschüssige Adaptoren und Primerfragmente und eliminiert partielle cDNA-Moleküle durch Abbau von mRNAs oder Versagen von reverser Transkriptase beim Synthetisieren vollständiger erster Stränge. Fünftens, die cDNAs werden in Klonierungsvektoren ligiert und gepackt. cDNA-Synthese-Protokolle sind dem Fachmann gut bekannt und werden in Standardwerken beschrieben, z. B. in: Plant Molecular Biology: A Laboratory Manual, Clark, Herausg., Springer-Verlag, Berlin (1997); und Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., Herausg., Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York (1995). cDNA-Synthesekits sind von einer Vielzahl kommerzieller Lieferanten, z. B. Stratagene oder Pharmacia, erhältlich.
Es wurde eine Reihe von cDNA-Syntheseprotokollen beschrieben, welche im Wesentlichen reine Volllängen-cDNA-Bibliotheken bereitstellen. Im Wesentlichen reine Volllängen-cDNA-Bibliotheken werden konstruiert, so dass sie wenigstens 90% und bevorzugter wenigstens 93% oder 95% Volllängeninserts unter Klonen, die Inserts enthalten, umfassen. Die Insertlänge in solchen Bibliotheken kann von 0 bis 8, 9, 10, 11, 12, 13 oder mehr Kilobasenpaare sein. Vektoren zum Akkomodieren von Inserts dieser Größen sind auf dem Fachgebiet bekannt und im Handel erhältlich. Siehe z. B. Stratagene's lambda ZAP Express (cDNA-Klonierungsvektor mit 0 bis 12 kb Klonierungskapazität).
Ein beispielhaftes Verfahren zum Konstruieren einer Bibliothek mit mehr als 95% reiner Volllängen-cDNA wird von Carninci et al., Genomics, 37: 327–336 (1996) beschrieben. In diesem Protokoll wird die Cap-Struktur von eukaryotischer mRNA mit Biotin chemisch markiert. Durch Verwendung von Streptavidin-beschichteten magnetischen Perlen werden nur die Volllängen-Erststrang-cDNA/mRNA-Hybride selektiv nach RNase I-Behandlung wiedergewonnen. Das Verfahren stellt eine Bibliothek hoher Ausbeute mit einer zweifelsfreien Repräsentation der Ausgangs-mRNA-Population bereit. Andere Verfahren für die Produktion von Volllängenbibliotheken sind auf dem Fachgebiet bekannt. Siehe z. B. Edery et al., Mol. Cell Biol., 15(6): 3363–3371 (1995); und die PCT-Anmeldung WO 96/34981 .
A3. Normalisierte oder subtrahierte cDNA Bibliotheken
Eine nicht-normalisierte cDNA-Bibliothek stellt die mRNA-Population des Gewebes dar, aus dem sie hergestellt ist. Da einzelne Klone durch Klone, die von hoch exprimierten Genen stammen, ausgemustert werden, kann ihre Isolierung mühsam sein. Eine Normalisierung einer cDNA-Bibliothek ist das Verfahren der Schaffung einer Bibliothek, in der jeder Klon gleichermaßen repräsentiert ist.
Es ist eine Reihe von Ansätzen bekannt, um cDNA-Bibliotheken zu normalisieren. Ein Ansatz basiert auf einer Hybridisierung an genomische DNA. Die Häufigkeit jeder hybridisierten cDNA in der resultierenden normalisierten Bibliothek wäre proportional zu der jedes korrespondierenden Gens in der genomischen DNA. Ein anderer Ansatz basiert auf Kinetik. Wenn ein cDNA-Re-Annealing einer Kinetik zweiter Ordnung folgt, lagern sich seltenere Spezies weniger schnell an und die verbleibende einzelsträngige Fraktion von cDNA wird im Verlauf der Hybridisierung fortschreitend stärker normalisiert. Ein spezifischer Verlust einer cDNA-Spezies tritt ungeachtet ihrer Abundanz bei keinem Cot-Wert auf. Eine Konstruktion von normalisierten Bibliotheken wird beschrieben in: Ko, Nucl. Acids. Res., 18(19): 5705–5711 (1990); Patanjali et al., Proc. Natl. Acad. U.S.A., 88: 1943–1947 (1991); U.S. Patenten 5,482,685 und 5,637,685 . In einem beispielhaften Verfahren, das von Soares et al. beschrieben wurde, resultierte eine Normalisierung in einer Verringerung der Abundanz von Klonen von einem Bereich einer vierstelligen Größenordnung zu einem engen Bereich nur einer Größenordnung. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91: 9228–9232 (1994).
Subtrahierte cDNA-Bibliotheken sind ein anderes Mittel, um den Verhältnisanteil von weniger abundanten cDNA-Spezies zu erhöhen. Bei dieser Vorgehensweise wird cDNA, die aus einem mRNA-Pool hergestellt wurde, durch Hybridisierung an Sequenzen verarmt, die in einem zweiten mRNA-Pool vorliegen. Die cDNA:mRNA-Hybride werden entfernt und der verbleibende unhybridisierte cDNA-Pool wird bezüglich Sequenzen, die in jenem Pool einmal vorhanden sind, angereichert. Siehe Foote et al., in Plant Molecular Biology: A Laboratory Manual, Clark, Herausg., Springer-Verlag, Berlin (1997); Kho und Zarbl, Technique, 3(2): 58–63 (1991); Sive und St. John, Nucl. Acid. Res., 16(22): 10937 (1988); Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., Herausg., Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York (1995); und Swaroop et al., Nucl. Acids Res., 19(8): 1954 (1991). cDNA-Subtraktions-Kits sind im Handel erhältlich. Siehe z. B. PCR-Select (Clontech).
A4. Konstruktion einer genomischen Bibliothek
Um genomische Bibliotheken zu konstruieren, werden große Segmente genomischer DNA durch Randomfragmentierung, z. B. unter Verwendung von Restriktionsendonukleasen, erzeugt und mit Vektor-DNA unter Bildung von Concatemeren, welche in den geeigneten Vektor gepackt werden können, ligiert. Methodologien zur Erreichung dieser Ziele und Sequenzierungsverfahren zur Bestätigung der Sequenz von Nucleinsäuren sind auf dem Fachgebiet bekannt. Beispiele für geeignete molekularbiologische Techniken und Instruktionen, die ausreichend sind, um Fachleute durch viele Konstruktions-, Klonierungs- und Screening-Methodologien zu leiten, werden bei Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory, Bd. 1–3 (1989), Methods in Enzymology, Bd. 152: Guide to Molecular Cloning Techniques, Berger und Kimmel, Herausg., San Diego: Academic Press, Inc. (1987), Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, et al., Herausg., Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York (1995); Plant Molecular Biology: A Laboratory Manual, Clark, Herausg., Springer-Verlag, Berlin (1997) gefunden. Kits zur Konstruktion genomischer Bibliotheken sind ebenfalls im Handel erhältlich.
A5. Nucleinsäure-Screening- und -Isolierungs-Verfahren
Die cDNA- oder die genomische Bibliothek kann unter Verwendung einer Sonde durchgemustert werden, welche auf der Sequenz eines Polynucleotids der vorliegenden Erfindung, z. B. solchen, die hierin offenbart sind, basiert. Sonden können verwendet werden, um mit genomischen DNA- oder cDNA-Sequenzen zu hybridisiersen, um homologene Gene in derselben oder einer unterschiedlichen Pflanzenspezies zu isolieren. Der Fachmann wird erkennen, dass verschiedene Grade der Hybridisierungsstringenz in dem Assay angewendet werden können und ob die Hybridisierung oder das Waschmedium stringent sein können. Wenn die Hybridisierungsbedingungen stringenter werden, muss es einen größeren Komplementaritätsgrad zwischen der Sonde und dem Target geben, damit eine Duplexbildung auftritt. Der Stringenzgrad kann durch Temperatur, Ionenstärke, pH und das Vorliegen eines partiell denaturierenden Lösungsmittels, z. B. Formamid, kontrolliert werden. Beispielsweise wird die Hybridisierungsstringenz zweckmäßigerweise verändert, indem die Polarität der Reaktantenlösung durch Manipulation der Formamidkonzentration innerhalb des Bereichs von 0% bis 50% verändert wird. Der Komplementaritätsgrad (Sequenzidentität), der für eine detektierbare Bindung erforderlich ist, wird entsprechend der Stringenz des Hybridisierungsmediums und/oder Waschmediums variieren. Der Komplementaritätsgrad wird optimal 100% sein; allerdings sollte einzusehen sein, dass geringere Sequenzvariationen in den Sonden und Primern zur Reduzierung der Stringenz des Hybridisierungs- und/oder Waschmediums kompensiert werden können.
Die Nucleinsäuren von Interesse können auch unter Anwendung von Amplifikationstechniken aus Nucleinsäureproben amplifiziert werden. Beispielsweise kann die Polymerase-Ketten- Reaktions(PCR)-Technik eingesetzt werden, um die Sequenzen von Polynucleotiden der vorliegenden Erfindung und verwandten Genen direkt aus genomischen DNA- oder cDNA-Bibliotheken zu amplifizieren. Eine PCR- und andere in vitro-Amplifikationsverfahren können auch einsetzbar sein, um z. B. Nucleinsäuresequenzen, die für zu exprimierende Proteine codieren, zu klonieren, um Nucleinsäuren zur Verwendung als Sonden zum Detektieren des Vorliegens der gewünschten mRNA in Proben, zur Nucleinsäuresequenzierung oder für andere Zwecke herzustellen. Beispiele für Techniken, die ausreichend sind, um einen Fachmann durch in vitro-Amplifikationsverfahren zu leiten, werden in Berger, Sambrook und Ausubel, sowie Mullis et al., U.S. Patent Nr. 4,683,202 (1987); und PCR Protocols A Guide to Methods and Applications, Innis et al., Herausg., Academic Press Inc., San Diego, CA (1990) gefunden. Im Handel erhältliche Kits zur genomischen PCR-Amplifikation sind auf dem Fachgebiet bekannt. Siehe z. B. Advantage-GC Genomic PCR Kit (Clontech). Das T4-Gen-32-Protein (Böhringer Mannheim) kann eingesetzt werden, um die Ausbeute von langen PCR-Produkten zu verbessern.
PCR-basierte Screening-Verfahren wurden ebenfalls beschrieben. Wilfinger et al. beschreiben ein PCR-basiertes Verfahren, bei dem die längste cDNA im ersten Schritt identifiziert wird, so dass unvollständig Klone aus einer Studie eliminiert werden können. BioTechniques, 22(3): 481–486 (1997). In diesem Verfahren wird ein Primerpaar mit einem Primer, der an dem 5'-Ende des Sense-Strangs der gewünschten cDNA anlagert und der andere Primer an dem Vektor anlagert, synthetisiert. Klone werden gepoolt, um ein Screening in großem Maßstab zu ermöglichen. Durch dieses Verfahren wird der längstmögliche Klon unter Kandidatenklonen identifiziert. Außerdem wird das PCR-Produkt allein als ein Diagnostikum für das Vorliegen der gewünschten cDNA verwendet und es wird nicht das PCR-Produkt selbst verwendet. Solche Verfahren sind insbesondere in Kombination mit einer Volllängen-cDNA-Konstruktionsmethodologie wirksam.
B. Syntheseverfahren zum Konstruieren von Nucleinsäuren
Die isolierten Nucleinsäuren der vorliegenden Erfindung können auch durch direkte chemische Synthese nach z. B. den folgenden Verfahren hergestellt werden: das Phosphotriesterverfahren von Narang et al., Meth. Enzymol. 68: 90–99 (1979); das Phosphodiesterverfahren von Brown et al., Meth. Enzymol. 68: 109–151 (1979); das Diethylphosphoramiditverfahren von Beaucage et al., Tetra. Lett. 22: 1859–1862 (1981); das Festphasen-Phosphoramidittriester-Verfahren, das von Beaucage und Caruthers, Tetra. Letts. 22(20): 1859–1862 (1981) beschrieben wurde, z. B. unter Verwendung eines automatischen Synthesizers, z. B. wie er bei Needham-VanDevanter et al., Nucleic Acids Res., 12: 6159–6168 (1984) beschrieben wurde, und das Festphasenverfahren gemäß U.S. Patent Nr. 4,458,066 . Eine chemische Synthese produziert im Allgemeinen ein einzelsträngiges Oligonucleotid. Dieses kann durch Hybridisierung mit einer komplementären Sequenz oder durch Polymerisation mit einer DNA-Polymerase unter Verwendung des Einzelstrangs als Matrize in doppelsträngige DNA umgewandelt werden. Ein Fachmann wird erkennen, dass, da eine chemische Synthese von DNA auf Sequenzen von etwa 100 Basen be schränkt ist, längere Sequenzen durch die Ligation von kürzeren Sequenzen erhalten werden können.
Rekombinante Expressionskassetten
Die vorliegende Erfindung stellt ferner rekombinante Expressionskassetten bereit, die eine Nucleinsäure der vorliegenden Erfindung umfassen. Eine Nucleinsäuresequenz, die für das gewünschte Polynucleotid der vorliegenden Erfindung codiert, z. B. eine cDNA oder eine genomische Sequenz, die für ein Volllängenpolypeptid der vorliegenden Erfindung codiert, kann verwendet werden, um eine rekombinante Expressionskassette zu konstruieren, die in die gewünschte Wirtszelle eingeführt werden kann. Eine rekombinante Expressionskassette wird typischerweise ein Polynucleotid der vorliegenden Erfindung funktionell verknüpft mit Transkriptionsinitiationsregulatorsequenzen umfassen, welche die Transkription des Polynucleotids in der vorgesehenen Wirtszelle, z. B. Geweben einer transformierten Pflanze, steuern werden.
Pflanzenexpressionsvektoren können z. B. umfassen: (1) ein kloniertes Pflanzengen unter der Transkriptionskontrolle von 5'- und 3'-regulatorischen Sequenzen bzw. Regulatorsequenzen und (2) einen dominanten selektierbaren Marker. Solche Pflanzenexpressionsvektoren können, wenn dies gewünscht wird, auch eine Promotor-regulatorische Region (z. B. eine, die induzierbare oder konstitutive, Umwelt- oder Entwicklungs-regulierte oder Zell- oder Gewebe-spezifische/selektive Expression verleiht), eine Transkriptionsinitiationsstartstelle, eine Ribosomenbindungsstelle, ein RNA-Prozessierungssignal, eine Transkriptionsterminationsstelle und/oder ein Polyadenylierungssignal enthalten.
Es kann ein Pflanzenpromotorfragment verwendet werden, welches die Expression eines Polynucleotids der vorliegenden Erfindung in allen Geweben einer regenerierten Pflanze steuern wird. Solche Promotoren werden hierin als „konstitutive" Promotoren bezeichnet und sind unter den meisten Umweltbedingungen und Zuständen der Entwicklung oder Zelldifferenzierung aktiv. Beispiele für konstitutive Promotoren umfassen die Blumenkohlmosaikvirus(CaMV)-35S-Transkriptionsinitiationsregion, den 1'- oder 2'-Promotor, der aus T-DNA von Agrobacterium tumefaciens abgeleitet ist, den Ubiquitin-1-Promotor, den Smas-Promotor, den Cinnamylalkoholdehydrogenasepromotor ( U.S. Patent Nr. 5,683,439 ), den Nos-Promotor, den pEMu-Promotor, den Rubisco-Promotor, den GRP1-8-Promotor, den Actinpromotor, den F3.7-Promotor und andere Transkriptionsinitiationsregionen aus verschiedenen Pflanzengenen, die einem Fachmann bekannt sind.
Alternativ kann der Pflanzenpromotor eine Expression eines Polynucleotids der vorliegenden Erfindung in einem spezifischen Gewebe steuern oder kann in anderer Weise unter genauerer Umwelt- oder Entwicklungskontrolle sein. Solche Promotoren werden hier als „induzierbare" Promotoren bezeichnet. Umweltbedingungen, die eine Transkription durch induzierbare Promotoren bewirken können, umfassen Angriff durch Pathogene, anaerobe Bedingungen oder das Vorliegen von Licht. Beispiele für induzierbare Promotoren sind der Adh1-Promotor, der durch Hypoxie oder Kältestress induzierbar ist, den Hsp70-Promotor, der durch Hitzestress induzierbar ist, und der PPDK-Promotor, der durch Licht induzierbar ist.
Beispiele für Promotoren unter Entwicklungskontrolle umfassen Promotoren, die eine Transkription nur oder vorzugsweise in bestimmten Geweben, z. B. Blättern, Wurzeln, Früchten, Samen oder Blüten, initiieren. Das Wirken eines Promotors kann auch in Abhängigkeit von seiner Lage im Genom variieren. So kann ein induzierbarer Promotor in bestimmten Orten vollständig oder partiell konstitutiv werden.
Sowohl heterologe als auch nicht-heterologe (d. h. endogene) Promotoren können verwendet werden, um eine Expression der Nucleinsäuren der vorliegenden Erfindung zu steuern. Diese Promotoren können zum Beispiel auch in rekombinanten Expressionskassetten verwendet werden, um eine Expression von Antisense-Nucleinsäuren zu steuern, um die Konzentration und/oder die Zusammensetzung der Proteine der vorliegenden Erfindung in einem gewünschten Gewebe zu reduzieren, zu erhöhen oder zu verändern. So wird das Nucleinsäurekonstrukt in einigen Ausführungsformen einen Promotor, der in einer Pflanzenzelle, z. B. in Zea mays, funktionell ist, funktionell mit einem Polynucleotid der vorliegenden Erfindung verknüpft, umfassen. Promotoren, die in diesen Ausführungsformen einsetzbar sind, umfassen die endogenen Promotoren, die eine Expression eines Polypeptids der vorliegenden Erfindung steuern.
In einigen Ausführungsformen können isolierte Nucleinsäuren, die als Promotor- oder Enhancer-Elemente dienen, in die geeignete Position (im Allgemeinen stromaufwärts) einer nicht-heterologen Form eines Polynucleotids der vorliegenden Erfindung eingeführt werden, um so die Expression eines Polynucleotids der vorliegenden Erfindung nach oben oder nach unten zu regulieren. Zum Beispiel können endogene Promotoren in vivo durch Mutation, Deletion und/oder Substitution verändert werden (siehe Kmiec, U.S. Patent 5,565,350 ; Zarling et al., PCT/US93/03868 ) oder isolierte Promotoren können in der geeigneten Orientierung und im geeigneten Abstand von einem Gen der vorliegenden Erfindung in eine Pflanzezelle eingeführt werden, um so die Expression des Gens zu kontrollieren. Eine Genexpression kann unter Bedingungen, die für ein Pflanzenwachstum geeignet sind, moduliert werden, um so die Gesamtkonzentration und/oder die Zusammensetzung der Polypeptide der vorliegenden Erfindung in einer Pflanzenzelle zu verändern. Demnach stellt die vorliegende Erfindung Zusammensetzungen und Verfahren zur Herstellung von heterologen Promotoren und/oder Enhancern bereit, die funktionell an eine native, endogene (d. h. nicht-heterologe) Form eines Polynucleotids der vorliegenden Erfindung gebunden sind.
Methoden zur Identifizierung von Promotoren mit einem besonderen Expressionsmuster bezüglich z. B. Gewebetyp, Zelltyp, Entwicklungsstufe und/oder Umweltbedingungen sind auf dem Fachgebiet gut bekannt. Siehe z. B. The Maize Handbook, Kapitel 114–115, Freeling und Walbot, Herausg., Springer, New York (1994); Corn and Corn Improvement, 3. Ausgabe, Kapitel 6, Sprague and Dudley, Herausg., American Society of Agronomy, Madison, Wisconsin (1988). Ein typischer Schritt bei den Promotorisolierungsverfahren ist die Identifizierung von Genprodukten, die mit einem gewissen Spezifitätsgrad im Targetgewebe exprimiert werden. In dem Bereich von Methodologien sind: differentielle Hybridisierung an cDNA-Bibliotheken; subtraktive Hybridisierung; differentieller Display; differentielle 2-D-Proteingelelektrophorese; DNA-Sondenarrays; und Isolierung von Proteinen, von denen bekannt ist, dass sie mit gewisser Spezifität im Targetgewebe exprimiert werden. Solche Verfahren sind dem Fachmann gut bekannt. Im Handel verfügbare Produkte zu Identifizierung von Promotoren sind auf dem Fachgebiet bekannt, z. B. Clontech's (Palo Alto, CA) Universal Genome Walker Kit.
Für die Protein-basierten Verfahren ist es hilfreich, die Aminosäuresequenz für wenigstens einen Teil des identifizierten Proteins zu erhalten und dann die Proteinsequenz als die Basis zur Herstellung einer Nucleinsäure zu verwenden, die als Sonde verwendet werden kann, um entweder genomische DNA direkt oder vorzugsweise einen cDNA-Klon aus einer Bibliothek, die aus dem Targetgewebe hergestellt wurde, zu identifizieren. Sobald ein solcher cDNA-Klon identifiziert wurde, kann die Sequenz verwendet werden, um die Sequenz am 5'-Ende des Transkripts des angegebenen Gens zu identifizieren. Für eine differentielle Hybridisierung, eine subtraktive Hybridisierung und einen differentiellen Display wird die identifizierte Nucleinsäure, wie sie im Targetgewebe angereichert ist, verwendet, um die Sequenz am 5'-Ende des Transkripts des angegebenen Gens zu identifizieren. Sobald solche Sequenzen ausgehend entweder von Proteinsequenzen oder Nucleinsäuresequenzen identifiziert sind, kann eine beliebige dieser identifizierten Sequenzen, die aus dem Gentranskript ist, verwendet werden, um eine genomische Bibliothek, die aus dem Targetorganismus hergestellt wurde, durchzumustern. Verfahren zur Identifizierung und Bestätigung der Transkriptionsstartstelle sind auf dem Fachgebiet gut bekannt.
In dem Verfahren zur Isolierung von Promotoren, die unter bestimmten Umweltbedingungen oder bestimmtem Umweltstress oder in spezifischen Geweben oder in bestimmten Entwicklungsstufen exprimiert werden, wird eine Reihe von Genen identifiziert, die unter den gewünschten Umständen, in dem gewünschten Gewebe oder in der gewünschten Stufe exprimiert werden. Eine weitere Analyse wird eine Expression jedes bestimmten Gens in einem anderen Gewebe oder in mehreren anderen Geweben der Pflanze zeigen. Man kann einen Promotor mit Aktivität in dem gewünschten Gewebe oder bei dem gewünschten Zustand identifizieren, jedoch hat dieser keine Aktivität in irgendeinem anderen allgemeinen Gewebe.
Um die Promotorsequenz zu identifizieren, werden die 5'-Teile der hier beschriebenen Klone auf Sequenzen analysiert, die für Promotorsequenzen charakteristisch sind. Beispielsweise umfassen Promotorsequenzelemente, die TATA-Box-Konsensus-Sequenz (TATAAT), die üblicherweise ein AT-reicher Abschnitt aus 5–10 bp ist, der etwa 20 bis 40 Basenpaare stromaufwärts der Transkriptionsstartstelle lokalisiert ist. Die Identifizierung der TATA-Box ist auf dem Fachgebiet gut bekannt. Ein Weg, um den Ort dieses Elements vorauszusagen, besteht z. B. in der Identifizierung der Transkriptionsstartstelle unter Verwendung von Standard-RNA-Kartierungstechniken, z. B. Primerextension, S1-Analyse und/oder RNase-Schutz. Um das Vorliegen der AT-reichen Sequenz zu bestätigen, kann eine Struktur-Funktions-Analyse durchge führt werden, welche eine Mutagenese der vermeintlichen Region und eine quantitative Bestimmung der Mutationswirkung auf die Expression eines verknüpften stromabwärts gelegenen Reportergens involviert. Siehe z. B. The Maize Handbook, Kapitel 114, Freeling und Walbot, Herausg., Springer, New York, (1994).
In Pflanzen gibt es außerdem weiter stromaufwärts von der TATA-Box in den Positionen –80 bis –100 typischerweise ein Promotorelement (d. h. die CAAT-Box) mit einer Reihe von Adeninen, die das Trinucleotid G (oder T) N G umgeben. J. Messing et al., in Genetic Engineering in Plants, Kosage, Meredith und Hollaender, Herausg., S. 221–227 (1983). In Mais gibt es keine gut konservierte CAAT-Box, aber es gibt einige kurze, konservierte Protein-Bindungsmotive stromaufwärts der TATA-Box. Diese umfassen Motive für die trans-wirkenden Transkriptionsfaktoren, die bei der Lichtregulation, bei der anaeroben Induktion, der hormonalen Regulierung oder der Anthocyanin-Biosynthese, wie es für jedes Gen passend ist, involviert sind.
Sobald Promotor- und/oder Gensequenzen bekannt sind, wird eine Region geeigneter Größe aus der genomischen DNA ausgewählt, welche 5' zum Transkriptionsstart oder der Translationsstartstelle ist, und solche Sequenzen werden dann mit einer codierenden Sequenz verknüpft. Wenn die Transkriptionsstartstelle als der Fusionspunkt verwendet wird, kann eine beliebige einer Reihe von möglichen 5'-untranslatierten Regionen zwischen der Transkriptionsstartstelle und der partiellen codierenden Sequenz verwendet werden. Wenn die Translationsstartstelle am 3'-Ende des spezifischen Promotors verwendet wird, dann wird sie direkt mit dem Methionin-Startcodon einer codierenden Sequenz verknüpft.
Wenn eine Polypeptidexpression gewünscht wird, ist sie im Allgemeinen wünschenswert, um eine Polyadenylierungsregion am 3'-Ende einer codierenden Polynucleotidregion einzuschließen. Die Polyadenylierungsregion kann aus dem natürlichen Gen, aus einer Vielzahl anderer Pflanzengene oder aus T-DNA stammen. Die 3'-Endsequenz, die zu addieren ist, kann zum Beispiel aus den Nopalinsynthase- oder Ocotpinsynthase-Genen stammen oder kann alternativ aus einem anderen Pflanzengen oder weniger bevorzugt aus einem anderen eukaryotischen Gen stammen.
Eine Intronsequenz kann an die 5'-untranslatierte Region oder die codierende Sequenz der partiellen codierenden Sequenz addiert werden, um die Menge der reifen Message zu erhöhen, die im Cytosol akkumuliert. Der Einschluss eines spleißbaren Introns in die Transkriptionseinheit sowohl in Pflanzen- als auch Tierexpressionskonstrukten führt erwiesenermaßen zur Erhöhung der Genexpression sowohl auf dem mRNA- als auch dem Protein-Level bis zum 1000-fachen. Buchman und Berg, Mol. Cell Biol. 8: 4395–4405 (1988); Callis et al., Genes Dev. 1: 1183–1200 (1987). Eine solche Intronverstärkung der Genexpression ist typischerweise am größten, wenn die Platzierung nahe dem 5'-Ende der Transkriptionseinheit ist. Eine Verwendung von Maisintrons, des Adh1-S-Introns 1, 2 und 6, des Bronze-1-Introns, ist auf dem Fachgebiet bekannt. Siehe allgemein The Maize Handbook, Kapitel 116, Freeling und Walbot, Herausg. Springer, New York (1994).
Der Vektor, der die Sequenzen aus einem Polynucleotid der vorliegenden Erfindung umfasst, wird typischerweise ein Markergen umfassen, welches einen selektierbaren Phänotyp an Pflanzenzellen verleiht. Üblicherweise wird das selektierbare Markergen für Antibiotikaresistenz codieren, wobei geeignete Gene Gene umfassen, die für Resistenz gegen das Antibiotikum Spectinomycin codieren (z. B. das aada-Gen), das Streptomycinphosphotransferase(SPT)-Gen, das für Streptomycinresistenz codiert, das Neomycinphosphotransferase(NPTII)-Gen, das für Kanamycin- oder Geniticinresistenz codiert, das Hygromycinphosphotransferase(HPT)-Gen, das für Hygromycinresistenz codiert, Gene, die für Resistenz gegenüber Herbiziden, welche unter Inhibierung der Wirkung von Acetolactatsynthase (ALS) wirken, insbesondere die Herbizide vom Sulfonylharnstofftyp (z. B. das Acetolactatsynthase(ALS)-Gen, das Mutationen enthält, die zu einer solchen Resistenz führen, insbesondere die S4- und/oder Hra-Mutationen), codieren, Gene, die für Resistenz gegen Herbizide codieren, welche unter Inhibierung der Wirkung von Glutaminsynthase wirken, z. B. Phosphinotricin oder Basta (z. B. das bar-Gen), oder andere derartige Gene, die auf dem Fachgebiet bekannt sind. Das bar-Gen codiert für Resistenz gegen das Herbizid Basta, das nptII-Gen codiert für Resistenz gegen die Antibiotika Kanamycin und Geniticin und das ALS-Gen codiert für Resistenz gegen das Herbizid Chlorsulforon.
Typische Vektoren, die für die Expression von Genen in höheren Pflanzen verwendbar sind, sind auf dem Fachgebiet gut bekannt und umfassen Vektoren, die von dem Tumor-induzierenden (Ti)-Plasmid von Agrobacterium tumefaciens abgeleitet sind, die von Rogers et al., Meth. In Enzymol., 153: 253–277 (1987) beschrieben wurden. Diese Vektoren sind in Pflanzen-integrierende Vektoren derart, dass die Vektoren bei Transformation einen Teil der Vektor-DNA in das Genom der Wirtspflanze integrieren. Beispiele für A. tumefaciens-Vektoren, die hier verwendbar sind, sind die Plasmide pKYLX6 und pKYLX7 von Schardl et al., Gene, 61: 1–11 (1987) und Berger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 8402–8406 (1989). Ein anderer hier verwendbarer Vektor ist das Plasmid pBI101.2, der von Clontech Laboratories, Inc. (Palo Alto, CA) verfügbar ist.
Ein Polynucleotid der vorliegenden Erfindung kann entweder in Sense- oder Antisense-Orientierung, wie es gewünscht ist, exprimiert werden. Es wird einzusehen sein, dass die Kontrolle der Genexpression entweder in Sense- oder Antisense-Orientierung einen direkten Einfluss auf die beobachtbaren Pflanzencharakteristika haben kann. Antisense-Technologie kann zweckmäßigerweise zur Genexpression in Pflanzen verwendet werden. Um dies zu erreichen, wird ein Nucleinsäuresegment aus dem gewünschten Gen kloniert und funktionell mit einem Promotor verknüpft, so dass der Antisense-Strang von RNA transkribiert werden wird. Das Konstrukt wird dann in Pflanzen transformiert und der Antisense-Strang von RNA wird produziert. Es wurde gezeigt, dass in Pflanzenzellen Antisense-RNA eine Genexpression inhibiert, indem sie die Akkumulation von mRNA verhindert, welche für das Enzym von Interesse codiert, siehe z. B. Sheehy et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. (USA) 85: 8805–8809 (1988); und Hiatt et al., U.S Patent Nr. 4,801,340 .
Ein anderes Suppressionsverfahren ist Sense-Suppression. Die Einführung von Nucleinsäure, die in der Sense-Orientierung konfiguriert ist, erwies sich als wirksames Mittel, durch welches die Transkription von Targetgenen blockiert wird. Für ein Beispiel der Verwendung dieses Verfahrens, um eine Expression von endogenen Genen zu exprimieren, siehe Napoli et al., The Plant Cell 2: 279–289 (1990) und U.S Patent Nr. 5,034,323 .
Es können auch katalytische RNA-Moleküle oder Ribozyme verwendet werden, um eine Expression von Pflanzengenen zu inhibieren. Es ist möglich, Ribozyme zu entwickeln, die sich spezifisch mit tatsächlich einer beliebigen Target-RNA paaren und die Phosphodiesterhauptkette an einer spezifischen Stelle spalten, wodurch die Target-RNA funktionell inaktiviert wird. Bei der Durchführung dieser Spaltung wird das Ribozym nicht selbst verändert und ist somit zum Recycling und Spalten anderer Moleküle fähig, was es zu einem echten Enzym macht. Der Einschluss von Ribozymsequenzen in Antisense-RNAs verleiht diesen RNA-Spaltungsaktivität, wodurch die Aktivität der Konstrukte erhöht wird. Die Entwicklung und die Verwendung von Target-RNA-spezifischen Ribozymen wird bei Haseloff et al., Nature 334: 585–591 (1988) beschrieben.
Es kann eine Vielzahl von Vernetzungsmitteln, Alkylierungsmitteln und Radikale-erzeugenden Spezies als vorstehende Gruppen an Polynucleotiden der vorliegenden Erfindung verwendet werden, um Nucleinsäuren zu binden, zu markieren, zu detektieren und/oder zu spalten. Beispielsweise beschreiben Vlassov, V. V., et al., Nucleic Acids Res (1986) 14: 4065–4076 die kovalente Bindung eines einzelsträngigen DNA-Fragments mit alkylierenden Derivaten von Nucleotiden, die zu Targetsequenzen komplementär sind. Ein Bericht über eine ähnliche Arbeit derselben Gruppe ist der von Knorre, D. G., et al., Biochimie (1985) 67: 785–789. Iverson und Dervan zeigten auch eine Sequenz-spezifische Spaltung von einzelsträngiger DNA, vermittelt durch Einbau eines modifizierten Nucleotids, welches fähig war, eine Spaltung zu aktivieren (J Am Chem Soc (1987) 109: 1241–1243). Meyer, R. B., et al., J Am Chem Soc (1989) 111: 8517–8519 bewirkten eine kovalente Vernetzung an ein Targetnucleotid unter Verwendung eines Alkylierungsmittels, das komplementär zu der einzelsträngigen Targetnucleotidsequenz war. Eine photoaktivierte Vernetzung an einzelsträngige Oligonucleotide, vermittelt durch Psoralen, wurde von Lee, B. L., et al., Biochemistry (1988) 27: 3197–3203 offenbart. Die Verwendung einer Vernetzung in Tripelhelix-bildenden Sonden wurde auch von Home, et al., J Am Chem Soc (1990) 112: 2435–2437 offenbart. Eine Verwendung von N4, N4-Ethanocytosin als Alkylierungsmittel zur Vernetzung an einzelsträngige Oligonucleotide wurde auch von Webb und Matteucci, J Am Chem Soc (1986) 108: 2764–2765; Nucleic Acids Res (1986) 14: 7661–7674; Feteritz et al., J. Am. Chem. Soc. 113: 4000 (1991) beschrieben. Auf dem Fachgebiet sind verschiedene Verbindungen bekannt, um Nucleinsäuren zu binden, zu detektieren, zu markieren und/oder zu spalten. Siehe z. B. die U.S.-Patente Nrn. 5,543,507 ; 5,672,593 ; 5,484,908 ; 5,256,648 ; und 5,681,941 .
Die Erfindung stellt ein isoliertes Protein bereit, das Cellulosesynthaseaktivität hat und ausgewählt ist aus:

Wie der Fachmann erkennen wird, umfasst die vorliegende Erfindung katalytisch aktive Polypeptide der vorliegenden Erfindung (d. h. Enzyme). Katalytisch aktive Polypeptide haben eine spezifische Aktivität von wenigstens 20%, 30% oder 40% und vorzugsweise wenigstens 50%, 60% oder 70% und am bevorzugtesten wenigstens 80%, 90% oder 95% der des nativen (nicht-synthetischen) endogenen Polypeptids. Darüber hinaus ist die Substratspezifität (k_cat/K_m) gegebenenfalls im Wesentlichen ähnlich der des nativen (nicht-synthetischen), endogenen Polypeptids. Typischerweise wird die K_m wenigstens 30%, 40% oder 50% derjenigen des nativen (nicht-synthetischen), endogenen Polypeptids sein und bevorzugter wenigstens 60%, 70%, 80% oder 90% sein. Verfahren zur Analyse und quantitativen Messung der enzymatischen Aktivität und der Substratspezifität (k_cat/K_m) sind dem Fachmann gut bekannt.
Im Allgemeinen werden die Proteine der vorliegenden Erfindung, wenn sie als ein Immunogen präsentiert werden, die Produktion eines Antikörpers auslösen, der spezifisch reaktiv auf ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung ist. Ferner werden die Proteine der vorliegenden Erfindung nicht an Antiserum binden, das gegen ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung erzeugt wurde, welches mit demselben Polypeptid vollständig immunsorbiert wurde. Immunoassays zur Bestimmung der Bindung sind dem Fachmann gut bekannt. Ein bevorzugter Immunoassay ist ein kompetitiver Immunoassay, wie er unten diskutiert wird. Somit können die Proteine der vorliegenden Erfindung als Immunogene zur Konstruktion von Antikörpern verwendet werden, welche gegen ein Protein der vorliegenden Erfindung immunreaktiv sind, und zwar für solche beispielhaften Verwendbarkeiten, wie Immunoassays oder Proteinreinigungstechniken.
Expression von Proteinen in Wirtszellen
Unter Verwendung der Nucleinsäuren der vorliegenden Erfindung kann man ein Protein der vorliegenden Erfindung in einer rekombinant gentechnisch manipulierten Zelle, z. B. Bakterien-, Hefe-, Insekten-, Säuger- oder vorzugsweise Pflanzenzellen, exprimieren. Die Zellen produzieren das Protein in einem nicht-natürlichen Zustand (z. B. bezüglich Menge, Zusammensetzung, Ort und/oder Zeit), da sie durch menschlichen Eingriff, um dies zu erreichen, gentechnisch verändert wurden.
Es wird davon ausgegangen, dass dem Fachmann zahlreiche Expressionssysteme geläufig sind, die zur Expression einer Nucleinsäure, die für ein Protein der vorliegenden Erfindung codiert, verfügbar sind. Es wird kein Versuch unternommen, die verschiedenen Verfahren, die für die Expression von Proteinen in Prokaryoten oder Eukaryoten bekannt sind, zu beschreiben.
Kurz zusammengefasst, die Expression von isolierten Nucleinsäuren, die für ein Protein der vorliegenden Erfindung codieren, wird typischerweise erreicht, indem z. B. die DNA oder cDNA an einen Promotor (der entweder konstitutiv oder induzierbar ist) funktionell verknüpft wird, gefolgt vom Einbau in einen Expressionsvektor. Die Vektoren können zur Replikation und Integration entweder in Prokaryoten oder Eukaryoten geeignet sein. Typische Expressionsvekto ren enthalten Transkriptions- und Translationsterminatoren, Initiationssequenzen und Promotoren, die für eine Regulation der Expression der DNA, die für ein Protein der vorliegenden Erfindung codiert, verwendbar sind. Um hohe Expressionslevel eines klonierten Gens zu erhalten, ist es wünschenswert, Expressionsvektoren zu konstruieren, die mindestens einen starken Promotor zur Steuerung der Transkription, eine Ribosomenbindungsstelle zur Translationsinitiation und einen Transkriptions/Translationsterminator enthalten. Ein Fachmann wird erkennen, dass Modifikationen an einem Protein der vorliegenden Erfindung durchgeführt werden können, ohne seine biologische Aktivität zu vermindern. Einige Modifikationen können durchgeführt werden, um die Klonierung, Expression oder den Einbau des Targetingmoleküls in ein Fusionsprotein zu erleichtern. Solche Modifikationen sind dem Fachmann gut bekannt und umfassen z. B. ein Methionin, das an den Aminoterminus addiert wird, um eine Initiationsstelle bereitzustellen, oder zusätzliche Aminosäuren (z. B. Poly-His), die an einem Terminus platziert sind, um zweckdienlich lokalisierte Reinigungssequenzen zu schaffen. Es können auch Restriktionsstellen oder Terminationscodons eingeführt werden.
A. Expression in Prokaryoten
Prokaryotische Zellen können als Wirte zur Expression verwendet werden. Prokaryoten werden am häufigsten durch verschiedene Stämme von E. coli repräsentiert; allerdings können auch andere mikrobielle Stämme verwendet werden. Üblicherweise verwendete prokaryotische Kontrollsequenzen, welche hierin so definiert sind, dass sie Promotoren zur Transkriptionsinitiation, gegebenenfalls mit einem Operator, zusammen mit Ribosomenbindungsstellensequenzen umfassen, umfassen solche üblicherweise verwendeten Promotoren, wie die beta-Lactamase (Penicillinase)- und Lactose (lac)-Promotorsysteme (Chang et al., Nature 198: 1056 (1977)), das Trypotphan (trp)-Promotorsystem (Goeddel et al., Nucleic Acids Res. 8: 4057 (1980)) und den von lambda stammenden P-L-Promotor und die N-Gen-Ribosomenbindungsstelle (Schimatake et al., Nature 292: 128 (1981)). Der Einschluss von Selektionsmarkern in DNA-Vektoren, die in E. coli transfiziert sind, ist ebenfalls verwendbar. Beispiele für solche Marker umfassen Gene, die Resistenz gegen Ampicillin, Tetracyclin oder Chloramphenicol spezifizieren.
Der Vektor wird so gewählt, dass er eine Einführung in die geeignete Wirtszelle erlaubt. Bakterielle Vektoren stammen typischerweise aus Plasmid oder Phage. Geeignete Bakterienzellen werden mit Phage-Vektor-Partikel infiziert oder mit nackter Phagen-Vektor-DNA transfiziert. Wenn ein Plasmivektor verwendet wird, werden die Bakterienzellen mit der Plasmidvektor-DNA transfiziert. Expressionssysteme zum Exprimieren eines Proteins der vorliegenden Erfindung sind unter Verwendung von Bacillus sp. und Salmonella (Palva, et al., Gene 22: 229–235 (1983); Mosbach, et al., Nature 302: 543–545 (1983)), verfügbar.
B. Expression in Eukaryoten
Eine Vielfalt von eukaryotischen Expressionssystemen, z. B. Hefe, Insektenzelllinien, Pflanzen- und Säugerzellen, ist dem Fachmann bekannt. Wie kurz unten erläutert wurde, kann eine Sequenz der vorliegenden Erfindung in diesen eukaryotischen Systemen exprimiert werden. In einigen Ausführungsformen werden transformierte/transfizierte Pflanzenzellen, wie sie unten diskutiert wurden, als Expressionssysteme zur Produktion der Proteine der vorliegenden Erfindung verwendet.
Eine Synthese von heterologen Proteinen in Hefe ist gut bekannt. Sherman, F., et al., Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory (1982) ist eine gut bekannte Arbeit, die die verschiedenen Verfahren beschreibt, die zur Herstellung des Proteins in Hefe verfügbar sind. Zwei umfangreich verwendete Hefen zur Produktion von eukaryotischen Proteinen sind Saccharomyces cervisisiae und Pichia pastoris. Vektoren, Stämme und Protokolle zur Expression in Saccharomyces und Pichia sind auf dem Fachgebiet bekannt und von kommerziellen Lieferanen (z. B. Invitrogen) verfügbar. Geeignete Vektoren haben üblicherweise Expressionskontrollsequenzen, z. B. Promotoren, einschließlich 3-Phosphoglyceratkinase oder Alkoholoxidase, und einen Replikationsursprung, Terminierungssequenzen und dergleichen, wenn es gewünscht ist.
Ein Protein der vorliegenden Erfindung kann, sobald es exprimiert ist, aus Hefe isoliert werden, indem die Zellen lysiert werden und Standardprotein-Isolierungstechniken auf die Lysate angewendet werden. Die Überwachung des Reinigungsprozesses kann unter Verwendung von Western-Blot-Techniken oder Radioimmunoassay oder anderen Standard-Immunoassaytechniken erreicht werden.
Die Sequenzen, die Proteine der vorliegenden Erfindung codieren, können zur Verwendung beim Transfizieren von Zellkulturen von zum Beispiel Säuger-, Insekten- oder Pflanzenherkunft an verschiedene Expressionsvektoren ligiert werden. Beispiele für Zellkulturen, die für die Produktion der Peptide einsetzbar sind, sind Säugerzellen. Säugerzellsysteme werden oft in der Form von Zellmonolayern sein, obgleich auch Säugerzellsuspensionen verwendet werden können. Eine Reihe geeigneter Wirtszelllinien, die fähig sind, intakte Proteine zu exprimieren, wurden auf dem Fachgebiet entwickelt und umfassen die HEK293-, BHK21- und CHO-Zelllinien. Expressionsvektoren für diese Zellen können Expressionskontrollsequenzen umfassen, z. B. einen Replikationsursprung, einen Promotor (z. B. den CMV-Promotor, einen HSV-tk-Promotor, oder pgk (Phosphoglyceratkinase)-Promotor, einen Enhancer (Queen et al., Immunol. Rev. 89: 49 (1986)) und notwendige Prozessierungsinformationsstellen, z. B. Ribosomenbindungsstellen, RNA-Spleißstellen, Polyadenylierungsstellen (z. B. eine SV40-large T Ag-Poly-A-Additionsstelle) und Transkriptionsterminatorsequenzen. Andere Tierzellen, die zur Produktion von Proteinen der vorliegenden Erfindung nützlich sind, sind zum Beispiel von der American Type Culture Collection Catalogue of Cell Lines and Hybridomas (7. Ausgabe, 1992) erhältlich.
Geeignete Vektoren zum Exprimieren von Proteinen der vorliegenden Erfindung in Insektenzellen stammen üblicherweise aus dem SF9-Baculovirus. Geeignete Insektenzelllinien umfassen Mosquitolarven-, Seidenwurm-, Heerwurm-, Motten- und Drosophila-Zelllinien, zum Beispiel eine Schneider-Zelllinie (Siehe Schneider, J. Embryol. Exp. Morphol. 27: 353–365 (1987)).
Wenn höhere Tier- oder Pflanzen-Wirtszellen verwendet werden, werden typischerweise wie bei Hefe Polyadenylierungs- oder Transkriptionsterminatorsequenzen in den Vektor einge baut. Ein Beispiel für eine Terminatorsequenz ist die Polyadenylierungssequenz aus dem Rinderwachstumshormongen. Sequenzen für ein akurates Spleißen des Transkripts können ebenfalls enthalten sein. Ein Beispiel für eine Spleißsequenz ist das VP1-Intron aus SV40 (Sprague, et al., J. Virol. 45: 773–781 (1983)). Zusätzlich können Gensequenzen zur Kontrolle einer Replikation in der Wirtszelle in den Vektor eingearbeitet werden, z. B. die, die in Vektoren des Rinderpapillomavirus-Typs gefunden werden. Saveria-Campo, M., Bovine Papilloma Virus DNA a Eukaryotic Cloning Vektor in DNA Cloning Bd. II a Practical Approach, D. M Glover, Herausg.; IRL Press, Arlington, Virginia S. 213–238 (1985).
Transfektion/Transformation von Zellen
Das Verfahren der Transformation/Transfektion ist für die vorliegende Erfindung nicht kritisch. Derzeit sind verschiedene Verfahren zur Transformation oder Transfektion verfügbar. Wenn neuere Verfahren zum Transformieren von Nutzpflanzen oder anderen Wirtszellen verfügbar sind, können sie direkt angewendet werden. Dementsprechend wurde eine weite Vielzahl von Verfahren entwickelt, um eine DNA-Sequenz in das Genom einer Wirtszelle zu insertieren, um die Transkription und/oder Translation der Sequenz zu erzielen, um phänotypische Veränderungen in dem Organismus durchzuführen. Auf diese Weise kann ein beliebiges Verfahren, das für eine effiziente Transformation/Transfektion sorgt, eingesetzt werden.
A. Pflanzentransformation
Eine DNA-Sequenz, die das gewünschte Polynucleotid der vorliegenden Erfindung codiert, zum Beispiel eine cDNA oder eine genomische Sequenz, die für ein Volllängenprotein codiert, wird verwendet werden, um eine rekombinante Expressionskassette zu konstruieren, welche in die gewünschte Pflanze eingeführt werden kann.
Isolierte Nucleinsäuren der vorliegenden Erfindung können nach Techniken, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, in Pflanzen eingeführt werden. Im Allgemeinen werden rekombinante Expressionskassetten, wie sie oben beschrieben wurden und die zur Transformation von Pflanzenzellen geeignet sind, hergestellt. Techniken zum Transformieren einer weiten Vielzahl von höheren Pflanzenspezies sind gut bekannt und in der technischen, wissenschaftlichen und Patentliteratur beschrieben. Siehe zum Beispiel Weising et al., Ann. Rev. Genet. 22: 421–477 (1988). Zum Beispiel kann das DNA-Konstrukt direkt in die genomische DNA der Pflanzenzelle eingeführt werden, indem Techniken wie z. B. Elektroporation, PEG-Poration, Partikelbeschuss, Siliciumfaserabgabe oder Mikroinjektion von Pflanzenzellenprotoplasten oder embryogenem Callus verwendet werden. Siehe z. B. Tomes et al., Direct DNA Transfer into Intact Plant Cells via Microprojectile Bombardment, S. 197–213 in Plant Cell, Tissue and Organ Culture, Fundamental Methods, (Herausg. O. L. Gamborg und G. C. Phillips, Springer-Verlag Berlin Heidelberg New York, 1995). Alternativ können die DNA-Konstrukte mit geeigneten T-DNA-flankierenden Regionen kombiniert werden und in einen herkömmlichen Agrobacterium tumefaciens-Wirtsvektor eingeführt werden. Die Virulenzfunktionen des Agrobacterium tumefaciens-Wirts werden die Insertion des Konstrukts und angrenzender Marker in die Pflanzenzell-DNA steuern, wenn die Zelle durch die Bakterien infiziert wird. Siehe U.S. Patent Nr. 5,591,616 .
Die Einführung von DNA-Konstrukten unter Verwendung einer Polyethylenglykolpräzipitation ist in Paszkowski et al., Embo J. 3: 2717–2722 (1984) beschrieben. Elektroporationstechniken werden in Fromm et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 82: 5824 (1985) beschrieben. Ballistische Transformationstechniken sind in Klein et al., Nature 327: 70–73 (1987) beschrieben.
Agrobacterium tumefaciens-vermittelte Transformationstechniken sind in der wissenschaftlichen Literatur gut beschrieben. Siehe zum Beispiel Horsch et al., Science 233: 496–498 (1984), und Fraley et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 80: 4803 (1983). Obgleich Agrobacterium in erster Linie in Dicotylen einsetzbar ist, können bestimmte Monocotylen durch Agrobacterium transformiert werden. Zum Beispiel wird eine Agrobacterium-Transformation von Mais im U.S. Patent Nr. 5,550,318 beschrieben.
Andere Verfahren zur Transfektion oder Transformation umfassen (1) Agrobacterium rhizogenes-vermittelte Transformation (siehe z. B. Lichtenstein und Fuller in: Genetic Engineering, Bd. 6, PWJ Rigby, Herausg., London, Academic Press, 1987; und Lichtenstein, C. P., und Draper, J. in: DNA Cloning, Bd. II, D. M. Glover, Herausg., Oxford, IRI Press, 1985), PCT-Anmeldung/US87/02512 ( WO 88/02405 , veröffentlicht am 7. 4. 1988) beschreiben die Verwendung von A. rhizogenes-Stamm A4 und seines Ri-Plasmids zusammen mit A. tumefaciens-Vektoren pARC8 oder pARC16); (2) Liposomen-vermittelte DNA-Aufnahme (siehe z. B. Freeman et al., Plant Cell Physiol, 25: 1353, 1984), (3) das Vortex-Verfahren (siehe z. B. Kindle, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 1228, (1990)).
DNA kann auch durch direkten DNA-Transfer in Pollen eingeführt werden, wie es bei Zhou et al., Methods in Enzymology, 101: 433 (1983); D. Hess, Intern Rev. Cytol., 107: 367 (1987); Luo et al., Plane Mol. Biol. Reporter, 6: 165 (1988) beschrieben ist. Eine Expression von für Polypeptid codierenden Genen kann durch Injektion der DNA in Fortpflanzungsorgane einer Pflanze erhalten werden, wie es von Pena et al., Nature, 325: 274 (1987) beschrieben wurde. DNA kann auch direkt in die Zellen von unreifen Embryos und die Rehydratation von getrockneten Embryos injiziert werden, wie es von Neuhaus et al., Theor. Appl. Genet., 75: 30 (1987); und Benbrook et al., in Proceedings Bio Expo 1986, Butterworth, Stoneham, Mass., S. 27–54 (1986) beschrieben wurde. Auf dem Fachgebiet ist eine Vielzahl von Pflanzenviren bekannt, die als Vektoren verwendet werden können, und diese umfassen Blumenkohlmosaikvirus (CaMV), Geminivirus, Trespenmosaikvirus und Tabakmosaikvirus.
B. Transfektion von Prokaryoten, niederen Eukaryoten und Tierzellen
Tier- und niedere eukaryotische (z. B. Hefe-) Wirtszellen sind für eine Transfektion durch verschiedene Mittel kompetent oder kompetent gemacht. Es gibt mehrere gut bekannte Verfahren zur Einführung von DNA in Tierzellen. Diese umfassen Calciumphosphatpräzipitation, Fusion der Rezipientenzellen mit Bakterienprotoplasten, die die DNA enthalten, Behandlung der Rezipientenzellen mit Liposomen, die die DNA enthalten, DEAE-Dextran, Elektroporation, Biolistika und Mikroinjektion der DNA direkt in die Zellen. Die transfizierten Zellen werden durch Mittel, die auf dem Fachgebiet gut bekannt sind, kultiviert. Kuchler, R. J., Biochemical Methods in Cell Culture and Virology, Dowden, Hutchinson und Ross, Inc. (1977).
Synthese von Proteinen
Die Proteine der vorliegenden Erfindung können unter Verwendung von nicht-cellulären Syntheseverfahren konstruiert werden. Eine Festphasensynthese von Proteinen mit weniger als etwa 50 Aminosäuren Länge kann durchgeführt werden, indem die C-terminale Aminosäure der Sequenz an einen unlöslichen Träger gebunden wird, gefolgt von einer sequentiellen Addition der restlichen Aminosäuren in der Sequenz. Techniken zur Festphasensynthese sind in Barany und Merrifield, Solid-Phase Peptide Synthesis, S. 3–284, in The Peptides: Analysis, Synthesis, Biologe. Bd. 2: Special Methods in Peptide Synthesis, Teil A.; Merrifield, et al., J. Am. Chem. Soc. 85: 2149–2156 (1963) und Stewart et al., Solid Phase Peptide Synthesis, 2. Ausgabe, Pierce Chem. Co., Rockford, Ill. (1984) beschrieben. Proteine größerer Länge können durch Kondensation der Amino- und Carboxytermini kürzerer Fragmente synthetisiert werden. Verfahren zur Bildung von Peptidbindungen durch Aktivierung eines carboxyterminalen Endes (z. B. durch die Verwendung des Kopplungsreagenses N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid) sind dem Fachmann bekannt.
Reinigung von Proteinen
Die Proteine der vorliegenden Erfindung können durch Standardtechniken, die dem Fachmann gut bekannt sind, gereinigt werden. Rekombinant produzierte Proteine der vorliegenden Erfindung können direkt exprimiert werden oder als Fusionsprotein exprimiert werden. Das rekombinante Protein wird durch eine Kombination von Zelllyse (z. B. Beschallung, French-Press) und Affinitätschromatographie gereinigt. Für Fusionsprodukte setzt ein anschließender Verdau des Fusionsproteins mit einem geeigneten proteolytischen Enzym das gewünschte rekombinante Protein frei.
Die Proteine dieser Erfindung, rekombinant oder synthetisch, können durch Standardtechniken, die auf dem Fachgebiet gut bekannt sind, zu substantieller Reinheit gereinigt werden; diese Techniken umfassen Detergent-Solubilisierung, selektive Präzipitation mit solchen Substanzen wie Ammoniumsulfat, Säulenchromatographie, Immunreinigungsverfahren und andere. Siehe z. B. R. Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag: New York (1982); Deutscher, Guide to Protein Purification, Academic Press (1990). Beispielsweise können Antikörper gegen die Proteine erzeugt werden, wie es hierin beschrieben wird. Eine Reinigung aus E. coli kann nach den Verfahren, die im U.S. Patent Nr. 4,511,503 beschrieben sind, erreicht werden. Das Protein kann dann aus Zellen, die das Protein exprimieren, isoliert werden und außerdem durch hierin beschriebene Standardproteinchemietechniken gereinigt werden. Eine Detektion des exprimierten Proteins wird durch Verfahren erreicht, die auf dem Fachgebiet bekannt sind und z. B. Radioimmunoassays, Western-Blotting-Techniken oder Immunopräzipitation umfassen.
Transgene Pflanzen-Regeneration
Transformierte Pflanzenzellen, die aus einer beliebigen der obigen Transformationstechniken stammen, können kultiviert werden, um eine ganze Pflanze zu regenerieren, welche den transformierten Genotyp besitzt. Solche Regenerationstechniken basieren oft auf einer Manipulation von bestimmten Phytohormonen in einem Gewebekulturwachstumsmedium, die typischerweise auf einem Biozid- und/oder Herbizidmarker basiert, der zusammen mit einem Polynucleotid der vorliegenden Erfindung eingeführt wurde. Zur Transformation und Regeneration von Mais siehe Gordon-Kamm et al., The Plant Cell, 2: 603–618 (1990).
Pflanzenzellen, die mit einem Pflanzenexpressionsvektor transformiert wurden, können z. B. aus Einzelzellen, Callusgewebe oder Blattscheiben nach Standardpflanzengewebekulturtechniken regeneriert werden. Auf dem Fachgebiet ist gut bekannt, dass verschiedene Zellen, Gewebe und Organe aus fast jeder beliebigen Pflanze erfolgreich unter Regeneration einer ganzen Pflanze kultiviert werden können. Eine Pflanzenregeneration aus kultivierten Protoplasten wird in Evans et al., Protoplasts Isolation and Culture, Handbook of Plant Cell Culture, Macmillilan Publishing Company, New York, S. 124–176 (1983); und Binding, Regeneration of Plants, Plant Protoplasts, CRC Press, Boca Raton, S. 21–73 (1985) beschrieben.
Die Regeneration von Pflanzen, die das Fremdgen durch Agrobacterium eingeführt enthalten, aus Blattexplantaten kann erreicht werden, wie es von Horsch et al., Science, 227: 1229–1231 (1985) beschrieben wurde. In diesem Verfahren werden Transformanten in Gegenwart eines Selektionsmittels und in einem Medium, das die Regeneration von Schösslingen in der Pflanzespezies induziert, die transformiert wurde, wachsen gelassen, wie es bei Fraley et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80: 4803 (1983) beschrieben wurde. Dieses Verfahren produziert typischerweise Schösslinge in zwei bis vier Wochen und diese Transformantenschösslinge werden dann in ein geeignetes Wurzel-induzierendes Medium, das das Selektionsmittel und ein Antibiotikum zur Verhinderung von bakteriellem Wachstum enthält, transferiert. Transgene Pflanzen der Erfindung können fertil oder steril sein.
Eine Regeneration kann auch aus Pflanzencallus, Explantaten, Organen oder Teilen davon erreicht werden. Solche Regenerationstechniken sind allgemein in Klee et al., Ann. Rev. of Plant Phys. 38. 467–486 (1987) beschrieben. Die Regeneration von Pflanzen entweder aus Einzelpflanzenprotoplasten oder verschiedenen Explantaten ist auf dem Fachgebiet gut bekannt. Siehe zum Beispiel Methods for Plant Molecular Biology, A. Weissbach und H. Weissbach, Herausg., Academic Press, Inc., San Diego, Kalif. (1988). Dieses Regenerations- und Wachstumsverfahren beinhaltet die Schritte einer Selektion von Transformantenzellen und Schösslingen, Bewurzeln der Transformantenschösslinge und Wachstum der Pflänzchen in Erde. Für eine Maiszellkultur und -regeneration siehe allgemein The Maize Handbook, Freeling und Walbot, Herausg., Springer, New York (1994); Corn and Corn Improvement, 3. Ausgabe, Sprague und Dudley Herausg., American Society of Agronomy, Madison, Wisconsin (1988).
Ein Fachmann wird erkennen, dass, nachdem die rekombinante Expressionskassette stabil in transgene Pflanzen eingebaut wurde und als funktionell bestätigt wurde, sie durch sexuelle Kreuzung in andere Pflanzen eingeführt werden kann. In Abhängigkeit von der zu kreuzenden Spezies kann eine beliebige einer Reihe von Standardzüchtungstechniken verwendet werden.
Bei vegetativ vermehrten Nutzpflanzen können reife transgene Pflanzen durch die Entnahme von Schnitten oder durch Gewebekulturtechniken vermehrt werden, um mehrere identische Pflanzen zu erzeugen. Es wird eine Selektion von wünschenswerten Transgenen durchgeführt und neue Varietäten werden erhalten und zur kommerziellen Verwendung vegetativ vermehrt. Bei durch Säen vermehrten Nutzpflanzen können reife transgene Pflanzen geselbstet werden, um eine homozygote Inzuchtpflanze zu erzeugen. Die Inzuchtpflanze produziert Samen, die die neu eingeführte heterologe Nucleinsäure enthalten. Diese Samen können wachsen gelassen werden, um Pflanzen zu produzieren, die den ausgewählten Phänotyp produzieren.
Teile, die von der regenerierten Pflanze erhalten wurden, z. B. Blüten, Samen, Blätter, Zweige, Früchte und dergleichen, werden von der Erfindung mit umfasst, vorausgesetzt, dass diese Teile Zellen umfassen, die die isolierte Nucleinsäure der vorliegenden Erfindung umfassen. Nachkommenschaft und Varianten und Mutanten der regenerierten Pflanzen sind im Rahmen der Erfindung ebenfalls eingeschlossen, vorausgesetzt, dass diese Teile die eingeführten Nucleinsäuresequenzen umfassen.
Transgene Pflanzen, die den selektierbaren Marker exprimieren, können bezüglich einer Transmission der Nucleinsäure der vorliegenden Erfindung beispielsweise durch Standard-Immunoblot- und -DNA-Detektions-Techniken durchgemustert werden. Transgene Linien werden typischerweise auch bezüglich der Expressionslevel der heterologen Nucleinsäure evaluiert. Eine Expression auf dem RNA-Level kann anfangs bestimmt werden, um Expressions-positive Pflanzen zu identifizieren und zu quantifizieren. Standardtechniken für die RNA-Analyse können verwendet werden und umfassen PCR-Amplifikationsassays, die Oligonucleotidprimer verwenden, die so konzipiert sind, dass sie nur die heterologen RNA-Matrizen amplifizieren, und Lösungshybridisierungsassays, die heterologe Nucleinsäure-spezifische Sonden verwenden. Die RNA-positiven Pflanzen können dann durch Western-Immunoblot-Analyse auf Proteinexpression analysiert werden, wobei die spezifisch reaktiven Antikörper der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Außerdem kann eine in situ-Hybridisierung und Immuncytochemie nach Standardprotokollen durchgeführt werden, wobei Nucleinsäure-spezifische Polynucleotidsonden bzw. Antikörper verwendet werden, um Expressionsstellen innerhalb eines transgenen Gewebes zu lokalisieren. Im Allgemeinen wird üblicherweise eine Reihe von transgenen Linien bezüglich der eingebauten Nucleinsäure durchgemustert, um Pflanzen mit den geeignetesten Expressionsprofilen zu identifizieren und auszuwählen.
Eine bevorzugte Ausführungsform ist eine transgene Pflanze, die für die addierte heterologe Nucleinsäure homozygot ist, d. h. eine transgene Pflanze, die zwei addierte Nucleinsäuresequenzen enthält, ein Gen an demselben Locus auf jedem Chromosom eines Chromosomenpaars. Eine homozygote transgene Pflanze kann durch sexuelle Kreuzung (Selbstung) einer heterozygoten transgenen Pflanze, die eine einzelne addierte heterologe Nucleinsäure enthält, Keimen einiger der Samen, die produziert wurden, und Analysieren der resultierenden produzierten Pflanzen auf veränderte Expression eines Polynucleotids der vorliegenden Erfindung im Vergleich zu einer Kontrollpflanze (d. h. eine native, nicht-transgene Pflanze) erhalten werden. Eine Rückkreuzung zu einer Elternpflanze und eine Auskreuzung mit einer nicht-transgenen Pflanze werden ebenfalls in Betracht gezogen.
Modulierung der Polypeptidlevel und/oder -zusammensetzung
Die vorliegende Erfindung stellt ferner ein Verfahren zur Modulierung (d. h. Erhöhung oder Verminderung) der Konzentration oder Zusammensetzung der Polypeptide der vorliegenden Erfindung in einer Pflanze oder einem Teil davon bereit. Eine Modulierung kann durch Erhöhen oder Vermindern der Konzentration und/oder der Zusammensetzung (d. h. das Verhältnis der Polypeptide der vorliegenden Erfindung) in einer Pflanze durchgeführt werden. Das Verfahren umfasst Transformieren einer Pflanzenzelle mit einer rekombinanten Expressionskassette, umfassend ein Polynucleotid der vorliegenden Erfindung, wie es oben beschrieben wurde, unter Erhalt einer transformierten Pflanzenzelle, Kultivieren der transformierten Pflanzenzelle unter Pflanzenbildungsbedingungen und Induzieren einer Expression eines Polynucleotids der vorliegenden Erfindung in der Pflanze für eine Zeit, die ausreichend ist, um die Konzentration und/oder die Zusammensetzung in der Pflanze oder einem Pflanzenteil zu modulieren.
In einigen Ausführungsformen kann der Gehalt und/oder die Zusammensetzung von Polypeptiden der vorliegenden Erfindung in einer Pflanze moduliert werden, indem in vivo oder in vitro der Promotor eines nicht-isolierten Gens der vorliegenden Erfindung verändert wird, um die Genexpression hoch oder runter zu regulieren. In einigen Ausführungsformen können die codierenden Regionen von nativen Genen der vorliegenden Erfindung durch Substitution, Addition, Insertion oder Deletion verändert werden, um die Aktivität des codierten Enzyms zu senken. Siehe z. B. Kmiec, U.S. Patent 5,565,350 ; Zarling et al., PCT/US93/03868 . Und in einigen Ausführungsformen wird eine isolierte Nucleinsäure (z. B. ein Vektor), die eine Promotorsequenz umfasst, in eine Pflanzenzelle transfiziert. Anschließend wird eine Pflanzenzelle, die den Promotor funktionell mit einem Polynucleotid der vorliegenden Erfindung verknüpft umfasst, ausgewählt und zwar durch Mittel, die dem Fachmann bekannt sind, z. B., aber nicht beschränkt auf, Southern-Blot-DNA-Sequenzierung oder PCR-Analyse, wobei Primer verwendet werden, die für den Promotor und das Gen spezifisch sind, und daraus produzierte Amplicons detektiert werden. Eine Pflanze oder ein Pflanzenteil, die/der durch die vorstehende Ausführungsform verändert oder modifiziert wurde, wird unter Pflanzenbildungsbedingungen für eine Zeit wachsen gelassen, die ausreichend ist, um die Konzentration und/oder Zusammensetzung von Polypeptiden der vorliegenden Erfindung in der Pflanze zu modulieren. Pflanzenbildungsbedingungen sind auf dem Fachgebiet gut bekannt und oben kurz diskutiert.
Im Allgemeinen wird die Konzentration oder Zusammensetzung im Vergleich zu einer nativen Kontrollpflanze, einem nativen Pflanzenteil oder einer Zelle, denen die vorstehend genannte rekombinante Expressionskassette fehlt, um wenigstens 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% oder 90% erhöht oder verringert. Eine Modulation bzw. Modulierung in der vorliegenden Erfindung kann während des Wachstums und/oder anschließend an das Wachstum der Pflanze zu der gewünschten Entwicklungsstufe erfolgen. Eine Modulierung der Nucleinsäureexpression temporär und/oder in bestimmten Geweben kann durch Verwendung des geeigneten Promotors, der funktionell mit dem Polynucleotid der vorliegenden Erfindung in z. B. Sense- oder Antisense-Orientierung verknüpft ist, wie es detaillierter oben diskutiert ist, kontrolliert werden. Die Induktion der Expression eines Polynucleotids der vorliegenden Erfindung kann auch durch exogene Verabreichung einer wirksamen Menge an induzierender Verbindung kontrolliert werden. Induzierbare Promotoren und induzierende Verbindungen, welche die Expression aus diesen Promotoren aktivieren, sind auf dem Fachgebiet gut bekannt. In bevorzugten Ausführungsformen werden die Polypeptide der vorliegenden Erfindung in Monocotylen, insbesondere Mais, moduliert.
Molekulare Marker
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Genotypisierung einer Pflanze, die ein Polynucleotid der vorliegenden Erfindung umfasst, bereit. Die Pflanze ist vorzugsweise eine Monocotyle, z. B. Mais oder Sorghum. Eine Genotypisierung stellt ein Mittel zur Unterscheidung von Homologen eines Chromosomenpaars bereit und kann eingesetzt werden, um Segreganten in einer Pflanzenpopulation zu differenzieren. Molekulare Marker-Methoden können für phylogenetische Studien, eine Charakterisierung einer genetischen Beziehung unter Nutzpflanzenvarietäten, zur Identifizierung von Kreuzungen oder somatischen Hybriden, zur Lokalisierung von chromosomalen Segmenten, die monogene Merkmale beeinträchtigen, zur kartenbasierten Klonierung und zur Studie einer quantitativen Vererbung verwendet werden. Siehe z. B. Plant Molecular Biology: A Laboratory Manual, Kapitel 7, Clar, Herausg., Springer-Verlag, Berlin (1997). Für molekulare Marker-Methoden siehe allgemein The DNA Revolution von Andrew H. Paterson 1996 (Kapitel 2) in: Genome Mapping in Plants (Herausg. Andrew H. Paterson) von Academic Press/R. G. Landis Company, Austin, Texas, S. 7–21.
Das besondere Verfahren der Genotypisierung in der vorliegenden Erfindung kann eine beliebige Anzahl von analytischen Techniken mit molekularem Marker verwenden, z. B., aber nicht beschränkt auf, Restriktionsfragmentlängenpolymorphismen (RFLPs). RFLPs sind das Produkt von allelischen Unterschieden zwischen DNA-Restriktionsfragmenten, verursacht durch Nucleotidsequenzvariabilität. Wie es dem Fachmann bekannt ist, werden RFLPs typischerweise durch Extraktion von genomischer DNA und Verdau mit einem Restriktionsenzym detektiert. Im Allgemeinen werden die resultierenden Fragmente nach Größe getrennt und mit einer Sonde hybridisiert; Einzelkopiesonden sind bevorzugt. Restriktionsfragmente aus homologen Chromosomen werden gezeigt. Differenzen in der Fragmentgröße unter Allelen stellen einen RFLP dar. Somit stellt die vorliegende Erfindung außerdem ein Mittel zur Verfolgung der Segregation eines Gens oder einer Nucleinsäure der vorliegenden Erfindung sowie chromosomale Sequenzen, die genetisch mit diesen Genen oder Nucleinsäuren verknüpft sind, bereit, wobei solche Techniken wie RFLP-Analyse verwendet werden. Verknüpfte chromosomale Sequenzen sind innerhalb von 50 centiMorgans (cM), oft innerhalb von 40 oder 30 cM, vorzugsweise innerhalb von 20 oder 10 cM, bevorzugter innerhalb von 5, 3, 2 oder 1 cM eines Gens der vorliegenden Erfindung.
In der vorliegenden Erfindung hybridisieren die Nucleinsäuresonden, die zum molekularen Marker-Kartieren von Pflanzenkerngenomen verwendet werden, unter selektiven Hybridisierungsbedingungen selektiv an ein Gen, das ein Polynucleotid der vorliegenden Erfindung codiert. In bevorzugten Ausführungsformen werden die Sonden aus Polynucleotiden der vorliegenden Erfindung ausgewählt. Typischerweise sind diese Sonden cDNA-Sonden oder genomische PstI-Klone. Die Länge der Sonden ist oben detaillierter diskutiert, allerdings haben sie typischerweise eine Länge von wenigstens 15 Basen, bevorzugter wenigstens 20, 25, 30, 35, 40 oder 50 Basen. Im Allgemeinen sind die Sonden allerdings kleiner als etwa 1 Kilobase in der Länge. Vorzugsweise sind die Sonden Einzelkopiesonden, die an einen einmal vorkommenden Locus in einem haploiden Chromosomenkomplement hybridisieren. Einige Beispiele für Restriktionsenzyme, die bei der RFLP-Kartierung verwendet werden, sind EcoRI, EcoRv und SstI. Der Ausdruck „Restriktionsenzym", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf eine Zusammensetzung, die eine spezifische Nucleotidsequenz erkennt und allein oder in Verbindung mit einer anderen Zusammensetzung an einer spezifischen Nucleotidsequenz spaltet.
Das Verfahren zum Detektieren eines RFLP umfasst die Schritte: (a) Verdauen genomischer DNA einer Pflanze mit einem Restriktionsenzym; (b) Hybridisieren einer Nucleinsäuresonde unter selektiven Hybridisierungsbedingungen an eine Sequenz eines Polynucleotids der vorliegenden Erfindung der genomischen DNA; (c) Detektieren eines RFLP daraus. Andere Verfahren zur Differenzierug von polymorphen (allelischen) Varianten von Polynucleotiden der vorliegenden Erfindung können unter Verwendung von Techniken mit molekularem Marker, die dem Fachmann gut bekannt sind, erhalten werden; diese umfassen Techniken wie: 1) Einzelstrangkonformationsanalyse (SSCP); 2) denaturierende Gradienten-Gelelektrophorese (DGGE); 3) RNase-Schutzassays; 4) Allel-spezifische Oligonucleotide (ASOs); 5) die Verwendung von Proteinen, die Nucleotidfehlpaarungen erkennen, z. B. das E. coli-mutS-Protein; und 6) Allel-spezifische PCR. Andere Ansätze, die auf der Detektion von Fehlpaarungen zwischen den zwei komplementären DNA-Strängen basieren, umfassen „clamped" denaturierende Gelelektrophorese (CDGE); Heteroduplexanalyse (HA); und chemische Fehlpaarungsspaltung (CMC). Beispiele für polymorphe Varianten werden in Tabelle I oben bereitgestellt. Demnach stellt die vorliegende Erfindung außerdem ein Verfahren zur Genotypisierung bereit, umfassend die Schritte In-Kontakt-Bringen einer Probe, von der angenommen wird, dass sie ein Polynucleotid der vorliegenden Erfindung umfasst, unter stringenten Bedingungen mit einer Nucleinsäuresonde. Im Allgemeinen ist die Probe eine Pflanzenprobe, vorzugsweise eine Probe, von der angenommen wird, dass sie ein Maispolynucleotid der vorliegenden Erfindung umfasst (z. B. Gen, mRNA). Die Nucleinsäuresonde hybridisiert unter stringenten Bedingungen selektiv an eine Untersequenz eines Polynucleotids der vorliegenden Erfindung, das einen polymorphen Marker umfasst. Selektive Hybridisierung der Nucleinsäuresonde an die polymorphe Marker-Nucleinsäuresequenz führt zu einem Hybridisierungskomplex. Eine Detektion des Hybridisierungskomplexes zeigt das Vorliegen jenes polymorphen Markers in der Probe an. In bevorzugten Ausführungsformen umfasst die Nucleinsäuresonde ein Polynucleotid der vorliegenden Erfindung.
UTRs und Codonpräferenz
Es wurde gefunden, dass eine translationale Effizienz im Allgemeinen durch spezifische Sequenzelemente in der 5'-nicht-codierenden oder untranslatierten Region (5'-UTR) der RNA reguliert wird. Positive Sequenzmotive umfassen translationale Initiationskonsensussequenzen (Kozak, Nucleic Acids Res. 15: 8125 (1987)) und die 7-Methylguanosin-Cap-Struktur (Drummond et al., Nucleic Acids Res. 13: 7375 (1985)). Negative Elemente umfassen stabile intramolekulare 5'-UTR-Stem-Loop-Strukturen (Muesing et al., Cell 48: 691 (1987)) und AUG-Sequenzen oder kurze offene Leseraster, denen ein geeignetes AUG in der 5'-UTR vorausgeht (Kozak, oben, Rao et al., Mol. and Cell. Biol. 8: 284 (1988)). Dementsprechend stellt die vorliegende Erfindung 5'- und/oder 3'-UTR-Regionen zur Modulation der Translation von heterologen codierenden Sequenzen bereit.
Außerdem können die Polypeptid-codierenden Segmente der Polynucleotide der vorliegenden Erfindung unter Änderung der Codonverwendung modifiziert werden. Eine veränderte Codonverwendung kann verwendet werden, um eine translationale Effizienz zu verändern und/oder die codierende Sequenz zur Expression in einem gewünschten Wirt zu optimieren oder die Codonverwendung in einer heterologen Sequenz zur Expression in Mais zu optimieren. Eine Codonverwendung in den codierenden Regionen der Polynucleotide der vorliegenden Erfindung kann statistisch analysiert werden, wobei im Handel verfügbare Software-Packages, z. B. „Codon Preference", erhältlich von der University of Wisconsin Genetics Computer Group (siehe Devereux et al., Nucleic Acids Res. 12: 387–395 (1984)) oder Mac-Vektor 4.1 (Eastman Kodak Co., New Haven, Conn.), verwendet werden. Somit stellt die vorliegende Erfindung ein Häufigkeitscharakteristikum der Codonverwendung für die codierende Region wenigstens eines der Polynucleotide der vorliegenden Erfindung bereit. Die Anzahl der Polynucleotide, die verwendet werden können, um die Häufigkeit der Codonverwendung zu bestimmen, kann eine beliebige ganze Zahl von 1 bis zu der Zahl der Polynucleotide der vorliegenden Erfindung, wie sie hierin bereitgestellt werden, sein. Gegebenenfalls werden die Polynucleotide Volllängensequenzen sein. Eine beispielhafte Zahl der Sequenzen zur statistischen Analyse kann wenigstens 1, 5, 10, 20, 50 oder 100 sein.
Sequenz-Shuffling
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Verfahren zum Sequenz-Shuffling unter Verwendung von Polynucleotiden der vorliegenden Erfindung und auf Zusammensetzungen, die dar aus resultieren. Sequenz-Shuffling wird in der PCT-Veröffentlichung Nr. 96/19256 beschrieben. Siehe auch Zhang, J.-H, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 4504–4509 (1997). Im Allgemeinen stellt Sequenz-Shuffling ein Mittel zur Erzeugung von Bibliotheken von Polynucleotiden mit einem gewünschten Charakteristikum, welches selektiert werden kann oder auf welches durchgemustert werden kann, bereit. Bibliotheken rekombinanter Polynucleotide werden aus einer Gruppe von Polynucleotiden mit verwandter Sequenz erzeugt, welche Sequenzregionen umfassen, die substantielle Sequenzidentität haben und in vitro oder in vivo homolog rekombiniert werden können. Die Population von Sequenz-rekombinierten Polynucleotiden umfasst eine Subpopulation von Polynucleotiden, die gewünschte oder vorteilhafte Charakteristika besitzen und die durch ein geeignetes Selektions- oder Screeningverfahren selektiert werden können. Die Charakteristika können eine beliebige Eigenschaft oder ein beliebiges Attribut sein, die/das in einem Screeningsystem selektiert oder detektiert werden kann; diese können folgende Eigenschaften umfassen: ein codiertes Protein, ein Transkriptionselement, eine Sequenz, die die Transkription kontrolliert, RNA-Prozessierung, RNA-Stabilität, Chromatinkonformation, Translation oder andere Eigenschaften eines Gens oder Transgens, ein replikatives Element, ein Protein-bindendes Element oder dergleichen, z. B. ein beliebiges Merkmal, welches eine selektierbare oder detektierbare Eigenschaft verleiht. Das ausgewählte Charakteristikum kann ein verringertes Km und/oder erhöhtes K_cat gegenüber dem Wildtyp-Protein sein, wie es hierin bereitgestellt wird. In anderen Ausführungsformen wird ein Protein oder ein Polynucleotid, das mit Sequenz-Shuffling erzeugt wird, eine Ligandenbindungsaffinität haben, die größer ist als die des Wildtyp-Polynucleotids ohne Shuffling. Die Verstärkung solcher Eigenschaften kann wenigstens 110%, 120%, 130%, 140% oder wenigstens 150% des Wildtyp-Werts sein.
Generische und Konsensus-Sequenzen
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf Polynucleotide und Polypeptide mit: (a) einer generischen Sequenz von wenigstens zwei homologen Polynucleotiden bzw. Polypeptiden der vorliegenden Erfindung und (b) einer Konsensussequenz aus wenigstens drei homologen Polynucleotiden bzw. Polypeptiden der vorliegenden Erfindung. Ein Polynucleotid mit einer Aminosäure- oder Nucleinsäure-Konsensussequenz kann verwendet werden, um Antikörper zu erzeugen oder Nucleinsäuresonden oder Primer zu erzeugen, um auf Homologe in anderen Arten, Gattungen, Familien, Ordnungen, Klassen, Phyla oder Reichen durchzumustern. Zum Beispiel kann ein Polynucleotid mit Konsensussequenzen aus einer Genfamilie von Zea mays verwendet werden, um Antikörper oder Nucleinsäuresonden oder Primer für andere Gramineae-Spezies, z. B. Weizen, Reis oder Sorghum, zu erzeugen. Alternativ kann ein Polynucleotid mit einer Konsensussequenz, die aus orthologen Genen erzeugt wurde, verwendet werden, um Orthologe anderer Taxa zu identifizieren oder zu isolieren. Typischerweise wird ein Polynucleotid mit einer Konsensussequenz eine Länge von wenigstens 9, 10, 15, 20, 25, 30 oder 40 Aminosäuren oder eine Länge von 20, 30, 40, 50, 100 oder 150 Nucleotiden haben. Wie der Fachmann weiß, kann eine konservative Aminosäuresubstitution für Aminosäuren verwendet werden, die sich in der ange ordneten Sequenz unterscheiden, aber aus derselben konservativen Substitutionsgruppe sind, wie sie oben diskutiert wurde. Gegebenenfalls sind für jede 10 Aminosäuren-Länge einer Konsensussequenz nicht mehr als ein oder zwei konservative Aminosäuren substituiert.
Ähnliche Sequenzen, die für die Erzeugung einer Konsensus- oder generischen Sequenz verwendet werden, umfassen eine beliebige Anzahl an Kombination von allelischen Varianten desselben Gens, orthologe oder paraloge Sequenzen, wie sie hierin bereitgestellt werden. Gegebenenfalls werden ähnliche Sequenzen, die bei der Erzeugung einer Konsensus- oder generischen Sequenz verwendet werden, unter Verwendung der kleinsten Summenwahrscheinlichkeit des BLAST-Algorithmus (P(N)) identifiziert. In Kapitel 7 von Current Protocols in Molecular Biology, F. M. Ausubel et al., Herausg., Current Protocols, ein Gemeinschaftsunternehmen von Greene Publishing Associates, Inc., und John Wiley & Sons, Inc. (Ergänzung 30) werden verschiedene Lieferanten für Sequenz-Analyse-Software aufgelistet. Eine Polynucleotidsequenz wird als ähnlich zu einer Referenzsequenz angesehen, wenn die kleinste Summenwahrscheinlichkeit in einem Vergleich der Testnucleinsäure zu der Referenznucleinsäure kleiner als etwa 0,1, bevorzugter kleiner als etwa 0,01 oder 0,001 und am wahrscheinlichsten kleiner als etwa 0,0001 oder 0,00001 ist. Ähnliche Polynucleotide können angeordnet werden und eine Konsensus- oder generische Sequenz erzeugt werden, wobei Mehrsequenzanordnungs-Software verwendet wird, die von einer Reihe kommerzieller Lieferanten verfügbar ist, z. B. Genetics Computer Group's (Madison, WI) PILEUP-Software, Vector NTIs (North Bethesda, MD) ALIGNX oder Genecode's (Ann Arbor, MI) SEQUENCHER. Zweckmäßigerweise können Default-Parameter solcher Software eingesetzt werden, um Konsensus- oder generische Sequenzen zu erzeugen.
Detektion von Nucleinsäuren
Die vorliegende Erfindung bezieht sich außerdem auf Verfahren zum Detektieren eines Polynucleotids der vorliegenden Erfindung in einer Nucleinsäureprobe, von der angenommen wird, dass sie ein Polynucleotid der vorliegenden Erfindung umfasst, z. B. ein Pflanzenzelllysat, insbesondere ein Lysat von Mais bzw. Getreide. In einigen Ausführungsformen kann ein Gen der vorliegenden Erfindung oder ein Teil davon vor dem Schritt des In-Kontakt-Bringens der Nucleinsäureprobe mit einem Polynucleotid der vorliegenden Erfindung amplifiziert werden. Die Nucleinsäureprobe wird mit dem Polynucleotid unter Bildung eines Hybridisierungskomplexes in Kontakt gebracht. Das Polynucleotid hybridisiert unter stringenten Bedingungen an ein Gen, das ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung codiert. Die Bildung des Hybridisierungskomplexes wird verwendet, um ein Gen, das für ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung codiert, in der Nucleinsäureprobe zu detektieren. Der Fachmann wird erkennen, dass einer isolierten Nucleinsäure, die ein Polynucleotid der vorliegenden Erfindung umfasst, Kreuzhybridisierungssequenzen in üblichen Nicht-Target-Genen, die ein falsch positives Resultat liefern würden, fehlen sollten.
Eine Detektion des Hybridisierungskomplexes kann unter Verwendung einer Reihe von gut bekannten Verfahren erreicht werden. Beispielsweise kann die Nucleinsäureprobe oder ein Teil davon durch Hybridisierungsformate, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, Lösungspha sen-, Festphasen-, Mischphasen- oder In situ-Hybridisierungsassays, analysiert werden. Kurz ausgedrückt, in Lösungs (oder Flüssigkeits)-Phasenhybridisierungen sind sowohl die Targetnucleinsäure als auch die Sonde oder der Primer frei, um im Reaktionsgemisch zu wechselwirken. In Festphasenhybridisierungsassays sind Sonden oder Primer typischerweise an einen festen Träger gebunden, wo sie für eine Hybridisierung mit Targetnucleinsäure in Lösung verfügbar sind. In einer gemischten Phase hybridisieren Nucleinsäure-Intermediate in Lösung an Targetnucleinsäuren in Lösung wie auch an eine Nucleinsäure, die an einen festen Träger gebunden ist. Bei einer In situ-Hybridisierung wird die Targetnucleinsäure aus ihrer cellulären Umgebung freigesetzt, so dass sie zur Hybridisierung in der Zelle verfügbar ist, während die celluläre Morphologie für eine anschließende Interpretation und Analyse konserviert wird. Die folgenden Artikel liefern eine Übersicht über die verschiedenen Hybridisierungsassayformate: Singer et al., Biotechniques 4(3): 230–250 (1986); Haase et al., Methods in Virology, Bd. VII, S. 189–226 (1984); Wilkinson, The theory and practice of in situ hybridization in: In situ Hybridization, D. G. Wilkinson, Herausg., IRL Press, Oxford University Press, Oxford: und Nucleic Acid Hybridization: A Practical Approach, Hames; B. D. und Higgins, S. J., Herausg., ILR Press (1987).
Nucleinsäure-Markierungen und Detektionsverfahren
Die Mittel, durch welche Nucleinsäuren der vorliegenden Erfindung markiert werden, sind kein kritischer Aspekt der vorliegenden Erfindung und eine Markierung kann durch eine Vielzahl von Verfahren, die derzeit bekannt sind oder später entwickelt werden, erfolgen. Detektierbare Markierungen, die zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet sind, umfassen eine beliebige Zusammensetzung, die durch spektroskopische Radioisotopen-, photochemische, biochemische, immunchemische, elektrische, optische oder chemische Mittel detektierbar sind. Nützliche Markierungen in der vorliegenden Erfindung umfassen Biotin zur Färbung mit markiertem Streptavidinkonjugat, magnetische Perlen, Fluoreszenzfarbstoffe (z. B. Fluorescein, Texasrot, Rhodamin, grün fluoreszierendes Protein und dergleichen), radioaktive Markierungen (z. B. ³H, ¹²⁵I, ³⁵S, ¹⁴C oder ³²P), Enzyme (z. B. Meerrettichperoxidase, alkalische Phosphatase und andere, die üblicherweise in einem ELISA verwendet werden) und kolorimetrische Markierungen, z. B. kolloidales Gold oder gefärbte Glas- oder Kunststoff (z. B. Polystyrol, Polypropylen, Latex usw.) -Perlen.
Nucleinsäuren der vorliegenden Erfindung können durch ein beliebiges von mehreren Verfahren, die typischerweise verwendet werden, um das Vorliegen von hybridisierten Nucleinsäuren zu detektieren, markiert werden. Ein übliches Detektionsverfahren ist die Verwendung von Autoradiographie unter Verwendung von Sonden, die mit ³H, ¹²⁵I, ³⁵S, ¹⁴C oder ³²P oder dergleichen markiert sind. Die Wahl eines radioaktiven Isotops hängt von Forschungspräferenzen, bedingt durch die Einfachheit der Synthese, die Stabilität und die Halbwertszeit der ausgewählten Isotope ab. Andere Markierungen umfassen Liganden, die an Antikörper binden, die mit Fluorphoren, chemilumineszierenden Mitteln und Enzymen markiert sind. Alternativ können Sonden direkt mit Markierungen, z. B. Fluorophoren, chemilumineszierenden Mitteln oder Enzy men, konjugiert werden. Die Wahl der Markierung hängt von der verlangten Empfindlichkeit, der Einfachheit der Konjugation mit der Sonde, Stabilitätsanforderungen und verfügbaren Instrumenten ab. Eine Markierung der Nucleinsäuren der vorliegenden Erfindung wird in einfacher Weise durch Verwendung von markierten PCR-Primern erreicht.
In einigen Ausführungsformen wird die Markierung gleichzeitig während des Amplifikationsschrittes bei der Herstellung der Nucleinsäuren eingebaut. So wird zum Beispiel eine Polymerasekettenreaktion (PCR) mit markierten Primern oder markierten Nucleotiden ein markiertes Amplifikationsprodukt bereitstellen. In einer anderen Ausführungsform baut eine Transkriptionsamplifikation unter Verwendung eines markierten Nucleotids (z. B. Fluorescein-markiertes UTP und/oder CTP) eine Markierung in die transkribierten Nucleinsäuren ein.
Nicht-radioaktive Sonden werden oft durch indirekte Mittel markiert. Zum Beispiel wird ein Ligandenmolekül kovalent an die Sonde gebunden. Der Ligand bindet dann an ein Antiligandenmolekül, welches inhärent detektierbar ist oder kovalent an ein detektierbares Signalsystem, zum Beispiel ein Enzym, ein Fluorophor oder eine chemilumineszierende Verbindung, gebunden ist. Enzyme von Interessse als Markierungen werden in erster Linie Hydrolasen, z. B. Phosphatasen, Esterasen und Glycosidasen, oder Oxidoreduktasen, insbesondere Peroxidasen, sein. Fluoreszierende Verbindungen umfassen Fluorescein und seine Derivate, Rhodamin und seine Derivate, Dansyl, Umbelliferon usw. Chemilumineszierende Verbindungen umfassen Luciferin und 2,3-Dihydrophthalazindione, z. B. Luminol. Liganden und Antiliganden können in großem Umfang variiert werden. Wenn ein Ligand einen natürlichen Antiliganden hat, nämlich Liganden wie Biotin, Tyroxin und Cortisol, kann er in Verbindung mit seinen markierten, natürlich auftretenden Antiliganden verwendet werden. Alternativ kann eine beliebige Hapten- oder Antigen-Verbindung in Kombination mit einem Antikörper verwendet werden.
Sonden können auch durch direkte Konjugation mit einer Markierung markiert werden. Beispielsweise wurden klonierte DNA-Sonden direkt an Meerrettichperoxidase oder alkalische Phosphatase gekoppelt (Renz, M. und Kurz, K., A Colorimetric Method for DNA Hybridization, Nucl. Acids Res. 12: 3435–3444 (1984)) und synthetische Oligonucleotide wurden direkt mit alkalischer Phosphatase gekoppelt (Jablonski, E., et al., Preparation of Oligodeoxynucleotide-Alkaline Phosphatase Conjugates and Their Use as Hybridization Probes, Nuc. Acids. Res. 14: 6115–6128 (1986); und Li P., et al., Enzyme-linked Synthetic Oligonucleotide Probes: Non-Radioactive Detection of Enterotoxigenic Escherichia Coli in Faeca Specimens, Nucl. Acids Res. 15: 5275–5287 (1987)).
Mittel zur Detektion solcher Markierungen sind dem Fachmann gut bekannt. So können z. B. radioaktive Markierungen unter Verwendung eines photographischen Films oder eines Szintillationszählers detektiert werden, fluoreszierende Marker können unter Verwendung eines Photodetektors zum Detektieren von emittiertem Licht detektiert werden. Enzymatische Markierungen werden typischerweise detektiert, indem das Enzym mit einem Substrat versehen wird und das Reaktionsprodukt, das durch die Wirkung des Enzyms auf das Substrat produziert wird, de tektiert wird, und kolorimetrische Markierungen werden durch einfaches Sichtbarwerden der gefärbten Markierung detektiert.
Antikörper gegen Proteine
Antikörper können gegen ein Protein der vorliegenden Erfindung, einschließlich individueller, allelischer, Stamm- oder Spezies-Varianten und Fragmente davon, sowohl in ihren natürlich auftretenden (Volllängen-)Formen und in rekombinanten Formen, entwickelt werden. Außerdem werden Antikörper gegen diese Proteine in entweder ihren nativen Konfigurationen oder in nicht-nativen Konfigurationen entwickelt. Es können auch anti-idiotypische Antikörper erzeugt werden. Den Fachleuten sind viele Verfahren zur Herstellung von Antikörpern bekannt. Die folgende Diskussion wird als allgemeine Übersicht der verfügbaren Techniken präsentiert; allerdings wird ein Fachmann erkennen, dass viele Variationen bei den folgenden Verfahren bekannt sind.
Es wird eine Reihe von Immunogenen verwendet, um Antikörper zu produzieren, die mit einem Protein der vorliegenden Erfindung spezifisch reaktiv sind. Ein isoliertes rekombinantes, synthetisches oder natives Polynucleotid der vorliegenden Erfindung ist das bevorzugte Immunogen (Antigen) für die Produktion von monoklonalen oder polyklonalen Antikörpern. Der Fachmann wird leicht verstehen, dass die Proteine der vorliegenden Erfindung vor einer Bildung von Antikörpern zum Screening von Expressions-Bibliotheken oder für andere Assays, in denen ein vermeintliches Protein der vorliegenden Erfindung exprimiert oder in einer nicht-nativen Sekundär, Tertiär- oder Quarternärstruktur denaturiert wird, typischerweise denaturiert und gegebenenfalls reduziert werden. Nicht-isolierte Polypeptide der vorliegenden Erfindung können entweder in reiner Form oder in unreiner Form eingesetzt werden.
Das Protein der vorliegenden Erfindung wird dann in ein Tier injiziert, welches fähig ist, Antikörper zu produzieren. Es können entweder monoklonale oder polyklonale Antikörper für eine anschließende Verwendung in Immunoassays zur Messung des Vorliegens und der Menge des Proteins der vorliegenden Erfindung erzeugt werden. Verfahren zum Produzieren von polyklonalen Antikörpern sind dem Fachmann bekannt. Kurz ausgedrückt, ein Immunogen (Antigen), vorzugsweise ein gereinigtes Protein, ein Protein, das an einen geeigneten Träger gekoppelt ist (z. B. GST, Schlüssellochnapfschneckenhämatocyanin usw.) oder ein Protein, das in einen Immunisierungsvektor, z. B. ein rekombinantes Vacciniavirus eingebaut ist (siehe U.S. Patent Nr. 4,722,848 ) wird mit einem Adjuvans vermischt und Tiere werden mit dem Gemisch immunisiert. Die Immunantwort des Tieres auf die Immunogenpräparation wird überwacht, indem Testblutproben genommen werden und der Reaktivitätstiter auf das Protein von Interesse bestimmt wird. Wenn geeignet hohe Antikörpertiter auf das Immunogen erhalten werden, wird Blut aus dem Tier gesammelt und es werden Antiseren hergestellt. Eine weitere Fraktionierung der Antiseren, um auf Antikörper, die zu dem Protein reaktiv sind, anzureichern, wird auf Wunsch durchgeführt (siehe z. B. Coligan, Current Protocols in Immunology, Wiley/Greene, NY (1991); und Harlow und Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, NY (1989)).
Antikörper, einschließlich Bindungsfragmente und rekombinante Einzelkettenversionen davon, gegen vorbestimmte Fragmente eines Proteins der vorliegenden Erfindung werden durch Immunisieren von Tieren, z. B. mit Konjugaten der Fragmente mit Trägerproteinen, wie oben beschrieben, erzeugt. Typischerweise ist das Immunogen von Interesse ein Protein mit wenigstens etwa 5 Aminosäuren, typischerweise ist das Protein 10 Aminosäuren lang, vorzugsweise 15 Aminosäuren lang und bevorzugter ist das Protein 20 Aminosäuren lang oder größer. Die Peptide werden typischerweise an ein Trägerprotein (z. B. als Fusionsprotein) gekoppelt oder werden rekombinant in einem Immunisierungsvektor exprimiert. Antigene Determinanten an Peptiden, an welche Antikörper binden, haben typischerweise eine Länge von 3 bis 10 Aminosäuren.
Monoklonale Antikörper werden aus Zellen hergestellt, die den gewünschten Antikörper sezernieren. Monoklonale Antikörper werden auf Bindung an ein Protein, von dem das Immunogen abgeleitet ist, durchgemustert. Spezifische monoklonale und polyklonale Antikörper werden üblicherweise eine Antikörperbindungsstelle mit einer Affinitätskonstante für ihr verwandtes monovalentes Antigen von wenigstens zwischen 10⁶–10⁷, üblicherweise wenigstens 10⁸, vorzugsweise wenigstens 10⁹, bevorzugter wenigstens 10¹⁰ und am bevorzugtesten 10¹¹ Liter/mol, haben.
In einigen Fällen ist es wünschenswert, monoklonale Antikörper aus verschiedenen Säugerwirten, z. B. Mäuse, Nager, Primaten, Menschen usw., herzustellen. Eine Beschreibung von Techniken zur Herstellung solcher monoklonaler Antikörper wird in Basic and Clinical Immunology, 4. Ausgabe, Sites et al., Herausg., Lange Medical Publications, Los Altos, CA und darin zitierten Literaturstellen; Harlow und Lane, Supra; Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, 2. Ausgabe, Academic Press, New York, NY (1986); und Kohler und Milstein, Nature 256: 495–497 (1975) gefunden. Kurz zusammengefasst, dieses Verfahren läuft ab, indem einem Tier ein Immunogen, das ein Protein der vorliegenden Erfindung umfasst, injiziert wird. Das Tier wird dann getötet und Zellen werden aus seiner Milz entnommen, welche mit Myelomzellen fusioniert werden. Das Resultat ist eine Hybridzelle oder ein „Hybridom", das zur Reproduktion in vitro fähig ist. Die Population von Hybridomen wird dann durchgemustert, um einzelne Klone zu isolieren, von denen jeder eine einzelne Antikörperspezies gegen das Immunogen sezerniert. Auf diese Weise sind die individuellen Antikörperspezies, die erhalten werden, die Produkte von immortalisierten und klonierten einzelnen B-Zellen aus dem immunen Tier, erzeugt als Reaktion auf eine spezifische Stelle, die an der immunogenen Substanz erkannt wird.
Andere geeignete Techniken involvieren eine Selektion von Bibliotheken von rekombinanten Antikörpern in einem Phagen oder ähnlichen Vektoren (siehe z. B. Huse et al., Science 246: 1275–1281 (1989); und Ward et al., Nature 341: 544–546 (1989); und Vaughan et al., Nature Biotechnology, 14: 309–314 (1996)). Alternativ können humane monoklonale Antikörper hoher Affinität aus transgenen Mäusen erhalten werden, die Fragmente der nicht-umgelagerten humanen schwere- und leichte-Kette-Ig-Loci umfassen (d. h. transgene Minilocus-Mäuse). Fishwild et al., Nature Biotech., 14: 845–851 (1996). Es können auch rekombinante Immunglobuline produziert werden. Siehe Cabilly, U.S. Patent Nr. 4,816,567 ; und Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 86: 10029–10033 (1989).
Die Antikörper dieser Erfindung werden auch für eine Affinitätschromatographie bei der Isolierung von Proteinen der vorliegenden Erfindung verwendet. Säulen werden hergestellt, z. B. mit den Antikörpern, die an einen festen Träger, z. B. Partikel, wie Agarose, Sephadex, oder dergleichen gebunden sind, wobei ein Zelllysat durch die Säule geführt wird, gewaschen wird und mit steigenden Konzentrationen eines milden Denaturierungsmittels behandelt wird, wodurch gereinigtes Protein freigesetzt wird.
Die Antikörper können verwendet werden, um Expressions-Bibliotheken nach bestimmten Expressionsprodukten, z. B. normales oder abnormales Protein, durchzumustern. Üblicherweise werden die Antikörper in einem solchen Verfahren mit einer Gruppierung markiert, die eine einfache Detektion des Vorliegens von Antigen durch Antikörperbindung erlaubt.
Antikörper, die gegen ein Protein der vorliegenden Erfindung entwickelt wurden, können auch verwendet werden, um anti-idiotypische Antikörper zu erzeugen. Sie sind zum Detektieren oder Diagnostizieren von verschiedenen pathologischen Zuständen, die mit dem Vorliegen der entsprechenden Antigene verbunden sind, einsetzbar.
Häufig werden die Proteine und Antikörper der vorliegenden Erfindung markiert, indem sie entweder kovalent oder nicht-kovalent mit einer Substanz verbunden werden, die für ein detektierbares Signal sucht. Es ist ein weiter Bereich von Markierungen und Konjugationstechniken bekannt und ausgiebig in der wissenschaftlichen und Patentliteratur beschrieben. Geeignete Markierungen umfassen Radionucleotide, Enzyme, Substrate, Cofaktoren, Inhibitoren, fluoreszierende Gruppierungen, chemilumineszierende Gruppierungen, magnetische Partikel und dergleichen.
Proteinimmunoassays
Mittel zum Detektieren der Proteine der vorliegenden Erfindung sind keine kritischen Aspekte der vorliegenden Erfindung. In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Proteine detektiert und/oder quantitativ bestimmt, indem ein beliebiger einer Reihe von gut anerkannten immunologischen Bindungsassays verwendet wird (siehe z. B. U.S. Patente 4,366,241 ; 4,376,100 ; 4,517,288 ; und 4,837,168 ). Für eine Übersicht der allgemeinen Immunoassays siehe auch Methods in Cell Biology, Bd. 37: Antibodies in Cell Biology, Asai, Herausg., Academic Press, Inc. New York (1993); Basic and Clinical Immunology, 7. Ausgabe, Stites & Terr, Herausg. (1991). Darüber hinaus können die Immunoassays der vorliegenden Erfindung in einer beliebigen von mehreren Konfigurationen durchgeführt werden, z. B. solche, für die eine Übersicht in Enzyme Immunoassay, Maggio, Herausg., CRC Press, Boca Raton, Florida (1980); Tijan, Practice and Theory of Enzyme Immunoassays, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Elsevier Science Publishers B. V., Amsterdam (1985); Harlow und Lane, oben; Immunoassays: A Practical Guide, Chan, Herausg, Academic Press, Orlando, FL (1987); Principles and Practice of Immunoassaysm, Price und Newman, Herausg., Stockton Press, NY (1991); und Non-isotopic Immunoassays, Ngo, Herausg., Plenum Press, NY (1988) gegeben wird. Immuno logische Bindungsassays (oder Immunoassays) verwenden typischerweise ein „Fangmittel", um spezifisch an den Analyten (in diesem Fall ein Protein der vorliegenden Erfindung) spezifisch zu binden und oft zu immobilisieren. Das Fangmittel ist eine Gruppierung, die spezifisch an den Analyten bindet. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Fangmittel ein Antikörper, der spezifisch ein Protein (Proteine) der vorliegenden Erfindung bindet. Der Antikörper kann durch ein beliebiges einer Reihe von Mitteln, die dem Fachmann auf dem Gebiet, wie es hierin beschrieben wird, bekannt sind, produziert werden.
Immunoassays verwenden oft auch ein Markierungsmittel, um spezifisch an den Bindungskomplex, der durch das Fangmittel und den Analyten gebildet wird, zu binden und diesen zu markieren. Das Markierungsmittel kann selbst eine der Gruppierungen sein, die den Antikörper-Analytenkomplex umfassen. Demnach kann das Markierungsmittel ein markiertes Protein der vorliegenden Erfindung oder ein markierter Antikörper, der spezifisch reaktiv zu einem Protein der vorliegenden Erfindung ist, sein. Alternativ kann das Markierungsmittel eine dritte Gruppierung, z. B. ein anderer Antikörper, der spezifisch an den Antikörper/Protein-Komplex bindet, sein.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Markierungsmittel ein zweiter Antikörper, der eine Markierung trägt. Alternativ kann dem zweiten Antikörper eine Markierung fehlen, aber er kann wiederum an einen markierten dritten Antikörper gebunden sein, der für Antikörper der Spezies spezifisch ist, aus dem der zweite Antikörper abgeleitet ist. Der zweite kann mit einer detektierbaren Gruppierung, z. B. Biotin, modifiziert sein, an welches ein drittes markiertes Molekül spezifisch binden kann, z. B. Enzym-markiertes Streptavidin.
Andere Proteine, die fähig sind, spezifisch konstante Immunglobulinregionen zu binden, z. B. Protein A oder Protein G, können ebenfalls als das Markierungsmittel verwendet werden. Diese Proteine sind normale Bestandteile der Zellwände von Streptococcenbakterien. Sie weisen eine starke nicht-immunogene Reaktivität mit konstanten Immunglobulinregionen aus einer Vielzahl von Spezies auf (Siehe allgemein Kronval, et al., J. Immunol. 111: 1401–1406 (1973) und Akerstrom et al., J. Immunol. 135: 2589–2542 (1985)).
Durch die Assays können Inkubations- und/oder Waschschritte nach jeder Kombination von Reagenzien erforderlich sein. Inkubationsschritte können von etwa 5 Sekunden bis mehrere Stunden, vorzugsweise von etwa 5 Minuten bis etwa 24 Stunden, variieren. Allerdings wird die Inkubationszeit vom Assayformat, Analyten, Lösungsvolumen, von Konzentrationen und dergleichen abhängen. Üblicherweise werden die Assays bei Umgebungstemperatur durchgeführt werden, obgleich sie über einen Temperaturbereich, z. B. 10°C bis 40°C, durchgeführt werden können.
Obgleich die Details der Immunoassays der vorliegenden Erfindung mit dem bestimmten verwendeten Format variieren können, umfasst das Verfahren zum Detektieren eines Proteins der vorliegenden Erfindung in einer biologischen Probe im Allgemeinen die Schritte des In-Kontakt-Bringens der biologischen Probe mit einem Antikörper, der unter immunologisch reaktiven Be dingungen spezifisch mit einem Protein der vorliegenden Erfindung reagiert. Der Antikörper wird unter immunologisch reaktiven Bedingungen an das Protein binden gelassen und das Vorliegen des gebundenen Antikörpers wird direkt oder indirekt detektiert.
A. Nicht-kompetitive Assay-Formate
Immunoassays zum Detektieren von Proteinen der vorliegenden Erfindung umfassen kompetitive und nicht-kompetitive Formate. Nicht-kompetitive Immunoassays sind Assays, in denen die Menge an gefangenem Analyten (d. h. ein Protein der vorliegenden Erfindung) direkt gemessen wird. In einem bevorzugten „Sandwich"-Assay kann das Fangmittel (z. B. ein Antikörper, der unter immunreaktiven Bedingungen mit einem Protein der vorliegenden Erfindung spezifisch reaktiv ist) direkt an ein festes Substrat gebunden werden, wo sie immobilisiert werden. Diese immobilisierten Antikörper fangen dann das Protein, das in der Testprobe vorliegt. Das so immobilisierte Protein wird dann durch ein Markierungsmittel, z. B. einen zweiten Antikörper, der eine Markierung trägt, gebunden. Alternativ kann dem zweiten Antikörper eine Markierung fehlen, er kann aber wiederum an einen markierten dritten Antikörper gebunden werden, der für die Antikörper der Spezies, aus dem der zweite Antikörper stammt, spezifisch ist. Der zweite kann mit einer detektierbaren Gruppierung, z. B. Biotin, modifiziert sein, an welche ein drittes markiertes Molekül spezifisch binden kann, z. B. Enzym-markiertes Streptavidin.
B. Kompetitive Assay-Formate
In kompetitiven Assays wird die Menge an Analyt, der in der Probe vorliegt, indirekt gemessen, indem die Menge eines zugesetzten (exogenen) Analyten (z. B. ein Protein der vorliegenden Erfindung) von einem Fangmittel (z. B. ein Antikörper, der unter immunreaktiven Bedingungen mit dem Protein spezifisch reaktiv ist) durch den in der Probe vorliegenden Analyten verdrängt wird (durch Wettbewerb entfernt wird). In einem kompetitiven Assay wird eine bekannte Menge an Analyt zu der Probe gegeben und die Probe wird dann mit einem Fangmittel, das spezifisch ein Protein der vorliegenden Erfindung bindet, in Kontakt gebracht. Die Menge an Protein, die an das Fangmittel gebunden ist, ist umgekehrt proportional zu der Konzentration an Analyt, die in der Probe vorliegt.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird der Antikörper an einem festen Substrat immobilisiert. Die Menge an Protein, die an dem Antikörper gebunden ist, kann entweder durch Messen der Proteinmenge, die in einem Protein/Antikörper-Komplex vorliegt oder alternativ durch Messen der Menge an restlichem unkomplexiertem Protein bestimmt werden. Die Proteinmenge kann detektiert werden, indem ein markiertes Protein bereitgestellt wird.
Ein Hapteninhibierungsassay ist ein anderer bevorzugter kompetitiver Assay. In diesem Assay wird ein bekannter Analyt (z. B. ein Protein der vorliegenden Erfindung) an einem festen Substrat immobilisiert. Eine bekannte Menge an Antikörper, der unter immunreaktiven Bedingungen mit dem Protein spezifisch reaktiv ist, wird der Probe zugesetzt und die Probe wird dann mit dem immobilisierten Protein in Kontakt gebracht. In diesem Fall ist die Menge an Antikörper, die an das immobilisierte Protein gebunden ist, umgekehrt proportional zu der Menge an Protein, die in der Probe vorliegt. Wiederum kann die Menge an immobilisiertem Antikörper detektiert werden, indem entweder die immobilisierte Antikörperfraktion oder die Fraktion des Antikörpers, die in Lösung bleibt, detektiert wird. Eine Detektion kann direkt sein, wenn der Antikörper markiert ist, oder durch die anschließende Zugabe einer markierten Gruppierung, die spezifisch an den Antikörper bindet, wie es oben beschrieben wurde, indirekt sein.
C. Erzeugung von gepoolten Antiseren zur Verwendung in Immunoassays
Ein Protein, das spezifisch an einen Antikörper bindet oder das spezifisch immunreaktiv mit einem Antikörper ist, der gegen ein definiertes Immunogen erzeugt wurde, wird in einem Immunoassay bestimmt. Der Immunoassay verwendet ein polyklonales Antiserum, welches gegen ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung (d. h. das immunogene Polypeptid) entwickelt wurde. Dieses Antiserum wird so gewählt, dass es eine niedrige Kreuzreaktivität gegen andere Proteine hat und eine beliebige solche Kreuzreaktivität durch Immunoabsorption vor Verwendung im Immunoassay (z. B. durch Immunsorbtion der Antiseren mit einem Protein mit unterschiedlicher Substratspezifität (z. B. ein anderes Enzym) und/oder einem Protein mit derselben Substratspezifität, aber in anderer Form) entfernt wird.
Um Antisera zur Verwendung in einem Immunoassay zu produzieren, wird ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung isoliert, wie es hierin beschrieben ist. Beispielsweise kann ein rekombinantes Protein in einer Säuger- oder einer anderen eukaryotischen Zelllinie produziert werden. Ein Inzuchtstamm von Mäusen wird unter Verwendung eines Standardadjuvans, z. B. Freund's-Adjuvans, und unter Verwendung eines Standard-Mausimmunisierungsprotokolls (siehe Harlow und Lane, oben) mit dem Protein immunisiert. Alternativ wird ein synthetisches Polypeptid, das von den hierin offenbarten Sequenzen abgeleitet ist und an ein Trägerprotein konjugiert ist, als Immunogen verwendet. Polyklonale Seren werden gesammelt und gegen das immunogene Polypeptid in einem Immunoassay, z. B. in einem Festphasenimmunoassay, mit dem an einem festen Träger immobilisierten Immunogen getitert. Polyklonale Antisera mit einem Titer von 10⁴ oder größer werden gesammelt und auf ihre Kreuzreaktivität gegen Polypeptide unterschiedlicher Formen oder Substratspezifität getestet, wobei ein kompetitiver Bindungsimmunoassay verwendet wird, z. B. der, der bei Harlow und Lane, oben, auf den Seiten 570–573 beschrieben ist. Vorzugsweise werden zwei oder mehr unterschiedliche Formen von Polypeptiden bei dieser Bestimmung verwendet. Diese unterschiedlichen Typen von Polypeptiden werden als Kompetitoren eingesetzt, um Antikörper zu identifizieren, die durch das Polypeptid, auf das analysiert wird, spezifisch gebunden werden. Die kompetitiven Polypeptide können als rekombinante Proteine produziert werden und unter Verwendung von Standard-Molekularbiologie- und Standard-Proteinchemie-Techniken, wie sie hierin beschrieben werden, isoliert werden.
Immunoassays im kompetitiven Bindungsformat werden für Kreuzreaktivitätsbestimmungen verwendet. Beispielsweise wird das immunogene Polypeptid an einem festen Träger immobilisiert. Proteine, die dem Assay zugesetzt werden, kompetitieren mit der Bindung der Antiseren gegen das immobilisierte Antigen. Die Fähigkeit der obigen Proteine, um die Bindung der Antise ren gegen das immobilisierte Protein zu kompetitieren, wird mit dem immunogenen Polypeptid verglichen. Die prozentuale Kreuzreaktivität für die obigen Proteine wird errechnet, wobei Standardberechnungen verwendet werden. Solche Antiseren mit weniger als 10% Kreuzreaktivität mit einer unterschiedlichen Form eines Polypeptids werden ausgewählt und gepoolt. Die kreuzreagierenden Antikörper werden dann durch Immunabsorption mit einer unterschiedlichen Form eines Polypeptids aus den gepoolten Antiseren entfernt.
Die immunoabsorbierten und gepoolten Antiseren werden dann in einem kompetitiven Bindungsimmunoassay, wie er hierin beschrieben wird, eingesetzt, um ein zweites „Target"-Polypeptid mit dem immunogenen Polypeptid zu vergleichen. Um diesen Vergleich durchzuführen, werden die zwei Polypeptide jeweils in einem weiten Konzentrationsbereich analysiert und die Menge jedes Polypeptids, die erforderlich ist, um 50% der Bindung der Antiseren an das immobilisierte Protein zu inhibieren, wird unter Verwendung von Standardtechniken bestimmt. Wenn die Menge des Target-Polypeptids, die erforderlich ist, weniger als die zweifache Menge des immunogenen Polypeptids, die erforderlich ist, ist, dann wird gesagt, dass das Target-Polypeptid spezifisch an einen Antikörper, der gegen das immunogene Protein erzeugt wurde, bindet. Als abschließende Spezifitätsbestimmung wird das gepoolte Antiserum vollständig mit dem immunogenen Polypeptid immunsorbiert, bis keine Bindung an das verwendete Polypeptid bei der Immunsorbtion detektierbar ist. Das vollständig immunsorbierte Antiserum wird dann auf Reaktivität mit dem Test-Polypeptid untersucht. Wenn keine Reaktivität beobachtet wird, dann wird das Test-Polypeptid durch das Antiserum, das durch das immunogene Protein hervorgerufen wurde, spezifisch gebunden.
D. Andere Assay-Formate
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird eine Western-Blot (Immunoblot)-Analyse verwendet, um das Vorliegen von Protein der vorliegenden Erfindung in der Probe zu detektieren und zu quantifizieren. Die Technik umfasst im Allgemeinen ein Trennen von Probenproteinen durch Gelelektrophorese auf der Basis des Molekulargewichts, Transferieren der getrennten Proteine auf einen geeigneten festen Träger (z. B. ein Nitrocellulosefilter, ein Nylonfilter oder ein derivatisiertes Nylonfilter) und Inkubieren der Probe mit den Antikörpern, die ein Protein der vorliegenden Erfindung spezifisch binden. Die Antikörper binden spezifisch an das Protein auf dem festen Träger. Diese Antikörper können direkt markiert sein oder können alternativ anschließend unter Verwendung von markierten Antikörpern (z. B. markierte Schaf-Anti-Maus-Antikörper), die spezifisch an die Antikörper binden, detektiert werden.
E. Quantifizierung von Proteinen
Die Proteine der vorliegenden Erfindung können durch ein beliebiges einer Reihe von Mitteln, die dem Fachmann gut bekannt sind, detektiert und quantifiziert werden. Diese umfassen analytische biochemische Verfahren, wie z. B. Elektrophorese, Kapillarelektrophorese, Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC), Dünnschichtchromatographie (TLC), Hyperdiffusionschromatographie und dergleichen, und verschiedene immunologische Verfahren, z. B. Flüs sigkeits- oder Gelprecipitinreaktionen, Immunodiffusion (einzelne oder doppelte), Immunoelektrophorese, Radioimmunoassays (RIAs), enzymgekoppelte Immunadsorptionsassays (ELISA), Immunfluoreszenzassays und dergleichen.
F. Reduktion einer nicht-spezifischen Bindung
Ein Fachmann wird erkennen, dass es oft wünschenswert ist, eine nicht-spezifische Bindung in Immunoassays und während einer Analytenreinigung zu reduzieren. Wenn der Assay ein Antigen, einen Antikörper oder ein anderes Fangmittel, immobilisiert auf einem festen Träger involviert, ist es wünschenswert, die Menge an nicht-spezifischer Bindung an dem Substrat zu minimieren. Mittel zur Reduzierung einer solchen nicht-spezifischen Bindung sind dem Fachmann gut bekannt. Typischerweise involviert dies ein Beschichten des Substrats mit einer proteinartigen Zusammensetzung. In großem Umfang werden insbesondere Proteinzusammensetzungen, z. B. Rinderserumalbumin (BSA), Nicht-Fett-Milchpulver und Gelatine verwendet.
G. Immunoassay Markierungen
Das Markierungsmittel kann z. B. ein monoklonaler Antikörper, ein polyklonaler Antikörper, ein Bindungsprotein oder ein Komplex oder ein Polymer, z. B. eine Affinitätsmatrix, Kohlenhydrat oder Lipid sein. Detektierbare Markierungen, die zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet sind, umfassen eine beliebige Zusammensetzung, die durch spektroskopische, Radioisotopen-, photochemische, biochemische, immunochemische, elektrische, optische oder chemische Mittel detektierbar ist. Eine Detektion kann durch ein beliebiges bekanntes Verfahren, z. B. Immunoblotting, Western-Analyse, Gelmobilitätsverschiebungsassays, Fluoreszenz-in situ-Hybridisierungsanalyse (FISH), Verfolgung von radioaktiven oder biolumineszierenden Markern, kernmagnetische Resonanz, elektronenparamagnetische Resonanz, Spektroskopie mit gestopptem Fluss, Säulenchromatographie, Kapillarelektrophorese oder durch andere Verfahren, die ein Molekül auf der Basis einer Änderung in Größe und/oder Ladung verfolgen, erfolgen. Die bestimmte Markierung oder die bestimmte detektierbare Gruppe, die in dem Assay verwendet wird, ist kein kritischer Aspekt der Erfindung. Die detektierbare Gruppe kann ein beliebiges Material mit einer detektierbaren physikalischen oder chemischen Eigenschaft sein. Solche detektierbaren Markierungen sind auf dem Gebiet der Immunoassays gut entwickelt und im Allgemeinen kann eine beliebige Markierung, die in solchen Verfahren verwendbar ist, auf die vorliegende Erfindung angewendet werden. Somit ist eine Markierung eine beliebige Zusammensetzung, die durch spektroskopische, photochemische, biochemische, immunochemische, elektrische, optische oder chemische Mittel detektierbar ist. Verwendbare Markierungen in der vorliegenden Erfindung umfassen magnetische Perlen, Fluoreszenzfarbstoffe, radioaktive Markierungen, Enzyme und kolorimetrische Markierungen oder gefärbte Glas- oder Kunststoffperlen, wie sie oben für Nucleinsäuremarkierungen diskutiert wurden.
Die Markierung kann nach Verfahren, die auf dem Fachgebiet gut bekannt sind, direkt oder indirekt an die gewünschte Komponente des Assays gekoppelt werden. Wie oben angegeben wurde, kann eine weite Vielzahl von Markierungen verwendet werden, wobei die Wahl der Markierung von der erforderlichen Sensitivität, der Einfachheit der Konjugation der Verbindung, Stabilitätsanforderungen, verfügbaren Instrumenten und Entsorgungsvorschriften abhängt.
Nicht-radioaktive Markierungen werden oft durch indirekte Mittel gebunden. Im Allgemeinen wird ein Ligandenmolekül (z. B. Biotin) kovalent an das Molekül gebunden. Der Ligand bindet dann an ein Anti-Liganden (z. B. Streptavidin)-Molekül, welches entweder inhärent detektierbar ist oder kovalent an ein Signalsystem, z. B. ein detektierbares Enzym, eine fluoreszierende Verbindung oder eine chemilumineszierende Verbindung, gebunden ist. Es kann eine Reihe von Liganden und Anti-Liganden verwendet werden. Wenn ein Ligand einen natürlichen Anti-Liganden hat, z. B. Biotin, Thyroxin und Cortisol, kann er in Verbindung mit dem markierten, natürlich vorkommenden Anti-Liganden verwendet werden. Alternativ kann eine Hapten- oder Antigenverbindung in Kombination mit einem Antikörper verwendet werden.
Die Moleküle können auch direkt mit Signal erzeugenden Verbindungen konjugiert werden, z. B. durch Konjugation mit einem Enzym oder Fluorophor. Enzyme von Interesse als Markierungen werden in erster Linie Hydrolasen, insbesondere Phosphatasen, Esterasen und Glycosidasen oder Oxidoreduktasen, insbesondere Peroxidasen, sein. Fluoreszierende Verbindungen umfassen Fluorescein und seine Derivate, Rhodamin und seine Derivate, Dansyl, Umbelliferon usw. Chemilumineszierende Verbindungen umfassen Luceriferin und 2,3-Dihydrophathalazindione, z. B. Luminol. Für eine Übersicht über verschiedene Markierungs- oder Signal-produzierende Systeme, die verwendet werden können, siehe U.S. Patent Nr. 4,391,904 , welches hier durch Bezugnahme aufgenommen wird.
Mittel zum Detektieren von Markierungen sind dem Fachmann gut bekannt. Wenn die Markierung z. B. eine radioaktive Markierung ist, so umfassen Mittel zur Detektion einen Szintillationszähler oder einen photographischen Film, wie bei Autoradiographie. Wenn die Markierung eine fluoreszierende Markierung ist, kann sie durch Anregen des Fluorochroms mit dem Licht geeigneter Wellenlänge und Detektieren der resultierenden Fluoreszenz, z. B. durch Mikroskopie, Untersuchung mit den Augen, über photographischen Film, durch die Verwendung von elektronischen Detektoren, z. B. mit Ladung gekoppelten Vorrichtungen (CCDs) oder Photomultiplier und dergleichen detektiert werden. In ähnlicher Weise können enzymatische Markierungen durch Bereitstellung geeigneter Substrate für das Enzym und Detektieren des resultierenden Reaktionsprodukts detektiert werden. Schließlich können einfache kolorimetrische Markierungen in einfacher Weise durch Betrachten der Farbe, die mit der Markierung assoziiert ist, detektiert werden. So erscheint in verschiedenen Dipstick-Assays gold oft pinkfarben, während verschiedene konjugierte Perlen die Farbe der Perlen zeigen.
Einige Assay-Formate erfordern keine Verwendung von markierten Komponenten. Beispielsweise können Agglutinationsassays verwendet werden, um das Vorliegen der Target-Antikörper zu detektieren. In diesem Fall werden mit Antigen überzogene Partikel durch Proben, die die Target-Antikörper umfassen, agglutiniert. In diesem Format muss keine der Komponenten markiert werden und das Vorliegen des Target-Antikörpers wird durch einfache visuelle Inspektion detektiert.
Assays auf Verbindungen, die die enzymatische Aktivität oder die Expression modulieren
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf Mittel zur Identifizierung von Verbindungen, die an (z. B. Substrate) katalytisch aktive Polypeptide der vorliegenden Erfindung binden und/oder die enzymatische Aktivität von katalytisch aktiven Polypeptiden der vorliegenden Erfindung erhöhen oder verringern (d. h. modulieren). Das Verfahren umfasst In-Kontakt-Bringen eines Polypeptids der vorliegenden Erfindung mit einer Verbindung, deren Fähigkeit, Enzymaktivität zu binden oder zu modulieren, bestimmt werden soll. Das verwendete Polypeptid wird wenigstens 20%, vorzugsweise wenigstens 30% oder 40%, bevorzugter wenigstens 50% oder 60% und am bevorzugtesten wenigstens 70% oder 80% der spezifischen Aktivität des nativen Volllängen-Polypeptids der vorliegenden Erfindung (z. B. Enzym) haben. Im Allgemeinen wird das Polypeptid in einem Bereich vorliegen, der ausreichend ist, um die Wirkung der Verbindung zu bestimmen, typischerweise etwa 1 nM bis 10 μM. Entsprechend wird die Verbindung in einer Konzentration von etwa 1 nM bis 10 μM vorliegen. Der Fachmann wird einsehen, dass solche Faktoren wie Enzymkonzentration, Ligandenkonzentrationen (d. h. Substrate, Produkte, Inhibitoren, Aktivatoren), pH, Ionenstärke und Temperatur so kontrolliert werden, dass verwendbare Kinetikdaten erhalten werden und das Vorliegen oder Fehlen einer Verbindung, die Polypeptidaktivität bindet oder moduliert, bestimmen. Verfahren zur Messung der Enzymkinetik sind auf dem Fachgebiet gut bekannt. Siehe z. B. Segel, Biochemial Calculations, 2. Ausgabe, John Wiley and Sons, New York (1976).
Obgleich die vorliegende Erfindung detailliert durch Erläuterungen und Beispiele zu Zwecken des Verständnisses beschrieben wurde, wird es klar sein, dass bestimmte Änderungen und Modifikationen im Rahmen der beigefügten Ansprüche durchgeführt werden können.
Beispiel 1
Dieses Beispiel beschreibt die Konstruktion von cDNA-Bibliotheken
Gesamt-RNA-Isolierung
Gesamt-RNA wurde aus Maisgeweben mit TRIzol-Reagens (Life Technology Inc. Gaithersburg, MD) unter Verwendung einer Modifikation des Guanidinisocyanat/Säure-Phenol-Verfahrens, beschrieben von Chomczynski und Sacchi (Chomczynski, P. und Sacchi, N. Anal. Biochem. 162, 156 (1987)), isoliert. Kurz ausgedrückt, Pflanzengewebeproben wurden in flüssigem Stickstoff vor Zugabe des TRIzol-Reagenses pulverisiert und dann mit einem Mörser und Pistill weiter homogenisiert. Der Zusatz von Chloroform, gefolgt von einer Zentrifugation, wurde zur Trennung einer wässrigen Phase und einer organischen Phase durchgeführt. Die Gesamt-RNA wurde durch Präzipitation mit Isopropylalkohol aus der wässrigen Phase gewonnen.
Poly(A)+ RNA-Isolierung
Die Auswahl von Poly(A)+RNA aus Gesamt-RNA wurde unter Verwendung eines PolyATact-Sytems (Promega Corporation, Madison, WI) durchgeführt. Kurz ausgedrückt, biotinylierte Oligo(dT)-Primer wurden verwendet, um an die 3'-Poly(A)-Tails an mRNA zu hybridisieren. Die Hybride wurden unter Verwendung von Streptavidin, gekoppelt an paramagnetische Partikel, und eines magnetischen Trennungsstands gefangen. Die mRNA wurde unter Bedingungen hoher Stringenz gewaschen und mit RNase-freiem entionisiertem Wasser eluiert.
Konstruktion einer cDNA-Bibliothek
Eine cDNA-Synthese wurde durchgeführt und unidirektionale cDNA-Bibliotheken wurden unter Verwendung des SuperScript-Plasmidsystems (Life Technology Inc. Gaithersburg, MD) konstruiert. Der erste cDNA-Strang wurde synthetisiert, indem ein Oligo(dT)-Primer, der eine NotI-Stelle enthielt, geprimt wurde. Die Reaktion wurde durch SuperScript-reverse Transkriptase II bei 45°C katalysiert. Der zweite cDNA-Strang wurde mit alpha-³²P-dCTP markiert und ein Teil der Reaktion wurde durch Agarosegelelektrophorese analysiert, um die cDNA-Größen zu bestimmen. cDNA-Moleküle, die kleiner als 500 Basenpaare waren und nicht-ligierte Adapter wurden durch Sephacryl-S400-Chromatographie entfernt. Die ausgewählten cDNA-Moleküle wurden zwischen NotI- und SalI-Stellen in den pSPORT1-Vektor ligiert.
Beispiel 2
Dieses Beispiel beschreibt eine cDNA-Sequenzierung und eine Bibliothekssubtraktion
Sequenzierung einer Matrizenpräparation
Einzelne Kolonien wurden herausgenommen bzw. angeimpft und DNA wurde entweder durch PCR mit M13-Vorwärtsprimer und M13-Rückwärtsprimern oder durch Plasmidisolierung hergestellt. Alle cDNA-Klone wurden unter Verwendung von M13-Rückwärtsprimern sequenziert.
Q-bot-Subtraktionsverfahren
cDNA-Bibliotheken, die einem Subtraktionsverfahren unterzogen worden waren, wurden auf einer 22 × 22 cm²-Agarplatte in einer Dichte von etwa 3000 Kolonien pro Platte ausplattiert. Die Platten wurden für 12–24 Stunden in einem 37°C-Inkubator inkubiert. Kolonien wurden in 384-Well-Platten mit einem Kolonien-Picker-Roboter, Q-bot (GENETIX Limited), aufgenommen. Diese Platten wurden über Nacht bei 37°C inkubiert.
Sobald ausreichend Kolonien abgeimpft waren, wurden sie auf 22 × 22 cm²-Nylonmembranen unter Verwendung des Q-bot gebracht. Jede Membran enthielt 9216 Kolonien oder 36864 Kolonien. Diese Membranen wurden auf eine Agarplatte mit geeignetem Antibiotikum gelegt. Die Platten wurden über Nacht bei 37°C inkubiert.
Nachdem die Kolonien am zweiten Tag isoliert worden waren, wurden diese Filter auf mit Denaturierungslösung vorbefeuchtetes Filterpapier für vier Minuten gelegt, dann wurden sie auf einem siedenden Wasserbad für weitere vier Minuten inkubiert. Die Filter wurden dann für vier Minuten auf mit Neutralisierungslösung vorbefeuchtetes Filterpapier gelegt. Die überschüssige Lösung wurde entfernt, indem die Filter für eine Minute auf trockene Filterpapiere gelegt wurden, die Kolonienseite der Filter wurde in Proteinase K-Lösung gelegt, wurde für 40–50 Minuten bei 37°C inkubiert. Die Filter wurden auf trockene Filterpapiere gelegt, um über Nacht zu trocknen. DNA wurde durch UV-Licht-Behandlung an eine Nylonmembran vernetzt.
Eine Koloniehybridisierung wurde durchgeführt, wie sie von Sambrook, J., Fritsch, E. F. und Maniatis, T., (in Molecular Cloning: A laboratory Manual, 2. Auflage), beschrieben ist. Die folgenden Sonden wurden bei der Kolonienhybridisierung verwendet:

1. cDNA des ersten Strangs aus demselben Gewebe wie die Bibliothek wurde hergestellt, um die meisten redundanten Klone zu entfernen.
2. 48–192 am stärksten redundante cDNA-Klone aus derselben Bibliothek, basierend auf früheren Sequenzierungsdaten.
3. 192 stark redundante cDNA-Klone in der gesamten Mais-Partialsequenz-Datenbank.
4. Ein Sal-A20-Oligonucleotid: TCG ACC CAC GCG TCC GAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA entfernt Klone, die einen Poly A-Tail, aber keine cDNA enthalten.
5. cDNA-Klone, die von rRNA abgeleitet sind.

Das Bild der Autoradiographie wurde in einen Computer gescannt und die Signalintensität und die Bezeichnungen der kalten Kolonie wurden für jede Kolonie analysiert. Ein Rearraying von kalten Kolonien aus 384 Well-Platten zu 96 Well-Platten wurde unter Verwendung des Q-bot durchgeführt.
Beispiel 3
Dieses Beispiel beschreibt die Identifizierung des Gens aus einer Computer-Homologiesuche. Genidentitäten wurden durch Durchführung von BLAST (Basic Local Alignment Search Tool; Altschul, S. F., et al., (1993) J. Mol. Biol. 215: 403–410; Siehe auch www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST-Suchen unter Default-Parametern für Similarität für Sequenzen, die in der BLAST-„nr"-Datenbank (umfasst alle nicht-redundanten GenBank-CDS-Translationen, Sequenzen, die aus der dreidimensionalen Struktur-Brookhaven Protein-Datenbank, der letzten Hauptausgabe der SWISS-PROT-Proteinsequenz-Datenbank, EMBL und DDBJ-Datenbanken stammen) enthalten sind, durchgeführt. Die cDNA-Sequenzen wurden auf Ähnlichkeit mit allen öffentlich zugänglichen DNA-Sequenzen, die in der „nr"-Datenbank enthalten sind, analysiert, wobei der BLASTN-Algorithmus verwendet wurde. Die DNA-Sequenzen wurden in alle Leseraster translatiert und auf Similarität mit allen öffentlich zugänglichen Proteinsequenzen, die in der „nr"-Datenbank enthalten sind, unter Verwendung des BLASTX-Algorithmus (Gish, W. und States, D. J. (1993) Nature Genetics 3: 266–272), bereitgestellt von NCBI, verglichen. In einigen Fällen wurden die Sequenzierungsdaten aus zwei oder mehr Klonen, die überlappende DNA-Segmente enthielten, verwendet, um fortlaufende DNA-Sequenzen zu konstruieren.
Die obigen Beispiele werden bereitgestellt, um die Erfindung zu erläutern, aber nicht um ihren Umfang zu beschränken. Einem Fachmann auf dem Fachgebiet werden andere Varianten der Erfindung leicht klar werden und werden durch die beigefügten Ansprüche umfasst.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Isolierte Cellulosesynthase-Nucleinsäure, die ein Polypeptid mit Cellulosesynthaseaktivität codiert und umfasst: (a) ein Polynucleotid von SEQ ID NO: 5, 9 oder 25; oder (b) ein Polynucleotid, das ein Polypeptid von SEQ ID NO: 6, 10 oder 26 codiert.
Rekombinante Expressionskassette, umfassend eine Nucleinsäure nach Anspruch 1, funktionell verknüpft mit einem Promotor.
Expressionskassette nach Anspruch 2, wobei der Promotor ein Promotor mit Gewebebevorzugung ist.
Wirtszelle, umfassend eine heterologe Expressionskassette nach Anspruch 2 oder 3.
Wirtszelle nach Anspruch 4, die eine Pflanzenzelle ist.
Transgene Pflanze, umfassend eine heterologe Expressionskassette nach Anspruch 2 oder 3.
Transgene Pflanze nach Anspruch 6, wobei die Pflanze eine Monokotyle ist.
Transgene Pflanze nach Anspruch 6, wobei die Pflanze ausgewählt ist aus Mais, Sojabohne, Sonnenblume, Sorghum, Canola-Raps, Weizen, Alfalfa, Baumwolle, Reis, Gerste und Hirse.
Transgener Samen aus der transgenen Pflanze nach Anspruch 6, 7 oder 8, wobei der Samen eine heterologe Expressionskassette nach Anspruch 2 oder 3 umfasst.
Verfahren zum Modulieren des Levels der Cellulosesynthase in einer Pflanzenzelle, die zur Pflanzenneubildung befähigt ist, umfassend: (a) Transformieren der Pflanzenzelle mit einer Expressionskassette, umfassend eine Cellulosesynthase-Nucleinsäure nach Anspruch 1, funktionell verknüpft mit einem Promotor; (b) Kultivieren der transformierten Pflanzenzelle; (c) Exprimieren des Polynucleotids für eine Zeit, die ausreichend ist, um den Level der Cellulosesynthase in der transformierten Pflanzenzelle zu modulieren.
Verfahren zum Produzieren einer transgenen Pflanze, in der der Level der Cellulosesynthase durch eine Cellulosesynthase-Nucleinsäure nach Anspruch 1 moduliert ist, umfassend das Transformieren einer Pflanzenzelle mit einer Expressionskassette, umfassend die Nucleinsäure, funktionell verknüpft mit einem Promotor, und das Neubilden einer Pflanze, umfassend die Expressionskassette, aus der transformierten Zelle.
Verfahren nach Anspruch 10 oder 11, wobei die Pflanze ausgewählt ist aus Mais, Sojabohne, Sonnenblume, Canola-Raps, Weizen, Alfalfa, Baumwolle, Reis, Gerste und Hirse.
Verfahren nach Anspruch 10, 11 oder 12, wobei der Promotor ein Promotor mit Gewebebevorzugung ist.
Verfahren nach Anspruch 10, 11, 12, oder 13, in dem der Level der Cellulosesynthase in Relation zu demjenigen in der Pflanzenzelle vor der Transformation erhöht wird.
Verfahren nach Anspruch 11, weiterhin umfassend das Erhalten einer Nachkommen- oder Mutantenpflanze aus der neugebildeten Pflanze, wobei die Nachkommen- oder Mutantenpflanze die Expressionskassette umfasst.
Verfahren nach Anspruch 11, weiterhin umfassend: Bereitstellen einer Pflanze, die durch das Verfahren nach Anspruch 11 erhalten wurde, welche heterozygot für die Nucleinsäure nach Anspruch 1 ist; und Erhalten einer Pflanze, die für das Polynucleotid homozygot ist, durch Selbstung der heterozygoten transgenen Pflanze, Keimenlassen einiger der erzeugten Samen und Analysieren der resultierenden Pflanzen hinsichtlich veränderter Expression des Polynucleotids in Relation zu einer Kontrollpflanze oder durch Rückkreuzen mit einer Elternpflanze oder Auskreuzen mit einer nicht-transgenen Pflanze.
Pflanze nach Anspruch 6, 7 oder 8, die für die Nucleinsäure nach Anspruch 1, enthalten in der heterologen Expressionskassette, homozygot ist.
Isoliertes Protein mit Cellulosesynthaseaktivität und ausgewählt aus: (a) einem Polypeptid von SEQ ID NO: 6, 10 oder 26; und (b) einem Polypeptid, das durch eine Nucleinsäure nach Anspruch 1 codiert wird.