CH335386A - Verfahren zur Herstellung von neuen Produkten enzymatischer Oxydation - Google Patents

Description

  Verfahren zur Herstellung von neuen Produkten     enzymatischer        Oxydation       Es ist bereits bekannt, auf biochemischem  Wege, z. B. mittels Nebennieren, Nieren und  Lebern, insbesondere mit deren     Homo-          genaten    oder auch bei ihrer     Durchströmung     (siehe z. B. F. W.     Kahnt    und A. Wettstein,       Helv.        Chim.    Acta 34, 1791 [1951 ]), ferner auf  mikrobiologischem Wege (siehe z. B.     Peterson      &      Murray,    J. Am.     Chem.        Soc.    74,<B>1871</B> [1952 ] ;  F.

   W.     Kahnt    und Mitarbeiter,     Experientia    8,  422 [1952]) Sauerstoff, insbesondere     Hy-          droxylgruppen    in     11ss-    und 11     a-Stellung    sowie       Oxogruppen    in     11-Stellung    von Steroiden  einzuführen. Die verwendeten Ausgangsstoffe  wiesen immer die für Steroide typische     18-          Methylgruppe    auf.  



  Es wurde nun gefunden, dass man zu  physiologisch besonders interessanten Pro  dukten gelangen kann, wenn man von Ver  bindungen ausgeht, die in     13-Stellung    eine  freie bzw. funktionell abgewandelte     Carbinol-,          Formyl-    oder     Carboxylgruppe    enthalten.  Solche Verbindungen sind z. B. erhältlich  durch Totalsynthese gemäss dem Verfahren  des belgischen Patentes Nr. 534867, ferner  aus Naturstoffen, die in     IS-Stellung    bereits  einen     Substituenten    tragen.  



  Die     Erfindung    betrifft ein Verfahren zur  Herstellung von     11-Hydroxy-Steroidendurch     Einwirkung von Enzymen, die eine     Oxy-          gruppe    in 11 -Stellung einzuführen vermögen,  oder von solche produzierenden Mikro-         organismen    auf entsprechende     11-Desoxy-          steroide    unter     aeroben    Bedingungen, das da  durch gekennzeichnet ist, dass man gesättigte  oder ungesättigte     sübstituierte        Pregnane,

      die  in 3- und     20-Stellung    freie oder funktionell  abgewandelte     Oxy-    oder     Oxogruppen    und in       13-Stellung    eine freie oder funktionell ab  gewandelte     Carbinol-,        Formyl-    oder     Carb-          oxylgruppe    aufweisen, als Ausgangsverbin  dungen für die enzymatische Oxydation ver  wendet. Es kann sich auch um Verbindungen  der homo- und     nor-Pregnanreihe        handeln,     z.

   B. solche, die sich vom     19-Nor-    und/oder       D-Homo-pregnan    ableiten, wobei sich die       Seitenkette    des letzteren insbesondere in     17a-          Stellung    befindet.

   Als freie oder funktionell  abgewandelte     Oxy-    bzw.     Oxogruppen    kom  men beispielsweise Ester-, Äther-,     Thioester-,          Thioäther-,        Thiol-    und     Thionester-,        Acetal-,          Mercaptal-,        Ketal-,        Hydrazon-    oder     Semi-          carbazongruppen,    ferner     Enolgruppen,    wie  solche von     Enolestern,        Enoläthern    oder       Enaminen    in Betracht.

   Ausserdem können  die Ausgangsstoffe weitere     Substituenten    auf  weisen mit Ausnahme der Stellung 11.  Doppelbindungen können sich beispielsweise  in 1-, 4-, 5-, 6-, 7-, 14-, 15-     und/oder        16-Stel-          lung        befinden.    Insbesondere finden Verwen  dung gesättigte oder ungesättigte substi  tuierte     Pregnane,    die in 3-, 18-,

   20- und     21-          Stellung    freie oder geschützte     Oxy-    oder Oxo-           gruppen    aufweisen und die zusätzlich auch  in 16-     und/oder        17-Stellung    solche Gruppen  enthalten können, vorzugsweise     3,18,20-          Trioxo-,        3,20-Dioxo-18-oxy-,        3,18-Dioxy-20-          oxo-,        3,18-Dioxo-20-oxy-,        3-Oxy-18,20-          dioxo-,        3,20-Dioxy-18-oxo-,        18,

  20-Dioxy-3-          oxo-    oder     3,18,20-Trioxy-pregnanderivate,     entsprechende Verbindungen mit einer     Oxy-          oder        Oxogruppe    in     21-Stellung    sowie die  funktionellen Derivate all dieser Verbin  dungen.  



  Man kann die Ausgangsstoffe z. B. zu  sammen mit lebenden Mikroorganismen     aerob          inkubieren.    Man kann aber auch die Enzyme  aus dem Kulturfiltrat bzw. den Mikroorganis  men mehr oder weniger abtrennen und dann  nicht in Anwesenheit lebender Mikroorganis  men arbeiten. Die Mikroorganismen, z. B.

    solche der Gruppen     Actinomycetes,        Muco-          rales    oder Fungi     imperfecti,    wie     Strepto-          myceten,        Aspergillus,        Cunninghamella,        Rhi-          zopus,        Curvularia    oder     Penicillium    können in  an sich bekannter Weise gezüchtet werden,  z.

   B. in stehenden oder in untergetauchten,  bewegten Kulturen, die zweckmässig     assimi-          lierbaren        Kohlenstoff,    insbesondere Kohle  hydrate, enthalten. Das praktisch einfachste  Verfahren ist im folgenden geschildert:  Man züchtet die Organismen in Appara  turen und unter     ähnlichen    Bedingungen, wie  sie bei der Antibiotika-Fabrikation als soge  nanntes     Tieftankverfahren    bekannt sind.

    Nach Entwicklung der Kulturen gibt man     die     genannten     Ausgangsstoffe    in feiner Disper  sion oder Lösung, beispielsweise in Methanol,  Aceton oder     Aethylenglykol    zu und     inkubiert     weiter.     Schliesslich    trennt man vom     Mycel    ab,  extrahiert das Filtrat und/oder die     Myeel-          masse        und    isoliert aus dem Extrakt die     Reak=          tionsprodukte    in an sich bekannter Weise, z. B.

    durch     Entmischungsverfahren,        Adsorption,          Chromatographie,    Kristallisation, Über  führung in funktionelle Derivate wie     Girard-          Verbindungen    und dergleichen.  



  Anstelle von Enzymen mikrobiologischer  Herkunft können auch z. B. solche aus  tierischen Organen, insbesondere Neben  nieren, Nieren und Lebern Verwendung         finden.    Dabei kann man ebenfalls nach be  kannten Verfahren vorgehen:     Durchströmung     durch die Organe und insbesondere die An  wendung von     Homogenaten;    siehe z. B.  zitierte Literatur.  



  Die Verfahrensprodukte können als Heil  mittel Verwendung finden oder als Zwischen  produkte zu ihrer Herstellung dienen. Von  grösstem praktischem Interesse sind insbeson  dere     Aldosteron    und das mit ihm in nahem  strukturellem Zusammenhang stehende 44       3,20-Dioxo-11,18,21-trioxy-pregnen    bzw. ihre  funktionellen Derivate.

           Beispiel   <I>1</I>  4 Liter einer Nährlösung, enthaltend 40 g  Rohglucose, 240     cm3    Maisquellwasser     (corn          steep        liquor),    20 g     NaCl,    4 g     CaC0,    und Lei  tungswasser, werden mit verdünnter Natron  lauge auf PH 6,6 gebracht, gleichmässig auf  12     Erlenmeyerkolben    von je einem Liter  Fassungsvermögen verteilt und sterilisiert.  Nach Impfen mit     Cunninghamella        bla.ke-          sleeana    werden die Kolben bei     26 mechanisch     geschüttelt.

   Nach 60 Stunden wird eine Lö  sung von 1,0 g 44 3,     20-Dioxo-18,        21-dioxy-          pregnen    in 40     cm3    Methanol gleichmässig  unter sterilen Bedingungen zu den gut ent  wickelten Kulturen zugegeben und noch  weitere 48 Stunden bei 26  geschüttelt. Das       Mycel    wird abgetrennt und das Kulturfiltrat       (pH    8,2) erschöpfend mit Essigester aus  geschüttelt. Den Extrakt wäscht man mit  0,1-n. Salzsäure,     2J@        Natriumhydrogen-          carbonatlösung    und Wasser, trocknet ihn  über Natriumsulfat und dampft ihn im Va  kuum bei 30  ein.

   Der Rückstand (980 mg)  wird in warmem Benzol aufgenommen und  an einer mit Benzol bereiteten Säule von 30 g       Silicagel    nach der     Durchlaufmethode        chro-          matographiert.    Es wird mehrere Male     mit    je  100     cm3    Benzol, Äther,     Äther-Essigester     (9:1),     Äther-Essigester    (8:2),     Äther-Essig-          ester    (1:1), Essigester,     Essigester-Methanol     (9:1),     Essigester-Methanol    (8:

  2) und Metha  nol     eluiert.    Die     papierchromatographische     Untersuchung der einzelnen Fraktionen zeigt,      dass die ersten Fraktionen Ausgangsmaterial  und die Essigester: Methanol- und die     Metha-          nolfraktionen    ein Gemisch hochpolarer Pro  dukte enthalten. Aus den mittleren Frak  tionen hingegen kann eine Verbindung iso  liert werden, die höher polar ist als das Aus  gangsmaterial.

   Sie enthält die 44     3-Keto-          gruppierung        (U.V.        @max    = 241     m,u),        die        a-          Ketolseitenkette    (Reduktionsvermögen) und  ein zusätzliches     Sauerstoffatom    (Analyse).  Das so erhaltene 44     3,20-Dioxo-l1ss,18,21-          trioxy-pregnen    lässt sich durch     Umlösen    aus       Aceton-Äther-Petroläther-Gemischen    weiter  reinigen.  



  <I>Beispiel 2</I>  4 Liter einer Nährlösung, enthaltend 60 g       Pepton,    25     cm3    Maisquellwasser, 200 mg  Rohglucose und Leitungswasser, werden mit  verdünnter Natronlauge auf     p.    6,5 gebracht,  gleichmässig auf 12     Erlenmeyerkolben    von je  einem Liter Fassungsvermögen verteilt und  sterilisiert. Nach Impfen mit     Rhizopus        nigri-          cans    werden die Kolben bei 25  mechanisch  geschüttelt. Nach 48 Stunden haben sich die  Kulturen gut entwickelt.

   Unter sterilen  Bedingungen wird eine Lösung von 1,0 g       A4        3,20-Dioxo-18-oxy-pregnen    in 40     cm3     Methanol gleichmässig auf die 12     Erlenmeyer-          kolben    verteilt und noch weitere 48 Stunden  bei 25  geschüttelt. Nach Abtrennung des       Mycels    wird das Ausschütteln und die     chro-          matographische    Aufarbeitung des Extraktes  in gleicher Weise wie in Beispiel 1 beschrie  ben durchgeführt.

   Die     papierchromato-          graphische    Untersuchung der einzelnen       chromatographischen    Fraktionen zeigt,  dass die Essigester: Methanol- und die       Essigester-Fraktionen    ein hochpolares Ge  misch enthalten, während aus den Äther: Es  sig- und den     Essigester-Fraktionen    eine Sub  stanz isoliert werden kann, die höher polar  als das Ausgangsmaterial ist.

   Die C,     H-Be-          stimmung    weist auf den Eintritt eines Sauer  stoffatoms hin und das     U.V.-Spektrum          (@n,aq=241        mu)    zeigt die 44     3-Ketogrup-          pierung    an.

   Durch     Umlösen    aus     Aceton-Äther-          Petroläther-Gemischen    erhält man das     44     3,     20-Dioxo-11        a,18-dioxy-pregnen.       <I>Beispiel 3</I>  Wie in Beispiel 1     beschrieben,    werden  12 Kulturen von     Cunninghamella        blake-          sleeana    hergestellt. Dazu wird unter sterilen       Bedingungen    eine Lösung von 1,0 g     A4-31181          20-Trioxo-21-oxy-pregnen    in 40     cm3    Aceton  gleichmässig zugegeben.

   Nach 48     stünäigem          Schütteln    bei 26      wird    das     Mycel        abgetrennt     und das Kulturfiltrat     (pH    8,0) unter     Kühlung     mit Essigester ausgeschüttelt.

   Der Extrakt  wird mit Eiswasser gewaschen, getrocknet,  bei Zimmertemperatur eingedampft, der  Rückstand (950 mg) in     Methylenchlorid    ge  löst und an 30 g     Silicagel    nach der Durchlauf  methode     chromatographiert.    Man     eluiert     mehrere Male mit je 100     cm3Methylenchlorid,          Chloroform,    Chloroform :Aceton (9:1), Chlo  roform: Aceton (1:1) und Aceton.

   Die     papier-          chromatographische    Untersuchung zeigt Aus  gangsmaterial in den ersten     Chloroform-          Fraktionen    und hochpolare Produkte in den       Aceton-Fraktionen.    Die letzten     Chloroform-          Fraktionen    enthalten eine Verbindung mit  etwas stärkerer Polarität als     11-Desoxycorti-          costeron,    während in den     Chloroform-Aceton-          Fraktionen    eine Verbindung vorliegt, die sich       papierchromatographisch    fast gleich wie       Cortison    verhält.

   Letztere wird aus den ein  heitlichen Fraktionen     isoliert    und durch  Kristallisation aus     Aceton-Äther    weiter ge  reinigt. Das so erhaltene     11,18-Cyclohalb-          acetal    des 44     3,18,20-Trioxo-llss,21-dioxy-          pregnens    schmilzt bei 165-168 .  



  Wenn man vom     21-Acetat    ausgeht, ge  langt man zu derselben Verbindung. Das       Diacetat        schmilzt    unscharf bei 70-72 , sein  daraus durch partielle Hydrolyse mit     Na-          triumbicarbonat    bei Zimmertemperatur er  haltenes     18-Monoacetat    bei 220 , das durch  partielle     Acetylierung    erhaltene Monoacetat  bei 190-192 .

Claims (1)

1. PATENTANSPRUCH Verfahren zur Herstellung von 11-Hy- droxy-Steroiden durch Einwirkung von En zymen, die eine Oxygruppe in 11-Stellung einzuführen vermögen, oder von solche pro duzierenden Mikroorganismen auf ent- sprechende 11-Desoxysteroide unter aeroben Bedingungen, dadurch gekennzeichnet, dass man gesättigte oder ungesättigte substituierte Pregnane,

   die in 3- und 20-Stellung freie oder funktionell abgewandelte Oxy- oder Oxo- gruppen und in 13-Stellung eine freie oder funktionell abgewandelte Carbinol-, Formyl- oder Carboxylgruppe aufweisen, als Aus gangsverbindungen für die enzymatische Oxydation verwendet. UNTERANSPRÜCHE 1.

   Verfahren nach Patentanspruch, da durch gekennzeichnet, dass man die bio logische Oxydation mit Enzymen von Mikro organismen aus einer der Gruppen Actin- omycetes, Mucorales und Fungi imperfecti durchführt. 2. Verfahren nach Patentanspruch und Unteranspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man die biologische Oxydation mit En zymen von Mikroorganismen einer der Arten Streptomyces, Cunninghamella, Rhizopus, Aspergillus, Curvularia oder Penicillium durchführt. 3.

   Verfahren nach Patentanspruch und den Unteransprüchen 1 und 2, dadurch ge kennzeichnet, dass man gesättigte oder un gesättigte substituierte Pregnane, die in 3-, 18-, 20- und 21 -Stellung freie oder funktionell abgewandelte Oxy- oder Oxogruppen auf weisen, als Ausgangsstoffe verwendet. 4. Verfahren nach Patentanspruch und den Unteransprüchen 1-3, dadurch gekenn zeichnet, dass mand4 3,?0-Dioxo-18,21-dioxy- pregnen als Ausgangsstoff verwendet. 5.

   Verfahren nach Patentanspruch und den Unteransprüchen 1-3, dadurch gekenn zeichnet, dass man 44 3,18,20-Trioxo-21-oxy- pregnen als Ausgangsstoff verwendet. 6. Verfahren nach Patentanspruch und den Unteransprüchen 1-3, dadurch gekenn zeichnet, dass man d4 3,20-Dioxo-lS-oxy- pregnen als Ausgangsstoff verwendet.