CH628519A5

CH628519A5 - Procedimento per la preparazione di fibre inglobanti anticorpi, antigeni, od antisieri.

Info

Publication number: CH628519A5
Application number: CH1007375A
Authority: CH
Inventors: Onofrio Lostia; Francesco Bartoli
Original assignee: Snam Progetti
Priority date: 1974-07-31
Filing date: 1975-07-31
Publication date: 1982-03-15
Also published as: IL47845A; NL177839C; DK145346C; DE2534317B2; DK347875A; US4031201A; IT1008202B; DK145346B; FR2280353A1; DD120665A5; SE7508702L; ZA754949B; AU8356675A; CS209481B2; NL7509169A; FR2280353B1; IL47845A0; CA1060342A; GB1513169A; NO752690L

Description

La presente invenzione concerne un procedimento per la preparazione di fibre inglobanti anticorpi, antigeni o antisieri, caratterizzato dai seguenti stadi:

a) preparazione della sostanza da inglobare cui si è interessati con verifica della fissazione aspecifica sul materiale della fibra e della mancata o non rilevante inattivazione per trattamento con i solventi di filatura,

b) dissoluzione o sospensione della sostanza (a) in acqua o miscele di acqua e glicerina,

c) aggiunta della soluzione o sospensione (b) ad un polimero in soluzione,

d) agitazione fino ad ottenere un'emulsione omogenea,

e) filatura dell'emulsione (d) attraverso una filiera immersa in un bagno di coagulo e f) rimozione del liquido di coagulo e del solvente del polimero della fibra per trattamento in corrente di aria od altro gas, se necessario.

È noto che il termine anticorpo si riferisce a sostanze di tipo proteico che vengono formate in un vertebrato da cellule particolari (le plasma-cellule) come risposta alla somministrazione di un antigene e che reagiscono specificatamente con esso.

Lo studio delle reazioni fra antigene e anticorpo ha una notevole importanza teorica per meglio capire l'interazione di due molecole, ma ha anche una importanza pratica perché può fornire metodi sempre più raffinati per la diagnosi di malattie infettive e per l'identificazione di agenti infettanti. A questo scopo si analizza un componente essendo noto l'altro. Per quanto riguarda gli antigeni e gli anticorpi sono state descritte alcune tecniche di insolubilizzazione mediante legami chimici fra i suddetti prodotti e materiali polimerici insolubili in solvente acquoso.

Tuttavia queste preparazioni presentano lo svantaggio del continuo contatto con l'ambiente esterno, della possibile dispersione nella massa di reazione e quindi del possibile inquinamento del prodotto finale stesso. Inoltre si deve osservare che l'insorgere di legami chimici può influenzare la natura chimica della sostanza stessa con possibili conseguenze negative per la sua attività.

D'altra parte è parimenti noto che è possibile preparare fibre porose inglobanti enzimi che conservano, così immobilizzati, le loro proprietà catalitiche mentre vengono evitate la fuoriuscita dell'enzima, la sua dispersione nella massa di reazione e quindi il possibile inquinamento del prodotto di reazione. Una emulsione di soluzioni di polimeri formanti fibre con preparati enzimatici in piccolissime goccioline può essere filata, ad umido od a secco, per dare una fibra che presenta nel suo interno piccolissime cavità nelle quali si dispongono gli enzimi che sono separati dall'ambiente da una sottilissima membrana, la quale impedisce la fuoriuscita dell'enzima e la sua dispersione nella massa di reazione e tuttavia permette che l'enzima possa esplicare la sua azione catalitica.

Ora è stato riscontrato che, impiegando tecniche non dissimili da quelle usate per gli enzimi, è possibile inglobare in strutture porose antigeni, anticorpi, antisieri, come tali o polimerizzati, e le preparazioni così ottenute non presentano gli svantaggi summenzionati, senza pregiudizievole diminuzione di attività rispetto alle proteine native.

Le strutture così ottenute hanno attività elevata a causa dell'alto rapporto superficie/volume, il processo per il loro ottenimento è assai economico e semplice da realizzare ed inoltre offre la possibilità di inglobamento di sostanze anche di purezza non elevata.

Le strutture filamentose inglobanti anticorpi, antigeni e antisieri, ottenute col procedimento definito nella rivendicazione 1, trovano impiego in vari campi di applicazione, nei quali sempre si sfrutta il principio della reciproca reattività specifica. Così, ad esempio, relativamente agli antisieri e agli anticorpi, possono essere utilizzate per sottrarre ali/ambiente esterno antigeni, apteni o sostanze coniugate a proteine e/o polipeptidi, oppure, utilizzando antigeni polimerizzati inglobati, si possono sottrarre anticorpi più o meno specifici. Tali strutture filamentose possono essere inoltre impiegate per realizzare estrazioni di interesse industriale mediante fissazione selettiva e possibile distacco della sostanza fissata (antigeni, anticorpi, ecc.) ad esempio l'estrazione di enzimi quali ami-lasi, proteasi, invertasi, ecc. È possibile anche la loro utilizzazione in tecnica in cromatografia ed in particolare di cromatografia di affinità, ad esempio per separare sostanze isoenzimatiche del tipo della colinesterasi.

La differenza di peso molecolare tra le proteine inglobate nelle microcavità all'interno della fibra e le sostanze da legare ad esse deve essere sufficiente a consentire una diffusione all'interno della fibra della sostanza o delle sostanze da legare fino a raggiungere la sostanza di peso molecolare maggiore che rimane inclusa nella fibra a causa del suo maggiore peso molecolare.

Tra i materiali polimerici preferiti per la preparazione delle fibre secondo l'invenzione si possono citare i polimeri cellulosici, i polimeri cellulosici esterificati, eterificati o nitrati, particolarmente i polimeri del triacetato di cellulosa. Altri polimeri impiegabili sono il polietilene, le poliammidi, i polimeri o copolimeri di acrilonitrile, butadiene o isoprene, acrilati, metacrilati, esteri vinilici, cloruri vinilici, i polimeri o copolimeri di cloruro di vinilidene, stirolo, vinil-butirrato, y-metil-glutammato e simili..

Comunque tutte le particolarità operative saranno più evidenti dall'esame dei seguenti esempi illustrativi, che illustrano alcune forme di esecuzione dell'invenzione come definita nella rivendicazione 1.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

3

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Esempio 1

I) Preparazione degli antisieri

Gli antisieri sono ottenuti in cavia o coniglio o altro animale.

La sostanza contro cui si vuole ottenere Pantisiero (antigene o aptene coniugato) viene mescolata con adiuvante di Freund completo e iniettata nella faccia mediale della coscia della zampa posteriore dell'animale. A distanza di 15 e di 30 giorni si ripete l'iniezione con una uguale dose di agente immunizzante (antigene + adiuvante di Freund) e dopo altri 15 giorni si procede a una ulteriore immunizzazione con mezza dose. Quindi a intervalli di 15 giorni si fanno prelievi in tracardiaci di sangue e sul siero ottenuto si determina il titolo anticorpale. Questo viene misurato facendo diluizioni seriate dell'antisiero con tampone Veronal 0,02 M pH 8,5 contenente 0,5% di siero albumina umana (s. a. u.) e 0,5% di siero normale.

Con le tecniche del dosaggio radioimmunologico (RIA) si

B

trova la diluizione cui corrisponde un rapporto = 1.

F

Sempre con le tecniche del RIA viene determinata anche l'affinità dell'antisiero ottenuto.

II) Prove preliminari

A) Prove fissazione aspecifica;

B) Prove inattivazione antisiero per trattamento con i solventi utilizzati per la filatura.

A) Prove fissazione aspecifica

In tubicini di plastica sono stati pesati circa 50 mg di fibra come ottenuto dopo il processo di filatura, coagulo ed eliminazione solventi.

La fibra non conteneva antisieri o altri sequestranti ma solo una miscela di acqua e glicerina.

Si sono preparate tre serie di tubicini contenenti rispettivamente:

a) 50 mg fibra + 2,0 mi tampone fosfato (come blank);

b) 50 mg fibra + 1,5 mi tampone fosfato + 0,5 mi antigene marcato (Ag -1125);

c) 50 mg fibra + 0,5 mi tampone fosfato + 1,0 mi soluzione siero albumina bovina (BSA) V frazione al 2,5 % in tampone fosfato + 0,5 mi antigene marcato (Ag - I125).

Si è adoperato tampone fosfato 0,04 M, pH 7,4 contenente 0,5% BSA.

L'antigene marcato era costituito da Insulina -1125 con attività specifica di 100 |AC/fJig che è stata aggiunta nella misura di 0,1 [iC/50 mg fibra.

È stata anche adoperata digoxina -1125 in soluzione di etanolo avente una attività di 0,25 (xC/0,5 mi e di questa sono stati aggiunti 0,025 nC/50 mg fibra.

Entrambe sono state portate alla diluizione voluta con tampone fosfato.

Parte delle fibre prima dell'aggiunta dell'antigene marcato sono state messe a contatto per 1 ora con la soluzione contenente il 2,5 % di BSA.

I tempi di contatto delle fibre con l'antigene marcato variavano da 40 minuti a 48 ore.

Le attività dei tubicini contenenti le fibre sono state contate al y-counter.

Finito il tempo di contatto, le fibre sono state lavate per 5 volte con 2 mi di tampone fosfato per volta, quindi si è misurata la radioattività residua al y-counter.

Successivamente le fibre sono state lavate per altre 5 volte, sempre con 2 mi di tampone fosfato, ed è stata rimisurata la radioattività.

Quindi le fibre sono state messe a contatto con 2 mi di tampone fosfato sotto agitazione a 37°C per 17 ore ed è stata nuovamente misurata la radioattività residua; tale operazione è stata ripetuta altre due volte. Si è trovato che: 5 a) La radioattività associata alle fibre è gradualmente maggiore quando il tempo di contatto con l'antigene mercato passa da 40 minuti a 48 ore.

b) La preincubazione per 1 ora con BSA 2,5 % fa diminuire la quantità di radioattività associata alla fibra, io c) Rispetto alla radioattività aggiunta nei tubicini si nota che, per effetto dei lavaggi, questa diminuisce all'aumentare del numero dei lavaggi, e del tempo di contatto della fibra con il tampone di lavaggio; una piccola percentuale di questa rimane anche dopo le descritte operazioni di lavaggio. 15 Pertanto si è concluso che, come la gran parte dei materiali, anche la fibra adsorbiva in maniera aspecifica una piccola parte della radioattività presente nella preparazione dell'antigene marcato e che tale adsorbimento veniva diminuito dalla BSA che andava a saturare parte dei siti recettori posti 20 nella fibra.

B) Prove di inattivazione dell'antisiero per trattamento con i solventi utilizzati per la filatura Si sono utilizzati due flaconcini di un antisiero anti-insuli-25 na, quali sono forniti nei KITS commerciali per radioim-munoassay (antisiero anti-insulina porcina, ottenuta in cavia) e si sono aggiunti a ciascuno 5 mi di H20 bidistillata ottenendo 10 mi di soluzione di antisiero anti-insulina che è stata chiamata Ab2. Si sono quindi preparati 20 mi di una 3o miscela di acqua e glicerina (40:60) (v:v) che si è chiamata Gl60.

Si sono quindi preparate le seguenti miscele:

a) 2,5 mi Ab2

35

+ 2,5 mi H20 dist

5,0 mi

Abj

40

b)

7,3 mi

Ab2

+

7,3 mi

Gl60

45

14,6 mi

AbjGL,,

c)

5 mi

AbjGloQ

50

+

32,1 mi cloruro di metilene

37,5 mi di due fasi che si sono tenute ben a contatto sotto agitazione per 15 minuti a 0°C; quindi dopo centrifu-J5 gazione a temperatura ambiente, si è prelevata la fase acquosa dalla quale si è eliminato il cloruro di metilene con una corrente di azoto. Si sono quindi ottenuti 5 mi di soluzione indicata con Abj Gl30 M

60

d) 5 mi di AbjGl30

+ 2 mi di Toluene

65 7 mi di due fasi che si sono tenute ben a contatto sotto agitazione per 30 minuti a temperatura ambiente. Dopo centrifugazione a temperatura ambiente si è prelevata la fase acquosa dalla quale si è eliminato il toluolo con una cor-

628519

4

rente di azoto. Si sono quindi ottenuti 5 mi di una soluzione indicata come Abj Gl30 T.

Con le normali tecniche del RIA si sono tracciate le curve di taratura, nell'intervallo di concentrazioni 0 - 200 [iU/ mi di insulina umana standard, utilizzando l'antisiero trattato nei differenti quattro modi, e prima indicati come

Ab,,

Abi G13o

Abj Gl30 M

Abj Gl30 T

Dalle curve di taratura allegate (fig. 1) risulta che praticamente non si ha alcuna diminuzione della capacità legante dell'anticorpo per il trattamento dell'antisiero con i solventi utilizzati per la filatura.

III) Preparazione delle fibre

200 mg di triacetato di cellulosa (Fluka) vengono sciolti in 2,65 g di cloruro di metilene (C. Erba reagente puro) a temperatura ambiente.

Il prodotto da inglobare è sciolto o disperso in HzO o in miscele di H20 e glicerina.

0,4 mi di tale mezzo acquoso vengono aggiunti alla soluzione del polimero previamente raffreddata a 0°C. Si agita fino all'ottenimento di una emulsione omogenea, che viene poi lasciata a riposo per 20 minuti.

Questa preparazione avviene in un cilindro di vetro collegato in alto ad una bombola di azoto e terminante in basso con una filiera immersa in un bagno di coaguo contenente toluolo.

Esercitando una pressione di azoto, l'emulsione fuoriesce dalla filiera e, passando nel bagno di toluolo, coagula. Il filo risultante è raccolto su un rullo e quindi trattato con una corrente di aria per eliminare il toluolo e il cloruro di metilene.

IV) Inglobamento anticorpo anti-insulina

Con le tecniche prima descritte è stato preparato in cavia un antisiero-anti-insulina di cui è stato determinato il titolo anticorpale che è risultato pari a 150.000.

A 0,2 mi di questo antisiero sono stati aggiunti 0,15 mi di tampone Veronal 0,02 M pH 8,4 contenente 0,5% di siero albumina umana, e 0,15 mi di glicerina (C. Erba-R.P.).

0,4 mi di questa soluzione sono stati aggiunti al polimero secondo le condizioni di preparazione delle fibre precedentemente descritte.

Con la stessa apparecchiatura è stata eseguita la filatura di una fibra di controllo, in cui al posto dei 0,2 mi di soluzione di antisiero sono stati utilizzati 0,2 mi di tampone Veronal 0,02 M pH 8,4 contenente 0,5 % di siero albumina umana. In tubicini di plastica del tipo di quelli utilizzati per i dosaggi radioimmunologici, sono state poste quantità diverse di fibra come riportato in tabella 1, dove:

a) rappresenta la serie delle fibre di controllo b) rappresenta la serie delle fibre contenenti antisiero, come uscite dal processo di filatura c) rappresenta la serie delle fibre contenenti antisiero, che dopo il processo di filatura sono state conservate in tampone Veronal 0,02 M, pH 8,4 contenente 0,5 % di siero albumina umana e lavate per 5 volte con 2 mi di tampone Veronal prima dell'inizio dell'esperimento.

In ciascun tubicino sono stati aggiunti:

— 1,6 mi di tampone fosfato 0,04 M pH 7,4 contenente 0,5 % di siero albumina bovina;

— 0,2 mi di Insulina -1125 con attività specifica di 100 [iCi/|ig e, con una diluizione che portava l'attività, misurata alla data di preparazione, a 0,01 {iCi/0,1 mi;

— 0,2 mi di Insulina umana standard alla concentrazione di 200 p.U/ml.

Dopo mescolamento i tubicini sono stati posti a 4°C per 24 ore. Quindi da ciascun tubicino sono stati prepevati 1,5 mi 5 di soluzione di cui è stata misurata la radioattività con un y-counter (Packard, mod. 256), avente una efficienza del 54% per lo I125.

Le fibre sono state lavate per 3 volte con 2 mi di tampone fosfato e quindi è stata misurata la radioattività fissata io nelle fibre al y-counter come detto precedentemente. Sugli stessi campioni di fibra sono state ripetute le aggiunte dei reattivi (tampone, insulina I125, insulina standard), i lavaggi e le misure di radioattività per altre 4 volte.

Si fa notare che l'insulina I125 usata come tracciante non 15 supera il 5 % dell'insulina umana standard usata come carrier. I risultati ottenuti sono riportati in tabella 1 dove è possibile osservare che, mentre nelle fibre di controllo che non contengono anticorpo la fissazione di insulina, che chiameremo aspecifica, raggiunge un valore massimo nella prima 20 prova e si mantiene praticamente costante nelle prove successive, nelle fibre inglobanti l'anticorpo la fissazione di insulina cresce ogni volta che si ripete l'aggiunta dei reattivi.

Poiché la fibra di controllo è stata preparata in identiche condizioni rispetto alla fibra inglobante l'anticorpo, la dif-25 ferenza di comportamento deve essere attribuita soltanto alla formazione del legame antigene-anticorpo all'interno della fibra tra l'anticorpo anti-insulina inglobante e l'antigene insulina presente nel mezzo.

5

628519

TABELLA 1

Fibra

Esperienze

Camp. N°

Peso (mg)

1°

counts/10'

2°

counts/10'

3°

counts/10'

4°

counts/10'

5°

counts/10'

ai

7,0

6.822

5.059

2.703

2.579

2.718

_o o a2

12,5

12.716

11.162

5.567

4.966

5.127

a

0

33

18,4

15.328

13.405

5.132

5.543

6.314

•3

a4

25,0

16.060

16.595

6.594

6.983

7.059

o Ö

C/3

a5

33,7

15.317

20.919

9.564

8.474

7.915

a6

41,8

22.412

22.695

11.668

11.960

10.396

bi

7,1

22.895

39.193

48.025

57.800

64.907

B g b2

12,7

44.149

73.026

80.498

87.945

94.489

P

Q **2

b3

16,1

28.299

49.550

58.295

66.435

74.112

o •-

I

b4

22,1

45.831

79.268

90.734

100.182

113.027

fc b5

33,6

54.870

119.867

135.862

150.248

166.087

b6

40,5

50.910

116.575

135.154

152.010

170.242

0

V.

Cl

9,8

32.593

52.763

67.770

74.800

85.678

Jj Û "&

S M »

C2

11,3

39.403

65.432

79.011

84.292

91.836

§ g «

C3

12,3

43.554

66.607

83.098

97.018

107.592

g c al

<U Çï

B o S o a "G u o o-

•c ° g <*

GO

c4

12,1

42.794

68.325

82.292

94.203

105.739

c5

40,1

50.883

104.108

121.027

132.263

148.442

c6

42,7

—

66.490

89.960

99.300

111.166

c,

32,4

—

53.654

70.901

82.805

93.805

Esempio 2

Con le tecniche prima descritte è stato preparato in cavia un antisiero-anti-HGH di cui è stato determinato il titolo anticorpale che è risultato pari a 2.000.

A 0,2 mi di questo antisiero sonò stati aggiunti 0,15 mi di tampone Veronal 0,02 M pH 8,4 contenente 0,5 % di siero albumina umana e 0,15 mi di glicerina (C. Erba-R.P.).

Con la stessa apparecchiatura è stata eseguita la filatura di una fibra di controllo, in cui al posto dei 0,2 mi di soluzione di antisiero sono stati utilizzati 0,2 mi di tampone Veronal 0,02 M, pH 8,4 contenente 0,5 % di siero albumina umana.

In tubicini di plastica del tipo di quelli utilizzati per i dosaggi radioimmunologici sono state poste quantità diverse di fibra come riportato in tabella 2, dove:

a) rappresenta la serie delle fibre di controllo;

b) rappresenta la serie delle fibre contenenti antisiero, come uscite dal processo di filatura.

Alle due serie di tubicini (8 tubicini per serie) sono stati aggiunti:

— 1,6 mi di tampone borato 0,13 M pH 8,4 contenente 0,5% BSA;

— 0,2 mi di HGH-I125 con attività specifica 150 [xCi/jAg e con una diluizione che portava l'attività, misurata alla data di preparazione, a 0,015 [xCi/0,1 mi;

— 0,2 mi di HGH standard alle concentrazioni indicate nella tabella 2.

Dopo mescolamento i tubicini sono stati posti a 4°C per 24 ore. Quindi da ciascun tubicino sono stati prelevati 1,5 mi di soluzione di cui è stata misurata la radioattività con 45 un y-counter (Packard, mod. 256), avente una efficienza del 54% per lo I125.

Le fibre sono state lavate per 3 volte con 2 mi di tampone borato e quindi è stata misurata la radioattività fissata nelle fibre al Y-counter come precedentemente detto. Sugli 50 stessi campioni di fibra sono state ripetute per un'altra volta le aggiunte dei reattivi (tampone, HGH-I125, HGH standard), i lavaggi e le misure di radioattività. I risultati ottenuto sono riportati nella tabella 2. È possibile osservare che nelle fibre contenenti l'anticorpo-anti-HGH, soprattutto dopo la secon-55 da esperienza, risulta esservi, a tutti i livelli di concentrazione di HGH standard aggiunto, una quantità di radioattività fissata maggiore rispetto alle corrispondenti fibre di controllo che non contengono all'interno antisiero, ma che sono state trattate in maniera perfettamente identica a quelle 60 inglobanti l'antisiero.

Deve notarsi che l'antisiero-anti-HGH utilizzato ha un titolo pari a 2.000 e quindi il fenomeno del sequestro specifico è meno evidente di quello che è stato mostrato nell'esperimento riportato nell'esempio 1 in cui è stato utiliz-65 zato un antisiero-anti-insulina a titolo 150.000.

La fissazione specifica dovuta al legame antigene-anti-corpo nelle fibre contenenti anticorpi anti-HGH è però, anche in questo caso, inequivocabile.

628519

TABELLA 2

Fibra

Camp. N°

Peso (mg)

Concentr.

HGH

standard aggiunto

(Hg/ml)

Esperienze

1°

counts/10'

2°

counts/10'

o ai

^2

10,1 10,0

1,25 10

5.186 5.772

6.453 5.959

o s-<

a g

a4

10,2 9,7

10

5.739 4.080

7.529 4.523

'B

o

• H

a5 a6

10,1 9,6

20

5.093 3.799

6.756 4.783

0)

co a7 as

9,7 9,9

50

3.970 4.500

4.890 5.233

o u

.2

*23

t>i b2

9,6 10,4

1,25

6.239 6.029

9.169 9.492

1

3 S

b4

10,2 10,5

10

6.266 5.616

9.112 8.779

Ö

2 e o bs b6

10,0 10,2

20

5.259 5.653

7.739 8.163

Ü

S

'u

<D

Xfl b7

b8

9,8 9,8

50

4.943 5.366

6.736 7.899

10

15

Esempio 3

Con le tecniche già descritte è stato preparato un antisiero anti-triiodiotironina, inoculando in coniglio triiodioti-ronina (T3) legata a siero albumina umana. Sull'antisiero ottenuto è stato determinato un titolo anticorpale pari a 4.000.

A 0,2 mi di siero sono stati aggiunti 0,15 mi di tampone Veronal 0,08 M pH 7,5 contenente 0,5 g/1 di siero albumina umana e 0,15 mi di glicerina.

0,4 mi di questa soluzione sono stati inglobati in 200 mg di triacetato di cellulosa secondo la tecnica di preparazione delle fibre già descritta.

Con la stessa tecnica è stata preparata una fibra di controllo in cui al posto della soluzione di antisiero sono stati inglobati in 200 mg di triacetato di cellulosa 0,4 mi di una soluzione ottenuta mescolando 0,35 mi di tampone Veronal 0,08 M pH 7,5 contenente 0,5 g/1 di siero albumina umana e 0,15 mi di glicerina.

50 mg della fibra contenente l'anticorpo e 50 mg della fibra priva di anticorpo sono stati messi in 2 tubicini di plastica e sono stati lavati per 5 volte con 2 mi del tampone Veronal già descritto.

Quindi in ciascun tubicino sono stati aggiunti:

— 2 mi di tampone Veronal 0,08 M pH 7,5, contenente 0,5 g/1 di siero albumina umana e 4 jig/1 di T3.

— 0,2 mi di Ts-I125 con attività specifica di 90 ji,Cl/[ig diluito fino ad una attività di 0,1 (iCi/ml.

Dopo aver mescolato i tubicini sono stati posti a 4°C per 24 ore.

Quindi le fibre sono state liberate dalla soluzione contenente i reattivi e sono state lavate per cinque volte con 2 mi del tampone Veronal già descritto.

Poi sono state ripetute una seconda volta le aggiunte dei reattivi ed i lavaggi come già detto.

Infine è stata misurata al y-counter già menzionato la radioattività presente sulle fibre.

Sulla fibra priva di anticorpo sono stati misurati 45.000 counts/10'; sulla fibra contenente l'anticorpo sono stati misurati 146.000 counts/10'.

20

Esempio 4

È stato preparato, con le tecniche già descritte, un anticorpo anti-catene leggere X e K alla concentrazione di 25 mg/ml in soluzione fisiologica tamponata a pH 7,3 con 25 sodio fosfato 0,01 M.

A 0,35 mi di questa soluzione sono stati addizionati 0,15 mi di glicerina.

0,4 mi di quest'ultima soluzione sono stati inglobati in 200 mg di triacetato di cellulosa con la tecnica già descritta. 30 Utilizzando lo stesso procedimento di filatura sono stati inglobati in una fibra di controllo 0,4 mi del tampone già descritto.

100 mg di fibra contenente l'anticorpo e 100 mg della fibra di controllo sono stati introdotti in due tubicini di pla-35 stica. Le fibre sono state lavate per cinque volte con 2 mi di tampone fosfato 0,01 M pH 7,3.

Quindi nei tubicini è stato aggiunto 1 mi di tampone fosfato 0,01 M pH 7,3 contenente lo 0,9% di sodio cloruro e 0,5 mg/ml di catene leggere X e K.

40 I tubicini sono stati tenuti per 2 ore a 22qC e per altre 22 ore a 4°C.

Dopo l'incubazione le soluzioni sono state estratte dai tubicini e le fibre sono state lavate per 5 volte con 1 mi di tampone fosfato 0,01 M pH 7,3 contenente lo 0,9% di sodio 45 cloruro.

Le acque di lavaggio sono state riunite con le soluzioni prelevate dai tubicini dopo l'incubazione e sulla soluzione ottenuta è stata dosata la concentrazione proteica con il metodo di Lowry.

Nelle soluzioni che erano state in contatto con la fibra di controllo sono stati dosati 0,447 mg di proteine. Nelle soluzioni che erano state in contatto con la fibra contenente l'anticorpo sono stati dosati 0,385 mg di proteine.

50

v

1 foglio disegni

Claims

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1. Procedimento per la preparazione di fibre inglobanti anticorpi, antigeni o antisieri, caratterizzato dai seguenti stadi:

c) aggiunta della soluzione o sospensione (b) ad un polimero in soluzione,

d) agitazione fino ad ottenere un'emulsione omogenea,

e) filatura dell'emulsione (d) attraverso una filiera immersa in un bagno di coagulo e f) rimozione del liquido di coagulo e del solvente del polimero della fibra per trattamento in corrente di aria od altro gas.

2. Procedimento secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che il polimero è scelto fra i polimeri cellulosici. polimeri cellulosici esterificati, eterificati o nitrati.

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RIVENDICAZIONI

3. Procedimento secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che il polimero è scelto fra il polietilene, le poli-ammidi, i polimeri o copolimeri di acrilonitrile, butadiene o isoprene, acrilati, metacrilati, esteri, vinilici, cloruri vinilici, i polimeri e copolimeri di cloruro di vinilidene, stirolo, vinil-butirrato, Y-metil-glutammato.

4. Fibre inglobanti anticorpi, antigeni o antisieri, prodotti mediante il procedimento della rivendicazione 1.