ES2296405T3 - Celulosas sintasa del maiz y su utilizacion. - Google Patents

Abstract

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Description

Celulosas sintasa del maíz y su utilización.

Campo técnico

La presente invención se refiere en general a la biología molecular de las plantas. Más específicamente, se refiere a ácidos nucleicos y a métodos para modular su expresión en plantas.

Antecedentes de la invención

Los polisacáridos constituyen el grueso de las paredes celulares de las plantas y se han clasificado tradicionalmente en tres categorías: celulosa, hemicelulosa, y pectina. Fry, S. C. (1.988), The growing plant cell wall: Chemical and metabolic analysis. New York: Longman Scientific & Technical. Mientras la celulosa se elabora en la membrana plasmática y se dispone directamente en la pared celular, los polímeros hemicelulósicos y pécticos se elaboran primero en el aparato de Golgi y después se exportan a la pared celular mediante exocitosis. Ray, P. M., et al., (1.976), Ber. Deutsch. Bot. Ges. Bd. 89, 121-146. La variedad de enlaces químicos en los polisacáridos pécticos y hemicelulósicos indica que debe haber decenas de polisacárido sintetasas en el aparato de Golgi. Darvill et al., (1.980). The primary cell walls of flowering plants. In The Plant Cell (N. E. Tolbert, ed.), Vol. 1 en la Serie: The biochemistry of plants: A comprehensive treatise, eds. P.K. Stumpf y E.E. Conn (New York: Academic Press), págs. 91-162.

La celulosa, en virtud de su capacidad para formar microfibrillas semicristalinas, tiene una resistencia a la tracción muy elevada que se aproxima a la de algunos metales. Niklas, K. J. (1.992). Plant Biomechanics: An engineering approach to plant form and function, The University of Chicago Press, pp. 607. Se ha encontrado que la resistencia a la flexión del tallo de la cebada normal y de los mutantes de tallo quebradizo está directamente correlacionada con la concentración de celulosa en la pared celular. Kokubo, et al., (1.989), Plant Physiology 91, 876-882; Kokubo, et al., (1.991) Plant Physiology 97, 509-514.

Incluso aunque la composición de azúcar y polisacáridos de las paredes celulares de la planta ha sido bien caracterizada, se ha hecho un avance muy limitado hacia la identificación de las enzimas implicadas en la formación de polisacáridos, siendo la razón su naturaleza lábil y recalcitrante a la solubilización por los detergentes disponibles.

Se han realizado reivindicaciones esporádicas para la identificación de la celulosa sintasa de fuentes vegetales a lo largo de los años. Callaghan, T., y Benziman, M. (1.984), Nature 311, 165-167; Okuda, et al., (1.993), Plant Physiol. 101, 1131-1142. No obstante, estas reivindicaciones se han satisfecho con escepticismo. Callaghan, T., y Benziman, M. (1.985), Nature 314. 383-384; Delmer, et al., (1.993), Plant Physiol. 103, 307-308. Sólo recientemente fue clonado un supuesto gen para las celulosa sintasas vegetales (CelA) a partir del desarrollo de fibras de algodón basadas en la homología con el gen bacteriano. Pear, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 93, 12637-12642; Saxena, et al., (1.990), Plant Molecular Biology 15, 673-684; véase también, la publicación WO 9818949. La publicación WO 9800549 también proporciona genes que codifican los polipéptidos implicados en la biosíntesis de celulosa en las plantas.

Puesto que el tallo quebradizo es el principal problema de la cría de maíz, lo que se necesita en la técnica son composiciones y métodos para manipular la concentración de celulosa en la pared celular y vigilar de ese modo la calidad del tronco de la planta para un mejor sostenimiento o ensilaje. La presente invención proporciona estas y otras ventajas.

Compendio de la invención

Generalmente, el objeto de la presente invención es proporcionar ácidos nucleicos y proteínas relacionados con las celulosa sintasas. Un objeto de la presente invención es proporcionar: 1) ácidos nucleicos y proteínas relacionados con las celulosa sintasas del maíz; 2) plantas transgénicas que comprenden los ácidos nucleicos de la presente invención; 3) métodos para modular en una planta transgénica, la expresión de los ácidos nucleicos de la presente invención.

Por lo tanto, en un aspecto, la presente invención proporciona un ácido nucleico de celulosa sintasa aislado que codifica un polipéptido que tiene actividad de celulosa sintasa y que comprende:

(a) un polinucleótido del SEQ ID NO: 5, 9 o 25;

(b) un polinucleótido que codifica un polipéptido del SEQ ID NO: 6, 10 o 26.

El ácido nucleico aislado puede ser ADN o ARN.

En otro aspecto, la presente invención hace referencia a casetes de expresión recombinantes, que comprenden un ácido nucleico de la presente invención conectado operablemente a un promotor. En algunas realizaciones, el ácido nucleico está conectado operablemente en orientación antisentido al promotor.

En otro aspecto, la presente invención está dirigida a una célula anfitriona transfectada con la casete de expresión recombinante. Preferiblemente, la célula es una célula vegetal.

En un aspecto adicional, la presente invención hace referencia a una proteína aislada que tiene actividad celulosa sintasa y se selecciona entre:

(a) un polipéptido del SEQ ID NO: 6, 10 o 26; y

(b) un polipéptido codificado por un ácido nucleico de la invención.

En otro aspecto más, la presente invención hace referencia a una planta transgénica que comprende una casete de expresión recombinante que comprende un promotor vegetal conectado operablemente a cualquiera de los ácidos nucleicos aislados de la presente invención. En algunas realizaciones, la planta transgénica es Zea mays. La presente invención también proporciona semillas para la planta transgénica.

En un aspecto adicional, la presente invención hace referencia a un método de modulación de la expresión de los genes que codifican las proteínas de la presente invención en una célula vegetal susceptible de regeneración vegetal, que comprende las etapas de (a) transformar una célula vegetal con una casete de expresión recombinante que comprende un polinucleótido de la presente invención conectado operablemente a un promotor; (b) hacer crecer la célula vegetal en condiciones de crecimiento de la planta; y (c) inducir la expresión del polinucleótido durante un tiempo suficiente para modular la expresión de los genes de la planta. En algunas realizaciones, la planta es el maíz. La expresión de los genes que codifican las proteínas de la presente invención puede aumentar o disminuir con respecto a una planta de control no transformada.

Definiciones

Las unidades, los prefijos, y los símbolos pueden ser indicados en su forma aceptada por el SI. A menos que se indique de otro modo, los ácidos nucleicos se escriben de izquierda a derecha en orientación 5' a 3'; las secuencias de aminoácidos se escriben de izquierda a derecha en orientación amino a carboxi, respectivamente. Los intervalos numéricos incluyen los números que definen el intervalo e incluyen cada número entero definido en el intervalo. Los aminoácidos pueden ser referidos en la presente memoria por sus símbolos de tres letras o por sus símbolos de una letra conocidos comúnmente recomendados por la IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission. Del mismo modo, los nucleótidos pueden ser referidos por sus códigos de letras individuales aceptados comúnmente. A menos que se estipule de otro modo, el soporte lógico, los términos eléctricos, y electrónicos utilizados en la presente memoria son los definidos en The New IEEE Standard Dictionary of Electrical and Electronics Terms (5ª edición, 1.993). Los términos definidos más abajo se definen más completamente mediante la referencia a la memoria en su
totalidad.

Por "amplificado" se quiere significar la construcción de múltiples copias de una secuencia de ácido nucleico o de múltiples copias complementarias a la secuencia de ácido nucleico utilizando al menos una de las secuencias de ácido nucleico como molde. Los sistemas de amplificación incluyen el sistema de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), el sistema de la reacción en cadena de la ligasa (LCR), la amplificación basada en la secuencia del ácido nucleico (NASBA, Cangene, Mississauga, Ontario), los sistemas Q-Beta Replicasa, el sistema de amplificación basado en la transcripción (TAS), y la amplificación por desplazamiento de la hebra (SDA). Véase, p. ej., Diagnostic Molecular Microbiology: Principles and applications, D. H. Persing et al., Ed., American Society for Microbiology, Washington, D.C. (1.993). El producto de la amplificación se denomina amplicón.

El término "anticuerpo" incluye la referencia a las formas de unión al antígeno de los anticuerpos (p. ej., Fab, F(ab)_{2}). El término "anticuerpo" frecuentemente hace referencia a un polipéptido codificado sustancialmente por un gen de inmunoglobulina o genes de inmunoglobulina, o fragmentos de los mismos que se unen específicamente y reconocen un analito (antígeno). No obstante, si bien se pueden definir diversos fragmentos de anticuerpo en términos de la digestión de un anticuerpo intacto, un experto en la técnica apreciará que tales fragmentos se pueden sintetizar de novo químicamente o utilizando la metodología del ADN recombinante. De este modo, el término anticuerpo, según se utiliza en la presente memoria, también incluye fragmentos de anticuerpo tales como Fv de cadena sencilla, anticuerpos quiméricos (esto es, que comprende regiones constantes y variables de diferentes especies), anticuerpos humanizados (esto es, que comprenden una región determinante de la complementariedad (CDR) de una fuente no humana) y anticuerpos heteroconjugados (p. ej., anticuerpos biespecíficos).

El término "antígeno" incluye la referencia a una sustancia para la cual se puede generar un anticuerpo y/o para la cual el anticuerpo es específicamente inmunorreactivo. Los sitios inmunorreactivos específicos en el antígeno son conocidos como epítopos o determinantes antigénicos. Estos epítopos pueden ser una ordenación lineal de monómeros de una composición polimérica - tales como los aminoácidos de una proteína - o consistir en o comprender una estructura secundaria o terciaria más compleja. Los expertos en la técnica reconocerán que todos los inmunógenos (esto es, las sustancias capaces de obtener una respuesta inmunitaria) son antígenos; sin embargo algunos antígenos, tales como los haptenos, no son inmunógenos pero se pueden hacer inmunogénicos mediante el acoplamiento a una molécula portadora. Un anticuerpo inmunológicamente reactivo con un antígeno concreto puede ser generado in vivo o mediante métodos recombinantes tales como la selección de genotecas de anticuerpos recombinantes en fagos o vectores similares. Véase, p. ej., Huse et al., Science 246: 1275-1281 (1.989); y Ward, et al., Nature 341: 544-546 (1.989); y Vaughan et al., Nature Biotech. 14: 309-314 (1.996).

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Según se utiliza en la presente memoria, "orientación antisentido" incluye la referencia a una secuencia de polinucleótidos dúplex que está conectada operablemente a un promotor en una orientación en la que se transcribe la hebra antisentido. La hebra antisentido es suficientemente complementaria a un producto de transcripción endógeno de manera que la traducción del producto de transcripción endógeno a menudo resulta inhibida.

Según se utiliza en la presente memoria, "región cromosómica" incluye la referencia a una longitud de un cromosoma que se puede medir mediante la referencia al segmento lineal del ADN que comprende. La región cromosómica puede ser definida mediante la referencia a dos secuencias de ADN únicas, esto es, los marcadores.

El término "variantes modificadas conservativamente" se aplica a secuencias tanto de aminoácidos como de ácido nucleico. Con respecto a las secuencias de ácido nucleico concretas, las variantes modificadas conservativamente hacen referencia a aquellos ácidos nucleicos que codifican variantes idénticas o modificadas conservativamente de las secuencias de aminoácidos. Debido a la degeneración del código genético, un gran número de ácidos nucleicos funcionalmente idénticos codifican cualquier proteína dada. Por ejemplo, los codones GCA, GCC, GCG y GCU codifican todos el aminoácido alanina. De este modo, en cada posición en la que la alanina es especificada por un codón, el codón puede ser alterado a cualquiera de los codones correspondientes descritos sin alterar el polipéptido codificado. Tales variaciones del ácido nucleico son "variaciones silenciosas" y representan una especie de variación modificada conservativamente. Cada secuencia de ácido nucleico de la presente memoria que codifica un polipéptido también describe cada posible variación silenciosa del ácido nucleico. Un experto normal reconocerá que cada codón de un ácido nucleico (excepto AUG, que es normalmente el único codón para metionina; y UGG, que es normalmente el único codón para triptófano) puede ser modificado para rendir una molécula funcionalmente idéntica. Por consiguiente, cada variación silenciosa de un ácido nucleico que codifica un polipéptido de la presente invención está implícita en cada secuencia de polipéptido descrita y se incorpora en la presente memoria como referencia.

En cuanto a las secuencias de aminoácidos, un experto reconocerá que las sustituciones, deleciones o adiciones individuales en un ácido nucleico, péptido, polipéptido; o una secuencia de proteína que altera, añade o suprime un único aminoácido o un pequeño porcentaje de aminoácidos en la secuencia codificada es una "variante modificada conservativamente" donde la alteración da como resultado la sustitución de un aminoácido por un aminoácido químicamente similar. De este modo, se puede alterar cualquier número de restos aminoácido seleccionado del grupo de números enteros que consiste en 1 a 15. De este modo, por ejemplo, se pueden realizar 1, 2, 3, 4, 5, 7, o 10 alteraciones. Las variantes modificadas conservativamente proporcionan típicamente una actividad biológica similar a la de la secuencia de polipéptidos no modificada de la cual derivan. Por ejemplo, la especificidad del sustrato, la actividad enzimática, o la unión ligando/receptor es generalmente al menos un 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, o 90% la de la proteína nativa para su sustrato nativo. Las tablas de sustituciones conservativas que proporcionan aminoácidos funcionalmente similares son bien conocidas en la técnica.

Los siguientes seis grupos contienen cada uno aminoácidos que son sustituciones conservativas entre sí:

1)

Alanina (A), Serina (S), Treonina (T);

2)

Ácido aspártico (D), Ácido glutámico (E);

3)

Asparragina (N), Glutamina (Q);

4)

Arginina (R), Lisina (K);

5)

Isoleucina (I), Leucina (L), Metionina (M), Valina (V); y

6)

Fenilalanina (F), Tirosina (Y), Triptófano (W).

Véase también, Creighton (1.984) Proteins W.H. Freeman y Compañía.

Por "que codifica" o "codificado", con respecto a un ácido nucleico especificado, se quiere significar que comprende la información para la traducción a una proteína especificada. Un ácido nucleico que codifica una proteína puede comprender secuencias no traducidas (p. ej., intrones) en regiones traducidas del ácido nucleico, o puede carecer de tales secuencias no traducidas intermedias (p. ej., como en el ADNc). La información por la cual una proteína es codificada es especificada mediante el uso de codones. Típicamente, la secuencia de aminoácidos es codificada por el ácido nucleico utilizando el código genético "universal". No obstante, las variantes del código universal, tales como las presentes en algunas mitocondrias de plantas, animales, y hongos, la bacteria Mycoplasma capricolum (Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 82: 2306-2309 (1.985)), o el Macronucleus ciliado, pueden ser utilizadas cuando el ácido nucleico es expresado utilizando estos organismos.

Cuando se prepara un ácido nucleico o se altera sintéticamente, se puede sacar provecho de las preferencias de codones conocidas del anfitrión pretendido en el que se va a expresar el ácido nucleico. Por ejemplo, aunque las secuencias de ácido nucleico de la presente invención se pueden expresar en especies de plantas tanto monocotiledóneas como dicotiledóneas, se pueden modificar las secuencias para que representen las preferencias de los codones específicos y las preferencias del contenido en GC de monocotiledóneas y dicotiledóneas puesto que se ha demostrado que estas preferencias difieren (Murray et al. Nucl. Acids Res. 17: 477-498 (1.989)). De este modo, el codón preferido del maíz para un aminoácido concreto puede derivar de secuencias de genes conocidos del maíz. El uso de los codones del maíz para los 28 genes de las plantas de maíz se enumeran en la Tabla 4 de Murray et al., anterior.

Según se utiliza en la presente memoria "secuencia completa" en referencia a un polinucleótido especificado o su proteína codificada representa la secuencia de aminoácidos completa de una forma nativa (no sintética), endógena, catalíticamente activa de la proteína especificada. Los métodos para determinar si una secuencia es completa son bien conocidos en la técnica incluyendo técnicas ilustrativas como las transferencias northern o western, la prolongación con cebadores, la protección con S1, y la protección con ribonucleasa. Véase, p. ej., Plant Molecular Biology: A Laboratory Manual, Clark, Ed., Springer-Verlag, Berlin (1.997). También se puede utilizar la comparación con secuencias homólogas (ortólogas y/o parálogas) completas para identificar las secuencias completas de la presente invención. Adicionalmente, las secuencias consenso presentes típicamente en las regiones 5' y 3' regiones no traducidas de ARNm ayudan a la identificación de un polinucleótido como completo. Por ejemplo, la secuencia consenso ANNNNAUGG, donde el codón subrayado representa la metionina N-terminal, ayuda a determinar si un polinucleótido tiene el extremo 5' completo. Las secuencias consenso en el extremo 3', tales como las secuencias de poliadenilación, ayudan a determinar si el polinucleótido tiene un extremo 3' completo.

El término "actividad génica" hace referencia a una o más etapas implicadas en la expresión génica, incluyendo la transcripción, traducción, y funcionamiento de la proteína codificada por el gen.

Según se utiliza en la presente memoria, "heterólogo" en referencia a un ácido nucleico es un ácido nucleico que se origina a partir de una especie foránea, o si es de la misma especie, está modificado sustancialmente a partir de su forma nativa en composición y/o locus genómico por medio de la intervención humana deliberada. Por ejemplo, un promotor conectado operablemente a un gen estructural heterólogo es de una especie diferente de aquella de la cual deriva el gen estructural, o, si es de la misma especie, uno o ambos son modificados sustancialmente a partir de su forma original. Una proteína heteróloga se puede originar a partir de una especie foránea o, si es de la misma especie, está modificada sustancialmente a partir de su forma original por la intervención humana deliberada.

Por "célula anfitriona" se quiere significar una célula que contiene un vector y soporta la replicación y/o expresión del vector de expresión. Las células anfitrionas pueden ser células procarióticas tales como E. coli, o células eucarióticas tales como células de levadura, insecto, anfibio, o mamífero. Preferiblemente, las células anfitrionas son células de plantas monocotilendóneas o dicotiledóneas. Una célula anfitriona monocotiledónea particularmente preferida es una célula anfitriona de maíz.

El término "complejo de hibridación" incluye la referencia a una estructura de ácido nucleico dúplex formada por dos secuencias de ácido nucleico de hebra sencilla hibridadas entre sí.

Por "condiciones inmunológicamente reactivas" o "condiciones inmunorreactivas" se quiere significar condiciones que permiten que un anticuerpo, generado para un epítopo concreto, se una a ese epítopo en un grado detectablemente mayor (p. ej., al menos 2 veces por encima del fondo) que el anticuerpo se une sustancialmente a todos los demás epítopos en una mezcla de reacción que comprende el epítopo concreto. Las condiciones inmunológicamente reactivas dependen del formato de la reacción de unión al anticuerpos y típicamente son aquellas utilizadas en los protocolos de inmunoanálisis. Véase Harlow y Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications, New York (1.988), para una descripción de los formatos y las condiciones de inmunoanálisis.

El término "introducido" en el contexto de la inserción de un ácido nucleico en una célula, representa "transfección" o "transformación" o "transducción" e incluye la referencia a la incorporación de un ácido nucleico a una célula eucariótica o procariótica en la que el ácido nucleico puede ser incorporado en el genoma de la célula (p. ej., ADN de cromosoma, plásmido, plástido o mitocondria), convertido en un replicón autónomo, o expresado transitoriamente (p. ej., ARNm transfectado).

El término "aislado" hace referencia a un material, tal como un ácido nucleico o una proteína, que está: (1) sustancialmente o esencialmente libre de componentes que normalmente acompañan o interaccionan con él según se encuentra en su entorno natural. El material aislado opcionalmente comprende material que no se encuentra con el material en su entorno natural; o (2) si el material está en su entorno natural, el material ha sido alterado sintéticamente (no naturalmente) mediante la intervención humana deliberada a una composición y/o situado en un lugar en la célula (p. ej., genoma u orgánulo subcelular) no nativo para el material encontrado en el entorno. La alteración para rendir el material sintético se puede realizar en el material en su estado natural o apartado de él. Por ejemplo, un ácido nucleico natural se convierte en un ácido nucleico aislado si se altera, o si es transcrito a partir de ADN que ha sido alterado, mediante métodos no naturales, sintéticos (esto es, "hechos por el hombre") realizados en el célula a partir de la cual se origina. Véase, p. ej., Compounds and Methods for Site Directed Mutagenesis in Eukaryotic Cells, Kmiec, Patente de los Estados Unidos Núm. 5.565.350; In Vivo Homologous Sequence Targeting in Eukaryotic Cells; Zarling et al., PCT/US93/03868. Del mismo modo, un ácido nucleico de origen natural (p. ej., un promotor) se convierte en aislado si es introducido por medios no naturales en un locus del genoma no nativo para ese ácido nucleico. Los ácidos nucleicos que están "aislados" como se define en la presente memoria, también son referidos como ácidos nucleicos "heterólogos".

A menos que se establezca de otro modo, el término "ácido nucleico de celulosa sintasa" es un ácido nucleico de la presente invención y representa un ácido nucleico que comprende un polinucleótido de la presente invención (un "polinucleótido de celulosa sintasa") que codifica un polipéptido de celulosa sintasa. Un "gen de celulosa sintasa" es un gen de la presente invención y hace referencia a una forma genómica no heteróloga de un polinucleótido de celulosa sintasa completo.

Según se utiliza en la presente memoria, "localizado en la región cromosómica definida por y que incluye" con respecto a marcadores concretos incluye la referencia a una longitud contigua de un cromosoma delimitada por y que incluye los marcadores establecidos.

Según se utiliza en la presente memoria, "marcador" incluye la referencia a un locus sobre un cromosoma que sirve para identificar una posición única sobre el cromosoma. Un "marcador polimórfico" incluye una referencia a un marcador que aparece en múltiples formas (alelos) de manera que las diferentes formas del marcador, cuando están presentes en un par homólogo, permiten seguir la transmisión de cada uno de los cromosomas en ese par. Un genotipo puede ser definido mediante el uso de uno o una pluralidad de marcadores.

Según se utiliza en la presente memoria, "ácido nucleico" incluye la referencia a un polímero de desoxirribonucleótido o ribonucleótido en forma de hebra sencilla o doble, y a menos que se limite de otro modo, abarca análogos conocidos que tienen la naturaleza esencial de los nucleótidos naturales ya que hibridan con los ácidos nucleicos de cadena sencilla de una manera similar a los nucleótidos de origen natural (p. ej., ácidos nucleicos peptídicos).

Por "genoteca de ácido nucleico" se quiere significar una colección de moléculas de ADN o ARN aisladas que comprenden y sustancialmente representan la fracción transcrita completa de un genoma de un organismo especificado. La construcción de genotecas de ácido nucleico ilustrativas, tales como genotecas genómicas y de ADNc, se ilustra en las referencias de biología molecular normalizadas tales como Berger y Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology, Vol. 152, Academic Press, Inc., San Diego, CA (Berger); Sambrook et al., Molecular Cloning - A Laboratory Manual, 2nd ed., Vol. 1-3 (1.989); y Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel et al., Eds., Current Protocols, una empresa conjunta entre Greene Publishing Associates, Inc. y John Wiley & Sons, Inc. (Suplemento de 1.994).

Según se utiliza en la presente memoria "conectado operablemente" incluye una referencia a una conexión funcional entre un promotor y una segunda secuencia, donde la secuencia del promotor inicia y media la transcripción de la secuencia de ADN correspondiente a la segunda secuencia. Generalmente, conectado operablemente significa que las secuencias de ácido nucleico conectadas están contiguas y, cuando sea necesario unir dos regiones codificadoras de proteína, contiguas y en el mismo marco de lectura.

Según se utiliza en la presente memoria, el término "planta" incluye la referencia a plantas completas, partes u órganos de plantas (p. ej., hojas, tallos, raíces, etc.), células vegetales, semillas y progenie de las mismas. Las células vegetales, según se utiliza en la presente memoria, incluyen sin limitación, células obtenidas de o encontradas en: semillas, cultivos en suspensión, embriones, regiones meristemáticas, tejidos del callo, hojas, raíces, vástagos, gametofitos, esporofitos, polen, y microsporas. También se puede entender que las células vegetales incluyen células modificadas, tales como protoplastos, obtenidos de los tejidos mencionados antes. La clase de plantas que se pueden utilizar en los métodos de la invención es generalmente tan amplia como la clase de plantas superiores susceptibles de técnicas de transformación, incluyendo plantas tanto monocotiledóneas como dicotiledóneas. Las plantas particularmente preferidas incluyen maíz, soja, girasol, sorgo, canola, trigo, alfalfa, algodón, arroz, cebada y mijo.

Según se utiliza en la presente memoria, "polinucleótido" incluye la referencia a un desoxirribopolinucleótido, ribopolinucleótido, o análogos de los mismos que tienen la naturaleza esencial de un ribonucléotido natural ya que hibridan, en condiciones de hibridación restrictivas, sustancialmente con la misma secuencia de nucleótidos y/o permiten la traducción a los mismos aminoácidos que los nucleótidos de origen natural. Un polinucleótido puede ser completo o una subsecuencia de un gen estructural o regulador nativo o heterólogo. A menos que se indique de otro modo, el término incluye la referencia a la secuencia especificada así como la secuencia complementaria de la misma. De este modo, los ADN o ARN con esqueletos modificados por estabilidad o por otras razones son "polinucleótidos" como pretende el término en la presente memoria. Por otra parte, los ADN o ARN que comprenden bases inusuales, tales como inosina, o bases modificadas, tales como bases tritiladas, por nombrar solo dos ejemplos, son polinucleótidos según se utiliza el término en la presente memoria. Se apreciará que se han realizado una gran variedad de modificaciones para el ADN y el ARN que son útiles para muchos propósitos conocidos por los expertos en la técnica. El término polinucleótido empleado en la presente memoria abarca tales formas de polinucleótidos modificadas químicamente, enzimáticamente o metabólicamente, así como las formas químicas del ADN y ARN características de los virus y células, incluyendo entre otras, las células simples y complejas.

Los términos "polipéptido", "péptido" y "proteína" se utilizan indistintamente en la presente memoria para hacer referencia a un polímero de restos aminoácido. Los términos se aplican a polímeros de aminoácidos en los cuales uno o más restos aminoácido son análogos químicos artificiales del correspondiente aminoácido de origen natural, así como polímeros de aminoácidos de origen natural. La naturaleza esencial de tales análogos de los aminoácidos de origen natural es que, cuando se incorporan a una proteína, esa proteína es específicamente reactiva con los anticuerpos obtenidos para la misma proteína pero que consta enteramente de aminoácidos de origen natural. Los términos "polipéptido", "péptido" y "proteína" también incluyen modificaciones que incluyen, pero no están limitadas a, glicosilación, anclaje de lípidos, sulfación, gamma-carboxilación de restos de ácido glutámico, hidroxilación y ADP-ribosilación. Las modificaciones ilustrativas se describen en los textos más básicos, tales como, Proteins - Structure and Molecular Properties, 2ª ed., T. E. Creighton, W. H. Freeman y Compañía, New York (1.993). Están disponibles muchas revisiones detalladas sobre esta materia, tales como, por ejemplo, las proporcionadas por Wold, F., Post-translational Protein Modifications: Perspectives and Prospects, págs. 1-12 en Posttranslational Covalent Modification of Proteins, B. C. Johnson, Ed., Academic Press, New York (1.983); Seifter et al., Meth. Enzymol. 182: 626-646 (1.990) y Rattan et al., Protein Synthesis: Posttranslational Modifications and Aging, Ann. N. Y. Acad. Sci. 663: 48-62 (1.992). Se apreciará, como es bien sabido y como se ha indicado antes, que los polipéptidos no son siempre completamente lineales. Por ejemplo, los polipéptidos pueden ser ramificados como resultado de la ubiquitinación, y pueden ser circulares, con o sin ramificación, generalmente como resultado de eventos post-traduccionales, incluyendo el evento de maduración natural y los eventos ocasionados por la manipulación humana que no se producen naturalmente. Los polipéptidos circulares, ramificados y circulares ramificados pueden ser sintetizados mediante un procedimiento no natural de traducción y también mediante métodos completamente sintéticos. Las modificaciones se pueden producir en cualquier parte de un polipéptido, incluyendo el esqueleto del péptido, las cadenas laterales de los aminoácidos y los extremos amino y carboxilo. De hecho, el bloqueo del grupo amino o carboxilo de un polipéptido, o de ambos, mediante modificación covalente, es común en los polipéptidos de origen natural y sintéticos y tales modificaciones también pueden estar presentes en los polipéptidos de la presente invención. Por ejemplo, el resto amino terminal de los polipéptidos elaborados en E. coli u otras células, antes de la maduración proteolítica, casi invariablemente será N-formilmetionina. Durante la modificación post-traduccional del péptido, se puede suprimir un resto metionina en el extremo NH_{2}. Por consiguiente, esta invención contempla el uso de variantes que contienen metionina y variantes amino terminales menos metionina de la proteína de la invención. En general, según se utiliza en la presente memoria, el término polipéptido abarca todas estas modificaciones, concretamente aquellas que están presentes en los polipéptidos sintetizados expresando un polinucleótido en una célula anfitriona.

Según se utiliza en la presente memoria "promotor" incluye la referencia a una región de ADN aguas arriba del inicio de la transcripción e implicada en el reconocimiento y la unión de la ARN polimerasa y otras proteínas para iniciar la transcripción. Un "promotor vegetal" es un promotor capaz de iniciar la transcripción en células vegetales. Los promotores vegetales ilustrativos incluyen, pero no están limitados a, aquellos que se obtienen de plantas, virus de plantas, y bacterias, que comprenden genes expresados en células vegetales tales como Agrobacterium o Rhizobium. Los ejemplos de promotores bajo control evolutivo incluyen promotores que inician preferentemente la transcripción en ciertos tejidos, tales como hojas, raíces, o semillas. Tales promotores son referidos como "preferidos del tejido". Los promotores que inician la transcripción solamente en cierto tejido son referidos como "específicos del tejido". Un promotor específico del "tipo de célula" conduce principalmente la expresión en ciertos tipos de células en uno o más órganos, por ejemplo, células vasculares en raíces u hojas. Un "promotor inducible" es un promotor que está bajo el control medioambiental. Los ejemplos de las condiciones medioambientales que pueden tener efecto sobre la transcripción por medio de promotores inducibles incluyen condiciones anaerobias o la presencia de luz. Los promotores específicos del tejido, preferidos del tejido, específicos del tipo celular, e inducibles constituyen la clase de promotores "no constitutivos". Un promotor "constitutivo" es un promotor que es activo en la mayoría de las condiciones medioambientales.

El término "polipéptido celulosa sintasa" es un polipéptido de la presente invención y hace referencia a una o más secuencias de aminoácidos, en forma glicosilada o no glicosilada. El término también incluye fragmentos, variantes, homólogos, alelos o precursores (p. ej., preproproteínas o proproteínas) de los mismos. Una "proteína celulosa sintasa" es una proteína de la presente invención y comprende un polipéptido de celulosa sintasa.

Según se utiliza en la presente memoria "recombinante" incluye la referencia a una célula o vector, que ha sido modificado mediante la introducción de un ácido nucleico heterólogo o aquella célula derivada de una célula modificada de ese modo. Así, por ejemplo, las células recombinantes expresan genes que no se encuentran en una forma idéntica en la forma nativa (no recombinante) de la célula o expresan genes nativos que son expresados de otro modo anómalamente, expresados a la baja o no expresados en absoluto como resultado de la intervención humana deliberada. El término "recombinante" según se utiliza en la presente memoria no abarca la alteración de la célula o vector por medio de eventos de origen natural (p. ej., mutación espontánea, transformación/transducción/transposición natural) tales como los que se producen sin la intervención humana deliberada.

Según se utiliza en la presente memoria, una "casete de expresión recombinante" es un constructo de ácido nucleico, generado recombinantemente o sintéticamente, con una serie de elementos de ácido nucleico especificados que permiten la transcripción de un ácido nucleico concreto en una célula anfitriona. La casete de expresión recombinante puede ser incorporada en un ADN plasmídico, cromosómico, mitocondrial, ADN de plástido, virus, o fragmento de ácido nucleico. Típicamente, la porción de la casete de expresión recombinante de un vector de expresión incluye, entre otras secuencias, el ácido nucleico que se va a transcribir, y un promotor.

El término "resto" o "resto aminoácido" o "aminoácido" se utiliza indistintamente en la presente memoria para hacer referencia a un aminoácido que es incorporado a una proteína, polipéptido, o péptido (colectivamente "proteína"). El aminoácido puede ser un aminoácido de origen natural y, a menos que se limite de otro modo, puede abarcar análogos conocidos de aminoácidos naturales que pueden funcionar de una manera similar a los aminoácidos de origen natural.

El término "hibrida selectivamente" incluye la referencia a la hibridación, en condiciones de hibridación restrictivas, de una secuencia de ácido nucleico con una secuencia diana de ácido nucleico especificada en un grado detectablemente mayor (p. ej., al menos 2 veces sobre el fondo) que su hibridación con secuencias de ácido nucleico no diana y con la exclusión sustancial de ácidos nucleicos no diana. Las secuencias que hibridan selectivamente tienen típicamente aproximadamente una identidad de secuencia del 80%, preferiblemente una identidad de secuencia del 90%, y muy preferiblemente una identidad de secuencia del 100% (esto es, complementarias) entre sí.

El término "reactivo específicamente", incluye la referencia a una reacción de unión entre un anticuerpo y una proteína que tiene un epítopo reconocido por el sitio de unión al antígeno del anticuerpo. Esta reacción de unión es determinante de la presencia de una proteína que tiene el epítopo reconocido entre la presencia de una población heterogénea de proteínas y otros agentes biológicos. De este modo, en las condiciones del inmunoanálisis diseñado, los anticuerpos especificados se unen a un analito que tiene el epítopo reconocido en un grado sustancialmente mayor (p. ej., al menos 2 veces sobre el fondo) que sustancialmente todos los demás analitos que carecen del epítopo que están presentes en la muestra.

Los términos "condiciones restrictivas" o "condiciones de hibridación restrictivas" incluyen la referencia a condiciones en las cuales una sonda hibridará con su secuencia diana, en un grado detectablemente mayor que otras secuencias (p. ej., al menos 2 veces por encima del fondo). Las condiciones restrictivas dependen de la secuencia y serán diferentes en las diferentes circunstancias. Controlando la restricción de las condiciones de hibridación y/o lavado, se pueden identificar secuencias diana que son complementarias en un 100% a la sonda (sondeo de homólogos). Alternativamente, se pueden ajustar las condiciones restrictivas para permitir cierto emparejamiento erróneo en las secuencias de manera que se detecten grados de similitud más bajos (sondeo de heterólogos). Generalmente, una sonda tiene una longitud de menos de aproximadamente 1.000 nucleótidos, preferiblemente una longitud de menos de 500 nucleótidos.

Típicamente, las condiciones restrictivas serán aquellas en las cuales la concentración de sal es menor de aproximadamente 1,5 M de iones Na, típicamente aproximadamente una concentración una concentración de iones Na de aproximadamente 0,01 a 1,0 M (u otras sales) a un pH de 7,0 a 8,3 y la temperatura es de al menos aproximadamente 30ºC para sondas cortas (p. ej., 10 a 50 nucleótidos) y al menos aproximadamente 60ºC para sondas largas (p. ej., más de 50 nucleótidos). Las condiciones restrictivas también se pueden lograr con la adición de agentes desestabilizantes tales como formamida. Las condiciones poco restrictivas ilustrativas incluyen la hibridación con una solución tampón de formamida del 30 al 35%, NaCl 1 M, SDS al 1% (dodecilsulfato de sodio) a 37ºC, y un lavado en 1X a 2X SSC (20X SSC = NaCl 3,0 M/citrato trisódico 0,3 M) de 50 a 55ºC. Las condiciones restrictivas moderadas ilustrativas incluyen hibridación en formamida del 40 al 45 %, NaCl 1 M, SDS al 1% a 37ºC, y un lavado en 0,5X a 1X SSC de 55 a 60ºC. Las condiciones muy restrictivas ilustrativas incluyen hibridación en formamida al 50%, NaCl 1 M, SDS al 1% a 37ºC, y un lavado en 0,1 X SSC de 60 a 65ºC.

La especificidad es típicamente función de los lavados post-hibridación, siendo los factores críticos la fuerza iónica y la temperatura de la solución de lavado final. Para los híbridos de ADN-ADN, la T_{m} se puede aproximar a partir de la ecuación de Meinkoth y Wahl, Anal. Biochem., 138:267-284 (1.984): T_{m} = 81,5ºC + 16,6 (log M) + 0,41 (%GC) - 0,61 (% form) - 500/L; donde M es la molaridad de los cationes monovalentes, %GC es el porcentaje de nucleótidos de guanosina y citosina en el ADN, % form es el porcentaje de formamida en la solución de hibridación, y L es la longitud del híbrido en pares de bases. La T_{m} es la temperatura (a la fuerza iónica y el pH definidos) a la cual el 50% de la secuencia diana complemetaria hibrida con una sonda perfectamente emparejada. La T_{m} se reduce aproximadamente 1ºC por cada 1% de emparejamiento erróneo; así, la T_{m}, la hibridación y/o las condiciones de lavado se pueden ajustar para hibridar con secuencias de la identidad deseada. Por ejemplo, si se buscan secuencias con una identidad de \geq90%, la T_{m} puede disminuir 10ºC. Generalmente, las condiciones restrictivas se seleccionan para que sean aproximadamente 5ºC más bajas que el punto de fusión térmico (T_{m}) para la secuencia específica y su complemento a una fuerza iónica y un pH definidos. No obstante, las condiciones muy restrictivas pueden utilizar una hibridación y/o lavado a 1, 2, 3, o 4ºC más bajo que el punto de fusión térmico (T_{m}); las condiciones moderadamente restrictivas pueden utilizar una hibridación y/o lavado a 6, 7, 8, 9, o 10ºC más bajo que el punto de fusión térmico (T_{m}); las condiciones poco restrictivas pueden utilizar una hibridación y/o lavado a 11, 12, 13, 14, 15, o 20ºC más bajo que el punto de fusión térmico (T_{m}). Utilizando la ecuación, la hibridación y las composiciones de lavado, y la T_{m} deseada, aquellos expertos normales comprenderán que se describen inherentemente variaciones en la restricción de la hibridación y/o las soluciones de lavado. Si el grado de emparejamiento erróneo deseado da como resultado una T_{m} de menos de 45ºC (solución acuosa) o 32ºC (solución en formamida) se prefiere incrementar la concentración de SSC de manera que se pueda utilizar una temperatura más alta. Una guía extensa para la hibridación de ácidos nucleicos se encuentra en Tijssen, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology--Hybridization with Nucleic acid Probes, Parte I, Capítulo 2 "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays", Elsevier, New York (1.993); y Current Protocols in Molecular Biology, Capítulo 2, Ausubel, et al., Eds., Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York (1.995).

Según se utiliza en la presente memoria, "planta transgénica" incluye la referencia a una planta que comprende en su genoma un polinucleótido heterólogo. Generalmente, el polinucleótido heterólogo está integrado establemente en el genoma de manera que el polinucleótido pasa a las generaciones sucesivas. El polinucleótido heterólogo puede estar integrado en el genoma solo o como parte de una casete de expresión recombinante. "Transgénico" se utiliza en la presente memoria para incluir cualquier célula, línea celular, callo, tejido, parte vegetal o planta, cuyo genotipo ha sido alterado por la presencia de ácido nucleico heterólogo incluyendo aquellos transgénicos alterados inicialmente así como aquellos creados por cruces sexuales o propagación asexual a partir del transgénico inicial. El término "transgénico" según se utiliza en la presente memoria no abarca la alteración del genoma (cromosómico o extracromosómico) mediante métodos de cría vegetal convencionales o mediante eventos de origen natural tales como fertilización cruzada al azar, infección viral no recombinante, transformación bacteriana no recombinante, transposición no recombinante o mutación espontánea.

Según se utiliza en la presente memoria, "vector" incluye la referencia a un ácido nucleico utilizado en la transfección de una célula anfitriona y en el cual se puede insertar un polinucleótido. Los vectores a menudo son replicones. Los vectores de expresión permiten la transcripción de un ácido nucleico insertado allí.

Los siguientes términos se utilizan para describir la relaciones de las secuencias entre uno o más ácidos nucleicos o polinucleótidos: (a) "secuencia de referencia", (b) "ventana de comparación", (c) "identidad de secuencia", (d) "porcentaje de identidad de la secuencia", y (e) "identidad sustancial".

(a)

Según se utiliza en la presente memoria, "secuencia de referencia" es una secuencia definida utilizada como base para la comparación de las secuencias. Una secuencia de referencia puede ser un subgrupo o la totalidad de una secuencia especificada; por ejemplo, en forma de un segmento de un ADN completo o una secuencia génica, o el ADNc o la secuencia génica completos.

(b)

Según se utiliza en la presente memoria, "ventana de comparación" incluye la referencia a un segmento contiguo y especificado de una secuencia de polinucleótidos, donde la secuencia de polinucleótidos se puede comparar con una secuencia de referencia y donde la porción de la secuencia de polinucleótidos en la ventana de comparación puede comprender adiciones o deleciones (esto es, espacios) en comparación con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones o deleciones) para el alineamiento óptimo de las dos secuencias. Generalmente, la ventana de comparación tiene una longitud de al menos 20 nucleótidos contiguos, y opcionalmente puede tener 30, 40, 50, 100, o más. Los expertos en la técnica comprenden que para evitar una elevada similitud con una secuencia de referencia debido a la inclusión de espacios en la secuencia de polinucleótidos se introduce típicamente una penalidad de espacios y se resta del número de emparejamientos. Los métodos de alineamiento de secuencias son bien conocidos en la técnica. El alineamiento óptimo de las secuencias para su comparación se puede llevar a cabo mediante el algoritmo de la homología local de Smith y Waterman, Adv. Appl. Math. 2: 482 (1.981); mediante el algoritmo del alineamiento por homología de Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443 (1.970); mediante la búsqueda de similitud por el método de Pearson y Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. 85: 2444 (1.988); mediante implementaciones computarizadas de estos algoritmos, incluyendo, pero no limitadas a: CLUSTAL en el programa PC/Gene de Intelligenetics, Mountain View, California, GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA, y TFASTA en el Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Dr., Madison, Wisconsin, USA; el programa CLUSTAL está bien descrito por Higgins y Sharp, Gene 73: 237-244 (1.988); Higgins y Sharp, CABIOS 5: 151-153 (1.989); Corpet, et al., Nucleic Acids Research 16: 10881-90 (1.988); Huang, et al., Computer Applications in the Biosciences 8: 155-65 (1.992), y Pearson, et al., Methods in Molecular Biology 24: 307-331 (1.994). La familia de programas BLAST que se puede utilizar para las búsquedas de similitud en las bases de datos incluye: BLASTN para secuencias de nucleótidos interrogantes frente a las secuencias de las bases de datos de nucleótidos; BLASTX para secuencias interrogantes de nucleótidos frente a secuencias de las bases de datos de proteína; BLASTP para secuencias interrogantes de proteínas frente a las secuencias de las bases de datos de proteínas; TBLASTN para las secuencias interrogantes de proteínas frente a las secuencias de las bases de datos de nucleótidos; y TBLASTX para secuencias interrogantes de nucleótidos frente a las secuencias de las bases de datos de nucleótidos. Véase, Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 19, Ausubel, et al., Eds., Greene Publishing y Wiley-Interscience, New York (1.995).

\quad

A menos que se establezca de otro modo, los valores de identidad/similitud de la secuencia proporcionados en la presente memoria hacen referencia al valor obtenido utilizando la serie de programas BLAST 2.0 utilizando los parámetros por defecto. Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402 (1.997). El soporte lógico para realizar los análisis BLAST se encuentra disponible al público, p. ej., a través del National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.ntm.nih.gov/). Este algoritmo implica identificar primero los pares de secuencias de puntuación elevada (HSP) identificando las palabras cortas de longitud W en la secuencia interrogante, que coinciden o satisfacen una puntuación T umbral valorada como algo positiva cuando se alinean con una palabra de la misma longitud en la secuencia de la base de datos. T es referida umbral de puntuación de la palabra vecina (Altschul et al., supra). Estas palabras comunes vecinas iniciales actúan como semillas para iniciar búsquedas para encontrar los HSP más largos que los contienen. Las palabras comunes se extienden después en ambas direcciones a lo largo de cada secuencia en tanto que la puntuación cumulativa del alineamiento pueda ser incrementada. Las puntuaciones cumulativas se calculan utilizando, para las secuencias de nucleótidos, los parámetros M (puntuación recompensa para un par de restos pareados; siempre > 0) y N (puntuación penalidad para restos pareados erróneamente; siempre < 0). Para las secuencias de aminoácidos, se utiliza una matriz de puntuación para calcular la puntuación cumulativa. La extensión de las palabras comunes ("word hits") en cada una de las direcciones se detiene cuando: la puntuación del alineamiento cumulativo cae en una cantidad X desde su máximo valor alcanzado; la puntuación cumulativa tiende a cero o menos, debido a la acumulación de uno o más alineamientos de restos de puntuación negativa; o se alcanza el final de cualquier secuencia. Los parámetros del algoritmo BLAST W, T, y X determinan la sensibilidad y la velocidad del alineamiento. El programa BLASTN (para las secuencias de nucleótidos) utiliza como defecto un tamaño de palabra (W) de 11, una expectativa (E) de 10, un corte de 100, M=5, N=-4, y una comparación de ambas hebras. Para las secuencias de aminoácidos, el programa BLASTP utiliza como defecto un tamaño de palabra (W) de 3, una expectativa (E) de 10, y la matriz de puntuación BLOSUM62 (véase Henikoff & Henikoff (1.989) Proc. Natl. Acad Sci. USA 89:10915).

\quad

Además de calcular el porcentaje de identidad de la secuencia, el algoritmo BLAST también realiza un análisis estadístico de la similitud entre dos secuencias (véase, p. ej., Karlin & Altschul, Proc. Natl. Acad Sci. USA 90:5873-5787 (1.993)). Una medida de similitud proporcionada por el algoritmo BLAST es la probabilidad de la suma más pequeña (P(N)), que proporciona una indicación de la probabilidad por la cual un emparejamiento entre dos secuencias de nucleótidos o aminoácidos se produciría por casualidad.

\quad

Las búsquedas BLAST suponen que las proteínas pueden ser modeladas como secuencias al azar. No obstante, muchas proteínas reales comprenden zonas de secuencias no al azar que pueden ser regiones homopoliméricas, repeticiones de periodo corto, o regiones enriquecidas en uno o más aminoácidos. Tales regiones de baja complejidad se pueden alinear entre proteínas no relacionadas incluso aunque otras regiones de la proteína sean totalmente distintas. Se pueden emplear numerosos programas de filtro de baja complejidad para reducir tales alineamientos de baja complejidad. Por ejemplo, se pueden emplear los filtros de baja complejidad SEG (Wooten y Federhen, Comput. Chem., 17:149-163 (1.993)) y XNU (Claverie y States, Comput. Chem., 17:191-201 (1.993)) solos o combinados.

(c)

Según se utiliza en la presente memoria, "identidad de secuencia" o "identidad" en el contexto de dos secuencias de ácido nucleico o polipéptido incluye la referencia a los restos de las dos secuencias que son los mismos cuando se alinean para una máxima correspondencia a lo largo de una ventana de comparación especificada. Cuando el porcentaje de identidad de secuencia se utiliza en referencia a proteínas se reconoce que las posiciones de los restos que no son idénticos a menudo difieren por sustituciones de aminoácidos conservativas, donde los restos aminoácido son sustituidos por otros restos aminoácido con propiedades químicas similares (p. ej. carga o carácter hidrófobo) y por lo tato no cambian las propiedades funcionales de la molécula. Cuando las secuencias difieren en sustituciones conservativas, el porcentaje de identidad de la secuencia se puede ajustar al alza para corregir la naturaleza conservativa de la sustitución. Las secuencias que difieren en tales sustituciones conservativas se dice que tienen "similitud de secuencia" o "similitud". Los medios para realizar este ajuste son bien conocidos por los expertos en la técnica. Típicamente esto implica puntuar una sustitución conservativa como un emparejamiento erróneo parcial en lugar de total. De este modo, por ejemplo, cuando se da una puntuación de 1 a un aminoácido idéntico y se da una puntuación de cero a una sustitución no conservativa, se da una puntuación entre cero y 1 a una sustitución conservativa. La puntuación de las sustituciones conservativas se calcula, por ejemplo, según el algoritmo de Meyers y Miller, Computer Applic. Biol. Sci., 4: 11-17 (1.988) p. ej., implementado en el programa PC/GENE (Intelligenetics, Mountain View, California, USA).

(d)

Según se utiliza en la presente memoria, "porcentaje de identidad de secuencia" representa el valor determinado comparando dos secuencias alienadas óptimamente a lo largo de una ventana de comparación, donde la porción de la secuencia de polinucleótidos de la ventana de comparación puede comprender adiciones o deleciones (esto es, espacios) en comparación con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones o deleciones) para un alineamiento óptimo de las dos secuencias. El porcentaje se calcula determinando el número de posiciones en las cuales la base de ácido nucleico o el resto aminoácido idéntico existe en ambas secuencias para rendir el número de posiciones emparejadas, dividiendo el número de posiciones emparejadas por el número total de posiciones de la ventana de comparación y multiplicando el resultado por 100 para dar el porcentaje de identidad de la secuencia.

(e) (i)

El término "identidad sustancial" de las secuencias de polinucleótidos significa que un polinucleótido comprende una secuencia que tiene una identidad de secuencia de al menos 70%, preferiblemente al menos 80%, más preferiblemente al menos 90% y muy preferiblemente al menos 95%, en comparación con una secuencia de referencia utilizando uno de los programas de alineamiento descritos utilizando parámetros normalizados. Un experto reconocerá que estos valores se pueden ajustar apropiadamente para determinar la correspondiente identidad de las proteínas codificadas por dos secuencias de nucleótidos tomando en consideración la degeneración de codones, la similitud de los aminoácidos, la situación del marco de lectura y similares. La identidad sustancial de las secuencias de aminoácidos para estos fines representa normalmente una identidad de secuencia de al menos 60%, más preferiblemente al menos 70%, 80%, 90%, y muy preferiblemente al menos 95%.

\quad

Otra indicación de que las secuencias de nucleótidos son sustancialmente idénticas es que las dos moléculas hibridan entre sí en condiciones restrictivas. No obstante, los ácidos nucleicos que no hibridan entre sí en condiciones restrictivas todavía son sustancialmente idénticos si los polipéptidos que codifican son sustancialmente idénticos. Esto puede ocurrir, p. ej., cuando se crea una copia de un ácido nucleico utilizando la máxima degeneración de codones permitida por el código genético. Una indicación de que dos secuencias de ácido nucleico son sustancialmente idénticas es que el polipéptido que codifica el primer ácido nucleico presenta una reacción inmunológica cruzada con el polipéptido codificado por el segundo ácido nucleico.

(e) (ii)

El término "identidad sustancial" en el contexto de un péptido indica que un péptido comprende una secuencia con una identidad de secuencia de al menos 70% con respecto a una secuencia de referencia, preferiblemente 80%, más preferiblemente 85%, muy preferiblemente una identidad de secuencia de al menos 90% o 95% con respecto a la secuencia de referencia a lo largo de una ventana de comparación especificada. Preferiblemente, el alineamiento óptimo se lleva a cabo utilizando el algoritmo de alineamiento por homología de Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443 (1.970). Una indicación de que dos secuencias peptídicas son sustancialmente idénticas es que un péptido es inmunológicamente reactivo con los anticuerpos originados contra el segundo péptido. De este modo, un péptido es sustancialmente idéntico a un segundo péptido, por ejemplo, donde los dos péptidos difieren solamente por una sustitución conservativa. Los péptidos que son "sustancialmente similares" comparten secuencias como se ha indicado antes excepto que las posiciones de los restos que no son idénticos pueden diferir por cambios de aminoácidos conservativos.

Descripción detallada de la invención Visión global

La presente invención proporciona, entre otras cosas, composiciones y métodos para modular (esto es, aumentar o disminuir) el nivel de polipéptidos de la presente invención en las plantas. En particular, los polipéptidos de la presente invención se pueden expresar en fases del desarrollo, en tejidos, y/o en cantidades que no son características de las plantas no diseñadas recombinantemente. De este modo, la presente invención proporciona utilidad en tales aplicaciones ejemplares como mejora de la calidad del tallo para un mejor sostenimiento o ensilaje. Adicionalmente, la presente invención proporciona una concentración incrementada de celulosa en el pericarpo; endurecimiento de la almendra y de este modo mejora de su capacidad de manipulación.

Los ácidos nucleicos aislados que comprenden polinucleótidos de suficiente longitud y complementariedad con un gen de la presente invención se pueden utilizar como sondas o cebadores de amplificación en la detección, cuantificación, o aislamiento de transcritos génicos. Por ejemplo, los ácidos nucleicos aislados de la presente invención se pueden utilizar como sondas en la detección de deficiencias a nivel de ARNm en los escrutinios para plantas transgénicas deseadas, para detectar mutaciones en el gen (p. ej., sustituciones, deleciones, o adiciones), para controlar la regulación al alza de la expresión o los cambios de actividad enzimática en los análisis de escrutinio de compuestos, para la detección de cualquier número de variantes alélicas (polimorfismos) del gen, o para su uso como marcadores moleculares en los programas de cría de plantas. Los ácidos nucleicos aislados de la presente invención también se pueden utilizar para la expresión recombinante de sus polipéptidos codificados, o para su uso como inmunógenos en la preparación y/o escrutinio de anticuerpos. Los ácidos nucleicos aislados de la presente invención también se pueden emplear para su uso en la supresión sentido o antisentido de uno o más genes de la presente invención en una célula anfitriona, tejido o planta. El anclaje de agentes químicos que se unen, intercalan, escinden y/o entrecruzan con los ácidos
nucleicos aislados de la presente invención se puede utilizar también para modular la transcripción o la traducción.

La presente invención también proporciona proteínas aisladas que comprenden un polipéptido de la presente invención (p. ej., preproenzima, proenzima, o enzimas). La presente invención también proporciona proteínas que comprenden al menos un epítopo de un polipéptido de la presente invención. Las proteínas de la presente invención se pueden empelar en análisis para agonistas o antagonistas de la función de una enzima, o para su uso como inmunógenos o antígenos para obtener anticuerpos específicamente inmunorreactivos con una proteína de la presente invención. Tales anticuerpos se pueden utilizar en análisis de los niveles de expresión, para identificar y/o aislar ácidos nucleicos de la presente invención de genotecas de expresión, o para la purificación de polipéptidos de la presente invención.

Los ácidos nucleicos y proteínas aislados de la presente invención se pueden utilizar sobre de una amplia gama de tipos de plantas, concretamente monocotiledóneas tales como las especies de la Familia Gramíneas incluyendo Sorghum bicolor y Zea mays. El ácido nucleico y las proteínas aislados de la presente invención también se pueden utilizar en especies de los géneros: Cucurbita, Rosa, Vitis, Juglans. Fragaria, Lotus, Medicago, Onobrychis, Trifolium, Trigonella, Vigna, Citrus, Linum, Geranium, Manihot, Daucus, Arabidopsis, Brassica, Raphanus, Sinapis, Atropa, Capsicum, Datura, Hyoscyamus, Lycopersicon, Nicotiana, Solanum, Petunia, Digitalis, Majorana, Ciahorium, Helianthus, Lactuca, Bromus, Asparagus, Antirrhinum, Heterocallis, Nemesis, Pelargonium, Panieum, Pennisetum, Ranunculus, Senecio, Salpiglossis, Cucumis, Browaalia, Glycine, Pisum, Phaseolus, Lolium, Oryza, Avena, Hordeum, Secale, Triticum, Bambusa, Dendrocalamus, y Melocanna.

Ácidos nucleicos

La presente invención proporciona, entre otros, ácidos nucleicos aislados de ARN, ADN, y análogos y/o quimeras de los mismos, que comprenden un polinucleótido de la presente invención.

Un polinucleótido de la presente invención incluye:

(a) un polinucleótido que codifica un polipéptido de los SEQ ID NOS: 6, 10, o 26 y las variantes modificadas conservativamente y polimórficas del mismo, incluyendo los polinucleótidos ilustrativos de los SEQ ID NOS: 5, 9 o 25.

A. Polinucleótidos que Codifican un Polipéptido de la presente invención o Variantes Modificadas Conservativamente o Polimórficas de los Mismos

Como se ha indicado en el apartado (a) anterior, la presente invención proporciona ácidos nucleicos aislados que comprenden un polinucleótido de la presente invención, donde el polinucleótido codifica un polipéptido de la presente invención, o variantes modificadas conservativamente o polimórficas del mismo. Los expertos en la técnica reconocerán que la degeneración del código genético permite que una pluralidad de polinucleótidos codifiquen la secuencia de aminoácidos idéntica. Tales "variaciones silenciosas" se pueden utilizar, por ejemplo, para hibridar selectivamente y detectar las variantes alélicas de los polinucleótidos de la presente invención. Por consiguiente, la presente invención incluye polinucleótidos de los SEQ ID NOS: 5, 9, y 25, y las variaciones silenciosas de los polinucleótidos que codifican un polipéptido de los SEQ ID NOS: 6, 10 y 26. La presente invención proporciona adicionalmente ácidos nucleicos aislados que comprende polinucleótidos que codifican variantes modificadas conservativamente de un polipéptido de los SEQ ID NOS: 6, 10 y 26. Adicionalmente, la presente invención proporciona nuevamente ácidos nucleicos aislados que comprenden polinucleótidos que codifican una o más variantes polimórficas (alélicas) de los polipéptidos/polinucleótidos. Las variantes polimórficas se utilizan frecuentemente para seguir la segregación de las regiones
cromosómicas, por ejemplo, en los métodos de selección ayudados por marcadores para la mejora de las cosechas.

B. Polinucleótidos Amplificados a partir de una Genoteca de Ácido Nucleico de Zea mays

Los polinucleótidos de la presente invención pueden ser amplificados a partir de una genoteca de ácido nucleico de Zea mays, como lo pueden las secuencias adicionales. Las líneas B73, PHRE1, A632, BMS-P2#10, W23, y Mol7 de Zea mays son conocidas y están disponibles para el público. Se pueden obtener otras líneas de maíz conocidas públicamente y asequibles de la Maize Genetics Cooperation (Urbana, IL). La genoteca de ácido nucleico puede ser una genoteca de ADNc, una genoteca genómica, o una genoteca construida generalmente a partir de transcritos nucleares en cualquier fase de procesamiento del intrón. Las genotecas de ADNc se pueden normalizar para aumentar la representación de los ADNc relativamente raros. En las realizaciones opcionales, la genoteca de ADNc se construye utilizando un método de síntesis de ADNc completo. Los ejemplos de tales métodos incluyen la Protección Terminal con Oligos ("Oligo-Capping") (Maruyama, K. y Sugano, S. Gene 138: 171-174, 1.994), Trampa de CAP Biotinilado ("Biotinylated CAP Trapper") (Carninci, P., Kvan, C., et al. Genomics 37: 327-336, 1.996), y Procedimiento de Retención de CAP ("CAP Retention Procedure") (Edery, E., Chu, L.L., et al. Molecular y Cellular Biology 15: 3363-3371, 1.995). La síntesis de ADNc a menudo es catalizada a 50-55ºC para evitar la formación de una estructura secundaria de ARN. Los ejemplos de las transcriptasas inversas que son relativamente estables a estas temperaturas son SuperScript II Reverse Transcriptase (Life Technologies, Inc.), AMV Reverse Transcriptase (Boehringer Mannheim) y RetroAmp Reverse Transcriptase (Epicentre). Los tejidos que crecen rápidamente, o las células que se dividen rápidamente se utilizan preferiblemente como fuentes de ARNm tales como las de los internudos de elongación de las plantas de maíz.

Los polinucleótidos pueden ser amplificados utilizando los siguientes pares de cebadores:

SEQ ID NOS: 3 y 4 que producen un amplicón que comprende una secuencia que tiene identidad sustancial con el SEQ ID NO: 1;

SEQ ID NOS: 7 y 8 que producen un amplicón que comprende una secuencia que tiene identidad sustancial con el SEQ ID NO: 5 de la invención, y

SEQ ID NOS: 11 y 12 que producen un amplicón que comprende una secuencia que tiene identidad sustancial con el SEQ ID NO: 9 de la invención.

SEQ ID NOS: 15 y 16 que producen un amplicón que comprende una secuencia que tiene identidad sustancial con el SEQ ID NO: 13.

SEQ ID NOS: 19 y 20 que producen un amplicón que comprende una secuencia que tiene identidad sustancial con el SEQ ID NO: 17;

SEQ ID NOS: 23 y 24 que producen un amplicón que comprende una secuencia que tiene identidad sustancial con el SEQ ID NO: 21;

SEQ ID NOS: 27 y 28 que producen un amplicón que comprende una secuencia que tiene identidad sustancial con el SEQ ID NO: 25 de la invención.

SEQ ID NOS: 31 y 32 que producen un amplicón que comprende una secuencia que tiene identidad sustancial con el SEQ ID NO: 29.

SEQ ID NOS: 35 y 36 que producen un amplicón que comprende una secuencia que tiene identidad sustancial con el SEQ ID NO: 33;

SEQ ID NOS: 39 y 40 que producen un amplicón que comprende una secuencia que tiene identidad sustancial con el SEQ ID NO: 37; y

SEQ ID NOS: 43 y 44 que producen un amplicón que comprende una secuencia que tiene identidad sustancial con el SEQ ID NO: 41.

SEQ ID NOS: 47 y 48 que producen un amplicón que comprende una secuencia que tiene identidad sustancial con el SEQ ID NO: 45.

SEQ ID NOS: 51 y 52 que producen un amplicón que comprende una secuencia que tiene identidad sustancial con el SEQ ID NO: 49;

SEQ ID NOS: 55 y 56 que producen un amplicón que comprende una secuencia que tiene identidad sustancial con el SEQ ID NO: 53; y

SEQ ID NOS: 59 y 60 que producen un amplicón que comprende una secuencia que tiene identidad sustancial con el SEQ ID NO: 57.

La presente invención también hace referencia a subsecuencias de los polinucleótidos de la presente invención. Se puede obtener una variedad de subsecuencias utilizando los cebadores que hibridan selectivamente en condiciones restrictivas con al menos dos sitios de un polinucleótido de la presente invención, o con dos sitios del ácido nucleico que limitan y comprenden un polinucleótido de la presente invención, o con un sitio de un polinucleótido de la presente invención y un sitio del ácido nucleico que lo comprende. Los cebadores se escogen para que hibriden selectivamente, en condiciones de hibridación restrictivas, con un polinucleótido de la presente invención. Generalmente, los cebadores son complementarios a una subsecuencia del ácido nucleico diana que amplifican. Como los expertos en la técnica apreciarán, los sitios en los cuales hibridarán selectivamente los pares de cebadores se seleccionan de manera que se pueda formar un único ácido nucleico contiguo en las condiciones de amplificación deseadas.

Se pueden construir cebadores de manera que hibriden selectivamente en condiciones restrictivas con una secuencia (o su complemento) en el ácido nucleico diana que comprende el codón que codifica el resto carboxi o amino terminal (esto es, la región codificadora 3' terminal y la región codificadora 5' terminal, respectivamente) de los polinucleótidos de la presente invención. Opcionalmente, los cebadores se construirán para que hibriden selectivamente de manera completa dentro de la región codificadora del polinucleótido diana de la presente invención de manera que el producto de amplificación de una diana de ADNc consista en la región codificadora de ese ADNc. La longitud del cebador en nucleótidos se selecciona del grupo que consiste en al menos 15 a 50. De este modo, los cebadores pueden tener al menos 15, 18, 20, 25, 30, 40, o 50 nucleótidos de longitud. Los expertos reconocerán que se puede emplear la secuencia del cebador alargada para incrementar la especificidad de la unión (esto es, asociación) a una secuencia diana. Se puede añadir una secuencia no asociada en el extremo 5' (una "cola"), por ejemplo, para introducir un sitio de clonación en los extremos terminales del amplicón.

Los productos de la amplificación se pueden traducir utilizando sistemas de expresión bien conocidos por los expertos en la técnica y como se discute, más abajo. Los productos resultantes de la traducción se pueden confirmar como polipéptidos de la presente invención analizando, por ejemplo, la actividad catalítica apropiada (p. ej., actividad específica y/o especificidad de sustrato), o verificando la presencia de uno o más epítopos lineales que son específicos para un polipéptido de la presente invención. Los métodos para la síntesis de proteínas a partir de moldes derivados por PCR son conocidos en la técnica y se encuentran disponibles en el mercado. Véase, p. ej., Amersham Life Sciences, Inc, Catálogo '97, pág.354.

Los métodos para obtener extremos 5' y/o 3' de un inserto vector son bien conocidos en la técnica. Véase, p. ej., RACE (Amplificación Rápida de Extremos Complementarios) como describe Frohman, M. A., en PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, M. A. Innis, D. H. Gelfand, J. J. Sninsky, T. J. White, Eds. (Academic Press, Inc., San Diego, 1.990), págs. 28-38.); véase también, la Patente de los Estados Unidos Núm. 5.470.722, y Current Protocols in Molecular Biology, Unit 15.6, Ausubel, et al., Eds., Greene Publishing y Wiley-Interscience, New York (1.995); Frohman y Martin, Techniques 1:165 (1.989).

C. Polinucleótidos que Hibridan Selectivamente con un Polinucleótido de (A) o (B)

La presente invención también hace referencia a ácidos nucleicos aislados que comprenden los polinucleótidos de la presente invención, donde los polinucleótidos hibridan selectivamente, en condiciones de hibridación selectivas, con un polinucleótido de los párrafos (A) o (B) como se ha mencionado antes, más arriba . Tales polinucleótidos pueden ser utilizados para aislar, detectar, y/o cuantificar ácidos nucleicos que comprenden los polinucleótidos de la invención de (A) o (B). Por ejemplo, tales polinucleótidos se pueden utilizar para identificar, aislar, o amplificar clones parciales o completos en una genoteca depositada. Tales polinucleótidos pueden ser secuencias genómicas o de ADNc aisladas o complementarias de otro modo a un ADNc de una genoteca de ácido nucleico de dicotiledónea o monocotiledónea. Las especies ilustrativas de monocotiledóneas y dicotiledóneas incluyen, pero no están limitadas a: maíz, canola, soja, algodón, trigo, sorgo, girasol, avenas, caña de azúcar, mijo, cebada, y arroz. Opcionalmente, la genoteca de ADNc comprende al menos 80% de secuencias completas, preferiblemente al menos 85% o 90% de secuencias completas, y más preferiblemente al menos 95% de secuencias completas. Las genotecas de ADNc se pueden normalizar para incrementar la representación de secuencias raras. Típicamente, pero no exclusivamente, se emplean condiciones de hibridación poco restrictivas con las secuencias que tienen una identidad de secuencia relativamente reducida con las secuencias complementarias. Opcionalmente se pueden emplear condiciones moderadamente o altamente restrictivas para las secuencias de mayor identidad. Las condiciones poco restrictivas permiten la hibridación selectiva de secuencias que tienen una identidad de secuencia de aproximadamente 70% y se pueden emplear para identificar secuencias ortólogas y parálogas.

E. Polinucleótidos que Codifican una Proteína que tiene una Subsecuencia de un Polipéptido Prototipo y Presenta Reacción Cruzada con el Polipéptido Prototipo

La presente invención también hace referencia a ácidos nucleicos aislados que comprenden los polinucleótidos de la presente invención, donde los polinucleótidos codifican una proteína que tiene una subsecuencia de aminoácidos contiguos de un polipéptido prototipo de la presente invención tales como los proporcionados en (a), antes. La longitud de aminoácidos contiguos del polipéptido prototipo se selecciona del grupo de números enteros que consiste en al menos 10 al número de aminoácidos de la secuencia prototipo. De este modo, por ejemplo, semejante polinucleótido puede codificar un polipéptido que tiene una subsecuencia que tiene al menos 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, o 50, aminoácidos contiguos del polipéptido prototipo. Adicionalmente, el número de tales secuencias codificadas por un polinucleótido de la presente realización puede ser cualquier número entero seleccionado del grupo que consiste en 1 a 20, tal como 2, 3, 4, o 5. Las subsecuencias pueden estar separadas por cualquier número entero de nucleótidos de 1 al número de nucleótidos de la secuencia tal como al menos 5, 10, 15, 25, 50, 100, o 200 nucleótidos. Tales proteínas, cuando se presentan como inmunógenos, logran la producción de anticuerpos policlonales que se unen específicamente a un polipéptido prototipo tal como pero no limitados a, un polipéptido codificado por el polinucleótido de (a) o (b), anterior. Generalmente, no obstante, una proteína codificada por semejante polinucleótido no se une a antisueros originados contra el polipéptido prototipo cuando los antisueros han sido totalmente inmunoabsorbidos con el polipéptido prototipo. Los métodos para elaborar y analizar la especificidad/afinidad de unión al anticuerpo son bien conocidos en la técnica. Los formatos de imunoanálisis ilustrativos incluyen ELISA, inmunoanálisis competitivos, radioinmunoanálisis, transferencias Western, análisis de inmunofluorescencia indirectos y similares.

En un método de análisis preferido, se pueden utilizar antisueros totalmente inmunoabsorbidos y reunidos que se producen para el polipéptido prototipo en un análisis de unión competitivo para someter a ensayo la proteína. Se determina la concentración del polipéptido prototipo requerida para inhibir un 50% de la unión del antisuero al polipéptido prototipo. Si la cantidad de la proteína requerida para inhibir la unión es menor de dos veces la cantidad de proteína prototipo, se dice que la proteína se une específicamente a los antisueros obtenidos para el inmunógeno. Por consiguiente, las proteínas de la presente invención abarcan variantes alélicas, variantes modificadas conservativamente, y modificaciones recombinantes mínimas para un polipéptido prototipo.

Semejante polinucleótido codifica opcionalmente una proteína que tiene un peso molecular para la proteína no glicosilada dentro del 20% del peso molecular de los polipéptidos no glicosilados completos de la presente invención. El peso molecular se puede determinar fácilmente mediante SDS-PAGE en condiciones reductoras. Preferiblemente, el peso molecular está dentro del 15% de un polipéptido completo de la presente invención, más preferiblemente dentro del 10% o 5%, y muy preferiblemente dentro del 3%, 2%, o 1 % de un polipéptido completo de la presente invención. La determinación del peso molecular de una proteína se puede realizar convenientemente mediante SDS-PAGE en condiciones desnaturalizantes.

Opcionalmente, semejantes polinucleótidos de esta realización codificarán una proteína que tiene una actividad específica de al menos 50%, 60%, 80%, o 90% del polipéptido completo nativo, endógeno (esto es, no aislado), de la presente invención. Adicionalmente, las proteínas codificadas por dichos polinucleótidos tendrán opcionalmente una constante de afinidad (K_{m}) y/o una actividad catalítica (esto es, constante de velocidad microscópica, K_{cat}) sustancialmente similares a las de la proteína completa, nativa endógena. Los expertos en la técnica reconocerán que el valor k_{car}/K_{m} determina la especificidad para sustratos que compiten y a menudo es referido como constante de especificidad. Tales proteínas pueden tener un valor K_{car}/K_{m} de al menos 10% del polipéptido completo no aislado determinado utilizando el sustrato endógeno de ese polipéptido. Opcionalmente, el valor k_{car}/K_{m} será de al menos 20%, 30%, 40%, 50%, y muy preferiblemente al menos 60%, 70%, 80%, 90%, o 95% del valor k_{car}/K_{m} del polipéptido completo no aislado de la presente invención. La determinación de k_{car}, K_{m}, y k_{car}/K_{m} se puede determinar mediante cualquiera de los numerosos medios bien conocidos por los expertos en la técnica. Por ejemplo, las velocidad iniciales (esto es, el primer 5% o menos de la reacción) se pueden determinar utilizando técnicas de mezcla y muestreo rápidas (p. ej., técnicas de flujo continuo, flujo detenido, o extinción rápida), fotolisis instantánea, o métodos de relajación (p. ej., saltos de temperatura) junto con métodos ilustrativos de medición de espectrofotometría, espectrofluorimetría, resonancia magnética nuclear, o procedimientos radiactivos. Los valores cinéticos se obtienen convenientemente utilizando un gráfico Lineweaver-Burk o Eadie-Hofstee.

F. Polinucleótidos Complementarios a los Polinucleótidos de (A)-(E)

La presente invención hace referencia a ácidos nucleicos aislados que comprenden polinucleótidos complementarios a los polinucleótidos de los párrafos A - E, anteriores. Como reconocerán los expertos en la técnica, las secuencias complementarias emparejan las bases durante la totalidad de su longitud con los polinucleótidos de A - E (esto es, tienen una identidad de secuencia del 100% a lo largo de toda su longitud). Las bases complementarias se asocian por enlaces de hidrógeno en los ácidos nucleicos de doble hebra. Por ejemplo, los siguientes pares de bases son complementarios: guanina y citosina; adenina y timina; y adenina y uracilo.

G. Polinucleótidos que son Subsecuencias de los polinucleótidos de (A)-(F)

La presente invención también hace referencia a ácidos nucleicos aislados que comprenden polinucleótidos que comprenden al menos 15 bases contiguas de los polinucleótidos de (A) a (F) mencionados antes. La longitud del polinucleótido se da como un número entero seleccionado del grupo que consiste en al menos 15 a la longitud de la secuencia de ácido nucleico de la cual el polinucleótido es una subsecuencia. De este modo, por ejemplo, tales polinucleótidos pueden comprender al menos 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 75, o 100 nucleótidos contiguos de largo a partir de los polinucleótidos de (A)-(F). Opcionalmente, el número de tales subsecuencias puede ser cualquier número entero seleccionado del grupo que consiste en 1 a 20, tal como 2, 3, 4, o 5. Las subsecuencias pueden estar separadas por cualquier número entero de nucleótidos desde 1 hasta el número de nucleótidos de la secuencia tal como al menos 5, 10, 15, 25, 50, 100, o 200 nucleótidos. Tales subsecuencias pueden comprender características estructurales de la secuencia de la cual derivan. Alternativamente, las subsecuencias pueden carecer de ciertas características estructurales de la secuencia más larga de la cual derivan. Por ejemplo, una subsecuencia de un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene al menos un epítopo lineal en común con una secuencia polipeptídica prototipo proporcionada en (a), antes, puede codificar un epítopo en común con la secuencia prototipo. Alternativamente, la subsecuencia puede no codificar un epítopo en común con la secuencia prototipo pero se puede utilizar para aislar la secuencia más grande, por ejemplo hibridación del ácido nucleico con la secuencia de la cual deriva. Se pueden utilizar subsecuencias para modular o detectar la expresión génica introduciendo en las subsecuencias compuestos que se unen, intercalan, escinden y/o entrecruzan con ácidos nucleicos. Los compuestos ilustrativos incluyen productos conjugados de acridina, psoraleno, fenantrolina, naftoquinona, daunomicina o cloroetilaminoarilo.

Construcción de Ácidos nucleicos

Los ácidos nucleicos aislados de la presente invención se pueden elaborar utilizando (a) métodos recombinantes normalizados, (b) técnicas sintéticas, o combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, los polinucleótidos de la presente invención se clonarán, amplificarán, o construirán de otro modo a partir de una monocotiledónea. En las realizaciones preferidas la monocotiledónea es Zea mays.

Los ácidos nucleicos pueden comprender convenientemente secuencias además de un polinucleótido de la presente invención. Por ejemplo, un sitio de multi-clonación que comprende uno o más sitios para endonucleasas de restricción se puede insertar en el ácido nucleico para ayudar al aislamiento del polinucleótido. También, se pueden insertar secuencias traducibles para ayudar al aislamiento del polinucleótido traducido de la presente invención. Por ejemplo, una secuencia marcadora de hexa-histidina proporciona un método conveniente para purificar las proteínas de la presente invención. Un polinucleótido de la presente invención se puede anclar a un vector, adaptador, o conector para clonar y/o expresar un polinucleótido de la presente invención. Se pueden añadir secuencias adicionales a tales secuencias de clonación y/o expresión para optimizar su función en la clonación y/o expresión, para ayudar al aislamiento del polinucleótido, o para mejorar la introducción del polinucleótido en una célula. Típicamente, la longitud del ácido nucleico de la presente invención menos la longitud de su polinucleótido de la presente invención es menor de 20 kilopares de base, a menudo menor de 15 kb, y frecuentemente menor de 10 kb. El uso de vectores de clonación, vectores de expresión, adaptadores, y conectores es bien conocido y está ampliamente descrito en el técnica. Para una descripción de diversos ácidos nucleicos véase, por ejemplo, Stratagene Cloning Systems, Catálogos 1995, 1996, 1997 (La Jolla, CA); y, Amersham Life Sciences, Inc, Catálogo '97 (Arlington Heights, IL).

A. Métodos Recombinantes para Construir Ácidos nucleicos

Se pueden obtener composiciones de ácido nucleico aislado de esta invención, tales como ARN, ADNc, ADN genómico, o un híbrido de los mismos, a partir de fuentes biológicas vegetales utilizando cualquiera de las numerosas metodologías de clonación conocidas por los expertos en la técnica. En algunas realizaciones, se utilizan sondas de oligonucleótidos que hibridan selectivamente, en condiciones restrictivas, con los polinucleótidos de la presente invención para identificar la secuencia deseada en una genoteca de ADNc o ADN genómico. Si bien el aislamiento de ARN, y la construcción de genotecas de ADNc y genómicas son bien conocidos por los expertos normales en la técnica, lo siguiente destaca algunos de los métodos empleados.

A1. Aislamiento y Purificación de ARNm

El ARN total de las células vegetales comprende ácidos nucleicos tales como ARN mitocondrial, ARN cloroplástico, ARNr, ARNt, ARNhn y ARNm. La preparación de ARN total implica típicamente la lisis de las células y la eliminación de las proteínas, seguido de la precipitación de los ácidos nucleicos. La extracción del ARN total de las células vegetales se puede completar mediante una variedad de métodos. Frecuentemente, los tampones de extracción incluyen un detergente fuerte tal como SDS y un desnaturalizante orgánico tal como isotiocianato de guanidinio, hidrocloruro de guanidina o fenol. Después del aislamiento del ARN total, se purifica típicamente el ARNm poli(A)^{+} del resto del ARN utilizando celulosa oligo(dT). Los protocolos de aislamiento de ARN total y de ARNm ilustrativos se describen en Plant Molecular Biology: A Laboratory Manual, Clark, Ed., Springer-Verlag, Berlin (1.997); y, Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, et al., Eds., Greene Publishing y Wiley-Interscience, New York (1.995). Se encuentran disponibles en el mercado kits de aislamiento de ARN total y ARNm tales como Stratagene (La Jolla, CA), Clonetech (Palo Alto, CA), Pharmacia (Piscataway, NJ), y 5'-3' (Paoli, PA). Véanse también, las Patentes de los Estados Unidos Núms. 5.614.391; y, 5.459.253. El ARNm puede ser fraccionado en poblaciones con intervalos de tamaño de aproximadamente 0,5, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5 o 3,0 kb. El ADNc sintetizado para cada una de estas fracciones se puede seleccionar por tamaños en el mismo intervalo de tamaño que su ARNm antes de la inserción del vector. Este método ayuda a eliminar el ADNc truncado formado por el ARNm sometido a una transcripción inversa incompleta.

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A2. Construcción de una Genoteca de ADNc

La construcción de una genoteca de ADNc generalmente abarca cinco etapas. Primero, se inicia la síntesis de la primera hebra del ADNc a partir de un molde de ARNm poli(A)^{+} utilizando un cebador poli(dT) o hexanucleótidos al azar. Segundo, el híbrido de ARN-ADN resultante se convierte en un ADNc de doble hebra, típicamente mediante una combinación de ARNasa H y ADN polimerasa I (o fragmento de Klenow). Tercero, los extremos del ADNc de doble hebra se ligan a los adaptadores. La ligación de los adaptadores producirá extremos cohesivos para la clonación. Cuarto, la selección por tamaños del ADNc de doble hebra elimina el exceso de adaptadores y fragmentos de cebador, y elimina las moléculas de ADNc parcial debido a la degradación de los ARNm o al fracaso de la transcriptasa inversa para sintetizar primeras hebras completas. Quinto, los ADNc se ligan en vectores de clonación y se empaquetan . Los protocolos de síntesis de ADNc son bien conocidos por los expertos y se describen en referencias normalizadas tales como: Plant Molecular Biology: A Laboratory Manual, Clark, Ed., Springer-Verlag, Berlin (1.997); y, Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, et al., Eds., Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York (1.995). Se encuentran disponibles kits para la síntesis de ADNc de una variedad de suministradores comerciales tales como Stratagene o Pharmacia.

Se han descrito numerosos protocolos de síntesis de ADNc que proporcionan genotecas de ADNc completos sustancialmente puros. Se construyen genotecas de ADNc completos sustancialmente puros para que comprendan al menos 90%, y más preferiblemente al menos 93% o 95% de insertos completos entre los insertos que contienen clones. La longitud del inserto en tales genotecas puede ser de 0 a 8, 9, 10, 11, 12, 13, o más kilopares de bases. Los vectores para acomodar los insertos de estos tamaño son conocidos en la técnica y están disponibles en el mercado. Véase, p. ej., Lambda ZAP Express de Stratagene (vector de clonación de ADNc con capacidad para clonar de 0 a 12 kb).

Un método ilustrativo para la construcción de una genoteca de ADNc completo puro en más del 95% es descrito por Carninci et al., Genomics, 37:327-336 (1.996). En ese protocolo, se marca químicamente con biotina una estructura protegida terminalmente de ARNm eucariótico. Utilizando cuentas magnéticas recubiertas con estreptavidina, solamente se recuperan selectivamente los híbridos de ADNc/ARNm de la primera hebra completa después del tratamiento con ARNasa I. El método proporciona una genoteca de elevado rendimiento con una representación imparcial de la población de ARNm de partida. Se conocen en la técnica otros métodos para producir genotecas completas. Véase, p. ej., Edery et al., Mol. Cell Biol., 15(6):3363-3371 (1.995); y, Solicitud PCT WO 96/34981.

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A3. Genotecas de ADNc Normalizadas o Sustraídas

Una genoteca de ADNc no normalizada representa la población de ARNm del tejido del cual está elaborada. Puesto que los clones únicos son superados en número por los clones derivados de los genes altamente expresados su aislamiento puede ser laborioso. La normalización de una genoteca de ADNc es el proceso de creación de una genoteca en la cual cada clon está representado más equitativamente.

Se conocen en la técnica numerosos enfoques para normalizar las genotecas de ADNc. Un enfoque se basa en la hibridación con ADN genómico. La frecuencia de cada ADNc hibridado en la genoteca normalizada resultante sería proporcional a la de cada gen correspondiente en el ADN genómico. Otro enfoque se basa en la cinética. Si la reasociación del ADNc sigue una cinética de segundo orden, las especies más raras se asocian menos rápidamente y las fracciones de ADNc de hebra sencilla restantes se vuelven progresivamente más normalizadas durante el transcurso de la hibridación. La pérdida específica de cualquiera de las especies de ADNc, con independencia de su abundancia, no se produce a cualquier valor Cot. La construcción de genotecas normalizadas la describen Ko, en Nucl. Acids. Res., 18(1.9):5705-5711 (1.990); Patanjali et al., Proc. Natl. Acad. U.S.A., 88:1943-1947 (1.991); Patentes de los Estados Unidos 5.482.685, y 5.637.685. En un método ilustrativo descrito por Soares et al., la normalización daba como resultado la reducción de la abundancia de clones a partir de un intervalo de cuatro órdenes de magnitud hasta un intervalo estrecho de solamente 1 orden de magnitud. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:9228-9232 (1.994).

Las genotecas de ADNc sustraídas son otro método para incrementar la proporción de especies de ADNc menos abundantes. En este procedimiento, el ADNc preparado a partir de una reserva de ARNm presenta una merma de secuencias presentes en una segunda reserva de ARNm mediante hibridación. Los híbridos de ADNc:ARNm se eliminan y el resto de la reserva de ADNc que no ha hibridado se enriquece en cuanto a secuencias únicas para esa reserva. Véase, Foote et al. en, Plant Molecular Biology: A Laboratory Manual, Clark, Ed., Springer-Verlag, Berlin (1.997); Kho y Zarbl, Technique, 3(2):58-63 (1.991); Sive y St. John, Nucl. Acids Res., 16(22):10937 (1.988); Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, et al., Eds., Greene Publishing y Wiley-Interscience, New York (1.995); y, Swaroop et al., Nucl. Acids Res., 19)8):1954 (1.991). Los estuches de sustracción de ADNc se encuentran disponibles en el mercado. Véase, p. ej., PCR-Select (Clontech).

A4. Construcción de una Genoteca Genómica

Para construir genotecas genómicas, se generan grandes segmentos de ADN genómico mediante fragmentación al azar, p. ej. utilizando endonucleasas de restricción, y se ligan con un ADN vector para formar concatámeros que se pueden empaquetar en el vector apropiado. Las metodologías para completar estos extremos, y los métodos de secuenciación para verificar la secuencia de los ácidos nucleicos son bien conocidos en la técnica. Los ejemplos de las técnicas de biología molecular apropiadas y las instrucciones suficientes para dirigir a las personas expertas a través de muchas de las metodologías de construcción, clonación, y escrutinio se encuentran en Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Vols. 1-3 (1.989), Methods in Enzymology, Vol. 152: Guide to Molecular Cloning Techniques, Berger y Kimmel, Eds., San Diego: Academic Press, Inc. (1.987), Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, et al., Eds., Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York (1.995); Plant Molecular Biology: A Laboratory Manual, Clark, Ed., Springer-Verlag, Berlin (1.997). Los kits para la construcción de genotecas genómicas se encuentran disponibles en el mercado.

A5. Escrutinio de Ácidos nucleicos y Métodos de Aislamiento

La genoteca de ADNc o genómica puede ser escrutada utilizando una sonda basada en la secuencia de un polinucleótido de la presente invención tal como los descritos en la presente memoria. Se pueden utilizar sondas para hibridar con el ADN genómico o secuencias de ADNc para aislar genes homólogos en una especie de planta igual o diferente. Los expertos en la técnica apreciarán que se pueden emplear en este análisis diversos grados de restricción en la hibridación; y pueden ser restrictivos la hibridación o el medio de lavado. A medida que las condiciones de hibridación se vuelven más restrictivas, debe haber un mayor grado de complementariedad entre la sonda y la diana para que se produzca la formación del dúplex. El grado de restricción se puede controlar por medio de la temperatura, la fuerza iónica, el pH y la presencia de un disolvente parcialmente desnaturalizante tal como la formamida. Por ejemplo, la restricción de hibridación varía convenientemente cambiando la polaridad de la solución reaccionante por medio de la manipulación de la concentración de formamida dentro en el intervalo del 0% al 50%. El grado de complementariedad (identidad de la secuencia) requerido para una unión detectable variará de acuerdo con la restricción del medio de hibridación y/o el medio de lavado. El grado de complementariedad será óptimamente del 100 por cien; no obstante, se debe entender que las variaciones mínimas de la secuencia en las sondas y cebadores pueden ser compensadas reduciendo la restricción de la hibridación y/o el medio de lavado.

Los ácidos nucleicos de interés también pueden ser amplificados a partir de muestras de ácido nucleico utilizando técnicas de amplificación. Por ejemplo, se puede utilizar la tecnología de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para amplificar las secuencias de polinucleótidos de la presente invención y los genes relacionados directamente a partir de las genotecas de ADN genómico o ADNc. También pueden ser útiles la PCR y otros métodos de amplificación in vitro, por ejemplo, para clonar secuencias de ácido nucleico que codifican las proteínas que se van a expresar, para elaborar ácidos nucleicos para utilizarlos como sondas para detectar la presencia del ARNm deseado en las muestras, para la secuenciación de ácido nucleico, o para otros fines. Los ejemplos de las técnicas suficientes para dirigir a los expertos a través de los métodos de amplificación in vitro se encuentran en Berger, Sambrook, y Ausubel, así como Mullis et al., Patente de los Estados Unidos Núm. 4.683.202 (1.987); y, PCR Protocols A Guide to Methods and Applications, Innis et al., Eds., Academic Press Inc., San Diego, CA (1.990). Los kits disponibles en el mercado para la amplificación mediante PCR genómica son conocidos en la técnica. Véase, p. ej., Advantage-GC Genomic PCR Kit (Clontech). Se puede utilizar la proteína 32 del gen T4 (Boehringer Mannheim) para mejorar el rendimiento de productos de la PCR largos.

También se han descrito métodos de escrutinio basados en la PCR. Wilfinger et al. describen un método basado en la PCR en el cual el ADNc más largo se identifica en la primera etapa de manera que los clones incompletos se pueden eliminar del estudio. BioTechniques, 22(3): 481-486 (1.997). En ese método, se sintetiza un par de cebadores con un cebador que se asocia al extremo 5' de la hebra efectora del ADNc deseado y el otro cebador al vector. Los clones se reúnen para permitir el escrutinio a gran escala. Mediante este procedimiento, el clon más largo posible es identificado entre los clones candidato. Adicionalmente, se utiliza solamente el producto de la PCR como diagnóstico para la presencia del ADNc deseado y no se utiliza el propio producto de la PCR. Tales métodos son particularmente eficaces combinados con la metodología de construcción de ADNc completo, anterior.

B. Métodos Sintéticos para Construir Ácidos nucleicos

Los ácidos nucleicos aislados de la presente invención también se pueden preparar mediante síntesis química directa por medio de métodos tales como el método del fosfotriéster de Narang et al., Meth. Enzymol. 68: 90-99 (1.979); el método del fosofodiéster de Brown et al., Meth. Enzymol. 68: 109-151 (1.979); el método de la dietilfosforamidita de Beaucage et al., Tetra. Lett. 22: 1859-1862 (1.981); el método del triéster de fosforamidita en fase sólida descrito por Beaucage y Caruthers, Tetra. Letts. 22(20): 1859-1862 (1.981), p. ej., utilizando un sintetizador automatizado p. ej., como describen Needham-VanDevanter et al., Nucleic Acids Res., 12: 6159-6168 (1.984); y, el método del soporte sólido de la Patente de los Estados Unidos Núm. 4.458.066. Generalmente la síntesis química produce un oligonucleótido de hebra sencilla. Este se puede convertir en ADN de doble hebra mediante hibridación con una secuencia complementaria, o mediante polimerización con una ADN polimerasa utilizando la hebra sencilla como molde. Un experto en la técnica reconocerá que mientras la síntesis química de ADN está limitada a secuencias de aproximadamente 100 bases, se pueden obtener secuencias más largas mediante ligación de secuencias más cortas.

Casetes de Expresión Recombinantes

La presente invención proporciona adicionalmente casetes de expresión recombinantes que comprenden un ácido nucleico de la presente invención. La secuencia de ácido nucleico que codifica el polinucleótido deseado de la presente invención, por ejemplo un ADNc o una secuencia genómica que codifica un polipéptido completo de la presente invención, se puede utilizar para construir una casete de expresión recombinante que se puede introducir en la célula anfitriona deseada. Una casete de expresión recombinante comprenderá típicamente un polinucleótido de la presente invención conectado operablemente a secuencias reguladoras del inicio de la transcripción que dirigirán la transcripción del polinucleótido en una célula anfitriona deseada, tal como los tejidos de una planta transformada.

Por ejemplo, los vectores de expresión vegetales pueden incluir (1) un gen vegetal clonado bajo el control de secuencias reguladoras 5' y 3' y (2) un marcador seleccionable dominante. Tales vectores de expresión vegetales también pueden contener, si se desea, una región reguladora del promotor (p. ej., una que confiere una expresión inducible o constitutiva, regulada medioambientalmente o evolutivamente, o específica/selectiva de la célula o tejido), un sitio de arranque del inicio de la transcripción, un sitio de unión al ribosoma, una señal de procesamiento del ARN, un sitio de terminación de la transcripción, y/o una señal de poliadenilación.

Se puede emplear un fragmento promotor vegetal que dirija la expresión directa de un polinucleótido de la presente invención en todos los tejidos de una planta regenerada. Tales promotores son referidos en la presente memoria como promotores "constitutivos" y son activos en la mayoría de las condiciones medioambientales y estados de evolución o diferenciación celular. Los ejemplos de los promotores constitutivos incluyen la región de inicio de la transcripción 35S del virus del mosaico de la coliflor (CaMV), el promotor 1' o 2' derivado de ADN-T de Agrobacterium tumefaciens, el promotor de la ubiquitina 1, el promotor Smas, el promotor de la cinamil alcohol deshidrogenasa (Patente de los Estados Unidos Núm. 5.683.439), el promotor Nos, el promotor pEmu, el promotor de la rubisco, el promotor GRP1-8, el promotor de la actina, el promotor F3.7, y otras regiones de inicio de la transcripción de diversos genes vegetales conocidos por los expertos.

Alternativamente, el promotor vegetal puede dirigir la expresión de un polinucleótido de la presente invención en un tejido específico o puede estar de otro modo bajo el control medioambiental o evolutivo más preciso. Tales promotores son referidos aquí como promotores "inducibles". Las condiciones medioambientales que pueden tener efecto sobre la transcripción mediante promotores inducibles incluyen el ataque de patógenos, las condiciones anaerobias, o la presencia de luz. Los ejemplos de promotores inducibles son el promotor Adh1 que es inducible por hipoxia o estrés por frío, el promotor Hsp70 que es inducible por estrés por calor, y el promotor PDDK que es inducible por la luz.

Los ejemplos de los promotores bajo el control evolutivo incluyen los promotores que inician la transcripción solamente, o preferentemente, en ciertos tejidos, tales como hojas, raíces, frutos, semillas, o flores. El funcionamiento de un promotor también puede variar dependiendo de su localización en el genoma. De este modo, un promotor inducible se puede volver totalmente o parcialmente constitutivo en ciertas localizaciones.

Se pueden emplear promotores tanto heterólogos como no heterólogos (esto es, endógenos) para dirigir la expresión de los ácidos nucleicos de la presente invención. Estos promotores también se pueden utilizar, por ejemplo, en casetes de expresión recombinantes para dirigir la expresión de ácidos nucleico antisentido para reducir, incrementar, o alterar la concentración y/o composición de las proteínas de la presente invención en un tejido deseado. De este modo, en algunas realizaciones, el constructo de ácido nucleico comprenderá un promotor funcional en una célula vegetal, por ejemplo en Zea mays, conectado operablemente a un polinucleótido de la presente invención. Los promotores útiles en estas realizaciones incluyen los promotores endógenos que conducen la expresión de un polipéptido de la presente invención.

En algunas realizaciones, se pueden introducir ácidos nucleicos aislados que sirven como elementos promotores o intensificadores en la posición apropiada (generalmente aguas arriba) de una forma no heteróloga de un polinucleótido de la presente invención con el fin de regular al alza o a la baja la expresión de un polinucleótido de la presente invención. Por ejemplo, se pueden alterar promotores endógenos in vivo mediante mutación, deleción, y/o sustitución (véase, Kmiec, Patente de los Estados Unidos 5.565.350; Zarling et al., PCT/US93/03868), o se pueden introducir promotores aislados en una célula vegetal en la orientación y a la distancia apropiada de un gen de la presente invención con el fin de controlar la expresión del gen. La expresión del gen puede ser modulada en condiciones adecuadas para el crecimiento de la planta con el fin de alterar la concentración total y/o alterar la composición de los polipéptidos de la presente invención en la célula vegetal. De este modo, la presente invención proporciona composiciones, y métodos para elaborar, promotores y/o intensificadores heterólogos conectados operablemente a una forma nativa, endógena (esto es no heteróloga) de un polinucleótido de la presente invención.

Los métodos para identificar los promotores con un patrón de expresión concreto, en términos, p. ej., del tipo de tejido, tipo de célula, fase de desarrollo, y/o condiciones medioambientales, son bien conocidos en la técnica. Véase, p. ej., The Maize Handbook, Capítulos 114-115, Freeling y Walbot, Eds., Springer, New York (1.994); Corn y Corn Improvement, 3ª edición, Capítulo 6, Sprague y Dudley, Eds., American Society of Agronomy, Madison, Wisconsin (1.988). Una etapa típica en los métodos de aislamiento de promotores es la identificación de productos génicos que son expresados con cierto grado de especificidad en el tejido diana. En la gama de metodologías se encuentran: hibridación diferencial con genotecas de ADNc; hibridación sustractiva; presentación diferencial; electroforesis en gel de proteína 2-D diferencial; matrices de sondas de ADN; y aislamiento de proteínas conocidas por ser expresadas con cierta especificidad en el tejido diana. Tales métodos son bien conocidos por los expertos en la técnica. Los productos disponibles en el mercado para identificar promotores son conocidos en la técnica tales como el Universal GenomeWalker Kit de Clontech (Palo Alto, CA).

Para los métodos basados en proteínas, es útil obtener la secuencia de aminoácidos para al menos una porción de la proteína identificada, y después utilizar la secuencia de la proteína como base para preparar un ácido nucleico que se puede utilizar como sonda para identificar o bien el ADN genómico directamente, o bien preferiblemente, identificar un clon de ADNc de una genoteca preparada a partir del tejido diana. Una vez que semejante clon de ADNc ha sido identificado, se puede utilizar esa secuencia para identificar la secuencia en el extremo 5' del transcrito del gen indicado. Para la hibridación diferencial, la hibridación sustractiva y la presentación diferencial, la secuencia de ácido nucleico identificada como enriquecida en el tejido diana se utiliza para identificar la secuencia en el extremo 5' del transcrito del gen indicado. Una vez que las secuencias son identificadas, partiendo de las secuencias de proteína o de las secuencias de ácido nucleico, se puede utilizar cualquiera de estas secuencias identificadas por ser del transcrito génico para escrutar una genoteca genómica preparada a partir del organismo diana. Los métodos para identificar y confirmar el sitio de inicio de la transcripción son bien conocidos en la técnica.

En el procedimiento de aislamiento de los promotores expresados en condiciones o tensiones medioambientales concretas, o en tejidos específicos, o en fases del desarrollo concretas, se identifican numerosos genes que son expresados en las circunstancias deseadas, en el tejido deseado, o en la fase deseada. El análisis adicional revelará la expresión de cada gen concreto en uno o más tejidos distintos de la planta. Se puede identificar un promotor con actividad en el tejido o la condición deseada pero ése no tiene actividad en ningún otro tejido común.

Para identificar la secuencia promotora, se analizan las porciones 5' de los clones descritos aquí en cuanto a las secuencias características de las secuencias promotoras. Por ejemplo, los elementos de la secuencia promotora incluyen la secuencia consenso de la caja TATA (TATAAT), que es normalmente un tramo rico en AT de 5-10 pb localizado aproximadamente 20 a 40 pares de bases aguas arriba del sitio de inicio de la transcripción. La identificación de la caja TATA es bien conocida en la técnica. Por ejemplo, se puede predecir la localización de este elemento para identificar el sitio de inicio de la transcripción utilizando mecanismos de mapeo de ARN normalizados tales como la extensión con cebadores, el análisis con S1, y/o la protección con ARNasa. Para confirmar la presencia de la secuencia rica en AT, se puede realizar un análisis estructura-función que implica la mutagénesis de la supuesta región y la cuantificación del efecto de la mutación sobre la expresión de un gen informador conectado aguas abajo. Véase, p. ej., The Maize Handbook, Capítulo 114, Freeling y Walbot, Eds., Springer, New York, (1.994).

En las plantas, más aguas arriba de la caja TATA, en las posiciones -80 a -100, existe típicamente un elemento promotor (esto es, la caja CAAT) con una serie de adeninas rodeando el trinucleótido G (o T) N G. J. Messing et al., en Genetic Engineering in Plants, Kosage, Meredith y Hollaender, Eds., págs. 221-227 1.983. En el maíz, no existe una caja CAAT bien conservada, pero existen numerosos motivos de unión a proteína conservados, cortos aguas arriba de la caja TATA. Estos incluyen motivos para factores de transcripción que actúan en trans implicados en la regulación de la luz, la inducción anaerobia, la regulación hormonal, o la biosíntesis de antocianina, según sea apropiado para cada gen.

Una vez que se conocen las secuencias del promotor y/o el gen, se selecciona una región del tamaño adecuado del ADN genómico que se encuentra 5' con respecto al inicio transcripcional, o el sitio de inicio de la traducción, y tales secuencias se conectan después a una secuencia codificadora. Si se utiliza el sitio de inicio de la transcripción como punto de fusión, se puede utilizar cualquiera de las numerosas regiones no traducidas 5' posibles entre el sitio de inicio de la transcripción y la secuencia codificadora parcial. Si se utiliza el sitio de inicio de la traducción en el extremo 3' del promotor especifico, éste se conecta directamente al codón de iniciación metionina de una secuencia codificadora.

Si se desea la expresión del polipéptido, generalmente es deseable incluir una región de poliadenilación en el extremo 3' de una región codificadora del polinucleótido. La región de poliadenilación puede derivar del gen natural, de una variedad de otros genes vegetales, o del ADN-T. La secuencia del extremo 3' que se va a añadir puede derivar, por ejemplo, de los genes de la nopalina sintasa o la octopina sintasa, o alternativamente de otro gen vegetal, o menos preferiblemente de cualquier otro gen eucariótico.

Se puede añadir una secuencia intrónica a la región no traducida 5' o la secuencia codificadora de la secuencia codificadora parcial para incrementar la cantidad de mensaje maduro que se acumula en el citosol. Se ha demostrado que la inclusión de un intrón empalmable en la unidad de transcripción en ambos constructos de expresión vegetales y animales incrementa la expresión génica a nivel tanto de ARNm como de proteína hasta 1.000 veces. Buchman y Berg, Mol. Cell Biol. 8: 4395-4405 (1.988); Callis et al., Genes Dev. 1: 1183-1200 (1.987). Semejante potenciación intrónica de la expresión del gen es típicamente máxima cuando se coloca cerca del extremo 5' de la unidad de transcripción. El uso de los intrones de maíz intrón Adh1-S 1, 2, y 6, intrón Bronze-1 es conocido en la técnica. Véase generalmente, The Maize Handbook, Capítulo 116, Freeling y Walbot, Eds., Springer, New York (1.994).

El vector que comprende las secuencias de un polinucleótido de la presente invención comprenderá típicamente un gen marcador que confiere un fenotipo seleccionable en células vegetales. Normalmente, el gen marcador seleccionable codificará la resistencia a antibióticos, con genes adecuados que incluyen genes que codifican la resistencia al antibiótico espectinomicina (p. ej., el gen aada), el gen de la estreptomicin-fosfotransferasa (SPT) que codifica la resistencia a la estreptomicina, el gen de la neomicin-fosfotransferasa (NPTII) que codifica la resistencia a la kanamicina o a la geneticina, el gen de la higromicin-fosfotransferasa (HPT) que codifica la resistencia a la higromicina, los genes que codifican la resistencia a los herbicidas que actúan inhibiendo la acción de la acetolactato sintasa (ALS), en particular los herbicidas de tipo sulfonilurea (p. ej., el gen de la acetolactato sintasa (ALS) que contiene mutaciones que conducen a semejante resistencia en particular las mutaciones S4 y/o Hra), los genes que codifican la resistencia a herbicidas que actúan inhibiendo la acción de la glutamina sintasa, tales como la fosfinotricina o basta (p. ej., el gen bar), u otros genes conocidos en la técnica. El gen bar codifica la resistencia al herbicida basta, el gen nptII codifica la resistencia a los antibióticos kanamicina y geneticina, y el gen ALS codifica la resistencia al herbicida
clorosulfón.

Los vectores típicos útiles para la expresión de los genes en plantas superiores son bien conocidos en la técnica e incluyen vectores derivados del plásmido inductor de tumores (Ti) de Agrobacterium tumefaciens descrito por Rogers et al., Meth. In Enzymol., 153:253-277 (1.987). Estos vectores son vectores integrantes de las plantas, ya que en la transformación los vectores integran una porción del ADN del vector en el genoma de la planta anfitriona. Los vectores de A. tumefaciens ilustrativos útiles en la presente memoria son los plásmidos pKYLX6 y pKYLX7 de Schardl et al., Gene, 61:1-11 (1.987) y Berger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 86:8402-8406 (1.989). Otro vector útil en la presente memoria es el plásmido pBI101.2 que es asequible de Clontech Laboratories, Inc. (Palo Alto, CA).

Un polinucleótido de la presente invención puede ser expresado en orientación efectora o antisentido según se desee. Se apreciará que el control de la expresión génica en orientación tanto efectora como antisentido puede tener un impacto directo sobre las características observables de la planta. La tecnología antisentido se puede utilizar convenientemente para la expresión de genes en plantas. Para lograr esto, se clona un segmento de ácido nucleico del gen deseado y se conecta operablemente a un promotor de manera que se transcriba la hebra antisentido del ARN. El constructo es transformado después en las plantas y se produce la hebra antisentido del ARN. El ARN inhibe la expresión del gen evitando la acumulación del ARNm que codifica la enzima de interés, véase, p. ej., Sheehy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 85: 8805-8809 (1,988); y Hiatt et al., Patente de los Estados Unidos Núm. 4.801.340.

Otro método de supresión es la supresión en sentido. Se ha demostrado que la introducción de ácido nucleico configurado en la orientación sentido es un método eficaz mediante el cual se bloquea la transcripción de los genes diana. Para un ejemplo del uso de este método para modular la expresión de genes endógenos véase, Napoli et al., The Plant Cell 2: 279-289 (1.990) y la Patente de los Estados Unidos Núm. 5.034.323.

También se pueden utilizar moléculas de ARN catalítico o ribozimas para inhibir la expresión de genes vegetales. Es posible diseñar ribozimas que se emparejen específicamente con virtualmente cualquier ARN diana y escindan el esqueleto de fosfodiéster en una localización especifica, inactivando de ese modo funcionalmente el ARN diana. Al llevar a cabo esta escisión, la propia ribozima no es alterada, y de este modo es capaz de reciclarse y escindir otras moléculas, convirtiéndola en la verdadera enzima. La inclusión de secuencias de ribozima en los ARN antisentido les confiere actividad de escisión del ARN, aumentando de ese modo la actividad de los constructos. El diseño y uso de las ribozimas específicas del ARN diana lo describen Haseloff et al., en Nature 334: 585-591 (1.988).

Se pueden utilizar una variedad de agentes de entrecruzamiento, agentes alquilantes y especies generadoras de radicales como grupos pendientes en los polinucleótidos de la presente invención para unir, marcar, detectar, y/o escindir los ácidos nucleicos. Por ejemplo, Vlassov, V. V., et al., en Nucleic Acids Res (1.986) 14:4065-4076, describen la unión covalente de un fragmento de ADN de hebra sencilla con derivados alquilantes de nucleótidos complementarios a secuencias diana. Un informe de un trabajo similar del mismo grupo es el de Knorre, D. G., et al., Biochimie (1.985) 67:785-789. Iverson y Dervan también demostraron la escisión específica de la secuencia del ADN de hebra sencilla mediada por la incorporación de un nucleótido modificado que era capaz de activar la escisión (J Am Chem Soc (1.987) 109:1241-1243). Meyer, R. B., et al., J Am Chem Soc (1.989) 111:8517-8519, realizaron el entrecruzamiento covalente con un nucleótido diana utilizando un agente alquilante complementario a la secuencia de nucleótidos diana de hebra sencilla. Lee, B. L., et al., en Biochemistry (1.988) 27:3197-3203 describieron un entrecruzamiento fotoactivado con oligonucléotidos de hebra sencilla mediado por psoraleno. El uso del entrecruzamiento en sondas formadoras de triple hélice también fue descrito por Home, et al., en J Am Chem Soc (1.990) 112:2435-2437. Asimismo se ha descrito el uso de N4,N4-etanocitosina como agente alquilante para el entrecruzamiento con oligonucleótidos de hebra sencilla por Webb y Matteucci, J Am Chem Soc (1.986) 108:2764-2765; Nucleic Acids Res (1.986) 14:7661-7674; Feteritz et al., J. Am. Chem. Soc. 113:4000 (1.991). Se conocen en la técnica diversos compuestos para la unión, detección, marcaje y/o escisión de ácidos nucleicos. Véanse, por ejemplo, las Patentes de los Estados Unidos Núms. 5.543.507; 5.672.593; 5.484.908; 5.256.648; y 5.681.941.

La invención proporciona una proteína aislada que tiene actividad celulosa sintasa y se selecciona entre:

(a) un polipéptido del SEQ ID NO: 6, 10 o 26; y

(b) un polipéptido codificado por un ácido nucleico de la invención.

Como apreciarán los expertos, la presente invención incluye los polipéptidos catalíticamente activos de la presente invención (esto es, enzimas). Los polipéptidos catalíticamente activos tienen una actividad específica de al menos un 20%, 30%, o 40%, y preferiblemente al menos un 50%, 60%, o 70%, y muy preferiblemente al menos un 80%, 90%, o 95% la del polipéptido endógeno, nativo (no sintético). Adicionalmente, la especificidad de sustrato (k_{car}/K_{m}) es opcionalmente sustancialmente similar a la del polipéptido endógeno, nativo (no sintético). Típicamente, la K_{m} será al menos un 30%, 40%, o 50%, la del polipéptido endógeno, nativo (no sintético); y más preferiblemente al menos un 60%, 70%, 80%, o 90%. Los métodos para analizar y cuantificar las medidas de la actividad enzimática y la especificidad de sustrato (k_{car}/K_{m}), son bien conocidos por los expertos en la técnica.

Generalmente, las proteínas de la presente invención lograrán, cuando se presenten como inmunógenos, la producción de un anticuerpo específicamente reactivo con un polipéptido de la presente invención. Adicionalmente, las proteínas de la presente invención no se unirán a antisueros originados contra un polipéptido de la presente invención que haya sido totalmente inmunoabsorbido con el mismo polipéptido. Los inmunoanálisis para determinar la unión son bien conocidos por los expertos en la técnica. Un imunoanálisis preferido es un inmunoanálisis competitivo, como se comenta más abajo. De este modo, las proteínas de la presente invención se pueden emplear como inmunógenos para construir anticuerpos inmunorreactivos con una proteína de la presente invención para utilidades ilustrativas tales como inmunoanálisis o mecanismos de purificación de proteínas.

Expresión de Proteínas en Células Anfitrionas

Utilizando los ácidos nucleicos de la presente invención, se puede expresar una proteína de la presente invención en una célula diseñada recombinantemente tal como una bacteria, levadura, insecto, mamífero, o preferiblemente células vegetales. Las células producen la proteína en condiciones no naturales (p. ej., en cantidad, composición, localización, y/o tiempo), debido a que han sido alteradas genéticamente por la intervención humana para que lo hagan.

Se espera que los expertos en la técnica sean entendidos en los numerosos sistemas de expresión disponibles para la expresión de un ácido nucleico que codifica una proteína de la presente invención. No se realizarán intentos para describir con detalle los diversos métodos conocidos para la expresión de proteínas en procariotas y eucariotas.

En un breve resumen, la expresión de los ácidos nucleicos aislados que codifican una proteína de la presente invención se logrará típicamente conectando operablemente, por ejemplo, el ADN o ADNc a un promotor (que sea constitutivo o inducible), seguido de la incorporación en un vector de expresión. Los vectores pueden ser adecuados para la replicación e integración en procariotas o eucariotas. Los vectores de expresión típicos contienen terminadores de la transcripción y la traducción, secuencias de iniciación, y promotores útiles para la regulación de la expresión del ADN que codifica una proteína de la presente invención. Para obtener un nivel de expresión elevado de un gen clonado, es deseable construir vectores de expresión que contengan, como mínimo, un promotor fuerte para la transcripción directa, un sitio de unión al ribosoma para el inicio de la traducción, y un terminador de la transcripción/traducción. Un experto reconocería que se pueden realizar modificaciones en una proteína de la presente invención sin disminuir su actividad biológica. Se pueden hacer algunas modificaciones para facilitar la clonación, expresión, o incorporación de la molécula diana a una proteína de fusión. Tales modificaciones son bien conocidas por los expertos en la técnica e incluyen, por ejemplo, una metionina añadida en el extremo amino para proporcionar un sitio de iniciación, o aminoácidos adicionales (p. ej., poli His) situados en cualquier extremo para crear secuencias de purificación convenientemente localizadas. También se pueden introducir sitios de restricción o codones de
terminación.

A. Expresión en Procariotas

Se pueden utilizar células procarióticas como anfitriones para la expresión. Los procariotas están representados muy frecuentemente por diversas cepas de E. coli; no obstante, también se pueden utilizar otras cepas microbianas. Las secuencias de control procarióticas utilizadas comúnmente que se definen en la presente memoria para que incluyan promotores para el inicio de la transcripción, opcionalmente con un operador, junto con secuencias del sitio de unión al ribosoma, incluyen promotores utilizados comúnmente tales como los sistemas promotores de la beta lactamasa (penicilinasa) y lactosa (lac) (Chang et al., Nature 198:1056 (1.977)), el sistema promotor del triptófano (trp) (Goeddel et al., Nucleic Acids Res. 8:4057 (1.980)) y el promotor derivado de lambda P L y el sitio de unión al ribosoma del gen (Shimatake et al., Nature 292:128 (1.981)). La inclusión de marcadores de selección en los vectores de ADN transfectados en E. coli también es útil. Los ejemplos de tales marcadores incluyen genes que especifican la resistencia a ampicilina, tetraciclina, o cloramfenicol.

El vector se selecciona para permitir la introducción en la célula anfitriona apropiada. Los vectores bacterianos son típicamente de origen plasmídico o de fagos. Las células bacterianas apropiadas se infectan con partículas vectoras de fagos o se transfectan con ADN de vectores de fagos desnudos. Si se utiliza un vector plasmídico, las células bacterianas son transfectadas con el ADN del vector plasmídico. Los sistemas de expresión para expresar una proteína de la presente invención están disponibles utilizando Bacillus sp. y Salmonella (Palva, et al., Gene 22: 229-235 (1.983); Mosbach, et al., Nature 302: 543-545 (1.983)).

B. Expresión en Eucariotas

Una variedad de sistemas de expresión eucarióticos tales como levaduras, líneas celulares de insectos, células vegetales y animales, son conocidos por los expertos en la técnica. Como se explica brevemente más abajo, un de la presente invención puede ser expresado en estos sistemas eucarióticos. En algunas realizaciones, las células vegetales transformadas/transfectadas, como se comenta más abajo, se emplean como sistemas de expresión para la producción de las proteínas de la presente invención.

La síntesis de proteínas heterólogas en levaduras es bien conocida. Sherman, F., et al., Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory (1.982) es un trabajo bien reconocido que describe los diversos métodos disponibles para producir la proteína en levaduras. Dos levaduras ampliamente utilizadas para la producción de proteínas eucarióticas son Saccharomyces cerevisiae y Pichia pastoris. Los vectores, cepas, y protocolos para la expresión en Saccharomyces y Pichia son conocidos en la técnica y son asequibles de proveedores comerciales (p. ej., Invitrogen). Los vectores adecuados tienen secuencias de control de la expresión, tales como promotores, incluyendo la 3-fosfoglicerato quinasa o la alcohol oxidasa, y un origen de replicación, secuencias de terminación y similares según se desee.

Una proteína de la presente invención, una vez expresada, puede ser aislada de la levadura mediante lisis de las células y aplicación de técnicas de aislamiento de proteínas normalizadas a los productos lisados. El control de los procedimientos de purificación se puede lograr utilizando técnicas de transferencia Western o radioinmunoanálisis de otras técnicas de inmunoanálisis normalizadas.

La secuencias que codifican las proteínas de la presente invención también pueden ser ligadas a diversos vectores de expresión para su uso en la transfección de cultivos celulares, por ejemplo, de origen mamífero, de insecto, o vegetal. Son ilustrativas de los cultivos celulares útiles para la producción de los péptidos las células de mamífero. Los sistemas celulares de mamífero a menudo estarán en forma de monocapas de células aunque también se pueden utilizar suspensiones de células de mamíferos. Se han desarrollado en la técnica numerosas líneas de células anfitrionas capaces de expresar proteínas intactas, e incluyen las líneas celulares HEK293, BHK21, y CHO. Los vectores de expresión para estas células pueden incluir secuencias de control de la expresión, tales como un origen de replicación, un promotor (p. ej., el promotor de CMV, un promotor tk de HSV o un promotor pgk (fosfoglicerato quinasa)), un intensificador (Queen et al., Immunol. Rev. 89: 49 (1.986)), y sitios de información del procesamiento necesarios, tales como los sitios de unión al ribosoma, los sitios de empalme de ARN, los sitios de poliadenilación (p. ej., un sitio de adición de poli A del Ag T grande de SV40), y secuencias terminadoras de la transcripción. Otras células animales útiles para la producción de proteínas de la presente invención se encuentran disponibles, por ejemplo, de la Colección Americana de Cultivos Tipo Catálogo de Líneas Celulares e Hibridomas (7ª edición, 1.992).

Los vectores apropiados para expresar las proteínas de la presente invención en células de insectos derivan normalmente del baculovirus SF9. Las líneas celulares de insectos adecuadas incluyen larvas de mosquito, gusano de seda, oruga militar, polilla y líneas celulares de Drosophila tales como la línea celular de Schneider (Véase Schneider, J. Embryol. Exp. Morphol. 27: 353-365 (1.987).

Como con las levaduras, cuando se emplean células anfitrionas animales o vegetales, se incorporan típicamente secuencias terminadoras de poliadenilación o transcripción en el vector. Un ejemplo de una secuencia terminadora es la secuencia de poliadenilación del gen de la hormona de crecimiento bovina. También se pueden incluir secuencias para el empalme exacto del transcrito. Un ejemplo de una secuencia de empalme es el intrón VP1 de SV40 (Sprague, et al., J. Virol. 45: 773-781 (1.983)). Adicionalmente, se pueden incorporar al vector secuencias génicas para controlar la replicación en una célula anfitriona tales como las encontradas en los vectores de tipo virus del papiloma bovino. Saveria-Campo, M., Bovine Papilloma Virus DNA a Eukaryotic Cloning Vector in DNA Cloning Vol. II a Practical Approach, D.M. Glover, Ed., IRL Press, Arlington, Virginia págs. 213-238 (1.985).

Transfección/Transformación de Células

El método de transformación/transfección no es crítico para la presente invención; en la actualidad se encuentran disponibles diversos métodos de transformación o transfección. Como se encuentran disponibles métodos más novedosos para transformar cultivos u otras células anfitrionas, estos se pueden aplicar directamente. Por consiguiente, se ha desarrollado una amplia variedad de métodos para insertar una secuencia de ADN en el genoma de una célula anfitriona para obtener la transcripción/traducción de la secuencia para efectuar cambios fenotípicos en el organismo. De este modo, se puede emplear cualquier método que proporcione una transformación/transfección eficaz.

A. Transformación Vegetal

Se utilizará una secuencia de ADN que codifica el polinucleótido deseado de la presente invención, por ejemplo un ADNc o una secuencia genómica que codifica una proteína completa, para construir una casete de expresión recombinante que se puede introducir en la planta deseada.

Los ácidos nucleicos aislados de la presente invención se pueden introducir en plantas de acuerdo con los mecanismos conocidos en la técnica. Generalmente, se preparan casetes de expresión recombinante descritas antes y adecuadas para la transformación de células vegetales. Los mecanismos para transformar una amplia variedad de especies de plantas superiores son bien conocidos en la literatura técnica, científica, y de patentes. Véase, por ejemplo, Weising et al., Ann. Rev. Genet. 22: 421-477 (1.988). Por ejemplo, El constructo de ADN puede ser introducido directamente en el ADN genómico de la célula vegetal utilizando mecanismos tales como la electroporación, la poración con PEG, el bombardeo de partículas, el reparto con fibras de silicio, o la microinyección de protoplastos de células vegetales o callos embriogénicos. Véase, p. ej., Tomes, et al., Direct DNA Transfer into Intact Plant Cells via Microprojectile Bombardment, págs. 197-213 en Plant Cell, Tissue and Organ Culture, Fundamental Methods, (eds. O.L. Gamborg y G.C. Phillips, Springer-Verlag Berlin Heidelberg New York, 1.995). Alternativamente, se pueden combinar los constructos de ADN con regiones limítrofes de ADN T adecuadas e introducirlos en un vector anfitrión de Agrobacterium tumefaciens convencional. Las funciones de virulencia del anfitrión de Agrobacterium tumefaciens dirigirán la inserción del constructo y el marcador adyacente en el ADN de la célula vegetal cuando la célula es infectada por la bacteria. Véase, la Patente de los Estados Unidos Núm. 5.591.616.

La introducción de constructos de ADN utilizando la precipitación con polietilenglicol los describen Paszkowski et al., en Embo J. 3: 2717-2722 (1.984). Las técnicas de electroporación las describen Fromm et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 82: 5824 (1.985). Las técnicas de transformación balística las describen Klein et al., en Nature 327: 70-73 (1.987). Las técnicas de transformación mediadas por Agrobacterium tumefaciens están bien descritas en la literatura científica. Véase, por ejemplo Horsch et al., Science 233: 496-498 (1.984), y Fraley et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 80: 4803 (1.983). Aunque Agrobacterium es principalmente útil en dicotiledóneas, ciertas monocotiledóneas pueden ser transformadas por Agrobacterium. Por ejemplo, se describe la transformación de maíz con Agrobacterium en la Patente de los Estados Unidos Núm. 5.550.318.

Otros métodos de transfección o transformación incluyen (1) la transformación mediada por Agrobacterium rhizogenes (véase, p. ej., Lichtenstein y Fuller En: Genetic Engineering, vol. 6, PWJ Rigby, Ed., London, Academic Press, 1.987; y Lichtenstein, C. P., y Draper, J,. En: DNA Cloning, Vol. II, D. M. Glover, Ed., Oxford, IRI Press, 1985). En la solicitud PCT/US87/02512 (WO 88/02405 publicada el 7 de Abril de 1.988) se describe el uso de una cepa A4 de A. rhizogenes y su plásmido Ri junto con vectores de A. tumefaciens pARC8 o pARC16 (2) la absorción de ADN mediada por liposomas (véase, p. ej., Freeman et al., Plant Cell Physiol. 25: 1353, 1.984), (3) el método del vórtice (véase, p. ej., Kindle, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 87: 1228, (1.990).

También se puede introducir ADN en plantas mediante transferencia directa de ADN en polen como describen Zhou et al., Methods in Enzymology, 101:433 (1.983); D. Hess, Intern Rev. Cytol., 107:367 (1.987); Luo et al., Plane Mol. Biol. Reporter, 6:165 (1.988). La expresión de los genes que codifican el polipéptido se puede obtener mediante inyección del ADN en órganos reproductores de una planta como describen Pena et al., Nature, 325.:274 (1.987). También se puede inyectar ADN directamente en las células de embriones inmaduros y la rehidratación de los embriones desecados como describen Neuhaus et al., en Theor. Appl. Genet., 75:30 (1.987); y Benbrook et al., en Proceedings Bio Expo 1986, Butterworth, Stoneham, Mass., págs. 27-54 (1.986). Se conoce en la técnica una variedad de virus de plantas que se pueden emplear como vectores e incluyen el virus del mosaico de la coliflor (CaMV), el geminivirus, el virus del mosaico del bromus, y el virus del mosaico del tabaco.

B. Transfección de Procariotas, Eucariotas Inferiores, y Células Animales

Las células anfitrionas animales y eucarióticas inferiores (p. ej., levaduras) son competentes o se vuelven competentes para la transfección mediante diversos métodos. Existen numerosos métodos bien conocidos para la introducción de ADN en células animales. Estos incluyen: precipitación con fosfato de calcio, fusión de las células receptoras con protoplastos bacterianos que contienen ADN, tratamiento de las células receptoras con liposomas que contienen ADN, DEAE-dextrano, electroporación, métodos biolísticos, y micro-inyección del ADN directamente en las células. Las células transfectadas se cultivan por medios bien conocidos en la técnica. Kuchler, R.J., Biochemical Methods in Cell Culture y Virology, Dowden, Hutchinson y Ross, Inc. (1.977).

Síntesis de Proteínas

Las proteínas de la presente invención se pueden construir utilizando métodos sintéticos no celulares. La síntesis en fase sólida de proteínas de menos de aproximadamente 50 aminoácidos de longitud se puede completar anclando el aminoácido C-terminal de la secuencia a un soporte insoluble seguido del resto de los aminoácidos de la secuencia. Los mecanismos para la síntesis en fase sólida son descritos por Barany y Merrifield, en Solid-Phase Peptide Synthesis, págs. 3-284 en The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology. Vol. 2: Special Methods in Peptide Synthesis, Parte A.; Merrifield, et al., J. Am. Chem. Soc. 85: 2149-2156 (1.963), y Stewart et al., Solid Phase Peptide Synthesis, 2ª ed., Pierce Chem. Co., Rockford, III. (1.984). Las proteínas de mayor longitud se pueden sintetizar mediante condensación de los extremos amino y carboxi de fragmentos más cortos. Los métodos de formación de enlaces peptídicos mediante la activación del extremo carboxi terminal (p. ej., mediante el uso del reactivo de acoplamiento N,N'-diciciclohexilcarbodiimida)) es conocido por los expertos.

Purificación de Proteínas

Las proteínas de la presente invención se pueden purificar mediante mecanismos conocidos por los expertos en la técnica. Las proteínas producidas recombinantemente de la presente invención se pueden expresar directamente o se pueden expresar como una proteína de fusión. La proteína recombinante se purifica mediante una combinación de lisis celular (p. ej., sonicación, prensa French) y cromatografía de afinidad. Para los productos de fusión, la posterior digestión de la proteína de fusión con una enzima proteolítica adecuada libera la proteína recombinante deseada.

Las proteínas de esta invención, recombinantes o sintéticas, pueden ser purificadas hasta una pureza sustancial mediante mecanismos normalizados bien conocidos en la técnica, incluyendo la solubilización con detergente, la precipitación selectiva con sustancias tales como sulfato de amonio, la cromatografía en columna, los métodos de inmunopurificación, y otros. Véase , por ejemplo, R. Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag: New York (1.982); Deutscher, Guide to Protein Purification, Academic Press (1.990). Por ejemplo, se pueden producir anticuerpos para las proteínas descritas en la presente memoria. Se puede lograr la purificación a partir de E. coli siguiendo los siguientes procedimientos descritos en la Patente de los Estados Unidos Núm. 4.511.503. La proteína puede ser aislada después de las células expresando la proteína y se puede purificar adicionalmente mediante mecanismos de la química de proteínas normalizada como se describe en la presente memoria. La detección de la proteína expresada se puede lograr mediante métodos conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, radioinmunoanálisis, mecanismos de transferencia Western o inmunoprecipitación.

Regeneración de Plantas Transgénicas

Las células vegetales transformadas que derivan mediante cualquiera de los mecanismos de transformación anteriores pueden ser cultivadas para regenerar una planta completa que posee el genotipo transformado. Tales mecanismos de regeneración a menudo cuentan con la manipulación de ciertas fitohormonas en un medio de crecimiento para el cultivo de tejidos, contando típicamente con un marcador biocida y/o herbicida que ha sido introducido junto con un polinucleótido de la presente invención. Para la transformación y regeneración de maíz, véase Gordon-Kamm et al., The Plant Cell, 2:603-618 (1.990).

Las células vegetales transformadas con un vector de expresión vegetal pueden ser regeneradas, p. ej., a partir de células individuales, tejido de callos o discos foliares de acuerdo con los mecanismos de cultivo de tejidos vegetales normalizados. Es bien sabido en la técnica que las diversas células, tejidos, y órganos de casi cualquier planta pueden ser cultivados con éxito para regenerar una planta completa. La regeneración de plantas a partir de protoplastos cultivados es descrita por Evans et al., en Protoplasts Isolation and Culture, Handbook of Plant Cell Culture, Macmillilan Publishing Company, New York, págs. 124-176 (1.983); y Binding, Regeneration of Plants, Plant Protoplasts, CRC Press, Boca Raton, págs. 21-73 (1.985).

La regeneración de plantas que contienen el gen foráneo introducido por Agrobacterium de explantes foliares se puede lograr como describen Horsch et al., en Science, 227:1229-1231 (1.985). En este procedimiento, los transformantes se hacen crecer en presencia de un agente de selección y en un medio que induce la regeneración de los vástagos en las especies vegetales que están siendo transformadas como describen Fraley et al., en Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 80:4803 (1.983). Este procedimiento produce típicamente vástagos en dos a cuatro semanas y estos vástagos transformantes son transferidos después a un medio que induce la formación de raíces apropiado que contiene el agente selectivo y un antibiótico para evitar el crecimiento bacteriano. Las plantas transgénicas de la presente invención pueden ser fértiles o estériles.

También se puede obtener la regeneración a partir de callos, explantes, órganos de plantas, o partes de los mismos. Tales mecanismos de regeneración son descritos generalmente por Klee et al., en Ann. Rev. of Plant Phys. 38: 467-486 (1.987). La regeneración de plantas a partir de protoplastos de plantas individuales o de diversos explantes es bien conocida en la técnica. Véase, por ejemplo, Methods for Plant Molecular Biology, A. Weissbach y H. Weissbach, eds., Academic Press, Inc., San Diego, Calif. (1.988). Este procedimiento de regeneración y crecimiento incluye las etapas de selección de las células transformantes y los vástagos, enraizamiento de los vástagos transformantes y crecimiento de las plántulas en la tierra. Para el cultivo y regeneración de células de maíz véase generalmente, The Maize Handbook, Freeling y Walbot, Eds., Springer, New York (1.994); Corn and Corn Improvement, 3ª edición, Sprague and Dudley Eds., American Society of Agronomy, Madison, Wisconsin (1.988).

Un experto reconocerá que una vez que la casete de expresión recombinante es incorporada establemente en las plantas transgénicas y se confirma que es operable, puede ser introducida en otras plantas mediante cruzamiento sexual. Se puede utilizar cualquiera de los numerosos mecanismos de cría normalizados, dependiendo de las especies que se vayan a cruzar.

En los cultivos propagados vegetativamente, las plantas transgénicas maduras se pueden propagar tomando los esquejes o mediante mecanismos de cultivo de tejidos para producir múltiples plantas idénticas. Se realiza la selección de transgénicos deseables y se obtienen nuevas variedades y se propagan vegetativamente para uso comercial. En los cultivos propagados por semillas, las plantas transgénicas maduras pueden ser cruzadas consigo mismas para producir una planta innata homocigota. La planta innata produce semillas que contienen el ácido nucleico heterólogo recién introducido. Estas semillas se pueden hacer crecer para producir plantas que produzcan el fenotipo seleccionado.

Las partes obtenidas de la planta regenerada, tales como flores, semillas, ramas, frutos, y similares están incluidas en la invención, siempre que estas partes comprendan células que comprendan el ácido nucleico aislado de la presente invención. También están incluidos en el alcance de la invención, la progenie y las variantes, y los mutantes de las plantas regeneradas, siempre que estas partes comprendan las secuencias de ácido nucleico introducidas.

Las plantas transgénicas que expresan el marcador seleccionable pueden ser escrutadas en cuanto a la transmisión del ácido nucleico de la presente invención, por ejemplo, mediante mecanismos de inmunotransferencia y detección de ADN normalizados. Las líneas transgénicas también se evalúan típicamente en cuanto a los niveles de expresión del ácido nucleico heterólogo. La expresión a nivel de ARN se puede determinar inicialmente para identificar y cuantificar las plantas con expresión positiva. Se pueden emplear los mecanismos normalizados para el análisis de ARN e incluyen los análisis de amplificación por PCR utilizando cebadores oligonucleotídicos diseñados para amplificar solamente los moldes de ARN heterólogos y los análisis de hibridación en solución utilizando sondas específicas del ácido nucleico heterólogo. Las plantas ARN positivas se pueden analizar después en cuanto a la expresión de la proteína mediante análisis de inmunotransferencia Western utilizando los anticuerpos específicamente reactivos de la presente invención. Además, se puede realizar la hibridación y la inmunocitoquímica in situ según los protocolos normalizados utilizando sondas de polinucleótidos específicas del ácido nucleico y anticuerpos, respectivamente, para localizar los sitios de expresión dentro del tejido transgénico. Generalmente, se escrutan normalmente numerosas líneas transgénicas en cuanto al ácido nucleico incorporado para identificar y seleccionar las plantas con los perfiles de expresión más apropiados.

Una realización preferida es una planta transgénica que es homocigota para el ácido nucleico heterólogo añadido; esto es, una planta transgénica que contiene dos secuencias de ácido nucleico añadidas, un gen en el mismo locus de cada cromosoma de un par de cromosomas. Se puede obtener una planta transgénica homocigota mediante apareamiento sexual (autogamia) de una planta transgénica heterocigota que contiene un único ácido nucleico heterólogo añadido, haciendo germinar algunas de las semillas producidas y analizando las plantas resultantes producidas en cuanto a la expresión alterada de un polinucleótido de la presente invención con respecto a una planta de control (esto es, nativa, no transgénicas). También se contemplan el retrocruzamiento con una planta parental y el cruzamiento ("out-crossing") con una plana no transgénica.

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Modulación de los Niveles y/o la Composición Polipeptídicos

La presente invención proporciona adicionalmente un método para modular (esto es, aumentar o disminuir) la concentración o composición de los polipéptidos de la presente invención en una planta o una parte de la misma. La modulación se puede efectuar aumentando o disminuyendo la concentración y/o la composición (esto es, la razón de los polipéptidos de la presente invención) en una planta. El método comprende transformar una célula vegetal con una casete de expresión recombinante que comprende un polinucleótido de la presente invención como se ha descrito antes para obtener una célula vegetal transformada, hacer crecer la célula vegetal transformada en condiciones para formar una planta, e inducir la expresión de un polinucleótido de la presente invención en la planta durante un tiempo suficiente para modular la concentración y/o la composición en la planta o una parte de la planta.

En algunas realizaciones, el contenido y/o la composición de polipéptidos de la presente invención en una planta puede ser modulado alternado, in vivo o in vitro, el promotor de un gen no aislado de la presente invención para regular al alza o a la baja la expresión el gen. En algunas realizaciones, las regiones codificadoras de los genes nativos de la presente invención se pueden alterar por medio de una sustitución, adición, inserción, o deleción para disminuir la actividad de la enzima codificada. Véase, p. ej., Kmiec, Patente de los Estados Unidos 5.565.350; Zarling et al., PCT/US93/03868. Y en algunas realizaciones, se transfecta un ácido nucleico aislado (p. ej., un vector) que comprende una secuencia promotora a una célula vegetal. Con posterioridad, se selecciona una célula vegetal que comprende el promotor conectado operablemente a un polinucleótido de la presente invención mediante métodos conocidos por los expertos en la técnica tales como, pero no limitados a, transferencia Southern, secuenciación de ADN, o análisis mediante PCR utilizando cebadores específicos para el promotor y para el gen y detectando los amplicones producidos a partir de ellos. Una planta o una parte de una planta alterada o modificada mediante las realizaciones anteriores se hace crecer en las condiciones para la formación de plantas durante un tiempo suficiente para modular la concentración Y/o la composición de los polipéptidos de la presente invención en la planta. Las condiciones para la formación de plantas son bien conocidas en la técnica y se han comentado brevemente, más arriba.

En general, la concentración o la composición aumenta o disminuye al menos un 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, o 90% con respecto a la planta de control nativa, la parte de la planta o la célula que carece de la casete de expresión recombinante mencionada antes. La modulación en la presente invención se puede producir durante y/o después del crecimiento de la planta hasta la fase de desarrollo deseada. La modulación de la expresión del ácido nucleico temporalmente y/o en tejidos concretos se puede controlar empleando el promotor apropiado conectado operablemente a un polinucleótido de la presente invención, por ejemplo, en orientación efectora o antisentido como se ha comentado con más detalle, antes. La inducción de la expresión de un polinucleótido de la presente invención también se puede controlar mediante la administración exógena de una cantidad eficaz de compuesto inductor. Los promotores inducibles y los compuestos inductores que activan la expresión de estos promotores son bien conocidos en la técnica. En las realizaciones preferidas, los polipéptidos de la presente invención son modulados en monocotiledóneas, concretamente en maíz.

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Marcadores Moleculares

La presente invención proporciona un método de tipificación genotípica de una plata que comprende un polinucleótido de la presente invención. Preferiblemente, la planta es una monocotiledónea, tal como maíz o sorgo. La tipificación genotípica proporciona un medio para distinguir los homólogos de un par de cromosomas y se puede utilizar para diferenciar los segregantes en una población vegetal. Se pueden utilizar marcadores moleculares para estudios filogenéticos, caracterizando las relaciones genéticas entre las variedades de cultivos, identificando los cruces o híbridos somáticos, localizando los segmentos cromosómicos que afectan a los rasgos monogénicos, la clonación basada en mapas, y el estudio de la herencia cuantitativa. Véase, p. ej., Plant Molecular Biology: A Laboratory Manual, Capítulo 7, Clark, Ed., Springer-Verlag, Berlin (1.997). Para los métodos con marcadores moleculares, véase generalmente, The DNA Revolution by Andrew H. Paterson 1.996 (Capítulo 2) en: Genome Mapping in Plants (ed. Andrew H. Paterson) por Academic Press/R. G. Landis Company, Austin, Texas, págs. 7-21.

El método concreto de tipificación genotípica en la presente invención puede emplear cualquiera de las numerosas técnicas analíticas con marcadores moleculares tales como, pero no limitadas a, los polimorfismos de longitud de los fragmentos de restricción (RFLP). Los RFLP son el producto de las diferencias alélicas entre los fragmentos de restricción del ADN ocasionadas por la variabilidad de la secuencia de nucleótidos. Como es bien sabido por los expertos en la técnica, los RFLP se detectan típicamente mediante extracción del ADN genómico y digestión con una enzima de restricción. Generalmente, los fragmentos resultantes se separan según el tamaño y se hibridan con una sonda; se prefieren las sondas de una sola copia. Los fragmentos de restricción de los cromosomas homólogos se revelan. Las diferencias en el tamaño de los fragmentos entre los alelos representan un RFLP. De este modo, la presente invención proporciona adicionalmente un método para seguir la segregación de un gen o un ácido nucleico de la presente invención así como secuencias cromosómicas conectadas genéticamente a estos genes o ácidos nucleicos utilizado mecanismos tales como el análisis de RFLP. Las secuencias cromosómicas conectadas están en 50 centiMorgans (cM), a menudo en 40 o 30 cM, preferiblemente en 20 o 10 cM, más preferiblemente en 5, 3, 2, o 1 cM de un gen de la presente invención.

En la presente invención, las sondas de ácido nucleico empleadas para el mapeo con marcadores moleculares de los genomas nucleares de las plantas hibridan selectivamente, en condiciones de hibridación selectivas, con un gen que codifica un polinucleótido de la presente invención. En realizaciones preferidas, las sondas se seleccionan entre los polinucleótidos de la presente invención. Típicamente, estas sondas son sondas de ADNc o clones genómicos con Pst I. La longitud de las sondas se han comentado con mayor detalle, antes, pero tienen típicamente al menos 15 bases de longitud, más preferiblemente al menos 20, 25, 30, 35, 40, o 50 bases de longitud. Generalmente, sin embargo, las sondas son menores de aproximadamente 1 kilobase de longitud. Preferiblemente, las sondas son sondas de una sola copia que hibridan con un locus único en un complemento de un cromosoma haploide. Algunas enzimas de restricción ilustrativas empleadas en el mapeo de RFLP son EcoRI, EcoRv, y SstI. Según se utiliza en la presente memoria el término "enzima de restricción" incluye la referencia a una composición que reconoce y, sola o combinada con otra composición, escinde una secuencia de nucleótidos específica.

El método de detección de un RFLP comprende las etapas de (a) digerir el ADN genómico de una planta con una enzima de restricción; (b) hibridar una sonda de ácido nucleico, en condiciones de hibridación selectivas, con una secuencia de un polinucleótido de la presente de dicho ADN genómico; (C) detectar un RFLP a partir de ello. Otros métodos de diferenciación de variantes polimórficas (alélicas) de los polinucleótidos de la presente invención se pueden obtener utilizando mecanismos con marcadores moleculares bien conocidos por los expertos en la técnica incluyendo mecanismos tales como: 1) análisis de conformación de hebra sencilla (SSCP); 2) electroforesis en gel con gradiente desnaturalizante (DGGE); 3) análisis de protección con ARNasa; 4) oligonucleótidos alelo-específicos (ASO); 5) el uso de proteínas que reconocen emparejamientos erróneos de nucleótidos, tales como la proteína mutS de E. coli; y 6) PCR alelo-específica. Otros enfoques basados en la detección de emparejamientos erróneos entre dos hebras de ADN complementarias incluyen la electroforesis de gel desnaturalizante constante (CDGE); análisis de heterodúplex (HA); y escisión química de emparejamientos erróneos (CMC). Las variantes polimórficas ilustrativas se proporcionan en la Tabla I, anterior. De este modo, la presente invención proporciona adicionalmente un método para la tipificación genotípica que comprende las etapas de poner en contacto, en condiciones de hibridación restrictivas, una muestra que se sospecha que comprende un polinucleótido de la presente invención con una sonda de ácido nucleico. Generalmente, la muestra es una muestra vegetal; preferiblemente, una muestra que se sospecha que comprende un polinucleótido de maíz de la presente invención (p. ej., un gen, ARNm). La sonda de ácido nucleico hibrida selectivamente, en condiciones restrictivas, con una subsecuencia de un polinucleótido de la presente invención que comprende un marcador polimórfico. La hibridación selectiva de la sonda de ácido nucleico con el ácido nucleico del marcador polimórfico proporciona un complejo de hibridación. La detección del complejo de hibridación indica la presencia de ese marcador polimórfico en la muestra. En las realizaciones preferidas, la sonda de ácido nucleico comprende un polinucleótido de la presente invención.

UTR y Preferencia del Codón

En general, se ha encontrado que la eficacia traduccional está regulada por elementos de secuencia específica en la región 5' no codificadora o no traducida (5' UTR) del ARN. Los motivos de secuencia positiva incluyen secuencias consenso de inicio de la traducción (Kozak, Nucleic Acids Res. 15:8125 (1.987)) y la estructura de protección terminal 7-metilguanosina (Drummond et al., Nucleic Acids Res. 13:7375 (1.985)). Los elementos negativos incluyen estructuras en lazo 5' UTR intramoleculares estables (Muesing et al., Cell 48:691 (1.987)) y secuencias de AUG o marcos de lectura abiertos cortos precedidos por un AUG en el 5' UTR (Kozak, anterior, Rao et al., Mol. y Cell. Biol. 8:284 (1.988)). Por consiguiente, la presente invención proporciona regiones 5' y/o 3' UTR para la modulación de la traducción de secuencias codificadoras heterólogas.

Adicionalmente, los segmentos que codifican polipéptido de los polinucleótidos de la presente invención pueden ser modificados para alterar el uso de los codones. Se puede emplear el uso de codones alterado para alterar la eficacia traduccional y/o para optimizar la secuencia codificadora para la expresión en un anfitrión deseado o para optimizar el uso de codones en una secuencia heteróloga para la expresión en maíz. El uso de codones en las regiones codificadoras de los polinucleótidos de la presente invención se puede analizar estadísticamente utilizando paquetes de soporte lógico disponibles en el mercado tales como "Codon Preference" asequible del University of Wisconsin Genetics Computer Group (véase Devereaux et al., Nucleic Acids Res. 12: 387-395 (1.984)) o MacVector 4.1 (Eastman Kodak Co., New Haven, Conn.). De este modo, la presente invención proporciona una frecuencia del uso de codones característica de la región codificadora de al menos uno de los polinucleótidos de la presente invención. El número de polinucleótidos que se puede utilizar para determinar la frecuencia del uso de codones puede ser cualquier número entero de 1 al número de polinucleótidos de la presente invención proporcionado en la presente memoria. Opcionalmente, los polinucleótidos serán secuencias completas. Un número ilustrativo de secuencias para el análisis estadístico puede ser de al menos 1, 5, 10, 20, 50, o 100.

Barajado de Secuencia

La presente invención hace referencia a métodos para el barajado de la secuencia utilizando los polinucleótidos de la presente invención, y las composiciones resultantes de allí. El barajado de la secuencia se describe en la Publicación PCR Núm. 96/19256. Véase también, Zhang, J.-H., et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:4504-4509 (1.997). Generalmente, el barajado de la secuencia proporciona un método para generar genotecas de polinucleótidos que tienen una característica deseada que pueden ser seleccionados o escrutados. Las genotecas de polinucleótidos recombinantes se generan a partir de una población de polinucleótidos de secuencia relacionada que comprende regiones de secuencia que tienen una identidad de secuencia sustancial y pueden ser recombinados homólogamente in vitro o in vivo. La población de polinucleótidos de secuencia recombinada comprende una subpoblación de polinucleótidos que posee las características deseadas o ventajosas y que pueden ser seleccionadas mediante un método de selección o escrutinio adecuado. Las características pueden ser cualquier propiedad o atributo susceptible de ser seleccionado o detectado en un sistema de escrutinio, y puede incluir propiedades de: una proteína codificada, un elemento transcripcional, una secuencia controladora de la transcripción, tratamiento del ARN, estabilidad del ARN, conformación de cromatina, traducción, u otra propiedad de la expresión de un gen o transgén, un elemento replicativo, un elemento de unión a una proteína, o similar, tal como cualquier rasgo que confiera una propiedad seleccionable o detectable. La característica seleccionada puede ser una K_{m} disminuida y/o una K_{cat} aumentada en la proteína de tipo salvaje proporcionada en la presente memoria. En otras realizaciones, la proteína o polinucleótido generado a partir del barajado de la secuencia tendrá una afinidad de unión al ligando mayor que la del polinucleótido de tipo salvaje no barajado. El incremento de tales propiedades puede ser de al menos un 110%, 120%, 130%, 140% o al menos 150% del valor de tipo salvaje.

Secuencias Genéricas y Consenso

La presente invención también hace referencia a polinucleótidos y polipéptidos que tienen: (a) una secuencia genérica de al menos dos polinucleótidos o polipéptidos homólogos, respectivamente, de la presente invención; y, (b) una secuencia consenso de al menos tres polinucleótidos o polipéptidos homólogos, respectivamente, de la presente invención. Un polinucleótido que tiene una secuencia consenso de aminoácidos o ácido nucleico puede ser utilizada para generar anticuerpos o producir sondas o cebadores de ácido nucleico para escrutar homólogos en otras especies, géneros, familias, órdenes, clases, fila, o reinos. Por ejemplo, se puede utilizar un polinucleótido que tiene secuencias consenso de una familia de genes de Zea mays para generar anticuerpos o sondas o cebadores de ácido nucleico para otra especie de gramínea tal como trigo, arroz, o sorgo. Alternativamente, se puede utilizar un polinucleótido que tiene una secuencia consenso generada a partir de genes ortólogos para identificar o aislar ortólogos de otros taxa. Típicamente, un polinucleótido que tiene una secuencia consenso tendrá al menos 9, 10, 15, 20, 25, 30, o 40 aminoácidos de longitud, o 20, 30, 40, 50, 100, o 150 nucleótidos de longitud. Como saben los expertos en la técnica, se puede utilizar una sustitución de aminoacidos conservativa para los aminoácidos que difieren entre la secuencia alineada pero son del mismo grupo de sustituciones conservativas mencionado antes. Opcionalmente, se sustituyen no más de 1 o 2 aminoácidos conservativos por cada 10 aminoácidos de longitud de la secuencia consenso.

Secuencias similares utilizadas para la generación de una secuencia consenso o genérica incluyen cualquier número y combinación de variantes alélicas del mismo gen, secuencias ortólogas, o parálogas proporcionadas en la presente memoria. Opcionalmente, las secuencias similares utilizadas en la generación de una secuencia consenso o genérica se identifican utilizando la probabilidad del sumatorio más pequeño del algoritmo BLAST (P(N)). En el capítulo 7 de Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel et al., Eds., Current Protocols, una empresa conjunta entren Greene Publishing Associates, Inc. y John Wiley & Sons, Inc. (Suplemento 30) se enumeran diversos proveedores de soporte lógico para el análisis de secuencias. Una secuencia de polinucleótidos se considera similar a una secuencia de referencia si la probabilidad de la suma más pequeña en comparación del ácido nucleico de ensayo con el ácido nucleico de referencia es menor de aproximadamente 0,1, más preferiblemente menor de aproximadamente 0,01, o 0,001, y muy preferiblemente menor de aproximadamente 0,0001, o 0,00001. Los polinucleótidos similares pueden ser alineados y se puede generar una secuencia consenso o genérica generada utilizando los múltiples soportes lógicos para el alineamiento de la secuencia disponibles de numerosos proveedores comerciales tales como el soporte lógico PILEUP del Genetics Computer Group (Madison, WI), ALIGNX de Vector NTI (North Bethesda, MD), o SEQUENCHER de Genecode (Ann Arbor, MI). Convenientemente, se pueden utilizar los parámetros por defecto de semejante soporte lógico para generar secuencias consenso o genéricas.

Detección de Ácidos Nucleicos

La presente invención hace referencia adicionalmente a métodos para detectar un polinucleótido de la presente invención en una muestra de ácido nucleico que se sospecha que comprende un polinucleótido de la presente invención, tal como un producto lisado de células vegetales, concretamente un producto lisado de maíz. En algunas realizaciones, se puede amplificar un gen de la presente invención o una porción del mismo antes de la etapa de contacto de la muestra de ácido nucleico con un polinucleótido de la presente invención. La muestra de ácido nucleico se pone en contacto con el polinucleótido para formar un complejo de hibridación. El polinucleótido hibrida en condiciones restrictivas con un gen que codifica un polipéptido de la presente invención. La formación del complejo de hibridación se utiliza para detectar un gen que codifica un polipéptido de la presente invención en la muestra de ácido nucleico. Los expertos apreciarán que un ácido nucleico aislado que comprende un polinucleótido de la presente invención debe carecer de secuencias que hibridan de forma cruzada en común con genes no diana que producirían un resultado falso positivo.

La detección del complejo de hibridación se puede lograr utilizando cualquier número de métodos bien conocidos. Por ejemplo, la muestra de ácido nucleico, o una porción de la misma, se puede analizar mediante formatos de hibridación que incluyen pero no están limitados a, fase de solución, fase sólida, fase mixta, o análisis de hibridación in situ. Brevemente, en las hibridaciones en fase de solución (o líquida), tanto el ácido nucleico diana como la sonda o el cebador están libres de interacción en la mezcla de reacción. En los análisis de hibridación en fase sólida, las sondas o cebadores están conectados típicamente a un soporte sólido donde están disponibles para la hibridación con un ácido nucleico diana en solución. En la fase mixta, los intermedios de ácido nucleico en solución hibridan con los ácidos nucleicos diana en solución así como con un ácido nucleico conectado a un soporte sólido. En la hibridación in situ, el ácido nucleico diana es liberado de su entorno celular de tal manera que esté disponible para la hibridación en la célula a la vez que conserva la morfología celular para la posterior interpretación y análisis. Los siguientes artículos proporcionan una visión de conjunto de los diversos formatos de análisis de hibridación: Singer et al., Biotechniques 4(3): 230-250 (1.986); Haase et al., Methods in Virology, Vol. VII, págs. 189-226 (1.984); Wilkinson, The theory and practice of in situ hybridization en: In situ Hybridization, D.G. Wilkinson, Ed., IRL Press, Oxford University Press, Oxford; y Nucleic Acid Hybridization: A Practical Approach, Hames, B.D. y Higgins, S.J., Eds., IRL Press (1.987).

Marcas de Ácido Nucleico y Métodos de Detección

Los métodos por los cuales los ácidos nucleicos de la presente invención son marcados no son un aspecto crítico de la presente invención y se pueden completar mediante cualquiera de los numerosos métodos conocidos actualmente o desarrollados más tarde. Las marcas detectables adecuadas para su uso en la presente invención incluyen cualquier composición detectable mediante métodos espectroscópicos, radioisotópicos, fotoquímicos, bioquímicos, inmunoquímicos, eléctricos, ópticos o químicos. Las marcas útiles en la presente invención incluyen biotina para la tinción con un producto conjugado de estreptavidina marcado, cuentas magnéticas, colorantes fluorescentes (p. ej., fluoresceína, rojo texas, rodamina, proteína fluorescente verde, y similares), radiomarcas (p. ej., H^{3}, I^{125}, S^{35}, C^{14}, o P^{32}), enzimas (p. ej., peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina y otros comúnmente utilizados en un ELISA), y marcas colorimétricas
tales como oro coloidal o cuentas de vidrio o plástico coloreado (p. ej., poliestireno, polipropileno, látex, etc.).

Los ácidos nucleicos de la presente invención se pueden marcar mediante uno cualquiera de los diversos métodos utilizados típicamente para detectar la presencia de ácidos nucleicos hibridados. Un método de detección común consiste en el uso de autorradiografías empleando sondas marcadas con H^{3}, I^{125}, S^{35}, C^{14}, o P^{32}, o similares. La elección del isótopo radiactivo depende de las preferencias de búsqueda debido a la facilidad de síntesis, la estabilidad, y las vidas medias de los isótopos seleccionados. Otras marcas incluyen ligandos que se unen a anticuerpos marcados con fluoróforos, agentes quimioluminiscentes, y enzimas. Alternativamente, las sondas se pueden conjugar directamente con marcas tales como fluoróforos, agentes quimioluminiscentes o enzimas. La elección de la marca depende de la sensibilidad requerida, la facilidad de conjugación con la sonda, los requerimientos de estabilidad, y el instrumental disponible. El marcaje de los ácidos nucleicos de la presente invención se logra fácilmente mediante el uso de cebadores de PCR marcados.

En algunas realizaciones, la marca se incorpora simultáneamente durante la etapa de amplificación en la preparación de los ácidos nucleicos. De este modo, por ejemplo, la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con cebadores marcados o nucleótidos marcados proporcionará un producto de amplificación marcado. En otra realización, la amplificación de la transcripción utilizando un nucleótido marcado (p. ej., UTP y/o CTP marcado con fluoresceína) incorpora una marca en los ácidos nucleicos transcritos.

Las sondas no radiactivas se marcan a menudo mediante métodos indirectos. Por ejemplo, una molécula de ligando se une covalentemente a la sonda. El ligando se une después a una molécula anti-ligando que o bien es detectable inherentemente o bien se une covalentemente a un sistema de señal detectable, tal como una enzima, un fluoróforo, o un compuesto quimioluminiscente. Las enzimas de interés como marcas serán principalmente hidrolasas, tales como fosfatasas, esterasas y glicosidasas, u oxidorreductasas, concretamente peroxidasas. Los compuestos fluorescentes incluyen fluoresceína y sus derivados, rodamina y sus derivados, dansilo, umbeliferona, etc. Los quimioluminiscentes incluyen luciferina, y 2,3-dihidroftalazinodionas, p. ej., luminol. Los ligandos y anti-ligandos pueden variar ampliamente. Cuando un ligando tiene un anti-ligando natural, esto es ligandos tales como biotina, tiroxina, y cortisol, éste se puede utilizar junto con su anti-ligando de origen natural, marcado. Alternativamente, se puede utilizar cualquier compuesto hapténico o antigénico combinado con un anticuerpo.

Las sondas también se pueden marcar mediante conjugación directa con una marca. Por ejemplo, se han acoplado sondas de ADN clonado directamente a peroxidasa de rábano picante o fosfatasa alcalina, (Renz. M., y Kurz, K., A Colorimetric Method for DNA Hybridization, Nucl. Acids Res. 12: 3435-3444 (1.984)) y se han acoplado oligonucleótidos sintéticos directamente con fosfatasa alcalina (Jablonski, E., et al., Preparation of Oligodeoxynucleotide-Alkaline Phosphatase Conjugates and Their Use as Hybridization Probes, Nuc. Acids. Res. 14: 6115-6128 (1.986); y Li P., et al., Enzyme-linked Synthetic Oligonucleotide probes: Non-Radioactive Detection of Enterotoxigenic Escherichia Coli in Faeca Specimens, Nucl. Acids Res. 15: 5275-5287 (1.987)).

Los métodos para detectar tales marcas son bien conocidos para los expertos en la técnica. De este modo, por ejemplo, se pueden detectar radiomarcas utilizando película fotográfica o contadores de centelleo, los marcadores fluorescentes se pueden detectar utilizando un fotodetector para detectar la luz emitida. Las marcas enzimáticas se detectan típicamente proporcionando a la enzima un sustrato y detectando el producto de reacción producido por la acción de la enzima sobre el sustrato, y las marcas colorimétricas se detectan simplemente visualizando la marca coloreada.

Anticuerpos para Proteínas

Se pueden producir anticuerpos para una proteína de la presente invención, incluyendo variantes alélicas, de cepas, o de especie, y fragmentos de las mismas, tanto en sus formas de origen natural (completa) como en formas recombinantes. Adicionalmente, se producen anticuerpos para estas proteínas en sus configuraciones nativas o en configuraciones no nativas. También se pueden generar anticuerpos anti-idiotípicos. Los expertos en la técnica conocen muchos métodos de elaborar anticuerpos. La siguiente discusión se presenta como una visión global general de las técnicas disponibles; sin embargo, un experto reconocerá que se conocen muchas variaciones de los siguientes métodos.

Se utilizan numerosos inmunógenos para producir anticuerpos específicamente reactivos con una proteína de la presente invención. Los imunógenos preferidos (antígenos) para la producción de anticuerpos monoclonales o policlonales son un polinucleótido sintético o nativo, recombinante aislado de la presente invención. Los expertos comprenderán fácilmente que las proteínas de la presente invención son desnaturalizadas típicamente, y opcionalmente reducidas, antes de la formación de anticuerpos para el escrutinio de las genotecas de expresión u otros análisis en los cuales una supuesta proteína de la presente invención es expresada o desnaturalizada en una estructura secundaria, terciaria, o cuaternaria no nativa. Los polipéptidos no aislados de la presente invención se pueden utilizar en forma pura o impura.

Después se inyecta la proteína de la presente invención en un animal capaz de producir anticuerpos. Se pueden generar anticuerpos monoclonales o policlonales para su posterior uso en inmunoanálisis para medir la presencia y cantidad de la proteína de la presente invención. Los métodos para producir anticuerpos policlonales son conocidos por los expertos en la técnica. En resumen, se mezcla un inmunógeno (antígeno), preferiblemente una proteína purificada, una proteína acoplada a un portador apropiado (p. ej., GST, hemocianina de lapa ojo de cerradura, etc.), o una proteína incorporada en un vector de inmunización tal como un virus vaccinia recombinante (véase , Patente de los Estados Unidos Núm. 4.722.848) con un coadyuvante y los animales son inmunizados con la mezcla. La respuesta inmunitaria del animal a la preparación de inmunógeno se controla tomando muestras de sangre y determinando el título de reactividad para la proteína de interés. Cuando se obtienen elevados títulos de anticuerpo para el inmunógeno apropiadamente elevados, se recoge la sangre del animal y se preparan antisueros. El fraccionamiento adicional de los antisueros para enriquecerlos en anticuerpos reactivos a la proteína se realiza cuando se desea (Véase, p. ej., Coligan, Current Protocols in Immunology, Wiley/Greene, NY (1.991); y Harlow y Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, NY (1.989)).

Los anticuerpos, incluyendo los fragmentos de unión y las versiones recombinantes de cadena sencilla de los mismos, frente a fragmentos predeterminados de una proteína de la presente invención son producidos por animales de inmunización, p. ej., con productos conjugados de los fragmentos con proteínas portadoras como se ha descrito antes. Típicamente, el inmunógeno de interés es una proteína de al menos aproximadamente 5 aminoácidos, más típicamente la proteína tiene 10 aminoácidos de longitud, preferiblemente, 15 aminoácidos de longitud y más preferiblemente la proteína tiene 20 aminoácidos de longitud o más. Los péptidos se acoplan típicamente a una proteína portadora (p. ej., en forma de una proteína de fusión), o se expresan recombinantemente en un vector de inmunización. Los determinantes antigénicos de los péptidos a los cuales se unen los anticuerpos tienen típicamente de 3 a 10 aminoácidos de longitud.

Los anticuerpos monoclonales se preparan a partir de células que secretan el anticuerpo deseado. Los anticuerpos monoclonales se escrutan en cuanto a la unión a una proteína de la cual derivaba el inmunógeno. Los anticuerpos monoclonales y policlonales específicos tendrán normalmente un sitio de unión al anticuerpo con una constante de afinidad para su antígeno monovalente cognado al menos entre 10^{6}-10^{7}, normalmente al menos 10^{8}, preferiblemente al menos 10^{9}, más preferiblemente al menos 10^{10}, y muy preferiblemente al menos 10^{11} litros/mol.

En algunos casos, es deseable preparar anticuerpos monoclonales de diversos anfitriones mamíferos, tales como ratones, roedores, primates, humanos, etc. Se encuentran descripciones de las técnicas para preparar tales anticuerpos monoclonales, p. ej., en Basic and Clinical Immunology, 4ª ed., Stites et al., Eds., Lange Medical Publications, Los Altos, CA, y referencias citadas allí; Harlow y Lane, Supra; Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, 2ª ed., Academic Press, New York, NY (1.986); y Kohler y Milstein, Nature 256: 495-497 (1.975). Resumido brevemente, este método prosigue inyectando en un animal un inmunógeno que comprende una proteína de la presente invención. Después el animal se sacrifica y se toman células del bazo, que se fusionan con células de mieloma. El resultado es una célula híbrida o "hibridoma" que es capaz de reproducirse in vitro. La población de hibridomas se escruta después para aislar clones individuales, cada uno de los cuales secreta una única especie de anticuerpo para el inmunógeno. De esta manera, las especies de anticuerpos individuales obtenidas son los productos de las células B inmortalizadas y clonadas a partir del animal inmune generadas en respuesta a un sitio específico reconocido sobre la sustancia inmunogénica.

Otras técnicas adecuadas implican la selección de genotecas de anticuerpos recombinantes en fagos o vectores similares (véase, p. ej., Huse et al., Science 246: 1275-1281 (1.989); y Ward, et al., Nature 341: 544-546 (1.989); y Vaughan et al., Nature Biotechnology, 14: 309-314 (1.996)). Alternativamente, se pueden obtener anticuerpos monoclonales humanos de gran avidez a partir de ratones transgénicos que comprenden fragmentos de los loci de la Ig de cadena pesada y ligera humana desorganizados (esto es, ratones con transgenes de los miniloci). Fishwild et al., Nature Biotech., 14: 845-851 (1.996). También, se pueden producir inmunoglobulinas recombinantes. Véase, Cabilly, Patente de los Estados Unidos Núm. 4.816.567; y Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 86: 10029-10033
(1.989).

Los anticuerpos de esta invención también se utilizan para la cromatografía de afinidad en proteínas aisladas de la presente invención. Las columnas se preparan, p. ej., con los anticuerpos conectados a un soporte sólido, p. ej., partículas, tales como agarosa, Sephadex, o similar, donde se hace pasar a través de la columna un producto lisado celular, se lava y se trata con concentraciones crecientes de un desnaturalizante débil, con lo que la proteína purificada es liberada.

Se pueden utilizar los anticuerpos para escrutar las genotecas de expresión en cuanto a productos de expresión concretos tales como una proteína normal o anormal. Normalmente los anticuerpos de semejante procedimiento se marcan con un radical que permite la fácil detección de la presencia de antígenos por la unión del anticuerpo.

Los anticuerpos originados contra una proteína de la presente invención también pueden ser utilizados para originar anticuerpos anti-idiotípicos. Estos son útiles para detectar o diagnosticar diversas afecciones patológicas relacionadas con la presencia de los respectivos antígenos.

Frecuentemente, las proteínas y anticuerpos de la presente invención serán marcados uniendo, ya sea covalentemente o no covalentemente, una sustancia que proporciona una señal detectable. Se conocen una amplia variedad de marcas y mecanismos de conjugación y son referidos ampliamente en la literatura tanto científica como de patentes. Las marcas adecuadas incluyen radionucleótidos, enzimas, sustratos, cofactores, inhibidores, radicales fluorescentes, radicales quimioluminiscentes, partículas magnéticas, y similares.

Inmunoanálisis de Proteínas

Los métodos para detectar las proteínas de la presente invención no son aspectos críticos de la presente invención. En una realización preferida, las proteínas se detectan y/o cuantifican utilizando cualquiera de los numerosos análisis de unión inmunológica bien reconocidos (véase, p. ej., Las Patentes de los Estados Unidos 4.366.241; 4.376.110; 4.517.288; y 4.837.168). Para una revisión de los inmunoanálisis generales, véase también Methods in Cell Biology, Vol. 37: Antibodies in Cell Biology, Asai, Ed., Academic Press, Inc. New York (1.993); Basic and Clinical Immunology 7ª Edición, Stites & Terr, Eds. (1.991). Por otra parte, los inmunoanálisis de la presente invención se pueden realizar en cualquiera de las diversas configuraciones, p. ej., aquellas revisadas en Enzyme Immunoassay, Maggio, Ed., CRC Press, Boca Raton, Florida (1.980); Tijan, Practice and Theory of Enzyme Immunoassays, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Elsevier Science Publishers B.V., Amsterdam (1.985); Harlow y Lane, antes; Immunoassay: A Practical Guide, Chan, Ed., Academic Press, Orlando, FL (1.987); Principles and Practice of Immunoassaysm, Price y Newman Eds., Stockton Press, NY (1.991); y Non-isotopic Immunoassays, Ngo, Ed., Plenum Press, NY (1.988). Los análisis de unión inmunológicos (o inmunoanálisis) utilizan típicamente un "agente de captura" para unirse específicamente y a menudo inmovilizar el analito (en este caso, una proteína de la presente invención). El agente de captura es un radical que se une específicamente al analito. En una realización preferida, el agente de captura es un anticuerpo que se une específicamente a una o varias proteínas de la presente invención. El anticuerpo puede ser producido mediante cualquiera de los numerosos métodos conocidos por los expertos en la técnica como se describe en la presente memoria.

Los inmunoanálisis a menudo utilizan también un agente de marcaje para unirse específicamente y marcar el complejo de unión formado por el agente de captura y el analito. El agente de marcaje puede a su vez ser uno de los radicales que comprenden el complejo anticuerpo/analito. De este modo, el agente de marcaje puede ser una proteína marcada de la presente invención o un anticuerpo marcado específicamente reactivo con una proteína de la presente invención. Alternativamente, el agente de marcaje puede ser un tercer radical, tal como otro anticuerpo, que se une específicamente al complejo anticuerpo/proteína.

En una realización preferida, el agente de marcaje es un segundo anticuerpo que lleva una marca. Alternativamente, el segundo anticuerpo puede carecer de marca, pero puede, a su vez, estar unido a un tercer anticuerpo marcado específico para los anticuerpos de especies de las cuales deriva el segundo anticuerpo. El segundo puede estar modificado con un radical detectable, tal como biotina, al cual se puede unir específicamente una tercera molécula marcada, tal como una estreptavidina marcada con enzima.

Otras proteínas capaces de unirse específicamente a regiones constantes de inmunoglobulina, tales como la proteína A o la proteína G también se pueden utilizar como agente marcador. Estas proteínas son constituyentes normales de las paredes celulares de las bacterias estreptocócicas. Muestran una fuerte reactividad no inmunogénica con las regiones constantes de imunoglobulina de una variedad de especies (Véase, generalmente Kronval, et al., J. Immunol. 111: 1401-1406 (1.973), y Akerstrom, et al., J. Immunol. 135: 2589-2542 (1.985)).

En todos los análisis, se pueden requerir etapas de incubación y/o lavado después de cada combinación de reactivos. Las etapas de incubación pueden variar de aproximadamente 5 segundos a varias horas, preferiblemente de aproximadamente 5 minutos a aproximadamente 24 horas. Sin embargo, el tiempo de incubación dependerá del formato del análisis, el analito, el volumen de solución, las concentraciones, y similares. Normalmente, los análisis se llevarán a cabo a la temperatura ambiente, aunque se pueden realizar a lo largo de un intervalo de temperaturas, por ejemplo de 10ºC a 40ºC.

Si bien los detalles de los inmunoanálisis de la presente invención pueden variar con el formato concreto empleado, el método de detección de la proteína de la presente invención en una muestra biológica comprende generalmente las etapas de poner en contacto la muestra biológica con un anticuerpo que reacciona específicamente, en condiciones inmunológicamente reactivas, con una proteína de la presente invención. Se deja que el anticuerpo se una a la proteína en condiciones inmunológicamente reactivas, y se detecta la presencia del anticuerpo unido directa o indirectamente.

A. Formatos de Análisis No-Competitivos

Los inmunoanálisis para detectar proteínas de la presente invención incluyen formatos competitivos y no competitivos. Los inmunoanálisis no competitivos son análisis en los que la cantidad de analito capturado (esto es, proteína de la presente invención) se mide directamente. En un análisis "sándwich" preferido, por ejemplo, se puede unir directamente el agente de captura (p. ej., anticuerpos específicamente reactivos, en condiciones inmunorreactivas, con una proteína de la presente invención) a un sustrato sólido donde éstos están inmovilizados. Estos anticuerpos inmovilizados capturan después la proteína presente en la muestra de ensayo. La proteína inmovilizada de este modo se une después por medio de un agente de marcaje, tal como un segundo anticuerpo que porta una marca. Alternativamente, el segundo anticuerpo puede carecer de marca, pero puede, estar unido, a su vez, por un tercer anticuerpo marcado específico para los anticuerpos de la especie de la cual deriva el segundo anticuerpo. El segundo puede ser modificado con un radical detectable, tal como biotina, al cual se puede unir específicamente una tercera molécula marcada, tal como estreptavidina marcada con enzima.

B. Formatos de Análisis Competitivos

En los análisis competitivos, la cantidad de analito presente en una muestra se mide indirectamente midiendo la cantidad de un analito añadido (exógeno) (p. ej., una proteína de la presente invención) desplazado (o fuera por competición) del agente de captura (p. ej., un anticuerpo específicamente reactivo, en condiciones inmunorreactivas, con la proteína) por el analito presente en la muestra. En un análisis competitivo, se añade una cantidad conocida de analito a la muestra y después la muestra se pone en contacto con un agente de captura que se une específicamente a una proteína de la presente invención. La cantidad de proteína unida al agente de captura es inversamente proporcional a la concentración de analito presente en la muestra.

En una realización particularmente preferida, el anticuerpo es inmovilizado sobre un sustrato sólido. La cantidad de proteína unida al anticuerpo se puede determinar o bien midiendo la cantidad de proteína presente en un complejo de proteína/anticuerpo, o bien alternativamente midiendo la cantidad de proteína no complejada restante. La cantidad de proteína se puede detectar proporcionando una proteína marcada.

Un análisis de inhibición de hapteno es otro análisis competitivo preferido. En este análisis se inmoviliza un analito conocido, (tal como una proteína de la presente invención) sobre un sustrato sólido. Se añade a la muestra una cantidad conocida de anticuerpo específicamente reactivo, en condiciones inmunorreactivas, con la proteína, y después la muestra se pone en contacto con la proteína inmovilizada. En este caso, la cantidad de anticuerpo unido a la proteína inmovilizada es inversamente proporcional a la cantidad de proteína presente en la muestra. De nuevo, se puede detectar la cantidad de anticuerpo inmovilizado detectando o bien la fracción de anticuerpo inmovilizada o bien la fracción de anticuerpo que permanece en solución. La detección puede ser directa donde el anticuerpo es marcado o indirecta mediante la posterior adición de un radical marcado que se une específicamente al anticuerpo descrito antes.

C. Generación de antisueros reunidos para su uso en inmunoanálisis

Se determina en un inmunoanálisis la proteína que se une específicamente o que es específicamente inmunorreactiva con un anticuerpo generado frente a un inmunógeno definido. El inmunoanálisis utiliza un antisuero policlonal que se origina para un polipéptido de la presente invención (esto es, el polipéptido inmunogénico). Este antisuero se selecciona para que tenga una baja reactividad cruzada frente a otras proteínas y se elimina cualquiera de tales reactividades cruzadas mediante inmunoabsorción antes de su uso en el inmunoanálisis (p. ej., mediante inmunoabsorción del antisuero con una proteína de diferente especificidad de sustrato (p. ej., una enzima diferente) y/o una proteína con la misma especificidad de sustrato pero de una forma diferente).

Con el fin de producir antisueros para su uso en un inmunoanálisis, se aísla un polipéptido de la presente invención como se describe en la presente memoria. Por ejemplo, se puede producir una proteína recombinante en un mamífero u otra línea celular eucariótica. Se inmuniza una cepa de ratón endogámica con la proteína utilizando un coadyuvante normalizado, tal como coadyuvante de Freund, y un protocolo de inmunización de ratón normalizado (Véase Harlow y Lane, antes). Alternativamente, se utiliza un polipéptido sintético derivado de las secuencias descritas en la presente memoria y se conjuga con una proteína portadora como inmunógeno. Se recogen los sueros policlonales y se titulan frente al polipéptido inmunogénico en un inmunoanálisis, por ejemplo, un inmunoanálisis en fase sólida con el inmunógeno inmovilizado sobre un soporte sólido. Los antisueros policlonales con un título de 10^{4} o mayor se seleccionan y se someten a ensayo en cuanto a su reactividad cruzada frente a los polipéptidos de diferentes formas o especificidad de sustrato, utilizando un inmunoanálisis de unión competitiva tal como el descrito por Harlow y Lane, antes, en las páginas 570-573. Preferiblemente, se utilizan en esta determinación dos o más formas distintas de polipéptidos. Esos tipos distintos de polipéptidos se utilizan como competidores para identificar anticuerpos que son específicamente unidos por el polipéptido que está siendo analizado. Los polipéptidos competitivos pueden ser producidos como proteínas recombinantes y aislados utilizando las técnicas de la biología molecular y la química de proteínas normalizadas como se describe en la presente memoria.

Se utilizan inmunoanálisis en el formato de unión competitiva para las determinaciones de la reactividad cruzada. Por ejemplo, el polipéptido inmunogénico es inmovilizado en un soporte sólido. Las proteínas añadidas al análisis compiten con la unión del antisuero al antígeno inmovilizado. La capacidad de las proteínas anteriores para competir con la unión del antisuero a la proteína inmovilizada se compara con la del polipéptido inmunogénico. El porcentaje de reactividad cruzada para las proteínas anteriores se calcula utilizando los cálculos normalizados. Aquellos antisueros con menos de un 10% de reactividad cruzada con una forma distinta de polipéptido se seleccionan y se reúnen. Los anticuerpos que presentan reacción cruzada se separan después de los antisueros reunidos mediante inmunoabsorción con una forma distinta de polipéptido.

Los antisueros imunoabsorbidos y reunidos se utilizan después en un inmunoanálisis de unión competitiva como se describe en la presente memoria para comparar un segundo polipéptido "diana" con el polipéptido inmunogénico. Con el fin de realizar esta comparación, se analizan cada uno de los dos polipéptidos a un amplio intervalo de concentraciones y se determina la cantidad de cada polipéptido requerida para inhibir el 50% de la unión de los antisueros a la proteína inmovilizada utilizando mecanismos normalizados. Si la cantidad del polipéptido diana requerida es menor de dos veces la cantidad de polipéptido inmunogénico requerido, se dice que el polipéptido diana se une específicamente a un anticuerpo generado para la proteína inmunogénica. En cuanto a la determinación final de la especificidad, los antisueros reunidos son totalmente inmunoabsorbidos con el polipéptido inmunogénico hasta que no es detectable unión al polipéptido utilizado en la inmunoabsorción. Después los antisueros completamente inmunoabsorbidos se someten a ensayo en cuanto a la reactividad con el polipéptido de ensayo. Si no se observa reactividad, el polipéptido de ensayo es específicamente unido después por los antisueros logrados por la proteína inmunogénica.

D. Otros Formatos de Análisis

En una realización particularmente preferida, se utiliza el análisis de transferencia Western (inmunotransferencia) para detectar y cuantificar la presencia de la proteína de la presente invención en la muestra. La técnica comprende generalmente separar las proteína de la muestra mediante electroforesis en gel basándose en el peso molecular, transferir las proteínas separadas a un soporte sólido adecuado, (tal como un filtro de nitrocelulosa, un filtro de nailon, o un filtro de nailon transformado), e incubar la muestra con los anticuerpos que se unen específicamente a la proteína de la presente invención. Los anticuerpos se unen específicamente a la proteína del soporte sólido. Estos anticuerpos se pueden marcar directamente o alternativamente se pueden detectar con posterioridad utilizando anticuerpos marcados (p. ej., anticuerpos anti-ratón de cabra marcados) que se unen específicamente a los anticuerpos.

E. Cuantificación de Proteínas

Las proteínas de la presente invención se pueden detectar y cuantificar mediante cualquiera de los numerosos métodos bien conocidos por los expertos en la técnica. Estos incluyen métodos bioquímicos analíticos tales como la electroforesis, la electroforesis capilar, la cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC), la cromatografía en capa fina (TLC), la cromatografía de hiperdifusión, y similares, y diversos métodos inmunológicos tales como reacciones de precipitación en fluido o gel, inmunodifusión (sencilla o doble), inmunoelectroforesis, radioinmunoanálisis (RIA), análisis de inmunoabsorción con enzima ligada (ELISA), análisis inmunofluorescentes, y similares.

F. Reducción de la Unión No Específica

Un experto apreciará que a menudo es deseable reducir la unión no específica en los inmunoanálisis y durante la purificación del analito. Cuando el análisis implica un antígeno, anticuerpo, u otro agente de captura inmovilizado sobre un sustrato sólido, es deseable minimizar la cantidad de unión no específica al sustrato. Los medios para reducir la unión no específica son bien conocidos por los expertos en la técnica. Típicamente, esto implica recubrir el sustrato con una composición proteinácea. En particular, se utilizan ampliamente composiciones de proteína tales como seralbúmina bovina (BSA), leche en polvo sin grasa, y gelatina.

G. Marcas de Inmunoanálisis

El agente de marcaje puede ser, p. ej., un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo policlonal, una proteína o un complejo de unión, o un polímero tal como una matriz de afinidad, un carbohidrato o un lípido. Las marcas detectables adecuadas para su uso en la presente invención incluyen cualquier composición detectable por métodos espectroscópicos, radioisotópicos, fotoquímicos, bioquímicos, inmunoquímicos, eléctricos, ópticos o químicos. La detección puede proseguir mediante cualquier método conocido, tal como la inmunotransferencia, el análisis western, los análisis de desplazamiento de la movilidad en gel, análisis de hibridación fluorescente in situ (FISH), rastreo de marcadores radiactivos o bioluminiscentes, resonancia magnética nuclear, resonancia paramagnética de electrones, espectroscopia de flujo detenido, cromatografía en columna, electroforesis capilar, u otros métodos que rastrean una molécula basados en la alteración del tamaño y/o la carga. La marca o grupo detectable concreto utilizado en el análisis no es un aspecto crítico de la invención. El grupo detectable puede ser cualquier material que tenga una propiedad física o química detectable. Tales marcas detectables han sido bien desarrolladas en el campo de los inmunoanálisis y, en general, se puede aplicar a la presente invención cualquier marca útil en tales métodos. De este modo, una marca es cualquier composición detectable mediante métodos espectroscópicos, fotoquímicos, bioquímicos, inmunoquímicos, eléctricos, ópticos o químicos. Las marcas útiles en la presente invención incluyen cuentas magnéticas, colorantes fluorescentes, radiomarcas, enzimas, y marcas colorimétricas o cuentas de vidrio o plástico coloreadas, como se ha comentado para las marcas de ácidos nucleicos, más arriba.

La marca se puede acoplar directamente o indirectamente al componente deseado del análisis según los métodos bien conocidos en la técnica. Como se ha indicado antes, se puede utilizar una amplia variedad de marcas, dependiendo la elección de la marca de la sensibilidad requerida, la facilidad de conjugación del compuesto, los requerimientos de estabilidad, el instrumental disponible, y las estipulaciones de recogida.

A menudo se anclan marcas no radiactivas mediante métodos indirectos. Generalmente, se une covalentemente una molécula de ligando (p. ej., biotina) a la molécula. El ligando se une después a una molécula de anti-ligando (p. ej., estreptavidina) que o bien es detectable inherentemente o bien se une covalentemente a un sistema de señales, tal como una enzima detectable, un compuesto fluorescente, o un compuesto quimioluminiscente. Se pueden utilizar numerosos ligandos y anti-ligandos. Cuando un ligando tiene un anti-ligando natural, por ejemplo, biotina, tiroxina, y cortisol, éste se puede utilizar junto con anti-ligandos de origen natural, marcados. Alternativamente, se puede utilizar cualquier compuesto hapténico o antigénico combinado con un anticuerpo.

Las moléculas también se pueden conjugar directamente con compuestos generadores de señales, p. ej., mediante conjugación con una enzima o fluoróforo. Las enzimas de interés como marcas serán principalmente hidrolasas, particularmente fosfatasas, esterasas, y glicosidasas, u oxidorreductasas, particularmente peroxidasas. Los compuestos fluorescentes incluyen fluoresceína y sus derivados, rodamina y sus derivados, dansilo, umbeliferona, etc. Los compuestos quimioluminiscentes incluyen luciferina, y 2,3-dihidroftalazinodionas, p. ej., luminol. Para una revisión de los diversos sistemas de marcaje o producción de señales que pueden utilizar, véase, la Patente de los Estados Unidos Núm. 4.391.904, que se incorpora en la presente memoria como referencia.

Los medios para detectar las marcas son bien conocidos por los expertos en la técnica. De este modo, por ejemplo, cuando la marca es una marca radiactiva, los medios para la detección incluyen un contador de centelleo o una película fotográfica como en la autorradiografía. Cuando la marca es una marca fluorescente, esta puede ser detectada excitando el fluorocromo con la longitud de onda de luz adecuada y detectando la fluorescencia resultante, p. ej., mediante microscopía, inspección visual, por medio de una película fotográfica, mediante el uso de detectores electrónicos tales como los dispositivos de carga acoplada (CCD) o fotomultiplicadores y similares. De un modo similar, se pueden detectar marcas enzimáticas proporcionando sustratos apropiados para la enzima y detectando el producto de reacción resultante. Finalmente, se pueden detectar las marcas colorimétricas simples observando simplemente el color asociado con la marca. De este modo, en diversos análisis con formato de tira ("dipstick"), el oro conjugado a menudo aparece de color rosa, mientras diversas cuentas conjugadas aparecen del color de la cuenta.

Algunos formatos de análisis no requieren el uso de componentes marcados. Por ejemplo, se pueden utilizar análisis de aglutinación para detectar la presencia de los anticuerpos diana. En este caso, las partículas recubiertas con antígeno son aglutinadas por muestras que comprenden los anticuerpos diana. En este formato, ninguno de los componentes necesita estar marcado y la presencia del anticuerpo diana se detecta mediante simple inspección visual.

Análisis para los Compuestos que Modulan la Actividad o la Expresión Enzimática

La presente invención también hace referencia a los métodos para identificar los compuestos que se unen (p. ej., sustratos), y/o aumentan o disminuyen (esto es, modulan) la actividad enzimática de los polipéptidos catalíticamente activos de la presente invención. El método comprende poner en contacto un polipéptido de la presente invención con un compuesto cuya capacidad para unirse a o modular la actividad enzimática va a ser determinada. El polipéptido empleado tendrá al menos un 20%, preferiblemente al menos un 30% o 40%, más preferiblemente al menos un 50% o 60%, y muy preferiblemente al menos un 70% u 80% de la actividad específica del polipéptido completo, nativo de la presente invención (p. ej., enzima). Generalmente, el polipéptido estará presente en un intervalo suficiente para determinar el efecto del compuesto, típicamente aproximadamente de 1 nM a 10 \muM. Del mismo modo, el compuesto estará presente a una concentración de aproximadamente 1 nM a 10 \muM. Los expertos comprenderán que se deberán controlar factores tales como la concentración de enzima, las concentraciones de ligando (esto es, sustratos, productos, inhibidores, activadores), pH, fuerza iónica, y temperatura con el fin de obtener datos cinéticos útiles y determinar la presencia o ausencia de un compuesto que se une a o modula la actividad del polipéptido. Los métodos de medición de la cinética de la enzima son bien conocidos en la técnica. Véase, p. ej., Segel, Biochemical Calculations, 2ª ed., John Wiley and Sons, New York (1.976).

Aunque la presente invención se ha descrito con cierto detalle a modo de ilustración y ejemplo para mayor claridad de comprensión, será obvio que se pueden poner en práctica ciertos cambios y modificaciones dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.

Ejemplo 1

Este ejemplo describe la construcción de genotecas de ADNc.

Aislamiento del ARN Total

Se aisló el ARN total de tejidos de maíz con TRIzol Reagent (Life Technology Inc. Gaithersburg, MD) utilizando una modificación del procedimiento de isotiocianato de guanidina/fenol ácido descrito por Chomczynski y Sacchi (Chomczynski, P., y Sacchi, N. Anal. Biochem. 162, 156 (1.987)). En resumen, se pulverizaron muestras de tejido vegetal en nitrógeno líquido antes de la adición del TRIzol Reagent, y después se homogeneizaron adicionalmente con un mortero y una mano de mortero. Se llevaron a cabo la adición de cloroformo seguida de centrifugación para la separación de una fase acuosa y una fase orgánica. El ARN total se recuperó mediante precipitación con alcohol isopropílico a partir de la fase acuosa.

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Aislamiento de ARN Poli(A)+

La selección del ARN poli(A)+ a partir del ARN total se realizó utilizando el sistema PolyATact (Promega Corporation. Madison, WI). En resumen, se utilizaron cebadores oligo(dT) biotinilados para hibridar las colas poli(A) 3' en el ARNm. Los híbridos se capturaron utilizando estreptavidina acoplada a partículas paramagnéticas y un equipo de separación magnética. El ARNm se lavó en condiciones muy restrictivas y se hizo eluir por medio de agua desionizada libre de ARNasa.

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Construcción de la Genoteca de ADNc

Se realizó la síntesis de ADNc y se construyeron genotecas de ADNc unidireccionales utilizando el SuperScript Plasmid System (Life Technology Inc. Gaithersburg, MD). La primera hebra de ADNc se sintetizó cebando un cebador oligo(dT) que contenía un sitio Not I. La reacción se catalizó mediante SuperScript Reverse Transcriptase II a 45ºC. La segunda hebra de ADNc se marcó con dCTP-P^{32}-alfa y se analizó una porción de la reacción mediante electroforesis en gen para determinar los tamaños del ADNc. Las moléculas de ADNc más pequeñas de 500 pares de bases y los adaptadores no ligados se separaron mediante cromatografía en Sephacryl-S400. Las moléculas de ADNc seleccionadas se ligaron en el vector pSPORT1 entre los sitios Not I y Sal I.

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Ejemplo 2

Este ejemplo describe la secuenciación de ADN y la sustracción de la genoteca.

Preparación del Molde de Secuenciación

Se escogieron colonias individuales y se preparó el ADN o bien mediante PCR con cebadores M13 directos y cebadores N13 inversos, o bien mediante aislamiento de plásmidos. Todos los clones de ADNc fueron secuenciados utilizando cebadores M13 inversos.

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Procedimiento de Sustracción Q-bot

Se cultivaron en placa genotecas de ADNc sometidas al procedimiento de sustracción sobre placas de agar de 22 x 22 cm^{2} a una densidad de aproximadamente 3.000 colonias por placa. Las placas se incubaron en una incubadora a 37ºC durante 12-24 horas. Las colonias se escogieron en placas de 384 pocillos por medio de un robot seleccionador de colonias Q-bot ("colony picker") (GENETIX (GENETIX Limited). Estas placas se incubaron durante la noche a 37ºC.

Una vez que se hubieron escogido suficientes colonias, se pincharon sobre membranas de nailon de 22 x 22 cm^{2} utilizando Q-bot. Cada membrana contenía 9.216 colonias o 36.864 colonias. Estas membranas se colocaron sobre placas de agar con el antibiótico apropiado. Las placas se incubaron a 37ºC durante la noche.

Después de recuperar las colonias el segundo día, se colocaron estos filtros sobre papel de filtro previamente empapado con solución desnaturalizante durante cuatro minutos, después se incubaron sobre la parte superior de un baño de agua hirviendo durante cuatro minutos más. Los filtros se colocaron después sobre papel de filtro previamente empapado con solución desnaturalizada durante cuatro minutos. Después de separar el exceso de solución colocando los filtros sobre papeles de filtro secos durante un minuto, los lados de las colonias de los filtros se colocaron en solución de Proteinasa K, se incubaron a 37ºC durante 40-50 minutos. Los filtros se colocaron sobre papeles de filtro secos para que se secaran durante la noche. Después el ADN fue entrecruzado en la membrana de nailon mediante tratamiento con luz UV.

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La hibridación de colonias se realizó como describen Sambrook,J., Fritsch, E.F. y Maniatis, T., (en Molecular Cloning: A laboratory Manual, 2ª Edición). Se utilizaron las siguientes sondas en la hibridación de colonias:

1. Primera hebra de ADNc del mismo tejido del que se había elaborado la genoteca para eliminar los clones más redundantes.

2. 48-192 clones de ADNc más redundantes de la misma genoteca basándose en los datos de secuenciación previos.

3. 192 clones de ADNc más redundantes de la base de datos de la secuencia parcial de maíz completa.

4. Un oligonucléotido Sal-A20: TCG ACC CAC GCG TCC GAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA, elimina clones que contienen una cola de poli A pero no ADNc.

5. Clones de ADNc derivados de ARNr.

La imagen de la autorradiografía se escaneó en el ordenador y se analizó la intensidad de la señal y las direcciones de las colonias frías de cada colonia. La re-ordenación de las colonias frías de placas de 384 pocillos a placas de 96 pocillos se realizó utilizando Q-bot.

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Ejemplo 3

Este ejemplo describe la identificación del gen de una búsqueda de homología por ordenador. Las identidades de los genes se determinaron realizando búsquedas BLAST (Basic Local Alignment Search Tool; Altschul, S. F., et al., (1.993) J. Mol. Biol. 215:403-410; Véase también www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/n) con los parámetros por defecto para la similitud con las secuencias contenidas en la base de datos BLAST "nr" (que comprende todas las traducciones de GenBank CDS no redundantes, secuencias derivadas del Brookhaven Protein Data Bank de estructuras tridimensionales, el último lanzamiento principal de la base de datos de proteínas SWISS-PROT, bases de datos EMBL, y DDBJ). Las secuencias de ADNc fueron analizadas en cuanto a la similitud con todas las secuencias de ADN disponibles públicamente contenidas en la base de datos "nr" utilizando el algoritmo BLASTN. Las secuencias de ADN fueron traducidas en todos los marcos de lectura y comparadas en cuanto a la similitud con todas las secuencias de proteínas disponibles contenidas en las bases de datos "nr" utilizando el algoritmo BLASTX (Gish, W. y States, D. J. (1.993) Nature Genetics 3:266-272) proporcionadas por el NCBI. En algunos casos, se utilizaron los datos de secuenciación de dos o más clones que contienen segmentos solapantes de ADN para construir secuencias de ADN contiguas.

Los ejemplos anteriores se proporcionan para ilustrar la invención pero no para limitar su alcance. Otras variantes de la invención pueden ser fácilmente evidentes para un experto en la técnica y están abarcadas por las reivindicaciones adjuntas.

<110> Pioneer Hi-Bred International, Inc.

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<120> Maize Cellulose Synthases and Uses Thereof

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<130> 0864-PCT

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<150> 60/096,822

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<151> 17 Agosto, 1.998

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<160> 60

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<170> FastSEQ para Windows Versión 3.0

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<210> 1

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<211> 3568

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<212> ADN

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<213> Zea mays

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<220>

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<221> CDS

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<222> (63)...(3237)

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<400> 1

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1

2

3

4

5

6

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<210> 2

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<211> 1059

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<212> PRT

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<213> Zea mays

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<400> 2

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7

8

9

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<210> 3

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<211> 25

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<212> ADN

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<213> Zea mays

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<400> 3

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\hskip-.1em\dddseqskip

atggaccagc ggaacggcca ggtgt

\hfill

25

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<210> 4

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<211> 25

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<212> DNA

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<213> Zea mays

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<400> 4

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\hskip-.1em\dddseqskip

ctagttgcaa tccagaccac actcc

\hfill

25

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<210> 5

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<211> 3773

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<212> ADN

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<213> Zea mays

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<220>

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<221> CDS

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<222> (338)...(3566)

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<400> 5

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10

11

12

13

14

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<210> 6

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<211> 1077

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<212> PRT

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<213> Zea mays

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<400> 6

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15

16

17

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<210> 7

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<211> 25

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<212> ADN

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<213> Zea mays

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atggagggcg acgcggacgg cgtga

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Zea mays

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctagcagttg atgccacacg tctgg

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

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<211> 3780

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<212> DNA

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<213> Zea mays

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<220>

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<221> CDS

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<222> (201)...(3423)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

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18

19

20

21

22

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

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<211> 1075

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<212> PRT

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<213> Zea mays

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

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23

24

25

26

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

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<211> 25

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<212> ADN

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<213> Zea mays

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<400> 11

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atggcggcca acaaggggat ggtgg

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

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<211> 25

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<212> ADN

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<213> Zea mays

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tcagcagttg acgccacatt gcccc

\hfill

25

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

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<211> 3725

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<212> ADN

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<213> Zea mays

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<221> CDS

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<222> (179)...(3398)

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<400> 13

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27

28

29

30

31

32

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<210> 14

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<211> 1074

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<212> PRT

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<213> Zea mays

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<400> 14

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33

34

35

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<210> 15

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<211> 25

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<212> DNA

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<213> Zea mays

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atggcggcca acaaggggat ggtgg

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

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<211> 25

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<212> ADNA

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<213> Zea mays

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tcagcagttc acaccacatt gcccc

\hfill

25

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

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<211> 3969

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<212> ADN

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<213> Zea mays

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<220>

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<221> CDS

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<222> (144)...(3399)

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<400> 17

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36

37

38

39

40

41

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<210> 18

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<211> 1086

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<212> PRT

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<213> Zea mays

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<400> 18

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42

43

44

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<210> 19

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<211> 25

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<212> ADN

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<213> Zea mays

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<400> 19

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\hskip-.1em\dddseqskip

atggaggcga gcgccgggct ggtgg

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

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<211> 25

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<212> ADN

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<213> Zea mays

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<400> 20

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\hskip-.1em\dddseqskip

ctagttgcaa tccaaaccac actcc

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

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<211> 3725

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<212> ADNA

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<213> Zea mays

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<220>

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<221> CDS

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<222> (179)...(3398)

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<400> 21

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45

46

47

48

49

50

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<210> 22

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<211> 1074

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<212> PRT

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<213> Zea mays

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<400> 22

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51

52

53

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<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADNA

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<213> Zea mays

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 59

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\hskip-.1em\dddseqskip

atggacggcg gcgacgccac gaatt

\hfill

25

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 60

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<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADNA

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<213> Zea mays

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 60

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctagcagttg atgccacatt tcgcg

\hfill

25

Claims (18)

1. Un ácido nucleico de celulosa sintasa aislado que codifica un polipéptido que tiene actividad celulosa sintasa y que comprende:

(a) un polinucleótido del SEQ ID NO: 5, 9 o 25; o

(b) un polinucleótido que codifica un polipéptido del SEQ ID NO: 6, 10 o 26.

2. Una casete de expresión recombinante, que comprende un ácido nucleico de la reivindicación 1 conectado operablemente a un promotor.

3. La casete de expresión de la reivindicación 2, donde dicho promotor es un promotor preferido por un tejido.

4. Una célula anfitriona que comprende una casete de expresión heteróloga de la reivindicación 2 o 3.

5. La célula anfitriona de la reivindicación 4 que es una célula vegetal.

6. Una planta transgénica que comprende una casete de expresión heteróloga de la reivindicación 2 o 3.

7. La planta transgénica de la reivindicación 6, donde la planta es una monocotiledónea.

8. La planta transgénica de la reivindicación 6, donde la planta se selecciona entre maíz, soja, girasol, sorgo, canola, trigo, alfalfa, algodón, arroz, cebada, y mijo.

9. Una semilla transgénica de la planta transgénica de la reivindicación 6, 7 u 8, cuya semilla comprende una casete de expresión heteróloga de la reivindicación 2 o 3.

10. Un método de modulación del nivel de celulosa sintasa en una célula vegetal susceptible de regeneración vegetal, que comprende:

(a) transformar la célula vegetal con una casete de expresión que comprende un ácido nucleico de celulosa sintasa de la reivindicación 1 conectado operablemente a un promotor;

(b) cultivar la célula vegetal transformada; y

(c) expresar dicho polinucleótido durante un tiempo suficiente para modular el nivel de celulosa sintasa en dicha célula vegetal transformada.

11. Un método para producir una planta transgénica en la cual el nivel de celulosa sintasa está modulado por un ácido nucleico de celulosa sintasa de la reivindicación 1, que comprende transformar una célula vegetal con una casete de expresión que comprende dicho ácido nucleico conectado operablemente a un promotor y regenerar a partir de dicha célula vegetal una planta que comprende dicha casete de expresión.

12. El método de la reivindicación 10 u 11 donde la planta se selecciona entre maíz, soja, girasol, sorgo, canola, trigo, alfalfa, algodón, arroz, cebada, y mijo.

13. El método de la reivindicación 10, 11 o 12, donde el promotor es un promotor preferido por el tejido.

14. El método de la reivindicación 10, 11, 12 o 13 donde el nivel de celulosa sintasa está incrementado con respecto al de la célula vegetal antes de la transformación.

15. El método de la reivindicación 11, que comprende adicionalmente obtener una progenie o una planta mutante a partir de dicha planta regenerada, donde dicha progenie o planta mutante comprende dicha casete de expresión.

16. El método de la reivindicación 11 que comprende adicionalmente: proporcionar una planta obtenida mediante el método de la reivindicación 11 que es heterocigota para el ácido nucleico de la reivindicación 1; y obtener una planta que es homocigota para dicho polinucleótido mediante autopolinización en dicha planta transgénica heterocigota, germinación de algunas de las semillas producidas y análisis de las plantas resultantes en cuanto a la expresión alterada de dicho polinucleótido con respecto a una planta de control, o mediante retrocruzamiento con una planta parental o auto-cruzamiento con una planta no transgénica.

17. Una planta de la reivindicación 6, 7 u 8 que es homocigota para el ácido nucleico de la reivindicación 1 contenido en la casete de expresión heteróloga.

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18. Una proteína aislada que tiene actividad celulosa sintasa y se selecciona entre:

(a) un polipéptido del SEQ ID NO: 6, 10 o 26; y

(b) un polipéptido codificado por un ácido nucleico de la reivindicación 1.