DK145857B - Analogifremgangsmaade til fremstilling af di-3,4,5-trimethoxybenzoesyreesteren af pyridin-2,6-dimethanol - Google Patents

Description

(is) DANMARK (w) ± \Ra/

ij® (12) FREMLÆGGELSESSKRIFT od 1^5857B

DIREKTORATET FOR PATENT- OG VAREMÆRKEVÆSENET

(21) Ansøgning nr. 1376/74 (51) IntCI.3 C 07 D 213/30 (22) Indieveringsdag 13· mar. 1974 (24) Løbedag 13· mar. 1974 (41) Aim. tilgængelig 15· S ep. 1974 (44) Fremlagt 21 . mar. 1983 (86) International ansøgning nr.

(86) International indleveringsdag (85) Videreførelsesdag - (62) Stamansøgning nr. -

(30) Prioritet l4. mar. 1973, 412609, ES

(71) Ansøger INSTINTERSA INSTITUTO INTERNACIONAL TERAPEUTICO S.A., Bar» celona, ES.

(72) Opfinder José Prous Ciochs, ES.

(74) Fuldmægtig Ingeniørfirmaet Budde, Schou & Co.

(54) Analogifremgangsmåde til fremstil» ling af di-3,4,5-trimethoxybenzoe= syreesteren af pyridin-2,6-dimet= hanol.

Den foreliggende opfindelse angår en analogifremgangs-måde til fremstilling af di-3,4,5-trimethoxybenzoesyreesteren af pyridin-2,6-dimethanol med formlen

Hoc° | I OCH- ^ h3co-// ^-cooci^ ch2ooc-/ \\-och3 -O H,CO ^OCH, J· 3 3 hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at 3,4,5-trimethoxy- ^ benzoesyrechlorid omsættes med pyridin-2,6-dimethanol ifølge Ω følgende reaktionsskema: 2 145857 H3C0 H,CO-/"\-COCl + I fl -» 3 >=/ ,ΑνΑ H3CO/ H0H2C ^2°11 H,CO OCH- —► \—, 15^20-(/ \\ -COOCH2 CH2OOC-</ \>-OCH3 + 2HC1 H3CO X°CH3 i et indifferent, organisk opløsningsmiddel i nærværelse af en tertiær amin, der optræder som syreacceptor for den under reaktionen dannede saltsyre, hvorefter det rå produkt fraskilles ved udhældning af reaktionsmassen på vand og omkrystalliseres fra opløsningsmidler, der er blandbare med vand.

Udgangsmaterialet 3,4,5-trimethoxybenzoesyrechlorid fremstilles ved omsætning af den tilsvarende syre med et overskud af thionylchlorid. Det fremstillede syrechlorid kan anvendes direkte i rå tilstand og kræver ikke rensning ved destillation.

Ved den her omhandlede omsætning anvendes der 3 mol 3,4,5-trimethoxybenzoesyrechlorid pr. mol pyridin-2,6-dimethanol.

Som tertiær amin kan der f.eks. anvendes triethylamin, pyridin og tri-n-butylamin. Der opnås gode resultater ved anvendelse af pyridin, idet dette samtidigt virker som opløsningsmiddel og binder saltsyre. Pyridin anvendes i en mængde på mellem 9 og 10,8 liter pr. kg pyridin-2,6-dimethanol.

Ved den her omhandlede fremgangsmåde udføres reaktionen fortrinsvis ved blanding af pyridin-2,6-dimethanol-opløsningen med syrechloridet ved omgivelsernes temperatur, hvorpå reaktionsmassen opvarmes til ca. 80°C ved hjælp af et varmebad i det tidsrum, der er nødvendigt for at tilendebringe reaktionen, sædvanligvis mellem 2 og 3 timer. Når reaktionen er forbi, tilsættes der vand. Derefter filtreres reaktionsmassen, og råproduktet opsamles på filteret og omkrystalliseres. På denne måde fås et udbytte ved reaktionen, der varierer mellem 60 og 68%.

For at få en ester af god kvalitet, er det vigtigt at skylle det rå reaktionsprodukt med vand for at fjerne de farvede urenheder, der sædvanligvis fremkommer ved reaktionen, og som er vanskelige at fjerne senere ved omkrystallisation, 3 145857 selv ved anvendelse af aktivt kul.

Den til slut foretagne omkrystallisation af råproduktet udføres i forskellige typer af opløsningsmidler, idet der fortrinsvis ved denne operation anvendes methanol, ethanol og isopropanol, hvor det må tages i betragtning, at produktets opløselighed stiger med temperaturen fra methanol til isopro-panol.

Strukturen af den omhandlede diester er blevet bekræftet ved undersøgelse af dens NMR- og IR-spektre.

Nært beslægtede pyridinmethanolestere er kendt fra dansk patentskrift nr. 69.137 og 116.942, USA patentskrift nr. 2.524.838 og DE fremlæggelsesskrift nr. 1.645.918. Disse kendte pyrdinmethanolestere er vasodilatorisk virksomme.

Di-3,4,5-trimethoxybenzoesyreesteren af pyridin-2,6--dimethanol har derimod vist sig at have en uventet, kraftig hypolipidæmisk virkning samtidig med en nedsættende virkning på forøget blodpladeaggregation både hos forsøgsdyr og mennesker. Den hypolipidæmiske virkning viser sig ved en specifik sænkning af lav-densitets-lipoproteiner. Disse terapeutiske virkninger er påvist som beskrevet i det følgende.

Den brede anvendelse af kaniner ved eksperimentelt fremkaldt atherosklerose har udgjort grundlaget for sammenlignende undersøgelser, jfr. P. Constantinides, J. Booth og G. Carlson: Production of advanced cholesterol atherosclerosis in the rabbits, Arch. Path., 70. (I960), s. 712? G.L. Duff og G.C. MacMillan: The effect of alloxan diabetes on experimental cholesterol atherosclerosis in the rabbits, J. Exp. Med., 89^ (1949), s. 611* D. Kritchevsky, J.L. Moynihan, J. Langan, S.A. Tepper og M.L. Sachs: Effect of D- and L-thyroxine and of D- og L-3,5,5'-triiodothyronine on development and regression of experimental atherosclerosis in rabbits* J· Atheroschler. Res., 1 (1961), s. 211^ og M.R. Parwaresch, Ch. Mader, W. Hill og K. Wiswedel: Ein kombinertes Verfahren zur Erzeugung von Arteriosklerose bei Kaninchen in Kurzzeitversuchen,

Res. Exp. Med., 160 (1973), s. 269.

Kaniner, der holdes på en atherogen diæt, udvikler hyper- lipidæmi med forhøjelse af β-zone-lipoproteiner (d< 1,063 g/ml) og sænkning af α-lipoproteiner, jfr. L. Mettler og M.R. Parwaresch: Morphologische und biochemische Untersuchungen iiber die pråventive Wirknung von Oestrogen (Oestradiol) auf eine lipidinduzierte 4 145857

Arteriosklerose, Geburtsh.Frauenheilk., ^2 (1972), s. 426. Graden af den resulterende atherosklerose kan angives kvantitativt som det påvirkede aorta- overfladeareal (jfr. M.r. Parwaresch et al. ovenfor) eller cholesterolindholdet i aortaer, der er frigjort fra det omgivende bløde væv (jfr. P. Constantinides et al. og D. Kritschevsky et al. ovenfor).

Den hypolipidæmiske og antiatherogene virkning af di--3,4,5-trimethoxybenzoesyreesteren af pyridin-2,6-dimethanol (MBP) gennemføres på følgende måde: 145 hanlige hvide udavlede New Zealand-kaniner med en alder på 6 måneder og en vægt på 3212 - 480 g deles i 3_ grupper. Forbindelsen anvendes suspenderet med en koncentration på 75 g/liter 1 30% ethanol. Kontrolgrupperne (1 og 2) indgives daglig 1 ml 30%'s ethanol. Hver fjerde uge udtages fra ørevener blodprøver til cholesterolbestemmelse. En fuldstændig analyse af lipid og lipo-proteiner gennemføres kun ved forsøgets slutning.

Efter 12 ugers forløb afblødes og dræbes kaninerne, og alle dyrene underkastes en grundig dissektion. Aortaerne fjernes fra det omgivende bløde væv. Der udtages straks prøver af coronar-arterierne subostialt ved begyndelsen af de tre hovedgrene og fremstilles histologiske præparatglas på sædvanlig måde. Aortaerne fotograferes, og det påvirkede overfladeareal måles planimetrisk.

På lignende måde bestemmes det stenotiske overfladeareal af den coronare lysning planimetrisk under anvendelse af et skalatilpasset Zeiss-mikroskop. Aortaerne fryses i tøris og acetone, og der fremstilles et acetone-pulver, der vejes og suspenderes i 2 ml chloroform/methanol i volumenforholdet 2:1.

Lipiderne ekstraheres som beskrevet af J. Folch, M.Lees og G.H. Stanley: A simple method for the isolation and purification of total lipids from animal tissues, J. Biol. Chem., 226 (1975), s. 497, og cholesterolmængden i disse ekstrakter bestemmes. Der måles total cholesterol (TCh), forestret cholesterol (ECh) og fri cholesterol (Ch) ved anvendelse af den enzymatiske metode ifølge P. Eøcklau, Ξ. Bernt og W. Gruber: Enzymatische Bestiimiung des Gesamb-Cholesterins im Serum, Z. Klin. Chem. Klin. Biochem., 12 (1974), s. 403. Serum-lipoproteiner .(EP) adskilles ved densitetsgradient-ultracentrifugering, jfr. F.T. Hatsch og R.S. Lees: Practical methods for plasma lipoprotein analysis,

Adv. Lipid Res., (1968), s. 1. LP med d< 1,063 g/ml betegnes lav-densitets-LP (LDL) eller β-zone-LP, efter at chylomicroner c 145857

D

og VLDL (LP med meget lav densitet) er fjernet under anvendelse af en densitetsgradient på d = 1,006 g/ml. LP med d>· 1,063 g/ml betegnes høj-densitets-LP (HDL) eller α-zone-LP. Renheden af LP--fraktionerne undersøges ved polyacrylamid-diskelektroforese af forud farvede LP-fraktioner, jfr. M.R. Parwaresch, H.J. Radzon og Ch. Måder: Diagnose primårer Hypolipoproteinåmien in Nabelschnur blut, Nachr. Kinderheilk., 125 (1977). s. 865. Til kvantitativ bedømmelse sammenlignes middelværdierne under anvendelse af Student's t-test for uafhængige populationer. Værdiernes spredning udtrykkes ved 95%'s øvre og nedre konfidensgrænser.

Resultater.

Resultaterne af forsøget er anført i tabel I. Dødeligheden overskrider ikke 10% i nogen af grupperne. ' Kaniner, der holdes på normalt foder (gruppe 1), udviser ikke nogen forandring af lipid-værdierne under: forsøget. Den atherogene diæt hos gruppe 2 af dyrene fører til en massiv forhøjelse af serumcholesterol og LDL-cholesterol med middelværdier på hhv. 958 og 939 mg/dl ved forsøgsperiodens slutning. Disse dyr udvikler en svær athero-sklerose. I gennemsnit påvirkes 57% af aortaoverfladen. De planimetriske undersøgelser af coronararterierne viser en atheromatøs stenose, der i gennemsnit optager 37% af karrenes lysning. Det intramurale cholesterolindhold i aorta er i god overensstemmelse med omfanget af vaskulære læsioner.

Gruppen,der holdes på MPB, viser en signifikant lavere grad af atherosklerose i aortaer og coronararterier end kontrolgruppen 2. Cholesterolindholdet i aorta og serumcholesterolniveauet er i overensstemmelse med karforandringerne. Dyr behandlet med MPB viser cholesterolværdier på 481 mg/dl.

145857 6

Tabel I

Hæmmende virkning af MPB på eksperimentel hypercholeste-rolæmi og atherosklerose hos kaniner efter en forsøgsperiode på 3 uger.

Procent påvirket overfladeareal

Gruppe nr. Serum HDL-TCh/ Aorta- Aorta Coronar- Døde- Behand- TCh LDL-TCh Aorta-ChECh over- lysning lighed ling (ml/dl) forhold TCh forhold flade _ χ NR 59 22/37 7 6,7/0,4 0 0 0/10 (50-68) 0,59 (5-9) 16,7 2D 958 19/939 85 31/53 57 37 3/29 (868-1049) 0,02 (76-93) 0,6 (51-62) (32-42) 3 D/MBP 481 87/394 46 24/21 30 13 2/30 (408-533) 0,22 (40-52) 1,19 (24-23) (10-16) NR = normalt foder. D = atherogen diæt. TCh = total cholesterol.

ECh = forestret cholesterol.

De anførte værdier er middelværdier. Værdierne i parentes er 95%'s øvre og nedre konfidensgrænser.

Resultaterne viser den tydelige cholesterolsænkende virkning af HPB, der hæmmer udviklingen af eksperimentelt fremkaldt atherosklerose hos kaniner.

Virkning af MPB på atherogene risikofaktorer hos mennesker.

1. Virkning på blodpladeaggregation.

2. Virkning på lipider og lipoproteiner ved primær type II a hyperlipoproteinæmi (hyperbetalipoproteinæmi).

Ved forsøg med kaniner udviser MBP en klar anti-atheroskle-rotisk virkning. Det er blevet antaget, at den antiatherosklerotiske virkning skyldes en mulig,, hypolipæmisk virkning. Denne hypotese er undersøgt som beskrevet i det følgende.

24 Patienter (begge køn, gennemsnitlig alder: 48 år) med en endogen hyperbetalipoproteinæmi, der klassificeres som hyper-lipoproteinæmi type II a ifølge et WHO-forslag, indgives en dosis på 25 mg MBP/kg legemsvægt pr. dag i 42 dage.

7 145857

Lipid- og lipoproteinanalysen samt blodpladeaggregations-testen gennemføres før (0) og 7, 14, 21, 28 og 42 dages medicinsk behandling. De samme undersøgelser foretages 1, 2 og 3 uger efter erstatning af det medicinske præparat med placebo.

Der udtages blodprøver efter 12 timers faste, og disse underkastes en modificeret blodpladeaggregationstest ifølge Breddin, hvorved den procentiske andel af aggregerede blodplader bestemmes.

Serumprøver underkastes en gravimetrisk bestemmelse af total lipid (TL) og en enzymatisk bestemmelse af frit og fores tret cholesterol (Ch, ECh) og af triglycerider (TG). Endvidere bestemmes phospholipider (Ph) og ikke-forestrede fede syrer (UFA) ved tyndtlagschromatografi.

Efter ultracentrifugerings-fraskillelse af chylomicroner (d·^ 0,93) VLDL (d^l,006), LDL (d-cl,063) og HDL (d-^1,12) ved en gradientfraktionering bestemmes de ovennævnte lipider (TL, ECh,

Ch, Ph, TG og UFA) i de fraskilte fraktioner.

Resultater:

Blodpladeaggregationsforsøg:

Forbindelsen MBP viser en klar virkning på blodpladeaggre-gationstilbøjeligheden, hvor der er tale om forøget blodplade-aggregation. I tabel II er sammenfattet de individuelle værdier i medicinbehandlingsperioden, begyndelsesværdierne og værdierne, der fås efter 3 ugers indgivelse af placebo. Forskellene, der bedømmes ved anvendelse af en fordelingstest ifølge Wilcoxon (modificeret ifølge Mann og Withney) er signifikant ved p-£0,05.

Tabel II

Aggregerede thrombocyter i % af begyndelsesværdierne.

Placebo i 0 dage 7 dage 14 dage 21 dage 28 dage 3 uger 88 36 33 59 65 92 87 30 31 36 32 86 76 30 28 31 32 79 63 28 25 25 31 68 60 28 22 20 31 68 60 23 20 20 28 66 52 22 20 18 18 58 30 18 20 18 18 23 16 18 18 15 17 18 13 12 18 11 15 18 11 10 18 11 12 15 8 145857

Af lipidværdierne i tabel III er LDL-estercholesterol stærkt forhøjet inden den medicinske behandling. Allerede i den første uge af behandlingen falder denne værdi i gennemsnit 14%.

Det fremgår af forsøgsresultaterne, at forbindelsen MBP klart hæmmer en forøget blodpladeaggregation. Resultaterne er statistisk signifikante.

Hovedvirkningen af MBP på serumlipider og lipoproteiner er en sænkende virkning på forhøjede LDL-ECh-værdier. Resultaterne er statistisk signifikante.

Resultaterne beviser, at forbindelsen har en nyttig anti-atherogen virkning, der hovedsagelig skyldes dens virkning mod de to væsentligste faktorer, der er ansvarlige for thrombotiske komplikationer.

9 1-45857 η 1-3 Hi ^ w n P> f O U O tJ* cr ro

H

H H

H H

PJ H

(Ji Η Μ

O 00 IB U1 O

σ\ ιΡ» o iP- co 1+ 1+ 1+ 1+ 1+

Ir*

σι η co co to D

on ip> co σι σι Ir1 it* Ml-·

Cn t> CO SI Ul

Cn si -J >1 1+ 1+ 1+ I + 1+ -Ί

Ό H iP> to H

tO Ό 00 Ji VO

V

II

iP* HH

co cn σι σι to to CO Ο Ο H it* Η 1+ 1+ 1+ 1+ ι+ >>

Cn Η to to to to ιο vo η co

.C- HH

Η σ> cTo »t» jP» Ο Η to 00 co to Η 1+ 1+ 1+ 1+ ι+ σι to co ip» to -j Η H cn σι

ips Η H

ο σι σι ip» co σι its. o vo to to 1+ 1+ 1+ 1+ 1+ oo σι co co σι h to o Ό cn oo

co H H

oo σι ui iP to to h cn cn oo 1+ 1+ 1+ 1+ 1+ tc- to σι to its. co h -o h cn η σι 145857 ίο

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen illustreres i de følgende eksempler.

Eksempel 1.

15 kg (70,7 mol) 5,4,5-trimethoxybenzoesyre og 65 liter benzen fyldes i en reaktor, og til denne blanding sættes der 27,4 liter thionylchlorid. Massen opvarmes til 56-70°C i 5 timer. Overskuddet af benzen og thionylchlorid afdestilleres under vakuum. Remanensen holdes under vakuum ved 120-123°C i 1 time, hvorved der fås et hårdt, krystallinsk, fast stof.

En opløsning af 3,24 kg (23,3 mol) pyridin-2,6-dimethanol i 35 liter ren pyridin sættes til remanensen, og massen opvarmes til 80°C i 2,5 timer. Reaktionsmassen får en brun farve. Det således dannede pyridin-hydrochlorid afkøles og udkrystalliseres. Derefter udhældes den herved fremkomne reaktionsmasse i vand, og det fremkomne bundfald filtreres fra og skylles derefter gentagne gange med vand. Til slut opløses det i 400 liter methanol, og den fremkomne opløsning filtreres med aktivt kul. Fra dette filtrat afdestilleres 50 liter methanol ved atmosfæretryk og der henstilles til krystallisation. Der fås 8,35 kg (15,8 mol) af di-3,4,5-trimethoxybenzoe-syreesteren af pyridin-2,6-dimethanol, svarende til et udbytte på 68%.

Produktet er et hvidt, krystallinsk, fast stof, der smelter ved 119-126°C. Efter omkrystallisation fra methanol fås et produkt, der smelter ved 126-127°C. En elementæranalyse heraf giver følgende resultater: C = 6l,24$, H = 5,46$, N = 2,82$, mens de beregnede værdier for formlen ^27Η29Ν010 er: C = 6l,47$, H = 5,54$, N = 2,65$. IR-spektrum: Esterstrukturen bekræftes af et C=0-absorptionsbånd ved 1720 cm""·*· og af kraftig absorption af C-O-C. Båndet ved 760 cm-^ tillægges de 3 hydrogenatomer på pyridinringen.

NMR-spektrum: (CDC1,, TMS): 3,94T singlet -OCHy 5,52 Τ’ singlet -OCHgj 8,00 - 7,27T multiplet aromatiske protoner.

Eksempel 2.

15 kg (70,7 mol) 3,4,5-trimethoxybenzoesyre og 65 liter benzen fyldes i en reaktor, og der tilsættes derefter 27,4 liter thionylchlorid. Massen opvarmes til 65-70°C i 5 timer. Overskuddet 11 145857 af benzen og thionylehlorid afdampes under vakuum. Remanensen opvarmes under vakuum i 1 time ved 120-123°C, hvorved der fås et hårdt, krystallinsk, fast stof.

Den fremkomne remanens opløses i 60 liter benzen, og hertil sættes 3,24 kg (23,3 mol) pyridin-2,6-methanol og 8 liter pyridin. Massen opvarmes under tilbagesvaling i 5 timer. Derpå fjernes opløsningsmidlerne ved destillation under vakuum, og remanensen udhældes i vand. Det herved dannede bundfald frafiltreres og skylles gentagne gange med vand, hvorefter der opløses i 400 liter methanol, og den fremkomne opløsning filtreres med aktivt kul (trækul).

Pra filtratet sidestilleres 50 liter methanol ved atmosfæretryk og der henstilles til krystallisation. På denne måde fås 8,98 kg (17 mol) af di-3,4,5-trimethoxybenzoesyreesteren af pyridin-2,6--dimethanol, svarende til et udbytte på 73%. Efter omkrystalli-sation fra methanol fås et produkt med et smeltepunkt på 126--127°C. Ved elementæranalyse fås følgende resultater: C = 61,24$, H = 5,46$, N = 2,82$ mod de beregnede værdier for formlen C27H29N010: C = 61,47$, H = 5,54$, N = 2,65$.