DK145346B - Poroese celluloseacetatfibre indeholdende et biologisk aktivt stof til brug ved gennemfoerelse af in vitro-reaktioner og fremgangsmaade til fremstilling af fibrene - Google Patents

Description

145346

Opfindelsen angår porøse celluloseacetatfibre med mikro-porer, hvori der er okkluderet et biologisk aktivt stof til brug ved gennemførelse af in vitro-reaktioner, hvorhos fibrenes porer er af en sådan art, at de forhindrer und-slippelse af det okkluderede stof, men tillader indtrængen af det agens, som skal omsættes med stoffet, samt en fremgangsmåde til fremstilling af fibrene.

Det er kendt, at betegnelsen "antistof" henfører til stoffer af proteinnatur, som dannes i hvirveldyr af bestemte celler (plasmaceller) som svarer på indgivningen af et antigen, og som specifikt reagerer med dette.

Undersøgelsen af reaktionerne mellem antigen og antistof har stor teoretisk betydning ud fra det synspunkt at opnå en bedre forståelse af molekylernes vekselvirkning, men den har også en praktisk betydning derved, at den kan føre til stadig mere forfinede metoder til diagnose af infektionssygdomme og identifikation af infektiøse midler. Med dette formål analyseres den ene komponent, når den anden er kendt. Hvad angår antigener og antistoffer, er der blevet angivet nogle metoder til in-solubilisering ved hjælp af kemiske bindinger mellem de nævnte produkter og polymere materialer, som er uopløselige i vandige opløsningsmidler.

Imidlertid har disse præparater den ulempe, at forbindelserne heri er i vedblivende kontakt med den ydre atmosfære, og at de muligvis kan dispergeres i reaktions-massen og således forurene produktet selv. Desuden må det bemærkes, at forekomsten af kemiske bindinger kan influere på selve stoffets kemiske natur med mulige skadelige konsekvenser for dets aktivitet.

145346 2 På den anden side er det ligeledes kendt, at det er muligt at fremstille porøse fibre, som har indlejret enzymer, som ued at immobiliseres således bevarer deres katalytiske egenskaber, medens enzymet samtidigt forhindres i at undslippe og dispergeres i reaktionsmassen og således forurene reaktionsproduktet. De filament-strukturer, som kan anvendes, og fremgangsmåden til indlejring af enzymet, er beskrevet i dansk fremlæggelses-skrift nr. 133 157, ifølge hvilket de enzymindeslut-tende fibre kan fremstilles ud fra opløsninger af polymere, som er i stand til at give fibre, hvori der er dispergeret enzympræparater i form af meget små dråber af størrelsesorden som i emulsioner. Den således opnåede emulsion kan spindes under våde eller tørre betingelser til dannelse af en fiber, som i sit indre har mikroporer, hvori enzymerne er indlejret og udelukkes fra den omgivende atmosfære af en meget tynd membran, der forhindrer enzymet i at undslippe og dispergeres i reaktionsmassen, men alligevel tillader enzymet at udøve dets katalytiske virkning. Selv om det således er kendt fra dansk fremlæggelsesskrift nr. 133 157 at indeslutte enzymer i fibre af bl.a. celluloseacetat, kunne det ikke heraf sluttes, atdet også ville være muligt at indeslutte antistoffer, antigener og antisera i fibre, uden at disse ville miste deres aktivitet. De nævnte enzymer er katalysatorer, som blot fikseres af fibrene, og som kan udvikle deres aktivitet over for reagenser, som strømmer gennem fiberporerne. Derimod drejer det sig ved antistoffer om reagenser, som selv deltager i kompleksbindingsreaktionen, og således ændres. Det kunne ikke på grundlag af teknikkens stade, som blot angik en katalysator, som kom i kort kontakt med et substrat, forventes, at en kompleksbindingsvirkning kunne udnyttes fuldt ud inden i fibrene. Derfor kunne det ikke forudses, at den kompleksbindende (sequestre-rende) virkning kunne fuldføres inden i fibrene, dvs. at antistoffet ville forblive uændret reaktionsdygtigt.

3 145346

Det har nu vist sig, at det ved anvendelse af lignende metoder som de, der anvendes på enzymer, er muligt at inkorporere antigener, antistoffer eller antisera, enten som sådanne eller polymeriserede, i porøse strukturer, og at de således opnåede præparater ikke udviser de ovennævnte ulemper og heller ingen skadelig sænkning af aktiviteten over for de naturlige proteiner.

I overensstemmelse hermed er fibrene ifølge opfindelsen ejendommelige ved, at det biologisk aktive stof er et antigen, antistof eller antiserum.

De på denne måde opnåede strukturer har høj aktivitet på grund af det høje forhold mellem overfladeareal og volumen; fremgangsmåden til deres fremstilling er simpel og billig at udføre, og den frembyder endvidere muligheden af også at indlejre stoffer, som ikke har en høj renhedsgrad.

Celluloseacetatfibrene ifølge opfindelsen indeholdende antistoffer, antigener og antisera, finder anvendelse inden for forskellige områder, hvori princippet med gensidig specifik reaktivitet altid udnyttes. Hvad angår antisera og antistoffer, kan sådanne fibre således f.eks. anvendes til fra de ydre omgivelser at fjerne antigener, haptener og stoffer konjugeret med proteiner og/eller polypeptider, eller alternativt kan man, når der anvendes indlejrede polymeriserede antigener, fjerne mere eller mindre specifikke antistoffer.

Endvidere kan de ovennævnte fibre anvendes til at udføre ekstraktioner af industriel interesse ved selektiv tilhæftning og eventuelt løsgørelde af det tilhæftede antigen eller antistof. Det er også muligt at anvende sådanne fibre ved chromatografiske metoder og nærmere bestemt ved affinitetschromatografi. ^ 4 145346

Forskellen i molekylvægt mellem de proteiner, som er indlejret i mikroporer i fiberens indre, og de stoffer, som skal bindes dertil, må være tilstrækkelig til at tillade diffusion ind i fiberens indre af de stoffer, som skal bindes, indtil disse når det stof med den højere molekylvægt, som forbliver indelukket i fiberen på grund af dets større molekylvægt.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen til fremstilling af de ovennævnte celluloseacetatfibre udføres som tidligere nævnt på en måde, som svarer til fremgangsmåden ved enzymindlejring, og er ejendommelig ved de følgende trin: (a) fremstilling af det antigen, antistof eller antiserum, som skal indlejres, og efterprøvning af, at det hæfter ikke-specifikt pa fibermaterialet og ikke eller kun uvæsentligt inaktiveres efter behandling med spindeopløsningsmidler » (b) opløsning eller suspension af det under (a) fremstillede antigen, antistof eller antiserum i vand eller i en vand/glycerol-blanding, (c) tilsætning af opløsningen eller suspensionen (b) til en opløsning af celluloseacetat, (d) omrøring, indtil der er opnået en homogen emulsion, (e) spinding af emulsionen (d) gennem en spindedyse neddykket i et koaguleringsbad, og (f) om nødvendigt fjernelse af koaguleringsvæsken °g cel-luloseacetatopløsningsmidlet fra fiberen ved behandling i en strøm af luft eller en anden gas.

5 145346

Spindebetingelserne og egenskaberne af de celluloseacetater, som anvendes, er de, som allerede er angivet i beskrivelsen til det førnævnte danske fremlæggelsesskrift.

Af celluloseacetat-polymere foretrækkes især cellulose-triacetat.

De arbejdsmæssige detaljer vil fremgå tydeligere af de følgende belysende eksempler på udførelsen af fremgangsmåden ifølge opfindelsen.

EKSEMPEL_1 (I) Fremstilling_af_antisera

Antiseraene opnås i marsvin, kaniner eller andre dyr.

Det stof, over for hvilket man ønsker at opnå antiserummet (antigen eller konjugeret hapten) blandes med "complete Freund adjuvant" og injiceres i medialfladen af køllen på dyrets bagben. Efter 15 og 30 dage gentages injektionen med en lige så stor dosis af immuniseringsmidlet (antigen + Freund adjuvant), og efter 15 dage mere udføres en yderligere immunisering med halv dosis.

Derpå tages med 15 dages intervaller intracardiale blodprøver, og på det opnåede serum bestemmes antistof-titeren. Denne bestemmes ved at fremstille fortyndings-rækker af antiserummet med Veronal-puffer, 0,02 molær, ved pH 8,4, indeholdende 0,5 pct. humant serumalbumin og 0,5 pct. normalt serum.

Ued radioimmunologiske prøvningsmetoder findes den fortynding, hvortil der svarer et forhold

Bindingskomponent B _ ^

Fri komponent F

6 145346

Igen med radioimmunologiske prøvningsmetoder bestemmes affiniteten af det opnåede antiserum.

(II) Indledende prøvninger A) Prøvninger for ikke-specifik fasthæftning.

B) Prøvninger for antiserum-inaktivering ved behandling med de opløsningsmidler, som anvendes ved spindingen.

A) Prøvning for_ikke-specifik fasthæftning I plastikreagensglas afvejedes 50 mg af en fiber opnået efter fremgangsmåden med spinding, koagulering og fjernelse af opløsningsmiddel.

Fiberen indeholdt ikke antiserum eller andre sekvestre-ringsmidler (forbindelser, der danner stabile komplekser med metalioner), men kun en blanding af vand og glycerol.

Der blev fremstillet tre sæt små reagensglas, nemlig: (a) 50 mg fiber plus 2,0 ml phosphatpuffer (som blindprø v e ); (b) 50 mg fiber plus 1,5 ml phosphatpuffer plus 0,5 125 ml mærket antigen (Ag- I); (c) 50 mg fiber plus 0,5 ml phosphatpuffer plus l,o ml af en opløsning af okseserumalbumin (B5A), 5. fraktion afokseserumprotein, med en koncentration på 2,5 pct. i phosphatpuffer, plus 0,5 ml 125 mærket antigen (Ag- I).

7 145346

Der anvendtes 0,04 molær phosphatpuffer med en pH-værdi på 7,4 og indeholdende 0,5 pct. okseserumalbumin.

125

Det mærkede antigen var insulin- I med en specifik radioaktivitet på 100 pCi/yq, som tilsattes i forholdet 0,1 ^iCi pr. 50 mg fiber.

125

Der anvendtes også digoxin- I i ethanolopløsning med en radioaktivitet på 0,25 ^iCi pr. 0,5 ml, og af denne opløsning tilsattes 0,025 juCi pr. 50 mg fiber.

Begge opløsninger blev bragt til den ønskede fortynding med phosphatpuffer.

En portion af fibrene, før tilsætningen af det mærkede antigen, anbragtes i kontakt med opløsningen indeholdende 2,5 pct. okseserumalbumin i 1 time.

Fibrenes kontakttider med det mærkede antigen varierede fra 40 minutter til 48 timer.

Radioaktiviteterne af de små reagensglas indeholdende fibrene blev målt med en gamma-tæller.

Efter kontakttiden blev fibrene vasket fem gange med 2 ml phosphatpuffer hver gang, og derpå blev den resterende radioaktivitet målt med en gamma-tæller.

Derefter blev fibrene vasket fem gange til, igen med 2 ml phosphatpuffer hver gang, og radioaktiviteten blev målt.

Så blev fibrene anbragt i kontakt med 2 ml phosphatpuffer under omrøring ved 37 °C i 17 timer, og igen måltes den resterende radioaktivitet. Dette trin blev gentaget to gange til. Det fandtes, at: 8 145346 (a) radioaktiviteten forbundet med fibrene forøges gradvist, når kontakttiden med det mærkede antigen er fra 40 minutter til 48 timer; (b) forinkubering i 1 time med 2,5 pet. okseserumalbumin formindsker den mængde radioaktivitet, som forbindes med fiberen; (c) med hensyn til den radioaktivitet, som sattes til de små reagensglas, blev det bemærket, at radioaktiviteten nedsættes, efterhånden som antallet af vasknin-ger forøges, og også efterhånden som fibrenes kontakttid med vaskepufferen forøges; en lille procentmængde radioaktivitet bevares, også efter de ovenfor beskrevne vaskningstrin.

Således blev det konkluderet, at fiberen, ligesom de fleste materialer, også adsorberede på en ikke-specifik måde en lille del af den radioaktivitet, som var til stede i præparatet med det mærkede antigen, og at denne adsorption blev nedsat af okseserumalbuminet, som mættede en del af modtagestederne i fiberen.

B) Prøvninger for antiserum-inaktivering ved behandling med de_opløsningsmidler1 som anvendes_ved_spindingen

Der anvendtes to små glas med et antiinsulin-antiserum som leveret i kommercielle radioimmunoprøvningsudstyr (opnået ved injektion af svineinsulin i marsvin), og til hvert glas sattes 5 ml dobbeltdestilleret vand, således at der blev opnået 10 ml af en opløsning af antiinsulin-antiserum, som blev kaldt Ab^. Derpå fremstilledes 20 ml af en blanding af vand og glycerol (volumenforhold 40:60), som blev kaldt G160·

Derefter blev der fremstillet følgende blandinger: 9 145346 (a) 2,5 ml Ab£ + 2,5 ml destilleret vand 5,0 ml Ab (b) 7,3 ml Ab2 + 7,3 ml Gl^g 14,6 ml AblG130 (c) 5 ml Ab^Gl^g + 32,1 ml methylenchlorid 37,5 ml af to faser holdtes i god kontakt ved omrøring i 15 minutter ved 0 °C; efter centrifugering ved stuetemperatur blev den vandige fase fjernet, og fra den blev methylen-chloridet afdampet med en nitrogenstrøm. Der blev således opnået 5 ml af en opløsning betegnet som AbjGl^gM.

(d) 5 ml Ab1Gl30 + 2 ml toluen 7 ml af to faser holdtes i god kontakt ved omrøring i 30 minutter ved stuetemperatur. Efter centrifugering ved stuetemperatur blev den vandige fase skilt fra, og fra den blev toluenet fjernet med en nitrogenstrøm. Der blev til slut opnået 5 ml af en opløsning betegnet som

AblG130T·

Ved de sædvanlige radioimmunoprøvningsmetoder blev der afsat kalibreringskurver i koncentrationsområdet fra 0 til 200 μΕ/ml standard-menneskeinsulin under anvendelse af antiserummet som behandlet på de fire forskellige måder angivet ovenfor og betegnet som:

Ab1

AblG130

AblG130"

AblG13o' 10 145346

Af kalibreringskurverne på den vedføjede tegning ses, at der i praksis ikke er nogen sænkning i antistoffets bindingsevne som resultat af behandlingen af antiserummet med de opløsningsmidler, som anvendes ved spindingen. På tegningen er scintillationstællingen (s ) for referencestandarden, hvis alt antigenet er mærket med I, og B er tællingen for prøven. B/B0 er således et normaliseret mål for bindingen af antigenet til antistoffet.

(III) [E^Ø^tilling af_fibrene 200 mg cellulosetriacetat opløses i 2,65 g methylenchlorid (reagenskvalitet) ved stuetemperatur.

Det produkt, som skal indlejres, opløses eller dispergeres i vand eller blandinger af vand og glycerol.

0,4 ml af det vandige medium sættes til opløsningen af cellulosetriacetat, som i forvejen er blevet afkølet til 0 °C. Der omrøres, indtil der er opnået en homogen emulsion; denne får derpå lov at stå i 10 minutter.

Dette præparat fremstilles i en glascylinder, hvis top er forbundet til en nitrogencylinder, og hvis bund ender i en spindedyse neddykket i et koaguleringsbad indeholdende toluen.

Ued frembringelse af et nitrogentryk presses emulsionen ud fra spindedysen og koaguleres, idet den passerer ud i toluenbadet. Det resulterende filament opsamles på en rulle og behandles derpå med en luftstrøm for at fjerne både toluen og methylenchlorid.

(IU) Indlejringaf antiinsulin-antistoffet

Ued de ovenfor beskrevne metoder fremstilledes i marsvin et antiinsulin-antiserum, hvis antistoftiter fandtes at være 150 000.

145346 11

Til 0,2 ml af dette antiserum sattes 0,15 ml af en 0,02 molær Veronal-puffer med pH 8,4, indeholdende o,5 pct. menneskeserumalbumin og 0,15 ml glycerol (reagenskvalitet).

0,4 ml af denne opløsning sattes til cellulosetriacetatet ifølge fremstillingsbetingelserne for fibrene som beskrevet i det foregående.

Med samme apparat udførtes spindingen af en kontrol fiber, hvori der i stedet for 0,2 ml antiserumopløsning anvendtes 0,2 ml af en 0,02 molær Veronal-puffer med pH 8,4 indeholdende 0,5 pct. menneskeserumalbumin.

I små platikreagensglas af den art, som anvendes ved radio-immunoprøvning, anbragtes forskellige mængder fiber som angivet i tabel 1, hvori: (a) er rækken af kontrolfibre; (b) er rækken af antiserumholdige fibre, som opnået fra spindingen; (c) er rækken af antiserumholdige fibre, som efter fuldførelsen af spindingsprocessen er blevet opbevaret i den 0,02 molære Veronal-puffer med pH 8,4 indeholdende 0,5 pct. menneskeserumalbumin og vasket fem gange med 2 ml Veronal-puffer før prøvningens start.

Til hvert lille reagensglas sattes: 1,6 ml 0,04 molær phosphatpuffer med pH 7,4 indeholdende 0,5 pct. okseserumalbumin.

125 0,2 ml insulin- I med en specifik aktivitet på 100 uCi/pig og med en fortynding, som indstillede aktiviteten, målt på fremstillingsdagen, til 0,01 juCi/0,1 ml.

0,2 ml menneskeinsulin, standard, i en koncentration på 200 pE/ml.

145346 12

Efter blanding blev de små reagensglas anbragt i et køleskab ved 4 °C i 24 timer. Derpå blev der fra hvert af de små glas udtaget 1,5 ml af opløsningen, hvis radioaktivitet blev målt med en gamma-tæller (Packard model 256) = 125 med en effektivitet pa 54 pet. for I.

Fibrene blev vasket tre gange med 2 ml phosphatpuffer, hvorefter den radioaktivitet, som blev fastholdt af fibrene, blev målt med en gamma-tæller som ovenfor. På de samme fiberprøver gentoges tilsætningerne af reagenserne (puffer, insulin-·*^, standardinsulin), vaskningerne og radioaktivitetstællingerne fire gange til.

125

Det skal bemærkes, at insulin- I, anvendt som mærknings-forbindelse, ikke overskrider 5 pct. af standard-menneske-insulinet, anvendt som bærer. De opnåede resultater er sammensat i tabel 1, hvoraf det kan ses, at insulinfikseringen, som her betegnes som ikke-specifik, i kontrol fibrene, som ikke indeholder antistoffer, når en maksimumsværdi i det første forsøg og holdes praktisk taget konstant i de efterfølgende forsøg, medens insulinfikseringen i de fibre, som har indlejret antistoffer, forøges hver gang tilsætningen af reagenserne gentages.

Da kontrolfiberen blev fremstillet under stort set samme betingelser som den antistof-indlejrende fiber, må forskellen i optræden udelukkende tilskrives dannelsen af antigen-antistof-bindingen i fiberens indre mellem det indlejrede antiinsulin og det insulin-antigen, som er til stede i mediet.

13 145346 m S 4 m u) s σι cm s s cm cd in ni o> c\i i£i in HCMHinHCh O CO H CM GO -4 ^ ^ ^ "5 5 9

IS H NI O CTi fn 0Ί ~4 H O O CM ID CO ID l> <t H CO

in CM in VØ ts S O 4 4 in ID O !£ H !£) 92 '’I ™ H VØ σι IS H C0 S to Dl O O 4 Η σι

Η Η Η Η Η Η H

m id m m 4 o o η n c\i oo o o w (D m m o m mo <r co md o 4 m co <f h o σ> h o vø o o in cn in σι -4 σι oo o\ 4 h w o co c\i o c\i w in oo ^ N <r m id oo H s s- co o o cm 4 4 n 4 w w w h in to 10 o m in s co σι σι κι σι 00

Η ιΗ H iH

O

5} 'Z Kl IS CM -4 -4 00 lA (O in 4 ni 4 O H 00 CM IS O H

μ o 10 m σι id id ni en 00 m id m is η σι σι cm cø o cn jj in η n in 10 o -4 cm s co h n o o w o o> σι

cc; ιήπ ni in m ιΰ σι H co o co O m in ^ ^ P

c h 4 to in 01 m m co h co 03 w to n-

O ή HH H

E

H h o t-4 -i m

CQ

<ri u r ο- σι ni in in σι m m vø o co s- in m cm s m co o -4 in cd o σι η σι σι ni in co ιο is cø κι o cm o <n mi σ> o H 4 in 01 ID H o m CM co in S 4 CD κι h ~4 co . c cn -η m h m vø o c\i σι κι σι σι σι 10 n in co co 4 10 m -h HHhcmcm m is -4 is η h in vø vø co o co m

r-i H H H

S) 4-) 'w' cm cø 00 o S cm in σι σι h o o mm-4-4Kn CM H CM CO Η H 01 4 σι m s η σι o m σι co co is κι o κι -4 co h cm co æ σι in o- in is co i i

—> cd cm in co m ni cm 4 co m 4 o ni σι m ni O

rhhhcm ni 4 ni 4 m in mm<n-4in +j^ o in -4 o S co h s η H co in co m κι η h ts -4 mm - ~ ~ ·>*·>·> * ·> cr; æa s cm co m κι h s- cm vø cm κι o σι h cm cm o cm cm |>v_^ HHCMm-4 i—li—l CM Kl -4 HHH-4-4tn m m

CD

H £> · § p h cu m 4 m co h cm n 4 in co h cm κι -4 in cø s

Ct, ^ ri cd co cu co cc tf o o o υ o o o

Ph

I I

I 1 I M M

H u ri ri pi O (DM CDMI-PHri

Ld) ΜΗ CD CQHCDiHCDrirQ

•p ,iij ·Η .ί H TJ Λ <D -P Λ d 3ll -PH.*! -PH^'rilQCQri o EB rioæ 5 2 ,æ S S £ ts «ri C Λ ri C £ ri 2 .*! !> <Η 145346 EKSEMPEL_2 14

Ved den procedure, som er beskrevet ovenfor, fremstilledes i marsvin et anti-HGH-antiserum (HGH=humant væksthormon), hvis antistoftiter fandtes at være 2 000.

Til 0,2 ml af dette antiserum sattes 0,15 ml af en 0,02 molær Veronal-puffer, pH 8,4, indeholdende 0,5 pct. menneske-serumalbumin og 0,15 ml glycerol (reagenskvalitet).

Med det samme apparat som ovenfor udførtes spindingen af en kontrolfiber, hvori der i stedet for 0,2 ml af antiserum-opløsningen anvendtes 0,2 ml af en 0,02 molær Veronal-puffer, pH 8,4, indeholdende 0,5 pct. menneskeserumalbumin.

I små plastreagensglas af den art, som anvendes til radio-immunoprøvninger, anbragtes forskellige mængder fibre som angivet i tabel 2, hvori: (a) er rækken af kontrolfibre, og (b) er rækken af antiserumholdige fibre, som opnået ved spindingsprocessen.

Til de to rækker små reagensglas (8 små glas for hver række) sattes: 1,6 ml af en 0,13 molær boratpuffer, pH 8,4, indeholdende 0,5 pct. okseserumalbumin; 125 0,2 ml HGH- I med en specifik aktivitet på 150 yuCi/jug og med en fortynding, som bragte aktiviteten, målt på fremstillingsdagen, til 0,015 jjCi/0,1 ml; 0,2 ml standard-HGH i de koncentrationer, som er angivet i tabel 2.

Efter blanding blev de små reagensglas anbragt i et køleskab ved 4 “C i 24 timer. Derpå blev der fra hvert lille glas udtaget 1,5 ml opløsning, hvis radioaktivitet blev målt med en 15 145346 gamma-tæller (Packard, model 256) med en effektivitet på 125 54 pet. for I.

Fibrene blev vasket tre gange med 2 ml boratpuffer hver gang, hvorefter den radioaktivitet, som var fikseret i fibrene, blev målt med en gamma-tæller som nævnt ovenfor.

På de samme fiberprøver gentoges en gang til tilsætningerne af reagenserne (puffer, HGH- I, standard-HGH) , vasknin-gerne og radioaktivitetstællingerne. De opnåede resultater er angivet i tabel 2. Det ses, at der i fibrene, som indeholder anti-HGH-antistoffet, især efter det andet forsøg, ved alle koncentrationsniveauerne af tilsat HGH er en mængde fikseret radioaktivitet, som er større end i de tilsvarende kontrol fibre, som ikke indeholder antiserum i deres indre, men som er blevet behandlet på stort set den samme måde som de, der har antiserummet indlejret.

Det skal bemærkes, at det anvendte anti-HGH-antiserum har en titer på 2 000, og således er det specifikke "sequesterings fænomen (den specifikke reciprokke antigen-antistof-virkning) mindre iøjnefaldende end det, som vistes for prøvningen i eksempel 1, hvori der anvendtes et antiinsulin-antiserum med en titer på 150 000.

Den specifikke fiksering på grund af antigen-antistof-bindin-gen i fibrene, som indeholder anti-HGH-antistofferne, er imidlertid utvivlsom også i dette tilfælde.

16 145346 ✓—s (-i

(D

jj o O o ΙΆ MD fA O (Π σίΙ\1 t\ICTi VDW

-p m m cm cm ia go cn n md σ> h s ia md ro cn • = <tCTi IA lA s s co cm Η ~Χ h s s h c— oo N c C5 -h MD IA S <1 M) <t" <t lA O OD <T\ 00 is CO os s o CO -1 od u o °- fø 01 c •H yj cm ctiO ia ση oo cti on md md on ia o md -< is γα oo on cr\ s o ro cu md h in in <r vo •—i hs so os on ia cm o cm md cm md on ia *“I £ΰ

in in in<t- in ιοί κη <1 MDMDMDiAiAiA<i-iA

CM

m

S

c s α CD Ό ri Ih cd ep Ό Cti 3 cd ri-P h tn lo

O mu g N CM

,j_J ^lj ^ m

-P CD PS &Q HO O I O I O I Hl Ol Ol O

cd -P CL Η H CM lA H CM LA

P-P w -P Cd ti ra 0 H O H £-P O

w -p^ HO CMS HMD SCT\ MD <1 CM in O CM C0C0

EtO tlD ·> ·> » - - - “ ·* - - pdss oo o o> o οι on on en o oo oo on on

HHH Η HHHHH

pq pq ω J_I ^ m

$ p H CM ΓΑ <T tn MD SCO H CM IA <f LT\ MD SCO

P^éhc! cd cd cd cd cd cd cdcd >a>a ,ω ,α & rQP

Cl) 93ptæaioj:q.HO}i e^eea δτρχοχρτιαθδτ^τιν EKSEMPEL_3 17 1Λ 5 3 Λ 6

Ued de procedurer, som er beskrevet ovenfor, fremstilledes et anti-triiodtyronin-antiserum ved indpodning af triiod-tyronin bundet til menneskeserumalbumin i kaniner. På det opnåede antiserum bestemtes en antistoftiter på 4 000. Til 0,2 ml af serummet sattes 0,15 ml af en 0,08 molær Ueronal-puf f er, pH 7,5, indeholdende 0,5 g/liter menneske-* serumalbumin og 0,15 ml glycerol.

0,4 ml af opløsningen blev indlejret i 200 mg cellulosetri-acetat ifølge den allerede beskrevne fiberfremstillingsprocedure.

Ved den samme procedure fremstilledes en kontrolfiber, hvori der i stedet for antiserumopløsningen i 200 mg cellu-losetriacetat var indlejret 0,4 ml af en opløsning opnået ved at blande 0,35 ml af en 0,08 molær Ueronal-puffer, pH 7,5, indeholdende 0,5 g/liter menneskeserumalbumin, og 0,15 ml glycerol.

50 mg af den antistofholdige fiber og 50 mg af kontrolfiberen uden antistof anbragtes i to små reagensglas af plastmateriale og blev vasket fem gange med 2 ml af den ovenfor beskrevne Veronal-puffer.

Derpå sattes til hvert af de små reagensglas: 2 ml 0,08 molær Ueronal-puffer, pH 7,5, indeholdende 0,4 g/liter menneskeserumalbumin og 4 mg/liter tri-iodtyronin; og 125 .

0,2 ml triiodtyronin- I med en specifik aktivitet pa 90 ^iCi/jjg fortyndet til en aktivitet på 0,1 (uCi/ml.

Efter blanding blev de små reagensglas anbragt i et køleskab ved 4 °C i 24 timer.

18 145346

Derpå blev fibrene befriet for opløsningen indeholdende reagenserne og vasket fem gange med 2 ml af den ovenfor beskrevne l/eronal-puf fer.

Derpå blev tilsætningerne af reagenserne og vaskningerne gentaget for anden gang, som angivet ovenfor.

Til sidst blev den i fibrene tilstedeværende radioaktivitet målt med den førnævnte gamma-tæller.

På kontrolfiberen uden antistoffer blev der målt en tælling på 45 000 pr. 10 minutter; på fiberen, som indeholdt antistoffet, blev der målt en tælling på 146 000 pr. 10 minutter.

EKSEMPEL_4

Med de allerede beskrevne procedurer blev der fremstillet et anti-(letkæde/Log 3t^)-antistof med koncentrationer på 25 mg/ml i en fysiologisk opløsning pufret til pH 7,3 med 0,01 molært natriumphosphat. (Letkæde'X og letkædeiter polypeptider med en molekylvægt på ca. 22 000, som indgår i immunoglobuliner, se Bellanti, "The Principles of Immunology", ed. Sounders, Philadelphia 1971, side 101-107, især side 104).

Til 0,35 ml af denne opløsning sattes 0,15 ml glycerol.

0,4 ml af den sidstnævnte opløsning blev indlejret i 200 mg cellulosetriacetat ved den allerede beskrevne procedure.

Under anvendelse af den samme spindingsprocedure blev der i en kontrolfiber indlejret 0,4 ml af den allerede beskrevne puffer.

100 mg af den antistofholdige fiber og 100 mg af kontrolfiberen blev anbragt i to små plastreagensglas. Fibrene blev vasket fem gange med 2 ml 0,01 molær phosphatpuffer, pH

7,3.

19 145346

Derpå sattes til de små glas 1 ml 0,01 molær phosphatpuffer, pH 7,3 indeholdende 0,9 pot. natriumchlorid og 0,5 mg/ml letkæder A og X. .

De små reagensglas blev holdt i 2 timer ved 22 °C og i yderligere 22 timer ved 4 °C.

Efter inkubation blev opløsningerne udtaget fra de små glas, og fibrene blev vasket fem gange med 1 ml 0,01 molær phosphatpuffer, pH 7,3, indeholdende 0,9 pct. natriumchlorid.

Vaskevæskerne blev kombineret med de opløsninger, som blev udtaget fra glassene efter inkubation, og proteinkoncentreringen på den således opnåede opløsning bestemtes ved Lowry-metoden.

I de opløsninger, som havde været i kontakt med kontrol-fiberen, måltes 0,447 mg proteiner. I de opløsninger, som havde været i kontakt med den antistofholdige fiber, måltes 0,385 mg proteiner. De tilsatte 0,5 mg letkæder Λ og er således næsten helt udvasket fra kontrolfiberen, medens en væsentlig mængde er tilbageholdt på den antistofholdige fiber.